KR19990076437A - Vaccine for the prevention and treatment of diseases related to Hericobacter pylori - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤리코박터 피로리의 항원 단백질인 어드헤신(adhesin)과 애쥬번트(adjuvant)로서 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 균의 톡신 중 A2, B 서브유니트가 연결된 키메라 단백질(chimeric protein)을 유효성분으로 포함하는 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다. 상기 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리균을 중화시킬 수 있는 특이적인 항체를 유발시킴으로써, 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for screening a chimeric protein linked with A2 and B subunits of toxin of Vibrio cholerae as an adjuvant with adhesin as an antigen protein of Helicobacter pylori as an active ingredient And a vaccine for preventing and treating Helicobacter pylori-related diseases. The chimeric protein can be used as an effective ingredient in the production of a diagnostic reagent for Helicobacter pyroliosis or a vaccine for the prevention or treatment of a disease associated with Helicobacter pylori by inducing a specific antibody capable of neutralizing Helicobacter pylori bacteria .

Description

헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신Vaccine for the prevention and treatment of diseases related to Hericobacter pylori

본 발명은 헤리코박터 피로리(Helicobacter pylori) 관련 질환의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 헤리코박터 피로리의 항원 단백질인 어드헤신(adhesin)과 애쥬번트(adjuvant)로서 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 균의 톡신 중 A2, B 서브유니트가 연결된 키메라 단백질(chimeric protein)을 유효성분으로 포함하는 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다.The present invention relates to a vaccine for the prevention and treatment of Helicobacter pylori-related diseases. More specifically, the present invention relates to a vaccine composition comprising Adicin, an antigenic protein of Helicobacter pylori, A2 as a adjuvant, Vibrio cholerae toxin, A2 chimeric protein linked to a B subunit protein as an active ingredient. The present invention also relates to a vaccine for the prevention and treatment of Helicobacter pylori-related diseases.

위염 및 위십이지장궤양 등의 위염관련 질병은 여러가지 원인에 의하여 유발될 수 있지만, 위점막의 상피세포간 접합부에 서식하는 헤리코박터 피로리에 의해서 주로 야기된다. 지역적인 차이는 있으나 아시아인의 90% 이상, 유럽인의 60% 이상이 헤리코박터 피로리 균에 감염되어 있고, 또한 위염 및 위십이지장궤양은 화학요법제에 의한 치료 후에도 약물에 대하여 내성을 가지는 헤리코박터 피로리 균에 의하여 재발되며, 결국 여러해 지나 위암으로 진행된다고 알려져 있다(참조: Timothy, et al., ASM News, 61:21(1995)).Gastritis related diseases such as gastritis and gastroduodenal ulcers can be caused by various causes, but they are mainly caused by Helicobacter pylori in the epithelium junction of gastric mucosa. Although there are regional differences, more than 90% of Asians and more than 60% of Europeans are infected with Helicobacter pylori, and gastritis and stomach duodenal ulcer are treated with a herbal drug resistant to chemotherapy It is known that it recurs by the nose pterorrhoeae and eventually progresses to gastric cancer (see Timothy, et al., ASM News, 61:21 (1995)).

이와 같이 헤리코박터 피로리 균에 의해 유발되는 위염 관련 질병을 치료하기 위해서, 종래에는 항생제 또는 항궤양제를 포함한 여러가지 화학요법제 등을 사용하여 왔으나, 이들 약물은 장점막의 투과에 한계가 있었고, 내성균의 현저한 증가, 감염 재발, 약물 부작용 등을 일으키는 문제점이 있었다. 따라서, 헤리코박터 피로리 균을 화학요법이 아닌 면역요법 등으로 제거할 수 있는 신규한 약물의 개발이 절실히 요구되었다. 그리하여, 최근에는 상기 문제점들을 해결하고자 헤리코박터 피로리 균에 대한 백신(vaccine) 개발이 시도되고 있다. 즉, 지금까지 밝혀진 헤리코박터 피로리의 항원결정기를 코딩하는 유전자인 우레아제(urease)(참조: Timothy, et al., Infection and Immunity, 59:1264(1991)), 플라겔라(flagella)(참조: Leying, et al., Molecular Microbiology, 6:2863(1992)), 어드헤신(adhesin)(참조: Evans, et al., Journal of Bacteriology, 175:674 (1993)), 슈퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase)(참조: Christiane, et al., Infection and Immunity, 61:5315(1993)), 카탈라제(catalase), 액포형성 사이토톡신(vacuolating cytotoxin)(참조: Timothy, et al., Infection and Immunity, 58:603(1990)) 유전자 등을 이용한 헤리코박터 피로리 균주의 진단과 예방 백신 등이 개발되어 전임상 단계에 있으나, 다음과 같은 단점을 가지고 있기 때문에 아직까지는 제품화되지 못하고 있다: 우레아제 유전자를 이용한 백신은 면역원성이 약하고; 액포형성 사이토톡신 유전자를 이용한 백신은 면역원성이 뛰어나나, 사이토톡신 자체의 독성이 문제가 될 수 있으며; 액포형성 사이토톡신의 비독성 부분(non-toxic varient) 유전자를 이용한 백신은 이 유전자가 모든 헤리코박터 피로리 균에 존재하는 것이 아니기 때문에, 모든 헤리코박터 피로리 균에 대하여 약효를 발휘할 수 없고; 어드헤신 유전자를 이용한 백신은 면역원성이 뛰어나나, 분비성 면역글로불린(secretory IgA: sIgA)의 생성을 촉진하지 못하여 백신으로서의 효능이 저하된다.In order to treat gastritis-related diseases caused by Helicobacter pylori bacteria, various chemotherapeutic agents including antibiotics or anti-ulcer agents have been conventionally used. However, these drugs have limitations on the permeation of intestinal mucosa, Causing a significant increase in resistant bacteria, recurrence of infection, adverse drug reactions, and the like. Therefore, it is urgently required to develop a novel drug capable of eliminating Hericobacter pyrolium by immunotherapy instead of chemotherapy. Thus, in recent years, attempts have been made to develop a vaccine against Helicobacter pylori to solve the above problems. That is to say, the urease (see: Timothy, et al., Infection and Immunity, 59: 1264 (1991)), the flagella (see, for example, (Leying et al., Molecular Microbiology, 6: 2863 (1992)), adhesins (Evans, et al., Journal of Bacteriology, 175: 674 (1993)), superoxide dismutase catalase, vacuolating cytotoxin (see Timothy, et al., Infection and Immunity, 58: 539 (1993)), : 603 (1990)) genes and the like have been developed and are in pre-clinical phase but have not yet been commercialized because they have the following disadvantages: Vaccine using urease gene Are weakly immunogenic; Vaccines using the vacuole-forming cytotoxin gene are excellent in immunogenicity, but toxicity of cytotoxin itself may be a problem; Since the vaccine using the non-toxic variant gene of the vacuole-forming cytotoxin is not present in all the H. pylori bacteria, it can not exert its effect on all H. pylori bacteria ; Vaccines using the adhesin gene are excellent in immunogenicity, but do not promote the secretory IgA (sIgA) production, and their efficacy as a vaccine is lowered.

