KR19990079062A - Composition for preventing and treating atherosclerosis containing naringin or naringenin - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나린진(naringin) 또는 나린제닌(naringenin)을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 의약용 및 식품용 조성물을 포함한다.The present invention relates to a composition for preventing and treating atherosclerosis, including naringin or naringenin, and the composition of the present invention includes a pharmaceutical and food composition.
Description
본 발명은 나린진(C27H32O14, 분자량 580.53) 및 나린제닌(C15H12O5, 분자량 272.25)을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing and treating atherosclerosis comprising naringin (C 27 H 32 O 14 , molecular weight 580.53) and naringenin (C 15 H 12 O 5 , molecular weight 272.25).
관상동맥성 심혈관 질환은 현재 모든 사망원인의 30% 이상을 차지하고 있으며 미국, 유럽 등 선진국에서는 심각한 문제가 되고 있다. 한편 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동부족 등의 영향을 받아 심장병이 증가하고 있는 추세에 있다. 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 대식세포(macrophage), 포말세포(foam cell) 등이 생성 침착되고 플라크(plaque)를 형성하여 혈액순환을 저해하는 동맥경화증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다(Ross, R.,Nature, 362, 801-809(1993)).Coronary cardiovascular disease currently accounts for more than 30% of all deaths and is a serious problem in developed countries such as the United States and Europe. Meanwhile, in developing countries, heart disease is on the rise due to westernization of diet and lack of exercise. If the amount of cholesterol in the blood is high, macrophage, foam cells, etc. are formed and deposited in the blood vessel walls, and plaques are formed, and atherosclerosis, which inhibits the blood circulation, is known to be prone to occur. Ross, R., Nature, 362 , 801-809 (1993)).
혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로는 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법이 있다. 아실 코에이: 콜레스테롤-o-아실트랜스퍼레이즈(acyl CoA: cholesterol-o-acyltransferase, ACAT)는 인체조직 속에서 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스터로 전환시켜주는 효소이다. 실험적이나 임상학적인 동맥경화 현상에서 대식세포(macrophage)나 평활근(smooth muscle) 세포 유래 포말세포들의 형성은 아주 중요한 인자이다. 포말세포들은 ACAT 작용에 의해 형성되고 혈액 속의 LDL에 의해 운반되는 콜레스테롤 에스터를 많이 함유하고 있다. 동맥 혈관 벽에 있는 포말세포들은 ACAT 활성의 증가와 더불어 발견되는 경우가 많기 때문에, ACAT 저해제는 동맥경화 예방제가 될 가능성이 높다. 또한 간 속의 ACAT 활성을 저해 할 경우 혈액속에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있을 것이다(Witiak, D. T. and D. R. Feller(eds),Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects, Elsevier, pp159-195(1991)).Reducing the amount of cholesterol in the blood is a way to suppress the absorption of cholesterol. Acyl CoA (cholesterol-o-acyltransferase, or ACAT) is an enzyme that converts cholesterol into cholesteryl esters in human tissues. The formation of macrophage or smooth muscle cell-derived foam cells is an important factor in experimental and clinical atherosclerosis. Foam cells contain large amounts of cholesterol esters formed by ACAT and carried by LDL in the blood. Because foam cells in the arterial vessel walls are often found with increased ACAT activity, ACAT inhibitors are likely to be protective agents of atherosclerosis. Inhibition of ACAT activity in the liver may also lower LDL-cholesterol levels in the blood (Witiak, DT and DR Feller (eds), Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects , Elsevier, pp159-195 (1991)).
혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 다른 방법으로는 지단백질간에 콜레스테롤 전이를 매개하는 콜레스테롤 에스터 전달 단백질(cholesterol ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나 간에서 콜레스테롤 생합성에 관련하는 효소인 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소의 작용을 억제하는 방법이다. HMG-CoA 환원효소는 스테롤이나 이소프레노이드계 화합물의 생합성 경로의 중간단계인 메발론산(mevalonic acid) 합성을 매개하는 효소로, 이 효소의 활성을 감소시킬 경우 콜레스테롤의 생합성 속도를 늦추어 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 치료에 효과적으로 이용될 수 있다(William, W. P.,Cardiovascular Pharmacology, Kanu Chatterjee(ed), Wolfe Pullishing, 8.6-8.7 (1994)). 현재 사용되고 있는 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제는 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속에서 유래된 것으로 미국 메르크사가 개발한 로바스타틴(lovastatin)과 심바스타틴(simvastatin) 및 일본 산쿄사가 개발한 프라바스타틴(pravastatin) 등이 있다. 그러나 스타틴(statin)류가 중추신경계에 부작용을 주고(Saheki, A.T. et al.,Pharm. Res.,11, 304-311 (1994)), 로바스타틴과 심바스타틴은 간의 LDL 수용체의 활성을 증가시킴으로써 혈중 LDL 콜레스테롤을 낮추지만 여러 효소의 양 증가, 크레아틴 키나제(creatine kinase)의 증가, 횡문근변성(rhabdomyolysis) 등의 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다(Farmer, J.A. et al.,Baillers-clin. Endocrinol. Metab.,9, 825-847 (1995)). 따라서 저렴하고 부작용이 없는 새로운 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제의 개발이 절실하다.Other ways to reduce the amount of cholesterol in the blood include 3-hydroxy-3-, an enzyme that inhibits the action of cholesterol ester transfer protein (CETP) that mediates cholesterol transfer between lipoproteins or is involved in cholesterol biosynthesis in the liver. A method of inhibiting the action of methyl glutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase. HMG-CoA reductase is an enzyme that mediates the synthesis of mevalonic acid, an intermediate step in the biosynthetic pathway of sterols and isoprenoid compounds. Hypercholesterolemia is caused by slowing the rate of cholesterol synthesis by decreasing the activity of this enzyme. (hypercholesterolemia) can be used effectively (William, WP, Cardiovascular Pharmacology , Kanu Chatterjee (ed), Wolfe Pullishing, 8.6-8.7 (1994)). HMG-CoA reductase activity inhibitors currently in use are derived from the genus Penicillium or Aspergillus, such as lovastatin and simvastatin developed by Merck, USA, and pravastatin, developed by Sankyo, Japan. There is this. However, statins have adverse effects on the central nervous system (Saheki, AT et al., Pharm. Res. , 11 , 304-311 (1994)), and lovastatin and simvastatin increase LDL receptor activity in the blood by increasing liver LDL receptor activity. Although it lowers cholesterol, it has been reported to have side effects such as increased amount of various enzymes, increased creatine kinase, and rhabdomyolysis (Farmer, JA et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metab ., 9 , 825-847 (1995)). Therefore, the development of new HMG-CoA reductase activity inhibitors that are inexpensive and have no side effects are urgently needed.
본 발명자들은 비교적 안전할 것으로 생각되는 생약재, 식품재료, 과채류 등에 풍부한 물질들의 약리활성물질 탐색연구를 수행하였다.The present inventors conducted research on pharmacologically active substances of substances rich in herbal medicines, food ingredients, fruits and vegetables that are considered to be relatively safe.
나린제닌은 오렌지, 귤 등의 감귤류에 존재하는 천연물 나린진에서 배당체를 제거하여 얻어진 물질로, 쥐에 투여하였을 때 0.5 내지 1% 농도에서 혈중 콜레스테롤 농도를 강하시킨다는 보고가 있다(일본 특허 공개 제 08-283154 호(1996. 10. 29)). 그러나, 상기 문헌에서는 나린진과 같은 배당체가 포함된 천연물은 콜레스테롤 강하에 효과가 약하다고 보고하였다. 또한, 혈중 콜레스테롤의 양은 동물 체내에서 많은 조절을 통해 통제되는데, 상기 문헌에서는 혈중 콜레스테롤 강하가 일어나는 구체적인 기작에 대해서는 언급하고 있지 않다.Naringenin is a substance obtained by removing glycosides from naringin, a natural product present in citrus fruits such as oranges and tangerines, and when administered to rats, naringenin has been reported to lower blood cholesterol concentrations at a concentration of 0.5 to 1%. 283154 (October 29, 1996). However, the literature reported that natural products containing glycosides such as naringin have a weak effect on cholesterol lowering. In addition, the amount of cholesterol in the blood is controlled through a lot of regulation in the animal body, which does not mention the specific mechanism by which blood cholesterol drop occurs.
본 발명자들은 감귤류의 과일중에 있는 바이오플라보노이드가 인체에 유익한 많은 종류의 활성을 가지고 있는 것을 안 후, 이들이 동맥경화증의 치료 및 예방과 관련이 있는지를 확인하고자 연구를 계속한 결과, 나린진과 나린제닌이 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키며 동맥경화증의 예방에 효과가 있다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.The inventors have found that bioflavonoids in citrus fruits have many types of activity beneficial to the human body, and have continued research to determine whether they are related to the treatment and prevention of atherosclerosis. The present invention has been completed by remarkably reducing blood cholesterol and having an effect on the prevention of atherosclerosis.
본 발명의 목적은 나린진 또는 나린제닌을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing and treating atherosclerosis comprising naringin or naringenin.
본 발명의 다른 목적은 나린진 또는 나린제닌을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food or beverage composition for preventing and treating atherosclerosis comprising naringin or naringenin.
