KR19990071688A

KR19990071688A - OB receptor and obesity diagnosis and treatment

Info

Publication number: KR19990071688A
Application number: KR1019980703965A
Authority: KR
Inventors: 루이스 에이. 타타글리아; 로버트 아이. 테퍼; 자니스 에이. 쿨페퍼; 데이비드 더블유. 화이트
Original assignee: 스티븐 홀츠만; 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 1999-09-27

Abstract

본 발명은 포유동물의 체중 조절에 관여하는 수용체 단백질인 Ob 수용체 (ObR)를 코드화하는 뉴클레오티드들의 발견, 동정 및 특성화(characterization)에 관계한다. 본 발명은 비만증, 카헥시(cachexia) 및 식욕부진을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 체중장애(body weight disorder)의 진단, 약물 스크리닝, 임상실험 모니터링, 및/또는 치료에 이용될 수 있는, obR 뉴클레오티드, 숙주세포 발현 시스템, ObR 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드, 수용체에 대한 항체, obR 형질전환유전자(transgene)를 발현하는 형질전환 동물 또는 ObR를 발현하지 않는 재조합 녹-아웃 동물(knock-out animal), 수용체의 길항물질(antagonists) 및 작동물질(agonists), 및 기타의 obR 유전자 발현 및 ObR 활성을 조절하는 화합물들을 포함한다.The present invention relates to the discovery, identification and characterization of nucleotides encoding the Ob receptor (ObR), a receptor protein involved in weight control in mammals. The invention may be used in the diagnosis, drug screening, clinical trial monitoring, and / or treatment of body weight disorders, including but not limited to obesity, cachexia and anorexia, obR nucleotides, host cell expression systems, ObR proteins, fusion proteins, polypeptides and peptides, antibodies to receptors, transgenic animals expressing the obR transgene or recombinant knock-out animals that do not express ObR -out animals, antagonists and agonists of receptors, and other compounds that modulate obR gene expression and ObR activity.

Description

Ｏｂ 수용체 및 비만의 진단 및 치료방법OH receptor and obesity diagnosis and treatment method

비만증은 가장 흔한 체중장애이고 서방 세계에서의 가장 중요한 영양장애(nutritional disorder)로서, 중년 인구의 30%부터 50% 범위내의 우세(prevalence)를 나타낸다. 합해서 서방 세계의 여성 인구의 약 0.2%가 걸려 있는 신경성 식욕부진, 및 신경성 불리미아와 같은 다른 체중장애들도 심각한 건강상의 위협이 되고 있다. 더욱이, 식욕부진 및 카헥시(소모성)와 같은 장애들도 암, 낭포성섬유증, 및 AIDS와 같은 다른 질병들의 두드러진 특징들이다.Obesity is the most common weight disorder and the most important nutritional disorder in the western world, with prevalence in the range of 30% to 50% of the middle-aged population. In addition, other weight disorders, such as anorexia nervosa and anorexia bloat, which affect about 0.2% of the female population in the western world, are also serious health threats. Moreover, disorders such as anorexia and carhexis (consumables) are also salient features of other diseases such as cancer, cystic fibrosis, and AIDS.

제지방체중(lean body mass; 除脂肪體重)에 대한 체지방의 과잉으로 정의되는 비만증도 다른 질병들에 기여한다. 예를 들어, 이러한 비만증은 관상동맥 질병, 발작, 및 당뇨병과 같은 질병들의 발생률을 증가시킨다. (예컨대, Nishina, P.M. et al., 1994, Metab. 43:554-558 참조). 비만증은 단순히 행동 문제(behavioral problem)가 아니고, 수의적인 다식증의 결과이다. 오히려, 비만인 개체와 정상인 개체 사이에 관찰된 상이한 신체 조성(body composition)은 대사 및 신경성/대사성 상호작용의 차이로부터 결과된다. 이러한 차이점들은 어느 정도 유전자발현, 및/또는 유전자 산물의 농도 또는 활성에 기인하는 것으로 생각된다 (Friedman, J.M. et al., 1991, Mammalian Gene 1:130-144).Obesity, defined as an excess of body fat to lean body mass, also contributes to other diseases. For example, such obesity increases the incidence of diseases such as coronary artery disease, seizures, and diabetes. (See, eg, Nishina, P.M. et al., 1994, Metab. 43: 554-558). Obesity is not just a behavioral problem, but a result of voluntary polyphagia. Rather, the different body compositions observed between obese and normal individuals result from differences in metabolic and neuronal / metabolic interactions. These differences are thought to be due, in part, to gene expression and / or concentration or activity of gene products (Friedman, J.M. et al., 1991, Mammalian Gene 1: 130-144).

비만증에 대한 역학조사 결과는 비만증이 유전적인 특성을 갖는다는 것을 입증해 준다(Stunkard, 1990, N. Eng. J. Med. 322:1483). 몰 등은 다수의 집단에서 비만증이 적은 수의 유전자 부위(genetic loci)에 의해 조절되는 것으로 보인다고 보고하였다(Moll et al. 1991, Am. J. Hum. Gen. 49:1243). 또한, 사람 쌍생아 연구 결과는 약 80-90%의 유전성을 갖는, 체중 조절에 대한 유전적인 기초를 시사해준다 (Simopoulos, A.P. & Childs B., eds., 1989, in "Genetic Variation and Nutrition in obesity", World Review of Nutrition and Diabetes 63, S. Karger, Basel, Switzerland; Borjeson, M, 1976, Acta. Paediatr. Scand. 65:279-287).Epidemiological studies of obesity demonstrate that obesity has a genetic character (Stunkard, 1990, N. Eng. J. Med. 322: 1483). Mole et al. Reported that obesity appears to be regulated by a small number of genetic loci in many populations (Moll et al. 1991, Am. J. Hum. Gen. 49: 1243). In addition, human twin studies have suggested a genetic basis for weight control, with about 80-90% heritability (Simopoulos, AP & Childs B., eds., 1989, in "Genetic Variation and Nutrition in obesity" , World Review of Nutrition and Diabetes 63, S. Karger, Basel, Switzerland; Borjeson, M, 1976, Acta.Paediatr.Scand. 65: 279-287).

계획적인 과식에 의해 의도적으로 체중을 증가시키려고 노력하는 비-비만증인 사람의 연구에서 이들은 이러한 체중 증가에 대해 저항성이 크고 매우 높은 칼로리 섭취에 의해서만 높은 체중을 유지할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이와 대조적으로, 비만증인 개체들은 정상 또는 중간 정도로 높은 칼로리 섭취에 의해 그들의 상태를 유지할 수 있다. 또한, 상이한 품종의 돼지, 소 등이 비만에 대한 상이한 체질(predispositions)을 갖는다는 것은 동물사육에서 흔히 경험하게 되는 것이다. 비만증인 사람 및 비만증인 동물 모델의 유전학 연구에서 비만증은 음식 섭취, 음식 유도 에너지 소비(food induced energy expenditure)및 지질과 제지방체중 동화작용(lean body anabolism) 사이의 균형의 복잡한 결함 있는 조절로부터 결과된다는 것이 입증되었다.A study of non-obese people who tried to gain weight intentionally by deliberate overeating found that they are resistant to this weight gain and can only maintain high weight by very high calorie intake. In contrast, individuals with obesity can maintain their condition by ingesting normal or moderately high calories. It is also common experience in animal breeding that different breeds of pigs, cattle, etc. have different predispositions to obesity. In genetic studies of obese and obese animal models, obesity results from complex defective regulation of food intake, food induced energy expenditure, and the balance between lipid and lean body anabolism Has been proven.

여러 가지 두드러진 증상들 중에서 자주 이형 특징(dysmorphic features) 및 정신지체와 함께 비만증을 특징으로 하는 유전적 질병들이 사람 및 다른 종의 동물에서 다수 존재한다. 예를 들어, 프레이더-윌리 증후군(PWS; Prader-Willi syndrome)은 생존 신생아에서 약 20,000명중의 1명꼴로 발생하고, 약한 신생아 근육 긴장(neonatal muscle tone), 안면 및 생식기 기형, 및 일반적으로 비만증을 포함한다.Among various prominent symptoms, there are many genetic diseases that are characterized by obesity, often with dysmorphic features and mental retardation, in humans and other species of animals. For example, Prader-Willi syndrome (PWS) occurs in about 1 in 20,000 live survivors, with weak neonatal muscle tone, facial and genital malformations, and generally obesity. It includes.

PWS 이외에, 하나의 증상으로 비만증을 포함하는 많은 다른 다형질발현성 증후군들이 규명되었다. 이러한 증후군들은 유전적으로 더욱 간단하고, 상염색체 열성 대립유전자들을 포함하는 것으로 보인다. 이러한 질병들은 다른 여러 가지 중에서 알스트롬, 카펜터, 바뎃-비델, 코헨 및 모르가그니-스튜어트-모넬 증후군들을 포함한다.In addition to PWS, many other polymorphic syndromes have been identified, including obesity as one symptom. These syndromes are genetically simpler and appear to include autosomal recessive alleles. These diseases include, among others, Alstrom, Carpenter, Bart-Biedel, Cohen and Morgangni-Stuart-Monel syndromes.

비만증을 연구하기 위한 다수의 모델들이 존재한다 (예컨대, Bray, G.A., 1992, Prog. Brain Res. 93:333-341, 및 Bray, G.A., 1989, Amer. J. Clin. Nutr. 5:891-902 참조). 예를 들어, 비만증 증상들을 포함하는 증후군을 발생시키는 돌연변이를 갖는 동물들이 확인되었고, 이러한 동물들을 비만증 연구용 모델로 이용하기 위한 시도가 있어 왔다. 현재까지 유전 비만증과 관련하여 가장 잘 연구된 동물 모델은 마우스 모델이다. Friedman, J.M. et al., 1991, Mamm. Gen. 1:130-144; Friedman, J.M. and Liebel, R.L., 1992, Cell 69:217-220 참조.There are a number of models for studying obesity (eg, Bray, GA, 1992, Prog. Brain Res. 93: 333-341, and Bray, GA, 1989, Amer. J. Clin. Nutr. 5: 891-). 902). For example, animals with mutations that produce syndromes including symptoms of obesity have been identified and attempts have been made to use these animals as models for studying obesity. To date, the best studied animal model for genetic obesity is the mouse model. Friedman, J.M. et al., 1991, Mamm. Gen. 1: 130-144; Friedman, J.M. and Liebel, R. L., 1992, Cell 69: 217-220.

마우스를 이용한 연구들은 비만증이 고도의 유전성을 갖는 매우 복잡한 형질임을 입증하였다. 비만 표현형을 초래하는 다수의 부위에서의 돌연변이들이 확인되었다. 이들은 상염색체 열성 돌연변이 비만(ob), 당뇨병(db), 지방(fat) 및 뚱뚱함[tubby](tub)를 포함한다. 또한, 상염색체 우성 돌연변이 agouti 부위에서의 옐로우 및 지방(Ad)도 비만 표현형에 기여하는 것으로 확인되었다.Studies using mice have demonstrated that obesity is a highly complex trait with a high degree of inheritance. Mutations at multiple sites have been identified that result in an obesity phenotype. These include autosomal recessive mutant obesity (ob), diabetes (db), fat and fat (tub). In addition, yellow and fat (Ad) at autosomal dominant mutant agouti sites were also found to contribute to the obesity phenotype.

ob 및 db 돌연변이들은 각각 염색체 6 및 4에 대한 돌연변이이지만, 1개월의 월령에서 분명하게 시작되는, 복잡하고 임상적으로 유사한 비만의 표현형을 나타내게 하는데, 이러한 표현들은 다식증, 심각한 글루코오스 및 인슐린 대사의 이상, 매우 나쁜 체온조절 및 비-떨림 열발생(non-shivering thermogenesis), 및 극단적인 둔마(extreme torpor), 및 제지방체중의 발육부전을 포함한다. 이러한 복잡한 표현형은 돌연변이로부터 기인하는 일차적인 결함을 확인하기 어렵게 만든다 (Bray G.A., et al., 1989, Amer. J. Clin. Nutr. 5:891-902).The ob and db mutations are mutations for chromosomes 6 and 4, respectively, but show complex and clinically similar obesity phenotypes that clearly begin at 1 month of age, which are manifestations of polyphagia, severe glucose and insulin metabolism abnormalities. , Very poor thermoregulation and non-shivering thermogenesis, and extreme torpor, and dysparesis of lean body weight. This complex phenotype makes it difficult to identify primary defects resulting from mutations (Bray G.A., et al., 1989, Amer. J. Clin. Nutr. 5: 891-902).

분자량 및 고전적인 유전 표지를 이용함으로써, ob 유전자는 미드크로모솜 4에 유전자지도 작성되었다 (Friedman et al., 1991, Mamm. Gen. 1:130-144). 사람과 동조성(syntonic)인 마우스 게놈중의 하나의 부위에 대한 돌연변이 지도는만약 db의 사람 상동물(homolog)가 있다면 사람 염색체 1p에 대한 지도일 것이라는 사실을 말해 준다.By using molecular weight and classical genetic labels, the ob gene was genetically mapped to midchromosome 4 (Friedman et al., 1991, Mamm. Gen. 1: 130-144). The mutation map for a site in the mouse genome that is syntonic with human tells us that if there is a human homolog of db, it would be a map for human chromosome 1p.

ob 유전자와 그의 사람 상동물은 최근에 클로닝되었다 (Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372:425-432). 상기 유전자는 167 아미노산 개방 해독 프레임을 포함하는 4.5 kb 지방조직 mRNA를 만들어내는 것으로 보인다. ob 유전자 산물의 추론 아미노산 서열은 그것이 분비된 단백질이고, 따라서, 체지방 침착의 몇 가지 양상을 조절하는 기능을 할 수 있는 지방조직으로부터의 신호 경로(signalling pathway)의 일부로서 역할을 담당할 수 있다는 것을 말해준다. 더욱이, 최근의 연구결과들은 렙틴으로도 알려진, 재조합 Ob 단백질이, 외부에서 투여될 때, ob 마우스에 나타나는 비만증-관련 표현형을 최소한 부분적으로라도 보정할 수 있다는 것을 입증한다 (Pelleymounter, M.A. et al., 1995, Science 269:540-543; Halalas, J.L. et al., 1995, Science 269:543-546; Campfield, L.A. et al., 1995, Science 269:546-549). 최근의 연구에서는 비만인 사람과 설치류(ob/ob 마우스 아닌)들은 ob mRNA 또는 단백질을 생산하는 능력에 결함이 없고, 일반적으로 마른 개체 보다 높은 농도로 생산한다는 사실이 밝혀졌다 (Maffei et al., 1995, Nature Med. 1(11):1155-1161; Considine et al., 1995, J. Clin. Invest. 95(6):2986-2988; Lohnqvist et al., 1995, Nature Med. 1:950-953; Hamilton et al., 1995, Nature Med. 1:953-956). 이러한 데이터들은 정상이거나 상승된 농도의 Ob에 대한 저항성은 사람 비만증에서 부적절한 Ob 생산보다 더 중요할 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 시상하부에서 발현되는 것으로 생각되는, ob 유전자 산물에 대한 수용체는 아직까지 미지의 존재로 남아있다.The ob gene and its human epithelium have recently been cloned (Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372: 425-432). The gene appears to produce 4.5 kb adipose tissue mRNA comprising a 167 amino acid open translation frame. The inferred amino acid sequence of the ob gene product is that it is a secreted protein and therefore can play a role as part of a signaling pathway from adipose tissue that can function to regulate some aspects of body fat deposition. Tell me. Moreover, recent studies demonstrate that recombinant Ob protein, also known as leptin, can at least partially correct obesity-related phenotypes present in ob mice when administered externally (Pelleymounter, MA et al., 1995, Science 269: 540-543; Halalas, JL et al., 1995, Science 269: 543-546; Campfield, LA et al., 1995, Science 269: 546-549). Recent studies have shown that obese people and rodents (but not ob / ob mice) have no defects in their ability to produce ob mRNA or protein and generally produce higher concentrations than lean individuals (Maffei et al., 1995). , Nature Med. 1 (11): 1155-1161; Considine et al., 1995, J. Clin.Invest. 95 (6): 2986-2988; Lohnqvist et al., 1995, Nature Med. 1: 950-953 Hamilton et al., 1995, Nature Med. 1: 953-956). These data suggest that resistance to normal or elevated concentrations of Ob may be more important than inappropriate Ob production in human obesity. However, the receptor for the ob gene product, which is thought to be expressed in the hypothalamus, still remains unknown.

fat 또는 tub 부위중 하나에서의 호모접합 돌연변이들은 ob 및 db 마우스에서 관찰된 것 보다 훨씬 느리게 발생되는 비만증을 일으키는데(Coleman, D.L., and Eicher, E.M., 1990, J. Heredity 81:424-427), tub 비만증이 fat 동물에서 관찰된 것 보다 느리게 발생한다. tub 비만증 표현형의 이러한 특징은 tub 비만증 표현형의 발생을 사람의 경우에 비만증이 발생하는 방식에 가장 유사하게 만든다. 그러나, 비록 그렇다 하더라도, 이러한 동물들에서의 비만증 표현형은 동물들이 결국 정상인 마우스의 평균 체중의 거의 2배에 해당하는 체중을 얻게 되는 점에서 조직에 광범위하게 영향을 미치는 것으로 특성화될 수 있다.Homozygous mutations in either the fat or tub region cause obesity, which occurs much slower than observed in ob and db mice (Coleman, DL, and Eicher, EM, 1990, J. Heredity 81: 424-427). Tub obesity develops more slowly than observed in fat animals. This feature of the tub obesity phenotype makes the development of the tub obesity phenotype most similar to the way in which obesity occurs in humans. However, even so, the obesity phenotype in these animals can be characterized as having a broad effect on tissues in that the animals eventually gain weight that is nearly twice the average weight of normal mice.

fat 돌연변이는 마우스 염색체 8에 위치되는 반면에, tub 돌연변이는 마우스 염색체 7에 위치되었다. 내거트 등에 의해, 최근 fat 돌연변이가 확인되었다 (Naggert, J.K., et al., 1995, Nature Genetics 10:135-141). 구체적으로, fat 돌연변이는 카브록시펩티다제(Cpe) E 단백질을 코드화하는 Cpe 부위내의 돌연변이인 것으로 보인다. Cpe는 프로인슐린을 포함하는 프로호르몬의 프로세싱에 관여하는 엑소펩티아다제이다.The fat mutation was located on mouse chromosome 8, while the tub mutation was located on mouse chromosome 7. Nagert et al. Have recently identified fat mutations (Naggert, J.K., et al., 1995, Nature Genetics 10: 135-141). Specifically, the fat mutation appears to be a mutation in the Cpe site that encodes a carboxypeptidase (Cpe) E protein. Cpe is an exopeptidase involved in the processing of prohormones, including proinsulin.

aqouti 부위에서의 우성 옐로우 돌연변이는 중간정도의 성년발병비만증, 노란 외막색(yellow coat color), 및 높은 발생률의 종양 생성(Herberg, L. and Coleman, D.L., 1977, Matabolism 26:59), 및 체지방의 비정삭적인 해부학적 배치(Coleman, D.L., 1978, Diabetologia 14:141-148)를 초래하는 다형질발현성 증후군을 일으킨다. 이러한 돌연변이는 체형의 감소가 아닌 증가를 유발하는 다형질발현성 돌연변이의 유일하게 알려진 예일 수 있다. 상기 돌연변이는 정상적으로는 신생아 피부에서만 발견되는 단백질의 광범위한 발현을 유발한다 (Michaud, E.J. et al., 1994, Genes Devel. 8:1463-1472).The dominant yellow mutations at the aqouti site have moderate adult obesity, yellow coat color, and high incidence of tumor production (Herberg, L. and Coleman, DL, 1977, Matabolism 26:59), and body fat Causes polymorphisms that result in non-finish anatomical placement of (Coleman, DL, 1978, Diabetologia 14: 141-148). Such mutations may be the only known example of polymorphogenic mutations that cause an increase but not a decrease in body shape. Such mutations cause a wide range of expression of proteins normally found only in neonatal skin (Michaud, E.J. et al., 1994, Genes Devel. 8: 1463-1472).

다른 동물 모델들은 상술한 ob/ob 및 db/db 마우스와 많은 유사점을 갖는 fa/fa(fatty) 쥐를 포함한다. 하나의 차이점은 fa/fa 쥐들은 추위에 매우 민감한 반면에, 그들의 비-떨림 열발생 능력은 정상이라는 것이다. 둔마(torpor)는 마우스 돌연변이에서 보다 fa/fa 쥐들에서, 비만증의 유지에 큰 역할을 담당하는 것으로 보인다. 또한, NZO 마우스 및 일본 KK 마우수와 같은 마우스 순종(inbred mouse strain)들은 중간 정도록 비만이다. 웰레슬리 마우스와 같은 특정한 잡종 마우스들은 자연적으로 비만이 된다. 더욱이, 고슴도치와 같은 몇몇 사막 설치류들은 그들의 지연적인 서식환경에서는 비만이 되지 않지만, 표준 실험실 먹이를 공급해주면 비만이 된다.Other animal models include fa / fa (fatty) mice that have many similarities to the ob / ob and db / db mice described above. One difference is that fa / fa mice are very sensitive to cold, while their non-quiver fever is normal. Torpor appears to play a larger role in the maintenance of obesity in fa / fa mice than in mouse mutations. In addition, inbred mouse strains such as NZO mice and Japanese KK Mausu are obese to middle age. Certain hybrid mice, such as Wellesley mice, naturally become obese. Moreover, some desert rodents, such as hedgehogs, do not become obese in their retarded habitat, but they can become obese by feeding standard laboratory food.

비만증에 대한 모델로 이용된 동물들은 물리적 또는 약물학적 방법에 의해 발육시켰다. 예를 들어, 쥐에서 복축정중 시상하부(VMH)와 복측외측 시상하부(VLH)에 있어서의 좌우양측 손상은 각각 다식증 및 육안적 비만과 그리고 연하불능증, 카헥시, 및 식욕부진과 관련된다. 더욱이, 신생 마우스에 대한 모노소디움-글루타메이트(MSG) 또는 골드 티오글루코오스의 급식도 비만증 증후군을 유발하는 것으로 확인되었다.Animals used as models for obesity were developed by physical or pharmacological methods. For example, left and right bilateral injuries in the hypothalamus (VMH) and the lateral lateral hypothalamus (VLH) during biaxial tablets in rats are associated with polyphagia and gross obesity and dyspnea, carhexia, and anorexia, respectively. Moreover, feeding of monosodium-glutamate (MSG) or gold thioglucose to newborn mice has also been shown to cause obesity syndrome.

설치류 비만증 모델들 각각은 사람의 타입 Ⅱ 당뇨병을 닮은 탄수화물 대사에 있어서의 변화에 수반된다. 예를 들어, ob 및 db 양자로부터의, 유사유전자형 C57BL/KS 마우스는 최종 β세포 탈저 및 섬 위축(islet atrophy)과 함께 중증 당뇨병을 발병하는 반면에, 유사유전자형 C57BL/6J ob 및 db 마우스는 사람 타입 Ⅱ 당뇨병과 닮은 β 세포 영양과도에 의해 보상되는 일시적인 인슐린-저항성 당뇨병을 발병한다.Each of the rodent obesity models is involved in changes in carbohydrate metabolism resembling human type II diabetes. For example, pseudogenic C57BL / KS mice, from both ob and db, develop severe diabetes with final β cell stunting and islet atrophy, whereas pseudogenic C57BL / 6J ob and db mice are human. Develop transient insulin-resistant diabetes, which is compensated for by β cell hypertrophy resembling type II diabetes.

ob 및 db 마우스의 경우, 돌연변이 마우스들은 (비만증인 사람과 마찬가지로) 마른 대조군 마우스들에 비해 더 많이 먹고 더 적은 에너지를 소비하는 점에서, 이들 마우스들의 표현형은 당뇨병 발병 이외의 점에서 사람 비만증을 닮았다. 이러한 표현형은 복축정중 시상하부(VMH)가 손상된 동물에서 발견되는 것과 유사한데, 이와 같은 사실은 양자의 돌연변이들이 중추신경계 내에서의 영양 정보(nutritional information)에 대해 적절하게 조정하고 반응하는 능력을 방해할 수 있다는 것을 말해 준다. 이러한 가정은 병체결합 실험(Coleman,D.L. 1973, Diabetologica 9:294-298)에 의해 뒷받침되는데, 이 실험은 ob 마우스들은 순환 포만 요소가 결핍되어 있고, db 마우스들은 ob 인자에 대해 저항성이라는 것을 보여준다. 이들 실험들은 이들 돌연변이 마우스들에 있어서의 비만증은 신체 구성을 조절하는 필수 피드백 메카니즘의 구심성 루프 및/또는 통합 센터의 결함으로부터 기인할 수 있을 것이라는 결론을 유도한다.For ob and db mice, the phenotype of these mice resembles human obesity in terms of non-diabetes, in that mutant mice eat more and consume less energy than lean control mice (as in obese people). . This phenotype is similar to that found in animals with damaged hypothalamus (VMH) during biaxial tablets, which hinders the ability of both mutations to properly adjust and respond to nutritional information in the central nervous system. Tell them you can. This hypothesis is supported by a pathogenesis experiment (Coleman, D.L. 1973, Diabetologica 9: 294-298), which shows that ob mice lack circulating satiety elements and db mice are resistant to ob factor. These experiments lead to the conclusion that obesity in these mutant mice may result from defects in the afferent loops and / or integration centers of the essential feedback mechanisms that regulate body composition.

따라서, 요약하면, 전세계적으로 건강상의 문제를 일으키는 비만증은 복잡하고, 고도로 유전성인 형질이다. 이러한 장애의 엄격성, 우세(prevalence) 및 잠재적인 유전성이 주어졌기 때문에, 체중의 조절에 관여하는 이들 유전자들 및 유전자 산물의 확인에 대한 커다란 요구가 존재한다.Thus, in summary, obesity, which causes health problems worldwide, is a complex, highly hereditary trait. Given the stringency, prevalence and potential heritability of these disorders, there is a great need for the identification of these genes and gene products involved in the regulation of body weight.

본 발명의 하나의 목적은 체중의 조절물질(modulators)을 제공하고, 체중장애의 진단방법을 제공하며, 이러한 장애에 대한 치료방법을 제공하고 체중조절에 이용될 수 있는 물질의 스크리닝을 위한 분석시스템을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide modulators of weight, to provide a method for diagnosing weight disorders, to provide a method for treating such disorders, and to provide an analysis system for screening of substances that can be used for weight control. To provide.