아울러, 헤리코박터 피로리 균은 위점막의 상피세포간 접합부에 서식하고 있기 때문에, 체액성 면역글로불린보다는 분비성 면역글로불린에 의하여 균이 제거되는데, 상기와 같은 백신은 장점막을 쉽게 투과하지 못하여 점액성 면역계(mucosal immune system)를 자극하지 못하므로, 분비성 면역글로불린(slgA)의 생성을 촉진하는 기능이 저하되어, 헤리코박터 피로리 균에 대한 면역효과가 감소되고, 또한 위산(pH 1∼2)에 의하여 쉽게 변성되어 활성이 떨어진다는 심각한 문제점을 가지고 있었다.In addition, since Herikobacteri pyroi is inhabited at the junction of epithelial cells of the gastric mucosa, the germ is removed by the secretory immunoglobulin rather than the humoral immunoglobulin. Such a vaccine does not easily penetrate the intestinal mucosa, The ability to stimulate the secretory immunoglobulin (slgA) is reduced, the immune effect against Helicobacter pylori is reduced, and the gastric acid (pH 1 to 3) 2), and thus the activity was deteriorated.

이와 같이 헤리코박터 피로리 유전자를 단독으로 이용하여 개발된 백신은 전술한 여러가지 단점을 가지고 있었기 때문에, 본 발명자들은 장점막을 쉽게 투과해서 점액성 면역계을 자극하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 유발시키는 기능을 가지는 단백질이 융합파트너로 결합된 키메라 단백질을 제조하여 이를 백신으로 이용하고자 하였다.Since the vaccine developed using the Helicobacter pylori gene alone has various disadvantages as described above, the inventors of the present invention can easily transmit the intestinal mucosa to stimulate the mucosal immune system to induce the secretory immunoglobulin (sIgA) And a fusion protein with a fusion partner were prepared and used as a vaccine.

우선, 본 발명자들은 상기와 같은 기능을 나타내는 융합파트너의 탐색 도중에 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 하기와 같은 특징에 주목하였다. 비브리오 코레라이 톡신 유전자는 A1, A2, B의 3가지 서브유니트로 구성되어 있는데, A1 서브유니트 유전자는 톡신 단백질의 독성을 나타내는 부분이며, A2 및 B 서브유니트는 숙주세포에 결합하여 sIgA 생성을 촉진시키고 주위 환경에 대한 단백질의 안정성을 증진시키는 부분이다. 또한, 코레라 톡신 유전자 전체(intact cholera toxin)를 융합파트너로 이용한 각종 백신은 A1 서브유니트의 독성 때문에 사람에게 직접 사용하지 못하는 반면, 비브리오 코레라이 톡신 유전자 중 A2, B 서브유니트를 이용하여 제조된 백신은 사람에게 사용될 수 있어 매우 유용하다. 아울러, 비브리오 코레라이 A2, B 서브유니트를 융합파트너로 이용하여 제조한 백신에 대한 연구결과로서, 비브리오 코레라이 A2, B 서브유니트에 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 어드헤신 유전자(adhesin gene)를 결합시켜 키메라 단백질을 제조한 다음, 이를 경구용 백신으로 투여하면, 분비성 면역글로불린(sIgA) 및 체액성 면역글로불린(serum IgG)의 생성이 촉진된다고 보고되었다(참조: Hajishengallis, et al., The Journal of Immunology, 154: 4322(1995)).First, the present inventors paid attention to the following characteristics of the Vibrio choloritoxin gene during the search for a fusion partner exhibiting the above functions. The Vibrio cholera toxin gene is composed of three subunits of A1, A2 and B, the A1 subunit gene is a part of toxin protein toxicity, A2 and B subunits bind to host cells to promote sIgA production And enhance the stability of the protein to the surrounding environment. In addition, various vaccines using intact cholera toxin as a fusion partner can not be directly used in humans due to the toxicity of the A1 subunit, whereas the vaccine produced using the A2, B subunit of the vibrio cholera toxin gene Vaccines are very useful because they can be used by humans. In addition, as a result of a study on a vaccine prepared using Vibrio cholera A2 and B subunit as fusion partners, Vibrio cholera A2, an adhesin gene of Streptococcus mutans in B subunit, (SIgA) and humoral immunoglobulin (serum IgG) is promoted by administering the chimeric protein to a subject, and then administering it as an oral vaccine (see Hajishengallis, et al. The Journal of Immunology, 154: 4322 (1995)).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 최초로 헤리코박터 피로리의 항원단백질 중 어드헤신과 애쥬번트로서 비브리오 코레라이 톡신 중 A2, B 서브유니트를 연결시킨 키메라 단백질이 헤리코박터 피로리에 대한 우수한 면역원성을 나타내며, 위내의 환경에 안정하고, 장점막을 쉽게 투과하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 촉진시킴으로써, 전술한 종래 백신의 문제점을 해결하여 헤리코박터 피로리 관련 질환에 대한 효과적인 백신으로 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have found that a chimeric protein, which is the first to bind A2 and B subunits of Vicriothelithoxin as an adjunct with adicin among the antigenic proteins of Helicobacter pylori, exhibits excellent immunogenicity against Helicobacter pylori, (SIgA) by promoting the secretory immunoglobulin (sIgA) by permeating the intestinal mucosa through the intestinal environment, thereby solving the problems of the conventional vaccine described above, and thus being able to be used as an effective vaccine against Herikobacter pyroliosis-related diseases And finally completed the present invention.

결국, 본 발명의 주된 목적은 헤리코박터 피로리 균의 어드헤신과 애쥬번트로서 비브리오 코레라이 균의 톡신 중 A2, B 서브유니트를 연결시킨 키메라 단백질을 이용한 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신을 제공하는 것이다.As a result, the main object of the present invention is to provide a method for preventing and treating Helicobacter pylori-related diseases using a chimeric protein comprising A2 and B subunits of toxin of Vibrio cholerae as an adenylate and adjuvant of Helicobacter pylori, And to provide a therapeutic vaccine.

도 1은 헤리코박터 피로리의 어드헤신(adhesin) 유전자와 비브리오 코레라이 톡신(toxin)의 A2, B 서브유니트 유전자를 연결한 DNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA linked with the A2, B subunit gene of Adherin gene of Helicobacter pylori and Vibrio choloritoxin (toxin) and the amino acid sequence translated therefrom.

도 2는 헤리코박터 피로리 어드헤신의 발현벡터 pHA022를 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.FIG. 2 is a diagram schematically illustrating the process of constructing the expression vector pHA022 of Helicobacter pyrroleadhesin.

도 3은 플라스미드 pTE105, 융합 유전자 및 발현벡터 pHA022를 제한효소 DsaI, PstI으로 각각 절단하고 1% 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.Fig. 3 is a photograph showing the result of digesting plasmid pTE105, a fusion gene and an expression vector pHA022 with restriction enzymes DsaI and PstI, respectively, and performing 1% agarose gel electrophoresis.

도 4는 발현벡터 pHA022로 형질전환된 대장균의 세포파쇄액을 15% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다.4 is a photograph showing the result of 15% SDS-PAGE of a cell lysate of E. coli transformed with the expression vector pHA022.

도 5는 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질과 어드헤신으로 면역화시킨 마우스의 혈청내 IgG 생성을 비교한 크로마토그램이다.FIG. 5 is a chromatogram comparing IgG production in serum of mice immunized with adhesin / CTXA2B chimeric protein and adefycin.

도 6은 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질과 어드헤신으로 면역화시킨 마우스의 위액 추출물내의 분비성 IgA 생성을 비교한 크로마토그램이다.Figure 6 is a chromatogram comparing the production of secretory IgA in the gastric juice extract of Adhesin / CTXA2B chimeric protein and mice immunized with adhecins.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described more specifically.