도 1a, 1b 및 1c는 각각 1% 콜레스테롤이 투여된 토끼, 1% 콜레스테롤과 0.5% 나린진이 투여된 토끼 및 1% 콜레스테롤과 20㎎/㎏ 로바스타틴이 투여된 토끼의 동맥사진이다.1A, 1B and 1C are arterial images of rabbits administered 1% cholesterol, rabbits administered 1% cholesterol and 0.5% naringin, and rabbits administered 1% cholesterol and 20 mg / kg lovastatin, respectively.
본 발명에서는 나린진 또는 나린제닌을 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한, 나린진 또는 나린제닌을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.In the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing and treating atherosclerosis comprising naringin or naringenin as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier. Also provided are food compositions and beverage compositions for preventing and treating atherosclerosis comprising naringin or naringenin.
나린진 또는 나린제닌은 감귤류로부터 추출하거나 공지된 합성 방법에 의해서도 합성할 수 있다. 본 발명에서 감귤류란 하귤, 당유자, 감귤, 오렌지, 레몬, 자몽 또는 유자 등을 말한다. 감귤류에 들어있는 나린진 등의 플라보노이드는 과일의 성숙기에 따라 또는 과일의 종류에 따라 각각 활성 성분의 비율이 변할 수 있으며, 이들의 추출 방법은 메르크 인덱스(Merck Index) 등의 문헌 및 특허 등에 다수 공개되어 있다.Naringin or naringenin can be extracted from citrus fruits or synthesized by known synthetic methods. Citrus fruits in the present invention refers to a mandarin orange, sugar, citrus, orange, lemon, grapefruit or citron. Flavonoids, such as naringin in citrus fruits, can vary in active ingredient ratios depending on the maturity of the fruit or the type of fruit, and their extraction methods are widely published in the literature and patents, such as the Merck Index. It is.
나린진 또는 나린제닌은 동맥경화증의 치료효과 뿐 아니라 예방효과를 가진다. 현재까지 연구된 독성시험 결과, 나린진 또는 나린제닌은 1000 mg/kg의 용량으로 쥐에게 경구투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 또한, 나린진 또는 나린제닌은 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않는다.Naringin or naringenin have a protective effect as well as a treatment of atherosclerosis. Toxicity studies studied to date have shown that naringin or naringenin is virtually nontoxic when administered orally to rats at a dose of 1000 mg / kg. In addition, naringin or naringenin show no adverse effects on the function of organs, including the liver.
동맥경화증의 예방 및 치료를 위하여, 나린진 또는 나린제닌을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.For the prevention and treatment of atherosclerosis, naringin or naringenin may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier as an active ingredient to prepare a composition for preventing and treating atherosclerosis. The pharmaceutical composition may further include conventionally used excipients, disintegrants, sweeteners, lubricants, flavoring agents, etc., tablets, capsules, powders, granules, suspensions, emulsifiers, syrups, liquids by conventional methods Or in dosage unit forms or as multi-dose pharmaceutical preparations, such as preparations for parenteral administration.
본 발명의 나린진 또는 나린제닌을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 나린진이 하루에 체중 1 ㎏당 1 내지 100 mg, 바람직하게는 3 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The composition for preventing and treating atherosclerosis containing naringin or naringenin of the present invention as an active ingredient may be parenterally or orally administered as desired, and naringin is 1 to 100 mg / kg body weight per day, preferably May be administered in portions of 1 to several times so as to be administered in an amount of 3 to 10 mg. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of the disease, and the like.
나린진 또는 나린제닌은 또한 동맥경화증을 예방 및 치료할 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 건강보조식품용 개발을 위하여 나린진 또는 나린제닌을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알콜음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.Naringin or naringenin may also be added to foods or beverages for the purpose of preventing and treating atherosclerosis. Examples of foods to which naringin or naringenin may be added for the development of dietary supplements include, for example, various foods, meats, beverages, chocolates, snacks, snacks, pizzas, ramen noodles, other noodles, gums, ice creams, alcohols. Beverages, vitamin complexes and dietary supplements.
이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following Examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these.
실시예 1: 실험동물의 식이 조성과 나린진 및 나린제닌의 동물투여실험Example 1 Dietary Composition of Animals and Animal Administration of Naringin and Naringenin
3주령의 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 흰쥐 30마리를 충북 음성군의 대한실험 동물센터로부터 구입하여 1주간 제일제당 실험동물 사료로 사육하고, 4주령(체중: 90∼110g)이 되었을 때, 난괴법(randomized block design)에 의해 3 개의 그룹으로 나누었다. 세 그룹의 쥐들에게 각각 세가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉, 정상식이(AIN-76 실험동물 식이)에 1% 콜레스테롤(대조군); 1% 콜레스테롤 및 0.1% 나린진; 그리고 1% 콜레스테롤 및 0.1% 나린제닌이 각각 함유된 식이를 섭취시켰다. 세 그룹에게 섭취시킨 식이의 조성은 하기 표 1에 나타나 있다.30 Sprague-Dawley rats of 3 weeks of age were purchased from the Korean Experimental Animal Center in Negative Chungcheongbuk-do and were bred for 1 week in experimental animal feed, and at 4 weeks of age (90-110 g), Divided into three groups by randomized block design. Three groups of rats each had three different high cholesterol diets, namely 1% cholesterol (control) in normal diet (AIN-76 experimental animal diet); 1% cholesterol and 0.1% naringin; A diet containing 1% cholesterol and 0.1% naringenin was taken. The composition of the diets ingested in the three groups is shown in Table 1 below.