[발명의 요약][Summary of invention]

본 발명은 포유동물의 체중 조절에 관여하는 신규한 수용체 단백질인, Ob 수용체 (ObR)를 코드화하는 뉴클레오티드들의 발견, 동정 및 특성화(characterization)에 관계한다. 본원에서 처음으로 기술되는 ObR은 세포막에 걸쳐있는 막간 단백질이고, 렙틴(leptin)으로도 알려진 그의 천연 리간드, Ob의 결합에 의해 개시되는 신호 변환에 관여한다. ObR은 클래스 Ⅰ 싸이토카인 수용체 군에서 발견된 아미노산 서열 모티브를 갖고, IL-6 수용체, G-CSF 수용체, 및 LIF 수용체의 gp130 신호변환성분에 관련된다. 본원의 실시예에 제시된 결과들은 긴-형태의 ObR(주로 시상하부에서 발현되는)이 IL-6 타입 싸이토카인 수용체들의 전형인 STAT 매개 경로를 통해 신호를 변환하는 반면에, 주로 자연에서 발견되는 절두된 형태 또는 비만 db/db 마우스에서 발견되는 돌연변이 형태는 신호변화하지 않는다. 긴-형태의 ObR은 STAT 단백질들의 활성화를 매개할 수 있고 IL-6 반응성 유전자 요소들을 통한 전사를 자극할 수 있다. 재구성 실험(reconstitution experiments)은 ObR이 IL-6 타입 싸이토카인 수용체들과 유사한 특이성을 가지고 세포내 신호를 전달할지라도, 신호법은 IL-6 타입 싸이토카인 수용체들의 gp130 신호변환성분에 대해 독립적인 것으로 보인다는 것을 말해준다.The present invention relates to the discovery, identification and characterization of nucleotides encoding the Ob receptor (ObR), a novel receptor protein involved in mammalian weight control. ObR, first described herein, is an intermembrane protein that spans cell membranes and is involved in signal transduction initiated by the binding of its natural ligand, Ob, also known as leptin. ObR has an amino acid sequence motif found in the Class I cytokine receptor family and is involved in the gp130 signal transduction component of the IL-6 receptor, G-CSF receptor, and LIF receptor. The results presented in the Examples herein show that long-form ObRs (mainly expressed in the hypothalamus) convert signals through the STAT mediated pathway typical of IL-6 type cytokine receptors, whereas the truncated ones found in nature Morphology or mutant morphology found in obese db / db mice does not signal change. Long-form ObR can mediate the activation of STAT proteins and stimulate transcription through IL-6 reactive gene elements. Reconstitution experiments show that although ObR delivers intracellular signals with specificity similar to IL-6 type cytokine receptors, signaling appears to be independent of the gp130 signal transduction components of IL-6 type cytokine receptors. Tell me.

약 5 kb 길이인, ObR mRNA 전사체는 맥락막총(choroid plexus), 시상하부 및 폐 및 간을 포함하는 다른 조직에서 발현된다. 본원에 기술된 쥐의 짧은 형태들은 894(도 1) 및 893 아미노산들의 수용체 단백질들을 코드화하고; 본원에 기술된 쥐의 긴 형태 obR cDNA와 사람 obR cDNA는 각각 1162 아미노산 및 1165 아미노산의 수용체 단백질들을 코드화한다 (각각 도 6 및 도 3). ObR은 전형적인 소수성 리더(leader) 서열(양자의 형태의 쥐 ObR에서 약 22 아미노산 길이이고, 사람 ObR에서 약 20 아미노산 길이); 세포외 도메인(양자의 형태의 쥐 ObR에서 약 815 아미노산 길이이고, 사람 ObR에서 약 819 아미노산 길이); 짧은 막간 부위(양자의 형태의 쥐 ObR 및 사람 ObR에서 약 23 아미노산 길이); 및 세포질 도메인을 포함한다. 쥐 ObR 짧은 형태(도 1)와 긴 형태(도 6)를 코드화하는 전사체들은 짧은 형태의 종결코돈의 5번째 코돈 5'까지 동일하고 그 다음부터는 다른데, 이는 교차 스플라이싱(alternative splicing)을 시사한다. 본원에 개시된 바와 같이, 894 아미노산 쥐 짧은 형태 obR cDNA에 의해 코드화되는 세포질 도메인은 34 아미노산인데 반하여, 쥐 긴 형태 obR cDNA(302 아미노산)에 의해 코드화되는 것은 사람 obR cDNA(303 아미노산)에 의해 코드화되는 세포질 도메인과 대략적으로 동일한 길이이다. 쥐 긴 형태 ObR 및 사람 ObR로부터의 추론 아미노산 서열들은 코드화 부위의 전체 길이가 상동성이고 75% 동일성을 공유한다(도 7).ObR mRNA transcripts, about 5 kb in length, are expressed in choroid plexus, hypothalamus and other tissues including lungs and liver. Short forms of the mice described herein encode receptor proteins of 894 (FIG. 1) and 893 amino acids; The long form of obR cDNA and human obR cDNA described herein encode receptor proteins of 1162 amino acids and 1165 amino acids, respectively (FIGS. 6 and 3, respectively). ObR is a typical hydrophobic leader sequence (about 22 amino acids long in quantum rat ObR and about 20 amino acids long in human ObR); Extracellular domain (about 815 amino acids in the protons of rat ObR and about 819 amino acids in human ObR); Short intermembrane sites (about 23 amino acids long in quantum rat ObR and human ObR); And cytoplasmic domains. Transcripts encoding the mouse ObR short form (FIG. 1) and long form (FIG. 6) are identical up to the 5th codon 5 'of the short form codon and subsequently different, indicating alternating splicing. Suggest. As disclosed herein, the cytoplasmic domain encoded by the 894 amino acid murine short form obR cDNA is 34 amino acids, whereas the encoding by murine long form obR cDNA (302 amino acids) is encoded by human obR cDNA (303 amino acids). Approximately the same length as the cytoplasmic domain. Inferred amino acid sequences from the murine long form ObR and human ObR are homologous and share 75% identity of the entire length of the coding region (FIG. 7).

db 마우스의 비만 표현형은 obR 유전자에 있어서의 G→T 트랜스버젼으로부터 결과된다. 이러한 트랜스버젼은 db 돌연변이체들에서 obR 긴 형태 mRNA의 비정상적인 프로세싱(aberrant processing)을 일으키는 스플라이스 도너 부위(splice donor site)를 만든다. db 돌연변이체들에서, 이러한 비정상적인 프로세싱은 894 아미노산 짧은 형태 ObR과 동일한 절두된 형태의 ObR을 코드화하는 긴 형태 mRNA를 만든다. 짧은 형태 ObR과 마찬가지로, 돌연변이 긴 형태 ObR은 대부분의 세포질 도메인을 갖고 있지 않고 STAT 매개 경로를 통해 신호를 변환할 수 없다. db/db 마우스에는 없는 신호할 수 있는 긴 형태 ObR은 체중유지에 필요하다.The obese phenotype of db mice results from G → T transduction in the obR gene. This transversion creates a splice donor site that causes abnormal processing of obR long form mRNA in db mutants. In db mutants, this abnormal processing produces long form mRNAs that encode truncated forms of ObR identical to the 894 amino acid short form ObR. Like the short form ObR, the mutant long form ObR does not have most cytoplasmic domains and cannot convert signals through the STAT mediated pathway. Signaling long form ObR, which db / db mice do not have, is required for weight maintenance.

본 발명은 다음의 뉴클레오티드, 이러한 뉴클레오티드들을 발현하는 숙주세포, 및 이러한 뉴클레오티드들의 발현산물들을 포함한다: (a) 사람 ObR을 포함하는 포유동물 ObR를 코드화하는 뉴클레오티드 및 obR 유전자 산물; (b) 그의 기능성 도메인에 해당하는 ObR의 부분들을 코드화하는 뉴클레오티드, 및 세포외 도메인(ECD) 및 세포질 도메인(CD)을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 특정되는 폴리펩타이드 산물; (c) 도메인들 중의 하나의 전부 또는 일부가 결실되거나 변형된 ObR의 돌연변이체를 코드화하는 뉴클레오티드, 및 TM의 전부 또는 일부가 결실된 가용성 수용체 및 CD의 전부 또는 일부가 결실된 비기능성 수용체들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 특정되는 폴리펩타이드 산물; (d) 다른 폴리펩타이드에 융합된 ObR 또는 그의 도메인들(예컨대, 세포외 도메인)을 포함하는 융합 단백질들을 코드화하는 뉴클레오티드.The present invention includes the following nucleotides, host cells expressing these nucleotides, and expression products of these nucleotides: (a) nucleotide and obR gene products encoding mammalian ObRs including human ObRs; (b) a polypeptide specified by such nucleotide sequence, including, but not necessarily limited to, nucleotides encoding portions of ObR corresponding to its functional domain, and extracellular domain (ECD) and cytoplasmic domain (CD) product; (c) nucleotides encoding a mutant of ObR in which all or part of one of the domains is deleted or modified, and soluble receptors in which all or part of the TM is deleted and nonfunctional receptors in which all or part of the CD is deleted But not necessarily limited to, polypeptide products specified by such nucleotide sequences; (d) nucleotides encoding fusion proteins comprising an ObR or domains thereof (eg, an extracellular domain) fused to another polypeptide.

본 발명은 obR 유전자 발현을 억제하거나(예컨대, 안티센스 및 리보자임 분자들, 및 유전자 또는 조절서열 대체 구조물) obR 유전자 발현을 증가시키는데(예컨대, obR 유전자를 강한 프로모터 시스템의 조절을 받도록 위치시키는 발현 구조물) 이용될 수 있는 뉴클레오티드 서열 및 obR 형질전환유전자를 발현하는 형질전환 동물 또는 ObR을 발현하지 않는 "녹-아웃"은 물론 작은 분자, 큰 분자, 천연 Ob와 경쟁하는 돌연변이 Ob 단백질, 및 항체를 포함하는 ObR의 길항물질 및 작동물질도 포함한다.The present invention inhibits obR gene expression (eg, antisense and ribozyme molecules, and gene or regulatory sequence replacement constructs) or increases obR gene expression (eg, places an obR gene under control of a strong promoter system). Nucleotide sequences and transgenic animals that express the obR transgene or “knock-outs” that do not express ObR, as well as small molecules, large molecules, mutant Ob proteins that compete with native Ob, and antibodies. It also includes antagonists and agonists of ObR.

또한, 본 발명은 비만증, 카헥시를 포함하는 체중장애의 진단평가, 타이핑 및 예후 방법 및 조성물, 및 이러한 이환상태의 소질을 갖는 대상의 확인을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 obR 핵산분자들은 진단 혼성화 프로브로 또는 obR 유전자 돌연변이, obR 유전자내의 대립유전자 변이 및 조절 결함의 확인을 위한 진단용 PCR 분석용 프라이머로 이용될 수 있다. 본 발명은 추가로 이러한 방법의 실시를 위한 진단키트를 제공한다.The present invention also includes methods and compositions for diagnosing obesity, weight disorders including carhexis, typing and prognosis, and for identifying subjects with predisposition to such morbidities. For example, the obR nucleic acid molecules of the present invention can be used as diagnostic hybridization probes or as primers for diagnostic PCR analysis to identify obR gene mutations, allelic variation in the obR gene and regulatory defects. The invention further provides a diagnostic kit for the implementation of this method.

더욱이, 본 발명은 obR 유전자 발현 및 obR 유전자 산물 활성을 조절하는 화합물들, 즉, 작동물질 또는 길항물질로 작용하는 화합물들의 동정을 위한 obR 유전자 및/또는 obR 유전자 산물의 이용 방법에도 관계한다. 이러한 화합물들은 체중조절 약제로 이용될 수 있는데, 특히 비만증, 카헥시, 및 식욕부진을 포함하는 체중장애에 대한 치료제로 이용제로 이용될 수 있다.Moreover, the present invention also relates to methods of using obR genes and / or obR gene products for the identification of compounds that modulate obR gene expression and obR gene product activity, ie compounds acting as agonists or antagonists. These compounds can be used as weight control agents, in particular as a therapeutic agent for weight disorders including obesity, carhexis, and anorexia.

더 나아가, 본 발명은 비만증, 카헥시, 및 식욕부진을 포함하는 체중장애 치료 방법 및 조성물도 포함한다. 이러한 방법 및 조성물들은 obR 유전자 발현 및 obR 유전자 산물 활성을 조절할 수 있다.Furthermore, the present invention also includes methods and compositions for treating weight disorders, including obesity, carhexis, and anorexia. These methods and compositions can modulate obR gene expression and obR gene product activity.

본 발명은 부분적으로 뇌의 맥락막총(choroid plexus)에서 Ob에 대한 고친화성 수용체들의 다수의 세포주 및 조직들에 대한 광범위한 조사 이후의, 맥락막총mRNA로부터 제조된 도서관으로부터의 obR cDNA의 동정 및 클로닝, 그의 신규한 서열들의 특성화, db 유전자지도로서의 마우스 게놈에서의 동일한 유전 간격에 대한 obR 유전자의 유전자지도작성 및 클래스 Ⅰ 싸이토카인 수용체 군의 막간 수용체로의 ObR의 특성화의 놀라운 발견에 기초한다. obR mRNA는 시상하부를 포함하는 다른 조직에서 발견되었다.The present invention partially identifies and clones obR cDNA from a library prepared from choroid plexus mRNA after extensive investigation of multiple cell lines and tissues of high affinity receptors for Ob in the choroid plexus of the brain, It is based on the surprising discovery of the characterization of its novel sequences, the genetic mapping of the obR gene for the same genetic interval in the mouse genome as the db gene map, and the characterization of ObR to the intercalated receptors of the Class I cytokine receptor family. obR mRNA was found in other tissues including the hypothalamus.

시상하부에서 주로 발현되는 전 길이 ObR(full-length ObR)은 STAT 단백질의 활성화 및 IL-6 반응성 유전자 요소를 통한 전사의 자극을 통해서 신호를 변환한다. 전 길이 형태의 ObR의 신호에 대한 능력은 신호 변환을 매개할 수 없는 자연에서 발견되는 절두된 형태 또는 돌연변이 형태와 대조적이다. 본 발명은 신호(signalling) 및 유전자 발현의 유도에 중요한 하나 또는 다른 세포내 도메인이 결여된 ObR 형태들도 포함한다.Full-length ObR, expressed mainly in the hypothalamus, converts signals through activation of STAT proteins and stimulation of transcription through IL-6 reactive gene elements. The ability of the full-length ObR to signal is in contrast to truncated or mutant forms found in nature that cannot mediate signal transduction. The invention also encompasses ObR forms that lack one or another intracellular domain important for induction of signaling and gene expression.

A. 정의A. Definition

본원에서 이용될 때 하기 용어들은 복수로 사용되거나 단수로 사용되거나 간에 다음과 같은 의미를 갖는다:As used herein, the following terms, whether used in plural or singular, have the following meanings:

Ob : 본원에 전문이 첨부된, Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372:425-432에 기술된 Ob 단백질을 의미하며, 렙틴(leptin)으로도 불린다. Ob는 Ob에 상동성이거나 ObR에 결합하는 분자들을 포함한다. N-말단 알칼라인 포스파타아제 도메인을 갖는 Ob 융합단백질들은 이하에서 AP-Ob라하고, C-말단 알칼라인 포스파타아제 도메인을 갖는 Ob 융합단백질들은 이하에서 Ob-AP라 한다.Ob: means the Ob protein described in Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372: 425-432, which is hereby incorporated by reference in its entirety, also called leptin. Ob includes molecules homologous to Ob or bind to ObR. Ob fusion proteins with an N-terminal alkaline phosphatase domain are hereinafter referred to as AP-Ob and Ob fusion proteins with a C-terminal alkaline phosphatase domain are hereinafter called Ob-AP.

obR 뉴클레오티드 또는 코드화 서열: ObR 단백질, ObR 단백질의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 또는 ObR 융합단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열들을 의미한다. obR 뉴클레오티드 서열들은 게놈 DNA(예컨대, obR 유전자)를 포함하는 DNA, 또는 cDNA 또는 RNA를 포함한다.obR nucleotide or coding sequence: Refers to an ObR protein, a polypeptide or peptide fragment of an ObR protein, or nucleotide sequences encoding an ObR fusion protein. obR nucleotide sequences include DNA comprising genomic DNA (eg, obR gene), or cDNA or RNA.

ObR: Ob 수용체 단백질을 의미한다.ObR: Ob receptor protein.

ObR 단백질의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편들을 ObR 폴리펩타이드 또는 ObR 펩타이드라 칭한다. ObR 또는 ObR 폴리펩타이드 또는 ObR 펩타이드들의 관련 단백질에 대한 융합물을 본원에서는 ObR 융합단백질이라 한다. 기능성 ObR은 생체내 및 생체외에서 높은 친화성을 가지고 ObR에 결합하는 단백질을 의미한다.Polypeptide or peptide fragments of the ObR protein are called ObR polypeptides or ObR peptides. Fusions of ObR or ObR polypeptides or related proteins of ObR peptides are referred to herein as ObR fusion proteins. Functional ObR refers to a protein that binds to ObR with high affinity in vivo and ex vivo.

ECD:"세포외 도메인"을 의미한다.ECD: means “extracellular domain”.

TM: "막간 도메인"을 의미한다.TM: means "intermembrane domain".

CD: "세포질 도메인"을 의미한다.CD: means "cytoplasmic domain".

본 발명은 포유동물의 체중 조절에 관여하는 수용체 단백질인 Ob 수용체 (ObR)를 코드화하는 뉴클레오티드들의 발견, 동정(identification) 및 특성화(characterization)에 관계한다. 본 발명은 비만증, 카헥시(cachexia) 및 식욕부진을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 체중장애(body weight disorder)의 진단, 약물 스크리닝, 임상실험 모니터링, 및/또는 치료에 이용될 수 있는, obR 뉴클레오티드, 숙주세포 발현 시스템, ObR 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드, 수용체에 대한 항체, obR 형질전환유전자(transgene)를 발현하는 형질전환 동물 또는 ObR를 발현하지 않는 재조합 녹-아웃 동물(knock-out animal), 수용체의 길항물질(antagonists) 및 작동물질(agonists), 및 기타의 obR 유전자 발현 및 ObR 활성을 조절하는 화합물들을 포함한다.The present invention relates to the discovery, identification and characterization of nucleotides encoding the Ob receptor (ObR), a receptor protein involved in weight control in mammals. The invention may be used in the diagnosis, drug screening, clinical trial monitoring, and / or treatment of body weight disorders, including but not limited to obesity, cachexia and anorexia, obR nucleotides, host cell expression systems, ObR proteins, fusion proteins, polypeptides and peptides, antibodies to receptors, transgenic animals expressing the obR transgene or recombinant knock-out animals that do not express ObR -out animals, antagonists and agonists of receptors, and other compounds that modulate obR gene expression and ObR activity.

도 1. 쥐의 짧은 형태 ObR 단백질(894 아미노산)을 코드화하는 쥐 obR(짧은 형태) cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 1) 및 추론 아미노산 서열(서열 2). 짧은 형태 쥐 ObR의 도메인들은 : 신호서열(아미노산 잔기 1 내지 약 22), 세포외 도메인(아미노산 잔기 약 23 부터 약 837까지), 막간 도메인(아미노산 잔기 약 838 부터 약 860까지), 세포질 도메인(아미노산 잔기 약 861 부터 약 894까지). 세포외도메인내의 잠재적인 N-말단 결합 포도당화 부위(N-linked glycosylation sites)들은 N-X-S와 N-X-T 모티브의 처음 아미노산 위에 애스터리스크(*)로 표현하였다. 밑줄 친 부분은 클래스 Ⅰ 싸이토카인 수용체 군에서 보존된 모티브들을 가리킨다.Figure 1. Nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of murine obR (short form) cDNA encoding murine short form ObR protein (894 amino acids). The domains of the short form mouse ObR are: signal sequence (amino acid residues 1 to about 22), extracellular domain (amino acid residues from about 23 to about 837), intermembrane domain (amino acid residues from about 838 to about 860), cytoplasmic domain (amino acids Residues from about 861 to about 894). Potential N-terminal glycosylation sites in the extracellular domain are expressed as asterisks (*) on the first amino acids of the N-X-S and N-X-T motifs. Underlined parts indicate conserved motifs in the Class I cytokine receptor family.

도 2A-2B. AP-Ob 융합단백질 결합 연구.2A-2B. AP-Ob fusion protein binding study.

도 2A. obR cDNA에 의해 트랜스펙션된 COS-7 세포들을 1 nM(DMEM+10% FBS내에 희석)의 여러 가지 AP 또는 AP-Ob 융합단백질로 처리하였다. 칼럼들은 2회의 결합 측정값의 평균이고 오차 막대는 둘 사이의 차이를 나타낸다. 1) 융합되지 않은 AP, 2) AP-Ob(마우스), 3) AP-Ob(마우스) + 100 nM 마우스 Ob, 4) AP-Ob(마우스) + 100 nM 사람 Ob, 5) AP-Ob(사람), 6) Ob-AP(마우스), 7) mock 트랜스펙션된(벡터-삽입물 없음) COS-7 세포들과 함께 인큐베이션된 AP-Ob(마우스).Figure 2A. COS-7 cells transfected with obR cDNA were treated with 1 nM (diluted in DMEM + 10% FBS) of various AP or AP-Ob fusion proteins. The columns are the average of two combined measurements and the error bars represent the difference between the two. 1) unfused AP, 2) AP-Ob (mouse), 3) AP-Ob (mouse) + 100 nM mouse Ob, 4) AP-Ob (mouse) + 100 nM human Ob, 5) AP-Ob ( Human), 6) Ob-AP (mouse), 7) AP-Ob (mouse) incubated with mock transfected (no vector-insert) COS-7 cells.

도 2B. AP-Ob와 ObR의 상호작용의 결합 등온선 및 Scatchard 분석. obR cDNA에 의해 트랜스펙션된 COS-7 세포들을 다양한 농도의 AP-Ob (마우스) 융합단백질과 함께 인큐베이션하였다. Scatchard 형질전환은 삽입화로 도시하였다.Figure 2B. Combined isotherm and Scatchard analysis of the interaction of AP-Ob with ObR. COS-7 cells transfected with obR cDNA were incubated with various concentrations of AP-Ob (mouse) fusion protein. Scatchard transformation is shown by inset.

도 3. 사람 ObR 단백질을 코드화하는 사람 obR cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 3) 및 추론 아미노산 서열(서열 4). 사람 ObR의 도메인들은 다음과 같다: 신호서열(아미노산 잔기 1 부터 약 20 까지), 세포외 도메인(아미노산 잔기 약 21 부터 약 839까지), 막간 도메인(아미노산 잔기 약 840 부터 약 862까지), 세포질 도메인(아미노산 잔기 약 863 부터 약 1165까지). 5-비해독 뉴클레오티드 서열들도 도시하였다. 세포외 도메인내의 잠재적인 N-결합 포도당화부위들은 N-X-S와 N-X-T 모티브의 처음 아미노산 위에 애스터리스크(*)로 표현하였다. 밑줄 친 부분은 클래스 Ⅰ 싸이토카인 수용체 군에서 보존된 모티브들을 가리킨다.3. Nucleotide sequence of human obR cDNA encoding human ObR protein (SEQ ID NO: 3) and inferred amino acid sequence (SEQ ID NO: 4). The domains of human ObR are as follows: signal sequence (amino acid residues 1 to about 20), extracellular domain (amino acid residues about 21 to about 839), intermembrane domain (amino acid residues about 840 to about 862), cytoplasmic domain (Amino acid residues from about 863 to about 1165). 5-nontranslated nucleotide sequences are also shown. Potential N-linked glycosylation sites in the extracellular domain are expressed as asterisks (*) on the first amino acids of the N-X-S and N-X-T motifs. Underlined parts indicate conserved motifs in the Class I cytokine receptor family.

도 4. 쥐 ObR 및 사람 gp-130의 세포외 도메인들의 배열. 동일한 잔기(검정색) 및 보존적 변화들(회색)은 해당 아미노산 주위를 음영을 주어 표현하였다. 표시된 보존적 변화들은 FASTA에 의해 정해진 것들이다.4. Array of extracellular domains of rat ObR and human gp-130. Identical residues (black) and conservative changes (grey) are represented by shading around that amino acid. Conservative changes indicated are those determined by FASTA.

도 5. 마우스 ObR(도 1에 도시된 짧은 형태) 및 사람 ObR의 배열. 두 가지의 서열 사이의 동일한 아미노산들은 별표로 표시하였다.5. Array of mouse ObR (short form shown in FIG. 1) and human ObR. Identical amino acids between the two sequences are marked with an asterisk.

도 6. 쥐의 긴 형태 ObR 단백질을 코드화하는 쥐 긴 형태 obR cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추론 아미노산 서열. 쥐 긴 형태 ObR의 도메인들은 다음과 같다: 신호서열(아미노산 잔기 1 내지 약 22), 세포외 도메인(아미노산 잔기 약 23 부터 약 837까지), 막간 도메인(아미노산 잔기 약 838 부터 약 860까지), 및 세포질 도메인(아미노산 잔기 약 861 부터 약 1162까지).6. Nucleotide and deduced amino acid sequences of murine long form obR cDNA encoding murine long form ObR protein. The domains of the murine long form ObR are as follows: signal sequence (amino acid residues 1 to about 22), extracellular domain (amino acid residues about 23 to about 837), intermembrane domain (amino acid residues about 838 to about 860), and Cytoplasmic domain (amino acid residues from about 861 to about 1162).

도 7. 사람 및 쥐 ObR의 긴 형태의 배열. 동일한 잔기 및 보존적 변화들은 각각 두 개의 애스터리스크 또는 하나의 애스터리스크로 표현하였다. 표시된 보존적 변화들은 FASTA에 의해 정해진 것들이다. 약어: mobr-1, 쥐 ObR 긴 형태, 및 hobr, 사람 상동물.7. Array of long forms of human and rat ObR. Identical residues and conservative changes were expressed as two asterisks or one asterisk, respectively. Conservative changes indicated are those determined by FASTA. Abbreviations: mobr-1, rat ObR long form, and hobr, human molar.

도 8. 마우스 염색체 4 상의 ObR을 코드화하는 유전자의 위치.8. Location of gene encoding ObR on mouse chromosome 4.

도 9. db/db의 긴 형태 전사체내의 106 염기쌍 삽입물의 뉴클레오티드 서열. 삽입부위 부근의 추론 아미노산 서열내의 정확한 삽입 위치를 도시하였다.9. Nucleotide sequence of 106 base pair insert in db / db long form transcript. The exact position of insertion in the inferred amino acid sequence near the insertion site is shown.