본 발명자들은 헤리코박터 피로리에 대한 항체생산을 촉진하기 위하여 면역원성이 우수한 헤리코박터 피로리의 어드헤신 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 A2B 유전자를 유전적으로 연결시켜 키메라 단백질을 제조하고 이를 헤리코박터 피로리균에 대한 백신으로 사용하고자 하였다. 즉, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 헤리코박터 피로리 어드헤신 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2, B 서브유니트 유전자를 각각 제조한 다음, 각 단편 유전자를 제한효소 EcoRI으로 절단하고, T₄DNA 연결효소로 두 유전자를 결합시켰다. 이렇게 연결된 융합유전자를 제한효소 DsaI 및 PstI으로 절단하고, pTE105 플라스미드(참조: 대한민국 특허 제 102993호, KCCM-10027)에 삽입하여 발현벡터 pHA022를 구축하고, 전기 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 재조합 대장균 DW/HP-222(Escherichia coli DW/HP-222, KCCM-10078)을 제조하였다(참조: 대한민국 특허공개 제 97-59278호). 그런 다음, 전기 재조합 대장균을 배양하여 헤리코박터 피로리의 어드헤신과 비브리오 코레라이 톡신의 A2, B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 수득하였다.To facilitate the production of antibodies against Helicobacter pylori, the present inventors prepared chimeric proteins by genetically linking the Adhesin gene of Helicobacter pyroeli with excellent immunogenicity to the Vibrio choloritoxin A2B gene, To be used as a vaccine. That is, the A2 and B subunit genes of Hericobacter pyrolidhesin gene and the Vibrio choloritoxin gene were prepared by polymerase chain reaction (PCR), respectively, and then the respective fragment genes were digested with restriction enzyme EcoRI , And the two genes were ligated with T ₄ DNA ligase. The fusion gene thus ligated was digested with restriction enzymes DsaI and PstI, inserted into pTE105 plasmid (Korean Patent No. 102993, KCCM-10027) to construct an expression vector pHA022, and E. coli was transformed with an expression vector to obtain recombinant Escherichia coli DW / HP-222 (Escherichia coli DW / HP-222, KCCM-10078) was prepared (Korean Patent Publication No. 97-59278). Then, the electro-recombinant E. coli was cultured to obtain a chimeric protein in which the A2, B subunits of adicin and vibrio cholorithoxin of Hericobacter pyroi were fused.

이에, 전기 키메라 단백질을 'Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질'이라 명명하고, 전기 키메라 단백질의 항체생성율 및 헤리코박터 피로리균에 대한 백신으로서의 효과를 조사하였다. 그 결과, 전기 키메라 단백질은 항체 생성율에 있어서, 종래의 어드헤신 단백질을 이용한 백신이 분비성 면역글로불린의 생성을 촉진하지 못하는 단점을 극복하여, 전기 키메라 단백질로 면역화시킨 마우스는 어드헤신 단독 단백질을 투여한 마우스보다 3배이상의 분비성 면역글로불린을 생성하였다. 또한, 전기 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질로 면역화시킨 마우스는 헤리코박터 피로리균에 감염 예방율 90%를 나타내는 데 비해, 대조군 마우스와 어드헤신 단독 단백질로 면역화시킨 마우스는 0% 및 30%의 감염 예방율을 나타내어, 헤리코박터 피로리 관련 질환의 백신으로 사용될 수 있음을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헤리코박터 피로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.Thus, the electrochimeric protein was named 'Adhesin / CTXA2B chimeric protein', and the antibody production rate of the electrochimeric protein and the effect of the vaccine against Helicobacter pylori were examined. As a result, the electrochimeric protein overcomes the disadvantage that the vaccine using conventional adhecin protein does not promote the secretory immunoglobulin production in the antibody production rate, and the mouse immunized with the electrochimeric protein is administered with adhehesin alone protein Secretory immunoglobulin 3 times more than one mouse. In addition, mice immunized with the electrical Adhesin / CTXA2B chimeric protein showed 90% inhibition of infection with Helicobacter pylori, whereas mice immunized with the control mice and adeshesin alone protein showed 0% and 30% , Indicating that it can be used as a vaccine against a disease related to Hericobacter pylori. Accordingly, the Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention can be used as an effective ingredient in the preparation of a diagnostic reagent for Helicobacter pyroliosis or a vaccine for the prevention or treatment of Helicobacter pylori-related diseases, It can also be used for antibody production.

본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 점액성 면역반응(mucosal immune response)을 자극함으로써, 항-adhesin IgA 항체 및/또는 임파구를 위점막으로 침투시켜 헬리코박터 피로리의 감염을 예방하거나, 기 감염된 헬리코박터 피로리를 제거한다. 따라서, 본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 헬리코박터 피로리에 감염되지 않은 상태에서 감염예방을 목적으로 또는, 헬리코박터 피로리에 감염된 경우 헬리코박터 피로리 제거 및 헬리코박터 피로리 관련 질환을 치료할 목적으로 투여할 수 있다. 이때, 헤리코박터 피로리 관련 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위암 등을 포함한다.The Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention stimulates the mucosal immune response to prevent infection of Helicobacter pylori by infiltrating anti-adhesin IgA antibodies and / or lymphocytes into the gastric mucosa, . Therefore, the Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention can be administered for the purpose of preventing infection in a state not infected with Helicobacter pylori or treating Helicobacter pylori-related diseases and Helicobacter pylori-related diseases when infected with Helicobacter pylori. At this time, the Hericobacter pyroliosis-related diseases include gastritis, gastric ulcer, duodenal ulcer, stomach cancer and the like.

본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 액제, 정제, 캡슐제, 과립제 등 통상적인 경구투여용 제형으로 제조한 후 경구투여할 수 있는데, 이러한 경구투여용 제형에는 이탄산나트륨, 이탄산칼륨 및 인산화나트륨 등과 같이 약학적으로 허용할 수 있는 완충제를 첨가함으로써 위액의 pH를 높이거나 중화시켜 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질을 안정하게 보호할 수 있으며, 안정화제, 감미제 등 약학적으로 허용할 수 있는 여러가지 담체들을 첨가하여 제조할 수 있다.The Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention may be formulated into a conventional oral dosage form such as a liquid, a tablet, a capsule, and a granule, and then administered orally. Such an oral dosage form includes sodium carbonate, potassium potassium phosphate and sodium phosphate By adding a pharmaceutically acceptable buffer, the pH of the gastric juice can be increased or neutralized to stably protect the Adhesin / CTXA2B chimeric protein, and various pharmaceutically acceptable carriers such as stabilizers and sweeteners can be added Can be manufactured.

또한, 다른 항생제 등을 첨가함으로써 헬리코박터 피로리 감염의 예방 및 제거를 용이하게 할 수도 있으며, 여러가지 항궤양제들을 첨가함으로써 위염 또는 위,십이지장 궤양의 치료기간을 단축할 수도 있다.In addition, the addition of other antibiotics may facilitate the prevention and elimination of Helicobacter pylori infection and may reduce the period of treatment of gastritis or stomach and duodenal ulcers by adding various anti-ulcer agents.

본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질의 투여량은 일반적으로 60kg의 체중을 가진 성인을 기준으로 1일 1회 투여로 10㎍ 내지 1,000㎎으로 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 결정될 수도 있다.The dose of the Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention is preferably 10 μg to 1,000 mg administered once a day on the basis of an adult having a body weight of 60 kg, It may be determined by the experience of the owner.

한편, 필요한 경우 1주일 또는 2주일 간격으로 재투여함으로써 추가항원 자극반응(booster reaction)을 유도할 수 있는데, 추가항원자극의 양(booster dose)은 최초 투여량과 동일하거나 또는 그 이하로 투여할 수 있다.On the other hand, if necessary, re-dosing can be induced at one or two week intervals to induce an additional booster reaction. The booster dose of the additional antigen will be administered at the same or less than the initial dose .