모든 식이들은 고콜레스테롤식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 나린진 및 나린제닌은 미국의 시그마사(Sigma Chemical company, St. Louis, Mo)로부터 구입하였으며, 실험용 흰쥐의 실험실 식이인 AIN-76 식이 조성 중 셀룰로즈, 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물 성분은 미국의 테크라드 프리미어사(TEKLAD premier, Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다.All diets correspond to a high cholesterol diet (1%, wt / wt), naringin and naringenin were purchased from Sigma Chemical company, St. Louis, Mo. AIN-, the laboratory diet of rats. Cellulose, mineral and vitamin mixture components in the 76 dietary composition were purchased from TEKLAD premier, Madison, Wisconsin, USA.
모든 식이군의 쥐들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정하였다. 동물사육이 종료된 후 사육일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중증가에 있어서는 3개군간 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장을 보였다.All dietary rats were given free diet with water for 6 weeks. The dietary intake was recorded daily and weighed every 7 days. After the animal breeding was completed, the data on the breeding journals were analyzed.
실시예 2: 실험동물의 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량 측정Example 2: Determination of Total Cholesterol, HDL-Cholesterol and Neutral Lipid Contents in Experimental Animals
실험 식이의 투여가 흰쥐의 혈중 콜레스테롤 및 중성지질 함량에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.The effects of experimental diet on blood cholesterol and triglyceride content in rats were investigated as follows.
세 식이군의 쥐들로부터 혈액 시료를 채취하고, 이로부터 덱스트란-설페이트방법인 침전 시약 키트(Sigma Chemical Co. Cat. No. 352-3)을 이용하여 혈장 HDL 분획를 분리하였다. 총 콜레스테롤 농도는 시그마사의 총 콜레스테롤 키트(Cat. No. 352-100)를 사용한 효소발색법(Allain et al.,Clin. Chem., 20, 470-475(1974))에 의해 측정하였다. HDL-콜레스테롤 농도의 측정을 위해서는 HDL-콜레스테롤 칼리브레이터(Cat. No. C9908)를 사용하였다. 중성 지질 농도는 시그마 진단 키트(Cat. No. 339-50)를 사용하여 측정하였다(McGowan, M.W. et al.,Clin. Chem., 29, 538-542(1983)). 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있는데, 혈장 총 콜레스테롤 농도는 나린진 투여군에서 대조군에 비해 32% 감소하였고, 나린제닌 투여군에서는 대조군에 비해 18% 감소하였다.Blood samples were taken from the rats of the three diets, and plasma HDL fractions were separated from the dextran-sulfate precipitation reagent kit (Sigma Chemical Co. Cat. No. 352-3). Total cholesterol concentration was measured by enzyme coloration (Allain et al., Clin. Chem., 20 , 470-475 (1974)) using Sigma's Total Cholesterol Kit (Cat. No. 352-100). HDL-cholesterol calibrator (Cat. No. C9908) was used for the measurement of HDL-cholesterol concentration. Neutral lipid concentrations were measured using Sigma Diagnostic Kit (Cat. No. 339-50) (McGowan, MW et al., Clin. Chem., 29 , 538-542 (1983)). The results are shown in Table 2 below, plasma total cholesterol concentration was reduced by 32% compared to the control group in naringin administration group, 18% compared to the control group in naringenin administration group.