도 10. Ob 단백질의 obR-Ig 중화를 도시한 막대그래프. COS 세포들을 일시적으로 obR cDNA로 트랜스펙션하여 그들의 0.5 nM AP-Ob에 대한 결합능력을 시험하였다. 칼럼 1은 ObR-IgG 융합단백질이 존재하지 않는 상태에서 관찰된 높은 수준의 특이적 결합을 나타낸다. 칼럼 2, 3 및 4는 정제된 ObR-IgG의 세 가지 상이한 칼럼 분획들에 의해 관찰된 거의 완전한 결합의 억제를 나타낸다.10. Histogram depicting obR-Ig neutralization of Ob protein. COS cells were transiently transfected with obR cDNA to test their binding to 0.5 nM AP-Ob. Column 1 shows the high level of specific binding observed in the absence of ObR-IgG fusion protein. Columns 2, 3 and 4 show the inhibition of nearly complete binding observed by three different column fractions of purified ObR-IgG.

도 11A. ObR 단백질의 다양한 C-말단 결실 돌연변이체들의 개략도. 단백질들의 명칭 및 예상 길이(aa)는 각 단백질 위에 표기하였다. 세포외 도메인은 줄무늬로 도시하였고, 막간 도메인은 검정색으로 도시하였으며, 세포질 도메인은 백색으로 표현하였다. 세포질 도메인내의 티로신 잔기들의 위치는 수평선(Y986, Y1079 및 Y1141은 사람과 쥐 ObR 사이에 보존되었다)으로 표현하였다. 세포질 도메인의 길이(aa)는 각 단백질 위에 표시하였다.Figure 11A. Schematic of various C-terminal deletion mutants of ObR protein. The names and expected lengths (aa) of the proteins are indicated above each protein. Extracellular domains are shown in stripes, transmembrane domains are shown in black, and cytoplasmic domains are shown in white. The location of tyrosine residues in the cytoplasmic domain is represented by horizontal lines (Y986, Y1079 and Y1141 were conserved between human and rat ObR). The length of the cytoplasmic domain (aa) is indicated above each protein.

도 11B. IL-6RE-CAT 발현 구조물(상단 패널) 또는 HRRE-CAT 발현 구조물(하단 패널) 및 도 11a의 ObR 결실 돌연변이체들을 이용한 CAT 분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 ObR 돌연변이체 및 IL-6RE-CAT 또는 HRRE-CAT를 코드화하는 cDNA로 트랜스펙션시켰다. 세포들의 2차배양세포들을 무혈청 배지(serum-free medium) 단독(-)으로 마우스 렙틴을 포함하는 무혈청 배지(+)로 처리하였다. CAT 활성을 측정하여 비처리 대조군 배양세포에서 수득된 값에 대한 대해 표현하였다.Figure 11B. Bar graph showing the results of CAT analysis using the IL-6RE-CAT expression construct (top panel) or HRRE-CAT expression construct (bottom panel) and the ObR deletion mutants of FIG. 11A. H-35 cells were transfected with ObR mutants and cDNA encoding IL-6RE-CAT or HRRE-CAT. Secondary cells of the cells were treated with serum-free medium (serum-free medium) alone (-) with serum-free medium containing mouse leptin (+). CAT activity was measured and expressed against the values obtained in untreated control culture cells.

도 12. AP-Ob 융합단백질 결합분석의 결과를 도시한 막대그래프. COS-7 세포들을 표기한 ObR 단백질을 코드화하는 cDNA로 트랜스펙션시켰다. 48시간 후 1 mM AP-Ob 융합단백질과 함께 인큐베이션하였다. 막대는 두 가지 결합분석의 평균값이다. 오차 막대는 둘 사이의 차이를 나타낸다.12. Bar graph showing the results of the AP-Ob fusion protein binding assay. COS-7 cells were transfected with cDNA encoding the ObR protein labeled. After 48 hours incubation with 1 mM AP-Ob fusion protein. Bars are the mean of two binding assays. Error bars represent the difference between the two.

도 13A. 다양한 돌연변이 ObR 단백질의 개략도. 티로신 잔기 986과 1079의 위치도 표기하였다. "박스 1(box 1)" 서열의 위치도 표기하였다.Figure 13A. Schematic of various mutant ObR proteins. The positions of tyrosine residues 986 and 1079 are also indicated. The location of the “box 1” sequence is also indicated.

도 13B. HRRE-CAT 유도분석(induction assay)의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 HRRE-CAT 및 OB-RY986F, OB-RY1079F 또는 OB-R(box 1mt)에 대한 발현 구조물을 공동-트랜스펙션(co-transfection)시켰다. 세포들의 2차배양세포들을 사람 렙틴을 함유하는 무혈청 배지로 24시간 동안 처리하였다. CAT 활성을 측정하여 비처리 대조군 배양세포에 대하여 수득된 값에 대하여 표현하였다.Figure 13B. Bar graph depicting the results of the HRRE-CAT induction assay. H-35 cells were co-transfected with expression constructs for HRRE-CAT and OB-RY986F, OB-RY1079F or OB-R (box 1mt). Secondary cells of cells were treated with serum-free medium containing human leptin for 24 hours. CAT activity was measured and expressed against the values obtained for untreated control cultured cells.

도 14A. 다양한 수용체 키메라들의 개략도. G-CSFR로부터 유래된 부분들은 음영을 주어 표현하였고; ObR로부터 유래된 부분은 음영을 주지 않았다. 박스 1, 박스 2, 및 박스 3 모티브들의 위치도 도시하였다.Figure 14A. Schematic of various receptor chimeras. Portions derived from G-CSFR are shaded; The part derived from ObR was not shaded. The locations of Box 1, Box 2, and Box 3 motifs are also shown.

도 14B. IL-6RE-CAT(좌측 패널) 및 HRRE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 표기한 수용체(ObR, G-CSFR, 또는 키메라)에 대한 발현 플라스미드, 및 IL-6RE-CAT 또는 HRRE-CAT 발현 구조물에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 적당한 리간드에 의해 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다 (3-4 실험의 평균±표준편차).Figure 14B. Bar graph showing the results of IL-6RE-CAT (left panel) and HRRE-CAT induction analysis. H-35 cells were co-transfected with an expression plasmid for the indicated receptor (ObR, G-CSFR, or chimera), and an IL-6RE-CAT or HRRE-CAT expression construct. Cells were stimulated with appropriate ligand and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells (mean ± standard deviation of 3-4 experiments).

도 15A. HRRE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 HRRE-CAT 및 표시한 양의 ObR 및 OB-RΔ868-1165에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 렙틴으로 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다.15A. Bar graph showing the results of HRRE-CAT induction analysis. H-35 cells were co-transfected with HRRE-CAT and indicated amounts of ObR and OB-RΔ868-1165. Cells were stimulated with leptin and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells.

도 15B. IL-6RE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 IL-6RE-CAT 및 표시한 양의 ObR/G-CSFR 및 OB-RΔ868-1165에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 렙틴으로 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다.Figure 15B. Bar graph showing the results of the IL-6RE-CAT induction assay. H-35 cells were co-transfected with IL-6RE-CAT and indicated amounts of ObR / G-CSFR and OB-RΔ868-1165. Cells were stimulated with leptin and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells.

도 15C. IL-6RE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 IL-6RE-CAT 및 표시한 양의 G-CSFR 및 G-CSFR(Δcyto)에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 G-CSF로 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다.Figure 15C. Bar graph showing the results of the IL-6RE-CAT induction assay. H-35 cells were co-transfected with IL-6RE-CAT and indicated amounts of G-CSFR and G-CSFR (Δcyto). Cells were stimulated with G-CSF and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells.

도 15D. IL-6RE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 IL-6RE-CAT 및 표시한 양의 G-CSFR/ObR 및 G-CSFR(Δcyto)에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 G-CSF로 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다.15D. Bar graph showing the results of the IL-6RE-CAT induction assay. H-35 cells were co-transfected with IL-6RE-CAT and indicated amounts of G-CSFR / ObR and G-CSFR (Δcyto). Cells were stimulated with G-CSF and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells.

도 15E. IL-6RE-CAT 유도분석의 결과를 도시한 막대그래프. H-35 세포들을 IL-6RE-CAT 및 표시한 양의 ObR 및 OB-RY1141F에 의해 공동-트랜스펙션시켰다. 세포들을 렙틴으로 자극하고 도 11b에 기술된 실험에 따라 CAT 활성을 측정하였다. 모든 값들은 비처리 대조군 배양세포에 대해 표현하였다.15E. Bar graph showing the results of the IL-6RE-CAT induction assay. H-35 cells were co-transfected with IL-6RE-CAT and indicated amounts of ObR and OB-RY1141F. Cells were stimulated with leptin and CAT activity was measured according to the experiment described in FIG. 11B. All values were expressed for untreated control cultured cells.

본원에서 처음으로 기술되는 ObR은 체중조절에 관여하는 신규한 수용체 단백질이다. ObR은 막에 걸쳐있고, 싸이토카인 수용체의 클래스 Ⅰ 군에 속하는 막간 단백질(transmembrane protein)이며, IL-6 수용체, G-CSF 수용체, 및 LIF 수용체의 gp-130 신호변환 성분과 가장 밀접하게 관련된다. 신호변환은 수용체에 대한 Ob의 결합에 의해 개시된다. Ob의 중화, Ob의 제거, 또는 ObR에 대한 그의 결합의 방해는 체중 증가를 초래한다. obR mRNA는 맥락막총 및 시상하부를 포함하는 다른 조직에서 발견된다.ObR, first described herein, is a novel receptor protein involved in weight control. ObR is a transmembrane protein that spans the membrane and belongs to the Class I group of cytokine receptors and is most closely associated with the gp-130 signal transduction components of the IL-6 receptor, the G-CSF receptor, and the LIF receptor. Signal transduction is initiated by the binding of Ob to a receptor. Neutralization of Ob, removal of Ob, or obstruction of its binding to ObR results in weight gain. obR mRNA is found in other tissues including the choroid plexus and hypothalamus.

본 발명은 obR 뉴클레오티드, ObR 단백질 및 펩타이드는 물론 ObR에 대한 항체(예를 들어, ObR 길항물질 또는 작동물질로 기능할 수 있는), 수용체 활성 또는 발현을 억제하는 길항물질, 또는 수용체 활성을 활성화하거나 그의 발현을 증가시키는 작동물질을 사람을 포함하는 동물의 비만증, 카헥시(cachexia) 및 식욕부진을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 체중장애(body weight disorder)의 진단 및 치료에 이용하는 것을 포함한다. 환자에 있어서, ObR 이상(abnormality) 또는 ObR 신호 변환 경로의 이상의 진단은 적절한 치료방법 또는 치료적 섭생을 안출하는데 도움이 될 것이다. 또한, obR 뉴클레오티드 및 ObR 단백질들은 ObR에 의해 조절되는 체중장애의 치료에 효과적인 화합물의 동정에 유용하다.The present invention activates obR nucleotides, ObR proteins and peptides, as well as antibodies to ObR (eg, can function as ObR antagonists or agonists), antagonists that inhibit receptor activity or expression, or receptor activity, Agonists that increase their expression include use in the diagnosis and treatment of body weight disorders including but not limited to obesity, cachexia, and anorexia in animals including humans . In a patient, diagnosis of ObR abnormality or abnormality of the ObR signal transduction pathway will help to identify an appropriate treatment or therapeutic regimen. In addition, obR nucleotides and ObR proteins are useful for the identification of compounds that are effective in the treatment of weight disorders controlled by ObR.

특히, 이하의 소단원에 기술된 본 발명은 ObR, ObR의 기능성 도메인들(예컨대, ECD, TM, 또는 CD)에 해당하는 폴리펩타이드, 또는 펩타이드들, 돌연변이되었거나 절두되었거나 또는 결실된 ObR(예컨대, 하나 이상의 기능성 도메인들 또는 ΔTM 및/또는 ΔCD와 같은 결실된 그들의 일부분들을 포함하는 ObR), ObR 융합단백질들(예컨대, ObR 또는 ECD와 같은 ObR의 기능성 도메인이 면역글로불린 불변부위(IgF_c)와 같은 관련이 없는 단백질 또는 펩타이드에 융합된 것), 이러한 산물들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 ObR 산물들을 생산할 수 있는 숙주세포발현시스템을 포함한다.In particular, the invention described in the following subsections relates to polypeptides or peptides corresponding to ObR, the functional domains of ObR (eg, ECD, TM, or CD), mutated, truncated or deleted ObR (eg, one). ObR comprising the above functional domains or portions thereof deleted such as ΔTM and / or ΔCD), ObR fusion proteins (eg, functional domains of ObR such as ObR or ECD are immunoglobulin constant regions (IgF _c ) Fused to unrelated proteins or peptides), nucleotide sequences encoding these products, and host cell expression systems capable of producing these ObR products.

본 발명은 정해진 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 Ob 수용체들을 특징으로 한다.The present invention features Ob receptors having an amino acid sequence substantially identical to a given amino acid sequence.

"실질적으로 동일하다"는 것은 폴리펩타이드 또는 뉴클레오티드가 기준 아미노산 또는 핵산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 90%, 및 더욱 바람직하게 95% 이상 동일한 서열을 갖는 것을 의미한다. 폴리펩타이드의 경우에, 기준 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 16 아미노산, 바람직하게 적어도 20 아미노산, 더욱 바람직하게 적어도 25 아미노산, 및 가장 바람직하게, 35 아미노산들일 것이다. 핵산의 경우에, 기준 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 50 뉴클레오티드들, 바람직하게 적어도 60 뉴클레오티드들, 더욱 바람직하게 적어도 75 뉴클레오티드들, 및 가장 바람직하게 110 뉴클레오티드들이다."Substantially identical" means that the polypeptide or nucleotide has a sequence that is at least 85%, preferably 90%, and more preferably at least 95% identical to the reference amino acid or nucleic acid sequence. In the case of a polypeptide, the length of the reference polypeptide sequence will generally be at least 16 amino acids, preferably at least 20 amino acids, more preferably at least 25 amino acids, and most preferably 35 amino acids. In the case of nucleic acids, the length of the reference nucleic acid sequence is generally at least 50 nucleotides, preferably at least 60 nucleotides, more preferably at least 75 nucleotides, and most preferably 110 nucleotides.

서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예컨대, 위스콘신주 53705, 매디슨, 유니버시티 애버뉴 1710, 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크날러지 센터 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹의 서열분석 소프트웨어 패키지)를 이용하여 측정할 수 있다.Sequence identity can be measured using sequence analysis software (eg, sequencing software package from the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 53705, Madison, University Avenue 1710, Wisconsin).

폴리펩타이드 서열이 기준 서열과 100% 미만의 동일성을 갖는 서열의 경우에, 동일하지 않는 부분들은 바람직하게, 반드시 그런 것은 아니지만, 기준 서열에 대해 보존적 치환(conservative substitutions)이다. 보존적 치환이란 다음 그룹내의 치환을 의미한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라진 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.In the case of sequences where the polypeptide sequence has less than 100% identity with the reference sequence, the portions that are not identical are preferably, but not necessarily, conservative substitutions for the reference sequence. Conservative substitutions means substitutions within the following groups: glycine and alanine; Valine, isoleucine, and leucine; Aspartic acid and glutamic acid; Asparagine and glutamine; Serine and threonine; Lysine and arginine; And phenylalanine and tyrosine.

특정한 폴리펩타이드가 정해진 길이의 기준 폴리펩타이드에 대해 특정한 퍼센트 동일성을 갖는다고 말해지는 경우에, 퍼센트 동일성은 기준 펩타이드에 대한 것이다. 따라서, 100 아미노산 길이의 기준 폴리펩타이드에 대해 50% 동일한 펩타이드는 기준 폴리펩타이드의 50 아미노산 길이 부분과 완전히 동일한 50 아미노산 폴리펩타이드일 수 있다. 그것은 그의 전체 길이를 초과하는 기준 폴리펩타이드와 50% 동일한 100 아미노산 길이 폴리펩타이드일 수도 있다. 물론 다른 많은 폴리펩타이드들이 동일한 기준을 만족시킬 것이다.If a particular polypeptide is said to have a specific percent identity to a reference polypeptide of a given length, then the percent identity is relative to the reference peptide. Thus, a peptide that is 50% identical to a 100 amino acid long reference polypeptide may be a 50 amino acid polypeptide that is exactly the same as the 50 amino acid length portion of the reference polypeptide. It may be a 100 amino acid length polypeptide 50% identical to a reference polypeptide exceeding its entire length. Of course many other polypeptides will meet the same criteria.

본 발명은 항체들과 항-이디오타입 항체(Fab 단편 포함), ObR의 길항물질과 작동물질은 물론 obR 유전자의 발현을 억제하는 화합물 또는 뉴클레오티드 구조물(전사인자 억제제, 안티센스 및 리보자임 분자들, 또는 유전자 또는 조절서열 대체 구조물), 또는 ObR의 발현을 증가시키는 화합물 또는 뉴클레오티드(예컨대, obR 코드화 서열이 프로모터, 프로모터/인헨서 등과 같은 발현조절요소와 기능가능하도록 연결되어 있는 발현 구조물들)도 포함한다. 본 발명은 사람 ObR을 발현하거나 동물의 내성 ObR의 발현을 억제하거나 "녹-아웃" 시키도록 유전자조작된 숙주세포 또는 동물(또는 그의 돌연변이체)에도 관계한다.The present invention relates to antibodies and anti-idiotype antibodies (including Fab fragments), antagonists and agonists of ObR as well as compounds or nucleotide constructs that inhibit the expression of the obR gene (transcription factor inhibitors, antisense and ribozyme molecules, Or genes or regulatory sequence replacement constructs, or compounds or nucleotides that increase the expression of ObR (eg, expression constructs in which the obR coding sequence is functionally linked to expression regulatory elements such as promoters, promoters / enhancers, etc.) do. The invention also relates to a host cell or animal (or mutant thereof) that has been engineered to express human ObR or to inhibit or "knock out" the expression of resistant ObR in an animal.

ObR 단백질 또는 펩타이드, ObR 융합단백질, obR 뉴클레오티드 서열, 항체, 길항물질 및 작동물질은 비만증, 카헥시 및 식욕부진을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 체중장애의 진단을 위해 돌연변이 ObR 또는 부적절하게 발현된 ObR을 검출하는데 유용할 수 있다. ObR 단백질 또는 펩타이드, ObR 융합단백질, obR 뉴클레오티드 서열, 숙주세포 발현시스템, 항체, 길항물질, 작동물질, 및 유전자조작된 세포들 및 동물들은 이러한 체중장애의 치료에 효과적인 약물의 스크리닝에 이용될 수 있다. 유전자조작된 숙주세포들 및/또는 동물들의 이용은 이러한 시스템들이 ObR의 ECD에 결합하는 화합물들의 동정을 가능하게 할뿐만 아니라 활성화된 ObR에 의한 신호변환에 영향을 미치는 화합물들도 동정할 수 있다는 점에서 이점을 제공할 수 있다.ObR proteins or peptides, ObR fusion proteins, obR nucleotide sequences, antibodies, antagonists and agonists include mutant ObRs or improperly expressed for the diagnosis of weight disorders including, but not necessarily limited to, obesity, carhexy and anorexia It may be useful for detecting an ObR. ObR proteins or peptides, ObR fusion proteins, obR nucleotide sequences, host cell expression systems, antibodies, antagonists, agonists, and engineered cells and animals can be used for the screening of drugs effective for the treatment of such weight disorders. . The use of engineered host cells and / or animals not only allows the identification of compounds that bind to the ECD of ObR, but also the compounds that influence signal transduction by activated ObR. This can provide an advantage.

끝으로, ObR 단백질 산물들(특히, ObR ECD에 해당하는 펩타이드와 같은 가용성 유도체들 또는 TM 도메인이 없는 절두된 폴리펩타이드들) 및 융합단백질 산물들(특히, ObR-Ig 융합단백질들, 즉, ObR 또는 ECD, ΔTM과 같은 일례의 ObR의 도메인의 IgF_c에 대한 융합), 항체 및 항-이디오타입 항체(Fab 단편 포함), 길항물질 또는 작동물질(ObR 신호변환경로에서 하류 표적에 작용할 수 있는 신호변환을 조절할 수 있는 화합물 포함)이 이러한 질병의 치료방법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 유효량의 가용성 ObR ECD, ΔTM ObR 또는 ECD-IgF_c융합단백질 또는 ObR ECD를 의태(mimic)한 항-이디오타입 항체(또는 그의 Fab)의 투여는 내성 Ob를 "제거(mop up)" 하거나 "중화"하고 결합 및 수용체 활성화를 방해하거나 감소시켜, 체중을 증가시킨다. 이러한 ObR 산물들을 코드화하는 뉴클레오티드 구조물들은 숙주들이 생체내에서 이러한 ObR 산물들을 발현하도록 숙주 세포를 유전자조작하는데 이용될 수 있고; 이와 같이 유전자조작된 세포들은 체내에서 Ob를 "제거"하거나 "중화"할 ObR, ObR 펩타이드, 가용성 ECD 또는 ΔTM 또는 ObR 융합단백질들을 계속적으로 공급하는 "바이오리액터(bioreactor)"로 기능한다. 기능적인 ObRs, 돌연변이 ObRs는 물론 안티센스 및 리보자임 분자들은 체중장애의 치료에 있어서 ObR 발현 및/또는 활성의 조절을 위한 "유전자 치료" 접근법에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 체중장애를 치료하는 약제 조성물 및 방법도 포함한다.Finally, ObR protein products (particularly soluble derivatives such as peptides corresponding to ObR ECD or truncated polypeptides without TM domains) and fusion protein products (particularly ObR-Ig fusion proteins, ie ObR Or fusion to IgF _c in domains of an example ObR such as ECD, ΔTM), antibodies and anti-idiotype antibodies (including Fab fragments), antagonists or agonists (which may act on downstream targets in the ObR signal transduction pathway). Compounds that can modulate signal transduction) can be used in the treatment of such diseases. For example, administration of an effective amount of a soluble ObR ECD, ΔTM ObR or ECD-IgF _c fusion protein or an anti-idiotype antibody (or Fab thereof) that mimics the ObR ECD may “mop up” the resistant Ob. ) Or "neutralize" and interfere with or reduce binding and receptor activation, thereby gaining weight. Nucleotide constructs encoding these ObR products can be used to engineer the host cell so that hosts express these ObR products in vivo; Such engineered cells function as "bioreactors" that continuously supply ObR, ObR peptides, soluble ECDs or ΔTM or ObR fusion proteins to "remove" or "neutral" Ob in the body. Functional ObRs, mutant ObRs as well as antisense and ribozyme molecules can be used in a "gene therapy" approach for the regulation of ObR expression and / or activity in the treatment of weight disorders. Accordingly, the present invention also includes pharmaceutical compositions and methods for treating weight disorders.

본 발명은 부분적으로 맥락막총에서 상당한 농도로 발현된 Ob에 대한 고친화성 수용체의 의외의 발견에 기초한다. 이러한 발견은 세포 및 조직의 정상위치(正常所在) 염색(in situ staining)을 위한 신규한 알칼라인 포스파타아제/Ob (AP-Ob) 융합단백질의 이용에 의해 가능하였다. 표지되지 않은 Ob와의 경쟁연구(competition studies)는 관찰된 정상소재 결합이 Ob에 대해 특이적이었다는 것을 입증해준다. 쥐 obR cDNA는 AP-Ob 융합단백질을 이용하여 쥐 맥락막총 mRNA로부터 합성되고 포유동물 COS 세포내에 일시적으로 트랜스펙션된 cDNA의 발현도서관을 스크리닝 함으로써 동정되었다. Ob에 대한 짧은 형태의 고친화성 수용체를 발현하는 하나의 클론, famj5312가 동정되고 서열결정되었다. 서열분석을 통해 obR cDNA 및 추론 아미노산 서열이 ObR이 수용체 단백질의 클래스 Ⅰ군의 구성원임을 말해주는 아미노산 부위를 포함하는 신규한 서열이라는 사실을 밝혀내었다. 본원에 기술된 유전자지도작성은 obR 유전자가 db 부위에 위치한다는 것을 입증한다. 본원에 제시된 데이터들은 db 유전자가 짧은 형태의 쥐 ObR과 동일한 단백질을 코드화하는 비정상적으로 스플라이싱된 obR 긴 형태 메시지를 발현하는 돌연변이 obR 유전자임을 증명한다. famj5312 서열을 사람 태아 뇌 cDNA 도서관을 스크리닝 하는데 이용하여, 본원에 기술된 사람 obR cDNA 클론 fahj5312d를 동정하였다. 사람 cDNA 서열에 기초하여 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하여 역시 본원에 기술된 사람 게놈 DNA 클론, h-obR-p87을 클로닝하였다. 쥐 긴 형태 ObR을 코드화하는 mRNA를 사람 ObR 세포질 도메인 상에 설계된 퇴화 프라이머(degenerate primer)를 이용하여 쥐 시상하부로부터 클로닝하였다.The present invention is based, in part, on the surprising discovery of high affinity receptors for Ob expressed at significant concentrations in the choroid plexus. This finding was made possible by the use of novel alkaline phosphatase / Ob (AP-Ob) fusion proteins for in situ staining of cells and tissues. Competition studies with unlabeled Ob demonstrate that the observed normal material binding was specific for Ob. Murine obR cDNA was identified by screening for expression libraries of cDNA synthesized from murine choroid plexus mRNA and temporarily transfected into mammalian COS cells using AP-Ob fusion proteins. One clone, famj5312, which expresses a short form of high affinity receptor for Ob was identified and sequenced. Sequencing revealed that the obR cDNA and inferred amino acid sequences are novel sequences comprising amino acid sites that tell ObR to be a member of the class I group of receptor proteins. Genetic mapping described herein demonstrates that the obR gene is located at the db site. The data presented herein demonstrate that the db gene is a mutant obR gene that expresses an abnormally spliced obR long form message that encodes the same protein as the short form of rat ObR. The famj5312 sequence was used to screen the human fetal brain cDNA library to identify the human obR cDNA clone fahj5312d described herein. Oligonucleotide primers designed based on human cDNA sequences were used to clone the human genomic DNA clone, h-obR-p87, also described herein. MRNA encoding the murine long form ObR was cloned from the rat hypothalamus using degenerate primers designed on the human ObR cytoplasmic domain.

본 발명의 여러 가지 양상들을 이하에서 더욱 상세히 설명한다.Various aspects of the invention are described in greater detail below.