본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질을 10마리의 마우스에 경구투여한 결과, LD₅₀가 4g/kg 이상으로 나타나, 유효량의 범위에서 본 발명의 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질이 안전한 약물임을 알 수 있었다.The Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention was orally administered to 10 mice. As a result, it was found that the LD ₅₀ was 4 g / kg or more, and the Adhesin / CTXA2B chimeric protein of the present invention was a safe drug in the effective amount range.

한편, 본 발명의 헤리코박터 피로리의 어드헤신 유전자, 비브리오 코레라이 톡신유전자 및 이들로부터 번역되는 단백질을 기술함에 있어, "기능적 등가물" 이란 표현은 키메라 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, "기능적 등가물"이라 함은 융합유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.On the other hand, the expression " functional equivalents " in describing the adeshesin gene, the vibrio choloritoxin gene and the protein translated therefrom of the present invention of the present invention includes Gly, Ala, Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; And Phe, Tyr, and the like. Further, in the nucleotide sequence of the present invention, the term " functional equivalent " means all genes having a nucleotide sequence capable of providing an amino acid of an electric combination in the nucleotide sequence of the fusion gene.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

실시예 1: 헤리코박터 피로리의 염색체 DNA 분리Example 1: Chromosomal DNA isolation of Helicobacter pylori

헤리코박터 피로리 11637 RPH 13487(ATCC 43504)를 소혈청이 5% 첨가된 BHI(brain heart infusion) 액체배지(반코마이신(vancomycin) 10mg/ml, 트리메토프림(trimetofrim) 5mg/ml, 앰포테리신 비(amphotericin B) 4mg/ml로 구성된 배지)에 10% CO₂배양기에서 72시간 배양한 다음, 통상적인 방법으로 염색체 DNA를 분리하였다.Helicobacter pylori 11637 RPH 13487 (ATCC 43504) was inoculated into a brain heart infusion (BHI) medium (vancomycin 10 mg / ml, 5 mg / ml trimetofrim, 5% bovine serum, (Amphotericin B) 4 mg / ml) for 72 hours in a 10% CO ₂ incubator, and then chromosomal DNA was isolated by a conventional method.

실시예 2: 올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 분석Example 2 Synthesis, Purification and Analysis of Oligonucleotides

헤리코박터 피로리의 어드헤신 유전자 증폭(하기 실시예 3)에 사용되는 하기와 같은 37머(mer)와 30머(mer) 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:The following 37 mer and 30 mer oligonucleotides used in Aheshin gene amplification of Helicobacter pylori (Example 3 below) were synthesized:

5'-CCGTGGCTCAAGCTGAATGGAAAAAATGCCTTTTAGG-3'5'-CCGTGGCTCAAGCTGAATGGAAAAAATGCCTTTTAGG-3 '

5'-AGAATTCTCGGTTTCTTTTGCCTTTTAATT-3'5'-AGAATTCTCGGTTTCTTTTGCCTTTTAATT-3 '

아울러, 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2, B 서브유니트 유전자증폭(하기 실시예 3)에 사용되는 하기와 같은 25머(mer)와 27머(mer) 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:In addition, the following 25 mer and 27 mer oligonucleotides used in A2, B subunit gene amplification of Vibrio choloritoxin gene (Example 3 below) were synthesized:

5'-AGAATTCGAGCCGTGGATTCATCAT-3'5'-AGAATTCGAGCCGTGGATTCATCAT-3 '

5'-ACTGCAGCACATAATACGCACTAAGGA-3'5'-ACTGCAGCACATAATACGCACTAAGGA-3 '

상기에서, 올리고뉴클레오티드는 자동화된 뉴클레오티드 합성기기(Pharmacla CKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)를 이용하여 합성하였다.In the above, oligonucleotides were synthesized using an automated nucleotide synthesizer (Pharmacla CKB Biotechnology, Uppsala, Sweden).

이렇게 합성된 각 올리고뉴클레오티드는 실리카에 부착된 채로 TTD(티오페놀/트리에틸아민/디옥산=1/2/2(v/v/v)) 용액과 반응시키고, 메탄올과 에탄올로 충분히 세척한 다음, 강 암모니아수를 처리하여 실리카 매트릭스로 부터 합성 올리고뉴클레오티드를 분리시켰다. 이렇게 분리된 올리고뉴클레오티드 용액에 강 암모니아수를 추가로 가하여 50℃에서 12시간 반응시키고, 가스제거와 함께 용액을 0.5ml가 될 때까지 감압농축시켰다. 이어, 농축된 올리고뉴클레오티드는 SEP-PAK 카트리지(Waters Inc., USA)를 이용하여 아세토니트릴/트리에틸아민 완충용액으로 일차 정제하고, 15% 폴리아크릴아마이드젤(TE-붕산, pH 8.3)을 이용하여 각각 전기영동하였다. 전기영동 후, 단파장 자외선으로 올리고뉴클레오티드의 위치를 확인하여 그 부위만을 절단하였다. 그런 다음, 절단한 젤 절편에서 올리고뉴클레오티드를 추출하고, 주사기에 연결시킨 SEP-PAK 카트리지를 이용하여 아세토니트릴/트리에틸아민 완충용액으로 염을 제거하여, 각 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 정제된 각각의 올리고뉴클레오티드는 T₄폴리뉴클레오티드키나제(New England Biolabs, # 201S, USA)를 사용하여 r^_［³²P］-ATP로 표지하고, 막삼길버트 서열분석법(참조: Maxam, A.M. & Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:560-564(1977))으로 각 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하였다.Each oligonucleotide thus synthesized was allowed to react with a solution of TTD (thiophenol / triethylamine / dioxane = 1/2/2 (v / v / v)) attached to silica and sufficiently washed with methanol and ethanol , Treated with aqueous ammonia water to isolate synthetic oligonucleotides from the silica matrix. To the thus-isolated oligonucleotide solution, strong ammonia water was further added, and the mixture was allowed to react at 50 DEG C for 12 hours. The solution was concentrated under reduced pressure until the solution became 0.5 mL with gas removal. The concentrated oligonucleotide was then firstly purified with an acetonitrile / triethylamine buffer solution using a SEP-PAK cartridge (Waters Inc., USA), and eluted using a 15% polyacrylamide gel (TE-boric acid, pH 8.3) Respectively. After electrophoresis, the position of the oligonucleotide was confirmed by short wavelength ultraviolet light, and only the region was cleaved. Then, oligonucleotides were extracted from the cleaved gel slice and the salts were removed with an acetonitrile / triethylamine buffer solution using a SEP-PAK cartridge connected to a syringe to purify each oligonucleotide. The purified oligonucleotides of each nucleotide is T ₄ polynucleotide kinase (New England Biolabs, # 201S, USA) and r ^{_ [32} P] labeled and maksam Gilbert sequencing by using -ATP (see: Maxam, AM & Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 560-564 (1977)).