실시예 3: 나린진 및 나린제닌 투여가 HMG-CoA 환원효소 활성에 미치는 영향Example 3: Effect of Naringin and Naringenin Administration on HMG-CoA Reductase Activity
(단계 1) 마이크로좀의 제조(Step 1) Preparation of the microsome
세 그룹의 흰쥐들을 희생시켜 간을 적출하였다. 2 g의 간 조직을 6 ml의 용액 1(0.1 M 트리에탄올아민, 0.02 M EDTA 및 2 M 디티올트레이톨)을 이용하여 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 10,000xg 로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 4℃에서 12,000xg로 15분 동안 다시 원심분리하였다. 상층액중 5 ml를 취하여 초원심분리 튜브(Beckman)로 옮기고, 4 ℃에서 100,000xg 로 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 1 ml의 용액 1 로 현탁시킨 후, 이 용액을 4℃에서 100,000xg로 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 1 ml의 용액 1 로 현탁시켰다. 현탁액중의 마이크로좀 단백질을 브래포드 등(Bradford M.M.,Anal. Biochem.,72, 248-254 (1976))의 방법으로 정량하고, 단백질 농도를 4 내지 8 mg/ml로 조절하였다. 이 현탁액을 액체 질소에 보관하였다.Liver was harvested at the expense of three groups of rats. 2 g of liver tissue was homogenized using 6 ml of solution 1 (0.1 M triethanolamine, 0.02 M EDTA and 2 M dithiolthritol). This homogenate was centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was transferred to a new tube and centrifuged again at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. 5 ml of the supernatant was taken and transferred to an ultracentrifuge tube (Beckman) and centrifuged at 100,000 × g at 4 ° C. for 1 hour. The supernatant was discarded and the pellet was suspended with 1 ml of solution 1, then the solution was centrifuged at 4Ox at 100,000xg for 1 hour. The supernatant was discarded and the pellet suspended in 1 ml of solution 1. The microsomal protein in suspension was quantified by Bradford et al. (Bradford MM, Anal. Biochem. , 72 , 248-254 (1976)) and the protein concentration was adjusted to 4-8 mg / ml. This suspension was stored in liquid nitrogen.
(단계 2) HMG-CoA 환원효소 활성 측정(Step 2) HMG-CoA Reductase Activity Measurement
HMG-CoA 환원효소 활성의 측정은 사피로 등(Shapiro D.J. et al.,Biochim. Biophy. Acta,370, 369-377 (1974))의 방법을 변형하여 다음과 같이 실시하였다.HMG-CoA reductase activity was measured by modifying the method of Sapiro et al. (Shapiro DJ et al., Biochim. Biophy. Acta , 370 , 369-377 (1974)).
실험전에 효소원의 양, 기질의 양, 조인자의 양, 반응시간에 따른 HMG-CoA 환원효소 활성도의 변화를 분석하였다. 그 결과, HMG-CoA 환원효소의 활성은 활성 측정시에 마이크로좀과 NADPH를 반응시킬 때의 전반응(preincubation) 및 반응(incubation) 시간과 마이크로좀의 농도에 대한 의존성이 매우 강하여, NADPH를 포함한 반응은 전반응시키지 않았을 때 활성도가 높으며, 반응시간은 짧을수록 활성도에 미치는 영향이 적어서 기존의 분광광도법보다 짧은 5 내지 15분, 마이크로좀 단백질은 1㎎이하, 특히 300㎍이하, 및 조인자의 양은 1 내지 2 mM의 농도에서 효소 활성도에 미치는 영향이 적다는 보고와 일치함을 알 수 있었다.Before the experiment, the change of HMG-CoA reductase activity according to the amount of enzyme source, the amount of substrate, the amount of cofactor, and reaction time was analyzed. As a result, the activity of HMG-CoA reductase was highly dependent on the preincubation and incubation time and the concentration of the microsomes when reacting the microsomes with NADPH at the time of activity measurement. When the reaction is not pre-reacted, the activity is high, and the shorter the reaction time, the less the effect on the activity, which is 5 to 15 minutes shorter than the conventional spectrophotometry, the microsomal protein is 1 mg or less, especially 300 µg or less, It was found to be in agreement with the report that the effect on the enzyme activity at a concentration of 1 to 2 mM is small.
각각의 양을 마이크로좀 100 내지 300㎍을 NADPH 500nmole 및 방사능 표지된 [14C] HMG-CoA 50 nmole(1,200 또는 2,400cpm/nmole 비활성)과 혼합하고 전체 부피를 60㎕로 한 후 37℃에서 15분간 전반응시켰다. 여기에 6N 염산 15㎕ 를 가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 단백질 활성을 제거하고, 수득된 메발로네이트를 락톤 형태로 만든 후 실리카 겔 60F254 박막 크로마토그래피 판위에 점적하여 메발로네이트 표준(락톤 형태)과 비교하여 Rf값이 0.2 부근인 밴드를 잘라 신틸레이션 카운팅하였다. 활성도는 1분 반응당 마이크로좀 단백질 1㎎이 생성되는 메발로네이트의 양을 pmole로 나타내었다.Each amount of 100-300 μg of microsomes was mixed with 500 nmole of NADPH and radiolabeled [ 14 C] HMG-CoA 50 nmole (1,200 or 2,400 cpm / nmole inactive) and the total volume was 60 μl followed by 15 at 37 ° C. It was reacted for a minute. 15 μl of 6N hydrochloric acid was added thereto, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes to remove protein activity, and the obtained mevalonate was made into a lactone form, and then deposited on a silica gel 60F254 thin film chromatography plate to give a mevalonate standard (lactone form). In comparison, the band having the R f value of about 0.2 was cut and scintillated counted. Activity was expressed as pmole the amount of mevalonate produced 1 mg of microsomal protein per minute reaction.