A. ObR 유전자A. ObR gene

쥐 짧은 형태(894 아미노산 길이) 및 쥐 긴 형태 ObR의 cDNA 서열(서열 1) 및 추론 아미노산 서열(서열 2)을 각각 도 1 및 도 6에 도시하였다. 양자의 쥐 짧은 및 긴 형태 ObR의 신호서열은 각각 도 1 및 6에서 아미노산 잔기 1부터 22까지이다; 양자의 형태의 쥐 ObR의 세포외 도메인은 도 1 및 6에서 아미노산 잔기 약 23부터 약 837까지이다; 양자의 형태의 쥐 ObR의 막간 도메인은 도 1 및 6에서 아미노산 잔기 약 838부터 약 860까지이다; 그리고 짧은 형태 쥐 ObR의 세포질 도메인은 도 1에서 약 아미노산 잔기 861부터 894까지인 반면에, 긴 형태 쥐 ObR의 세포질 도메인은 도 6에서 아미노산 잔기 861부터 1162까지이다. 도 1에 도시된 서열에 비해 하나의 아미노산만큼(즉, 893 아미노산) 짧은 적어도 하나의 다른 짧은 형태 쥐 ObR이 확인되었다. C-말단의 서열이 도 1에 도시된 것과 상이한데, 890-894 잔기(RTDTL)가 존재하지 않고; 그 대신에 두 번째 짧은 형태의 잔기 890-893은 다음과 같은 서열을 갖는다: IMWI.The cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the murine short form (894 amino acid length) and murine long form ObR are shown in FIGS. 1 and 6, respectively. The signal sequences of both murine short and long forms ObR are amino acid residues 1 to 22 in FIGS. 1 and 6, respectively; The extracellular domain of both forms of rat ObR is from amino acid residues about 23 to about 837 in FIGS. 1 and 6; The transmembrane domain of the rat ObR in both forms is from amino acid residues about 838 to about 860 in FIGS. 1 and 6; And the cytoplasmic domain of the short form rat ObR is from about amino acid residues 861 to 894 in FIG. 1, while the cytoplasmic domain of the long form rat ObR is from amino acid residues 861 to 1162 in FIG. 6. At least one other short form rat ObR has been identified that is as short as one amino acid (ie, 893 amino acids) relative to the sequence shown in FIG. 1. The C-terminal sequence is different from that shown in Figure 1, where there are no 890-894 residues (RTDTL); Instead, the second short form of residues 890-893 has the following sequence: IMWI.

사람 ObR의 cDNA 서열(서열 3) 및 추론 아미노산 서열(서열 4)을 도 3에 도시하였다. 사람 ObR 신호서열은 각각 도 3에서 아미노산 잔기 1부터 20까지이다; 사람 ObR의 세포외 도메인은 도 3에서 아미노산 잔기 약 21부터 약 839까지이다; 사람 ObR의 막간 도메인은 도 3에서 아미노산 잔기 약 840부터 약 862까지이다; 그리고 사람 ObR의 세포질 도메인은 도 3에서 아미노산 잔기 약 863부터 약 1165까지이다. 사람 cDNA 클론으로부터 유래된 서열을 하기 실시예에 기술된 사람 게놈 obR, h-obR-p87을 클로닝하는데 이용된 프라이머를 설계하는데 이용하였다.The cDNA sequence of human ObR (SEQ ID NO: 3) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) are shown in FIG. Human ObR signal sequences are amino acid residues 1 to 20 in FIG. 3, respectively; The extracellular domain of human ObR is from amino acid residues about 21 to about 839 in FIG. 3; The transmembrane domain of the human ObR is from amino acid residues about 840 to about 862 in FIG. 3; And the cytoplasmic domain of human ObR is from amino acid residues about 863 to about 1165 in FIG. 3. Sequences derived from human cDNA clones were used to design the primers used to clone the human genome obR, h-obR-p87, described in the Examples below.

후술하는 실시예에 제시된 데이터들은 obR 유전자가 db 부위에 위치하고, db 유전자는 db 마우스에서 비정상적으로 스플라이싱된 전사체로 발현되어 ObR의 세포질 도메인을 코드화하는 부분에 약 106 뉴클레오티드(nt) 길이의 삽입물을 포함하는 mRNA 종을 결과시키는 돌연변이 obR 유전자라는 것을 증명한다. 삽입물은 쥐 짧은 형태 ObR과 동일한 조기에 절두된 긴 형태(prematurely)를 코드화하는 전사체를 결과시키는 돌연변이를 유발한다.The data presented in the Examples below will show that the obR gene is located at the db site, the db gene is expressed as an abnormally spliced transcript in db mice and encodes about 106 nucleotides (nt) in the region encoding the cytoplasmic domain of ObR. Prove that it is a mutant obR gene resulting in mRNA species comprising. The inserts induce mutations that result in transcripts encoding prematurely prematurely truncated identical to the murine short form ObR.

본 발명의 obR 뉴클레오티드 서열들은 다음을 포함한다: (a) 도 1, 3 또는 6에 도시되거나 또는 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁된 이. 콜라이 균주 5312B4F3내의 cDNA 클론 famj5312내에 포함된 서열 또는 ATCC에 기탁된 이. 콜라이 균주 h-obRD내의 cDNA 클론 famj5312d내에 포함된 서열 또는 ATCC에 기탁된 사람 게놈 클론, h-obR-p87내에 포함된 DNA 서열; (b) 도 1, 3 또는 6에 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 famj5312 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d에 의해 코드화된 ObR 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁된 사람 게놈 클론, h-obR-p87내에 포함된 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 도 1, 3 또는 6에 도시된 DNA 서열의 보체 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 famj5312내에 포함되거나 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d내에 포함된 서열 또는 ATCC에 기탁된 사람 게놈 클론, h-obR-p87내에 포함된 DNA 서열의 보체(complement)와 고엄격성 조건(예컨대, 65℃하에서 0.5 M NaHPO₄, 7% 소디움도데실설페이트(SDS), 1mM EDTA내에서 막-결합 DNA와 혼성화하고, 68℃하에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 세정[Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. Ⅰ, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York, at p2.10.3])하에서 혼성화하고 기능적으로 균등한 유전자 산물을 코드화할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열; 및 (d) ATCC에 기탁된 cDNA 클론 famj5312내에 포함되거나 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d내에 포함되거나 또는 ATCC에 기탁된 사람 게놈 클론, h-obR-p87내에 포함된, 도 1, 3 또는 6에 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열의 보체와 중간 정도의 엄격성 조건(예컨대, 42℃하에서 0.2×SSC/0.1% SDS로 세정[Ausubel et al., 1989, 상술한 것과 동일한 문헌])하에서 혼성화하고 기능적으로 균등한 obR 유전자 산물을 코드화하는 임의의 뉴클레오티드 서열. ObR의 기능적인 균등물은 다른 종에서 존재하는 천연 ObR 및 천연 또는 유전자조작된 돌연변이 ObR을 포함한다. 본 발명은 서열 (a) 내지 (d)의 퇴화 변이체(degenerate variants)들도 포함한다.The obR nucleotide sequences of the present invention include: (a) E. coli or as deposited in the American Type Culture Collection (ATCC) shown in FIGS. E. deposited in the ATCC or sequences contained in cDNA clone famj5312 in E. coli strain 5312B4F3. The sequence contained in cDNA clone famj5312d in E. coli strain h-obRD or the human genomic clone deposited in ATCC, DNA sequence contained in h-obR-p87; (b) the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in FIGS. 1, 3 or 6 or the cDNA clone famj5312 deposited in ATCC or the cDNA clone fahj5312 deposited in ATCC or the ObR amino acid sequence encoded by ATCC or the human genomic clone deposited in ATCC a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence contained within h-obR-p87; (c) human genome clones deposited in the ATCC or sequences contained in the cDNA clone famj5312 deposited in the ATCC or the complement of the DNA sequences shown in FIGS. 1, 3 or 6, or deposited in the ATCC, h- Complement of DNA sequence contained in obR-p87 and hybridization with membrane-bound DNA in high stringency conditions (eg, 0.5 M NaHPO ₄ , 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA at 65 ° C.). , Washed with 0.1 × SSC / 0.1% SDS at 68 ° C. [Ausubel FM et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc. , New York, at p2.10.3]), any nucleotide sequence capable of hybridizing and encoding a functionally equivalent gene product; And (d) contained in the cDNA clone famj5312 deposited in ATCC or in the cDNA clone fahj5312d deposited in ATCC or in the human genome clone deposited in ATCC, h-obR-p87, in FIGS. 1, 3 or 6 Hybridization of the DNA sequence encoding the depicted amino acid sequence and hybridization under moderate stringency conditions (eg, washed with 0.2 × SSC / 0.1% SDS at 42 ° C. [Ausubel et al., 1989, the same as described above]). And any nucleotide sequence encoding a functionally equivalent obR gene product. Functional equivalents of ObR include native ObR present in other species and natural or engineered mutant ObR. The invention also includes degenerate variants of sequences (a) to (d).

본 발명은 앞 단락의 뉴클레오티드 서열 (a) 내지 (d)에 혼성화하므로 이들의 보체인 핵산 분자, 바람직하게 DNA 분자들도 포함한다. 이러한 혼성화 조건은 상술한 바와 같이 고도로 엄격하거나 또는 덜 엄격할 수 있다. 핵산 분자가 데옥시올리고뉴클레오티드("올리고스")인 경우에, 고도로 엄격한 조건은 예컨대, 37℃(14-염기 올리고스), 48℃(17-염기 올리고스), 55℃(20-염기 올리고스), 및 60℃(23-염기 올리고스)에서 6×SSC/0.05% 소디움 피로포스페이트로 세정(14-염기 올리고스)하는 것일 수 있다. 이들 핵산 분자들은 예를 들어, obR 유전자 조절(obR 유전자 핵산 서열의 증폭반응에서 안티센스 프라이머에 대하여 또는 안티센스 프라이머로)에 유용한 안티센스 분자들을 코드화하거나 obR 안티센스 분자들로 작용할 수 있다. obR 유전자 조절과 관련해서, 이러한 기술들은 예를 들어, 카헥시 및/또는 식욕부진을 조절하는데 이용될 수 있다. 더욱이, 이러한 서열들은 역시 obR 유전자 조절에 유용한 리보자임 및/또는 삼중나선 서열의 일부로서 이용될 수 있다. 더 나아가서, 이러한 분자들은 진단방법의 구성성분으로 이용되어, 예컨대, 비만증과 같은 체중장애를 유발시키는 특정한 obR 대립유전자의 존재를 검출할 수 있다.The present invention hybridizes to the nucleotide sequences (a) to (d) in the preceding paragraph and therefore includes nucleic acid molecules, preferably DNA molecules, which are complements thereof. Such hybridization conditions may be highly stringent or less stringent as described above. If the nucleic acid molecule is a deoxyoligonucleotide (“oligos”), highly stringent conditions are, for example, 37 ° C. (14-base oligos), 48 ° C. (17-base oligos), 55 ° C. (20-base oligos). And 6xSSC / 0.05% sodium pyrophosphate at 14O < 0 > C (23-base oligos). These nucleic acid molecules can encode or act as obR antisense molecules, for example, which are useful for obR gene regulation (for antisense primers or with antisense primers in the amplification of an obR gene nucleic acid sequence). With respect to obR gene regulation, these techniques can be used, for example, to control carhexi and / or anorexia. Moreover, such sequences can also be used as part of ribozymes and / or triple helix sequences useful for obR gene regulation. Furthermore, these molecules can be used as components of diagnostic methods to detect the presence of certain obR alleles that cause weight disorders such as, for example, obesity.

상술한 obR 뉴클레오티드 서열이외에, 같은 종에 존재하는 전체 길이의 obR cDNA 또는 유전자 서열 및/또는 다른 종에 존재하는 obR 유전자의 상동물들은 불필요한 실험을 거치지 않고도 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 분자생물학 기술을 이용함으로써 동정되고 용이하게 분리될 수 있다. 관련된 종들에 있어서 obR 유전자의 상동물의 동정은 약물 발견의 목적상 사람과 더욱 밀접하게 관련된 동물 모델 시스템을 개발하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 목적 유기체로부터 유래된 맥락막총 mRNA로부터 합성된 cDNA의 발현 도서관은 AP-Ob 융합단백질과 같은 그 종으로부터 유래된 표지된 Ob를 이용하여 스크리닝될 수 있다.In addition to the above-described obR nucleotide sequences, the full-length obR cDNA or gene sequences present in the same species and / or the molar animals of the obR gene present in other species are molecules well known in the art without unnecessary experimentation. By using biological techniques can be identified and easily separated. Identification of the murine of the obR gene in related species may be useful for developing animal model systems that are more closely related to humans for drug discovery purposes. For example, expression libraries of cDNA synthesized from choroid plexus mRNA derived from the organism of interest can be screened using labeled Ob derived from that species, such as AP-Ob fusion proteins.

그렇지 않으면, 목적 유기체로부터 유래된 이와 같은 cDNA 도서관 또는 게놈 DNA 도서관은 본원에 기술된 뉴클레오티드들을 혼성화 또는 증폭 프로브로 이용하여 혼성화에 의해 스크리닝될 수 있다. 더욱이, obR 유전자 산물의 하나 이상의 도메인에 대해 광범위한 상동성을 갖는 단백질들을 코드화하는 게놈내의 다른 유전자 부위에 있는 유전자들은 유사한 기술을 이용하여 동정될 수 있다. cDNA 도서관의 경우에, 이러한 스크리닝 기술은 동일 또는 상이한 종들에서 다르게 스플라이싱된 전사체들로부터 유래된 클론들을 동정할 수 있다.Alternatively, such cDNA libraries or genomic DNA libraries derived from the organism of interest can be screened by hybridization using the nucleotides described herein as hybridization or amplification probes. Moreover, genes at other gene sites in the genome that encode proteins with broad homology to one or more domains of the obR gene product can be identified using similar techniques. In the case of a cDNA library, this screening technique can identify clones derived from differently spliced transcripts in the same or different species.

스크리닝은 2중 필터를 이용하여, 필터 혼성화(filter hybridization)에 의할 수도 있다. 표지된 프로브는 도 1, 3 또는 6에 도시된 바와 같이, obR 뉴클레오티드 서열 적어도 15-30 염기쌍들을 포함할 수 있다. 이용되는 혼성화 세정 조건은 cDNA 도서관이 표지된 서열이 유래된 유기체와 다른 타입의 유기체로부터 유래될 때 낮은 엄격성 조건이어야만 한다. 사람 obR 상동물과 관련하여, 쥐 obR 프로브를 이용할 때, 예를 들어, 혼성화는 65℃에서 밤새도록 쳐치 완충액(7% SDS, 250 mM NaHPO₄, 2μM EDTA, 1% BSA)내에서 행해질 수 있다. 세정은 65℃에서 2×SSC/0.1% SDS로 그리고 이어서 65℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 행할 수 있다.Screening may be by filter hybridization, using a double filter. The labeled probe may comprise at least 15-30 base pairs of obR nucleotide sequences, as shown in FIG. 1, 3 or 6. The hybridization wash conditions used must be low stringency conditions when the cDNA library is derived from an organism of a different type from the organism from which the labeled sequence is derived. In the context of human obR epitopes, when using a murine obR probe, for example, hybridization can be done in a buffer buffer (7% SDS, 250 mM NaHPO ₄ , 2 μM EDTA, 1% BSA) overnight at 65 ° C. . The washing can be done at 65 ° C. with 2 × SSC / 0.1% SDS and then at 65 ° C. with 0.1 × SSC / 0.1% SDS.

낮은 엄격성 조건은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 도서관 및 표지 서열이 유래되는 구체적인 유기체들에 따라 예상대로 달라질 것이다. 이러한 조건에 대한 안내는 예컨대, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.Low stringency conditions are well known to those skilled in the art and will vary as expected depending on the specific organism from which the library and labeling sequences are derived. Guidance on such conditions may be found in, for example, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y .; And Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.

그렇지 않으면, 표지된 obR 뉴클레오티드 프로브는 다시 적당한 엄격성 조건을 이용함으로써 목적 유기체로부터 유래된 게놈 도서관을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 사람 게놈 클론들의 동정 및 특성화는 사람 환자에서 체중장애를 치료하기 위한 진단시험 및 임상적 프로토콜을 설계하는데 도움이 된다. 예를 들어, 사람 유전자의 인트론/엑손 경계에 인접한 부위으로부터 유래된 서열들은 엑손, 인트론, 스플라이싱 부위(예컨대, 스플라이스 억셉터 및/또는 도너 부위) 등에 있는 돌연변이를 검출하는, 진단에 이용될 수 있는 증폭분석법(amplification assays)에 이용하기 위한 프라이머를 설계하는데 이용될 수 있다.Alternatively, labeled obR nucleotide probes can be used to screen for genomic libraries derived from the organism of interest by again using appropriate stringency conditions. Identification and characterization of human genome clones help to design diagnostic tests and clinical protocols for treating weight disorders in human patients. For example, sequences derived from sites adjacent to the intron / exon boundary of a human gene can be used for diagnosis, detecting mutations in exons, introns, splicing sites (eg, splice acceptor and / or donor sites), and the like. It can be used to design primers for use in amplification assays.

더욱이, obR 유전자 상동물은 본원에 개시된 obR 유전자 산물의 아미노산 서열에 기초하여 제작된 두 개의 퇴화 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀들을 이용하여 PCR을 행함으로써 목적 유기체의 핵산으로부터 분리될 수 있다. 상기 반응을 위한 주형(template)은 예컨대 obR 유전자 대립유전자를 발현한다고 알려져 있거나 그럴 것으로 생각되는 사람 또는 비-사람 세포주 또는 맥락막총과 같은 조직으로부터 만들어진 mRNA의 역전사에 의해 수득된 cDNA일 수 있다.Moreover, the obR gene moiety can be isolated from the nucleic acid of the organism of interest by performing PCR using two degenerate oligonucleotide primer pools constructed based on the amino acid sequence of the obR gene product disclosed herein. The template for the reaction can be cDNA obtained by reverse transcription of mRNA made from tissues such as human or non-human cell lines or choroid plexes, for example known or thought to express the obR gene allele.

PCR 산물은 증폭된 서열이 obR 유전자의 서열들인지를 확인하기 위해 2차 클로닝되거나 서열결정될 수 있다. 이어서 PCR 단편은 여러 가지 방법에 의해 전체 길이의 cDNA를 분리하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편은 표지되고 박테리오파지 cDNA 도서관과 같은 cDNA 도서관을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 다른 방법으로, 표지된 단편은 게놈 도서관의 스크리닝을 통해서 게놈 클론을 분리하는데 이용될 수도 있다.PCR products may be secondary cloned or sequenced to confirm that the amplified sequence is the sequences of the obR gene. PCR fragments can then be used to separate full length cDNA by a number of methods. For example, amplified fragments can be labeled and used to screen for cDNA libraries, such as bacteriophage cDNA libraries. Alternatively, labeled fragments may be used to isolate genomic clones through screening of genomic libraries.

PCR 기술은 전체 길이 cDNA 서열을 분리하는데 이용될 수도 있다. 예를 들어, RNA는 적당한 세포 또는 조직 공급원(즉, 맥락막총 또는 뇌 조직과 같이 obR 유전자를 발현한다고 알려져 있거나 그럴 것으로 생각되는)으로부터 표준기술에 따라 분리될 수 있다. 역전사반응은 제 1 가닥 합성(first strand synthesis)의 프라이밍을 위한 증폭된 단편의 5' 말단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용함으로써 RNA에 대해 수행될 수 있다. 그 결과로 수득되는 RNA/DNA 하이브리드는 이어서 표준 말단 트랜스페라제 반응을 이용함으로써 구아닌에 의해 "테일링"될 수 있고, 하이브리드는 RNAase H에 의해 절단될 수 있고 이어서 제 2가닥 합성은 폴리-C 프라이머에 의해 프라이밍될 수 있다. 따라서 증폭 단편 상류의 cDNA 서열들은 쉽게 분리될 수 있다. 이용 가능한 클로닝 방법과 관련해서는 예컨대, Sambrook 등, 1989, 상술한 문헌을 참고할 수 있다.PCR techniques can also be used to separate full length cDNA sequences. For example, RNA can be isolated according to standard techniques from a suitable cell or tissue source (ie, known or thought to express the obR gene, such as choroid plexus or brain tissue). Reverse transcription can be performed on RNA by using oligonucleotide primers specific for the 5 'end of the amplified fragment for priming of first strand synthesis. The resulting RNA / DNA hybrid can then be “tailed” by guanine by using standard terminal transferase reactions, the hybrid can be cleaved by RNAase H and then the second strand synthesis is a poly-C primer. Can be primed by Thus cDNA sequences upstream of the amplification fragment can be easily separated. Regarding available cloning methods, reference may be made to Sambrook et al., 1989, supra.

obR 유전자 서열들은 부가적으로 돌연변이 obR 유전자 대립유전자를 분리하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 돌연변이 대립유전자들은 비만증, 카헥시 또는 식욕부진과 같은 체중장애의 증상에 기여하는 유전자형을 갖는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 제안된 개체로부터 분리될 수 있다. 돌연변이 대립유전자와 돌연변이 대립유전자 산물들은 이어서 후술하는 치료 및 진단 시스템에 이용될 수 있다. 또한, 이러한 obR 유전자 서열들은 체중에 영향을 미칠 수 있는 obR 유전자 조절(예컨대, 프로모터 또는 프로모터/인헨서) 결함을 검출하는데 이용될 수도 있다.obR gene sequences can additionally be used to isolate mutant obR gene alleles. Such mutant alleles may be isolated from individuals known or suggested to have a genotype that contributes to symptoms of weight disorders such as obesity, carhexi or anorexia. Mutant alleles and mutant allele products can then be used in the therapeutic and diagnostic systems described below. Such obR gene sequences may also be used to detect obR gene regulation (eg, promoter or promoter / enhancer) defects that may affect body weight.

돌연변이 obR 유전자의 cDNA는 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 기술인, PCR을 이용함으로써 분리될 수 있다. 이 경우에, 제 1 cDNA 가닥은 올리고-dT 올리고뉴클레오티드를 돌연변이 obR 대립유전자를 갖는 것으로 추정되는 개체 내에서 발현되는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 조직으로부터 분리된 mRNA에 혼성화함으로써 또는 새로운 가닥을 역전사효소에 의해 연장함으로써 합성될 수 있다. cDNA의 제 2 가닥은 정상 유전자의 5' 말단에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 합성된다. 이와 같은 두 개의 프라이머를 이용함으로써, 이어서 산물은 PCR을 통해 증폭되고, 적당한 벡터 내에 클로닝되고, 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 DNA 서열분석된다. 돌연변이 obR 대립유전자의 DNA서열을 정상 obR 대립유전자의 DNA 서열을 대조함으로써, 돌연변이 obR 유전자 산물의 기능의 상실 또는 변화를 담당하는 돌연변이들이 확인될 수 있다.The cDNA of the mutant obR gene can be isolated using, for example, PCR, a technique well known in the art. In this case, the first cDNA strand is hybridized to an oligo-dT oligonucleotide to mRNA isolated from tissue known to be or thought to be expressed in an individual suspected of having a mutant obR allele or to reverse a new strand. It can be synthesized by extending by. The second strand of cDNA is synthesized using oligonucleotides that specifically hybridize to the 5 'end of the normal gene. By using these two primers, the product is then amplified via PCR, cloned into appropriate vectors, and DNA sequenced according to methods well known to those skilled in the art. By matching the DNA sequence of the mutant obR allele against the DNA sequence of the normal obR allele, mutations responsible for loss or change in the function of the mutant obR gene product can be identified.

대안으로, 게놈 도서관이 돌연변이 obR 대립유전자를 갖는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 개체로부터 수득된 DNA를 이용하여 구성되거나 또는 cDNA 도서관이 돌연변이 obR 대립유전자를 발현하는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 조직으로부터의 RNA를 이용하여 구성될 수 있다. 이어서 정상 obR 유전자 또는 그의 임의의 적당한 단편은 표지되어 이와 같은 도서관중에서 대응하는 돌연변이 obR 대립유전자를 동정하기 위한 프로브로 이용될 수 있다. 그 다음으로 돌연변이 obR 유전자 서열들을 포함하는 클론들이 정제되고 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 서열분석될 수 있다.Alternatively, the genomic library may be constructed from DNA obtained from an individual known or likely to have a mutant obR allele or from a tissue from which the cDNA library is known or likely to express a mutant obR allele. It can be constructed using RNA. The normal obR gene or any suitable fragment thereof can then be labeled and used as a probe to identify the corresponding mutant obR allele in such a library. Clones comprising the mutant obR gene sequences can then be purified and sequenced according to methods well known to those skilled in the art.

또한, 발현 도서관(expression library)이 예를 들어, 돌연변이 obR 대립유전자를 갖는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 개체 내에서 돌연변이 obR 대립유전자를 발현하는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 조직으로부터 수득된 RNA로부터 합성된 cDNA를 이용하여 구성될 수 있다. 이와 같은 방법으로, 추정 돌연변이 조직에 의해 만들어진 유전자 산물들은 발현되고, 이하에 섹션 5.3에 기술된 바와 같이, 정상 obR 유전자 산물에 대해 만들어진 항체와 함께 표준항체 스크리닝 기술을 이용함으로써 스크리닝될 수 있다. (스크리닝 기술에 대해서는, 예를 들어, Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor 참조.). 부가적으로, 스크리닝은 예를 들어, AP-Ob 또는 Ob-AP 융합단백질들과 같은 표지된 Ob 융합단백질을 이용함으로써 이루어질 수 있다. obR 돌연변이가 기능이 변화(예컨대, 미스센스 또는 틀변경 돌연변이의 결과로)된 발현 유전자 산물을 초래하는 경우에, ObR에 대한 항체들의 다클론 세트들은 돌연변이 obR 유전자 산물과 상호-반응(cross-react)할 것이다. 이와 같은 표지된 항체들과의 반응을 통해 검출된 도서관 클론들은 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 정제되고 서열분석될 수 있다.In addition, the expression library is synthesized from RNA obtained from tissues known or likely to express the mutant obR allele, for example, in an individual known or likely to have a mutant obR allele. Can be constructed using the cDNA. In this way, gene products made by putative mutant tissue can be expressed and screened by using standard antibody screening techniques with antibodies made against normal obR gene products, as described in section 5.3 below. (For screening techniques, see, eg, Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.). In addition, screening can be accomplished by using labeled Ob fusion proteins, such as, for example, AP-Ob or Ob-AP fusion proteins. If an obR mutation results in an expression gene product with altered function (eg, as a result of missense or framework mutation), polyclonal sets of antibodies to ObR cross-react with the mutant obR gene product. )something to do. Library clones detected through reaction with such labeled antibodies can be purified and sequenced according to methods well known to those skilled in the art.