실시예 3: 중합효소 연쇄반응(PCR)Example 3: Polymerase chain reaction (PCR)

주형 DNA(10ng), 10㎕의 10 x Taq 중합효소 완충용액(500mM KCl, 15mM MgCl₂및 0.1%(v/v) 젤라틴을 함유한 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP를 1.25mM씩 함유), 프라이머(실시예 2에서 합성한 올리고뉴클레오티드) 2㎍씩, 0.5㎕의 Ampli Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, USA)를 혼합한 용액에 증류수를 가하여 총 부피가 100㎕되게 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해, 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 이때, 헤리코박터 피로리의 어드헤신 유전자를 증폭시키고자 하는 경우에, 주형 DNA는 실시예 1에서 분리한 헤리코박터 피로리의 염색체 DNA이고, 프라이머는 실시예 2에서 합성한 37mer와 30mer의 올리고뉴클레오티드이며; 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2, B 서브유니트 유전자를 증폭시키고자 하는 경우에, 주형 DNA는 비브리오 코레라이의 염색체 DNA이고, 프라이머는 실시예 2에서 합성한 25mer와 27mer의 올리고뉴클레오티드이다.Template DNA (10ng), 10 x Taq polymerase buffer solution (500mM KCl, 15mM MgCl ₂ and 0.1% (v / v) gelatin containing 10mM Tris-HCl, pH 8.3) , dNTP's mixture of 10㎕ of 10㎕ ( (Perkin Elmer Cetus, USA) containing 2 μg of each primer (oligonucleotide synthesized in Example 2) and 0.5 μl of Ampli Taq DNA Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA) were added to a solution of dGTP, dATP, dTTP and dCTP To give a total volume of 100 μl. To prevent evaporation of the solution, 50 mu L of mineral oil was added thereto. In this case, when amplifying the adherence gene of Helicobacter pylori, the template DNA was the chromosomal DNA of Helicobacter pyroley isolated in Example 1, and the primer was the 37mer and 30mer oligonucleotides synthesized in Example 2 ; In the case of amplifying the A2, B subunit gene of the Vibrio cholera toxin gene, the template DNA is the chromosomal DNA of Vibrio cholerae, and the primer is the 25mer and 27mer oligonucleotides synthesized in Example 2.

PCR 반응을 위하여, 온도순환기(Thermal Cycler, Cetus/Perkin- Elmer, USA)를 사용하여 변성(denaturation)(95℃, 1분), 결합(annealing) (55℃, 1분), 연장(extension)(72℃, 2분)을 30회(cycle) 진행시키고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다. 그런 다음, 중합효소를 제거하기 위하여, 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름 혼합용액(1:1(v/v))을 첨가하고 잘 혼합하여 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 소다움아세테이트, 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 혼합한 다음, 원심분리하여 이중나선의 핵산을 얻었다. 이 핵산을 20㎕의 TE완충용액에 용해시키고 추후의 실험에 사용하였다.For PCR reaction, denaturation (95 ° C for 1 minute), annealing (55 ° C for 1 minute), extension using a thermocycler (Cetus / Perkin-Elmer, USA) (72 ° C, 2 minutes) was allowed to proceed for 30 cycles, and finally the reaction was further performed at 72 ° C for 10 minutes. Then, to remove the polymerase, the same volume of phenol / chloroform mixed solution (1: 1 (v / v)) was added to the reaction mixture, mixed well and centrifuged. The supernatant was transferred to a new tube and mixed with 1/10 volume of 3M sodium acetate, 2 volumes of 100% ethanol and mixed, followed by centrifugation to obtain a double helix nucleic acid. This nucleic acid was dissolved in 20 μl of TE buffer solution and used for further experiments.

실시예 4: 발현벡터 pHA022의 제조Example 4: Preparation of expression vector pHA022

유전자의 융합을 위하여, 실시예 3에서 증폭한 헤리코박터 피로리 어드헤신 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2, B 서브유니트 유전자를 EcoRI 제한효소로 각각 절단한 다음, DNA 1㎍씩을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액(10mM DTT 및 100mM MgCl₂를 함유한 600mM Tris-HCl, pH 7.5) 3㎕, 10mM ATP 1㎕ 및 T₄DNA 연결효소(ligase) 10 단위(unit)를 가하여 전체 반응부피를 30㎕로 조정하고 14℃에서 16시간 반응시켰다. 반응물을 1% 아가로스 젤 전기영동하여 1.5kb 정도의 융합 유전자를 수득하고, 그의 염기서열을 결정하였다(참조: 도 1). 도 1에서, 염기서열 1번 부터 54번까지는 어드헤신의 신호 펩타이드(signal peptide)에 해당하는 서열이고, 염기서열 1010번 부터 1070번까지는 비브리오 코레라 B 서브유니트의 신호 펩타이드에 해당하는 서열을 나타낸다.For fusion of the gene, the Hericobacter pyrroleadessicin gene amplified in Example 3 and the A2 and B subunit genes of the Vibrio choloritoxin gene were digested with EcoRI restriction enzyme, and then 1 μg of each DNA was mixed, 3 μl of a 10-fold concentration of conjugate concentrate (600 mM Tris-HCl, pH 7.5 containing 10 mM DTT and 100 mM MgCl ₂ ), 1 μl of 10 mM ATP and 10 units of T ₄ DNA ligase were added, Was adjusted to 30 쨉 l and allowed to react at 14 째 C for 16 hours. The reaction product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to obtain a fusion gene of about 1.5 kb, and its base sequence was determined (Fig. 1). In FIG. 1, nucleotide sequences 1 to 54 correspond to the signal peptide of adhecins, and nucleotides 1010 to 1070 correspond to the signal peptide of the Vibrio cholera B subunit .

상기에서 결정된 염기서열을 가지는 융합 유전자를 제한효소 DsaI과 PstI으로 이중절단한 다음, 이를 전기 제한효소로 이중절단된 유전자 운반체 pTE105(참조: 대한민국 특허 제 102993호, KCCM-10027)에 삽입하여 환상의 플라스미드를 제조하였는데, 이를 ‘pHA022’라 명명하였다. 도 2는 발현벡터 pHA022의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.The fusion gene having the nucleotide sequence determined above was double-digested with restriction enzymes DsaI and PstI, and inserted into a gene carrier pTE105 (refer to Korean Patent No. 102993, KCCM-10027) The plasmid was named " pHA022 ". Fig. 2 is a schematic diagram showing the construction process of the expression vector pHA022.

도 3은 플라스미드 pTE105, 융합 유전자 및 발현벡터 pHA022를 제한효소 DasⅠ, PstⅠ으로 각각 절단하여, 융합유전자가 플라스미드 pTE105에 바르게 삽입되었음을 확인한 사진이다. 도 3에서, 제 1레인은 DNA 크기 마커로서의 1kb 래더(ladder)이며; 제 2레인은 플라스미드 pTE105; 제 3레인은 Adhesin 유전자; 제 4레인은 CTXA2B 유전자; 제 5레인은 Adhesin/CTXA2B 유전자; 및 제 6레인은 발현벡터 pHA022를 각각 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 융합유전자가 플라스미드 pTE105에 바르게 삽입되었음을 알 수 있었다. 아울러, 1% 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 발현벡터 pHA022는 각각의 제한효소에 대하여 단일 제한효소 부위를 가짐을 확인하였다.Fig. 3 is a photograph showing that the fusion gene was correctly inserted into the plasmid pTE105 by digesting the plasmid pTE105, the fusion gene and the expression vector pHA022 with restriction enzymes Das I and Pst I, respectively. In Figure 3, the first lane is a 1kb ladder as a DNA size marker; The second lane contained plasmid pTE105; The third lane is the Adhesin gene; The fourth lane is the CTXA2B gene; Fifth lane is the Adhesin / CTXA2B gene; And the sixth lane represent the expression vector pHA022, respectively. As shown in Fig. 3, it was found that the fusion gene was correctly inserted into the plasmid pTE105. In addition, 1% agarose gel electrophoresis was performed to confirm that the expression vector pHA022 had a single restriction enzyme site for each restriction enzyme.