(단계 3) HMG-CoA 환원효소 활성 저해도 측정(Step 3) HMG-CoA reductase activity inhibition measurement
사피로 등의 방법을 변형하여 실시하였다. 즉 NADPH 500nmole, 억제제 시료 0, 1, 10, 50 또는 100㎍와 완충용액(0.1M 트리에탄올아민, 0.02M EDTA)을 혼합하여 전체 부피 60㎕로 한 후 37℃에서 5분간 전반응시켰다. 여기에 HMG-CoA(Sigma Chemical Company) 50 nmole을 넣고 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 6N 염산 10㎕를 가하고 37℃에서 15분간 반응시켜 단백질 활성을 제거하고, 원심분리하고 상등액 15 내지 20㎕를 실리카 겔 60F254 박막 크로마토그래피 판위에 점적하여 메발로네이트 표준(락톤 형태)과 비교하여 Rf값이 0.2 부근인 밴드를 잘라 신틸레이션 카운팅하였다. 활성도는 1분 반응당 마이크로좀 단백질 1㎎이 생성되는 메발로네이트의 양을 pmole로 나타내었다.The method of Sapiro etc. was modified. That is, NADPH 500 nmole, inhibitor samples 0, 1, 10, 50 or 100 ㎍ and buffer solution (0.1M triethanolamine, 0.02M EDTA) were mixed to a total volume of 60 μl and pre-reacted at 37 ° C. for 5 minutes. 50 mgole of HMG-CoA (Sigma Chemical Company) was added thereto, followed by reaction at 37 ° C. for 15 minutes, 10 μl of 6N hydrochloric acid was added thereto, and reaction at 15 ° C. for 15 minutes to remove protein activity, centrifugation, and supernatant 15 to 20. [Mu] l was dropped onto a silica gel 60F254 thin film chromatography plate and scintillation counted by cutting out a band with an R f value near 0.2 compared to the mevalonate standard (lactone form). Activity was expressed as pmole the amount of mevalonate produced 1 mg of microsomal protein per minute reaction.
그 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.The results are shown in Table 3 below.
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 0.1% 나린진 투여시, 쥐의 간 속의 HMG-CoA 환원효소 활성도는 25% 감소하였다. 또한, 0.1% 나린제닌 투여는 HMG-CoA 환원효소 활성을 31% 감소시켰다.As can be seen in Table 3, administration of 0.1% naringin reduced HMG-CoA reductase activity in rat liver by 25%. In addition, administration of 0.1% naringenin reduced HMG-CoA reductase activity by 31%.
실시예 4: 나린진의 토끼 동맥경화증 예방 효과Example 4 Preventing Rabbit Arteriosclerosis of Naringin
뉴질랜드 흰 토끼(1.5 내지 2월령, 2.0 내지 2.5㎏, Covance, U.S.A.) 암컷 44 마리를 오전 8시부터 오후 6시까지 광조건하에 사육하면서 8 개의 그룹으로 나누고, 각 그룹의 토끼들에게 표 4에 기재된 조성에 따라 고콜레스테롤 동물사료(Oriental Yeast Co., 일본)에 콜레스테롤 및, 나린진 또는 로바스타틴이 함유된 고콜레스테롤 식이를 8주 동안 섭취시켰다. 이때, 나린진 및 나린제닌은 미국의 시그마사(Sigma Chemical company, St. Louis, Mo)로부터 구입하였고, 로바스타틴은 중외제약에서 구입하였다.Forty-four female New Zealand white rabbits (1.5-February age, 2.0-2.5kg, Covance, USA) were bred under 8 hours in the light conditions from 8 am to 6 pm and divided into eight groups. Depending on the composition, high cholesterol animal feed (Oriental Yeast Co., Japan) was fed a high cholesterol diet containing cholesterol and naringin or lovastatin for 8 weeks. At this time, naringin and naringenin were purchased from Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo, USA, and lovastatin was purchased from Sino Pharmaceutical.