본 발명은 돌연변이 ObR, ObR의 펩타이드 단편, 절두된 ObR 및 ObR 융합단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열도 포함한다. 이들은 후술하는 섹션 5.2에 기술된 돌연변이 ObR; ObR의 ECD, TM, 및/또는 CD 도메인들 또는 이들 도메인들의 일부분들에 해당하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 하나 또는 두 개의 도메인들이 결실된 절두된 ObR, 예컨대, TM이 없거나 또는 TM과 CD 부분이 모두 없는 가용성 ObR, 또는 CD 부위의 일부 또는 전부가 없는 절두된, 비기능성 ObR를 코드화하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 뉴클레오티드 코드화 융합단백질들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만, 예컨대, ObR ECD를 세포막에 결속시키는 막간 서열들; 혈류 내에서의 그 결과로서 수득되는 융합단백질(예컨대, ObR- Ig)의 안정성 및 반감기를 증가시키는 Ig Fc 도메인; 또는 마커로 이용될 수 있는 효소, 형광 단백질, 발광 단백질들과 같은 관련이 없는 단백질 또는 펩타이드에 융합된 전체 길이의 ObR, 절두된 ObR 또는 ObR의 펩타이드 단편들을 포함할 수 있다.The invention also includes nucleotide sequences encoding mutant ObR, peptide fragments of ObR, truncated ObR and ObR fusion proteins. These include the mutant ObRs described in Section 5.2 below; A polypeptide or peptide corresponding to the ECD, TM, and / or CD domains or portions of these domains of ObR; Truncated ObR lacking one or two domains, such as soluble ObR without TM or without both TM and CD moieties, or nucleotide sequences encoding truncated, non-functional ObR without some or all of the CD moiety But it is not necessarily limited to these. Nucleotide encoded fusion proteins are not necessarily limited to, for example, intermembrane sequences that bind ObR ECD to cell membranes; Ig Fc domains that increase the stability and half-life of the resulting fusion protein (eg, ObR-Ig) in the blood stream; Or peptide fragments of full length ObR, truncated ObR or ObR fused to an irrelevant protein or peptide such as enzymes, fluorescent proteins, luminescent proteins that can be used as markers.

본 발명은 (a) 전술한 예컨대, ObR 코드화 서열들 및/또는 그들의 보체들(예컨대, 안티센스) 중의 임의의 것을 포함하는 DNA 벡터들 ; (b) 코드화 서열의 발현을 유도하는 조절요소(regulatory elements)와 기능적으로 결합된 전술한 ObR 코드화 서열들 중의 임의의 것을 포함하는 DNA 발현 벡터; 및 (c) 숙주 세포내에서 코드화 서열의 발현을 유도하는 조절요소와 기능적으로 결합된 전술한 ObR 코드화 서열들 중의 임의의 것을 포함하는 유전자조작된 숙주 세포. 본원에서 이용될 때 조절요소들은 유도성 및 비유도성 프로모터, 인헨서, 오퍼레이터 및 유전자발현을 구동하고 조절하는 것으로 당업자들에게 알려진 다른 요소들을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 이러한 조절요소들은 싸이토메갈로바이러스 hCMV 조기 유전자(immediate early gene), SV40 아데노바이러스의 조기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파아지 λ의 주된 오퍼레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절부위, 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 산 포스파타아제(acid phosphatase)의 프로모터 및 효모 α-메이팅 펙터의 프로모터(yeast α-mating factors)를 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.The present invention provides an antibody comprising (a) DNA vectors comprising any of the foregoing ObR encoding sequences and / or their complements (eg antisense); (b) a DNA expression vector comprising any of the foregoing ObR coding sequences functionally associated with regulatory elements that direct expression of the coding sequence; And (c) any of the foregoing ObR coding sequences functionally associated with a regulatory element that directs expression of the coding sequence in the host cell. As used herein, regulatory elements include, but are not necessarily limited to, inducible and non-inducible promoters, enhancers, operators and other elements known to those skilled in the art to drive and regulate gene expression. These regulatory elements include cytomegalovirus hCMV early early gene, early or late promoter of SV40 adenovirus, lac system, trp system, TAC system, TRC system, major operator and promoter site of phage λ, fd coat protein Regulatory sites, promoters of 3-phosphoglycerate kinase, promoters of acid phosphatase and yeast α-mating factors, but are not necessarily limited to these. .

B. ObR 단백질 및 폴리펩타이드B. ObR Proteins and Polypeptides

ObR 및/또는 ObR 융합단백질들의 ObR 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 단편, 돌연변이 되거나, 절두되거나 결실된 형태는 예를 들어, 진단분석용 시약으로서의 항체의 생성, 체중장애의 치료에 이용될 수 있는 화합물에 대한 스크리닝을 위한 분석시약 및 ObR에 관련된 체중장애의 치료에 유용한 약제 시약으로서의, 체중조절에 관여하는 다른 세포 유전자 산물의 동정을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 여러 가지 다양한 용도로 만들어질 수 있다.ObR proteins, polypeptides and peptide fragments, mutated, truncated or deleted forms of ObR and / or ObR fusion proteins can be used in compounds that can be used, for example, in the production of antibodies as diagnostic reagents, in the treatment of body weight disorders. Analytical reagents for screening for and screening for other disorders of weight disorders associated with ObR, including, but not limited to, identification of other cellular gene products involved in weight control. have.

도 1 및 6은 각각 쥐의 짧은 형태 및 긴 형태 ObR 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 이들 형태의 ObR 단백질에서, 신호서열은 아미노산 잔기 1 부터 약 22까지이고; 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 잔기 약 23 부터 약 837까지이며; 막간 도메인(TM)은 아미노산 잔기 약 838 부터 약 860까지이다. 짧은 형태 ObR 단백질에서, CD는 아미노산 잔기 약 861 부터 약 894까지(또는 두 번째 짧은 형태에서는 893까지)인 반면에, 긴 형태에서 세포질도메인은 아미노산 잔기 약 861 부터 약 1162까지이다. 도 3은 사람 ObR의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 신호서열은 아미노산 잔기 1 부터 약 20 까지이고; 세포외 도메인은 아미노산 잔기 약 21 부터 약 839까지이며; 막간 도메인은 아미노산 잔기 약 840 부터 약 862까지이고; 세포질 도메인은 아미노산 잔기 약 863 부터 약 1165까지이다.1 and 6 depict amino acid sequences of the short and long form ObR proteins of mice, respectively. In these forms of ObR protein, the signal sequence is from amino acid residues 1 to about 22; The extracellular domain (ECD) is from amino acid residues about 23 to about 837; The transmembrane domain (TM) is from amino acid residues about 838 to about 860. In the short form ObR protein, CD is from amino acid residues about 861 to about 894 (or 893 in the second short form), while in the long form the cytoplasmic domain is amino acid residues from about 861 to about 1162. 3 depicts the amino acid sequence of human ObR. The signal sequence is from amino acid residues 1 to about 20; The extracellular domain is from amino acid residues about 21 to about 839; The transmembrane domain is from amino acid residues about 840 to about 862; The cytoplasmic domain is from amino acid residues about 863 to about 1165.

ObR 서열은 DNA 서열의 경우에 해독개시부위와 마찬가지로 메치오닌으로 시작하고, 그 다음에는 펩타이드 분비의 전형적인 소수성 신호 서열이 뒤따른다. 두 가지 형태의 쥐 ObR의 추정의 성숙한 세포외 도메인은 동일하고 815 아미노산 길이인 반면에, 사람 ObR에 대해 추론된 ECD는 819 아미노산 길이이다. ObR의 세포외 도메인은 클래스 Ⅰ 싸이토카인 수용체 군의 특징을 많이 보이고(Heldin, 1995, Cell 80:213-223 참고), IL-6 수용체(Taga et al., 1989, Cell 58:573-581), G-CSF 수용체 (Fukunaga et al., 1990, Cell 61:341-350) 및 LIF 수용체(Gearing et al., 1991, Science 255;1434-1437)의 gp-130 신호변환 성분과 가장 밀접하게 관련된다. 사실상, 본원에 제시된 데이터들은 긴 형태의 ObR이 STAT 단백질의 활성화를 통해서 신호한다는 것을 증명한다--IL-6 타입 수용체 군에 의해 매개되는 신호변환경로의 보증.The ObR sequence begins with methionine, as in the case of the DNA start, in the case of DNA sequences, followed by a typical hydrophobic signal sequence of peptide secretion. The putative mature extracellular domain of the two forms of rat ObR is the same and 815 amino acids long, while the ECD inferred for human ObR is 819 amino acids long. The extracellular domain of ObR is characterized by a class I cytokine receptor family (see Haldin, 1995, Cell 80: 213-223), IL-6 receptor (Taga et al., 1989, Cell 58: 573-581), Most closely related to the gp-130 signal transduction component of the G-CSF receptor (Fukunaga et al., 1990, Cell 61: 341-350) and the LIF receptor (Gearing et al., 1991, Science 255; 1434-1437). . In fact, the data presented herein demonstrate that the long form of ObR signals through activation of the STAT protein--assurance of the signal transduction pathway mediated by the IL-6 type receptor family.

쥐 ObR 및 gp-130의 세포외 도메인들 사이의 배열은 도 4에 도시하였다. 이들 두 가지 분자들 사이의 전체 아미노산 서열 동일성이 낮다(24%)고 하더라도, 특징적으로 보존된 시스테인 잔기, Trp-Ser-X-Trp-Ser 모티브(도 1에 도시된 쥐 서열내의 아미노산 잔기 317-321 및 620-624; 도 3에 도시된 사람 서열의 아미노산 잔기 319-323 및 622-626)와 이 그룹의 단백질내의 다른 잔기들의 보존이 명백하다(Kishimoto et al., 1994, Cell 76:253-262 참조). 쥐의 짧은 형태 ObR 및 사람 ObR의 추론 아미노산 서열들은 쥐의 짧은 형태 ObR의 길이 전체에 걸쳐서 고도로 상동성이다 (도 5). 실제로, 쥐 짧은 형태와 사람 클론 사이의 추론 아미노산 서열 동일성(78%)은 쥐와 gp130(Saito et al., 1992, J. Immunol. 148:4066-4071), LIF 수용체(Gough et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2623-2627), 및 G-CSF(Fukanaga et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:8702-8706)의 사람 형태를 비교했을 때 발견되는 것과 동일하거나 그 이상이다. 마찬가지로, 쥐 및 사람 긴 형태 ObR의 추론 아미노산 서열들은 코드화 서열의 길이 전체에 걸쳐서 고도로 상동성인데, 75%의 동일성을 갖는다(도 7).The arrangement between the extracellular domains of murine ObR and gp-130 is shown in FIG. 4. Although the overall amino acid sequence identity between these two molecules is low (24%), the characteristically conserved cysteine residue, the Trp-Ser-X-Trp-Ser motif (amino acid residue 317- in the murine sequence shown in FIG. 1) 321 and 620-624; amino acid residues 319-323 and 622-626 of the human sequence shown in FIG. 3 and other residues in the proteins of this group are evident (Kishimoto et al., 1994, Cell 76: 253-). 262). The deduced amino acid sequences of the mouse short form ObR and human ObR are highly homologous throughout the length of the mouse short form ObR (FIG. 5). Indeed, the deduced amino acid sequence identity (78%) between the rat short form and the human clone was found in rat and gp130 (Saito et al., 1992, J. Immunol. 148: 4066-4071), LIF receptor (Gough et al., 1988). , Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2623-2627), and G-CSF (Fukanaga et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8702-8706). It is the same or more than that. Likewise, the inferred amino acid sequences of the rat and human long form ObR are highly homologous over the length of the coding sequence, with 75% identity (FIG. 7).

잠재적인 N-결합 포도당화 부위(N-linked glycosylation sites)들(즉, 아미노산 서열 모티브 N-X-S 또는 N-X-T)은 쥐 및 사람 ObR 양자의 ECD에서 발견된다. 적어도 20개의 잠재적인 N-결합 포도당화 부위들이 도 1 및 6에 도시된 쥐 ObR ECD 서열(아미노산 잔기 23, 41, 56, 73, 81, 98, 187, 206, 276, 347, 397, 433, 516, 624, 659, 670, 688, 697, 728, 및 750에서 시작되는 3 펩타이드 모티브 참조)내에서 확인될 수 있는 반면에, 적어도 16개의 잠재적인 N-결합 포도당화 부위들이 도 3에 도시된 사람 ObR ECD 서열 (아미노산 잔기 41, 56, 73, 98, 187, 275, 345, 431, 514, 622, 657, 668, 686, 695, 698 및 726에서 시작되는 3 펩타이드 모티브 참조 )내에서 확인될 수 있다. 양자의 쥐 및 사람 ObR의 세포외 도메인 다음에는 23 아미노산 길이의 추정 막간도메인이 이어진다.Potential N-linked glycosylation sites (ie, amino acid sequence motif N-X-S or N-X-T) are found in the ECD of both rat and human ObR. At least 20 potential N-linked glycosylation sites are shown in the murine ObR ECD sequence shown in FIGS. 1 and 6 (amino acid residues 23, 41, 56, 73, 81, 98, 187, 206, 276, 347, 397, 433, While at least 16 potential N-linked glycosylation sites are shown in FIG. 3, as can be identified within the three peptide motifs starting at 516, 624, 659, 670, 688, 697, 728, and 750). To be identified within the human ObR ECD sequence (see 3 peptide motifs starting at amino acid residues 41, 56, 73, 98, 187, 275, 345, 431, 514, 622, 657, 668, 686, 695, 698 and 726). Can be. The extracellular domains of both rat and human ObRs are followed by putative transmembrane domains of 23 amino acids in length.

도 1에 도시된 쥐 cDNA는 짧은 세포질 도메인(34 아미노산)을 코드화한다. 쥐 ObR 세포질 도메인의 아미노산 5-24(즉, 도 1에서 아미노산 잔기 865 내지 884)는 LIF 수용체의 세포내 도메인의 막 근위 서열들과 47%의 동일성을 나타내고, 박스1 Jak 상호작용 서열(interaction sequences)을 포함한다(Narazaki et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2285-2289). 흥미롭게도, 사람 cDNA는 쥐의 짧은 형태 ObR 보다 훨씬 긴 세포내 도메인을 갖는 단백질을 코드화한다. 쥐의 짧은 형태 및 사람 세포내 도메인들이 쥐의 짧은 형태 ObR의 끝부분 5 잔기들까지 고도로 보존되었다고 해도, 사람 세포내 도메인은 gp-130의 그것과 유사한 길이까지 계속된다. 쥐 짧은 형태 및 사람 클론들의 뉴클레오티드 서열들도 쥐의 짧은 형태 ObR의 코드화 부위 전체와 매우 유사하지만, 쥐의 짧은 형태 ObR 종결코돈 부근에서는 완전히 달라진다.The murine cDNA shown in FIG. 1 encodes a short cytoplasmic domain (34 amino acids). Amino acids 5-24 of the murine ObR cytoplasmic domain (ie, amino acid residues 865-884 in FIG. 1) show 47% identity with the membrane proximal sequences of the intracellular domain of the LIF receptor, and the Box 1 Jak interaction sequences (Narazaki et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2285-2289). Interestingly, human cDNA encodes a protein with a much longer intracellular domain than the mouse short form ObR. Although the mouse short morphology and human intracellular domains were highly conserved up to 5 residues at the end of the mouse short morphology ObR, the human intracellular domain continues to a length similar to that of gp-130. The nucleotide sequences of the murine short form and human clones are very similar to the entire coding region of the murine short form ObR, but completely different around the murine short form ObR codon.

본원에 기술된 쥐의 짧은 형태 cDNA의 짧은 세포질 도메인은 몇몇 클래스의 싸이토카인 수용체 폴리펩타이드의 특징이다(Kishimoto et al., 1994, Cell 76:253-262). 그러나, 본원에 보고된 결과들은 짧은 형태의 ObR이 긴 형태의 ObR에 의해 매개되는 STAT 경로를 통한 신호변환을 활성화하지 못한다는 사실을 입증한다. 사실상, ObR이 최고의 상동성을 보이는 3 개의 수용체들은 모두 세포내 신호(intracellular signaling)에 중요한 긴 세포질 도메인을 갖는다. 이것은 분리된 쥐의 짧은 형태 ObR 클론이 맥락막총 내에서 발현된 주된 형태가 아닌 희귀한 비정상적으로 스플라이싱된 형태를 코드화하였거나 키메라였다는 가능성을 열어준다. 이러한 논점을 다루기 위해, 각각 독립적으로 도서관 스캐닝을 통해서 동정된 8 개의 쥐 클론들을 선별하여, 종결코돈의 서열 3'에 대해 만들어진 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭(각각 150 클론들의 서브풀로)시켰다. 결과는 8개 클론들 모두가 이러한 동일한 3' 비해독 서열들을 가짐을 입증해 주었다. 또한, 5 개의 독립적으로 분리된 클론들의 C-말단들을 서열결정하였는데 모두 동일한 종결코돈을 갖는 것으로 확인되었다. 최종적으로, cDNA 도서관이 유래된 것과 상이한 마우스 균주(C57B1/KsJ)로부터 분리된 맥락막총으로부터의 총 RNA에 의한 역전사 PCR은 동일한 위치에 동일한 종결코돈을 포함하는 동일한 PCR 산물을 만들어내었다. 이들 데이터들은 분리된 쥐의 짧은 형태 클론이 키메라도 아니고 희귀한 비정상적으로 스플라이싱된 형태도 아니고, 대신에 쥐의 맥락막총내의 이러한 수용체의 두드러진 형태일 것임을 암시한다. 본원에 제시된 데이터들은 몇몇 조직에서, 긴 세포내 도메인들(긴 형태)마우스 ObR의 다르게 스플라이싱된 형태들이 ; 즉, 야생형 obR 유전자는 두 가지 형태로 발현되는데, 약 100 뉴클레오티드의 삽입물을 갖는 하나의 mRNA 전사체는 짧은 세포질 도메인을 갖는 ObR을 코드화하고, 다른 mRNA 전사체는 사람 CD와 상동인 긴 세포질 도메인을 갖는 ObR을 코드화한다.The short cytoplasmic domain of the murine short form cDNA described herein is characteristic of several classes of cytokine receptor polypeptides (Kishimoto et al., 1994, Cell 76: 253-262). However, the results reported herein demonstrate that short forms of ObR do not activate signal transduction through the STAT pathway mediated by long forms of ObR. In fact, all three receptors with the highest homology to ObR have long cytoplasmic domains that are important for intracellular signaling. This opens up the possibility that the isolated mouse short form ObR clones were or were chimeras rare and spliced forms that were not the main form expressed in the choroid plexus. To address this issue, eight mouse clones, each independently identified through library scanning, were selected and amplified by PCR using primers made for sequence 3 ′ of the stop codon (to a subpool of 150 clones each). . The results demonstrated that all eight clones had these same 3 'non-dock sequences. In addition, the C-terminus of five independently isolated clones were sequenced and found to all have the same stop codon. Finally, reverse transcription PCR with total RNA from choroid plexes isolated from a different mouse strain (C57B1 / KsJ) from which the cDNA library was derived resulted in the same PCR product containing the same stop codon at the same location. These data suggest that the isolated short form clones of the mice are neither chimeras nor the rare abnormally spliced forms, but instead are prominent forms of these receptors in the mouse choroid plexus. The data presented herein indicate that in some tissues, differently spliced forms of long intracellular domains (long form) mouse ObR; That is, the wild-type obR gene is expressed in two forms: one mRNA transcript with an insert of about 100 nucleotides encodes ObR with a short cytoplasmic domain, and the other mRNA transcript has a long cytoplasmic domain homologous to human CD. Code an ObR with

도 6에 도시된 쥐 cDNA는 긴 형태의 ObR을 코드화한다. 상술한 문헌에서 기술된 바와 같이, 쥐의 긴 형태 ObR의 ECD 및 TM을 코드화하는 아미노산들은 쥐의 짧은 형태의 그것과 동일하다. 그러나, 쥐의 긴 형태 cDNA는 사람 ObR cDNA에 의해 코드화된 세포질 도메인과 대략적으로 같은 길이인 세포질 도메인(302 아미노산)을 코드화한다. ObR 짧은 형태와 달리, 쥐의 긴 형태의 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 ObR은 세포질 도메인 전체에 걸쳐서 사람 ObR의 그것과 계속 유사하다.The mouse cDNA shown in FIG. 6 encodes the long form of ObR. As described in the above references, the amino acids encoding ECD and TM of the long form ObR of the rat are identical to that of the short form of the rat. However, the rat long form cDNA encodes a cytoplasmic domain (302 amino acids) that is approximately the same length as the cytoplasmic domain encoded by human ObR cDNA. Unlike the ObR short form, the ObR encoded by the long nucleotide sequence of the rat continues to resemble that of the human ObR throughout the cytoplasmic domain.

본원에 제시된 데이터들은 db가 긴 형태 쥐 obR 유전자의 돌연변이체라는 것을 말해 준다. db 돌연변이체는 CD를 코드화하는 mRNA의 부분에 약 1.6 뉴클레오티드 길이의 삽입물을 포함하는 비정상적으로 스플라이싱된 전사체를 발현한다. 전사체가 길긴 하지만, 삽입된 서열은 짧은 형태의 ObR과 동일하여 대부분의 CD가 없는, 절두된 ObR 단백질을 코드화하는 전사체를 결과시키는 돌연변이를 유발한다. 본 발명에 제공된 데이터들은 긴 형태의 ObR과 달리, 짧은 형태의 ObR, 즉, db/db 마우스에서 비만 표현형과 관련된 수용체 형태는 STAT 경로에 의해 매개되는 신호 변환을 하지 않는다는 것을 증명한다. 따라서, 신호할 수 있는 (signalling competent) 긴 형태의 ObR은 체중 조절 및 유지에 적극적으로 관여하는 것으로 보인다.The data presented herein indicate that db is a mutant of the long form rat obR gene. The db mutant expresses an abnormally spliced transcript comprising an insert about 1.6 nucleotides long in the portion of the mRNA encoding the CD. Although the transcript is long, the inserted sequence is identical to the short form of ObR, resulting in a mutation that results in a transcript encoding the truncated ObR protein, which lacks most CDs. The data provided herein demonstrate that, unlike the long form of ObR, the short form of ObR, ie the receptor form associated with the obesity phenotype in db / db mice, does not undergo signal transduction mediated by the STAT pathway. Thus, signaling long forms of ObR appear to be actively involved in weight control and maintenance.

요컨대, 몇몇 주된 ObR 형태에 대한 전령 RNA가 동정되었다. 대부분의 조직에서 발견된 우세한 ObR mRNA는 짧은 형태로 불리는 34 아미노산 잔기의 짧은 세포질 도메인을 갖는 막간 도메인을 코드화한다. 시상하부에는, 긴 형태로 불리는 짧은 형태와 동일한 세포외 도메인을 갖지만 302 아미노산 잔기-길이의 세포질 도메인을 갖는 단백질을 코드화하는 ObR mRNA가 존재한다. db 돌연변이는 긴 형태 전사체의 비정상적인 스플라이스 산물의 생성을 초래하여, 세포질 도메인이 절단된 형태의 단백질이 만들어지게 한다. 흥미롭게도, db/db 마우스에서 긴 형태의 ObR에 대한 mRNA는 천연의 짧은 형태와 동일한 구조를 갖는 단백질을 코드화한다. 이러한 카르복시말단 부위의 손실은 ObR을 불활성화시키는 것으로 제안되었고 db/db 마우스에서 비만 표현형을 생성하는 것으로 추정된다.In short, messenger RNAs for some major ObR forms have been identified. The predominant ObR mRNA found in most tissues encodes a transmembrane domain with a short cytoplasmic domain of 34 amino acid residues called short forms. In the hypothalamus, there is an ObR mRNA that encodes a protein having the same extracellular domain as the short form, called the long form, but with the 302 amino acid residue-length cytoplasmic domain. db mutations result in the production of abnormal splice products of long form transcripts, resulting in proteins in the form of truncated cytoplasmic domains. Interestingly, mRNA for the long form of ObR in db / db mice encodes a protein with the same structure as the natural short form. This loss of carboxy terminus has been suggested to inactivate ObR and is believed to produce an obesity phenotype in db / db mice.

서열 정보는 ObR이 G-CSFR, LIFR, 및 gp-130의 그것과 유사한 신호작용을 발휘할 수 있다는 것을 시사한다(Stahl & Yancopoulos, 1993, Cell 74 : 587-590 ; Kishimoto, et al., 1995, Blood 86 : 1243-1254). 이들 수용체들에 의한 신호는 다른 여러 가지 중에서, STAT1, STAT3 및 STAT5의 DNA 결합 활성의 인산화 및 활성화에 기여하는 야누스 키나제 군의 수용체-결합 키나제의 활성화를 수반한다(Ihle, 1995, Nature 377:591-594; Kishimoto, et al., 1995, Blood 86:1243-1254). 이러한 방법은 급성 상 플라즈마 단백질(acute phase plasma proteins)을 코드화하는 간 유전자와 같은 STAT 단백질들에 대한 결합부위를 포함하는 유전자의 유도된 전사와 관련된다(Lai et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 : 23254-23257). 클로닝된 ObR 이소폼들이 실제로 수용체 분자들을 신호하는지 여부를 확인하기 위해, ObR을 확립된 조직배양세포에 도입하여 OB 처리에 대한 세포 반응을 구조적으로-관련된 IL-6 타입 싸이토카인 수용체에 의해 매개되는 것과 비교하였다. 후술하는 실시예에 제공된 결과들은 긴 형태의 ObR이 신호-변환 분자임을 증명해준다. 특히, 상기 결과들은 긴 형태의 ObR이 IL-6 타입 싸이토카인 수용체에 대해 기능적 특이성 공유한다는 것을 보여준다. 결과들은 또한 짧은 형태의 ObR이 긴 형태 ObR에 의해 변환되는 STAT 경로를 통한 신호를 하지 않는다는 것도 입증한다. 따라서, 긴 형태 ObR은 체중의 유지에 관여하지만 짧은 형태 ObR은 그렇지 않은 것으로 보인다.Sequence information suggests that ObR can exert signaling similar to that of G-CSFR, LIFR, and gp-130 (Stahl & Yancopoulos, 1993, Cell 74: 587-590; Kishimoto, et al., 1995, Blood 86: 1243-1254). Signaling by these receptors involves, among other things, activation of receptor-binding kinases of the Janus kinase family that contribute to phosphorylation and activation of the DNA binding activity of STAT1, STAT3 and STAT5 (Ihle, 1995, Nature 377: 591). -594; Kishimoto, et al., 1995, Blood 86: 1243-1254). This method involves induced transcription of genes, including binding sites for STAT proteins such as liver genes encoding acute phase plasma proteins (Lai et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 23254-23257). To confirm whether the cloned ObR isoforms actually signal receptor molecules, introducing ObR into established tissue culture cells allows the cellular response to OB treatment to be mediated by structurally-associated IL-6 type cytokine receptors. Compared. The results provided in the examples below demonstrate that the long form of ObR is a signal-conversion molecule. In particular, the results show that the long form of ObR shares functional specificity for the IL-6 type cytokine receptor. The results also demonstrate that the short form of ObR does not signal through the STAT pathway, which is converted by the long form of ObR. Thus, long form ObR seems to be involved in the maintenance of weight, while short form ObR does not seem to.