실시예 5: 형질전환체의 제조Example 5: Preparation of transformants

발현벡터 pHA022를 숙주세포로 도입하기 위하여, 우선 대장균 JM101 균주를 액체 LB배지에 접종하고, 600nm에서의 흡광도 수치가 0.25 내지 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양한 다음, 세포를 수득하고 0.1M MgCl₂을 가하여 세척하였다_.이어_,원심분리하여 침전물을 수득하고_,여기에 다시 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액과 실시예 4에서 제조한 발현벡터 pHA022를 첨가하여 얼음위에서 정치시켰다_.이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일 용액에 균일하게 분산시켰다(참조: DNA Cloning Vol. I, A Practical Approach, IRL Press, 1985)_.상기에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다_. To introduce the expression vector pHA022 into the host cells, Escherichia coli strain JM101 was first inoculated into liquid LB medium and cultured at 37 DEG C until the absorbance at 600 nm reached 0.25-0.5, And then washed with MgCl _{2 . Next,} to separate to give a precipitate, and _centrifuged, again, it added to the expression vector prepared in pHA022 0.1M CaCl _2, 0.05M MgCl ₂ solution as in Example 4 herein was allowed to stand on _ice. These cells were again centrifuged and homogenously dispersed in the same solution (DNA Cloning Vol. I, A Practical Approach, IRL Press, 1985) _. All the solutions and containers used above were cooled at 0 ° C and used _.

그런 다음, 테트라사이클린 12.5㎍/㎖을 함유한 액체 LB배지가 도포된 패트리디시에 상기에서 얻은 세포현탁액 0.2ml을 가하고 37℃에서 밤새 배양하여, pHA022를 함유하는 대장균 JM101 형질전환체를 수득하였다. 이 형질전환체를 대장균 DW/HP-222(Escherichia coli DW/HP-222)라 명명하고, 1995년 12월 11일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10078으로 기탁되었다.Then, 0.2 ml of the cell suspension obtained above was added to Patridishi coated with liquid LB medium containing 12.5 占 퐂 / ml of tetracycline and cultured at 37 占 폚 overnight to obtain Escherichia coli JM101 transformant containing pHA022. This transformant was named Escherichia coli DW / HP-222 (Escherichia coli DW / HP-222), and on December 11, 1995, the Korean Microorganism Preservation Center (KCCM) -10078.

실시예 6: 키메라 단백질의 발현Example 6: Expression of chimeric protein

형질전환체 대장균 DW/HP-222를 액체 LB배지에서 18시간 동안 37℃로 배양한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하고, 완충용액(0.1% 트리톤(Triton) X-100, 2mM EDTA 및 1mM PMSF를 함유한 10mM 트리스-HCl, pH 8.0)에 현탁시키고 세포를 파쇄하여 대장균 추출물을 제조하였다. 이어, 10㎕의 대장균 추출물을 람리(참조: Laemmli, et al., Nature, 277:680(1970))의 방법에 따라 15% SDS-PAGE하였다(참조: 도 4). 도 4에서, 제 1레인은 단백질 마커이며; 제 2레인은 대조군으로서 플라스미드 pTE105를 함유한 대장균의 추출물; 및, 제 3레인에서 제 7레인은 발현벡터 pHA022를 함유한 대장균 DW/HP-222를 IPTG로 유도시킨 후, 배양시간별 추출물을 각각 전기영동한 결과이며; 위 화살표는 헤리코박터 피로리 어드헤신과 비브리오 코레라이 A2 서브유니트가 융합된 키메라 단백질의 위치, 아래 화살표는 비브리오 코레라이 B 서브유니트 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 형질전환체 대장균 DW/HP-222에서 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질이 발현됨을 알 수 있었다.The transformant Escherichia coli DW / HP-222 was cultured in a liquid LB medium for 18 hours at 37 ° C and then centrifuged to obtain cells. The cells were washed with buffer solution (0.1% Triton X-100, 2 mM EDTA and 1 mM PMSF , 10 mM Tris-HCl, pH 8.0), and the cells were disrupted to prepare an Escherichia coli extract. 10 μl of E. coli extract was then subjected to 15% SDS-PAGE according to the method of Lemari (Laemmli, et al., Nature, 277: 680 (1970)) (see FIG. In Figure 4, the first lane is a protein marker; The second lane is an extract of E. coli containing the plasmid pTE105 as a control; And the third lane to the seventh lane are the results of electrophoresis of the extracts of the E. coli DW / HP-222 containing the expression vector pHA022 with IPTG, respectively; The upper arrow shows the position of the chimeric protein in which the Hericobacter pyroliadhesin and the Vibrio cholera A2 subunit are fused, and the lower arrow shows the position of the Vibrio cholera B subunit protein. As shown in FIG. 4, the Adhesin / CTXA2B chimeric protein was expressed in the transformant E. coli DW / HP-222.

실시예 7: 키메라 단백질(Adhesin/CTXA2B)의 정제Example 7: Purification of chimeric protein (Adhesin / CTXA2B)

상기 대장균 DW/HP-222(KCCM-10078)를 LB 배지에서 IPTG 유도 후 4시간까지 배양한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 리소자임(lysozyme)으로 파쇄하고 0.5% 트리톤 X-100으로 수차례 세척한 후, 8M 우레아로 불필요한 단백질을 제거하고, 8M 우레아 및 0.1M DTT(dithiothreitol)로 세포의 봉입체를 현탁하였다. 현탁한 봉입체를 글루타티온 산화환원 완충액(glutathione redox buffer)으로 희석시키면서, Adhesin/CTXA2B 단백질을 재접힘(refolding)시켰다. 이어 원심분리한 다음, 겔여과 크로마토그라피를 이용하여 크기차이에 따라 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질만을 수득하였다. 수득한 단백질은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿(Western-blot), G_M1-강글리오사이드(ganglioside) 분석으로 Adhesin/CTXA2B의 키메라 단백질임을 확인하였다.The Escherichia coli DW / HP-222 (KCCM-10078) was cultured in LB medium for 4 hours after IPTG induction, and then centrifuged to obtain cells. The obtained cells were disrupted with lysozyme and washed several times with 0.5% Triton X-100. Unnecessary proteins were removed with 8M urea, and the inclusion bodies of cells were suspended with 8M urea and 0.1M DTT (dithiothreitol). Adhesin / CTXA2B protein was refolded while the suspended inclusion body was diluted with glutathione redox buffer. After centrifugation, an Adhesin / CTXA2B chimeric protein was obtained according to the size difference using gel filtration chromatography. The obtained protein was confirmed to be a chimeric protein of Adhesin / CTXA2B by SDS-PAGE, Western-blot, and G _M1 -ganglioside analysis.