8개 그룹의 토끼를 희생시키고 에스퍼 등(Esper E. et al.,J. Lab. Clin. Med.,121, 103-110 (1993))의 방법에 따라 대동맥을 대동맥판의 1㎝ 상방으로부터 흉부 대동맥까지 방광주위의 지방이 보이지 않도록 하면서 복부 중앙에 절개한 후 접시위에 핀으로 고정하였다. 수분이 있는 상태의 조직을 사진촬영한 후 무수 프로필렌 글리콜로 2분씩 3회 세척하고 프로필렌 글리콜에 녹인 오일 레드 오(Oil Red O, ORO)의 포화용액으로 지방을 염색하였다. 염색 30분후 조직을 85% 프로필렌 글리콜로 세척하여 여분의 염색용액을 제거하고 물로 세척한 후 사진촬영을 하고 사진을 투사(tracing)하여 지방선의 축적면적을 전체 대동맥의 면적에 대한 백분률로 계산하였다. 대동맥의 일부는 헤모시아닌 및 에오신(H&E) 및 마손의 삼색 염색법(Masson's trichrome stain)에 따라 염색한 후 광학현미경하에서 혈관내막(intima), 내부(internal), 외탄력판(elastic lamina), 중간(media)에서 각각 죽상경화반의 침식이 있는지를 관찰하였다.Eight groups of rabbits were sacrificed and the aorta was resected from 1 cm above the aortic valve according to the method of Esper E. et al., J. Lab. Clin. Med. , 121 , 103-110 (1993). The incision was made in the middle of the abdomen with no visible fat around the bladder until it was fixed with a pin on the plate. After photographing the tissue in the moisture state and washed three times with anhydrous propylene glycol 2 minutes and stained fat with a saturated solution of oil red O (ORO) dissolved in propylene glycol. Thirty minutes after staining, tissue was washed with 85% propylene glycol to remove excess dye solution, washed with water, photographed and tracing to calculate the accumulation area of fat gland as a percentage of the total aortic area. . A portion of the aorta was stained according to hemocyanin and eosin (H & E) and Masson's trichrome stain, and then under the light microscope, intima, internal, elastic lamina, intermediate In each media, the presence of atherosclerotic plaques was observed.
그 결과, 콜레스테롤과 나린진, 또는 콜레스테롤과 로바스타틴이 투여된 토끼는 콜레스테롤만이 투여된 토끼의 경우에서보다 동맥내의 플라크 형성이 현저하게 감소하였다. 이중 1% 콜레스테롤이 투여된 토끼, 1% 콜레스테롤과 0.5% 나린진이 투여된 토끼 및 1% 콜레스테롤과 20㎎/㎏ 로바스타틴이 투여된 토끼의 동맥사진은 각각 도 1a, 1b 및 1c에 나타내었다. 도 1a 내지 1c로부터 보듯이, 1% 콜레스테롤이 투여된 토끼의 동맥에는 대식세포와 지질 등의 두꺼운 층이 형성되는데 반하여 1% 콜레스테롤과 0.5% 나린진이 투여된 토끼와 1% 콜레스테롤과 20㎎/㎏ 로바스타틴이 투여된 토끼의 동맥에는 대식세포와 지질 등의 두꺼운 층이 형성되지 않았다. 따라서 나린진과 로바스타틴은 동맥경화의 예방효과가 우수함을 알 수 있다.As a result, rabbits administered cholesterol and naringin, or cholesterol and lovastatin, had significantly reduced plaque formation in the arteries than in rabbits administered only cholesterol. Arterial photographs of rabbits administered 1% cholesterol, rabbits administered 1% cholesterol and 0.5% naringin, and rabbits administered 1% cholesterol and 20 mg / kg lovastatin were shown in FIGS. 1A, 1B and 1C, respectively. As shown in Figures 1a to 1c, a thick layer of macrophages and lipids is formed in the arteries of rabbits administered 1% cholesterol, whereas rabbits administered 1% cholesterol and 0.5% naringin, 1% cholesterol and 20mg / kg There was no thick layer of macrophages and lipids in the arteries of rabbits administered lovastatin. Therefore, naringin and lovastatin can be seen to be excellent in preventing the atherosclerosis.
토끼 혈장 속의 총콜레스테롤, 중성 지질, HDL은 실시예 2에서와 동일한 방법으로 측정하였다.Total cholesterol, neutral lipids, and HDL in rabbit plasma were measured in the same manner as in Example 2.
그 결과는 하기 표 5에 나타나 있다.The results are shown in Table 5 below.
표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 0.1 내지 0.5% 나린진 투여시, 토끼의 동맥경화 예방효과가 탁월하였다. 그러나 로바스타틴은 토끼의 동맥경화 예방효과는 우수하지만 혈장 크레아틴 키나제(CK)가 증가하고 과량 투여시 동물에 대한 독성 가능성이 나타났다.As can be seen in Table 5, the administration of 0.1 to 0.5% naringin, the anti-arteriosclerosis preventive effect of the rabbit was excellent. However, lovastatin has an excellent protective effect on atherosclerosis in rabbits, but the plasma creatine kinase (CK) is increased, and overdose has the potential to be toxic to animals.