본 발명의 ObR 아미노산 서열은 도 1(서열 2), 도 3(서열 4) 및 도 6에 도시된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 famj5312에 의해 코드화된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d에 의해 코드화된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁된 사람 게놈 클론, h-obR-p87에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함한다. 더욱이, 다른 종들의 ObR들은 본 발명에 포함된다. 사실상, 상기 섹션 5.1에 기술된 obR 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 임의의 ObR 단백질은 본 발명의 범위에 속한다.The ObR amino acid sequence of the present invention is the amino acid sequence shown in Figs. 1 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 4) and 6 or the amino acid sequence coded by the cDNA clone famj5312 deposited in ATCC or the cDNA clone fahj5312d deposited in ATCC. Amino acid sequence encoded by or the human genome clone deposited with ATCC, amino acid sequence encoded by h-obR-p87. Moreover, ObRs of other species are included in the present invention. In fact, any ObR protein encoded by the obR nucleotide sequence described in section 5.1 above is within the scope of the present invention.

본 발명은 Ob와 결합하는 능력, Ob에 대한 결합친화성, Ob 결합에 의해 결과되는 생물학적 효과, 예컨대, 신호변환, 세포대사의 변화(예컨대, 이온 플럭스, 티로신 인산화) 또는 ObR 균등물이 적당한 세포 유형에 존재할 때 표현형상의 변화(비만 표현형, 즉 db 또는 ob 표현형의 개선, 예방 또는 지연) 또는 체중손실을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 여러 가지 기준에 따라 판단할 때, 섹션 5.1에 기술된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 ObR과 기능상 균등한 단백질들도 포함한다. 이러한 기능상 균등한 ObR 단백질들은 침묵 변화(silent change)를 초래하여 기능상 균등한 유전자 산물이 생성되게 하는, 상기 섹션 5.1에 기술된 obR 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열내의 아미노산 잔기들의 부가 또는 치환을 포함하지만, 반드시 여기에 국한되는 것은 아니다.The present invention relates to cells in which the ability to bind Ob, binding affinity to Ob, biological effects resulting from Ob binding, such as signal transduction, changes in cell metabolism (eg, ion flux, tyrosine phosphorylation) or ObR equivalents are suitable. Section 5.1, including but not limited to, changes in phenotype (improved, prevented or delayed obesity phenotype, ie db or ob phenotype) or weight loss when present in a type, as determined in accordance with various criteria. Also included are proteins that are functionally equivalent to ObR encoded by the nucleotide sequence described in. These functionally equivalent ObR proteins include the addition or substitution of amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the obR nucleotide sequence described in section 5.1 above, resulting in a silent change resulting in a functionally equivalent gene product. However, it is not necessarily limited to this.

아미노산 치환은 포함된 잔기들의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들어. 비극성(소수성) 아미노산들은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메치오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 및 글루타민을 포함하며; 양전하를 띄는(염기성)인 아미노산들은 아르기닌, 리신 및 히스티딘이고; 음전하를 띄는(산성) 아미노산들은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.Amino acid substitutions can be made based on the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity of the residues involved. E.g. Nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine; Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine; Positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine and histidine; Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.

무작위 돌연변이가 obR DNA에 만들어질 수 있고(당업자들에게 잘 알려져 있는 무작위 돌연변이유발기술을 이용하여) 그 결과로서 수득되는 돌연변이 ObR들을 활성에 대해 조사할 수 있지만, 향상된 기능(예컨대, Ob에 대한 높은 친화성, 및/또는 높은 신호 능력); 또는 감소된 능력(예컨대, Ob에 대한 낮은 친화성 및/또는 감소된 신호변환능력)을 갖는 돌연변이 ObR을 만들기 위해, obR 코드화 부위의 부위-특이적 돌연변이(당업자들에게 잘 알려져 있는 부위-특이적 돌연변이유발기술을 이용하여)를 유전공학적으로 유발할 수 있다.Random mutations can be made in obR DNA (using random mutagenesis techniques well known to those skilled in the art) and the resulting mutant ObRs can be investigated for activity, but improved function (e.g. Affinity, and / or high signaling ability); Or site-specific mutations of the obR coding site (site-specific well known to those skilled in the art) to make a mutant ObR with reduced ability (eg, low affinity and / or reduced signal transduction capacity). Using mutagenesis techniques) can be genetically induced.

예를 들어, 마우스의 짧은 형태 ObR(도 1)와 사람 ObR 상동물(도 3)을 동일한 아미노산 잔기들은 별표로 표시하여 도 5에 나란히 도시하였다. 돌연변이 ObR들은 동일 부위들(도 5에서 별표로 표시)은 그대로 유지되지만, 가변 잔기들(variable residues)(도 5에서 별표로 표시하지 않은 부분)은 예컨대, 아미노산 잔기(들)의 결실 또는 삽입에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기들의 치환에 의해 변화된다. 가변 위치에서의 보존적 변화들(conservative alterations)은 예컨대, Ob 결합친화성 또는 신호변환능력 또는 이들 양자와 같은 기능을 보유한 돌연변이 ObR을 만들기 위해 유전공학적으로 만들 수 있다. 비-보존적 변화(non-conservative changes)들은 이들 가변 부위에서 예컨대, Ob 결합친화성 또는 신호변환능력 또는 이들 양자와 같은 기능을 변화시키기 위해 유전공학적으로 만들 수 있다. 다른 방법으로, 기능의 변화가 필요한 경우에는, 보존 부위(즉, 도 5에서 별표로 표시된 것과 동일함 아미노산들)의 결실 또는 비-보존적 변화를 유전공학적으로 만들 수 있다. 예를 들어, Ob와 결합하지만 신호는 할 수 없는(signalling-incompetent) 돌연변이 ObR을 만들기 위해, CD(예컨대, 쥐 ObR의 아미노산 잔기 861-894 (도 1) 또는 사람 ObR의 아미노산 잔기 863-1165 (도 3)) 또는 CD의 부분들(예컨대, 쥐 ObR의 아미노산 잔기 861-884 (도 1) 또는 사람 ObR(박스1 Jak 상호작용 도메인)의 아미노산 잔기 863-886 (도 3))의 결실 또는 비-보존적 변화(치환 또는 삽입)를 유전공학적으로 만들 수 있다. 도 5에 도시된 ECD내의 별표된 잔기들에 대한 비보존적 변화들은 변화된 Ob에 대한 결합친화성을 갖는 돌연변이 ObR을 만들기 위해 유전공학에 의해 만들어질 수 있다. 동일한 돌연변이 방법이 동일한 아미노산들은 이중 애스터리스크로 표시된 도 7에 나란히 도시한 쥐의 긴 형태 ObR 및 사람 ObR에 기초하여 돌연변이 ObR을 설계하는데도 이용될 수 있다.For example, the shorter forms of mouse ObR (FIG. 1) and human ObR epitopes (FIG. 3) are shown side by side in FIG. 5 with the same amino acid residues asterisks. Mutant ObRs remain the same sites (marked with an asterisk in FIG. 5), while variable residues (parts not marked with an asterisk in FIG. 5) may, for example, result in deletion or insertion of amino acid residue (s). Or by substitution of one or more amino acid residues. Conservative alterations at variable positions can be genetically engineered to produce mutant ObRs that possess, for example, Ob binding affinity or signal transduction or both. Non-conservative changes can be made genetically in order to alter a function such as, for example, Ob binding affinity or signal transduction capability or both at these variable sites. Alternatively, if a change in function is needed, deletion or non-conservative changes in the conserved site (ie, the same amino acids as indicated by an asterisk in FIG. 5) can be made genetically. For example, in order to make a signaling-incompetent mutant ObR that binds to Ob but cannot signal, CD (eg, amino acid residues 861-894 (FIG. 1) of mouse ObR or amino acid residues 863-1165 of human ObR ( 3)) or deletions or ratios of portions of the CD (eg, amino acid residues 861-884 (FIG. 1) of human ObR or amino acid residues 863-886 (FIG. 3) of human ObR (Box1 Jak interacting domain)) Conservative changes (substitution or insertion) can be made genetically. Non-conservative changes to the starred residues in the ECD shown in FIG. 5 can be made by genetic engineering to make a mutant ObR with binding affinity for the changed Ob. Amino acids with the same mutagenesis method can also be used to design mutant ObRs based on the mouse long forms ObR and human ObR shown side by side in double asterisks.

도 4는 쥐의 ECD와 사람 gp-130을 나란히 도시한 것으로, 동일한 잔기들은 검정색으로 표시하였고, 보존적 변화들은 회색으로 표현하였다. 아마도, 동일한 부분들 및 보존된 부분들은 ECD의 삼차구조의 유지에 중요한 반면에, 가변 부위들은 각 수용체의 그의 리간드에 대한 특이성에 기여할 것이다. 따라서, Ob에 대한 변화된 결합친화성을 갖는 ObR 돌연변이체들은 도 4에 도시된 가변부위들을 변화시킴으로써 유전공학적으로 만들어질 수 있다. 이러한 ObR 돌연변이체들은 도 4에 박스(검정 박스 및 회색 박스)로 표시한 ObR 아미노산 서열들은 그대로 갖거나 도 4에서 회색 박스로 도시한 gp-130 서열로부터 유래된 하나 이상의 보존적 치환을 포함하도록 설계될 수 있다.Figure 4 shows the rat ECD and human gp-130 side by side, identical residues in black and conservative changes in gray. Perhaps the same and conserved moieties are important for the maintenance of the tertiary structure of the ECD, while the variable regions will contribute to the specificity of each receptor for its ligand. Thus, ObR mutants with altered binding affinity for Ob can be made genetically by changing the variable regions shown in FIG. 4. These ObR mutants are designed to have the ObR amino acid sequences indicated by boxes (black boxes and gray boxes) in FIG. 4 as they are or include one or more conservative substitutions derived from the gp-130 sequence shown as gray boxes in FIG. 4. Can be.

obR 코드화 서열에 대한 다른 돌연변이들은 선택된 숙주세포내에서의 발현 스케일 업 등에 더욱 적합한 ObR을 생성하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기들은 이황화결합을 제거하기 위해 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있다; N- 결합 포도당화 부위들은 예를 들어 하이퍼글리코실레이트 N-결합 부위로 알려진 효모 숙주로부터 더욱 쉽게 회수되고 정제되는 균질한 산물을 수득하기 위하여 변화되거나 제거될 수 있다. 이러한 목적을 위해, ECD(N-X-S 또는 N-X-T)내에 있는 하나 이상의 임의의 포도당화 인식서열들의 첫 번째 및 세 번째 아미노산 중 하나 또는 양자의 위치에서의 여러 가지 아미노산 치환, 및/또는 ECD내의 하나 이상의 이와 같은 인식서열의 두 번째 위치에서의 아미노산 결실이 변형된 3펩타이드 서열(modified tripeptide sequence)에서 ObR의 포도당화를 억제할 것이다. (예컨대, Miyajima et al., 1986, EMBO J. 5(6) : 1193-1197 참조).Other mutations to the obR coding sequence can be made to generate ObRs that are more suitable for scaling up expression in selected host cells. For example, cysteine residues may be deleted or substituted with other amino acids to eliminate disulfide bonds; N-linked glucoseification sites can be altered or removed, for example, to obtain a homogeneous product that is more readily recovered and purified from a yeast host known as hyperglycosylated N-binding sites. For this purpose, various amino acid substitutions at the position of one or both of the first and third amino acids of one or more of any of the glycosylation recognition sequences in the ECD (NXS or NXT), and / or one or more such in the ECD The amino acid deletion at the second position of the recognition sequence will inhibit the glycosylation of ObR in the modified tripeptide sequence. (See, eg, Miyajima et al., 1986, EMBO J. 5 (6): 1193-1197).

ObR의 하나 이상의 도메인에 상당하는 펩타이드(예컨대, ECD, TM 또는 CD), 절두된 또는 결실된 ObR(예컨대, TM 및/또는 CD가 결실된 ObR)은 물론 전체 길이의 ObR, ObR 펩타이드 또는 절두된 ObR이 관련이 없는 단백질에 융합된 융합단백질들도 본 발명의 범위 내에 속하며, 본 섹션 및 상기 섹션 5.1에 개시된 obR 뉴클레오티드 및 ObR 아미노산 서열에 기초하여 제작될 수 있다. 이러한 융합 단백질들은 생체내에서 ObR 단백질 또는 펩타이드를 안정화하고 반감기를 연장시키는 IgF_c융합; 융합단백질이 세포막에 부착되게 하여 ECD가 세포표면에 나타나게 하는 임의의 아미노산 서열에 대한 마커 기능을 제공하는 융합; 또는 효소, 형광단백질, 또는 발광 단백질에 대한 융합을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.Peptides corresponding to one or more domains of ObR (eg, ECD, TM or CD), truncated or deleted ObR (eg, ObR missing TM and / or CD), as well as full length ObR, ObR peptide or truncated Fusion proteins fused to proteins in which ObR is not relevant are also within the scope of the present invention and can be constructed based on the obR nucleotide and ObR amino acid sequences disclosed in this section and section 5.1 above. Such fusion proteins include IgF _c fusions that stabilize the ObR protein or peptide in vivo and prolong half-life; Fusions that provide a marker function for any amino acid sequence that causes the fusion protein to adhere to the cell membrane, causing the ECD to appear on the cell surface; Or fusion to enzymes, fluorescent proteins, or luminescent proteins.

ObR 폴리펩타이드 및 펩타이드들이 화학적으로 합성될 수 있다고 해도(예컨대, Creighton, 1983, Proteins : Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. 참조), ObR 또는 전체 길이 ObR 그 자체로부터 유래된 대형 폴리펩타이드들은 obR 유전자 서열 및/또는 코드화서열을 포함하는 핵산을 발현시키기 위해 당업자들에게 잘 알려져 있는 기술을 이용함으로써 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법들은 섹션 5.1에 기술된 obR 뉴클레오티드 서열 및 적당한 전사 및 해독 조절 신호들을 포함하는 발현 벡터를 구성하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들어, 생체외 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 들 수 있다. 예컨대, Sambrook et al., 1989, 상술한 문헌 및 Ausubel et al., 1989, 상술한 문헌 참고. 다른 방법으로, obR 뉴클레오티드 서열을 코드화할 수 있는 RNA는 예를 들어, 합성기를 이용함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 첨부된 "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford 참조.Although ObR polypeptides and peptides can be chemically synthesized (see, eg, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman & Co., NY), large polypeptides derived from ObR or full-length ObR itself These can be produced by recombinant DNA techniques by using techniques well known to those skilled in the art to express nucleic acids comprising obR gene sequences and / or coding sequences. These methods can be used to construct an expression vector comprising the obR nucleotide sequence described in section 5.1 and appropriate transcriptional and translational control signals. Such methods include, for example, ex vivo recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo gene recombination. See, eg, Sambrook et al., 1989, supra, and Ausubel et al., 1989, supra. Alternatively, RNA capable of encoding the obR nucleotide sequence can be chemically synthesized, for example by using a synthesizer. For example, "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J., incorporated herein by reference in its entirety. ed., IRL Press, Oxford.

본 발명의 obR 뉴클레오티드 서열을 발현하는데는 여러 가지 숙주-발현 시스템들이 이용될 수 있다. ObR 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 가용성 유도체(예컨대, ECD에 상당하는 ObR 펩타이드; 절두된 또는 결실된 ObR(예컨대, TM 및/또는 CD가 결실된 ObR)인 경우에, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 배양세포로부터 회수될 수 있는데, 즉, ObR 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 분비되지 않는 경우에는 숙주세포로부터, 그리고 ObR 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 세포에 의해 분비되는 경우에는 배양배지로부터 회수될 수 있다. 그러나, 발현시스템들은 본래의 위치에 있는, 즉 세포막에 부착된 형태로 ObR 또는 그의 기능성 균등물들을 발현하도록 유전자조작된 숙주세포들도 포함한다. 이러한 발현시스템으로부터의 ObR의 정제 및 농축은 적당한 세제 및 지질 마이셀을 이용하고 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법을 이용함으로써 행할 수 있다. 그러나, 이와 같이 유전자조작된 숙주세포들 자체는 그것이 ObR의 구조 및 기능적 특성을 유지하는 것이 중요할 뿐만 아니라 예컨대, 약물 스크리닝 분석에서와 같이, 생물학적 활성을 평가하는 것이 중요한 상황에도 이용될 수 있다.Various host-expression systems can be used to express the obR nucleotide sequences of the invention. If the ObR peptide or polypeptide is a soluble derivative (eg, an ObR peptide corresponding to ECD; truncated or deleted ObR (eg, ObR lacking TM and / or CD)), the peptide or polypeptide is removed from the culture cell. It may be recovered, ie from the host cell if the ObR peptide or polypeptide is not secreted and from the culture medium if the ObR peptide or polypeptide is secreted by the cells. Also included are host cells that have been engineered to express ObR or functional equivalents thereof in the form of, ie, attached to the cell membrane, Purification and concentration of ObR from such an expression system can be performed using appropriate detergents and lipid micelles. This can be done by using a method well known to those skilled in the art. These engineered host cells themselves are not only important for maintaining the structural and functional properties of the ObR, but can also be used in situations where it is important to assess biological activity, such as in drug screening assays.

본 발명의 목적을 위해 이용될 수 있는 발현시스템들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만 obR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA, 발현 벡터에 의해 형질전환된 세균(예컨대, 이. 콜라이(E. coli), 비.서브틸리스(B. subtilis))과 같은 미생물; obR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모(예컨대, 사카로마이세스, 피치아); obR 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충세포 시스템; obR 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 감염되었거나, 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, obR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 포유동물세포(예컨대, 메탈로티오에인 프로모터)의 게놈으로부터 또는 포유동물 바이러스(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물을 포함하는 포유동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)을 포함한다.Expression systems that can be used for the purposes of the present invention include, but are not necessarily limited to, recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA, including obR nucleotide sequences, bacteria transformed with an expression vector (eg, Microorganisms such as E. coli, B. subtilis); yeast transformed with a recombinant yeast expression vector comprising an obR nucleotide sequence (eg Saccharomyces, Peachia); insect cell systems infected with recombinant virus expression vectors (eg, baculovirus) comprising an obR sequence; infected with a recombinant viral expression vector (eg cauliflower mosaic virus, CaMV, tobacco mosaic virus, TMV) comprising an obR sequence or transformed with a recombinant plasmid expression vector (eg Ti plasmid comprising an obR nucleotide sequence) Plant cell system; Or a mammal comprising a recombinant expression construct comprising a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg metallothioain promoter) or from a mammalian virus (eg adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter). Animal cell systems (eg, COS, CHO, BHK, 293, 3T3).

세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터들은 바람직하게 발현될 obR 유전자 산물에 대해 정해진 용도에 의존하여 선택될 수 있다. 예를 들어, ObR 단백질의 약제 조성물을 생산하기 위해 또는 ObR 단백질에 대한 항체를 증가시키기 위해 그러한 단백질이 다량 생산되어야 하는 경우에는, 예를 들어, 쉽게 정제되는 고농도의 융합단백질의 발현을 유도하는 벡터들이 바람직할 것이다. 이러한 벡터들은 obR 코드화 서열이 융합단백질이 생산되도록 개별적으로 벡터내의 lacZ 코드화부위에 연결되어 있는, 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO. J. 2:1719); pIN 벡터들(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids, Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. pGEX 벡터들도 글루타치온 S-트랜스페라제(GST)를 갖는 융합단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합단백질들은 가용성이고 글루타치온-아가로스 비드에 대한 흡착에 의해 용해된 세포들로부터 용이하게 정제된 후 유리된 글루타치온의 존재 하에서 용출될 수 있다. PGEX 벡터들은 클로닝된 표적 유전자 산물들이 GST 부분으로부터 분리될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 절단 부위를 포함하도록 설계된다.In bacterial systems, multiple expression vectors can be selected depending on the intended use, preferably for the obR gene product to be expressed. For example, if a large amount of such protein is to be produced to produce a pharmaceutical composition of the ObR protein or to increase the antibody against the ObR protein, for example, a vector that induces the expression of a high concentration of fusion protein that is readily purified. Would be preferred. These vectors comprise E. coli, wherein the obR coding sequence is individually linked to the lacZ coding region in the vector to produce a fusion protein. E. coli expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO. J. 2: 1719); pIN vectors (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids, Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509), and the like. It is not. pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). In general, these fusion proteins are soluble and can be easily purified from lysed cells by adsorption to glutathione-agarose beads and then eluted in the presence of free glutathione. PGEX vectors are designed to include thrombin or factor Xa cleavage sites so that cloned target gene products can be separated from the GST moiety.

곤충 시스템에서는, 오토그라파 칼리포르시아(Autographa califorcia) 핵 다형성 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 이용된다. 상기 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들 내에서 생장한다. obR 유전자 코드화 서열은 바이러스의 비-필수 부위(예를 들어 폴리헤드린 유전자)내에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓인다. obR 유전자 코드화 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자의 불활성화 및 비-폐색(non-occluded) 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 코드화된 단백질 피막을 갖지 않는 바이러스)의 생산을 초래할 것이다. 이러한 재조합 바이러스들은 이어서 그 안에서 삽입된 유전자가 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포를 감염시키는데 이용된다(예컨대, Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, 미국특허 제 4,215,051호 참조).In insect systems, Autographa califorcia nuclear polymorphism virus (AcNPV) is used as a vector for expressing foreign genes. The virus grows in Spodoptera frugiperda cells. The obR gene coding sequence is individually cloned into the non-essential portion of the virus (eg polyhedrin gene) and is under the control of an AcNPV promoter (eg polyhedrin promoter). Successful insertion of the obR gene coding sequence will result in the inactivation of the polyhedrin gene and the production of non-occluded recombinant virus (ie, a virus without the protein coating encoded by the polyhedrin gene). These recombinant viruses are then used to infect Spododotera pruperfera cells in which the gene inserted therein is expressed (eg, Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US Pat. No. 4,215,051). Reference).

포유동물 숙주세포에서는, 다수의 바이러스-계 발현 시스템들이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현벡터로 이용되는 경우에, 목적으로 하는 obR 뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예컨대, 후기 프로모터 및 삼분 리더 서열(tripartite leader sequence)에 연결될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이어서 생체내 또는 생체외 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈내의 비-필수 부위(예컨대, E1 또는 E3)내로의 삽입은 생존하여 감염된 숙주 내에서 obR 유전자 산물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 결과시킬 것이다 (Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 참조). 특수한 개시 신호들도 삽입된 obR 뉴클레오티드 서열의 효과적인 해독을 위해 필요하다. 이러한 신호들은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 자신의 개시 코돈 및 인접 서열들을 포함하는 전체 obR 유전자 또는 cDNA가 적당한 발현벡터내에 삽입되는 경우에는 추가 해독 조절 신호들이 필요하지 않다. 그러나, obR 코드화 서열의 일부만이 삽입된 경우에는, ATG 개시코돈을 포함하는, 외부로부터 유래된 해독 조절서열이 제공되어야만 한다. 더욱이, 개시코돈은 전체 삽입물이 해독되도록 보장하기 위해 목적 코드화 서열의 해독틀과 동상(in phase)이어야 한다. 이러한 외부로부터 제공된 해독조절신호들 및 개시코돈들은 여러 가지 출처로부터 것일 수 있고, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 발현의 효율성은 적당한 전사 인헨서 요소, 전사 터미네이터 등의 포함에 의해 향상될 수 있다(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544 참조).In mammalian host cells, a number of virus-based expression systems can be used. When adenoviruses are used as expression vectors, the desired obR nucleotide sequences can be linked to adenovirus transcriptional / detoxification regulatory complexes, such as late promoters and tripartite leader sequences. Such chimeric genes can then be inserted into the adenovirus genome by in vivo or ex vivo recombination. Insertion into a non-essential site (eg, E1 or E3) in the viral genome will result in a recombinant virus capable of surviving and expressing the obR gene product in the infected host (Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 3655-3659). Special initiation signals are also required for effective translation of the inserted obR nucleotide sequences. Such signals include an ATG start codon and contiguous sequences. No additional translational control signals are required if the entire obR gene or cDNA, including its start codon and its contiguous sequences, is inserted into a suitable expression vector. However, when only a portion of the obR coding sequence is inserted, an externally derived translational control sequence must be provided, including the ATG start codon. Moreover, the start codon should be in phase with the translation frame of the target coding sequence to ensure that the entire insert is translated. Such externally provided detoxification control signals and initiation codons may be from a variety of sources and may be natural or synthetic. The efficiency of expression can be enhanced by the inclusion of suitable transcription enhancer elements, transcription terminators, and the like (see Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

또한, 삽입된 서열들의 발현을 조절하거나 유전자 산물을 목적으로 하는 특수한 양식으로 변화시키고 가공하는 숙주세포 균주가 선택될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예컨대, 포도당화) 및 가공(예컨대, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 단백질 및 유전자 산물의 해독후-가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이한 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질이 정확하게 변형 및 가공되도록 하는 적당한 세포주 또는 숙주 세포 시스템들이 선택될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 유전자 산물의 포도당화와 인산화를 위한 적절한 세포기구를 갖는 진핵 숙주세포가 이용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주세포는 반드시 이들로 국한되는 것은 아니나, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 특히, 맥락막총 세포주를 포함한다.In addition, a host cell strain may be selected that modulates the expression of the inserted sequences or changes and processes them in a specific fashion for the gene product. Modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of such protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Appropriate cell lines or host cell systems can be selected that allow the expressed foreign protein to be accurately modified and processed. For this purpose, eukaryotic host cells with appropriate cellular machinery for proper processing of primary transcripts, glycosylation and phosphorylation of gene products can be used. Such mammalian host cells include, but are not necessarily limited to, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, in particular choroid plexus cell lines.