실시예 8: 키메라 단백질(Adhesin/CTXA2B)의 면역반응Example 8: Immune response of chimeric protein (Adhesin / CTXA2B)

실시예 7에서 수득한 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질의 항체생성율을 측정하기 위하여, 미국립보건원(NIH)의 지침서에 따라 동물실험을 수행하였다: 즉, 11 내지 12주령의 Balb/C 마우스 4마리를 한 군으로 하여, Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 100㎍을 350mM NaHCO₃0.5ml에 용해시킨 시료를 투여한 군, Adhesin 100㎍을 350mM NaHCO₃0.5ml에 용해시킨 시료를 투여한 군, 그리고 대조군으로서 350mM NaHCO₃0.5ml만을 투여한 군으로 나누어, 10일 간격으로 3번 위장관내로 경구투여하여 면역화시켰다. 사용된 동물들은 경구투여 2시간 전과 투여후 1시간 동안 절식시켰다. 혈청은 면역 하루전(0일)과 각 면역 후 1주일 뒤(8, 18, 28일)에 각각 꼬리정맥으로부터 채혈하였다. 위액추출물의 항체들은 0.5㎖의 라바쥐 용액(lavage solution)(25mM Nacl, 40mM Na₂SO₄, 10mM KCl, 20mM NaHCO₃및 48.5mM 폴리에틸렌글리콜로 구성된 용액)을 15분 간격으로 4번 투여하고 마지막 투여후 30분이 경과한 다음, 0.2ml의 필로카핀(pilocarpine, 0.5㎎/㎖)을 복강으로 주사하고 30분 경과후 마우스로부터 위액추출물을 수득하였다.In order to determine the antibody production rate of the Adhesin / CTXA2B chimeric protein obtained in Example 7, animal experiments were conducted according to the guidelines of the National Institutes of Health (NIH): four Balb / C mice aged 11 to 12 weeks As a control group, 100 μg of Adhesin / CTXA2B chimeric protein was dissolved in 0.5 ml of 350 mM NaHCO ₃ , 100 μg of Adhesin was dissolved in 0.5 ml of 350 mM NaHCO ₃ , and 350 mM NaHCO ₃ 0.5 ml alone, and they were immunized by oral administration to the gastrointestinal tract 3 at intervals of 10 days. Animals used were fasting 2 hours before oral administration and 1 hour after administration. Serum was collected from the tail vein one day before immunization (day 0) and one week after each immunization (days 8, 18, 28). The antibodies of the gastric juice extract are mice rubber solution (lavage solution) (25mM Nacl, 40mM Na 2 SO 4, 10mM KCl, 20mM NaHCO 3 and 48.5mM solutions consisting of polyethylene glycol), the dose every 15 minutes and 4 and the end of the 0.5㎖ After 30 minutes of administration, 0.2 ml of pilocarpine (0.5 mg / ml) was intraperitoneally injected and 30 minutes later, the gastric juice extract was obtained from the mice.

Adhesin/CTXA2B에 의하여 생성된 항체의 정량실험은 다음의 엘리자(ELISA) 방법으로 수행하였다: 즉, 마우스의 IgG와 IgA에 대한 염소항체를 처리한 96 웰 플레이트에 혈청과 위액 추출물 시료를 처리한 후, 2차항체로서 마우스 항체의 각 이소타입에 대한, 퍼옥시다아제가 연결된 염소의 항체를 반응시켰다. 퍼옥시다아제의 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)를 사용하여 405nm에서의 흡광도를 측정함으로써 항체생성율을 결정하였다. 그 결과, Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질을 투여한 경우, 혈청에서의 IgG의 양은 18일 이후 크게 증가하여, 어드헤신 단독단백질만 투여한 경우보다 2배 이상 증가하였다(참조: 도 5). 또한, 위액추출물에서의 IgA의 양도 어드헤신 단독단백질만 투여한 경우보다 3배 이상 증가하였다(참조: 도 6).Quantitation of the antibody produced by Adhesin / CTXA2B was carried out by the following ELISA method: a 96 well plate treated with a goat antibody against mouse IgG and IgA was treated with serum and gastric juice extract samples , And an antibody against chlorine to which peroxidase was linked was reacted with each isotype of mouse antibody as a secondary antibody. The antibody production rate was determined by measuring the absorbance at 405 nm using p-nitrophenyl phosphate as a substrate of peroxidase. As a result, when the Adhesin / CTXA2B chimeric protein was administered, the amount of IgG in the serum increased greatly after 18 days, which was more than two times higher than that of administration of adhezin alone protein (see FIG. 5). In addition, the amount of IgA in the gastric juice extract was more than 3-fold higher than that of only adefycin alone (Fig. 6).

실시예 9: Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질의 백신 효과Example 9: Vaccine effect of Adhesin / CTXA2B chimeric protein

Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질의 헤리코박터 피로리균에 대한 백신으로서의 효과를 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질과 어드헤신으로 각각 면역화시킨 마우스의 헤리코박터 피로리균에 대한 감염성을 조사함으로써 측정하였다.The effect of the Adhesin / CTXA2B chimeric protein as a vaccine against Helicobacter pylori was tested by examining the infectivity of H. pylori strains of mice immunized with Adhesin / CTXA2B chimeric protein and adhecins, respectively.

10 마리의 C57BL/6 마우스를 한 군으로하여, Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 100㎍을 생리식염수 0.5㎖에 용해시킨 시료를 투여한 군, 어드헤신 100㎍을 생리식염수 0.5㎖에 용해시킨 시료를 투여한 군, 그리고 대조군으로서 생리식염수 0.5㎖만을 투여한 군으로 나누어, 각각의 시료를 폴리에틸렌 카테차를 이용하여 마우스의 위장관내로 일주일 간격으로 3회 경구 투여하였다. 세 번째 투여한 후 7일 뒤에 헤리코박터 피로리 Q-35(경상대학교, 의과대학 미생물교실에서 분리한 균주 ) 균주를 10⁷CFU의 농도로 생리식염수 0.1㎖에 현탁시키고, 폴리에틸렌 카테차를 이용하여 이틀 간격으로 3회 경구 투여하였다.Ten C57BL / 6 mice were used as a group, and a sample in which 100 μg of Adhesin / CTXA2B chimeric protein was dissolved in 0.5 ml of physiological saline was administered. A sample in which 100 μg of adhecin was dissolved in 0.5 ml of physiological saline was administered And 0.5 ml of physiological saline alone as a control group. Each sample was orally administered to the gastrointestinal tract of a mouse three times at a week interval using a polyethylene catheter. Seven days after the third administration, Hericobacter pyrolii Q-35 (a strain isolated from a microbiological laboratory of Gyeongsang National University, Gyeongsang National University) was suspended in 0.1 ml of physiological saline at a concentration of 10 ⁷ CFU, and a polyethylene catheter was used And administered orally three times at intervals of two days.

2주 경과 후, 모든 마우스의 위의 유문부를 0.5cm X 0.5cm 크기로 절개한 후, 멸균된 브로스(Brain Heart Infusion broth, Difco사) 1ml에 담구었다. 각 시료는 10배 단위로 멸균된 생리식염수를 이용하여 희석시킨 후 배지(소혈청 5%가 첨가된 블러드 아가 베이스 No. 2(Blood agar base No. 2)배지로서, 반코마이신(vancomycin) 10㎎/㎖, 트리메토프림(trimethoprim) 5㎎/㎖, 앰포테리신 B (amphotericin B) 4㎎/㎖이 첨가된 배지)에 100㎕를 접종하여 37℃의 CO₂배양기(CO₂10%, 습도 90% 이상)에서 5일간 배양하였다. 배양 후 헤리코박터 피로리의 형태를 보이는 집락수를 세고, 해당 집락을 새 배지에 옮겨 3일간 배양하였다.After 2 weeks, the upper pyloric section of all mice was cut into a size of 0.5 cm x 0.5 cm, and then immersed in 1 ml of sterilized broth (Brain Heart Infusion broth, Difco). Each sample was diluted with sterilized physiological saline in 10-fold increments, and then diluted with medium (10 mg / ml of vancomycin as a medium for Blood agar base No. 2 supplemented with 5% of bovine serum) (5 mg / ml of trimethoprim and 4 mg / ml of amphotericin B) were inoculated in a CO ₂ incubator (CO ₂ 10%, humidity 90 %) For 5 days. After culturing, the number of colonies showing the form of Helicobacter pylori was counted, and the colonies were transferred to a new medium and cultured for 3 days.