이러한 결과를 종합하면, 나린진은 동맥경화증의 발생을 억제하는 작용이 있어 동맥경화증을 예방한다는 것을 알 수 있다.Taken together, these findings suggest that naringin prevents the development of atherosclerosis, thereby preventing atherosclerosis.
실시예 5: 나린진의 경구독성실험Example 5: Oral Toxicity of Naringin
7-8 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 체중 25-29 g의 암컷 6마리와 체중 34-38 g의 숫컷 6 마리를 온도 22±1 ℃, 습도 55±5 %, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1 주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫드용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유섭취시켰다.Specific pathogens free of 7-8 weeks of age, 6 females weighing 25-29 g and 6 males weighing 34-38 g, temperature 22 ± 1 ° C, humidity 55 ± 5%, illumination 12L / 12D was bred in the animal room. Mice were allowed to acclimate for about a week before being used for the experiment. Feed for experimental animals (Jeil Jedang Co., Ltd., mice and rats) and drinking water were supplied after sterilization and free ingestion.
나린진을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 100 mg/ml 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g 당 0.2 ml씩 경구투여하였다. 시료는 1회 경구투여하였으며 투여 후 10 일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 10일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 나린진에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.Naringin was prepared at a concentration of 100 mg / ml using 0.5% Tween 80 as a solvent, followed by oral administration of 0.2 ml per 20 g of mouse body weight. Samples were administered orally once and observed for side effects or lethality for 10 days after administration. That is, on the day of dosing, changes in general symptoms and the presence or absence of dead animals were observed at least once in the morning, at least 1 pm, 4 hours, 8 hours, 12 hours, and the next day until the 10th day of administration. In addition, the animals were killed and dissected at 10 days of administration, and the internal organs were visually examined. Changes in body weight were measured at daily intervals from the day of administration to observe the weight loss of animals caused by naringin.
본 실험은 나린진에 대하여 경구경로에서의 급성독성의 정도를 파악함으로써 일반약리 및 약효시험에서의 가용 약용량에 대한 정보를 제공하고 독성에 대한 기초 자료를 도출함을 목적으로 실시하여 아래와 같은 결과를 얻었다.The purpose of this experiment was to provide information on available drug doses in general pharmacology and drug efficacy tests and to derive basic data on toxicity by identifying the degree of acute toxicity in oral routes of naringin. Got it.
급성 경구독성의 경우는 나린진 1,000 mg/kg의 약용량에서 10일동안 치사동물이 관찰되지 않았다. 10일 후 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.In acute oral toxicity, no lethal animals were observed for 10 days at the dose of 1,000 mg / kg naringin. An autopsy of the surviving animals was performed 10 days later, and there were no gross lesions, and normal body weight gain was observed without any weight loss for 10 days from the day after the administration.
결론적으로, 나린진은 상기의 농도로 경구투여시 독성이 관찰되지 않았다.In conclusion, naringin was not toxic upon oral administration at the above concentrations.
하기 제제예는 본 발명의 제제를 예시하는 것일 뿐 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The following formulation examples are merely illustrative of the formulation of the present invention and do not limit the scope of the invention.
제 제 예My example
다음의 성분들을 이용하여 경질 젤라틴 캅셀을 제조하였다:Hard gelatin capsules were prepared using the following ingredients:
양(mg/캅셀)Amount (mg / capsule)
활성 성분(나린진) 200Active Ingredients (Naringin) 200
비타민 C 120Vitamin C 120
담체 또는 부형제(전분, 락토스, 펙틴 등) 160Carriers or excipients (starch, lactose, pectin, etc.) 160
스테아르산 마그네슘 20Magnesium Stearate 20
총 500 mg500 mg total
상기 성분들을 완전히 혼합하여 총 500 mg의 양으로 경질 젤라틴 캅셀에 채웠다. 상기 조성물은 또한 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 이 조성물을 이용하여 일반적으로 널리 알려진 방법에 따라 정제, 과립제, 분제, 마이크로캅셀, 드링크제 등의 각종 경구용 제제를 제조할 수 있다.The ingredients were mixed thoroughly and filled into hard gelatin capsules in a total amount of 500 mg. In addition to vitamin C, the composition may further include other health-friendly ingredients, and the composition may be used to prepare various oral preparations, such as tablets, granules, powders, microcapsules, and drinks, according to generally known methods. can do.
나린진 또는 나린제닌을 포함하는 조성물은 동물체내의 혈중 콜레스테롤의 양을 현저히 감소시키면서 혈장 크레아틴 키나제의 증가의 부작용이 없고 독성이 없어 동맥경화증 예방 및 치료에 매우 유용하다.Compositions containing naringin or naringenin are very useful for the prevention and treatment of atherosclerosis due to the significant decrease in the amount of blood cholesterol in the animal body and no side effects of an increase in plasma creatine kinase and no toxicity.
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