재조합 단백질을 장기간동안 높은 수율로 생산하기 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 상술한 obR 서열을 안정적으로 발현할 수 있는 세포주들이 유전자조작될 수 있다. 바이러스 복제기점을 갖는 발현벡터를 이용하는 대신에, 숙주세포를 적당한 발현조절 요소들(예컨대, 프로모터, 인헨서 서열, 전사 종결부위, 폴리아데닐화부위 등)에 의해 조절되는 DNA 및 선택가능한 마커로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입하고 나서, 유전자조작된 세포들을 농축된 배지 내에서 1-2일간 성장하도록 방치한 후 선택 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드내의 선택가능한 마커는 선택에 대해 저항성을 부여하여 세포들이 안정적으로 플라스미드를 그들의 염색체내로 도입하고 성장하여 추후 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있는 포사이(foci)를 형성할 수 있게 한다. 이러한 방법은 obR 유전자 산물을 발현하는 세포주를 유전자조작하는데 유리하게 이용될 수 있다. 이러한 유전자조작된 세포주들은 obR 유전자 산물의 내성 활성에 영향을 미치는 화합물들의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.In order to produce a recombinant protein in high yield for a long time, stable expression is desirable. For example, cell lines capable of stably expressing the above-described obR sequences may be engineered. Instead of using expression vectors with viral origins of replication, host cells are transformed with selectable markers and DNA regulated by appropriate expression control elements (e.g., promoters, enhancer sequences, transcription termination sites, polyadenylation sites, etc.). You can switch. After introducing foreign DNA, the engineered cells are allowed to grow for 1-2 days in concentrated medium and then transferred to selection medium. Selectable markers in recombinant plasmids confer resistance to selection, allowing cells to stably introduce plasmids into their chromosomes and grow to form foci that can later be cloned and expanded into cell lines. This method can be advantageously used to genetically engineer cell lines expressing obR gene products. Such engineered cell lines may be particularly useful for the screening and evaluation of compounds that affect the resistant activity of obR gene products.

헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, et al., 1977, Cell 11 : 223), 히포크산틴-구아닌 포르포리보실트랜스페라제 (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 : 2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제 (Lowy, et al., 1980, Cell 22 : 817) 유전자들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 이용가능한 다수의 선택 시스템은 각각 tk^-, hgprt^-, 또는 aprt^-세포들 내에서 이용될 수 있다. 또한, 안티메타볼레이트 저항성은 다음 유전자들의 선별을 위한 기초로 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대해 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77 : 3567 ; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 1527); 미코페놀릭 애시드에 대하여 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2072): 아미노글리코사이드 G-418에 대해 저항성을 부여하는 neo ( Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) ; 및 하이그로마이신에 대해 저항성을 부여하는 hygro (Santerre, et al., 1984, Gene 30 : 147).Herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 : 2026), and adenine phospholipid view trans Blow claim (Lowy, et al, 1980, Cell 22: 817) including the genes but not necessarily a number of selection systems are available, not limited to these were tk ^-, hgprt ^- Or aprt ^- cells. In addition, antimethabolate resistance can be used as the basis for the selection of the following genes: dhfr (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O, which confers resistance to methotrexate). Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); Gpt confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072): neo confers resistance to aminoglycoside G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); And hygro conferring resistance to hygromycin (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147).

다른 방법으로, 임의의 융합단백질들은 발현될 융합단백질에 대한 항체특이성을 이용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, Janknecht 등에 의해 기술된 시스템은 사람 세포주에서 발현된 비-변성 융합단백질의 용이한 분리를 가능하게 한다 (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 8972-8976). 이 시스템에서, 목적 유전자는 유전자의 개방 해독틀이 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노-말단 택에 해독상 융합되도록 백시니아 재조합 플라스미드 내에 2차 클로닝된다. 재조합 백시니아에 의해 감염된 세포들로부터의 추출물들은 Ni²⁺-니트릴로아세틱 애시드-아가로스 컬럼에 로딩되고 히스티딘-택이 붙은 단백질들은 이미다졸-함유 완충액 내에 선택적으로 용출된다.Alternatively, any of the fusion proteins can be purified using antibody specificity for the fusion protein to be expressed. For example, the system described by Janknecht et al. Allows for easy isolation of non-denatured fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972 -8976). In this system, the gene of interest is secondary cloned into a vaccinia recombinant plasmid such that the open translational frame of the gene is translationally fused to an amino-terminal tag consisting of six histidine residues. Extracts from cells infected by recombinant vaccinia are loaded onto a Ni ²⁺ -nitriloacetic acid-agarose column and histidine-tacked proteins are optionally eluted in imidazole-containing buffer.

obR 유전자 산물들은 형진전환동물내에서 발현될 수도 있다. 마우스, 쥐, 토끼, 기니아피그, 돼지, 마이크로-돼지, 염소, 및 비-사람 영장류, 예컨대, 비비, 원숭이, 및 챔팬치를 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 임의의 종의 동물이 obR 형질전환 동물들을 만드는데 이용될 수 있다.obR gene products may also be expressed in transgenic animals. Animals of any species, including but not necessarily limited to mice, rats, rabbits, guinea pigs, pigs, micro-pigs, goats, and non-human primates such as baboons, monkeys, and champans It can be used to make transition animals.

obR 형질전환유전자를 동물 내에 도입하여 제조자 계통의 형질전환동물을 만들기 위해 임의의 당업계에 알려진 기술들이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 프로뉴클리어 마이크로인젝션 (Hoppe, P.C. and Wagner, -33T.E., 1989, 미국특허 제 4,873,191호); 생식세포주내의 레트로바이러스 매개 유전자 전이 (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82 : 6148-6152) ; 배간세포(embryonic stem cells)에서의 유전자 표적화(gene targeting) (Thompson et al., 1989, Cell 56 : 313-321); 배의 일렉트로포레이션 (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); 및 정자-매개 유전자 전이(sperm-mediated gene transfer) (Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723); 등을 포함하는데 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 이러한 기술에 대한 더욱 상세한 사항은 본원에 전문이 참고자료로 첨부된 Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229를 참조할 수 있다.Any technique known in the art can be used to introduce an obR transgene into an animal to make a transgenic animal of the manufacturer line. Such techniques include Pronuclear Microinjection (Hoppe, P.C. and Wagner, -33 T.E., 1989, US Pat. No. 4,873,191); Retroviral mediated gene transfer in germ cell lines (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., 1989, Cell 56: 313-321); Embryo electroporation (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814); And sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717-723); And the like, but are not necessarily limited to these. Further details on these techniques are provided in Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229.

본 발명은 그들의 모든 세포내에 obR 형질전환유전자를 갖고 있는 형질전환동물은 물론 그들의 모든 세포는 아니지만 일부 세포내에 형질전환유전자를 갖는 동물(즉, 모자이크 동물)을 제공한다. 형질전환유전자들은 하나의 형질전환유전자로 또는 컨캐터머, 즉, 헤드-투-헤드 탄뎀 또는 헤드-투-테일 탄뎀으로 도입될 수 있다. 형질전환유전자는 라스코 등의 교시에 따라 특정한 세포 유형에 선택적으로 도입되고 활성화될 수 있다(Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236). 이러한 세포-유형 특이적 활성화에 필요한 조절서열들은 목적으로 하는 특정한 세포 유형에 의존하며 당업자들에게 자명할 것이다. obR 유전자 형질전환유전자가 내성 obR 유전자의 염색체 부위에 삽입되는 것이 바람직한 경우에는 유전자 표적화(gene targeting)가 바람직하다. 간단히 설명하면, 이러한 기술이 이용되어야 한다면, 내성 obR 유전자와 상동성인 일부 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 벡터들을 내성 obR 유전자의 뉴클레오티드 서열 내에 삽입하여 그 기능을 파괴하는 염색체 서열과의 상동재조합을 통해 도입하기 위해 설계된다. 형질전환유전자는 특정한 세포 유형에 선택적으로 도입되어, 예를 들어 구 등의 교시(Gu et al., 1994, Science 265:103-106)에 따라 그 세포 유형에서만 내성 obR 유전자를 불활성화할 수 있다. 이러한 세포-유형 특이적 불활성화에 요구되는 조절서열들은 목적으로 하는 특정한 세포 유형에 의존하며 당업자들에게 자명할 것이다.The present invention provides transgenic animals having an obR transgene in all their cells as well as animals having transgenes in some but not all of their cells (ie, mosaic animals). The transgenes may be introduced as a single transgene or as a converter, ie, head-to-head tandem or head-to-tail tandem. The transgene can be selectively introduced and activated in specific cell types according to the teachings of Lasco et al. (Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236). The regulatory sequences required for such cell-type specific activation depend on the particular cell type of interest and will be apparent to those skilled in the art. Gene targeting is preferred where it is desirable for the obR gene transgene to be inserted into the chromosomal region of the resistant obR gene. In short, if this technique is to be used, it is necessary to introduce vectors containing some nucleotide sequences homologous to the resistant obR gene through homologous recombination with chromosomal sequences that insert into the nucleotide sequence of the resistant obR gene and destroy its function. Is designed. The transgene can be selectively introduced into a particular cell type to inactivate the resistant obR gene only in that cell type, for example according to Gu et al., 1994, Science 265: 103-106. . The regulatory sequences required for such cell-type specific inactivation depend on the particular cell type of interest and will be apparent to those skilled in the art.

일단 형질전환동물이 만들어지면, 재조합 obR 유전자의 발현은 표준기술에 따라 분석할 수 있다. 최초 스크리닝은 형질전환유전자의 도입이 일어났는지 여부를 분석하기 위해서 동물 조직을 조사하기 위해 서던 블롯 분석 또는 PCR 기술을 이용하여 행할 수 있다. 형질전환 동물의 조직내의 형질전환유전자의 mRNA 발현 수준은 동물로부터 수득된 조직시료의 노던블롯 분석, 제자리 혼성화 분석(in situ hybridization analysis) 및 RT-PCR을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. obR 유전자-발현 조직의 시료들은 obR 형질전환유전자 산물에 대해 특이적인 항체를 이용함으로써 면역세포화학적으로 평가할 수도 있다.Once the transgenic animal is made, expression of the recombinant obR gene can be analyzed according to standard techniques. Initial screening can be done using Southern blot analysis or PCR techniques to examine animal tissue to analyze whether the introduction of the transgene has occurred. MRNA expression levels of transgenes in tissues of transgenic animals include, but are not limited to, Northern blot analysis, in situ hybridization analysis and RT-PCR of tissue samples obtained from the animals. Samples of obR gene-expressing tissue can also be immunocytochemically assessed using antibodies specific for the obR transgene product.

C. ObR 단백질에 대한 항체Antibodies to C. ObR Protein

ObR의 하나 이상의 에피톱 또는 ObR의 보존적 변이체의 에피톱들 또는 ObR의 펩타이드 단편을 특이적으로 인식하는 항체들도 본 발명에 포함된다. 이러한 항체들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니나, 다클론 항체, 단클론 항체(mABs), 인체에서 만들어진 것과 같은 성질로 만든 또는 키메라 항체들, 단일 쇄 항체들, Fab 단편들, F(ab')₂단편들, Fab 발현 도서관으로부터 만들어진 단편들, 항-이디오타입(anti-Id) 항체들 및 전술한 것들중 임의의 것의 에피톱-결합 단편들을 포함한다.Also included in the present invention are antibodies that specifically recognize one or more epitopes of ObR or epitopes of conservative variants of ObR or peptide fragments of ObR. These antibodies are not necessarily limited to, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mABs), made from human-like or chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') ₂ fragments. , Epitope-binding fragments of any of the foregoing, anti-Id antibodies, and fragments made from Fab expression libraries.

본 발명의 항체들은 예를 들어, 생물 시료내의 ObR을 검출하는데 이용될 수 있기 때문에, 진단 또는 예후 기술의 일부로 이용되어 환자가 비정상적인 ObR 양을 갖고 있는지 여부를 시험하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체들은 obR 유전자 산물의 발현 및/또는 활성에 대한 시험 화합물들의 효과를 평가하기 위하여, 아래 세견 5.5에 후술하는 바와 같은 화합물 스크리닝 스킴과 함께 이용될 수도 있다. 또한, 이러한 항체들은 세포들을 환자에게 도입하기 이전에 정상 및/또는 유전자조작된 ObR-발현 세포들을 평가하지 위해, 아래 섹션 5.6에 후술하는 바와 같은 유전자 치료법 기술(gene therapy techniques)과 함께 이용될 수도 있다. 이러한 항체들은 비정상적인 ObR 활성을 억제하는 방법으로도 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 항체들은 체중장애치료방법의 일부로 이용될 수 있다.Since antibodies of the invention can be used, for example, to detect ObR in a biological sample, it can be used as part of a diagnostic or prognostic technique to test whether a patient has an abnormal amount of ObR. Such antibodies may also be used with compound screening schemes, as described below in 5.5, below, to assess the effect of test compounds on the expression and / or activity of obR gene products. Such antibodies may also be used in conjunction with gene therapy techniques, as described below in Section 5.6 below, to assess normal and / or engineered ObR-expressing cells prior to introducing the cells into a patient. have. These antibodies can also be used as a method of inhibiting abnormal ObR activity. Therefore, these antibodies can be used as part of a weight disorder treatment method.

항체 생산의 경우에는, ObR, ObR 펩타이드(예컨대, ECD, TM, 또는 CD와 같은 수용체의 기능성 도메인에 해당하는 것), 절두된 ObR 폴리펩타이드(예컨대, TM 또는 CD와 같은 하나 이상의 도메인들이 결실된 ObR), ObR 기능성 균등물 또는 ObR의 돌연변이체를 주입하여 여러 가지 숙주 동물들을 면역화할 수 있다. 이러한 숙주동물들은 토끼, 마우스 및 쥐를 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 면역반응을 증가시키기 위해 여러 가지 아쥬반트들이 숙주 종에 따라 이용될 수 있다. 이러한 아쥬반트들은 프로인트(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 광물 겔(mineral gel), 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀과 같은 표면 활성화 물질들 및 BCG(bacille Calmette-Guerin) 코리네박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 사용가능한 사람 아쥬반트들을 포함하나 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 다클론 항체들은 면역화된 동물들의 혈청으로부터 유래된 항체 분자들의 불균일 집단(heterogeneous populations)이다.In the case of antibody production, the ObR, ObR peptide (e.g., corresponding to the functional domain of a receptor such as ECD, TM, or CD), truncated ObR polypeptide (e.g., one or more domains are deleted) ObR), ObR functional equivalents or mutants of ObR can be injected to immunize various host animals. Such host animals include, but are not necessarily limited to, rabbits, mice, and mice. Various adjuvants may be used depending on the host species to increase the immune response. These adjuvants are Freunds (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, lysocithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, Surface-activated substances such as dinitrophenol and potentially available human adjuvants such as bacille Calmette-Guerin (BCG) Corynebacterium parvum (BCG). Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibody molecules derived from the serum of immunized animals.

특정 항원에 대한 균일 집단인 단클론 항체들은, 컬처내에 지속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 기술에 의해 수득될 수 있다. 이들은 콜러와 밀스타인의 하이브리도마 기술(1975, Nature 256 : 495-497; 및 미국특허 제 4,376,110호), 사람 B-cell 하이브리도마 기술 (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72 ; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하지만 반드시 여기에 국한되는 것은 아니다. 이러한 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 및 이들의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스에 속하는 것일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마들은 생체내 및 생체외에서 배양될 수 있다. 생체내에서의 고역가의 mAb의 생산은 이것을 현재 바람직한 생산 방법으로 만든다.Monoclonal antibodies that are a homogeneous population for a particular antigen can be obtained by any technique that produces antibody molecules by persistent cell lines in the culture. These include Koler and Milstein's hybridoma technology (1975, Nature 256: 495-497; and US Pat. No. 4,376,110), human B-cell hybridoma technology (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole; et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, and EBV-Hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.). , pp. 77-96), but is not necessarily limited thereto. Such antibodies may belong to any class of immunoglobulins, including IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, and subclasses thereof. Hybridomas producing the mAb of the invention can be cultured in vivo and ex vivo. The production of high titers of mAbs in vivo makes this a presently preferred method of production.

또한, 적당한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터 유전자를 적당한 생물학적 활성을 갖는 사람 항체로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함에 의한 "키메라 항체"의 제조를 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81 : 6851-6855 ; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608 ; Takeda et al., 1985, Nature, 314 : 452-454)들도 이용될 수 있다. 키메라 항체는 쥐 mAb와 사람 면역글로불린 불변부위로부터 유래된 여러 가지 부위들을 갖는 것과 같은, 서로 다른 부분들이 서로 다른 동물 종들로부터 유래된 분자이다.In addition, techniques developed for the production of “chimeric antibodies” by splicing genes from mouse antibody molecules with appropriate antigen specificity with genes from human antibodies with appropriate biological activity (Morrison et al., 1984, Proc). Natl.Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454). . Chimeric antibodies are molecules from different animal species that differ in different parts, such as having different sites derived from murine mAbs and human immunoglobulin constant regions.

다른 방법으로, 단일 쇄 항체(single chain antibodies)의 제조 기술(미국특허 제 4,946,778호; Bird, 1988, Science 242 : 423-426 ; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334 : 544-546)은 obR 유전자 산물에 대한 단일 쇄 항체들을 만들기 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 항체들은 Fv 부위의 중쇄 단편과 경쇄 단편들을 아미노산 다리를 통해 단일 쇄 폴리펩타이드가 형성되도록 연결하여 제조될 수 있다.Alternatively, techniques for the preparation of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) can be modified to make single chain antibodies against the obR gene product. Single chain antibodies can be prepared by joining the heavy and light chain fragments of the Fv region to form a single chain polypeptide via an amino acid bridge.

특이적인 에피톱들을 인식하는 항체 단편들은 공지의 기술에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂단편들 및 F(ab')₂단편들의 이황화물 다리를 약화시킴으로써 제조될 수 있는 Fab 단편들. 대안으로, 목적하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편들을 신속하고 용이하게 동정할 수 있게 하기 위하여, Fab 발현 도서관을 구성할 수 있다(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281).Antibody fragments that recognize specific epitopes can be made by known techniques. For example, such fragments are necessarily include but are not then be limited to these: F (ab ') which can be produced by pepsin degradation of the antibody molecules ₂ fragments and F (ab') ₂ fragment disulfide bridge of Fab fragments that can be prepared by attenuating. Alternatively, Fab expression libraries can be constructed to enable rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281).

ObR에 대한 항체들은 이어서 당업자들에게 잘 알려져 있는 기술을 이용함으로써 ObR을 "의태(mimic)"한 항-이디오타입 항체들을 만드는데 이용될 수 있다(예컨대, Greenspan & Bona, 1993 FASEB J 7(5):437-444 ; and Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8) : 2429-2438 참조). 예를 들어, ObR ECD에 결합하여 ObR에 대한 Ob의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체들은 ECD를 "의태(mimic)"한 항-이디오타입 항체들을 만들어 Ob를 결합시키고 중화하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 항-이디오타입들의 이러한 중화 항-이디오타입 또는 Fab 단편들은 Ob를 중화하여 체중증가를 촉진하는 치료방법에 이용될 수 있다.Antibodies against ObR can then be used to make anti-idiotype antibodies that “mimic” ObR by using techniques well known to those skilled in the art (eg, Greenspan & Bona, 1993 FASEB J 7 (5). And: Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438). For example, antibodies that bind to ObR ECD and competitively inhibit binding of Ob to ObR can be used to bind and neutralize Ob by creating anti-idiotype antibodies that “mimic” ECD. Such neutralizing anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic methods that neutralize Ob to promote weight gain.

D. 체중장애 이상의 진단D. Diagnosis of Weight Disorder Abnormalities

여러 가지 방법이 비만증, 카헥시(cachexia) 및 식욕부진을 포함하는 체중장애의 진단 및 예후 평가 및 이러한 장애의 소질을 가지고 있는 대상을 동정하는데 이용될 수 있다.Various methods can be used to diagnose and predict prognostic weight disorders, including obesity, cachexia, and anorexia, and to identify subjects with predisposition to such disorders.

이러한 방법들은 예를 들어, 섹션 5.1에 기술된 obR 뉴클레오티드 서열 및 섹션 5.3에 기술된 바와 같은 ObR 항체들과 같은 시약을 이용한다. 구체적으로 이러한 시약들은 예를 들어, (1) obR 유전자 돌연변이의 존재의 검출, 또는 체중장애가 없는 상태에 대비한 obR mRNA의 과잉- 또는 부족-발현의 검출; (2)체중장애가 없는 상태에 대비한 obR 유전자 산물의 과잉- 또는 부족-발현의 검출; 및 (3) ObR에 의해 매개되는 신호변환경로의 동요 또는 이상을 검출하기 위해 이용될 수 있다.These methods utilize, for example, reagents such as the obR nucleotide sequence described in section 5.1 and ObR antibodies as described in section 5.3. Specifically such reagents include, for example, (1) detection of the presence of obR gene mutations, or over- or under-expression of obR mRNA in the absence of weight loss; (2) detection of over- or under-expression of the obR gene product in the absence of weight impairment; And (3) to detect fluctuations or anomalies in the signal transduction path mediated by ObR.

본원에 개시된 방법들은 적어도 하나의 특이적인 obR 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기술된 ObR 항체 시약을 포함하고, 임상적으로 체중장애 이상을 나타내는 환자를 진단하기 위해 편리하게 이용될 수 있는, 미리-패킹된 진단키트를 이용함으로써 행해질 수 있다.The methods disclosed herein comprise at least one specific obR nucleotide sequence or an ObR antibody reagent described herein and can be conveniently used to diagnose patients exhibiting clinically disordered weight disorders, pre-packed diagnostics By using a kit.

obR 돌연변이 검출의 경우에는, 임의의 유핵 세포가 게놈 핵산에 대한 출발 공급원으로 이용될 수 있다. obR 유전자 발현 또는 obR 유전자 산물의 검출의 경우에는, 예를 들어, 맥락막총 세포와 같은 obR 유전자가 발현되는 세포유형 또는 조직이 이용될 수 있다.For obR mutation detection, any nucleated cell can be used as a starting source for genomic nucleic acids. In the case of obR gene expression or detection of an obR gene product, a cell type or tissue in which the obR gene is expressed, for example choroid plexus cells, may be used.

핵산에 기초하는 검출 기술들은 아래 섹션 5.4.1에 기술하였다. 펩타이드 검출 기술은 아래 섹션 5.4.2에 기술하였다.Detection techniques based on nucleic acids are described in Section 5.4.1 below. Peptide detection techniques are described in section 5.4.2 below.

1. obR 유전자 및 전사체의 검출1. Detection of obR gene and transcript

obR 유전자내의 돌연변이들은 여러 가지 기술을 이용하여 검출할 수 있다. 임의의 유핵 세포로부터의 핵산은 이러한 기술에서 출발점으로 이용될 수 있고, 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준 핵산 제조방법에 따라 분리될 수 있다.Mutations in the obR gene can be detected using a variety of techniques. Nucleic acids from any nucleated cell can be used as a starting point in this technique and can be isolated according to standard nucleic acid preparation methods well known to those skilled in the art.

DNA는 점 돌연변이, 삽입, 결실 및 염색체 재배열을 포함하는 obR 유전자 구조상의 이상을 검출하기 위하여 생물시료의 혼성화 및 증폭분석에 이용될 수 있다. 이러한 분석은 서던 분석, 단일가닥 형상 다형성 분석(SSCP; single stranded conformational polymorphism analyses) 및 PCR 분석을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.DNA can be used for hybridization and amplification of biological samples to detect abnormalities in the obR gene structure, including point mutations, insertions, deletions and chromosomal rearrangements. Such analyzes include, but are not limited to, Southern analysis, single stranded conformational polymorphism analyses (SSCP), and PCR analysis.

obR 유전자-특이적 돌연변이의 검출을 위한 이러한 진단 방법들은 예를 들어, 예컨대, 환자 시료 또는 다른 적당한 세포 공급원으로부터 유래된 시료로부터 수득된 재조합 DNA 분자, 클로닝된 유전자 또는 이들의 퇴화 변이체들을 포함하는 핵산 분자들을 섹션 5.1에 기술된 바와 같이, obR 유전자내의 그들의 상보적인 서열들에 대한 특이적인 어닐링하는데 유리한 조건하에서 하나 이상의 표지된 재조합 DNA 분자, 클로닝된 유전자 또는 이들의 퇴화 변이체들을 포함하는 핵산 시약들과 접촉 및 인큐베이션하는 과정을 포함한다. 바람직하게, 이들 핵산 시약들의 길이는 적어도 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 인큐베이션 이후에, 모든 어닐링되지 않은 핵산을 핵산:obR 분자 하이브리드로부터 제거한다. 혼성화된 핵산분자가 존재할 경우, 이어서 이들의 존재가 검출된다. 이러한 검출 스킴을 이용함으로써, 목적으로 하는 세포 유형 또는 조직으로부터의 핵산을 예컨대, 막, 또는 마이크로타이터 플레이트 또는 폴리스티렌 비드와 같은 플라스틱 표면과 같은 고상 서포트에 고정할 수 있다. 이 경우에, 인큐베이션후, 섹션 5.1에 기술된 것과 같은 유형의 어닐링되지 않는, 비표지 핵산시약들은 제거된다. 나머지, 어닐링되고 표지된 obR 핵산 시약들의 검출은 당업계에 잘 알려져 있는 기술을 이용함으로써 이루어질 수 있다. 핵산 시약이 어닐링된 obR 유전자 서열들은 obR 유전자 돌연변이가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 정상 obR 유전자 서열로부터 예상되는 어닐링 패턴과 비교된다.Such diagnostic methods for the detection of obR gene-specific mutations include, for example, nucleic acids comprising recombinant DNA molecules, cloned genes or their degenerating variants obtained from, for example, patient samples or samples derived from other suitable cell sources. Nucleic acid reagents comprising one or more labeled recombinant DNA molecules, cloned genes or degenerate variants thereof under conditions favorable for specific annealing of their complementary sequences in the obR gene, as described in section 5.1; Contacting and incubating. Preferably, these nucleic acid reagents are at least 15 to 30 nucleotides in length. After incubation, all unannealed nucleic acids are removed from the nucleic acid: obR molecular hybrid. If hybridized nucleic acid molecules are present, their presence is then detected. By using this detection scheme, nucleic acids from the cell types or tissues of interest can be immobilized on solid phase supports such as, for example, membranes or plastic surfaces such as microtiter plates or polystyrene beads. In this case, after incubation, unannealed, unlabeled nucleic acid reagents of the type as described in section 5.1 are removed. The remainder of the detection of annealed and labeled obR nucleic acid reagents can be accomplished using techniques well known in the art. The obR gene sequences annealed with the nucleic acid reagents are compared with the annealing pattern expected from the normal obR gene sequence to confirm whether an obR gene mutation is present.