배양된 균을 500㎖의 생리식염수에 현탁시키고 다음과 같이 카탈라제, 옥시다제, 우레아제에 대한 생화학적 실험을 수행하였다: 먼저, 각 시료에서 100㎕를 취하여 우레아제 측정시약(우레아 20g/l, 페놀레드(phenolred) 0.05%(w/v), NaH₂PO₄H₂O 0.044g/l, Na₂HPO₄1.02g/l, NaN₃0.2g/l) 1㎖에 넣어 잘 흔들어준 후, 4시간 동안 실온에 방치하여 550nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정 결과, 시료를 넣지 않은 대조 시약보다 0.1 이상 높은 값을 나타내는 시료에 대해 양성반응을 나타낸 것으로 간주하였다. 다음으로, 카탈라제 측정을 위하여 슬라이드 글라스 위에 시료를 한방울 떨어뜨린 후, 3% H₂O₂한방울을 떨어뜨렸을 때 기체가 발생하여 거품이 생기면 양성반응으로 간주하였다. 또한, oxidase 측정을 위하여 거름종이 위에 시료를 한방울 떨어뜨린 후 이소아밀알코올에 용해시킨 1% N, N'-테트라메틸-파라-페닐렌디아민(N,N'-tetramethyl-p-phenylenediamine)을 한방울 떨어뜨려 수분 내에 보라색을 나타내면 양성으로 간주하였다.The cultured bacteria were suspended in 500 ml of physiological saline, and biochemical experiments were performed on the catalase, oxidase and urease as follows. First, 100 쨉 l of each sample was taken, and the urease assay reagent (urea 20 g / l, phenol red (phenolred 0.05% (w / v), 0.044 g / l NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 1.02 g / l Na ₂ HPO _{4 and} 0.2 g / l NaN ₃ ) , And the absorbance at 550 nm was measured. As a result of the measurement, a positive reaction was considered to be exhibited for a sample showing a value of 0.1 or more higher than that of the reference reagent not containing the sample. Next, a droplet of the sample was dropped onto a slide glass for measurement of catalase, and when a drop of 3% H ₂ O ₂ was dropped, a gas was generated and considered as a positive reaction when bubbles were generated. In addition, for the measurement of oxidase, a drop of a sample was dropped on a filter paper, and 1% N, N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dissolved in isoamyl alcohol was added dropwise When it dropped and became purple in a few minutes, it was regarded as positive.

위 3가지 실험에서 모두 양성을 나타낸 시료에 대해 헤리코박터 피로리가 감염된 것으로 측정하였다. 표 1에서 보듯이, 백신효과에 대한 실험 결과 Adhesin/CTXA2B를 투여한 군에서는 90% 예방율을 나타내었고, 어드헤신을 투여한 군에서는 30%의 예방율을 나타내었다. 생리식염수만 투여한 대조군은 모두 헤리코박터 피로리에 감염되어 예방효과가 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명에 의하여 제조된 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리균을 중화시킬 수 있는 특이적인 항체를 유발시켜, 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.In all three tests, Helicobacter pylori infection was detected in samples that were positive. As shown in Table 1, the vaccine effect showed a prevention rate of 90% in the group administered with Adhesin / CTXA2B and a prevention rate of 30% in the group administered adhesin / CTXA2B. All control group treated with saline only infected with Helicobacter pylori and showed no preventive effect. Therefore, it has been found that the Adhesin / CTXA2B chimeric protein produced by the present invention can be used as a vaccine for preventing and treating Helicobacter pylori-related diseases by inducing a specific antibody capable of neutralizing Helicobacter pylori bacteria I could.

Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질과 어드헤신으로 면역화시킨 마우스의 헤리코 박터 피로리균에 대한 감염성Infectivity of Helicobacter pylori bacteria in mice immunized with adhesin / CTXA2B chimeric protein and adefycin 투여군Administered group 감염균Infection 콜로니 형성한 마우스의 수/총 마우스의 수Number of colonized mice / number of total mice 감염예방율(%)Prevention rate (%) 대조군Control group Q-35Q-35 10/1010/10 00 어드헤신Adhecin Q-35Q-35 7/107/10 3030 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질Adhesin / CTXA2B chimeric protein Q-35Q-35 1/101/10 9090

제조예 1: Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 액제Production Example 1: Adhesin / CTXA2B chimeric protein solution

Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 100㎍Adhesin / CTXA2B chimeric protein 100 [mu] g

0.6M 이탄산나트륨 250㎕0.6 M sodium carbonate 250 쨉 l

증류수 250㎕250 μl of distilled water

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총 부피 500㎕Total volume 500 μl

제조예 2: Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 액제Preparation Example 2: Adhesin / CTXA2B chimeric protein solution

Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질 100㎍Adhesin / CTXA2B chimeric protein 100 [mu] g

0.35M 이탄산나트륨 500㎕0.35 M sodium carbonate 500 쨉 l

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총 부피 500㎕Total volume 500 μl

상기 조성으로 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질을 함유하는 액제를 제조하였다.A solution containing the Adhesin / CTXA2B chimeric protein in the above composition was prepared.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 헤리코박터 피로리의 어드헤신과 비브리오 코레라이 톡신의 A2, B 서브유니트를 연결시킨 키메라 단백질을 이용한 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신을 제공한다. 상기 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리균을 중화시킬 수 있는 특이적인 항체를 유발시킴으로써, 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a vaccine for preventing and treating Helicobacter pylori-related diseases using a chimeric protein comprising adicin of Hericobacter pylori and A2 and B subunits of Vibrio choloritoxin linked thereto to provide. The chimeric protein can be used as an effective ingredient in the production of a diagnostic reagent for Helicobacter pyroliosis or a vaccine for the prevention or treatment of a disease associated with Helicobacter pylori by inducing a specific antibody capable of neutralizing Helicobacter pylori bacteria .

Claims (4)

헤리코박터 피로리(Helicobacter pylori)의 항원 결정기인 어드헤신(adhesin)과 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 톡신의 A2, B 서브유니트(A2, B subunit)가 융합된 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신.The Adhesin / CTXA2B chimeric protein fused with A2 and B subunits of adhesin and Vibrio cholerae toxin, an antigenic determinant of Helicobacter pylori, And a pharmaceutically acceptable carrier. ≪ RTI ID = 0.0 > 18. < / RTI > 제 1항에 있어서,The method according to claim 1, 헤리코박터 피로리의 항원 결정기인 어드헤신과 비브리오 코레라이 톡신 의 A2, B 서브유니트가 융합된 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 하기와 같은 염기서열을 함유하는 재조합 DNA로부터 발현되는 것을 특징으로 하는The Adhesin / CTXA2B chimeric protein fused with A2, B subunits of adysin and vibrio choloritoxin, an antigenic determinant of Hericobacter pylori, is characterized in that it is expressed from recombinant DNA containing the following nucleotide sequence 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신:Vaccines for the prevention and treatment of diseases related to Hericobacter pylori: 제 1항에 있어서,The method according to claim 1, 헤리코박터 피로리의 항원 결정기인 어드헤신과 비브리오 코레라이 톡 신의 A2, B 서브유니트가 융합된 Adhesin/CTXA2B 키메라 단백질은 하 기와 같은 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는The adhesin / CTXA2B chimeric protein in which A2 and B subunits of adysin and vibrio choleraitox, the antigenic determinant of Hericobacter pylori, are fused, has an amino acid sequence identical to that of the parent 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신:Vaccines for the prevention and treatment of diseases related to Hericobacter pylori: 제 1항에 있어서,The method according to claim 1, 헤리코박터 피로리 관련 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위암인 것을 특징으로 하는The Hericobacter pyroliosis-associated disease is characterized by gastritis, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastric cancer 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 및 치료용 백신.Vaccine for the prevention and treatment of diseases related to Hericobacter pylori.