환자 시료 또는 다른 적당한 세포 공급원내의 obR 유전자 특이적 핵산 분자의 검출을 위한 다른 진단방법은 예컨대, PCR에 의해 그들을 증폭(Mullis, K.B., 1987, 미국특허 제 4,683,202호)시킨 다음, 당업자들에게 잘 알려져 있는 기술을 이용하여 증폭된 분자들을 검출하는 과정을 포함할 수 있다. 그 결과로서 수득되는 증폭된 서열들은 obR 유전자 돌연변이가 존재하는지 여부를 확인하기 위해, 증폭될 핵산분자가 단지 정상인 obR 유전자만을 포함한다고 가정되는 서열들과 비교될 수 있다.Other diagnostic methods for the detection of obR gene specific nucleic acid molecules in patient samples or other suitable cell sources can be amplified by, for example, PCR (Mullis, KB, 1987, US Pat. No. 4,683,202) and then used to those skilled in the art. It may include the process of detecting amplified molecules using known techniques. The resulting amplified sequences can be compared with sequences in which it is assumed that the nucleic acid molecule to be amplified contains only normal obR genes in order to determine whether an obR gene mutation is present.

또한, 잘 알려진 유전자타이핑 기술은 obR 유전자를 갖는 개체를 확인하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어, 이용된 특수한 제한효소에 대한 하나의 인식부위내의 서열 변화를 포함하는 제한단편길이 다형성(RFLPs)의 이용을 포함한다.In addition, well-known genetic typing techniques can be used to identify individuals with the obR gene. Such techniques include, for example, the use of restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) that include sequence changes within one recognition site for the particular restriction enzyme employed.

또한, obR 유전자 돌연변이의 확인에 이용될 수 있는 DNA 다형성을 분석하는 개선된 방법이 기술되었는데, 이 방법은 제한효소부위들 사이에 다양한 수의 짧고 세로로 반복되는(tandemly repeated) DNA 서열의 존재 시에 대문자로 표시한다. 예를 들어, 웨버(미국특허 제 5,075,217호; 본원에 전문 첨부)는 (dC-dA)n-(dG-dT)n 짧은 탄뎀 반복부위 블록내의 길이 다형성에 기초하는 DNA 마커를 기술한다. (dC-dA)n-(dG-dT)n 블록들의 평균 분리는 약 30,000 내지 60,000bp이다. 이와 같이 가깝게 위치한 마커들은 고빈도 동시-유전성(co-inheritance)을 시현하고, 예를 들어, obR 유전자내의 돌연변이, obR 돌연변이와 관련된 질병 또는 장애의 진단과 같은 유전적 돌연변이의 검출에 매우 유용하다.In addition, an improved method of analyzing DNA polymorphism that can be used to identify obR gene mutations has been described, which is present in the presence of varying numbers of short and tandemly repeated DNA sequences between restriction sites. In capital letters. For example, Weber (US Pat. No. 5,075,217; hereby attached in its entirety) describes DNA markers based on length polymorphism in (dC-dA) n- (dG-dT) n short tandem repeat block. The average separation of (dC-dA) n- (dG-dT) n blocks is about 30,000 to 60,000 bp. Such closely located markers exhibit high frequency co-inheritance and are very useful for the detection of genetic mutations such as, for example, the diagnosis of mutations in the obR gene, diseases or disorders associated with obR mutations.

또한 캐스키 등(미국특허 제 5,364,759호; 본원에 전문 첨부)은 짧은 3 및 4 뉴클레오티드 반복서열의 검출을 위한 DNA 증식 분석법을 기술하고 있다. 이 방법은 obR 유전자와 같은 목적 DNA를 추출하는 과정, 추출된 DNA를 증폭시키는 과정, 반복서열을 표지하여 개개의 DNA의 유전자형 지도를 만드는 과정을 포함한다.Casky et al. (US Pat. No. 5,364,759; hereby incorporated in its entirety) describe DNA proliferation assays for the detection of short 3 and 4 nucleotide sequences. This method involves extracting the target DNA, such as the obR gene, amplifying the extracted DNA, and labeling the repetitive sequence to create a genotype map of the individual DNA.

obR 유전자 발현의 수준은 obR 전사를 검출 및 측정함으로써 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포 유형 또는 obR 유전자를 발현하는 것으로 알려졌거나 그럴 것으로 생각되는 뇌, 특히 맥락막총과 같은 일례의 조직으로부터의 RNA를 분리하여 상술한 바와 같은 혼성화 또는 PCR 기술을 이용하여 시험할 수 있다. 분리된 세포들은 세포 컬처 또는 환자로부터 수득될 수 있다. 컬처로부터 수득한 세포의 분석은 세포-기초 유전자치료법 기술의 일부로 이용될 세포의 평가, 또는 obR 유전자의 발현에 대한 화합물들의 효과를 시험하기 위한 세포들의 평가에 필요한 단계일 수 있다. 이러한 분석은 obR 유전자 발현의 활성화 및 불활성화를 포함하는, obR 유전자의 발현 패턴의 정성적 및 정략적 양상을 모두 밝혀줄 것이다.The level of obR gene expression can be analyzed by detecting and measuring obR transcription. For example, RNA from an exemplary tissue, such as the brain, particularly the choroid plexus, known or thought to express a cell type or obR gene, can be isolated and tested using hybridization or PCR techniques as described above. . Isolated cells can be obtained from a cell culture or from a patient. Analysis of cells obtained from the culture can be a necessary step in the evaluation of cells to be used as part of cell-based gene therapy techniques, or in the evaluation of cells to test the effect of compounds on the expression of the obR gene. This analysis will reveal both qualitative and political aspects of the expression pattern of the obR gene, including activation and inactivation of obR gene expression.

이러한 검출 스킴의 하나의 구체예에서, cDNA는 예컨대, RNA 분자의 cDNA로의 역전사에 의해, 목적 RNA로부터 합성된다. cDNA 내의 서열은 이어서 PCR 증폭반응 등과 같은 핵산 증폭반응을 위한 주형으로 이용된다. 이 방법의 역전사 및 핵산증폭에서 합성개시 시약(예컨대, 프라이머)으로 사용된 핵산 시약들은 섹션 5.1에 기술된 obR 핵산 시약들 중에서 선택된다. 바람직한 길이의 이러한 핵산 시약들은 적어도 9-30 뉴클레오티드 길이이다. 증폭 생성물을 검출하기 위해, 핵산증폭은 방사성 표지되거나 비-방사성 표지된 뉴클레오티드들을 이용하여 행할 수 있다. 대안으로, 생성물들이 표준 에시디움 브로마이드 염색에 의해 가시화되거나 임의의 적당한 핵산 염색 방법을 이용함으로써 가시화될 수 있도록 충분한 증폭된 생성물들이 만들어질 수 있다.In one embodiment of this detection scheme, the cDNA is synthesized from the target RNA, eg, by reverse transcription of the RNA molecule into cDNA. The sequence in the cDNA is then used as a template for nucleic acid amplification reactions such as PCR amplification. The nucleic acid reagents used as initiation reagents (eg, primers) in reverse transcription and nucleic acid amplification of this method are selected from the obR nucleic acid reagents described in section 5.1. Such nucleic acid reagents of preferred length are at least 9-30 nucleotides in length. To detect amplification products, nucleic acid amplification can be done using radiolabeled or non-radiolabeled nucleotides. Alternatively, sufficient amplified products can be made so that the products can be visualized by standard ecidium bromide staining or by using any suitable nucleic acid staining method.

또한, 이러한 obR 유전자 발현 분석을 핵산을 정제할 필요가 없도록 "제자리(in situ)"에서, 즉, 생검법 또는 절제에 의해 수득된 환자의 조직의 조직편(고정 및/또는 냉동된)에 대해 직접 행하는 것도 가능하다. 섹션 5.1에 기술된 것과 같은 핵산 시약들은 이러한 제자리 방법을 위한 프로브 및/또는 프라이머로 이용될 수 있다(예컨대, Nuovo, G.J., 1992 , "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY. 참조).In addition, such obR gene expression analysis is performed directly in situ, ie, on tissue sections (fixed and / or frozen) of the patient's tissue obtained by biopsy or excision so that there is no need to purify the nucleic acid. It is also possible. Nucleic acid reagents such as those described in section 5.1 can be used as probes and / or primers for such in situ methods (eg, Nuovo, GJ, 1992, “PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications”, Raven Press, NY. Reference).

다른 방법으로, 충분한 양의 적당한 세포들을 수득할 수 있다면, obR 유전자의 mRNA 발현의 수준을 측정하기 위해서 표준 노던 분석을 행할 수 있다.Alternatively, if a sufficient amount of suitable cells can be obtained, standard northern analysis can be performed to measure the level of mRNA expression of the obR gene.

2. obR 유전자 산물의 검출2. Detection of obR gene products

상기 섹션 5.3에서 상술한 야생형 또는 돌연변이 obR 유전자 산물 또는 이들의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들에 대한 항체들도 본원에 기술된 바와 같이 체중장애 진단 및 예후방법에 이용될 수 있다. 이러한 진단방법들은 obR 유전자 발현 수준상의 이상 또는 ObR의 구조 및/또는 ObR의 일시적인, 조직, 세포 또는 서브세포 위치 상의 이상을 검출하는데 이용될 수 있고, 생체내 또는 생검조직상에서와 같이 생체외에서 행해질 수 있다.Antibodies to the wild type or mutant obR gene product or conserved variants or peptide fragments thereof described above in section 5.3 may also be used in weight disorder diagnosis and prognosis as described herein. Such diagnostic methods can be used to detect abnormalities on obR gene expression levels or structures of ObR and / or transient, tissue, cell or subcell locations of ObR, and can be performed ex vivo, such as in vivo or on biopsy tissue. have.

예를 들어, obR ECD의 에피톱에 대한 항체들은 체내에서의 ObR의 발현의 패턴과 수준을 생체내 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체들은 예를 들어, 방사성-불투명 화합물 또는 기타의 적당한 화합물에 의해 표지된 후, 체내에서 발현된 ObR에 대한 결합을 X-레이, CAT-스캔 또는 MRI와 같은 방법을 이용하여 가시화하기 위해 대상에게 주입될 수 있다. 항원결합부위의 가장 작은 부분을 포함하는 Fab 또는 단일 쇄 항체와 같은 표지된 항체 단편들은 혈액-뇌 장벽 사이의 크로싱을 촉진하고 맥락막총 내에서 발현된 ObR의 표지를 가능하게 하기 때문에 바람직하다.For example, antibodies against epitopes of obR ECD can be used to detect in vivo the pattern and level of expression of ObR in the body. Such antibodies are labeled, for example, by radio-opaque compounds or other suitable compounds, and then subjected to subjects to visualize binding to ObR expressed in the body using methods such as X-rays, CAT-scans, or MRI. Can be injected. Labeled antibody fragments, such as Fab or single chain antibodies, including the smallest portion of the antigen binding site, are preferred because they facilitate cross-brain barrier and labeling of expressed ObR in the choroid plexus.

또한, 그 존재가 확인될 수 있는 임의의 ObR 융합단백질 또는 ObR 접합 단백질이 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사성-불투명 또는 다른 적당한 화합물들에 의해 표지된 ObR 융합 또는 접합 단백질들은 표지된 항체에 대해 위에서 상술한 바와 같이 생체내에 투여되고 가시화될 수 있다. 더욱이, AP-Ob 또는 Ob-Ap와 같은 Ob 융합단백질들이 생체외 진단방법에 이용될 수 있다.In addition, any ObR fusion protein or ObR conjugate protein can be administered in which the presence can be confirmed. For example, ObR fusion or conjugation proteins labeled with radio-opaque or other suitable compounds can be administered and visualized in vivo as described above for labeled antibodies. Moreover, Ob fusion proteins such as AP-Ob or Ob-Ap can be used in in vitro diagnostic methods.

대안으로, ObR의 발현패턴을 조사하기 위하여, 상술한 바와 같은 면역분석 또는 융합단백질 검출방법이 생검 및 생체외의 사검(autopsy) 시료에 대해 이용될 수 있다. 이러한 분석은 obR ECD로 한정되는 항체들의 이용으로 국한되는 것이 아니고, 임의의 ObR 도메인들, 예컨대, ECD, TM 및/또는 CD의 에피톱에 대한 항체들의 이용도 포함할 수 있다. 이들 표지된 항체들 각각 또는 전부의 이용은 ObR의 해독 및 세포표면으로의 세포내 이송에 대한 유용한 정보를 제공할 것이고, 처리(processing)상의 결함을 확인할 수 있게 할 것이다.Alternatively, to examine the expression pattern of ObR, immunoassay or fusion protein detection methods as described above can be used for biopsy and in vitro autopsy samples. This analysis is not limited to the use of antibodies limited to obR ECD, but may also include the use of antibodies against the epitope of any ObR domains, such as ECD, TM and / or CD. The use of each or all of these labeled antibodies will provide useful information about the translation of ObR and intracellular transport to the cell surface and will allow for identification of processing defects.

분석될 조직 또는 세포유형은 일반적으로 예를 들어 맥락막총 세포와 같이 obR 유전자를 발현한다고 알려져 있거나 그럴 것으로 생각되는 것들을 포함한다. 본원에 이용된 단백질 분리방법은 예를 들어, 할로우 및 레인 등에 의해 기술된 방법과 같은 것이다(Harlow, E. and Lane D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 본원에 전문 참고로 첨부). 분리된 세포들은 세포 컬처 또는 환자로부터 수득될 수 있다. 컬처로부터 수득한 세포의 분석은 세포-기초 유전자치료법 기술의 일부로 이용될 수 있는 세포의 평가, 또는 obR 유전자의 발현에 대한 화합물들의 효과를 시험하기 위한 세포들의 평가에 필요한 단계일 수 있다.The tissue or cell type to be analyzed generally includes those known or thought to express the obR gene, such as for example choroid plexus cells. Protein isolation methods used herein are the same as those described by, for example, Harlow, E. and Lane D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; hereby incorporated by reference in its entirety. Isolated cells can be obtained from a cell culture or from a patient. Analysis of cells obtained from the culture can be a necessary step in the evaluation of cells that can be used as part of cell-based gene therapy techniques, or in the evaluation of cells to test the effects of compounds on the expression of the obR gene.

예를 들어, 상기 섹션 5.3에서 상술한 바와 같은 본 발명에서 이용될 수 있는 항체, 또는 항체들의 단편들은 obR 유전자 산물들 또는 그들의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들의 존재를 정략적으로 또는 정성적으로 검출하는데 이용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 광현미경분석, 세퐁유동분석 또는 형광측정검출과 병행되는 형광 표지된 항체(본 섹션의 아래 부분 참고)를 이용한 면역형광분석 기술에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 obR 유전자 산물이 세포표면에서 발현되는 경우에 특히 바람직하다.For example, antibodies, or fragments of antibodies, that may be used in the present invention as described above in section 5.3, may be used to detect or qualitatively detect the presence of obR gene products or their conserved variants or peptide fragments. Can be. This can be done, for example, by immunofluorescence techniques using fluorescently labeled antibodies (see below in this section) in parallel with photomicroscopy, Sefong flow analysis or fluorometry detection. This technique is particularly desirable when the obR gene product is expressed on the cell surface.

본 발명에서 이용가능한 항체들(또는 그의 단편들) 또는 Ob 융합 또는 접합 단백질들은 obR 유전자 산물 또는 이들의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들의 제자리 검출 또는 Ob 결합(표지된 Ob 융합단백질의 경우)을 위해 면역형광측정법, 면역전자현미경 또는 비-면역측정법에서와 같이 조직학적으로 이용될 수도 있다.Antibodies (or fragments thereof) or Ob fusion or conjugation proteins available in the present invention are immune for in situ detection or ob binding (in the case of labeled Ob fusion proteins) of obR gene products or their conserved variants or peptide fragments. It may also be used histologically as in fluorometry, immunoelectron microscopy or non-immunoassays.

제자리 검출(in situ detection)은 환자로부터 조직 표본을 적출하여, 거기에 본 발명의 표지된 항체 또는 융합단백질을 적용함으로써 이루어질 수 있다. 항체(또는 단편) 또는 융합단백질은 바람직하게 생물 시료상의 표지된 항체(또는 단편) 위에 적층함으로써 적용된다. 이러한 방법을 이용함으로써, obR 유전자 산물 또는 이들의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들 또는 Ob 결합의 존재뿐만 아니라 그의 조사대상 조직내의 분포까지도 확인할 수 있다. 본 발명을 이용함으로써, 당업자들은 매우 다양한 조직학적 방법들(염색방법과 같은)이 이러한 제자리 검출을 달성하기 위해서 변형될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.In situ detection can be accomplished by extracting a tissue sample from a patient and applying the labeled antibody or fusion protein of the invention thereto. The antibody (or fragment) or fusion protein is preferably applied by laminating onto a labeled antibody (or fragment) on a biological sample. By using this method, the presence of obR gene products or their conserved variants or peptide fragments or Ob bonds as well as their distribution in the tissues of investigation can be identified. By using the present invention, those skilled in the art will appreciate that a wide variety of histological methods (such as staining methods) can be modified to achieve this in situ detection.

obR 유전자 산물 또는 그의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들에 대한 면역측정법 및 비-면역측정법은 전형적으로 obR 유전자 산물 또는 그의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편들을 동정할 수 있고 검출 가능하게 표지된 항체의 존재 하에서의 생물 유체(biological fluid)와 같은 시료, 조직 추출물, 새롭게 회수된 세포들, 또는 세포 컬처에서 배양된 세포들의 용해물을 인큐베이션하는 과정 및 당업계에 잘 알려져 있는 여러 가지 방법 중에서 임의의 방법에 의한 결합 항체의 검출과정을 포함할 것이다.Immunoassays and non-immunoassays on obR gene products or conserved variants or peptide fragments thereof are typically organisms in the presence of an antibody that can identify and detectably label obR gene products or conserved variants or peptide fragments thereof. Binding antibodies by any of a variety of methods well known in the art and the process of incubating lysates of samples such as biological fluids, tissue extracts, freshly recovered cells, or cells cultured in a cell culture It will include the detection of.

생물시료는 고체상 서포트 또는 니트로셀룰로오스와 같은 캐리어, 또는 세포들, 세포 입자들, 가용성 단백질들을 고정할 수 있는 다른 고체상 서포트와 접촉되거나 거기에 고정될 수 있다. 상기 서포트는 이어서 적당한 완충액으로 세정되고나서, 검출 가능하게 표지된 ObR 항체 또는 Ob 융합단백질로 처리될 수 있다. 그 다음으로 고체상 서포트는 결합되지 않은 항체 또는 융합단백질들을 제거하기 위해 두 번째로 완충액에 의해 세정될 수 있다. 이어서 고체상 서포트에 대한 결합된 표지의 양은 종래의 방법으로 측정될 수 있다.The biosample may be contacted or immobilized with a solid phase support or a carrier such as nitrocellulose or another solid phase support capable of immobilizing cells, cell particles, soluble proteins. The support may then be washed with a suitable buffer and then treated with a detectably labeled ObR antibody or Ob fusion protein. The solid phase support can then be washed second by buffer to remove unbound antibody or fusion proteins. The amount of bound label for the solid phase support can then be measured by conventional methods.

"고체상 서포트 또는 캐리어"는 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있는 모든 서포트를 의미한다. 잘 알려진 서포트 또는 캐리어는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나이론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 반려암, 및 자철광을 포함한다. 본 발명의 목적상 캐리어의 특성은 어느 정도 가용성이거나 불용성이다. 서포트 재료는 궁극적으로 커플링된 분자들이 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있는 한 어떠한 가능한 구조 형태라도 가질 수 있다. 따라서, 서포트 형태는 비드와 같은 구형, 또는 시험관의 내표면 또는 로드의 외표면과 같은 원통형일 수 있다. 그렇지 않으면, 표면은 시이트, 테스트 스트립 등과 같이 평평할 수 있다. 바람직한 서포트는 폴리스티렙 비드를 포함한다. 당업자들은 항체 또는 항원의 결합을 위한 많은 다른 적당한 캐리어들을 알 것이고, 일상적인 실험을 통해서 위와 같은 사실을 확인할 수 있을 것이다."Solid support or carrier" means any support capable of binding an antigen or antibody. Well known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural and modified celluloses, polyacrylamides, gabbros, and magnetite. For the purposes of the present invention, the properties of the carrier are to some extent soluble or insoluble. The support material may ultimately have any possible structural form as long as the coupled molecules can bind the antigen or antibody. Thus, the support form may be spherical, such as beads, or cylindrical, such as the inner surface of a test tube or the outer surface of a rod. Otherwise, the surface may be flat, such as a sheet, test strips, or the like. Preferred supports include polystyrene beads. Those skilled in the art will know many other suitable carriers for the binding of antibodies or antigens and will be able to ascertain the above by routine experimentation.

일정한 양의 ObR 항체 또는 Ob 융합단백질의 결합활성은 주지의 방법에 따라 특정될 수 있다. 당업자들은 일상적인 실험을 통해서 각각의 측정에 필요한 최적의 조건을 결정할 수 있을 것이다.The binding activity of a certain amount of ObR antibody or Ob fusion protein can be specified according to well-known methods. Those skilled in the art will be able to determine the optimal conditions for each measurement through routine experimentation.

항체와 관련하여, ObR 항체를 검출 가능하도록 표지하는 방법들중 하나는 항체를 효소에 연결하여 효소면역측정법(EIA)(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD) ; Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520 ; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523 ; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, ; Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo)을 이용하는 것이다. 항체에 결합할 효소는 예를 들어 분광광도계, 형광측정계에 의해 또는 시각적인 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분들을 만들어내는 방식으로 적당한 기질, 바람직하게 발색성 기질(chromogenic substrate)과 반응할 것이다. 항체를 검출 가능하게 표지하는데 이용될 수 있는 효소들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다 말레이트 디하이드로게나제, 스태필로코칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 이스트 알콜 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트, 디하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소메라제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 아스파라지나제, 글루코오스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제, 및 아세틸크로린에스테라제를 포함한다. 검출은 효소로 발색성 기질을 이용하는 비색 방법(colorimetric method)에 의해 이루어질 수 있다. 검출은 또한 유사하게 준비된 표준에 대해 기질의 효소반응의 정도를 비교함으로써 시각적으로 행할 수도 있다.With respect to antibodies, one of the methods of labeling ObR antibodies detectably is by linking the antibody to an enzyme (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31: 507-520; Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73: 482-523; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL,; Ishikawa, E. et al., (Eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo). The enzyme to bind the antibody will react with a suitable substrate, preferably a chromogenic substrate, in such a way as to produce chemical moieties that can be detected by, for example, spectrophotometer, fluorometer or by visual means. Enzymes that can be used to detectably detect antibodies include, but are not limited to, malate dehydrogenase, staphylocoal nuclease, delta-5-steroid isomerase, east alcohol dehydrogenase, Alpha-glycerophosphate, dehydrogenase, trios phosphate isomerase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonucleases, urease Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and acetylchlorine esterase. Detection can be by colorimetric methods using chromogenic substrates as enzymes. Detection can also be done visually by comparing the degree of enzymatic reaction of the substrate against similarly prepared standards.

검출은 다른 여러 가지 면역측정법 중에 어느 하나를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편들을 방사성동위원소를 이용하여 표지함으로써, 방사선면역측정법(RIA)의 이용을 통해 ObR을 검출하는 것이 가능해진다(예컨대, 본원에 참고자료로 전문이 첨부된 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 방사성 동위원소는 감마카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자동방사능사진을 이용하는 것과 같은 방법을 이용하여 검출될 수 있다.Detection can be performed using any one of a variety of other immunoassays. For example, by labeling antibodies or antibody fragments with radioisotopes, it becomes possible to detect ObR through the use of radioimmunoassay (RIA) (eg, Weintraub, B, which is incorporated by reference in its entirety herein). , Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Radioisotopes can be detected using methods such as using gamma counters or scintillation counters or autoradiographs.

항체를 형광 화합물로 표지하는 것도 가능하다. 형광 표지된 항체가 적당한 파장의 빛에 노출되는 경우에, 그의 존재는 형광에 의해 검출될 수 있다. 가장 흔하게 이용되는 형광 표지 화합물로는 플루오레스신 이소시아네이트, 로다민, 피로에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스아민이 있다.It is also possible to label antibodies with fluorescent compounds. If a fluorescently labeled antibody is exposed to light of a suitable wavelength, its presence can be detected by fluorescence. The most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescin isocyanate, rhodamine, pylorierythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde and fluoresamine.

항체는¹⁵²Eu 또는 다른 란탄 계열과 같은 형광방사금속을 이용하여 검출 가능하게 표지할 수도 있다. 이들 금속들은 디에틸렌트리아민펜트아세틱 애시드(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세틱 애시드(EDTA)와 같은 금속 킬레이트기를 이용하여 항체에 붙일 수 있다.Antibodies can also be detectably labeled using fluorescent radioactive metals such as ¹⁵² Eu or other lanthanides. These metals can be attached to the antibody using metal chelate groups such as diethylenetriaminepentacetic acid (DTPA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).

항체들은 그것을 화학발광 화합물과 결합시킴으로써 검출 가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-택이 부착된 항체는 이어서 화학반응 도중에 발생되는 발광의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예들은 루미놀, 이소루미놀, 써모매틱 아크리디움 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.Antibodies can be detectably labeled by binding it to a chemiluminescent compound. Chemiluminescent-tack attached antibodies can then be measured by detecting the presence of luminescence that occurs during the chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, thermomatic acridium esters, imidazoles, acridinium salts and oxalate esters.

마찬가지로, 생물발광 화합물도 본 발명의 항체를 표지하는데 이용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광반응의 효율을 증가시키는 생물시스템내에서 발견되는 화학발광의 일종이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 표지의 목적상 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제, 및 아코오린이다.Likewise, bioluminescent compounds can be used to label the antibodies of the invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems where catalytic proteins increase the efficiency of chemiluminescence reactions. The presence of the bioluminescent protein is measured by detecting the presence of luminescence. Important bioluminescent compounds for the purposes of the label are luciferin, luciferase, and acoorin.

E. ObR 발현 또는 활성을 조절하는 화합물에 대한 스크리닝 분석Screening assays for compounds that modulate E. ObR expression or activity

이하의 분석법은 ObR(ObR의 ECD 또는 CD를 포함하지만 이들로 국한되는 것은 아님)과 상호작용(예컨대, 결합하는) 화합물, ObR(ObR의 ECD 또는 CD를 포함하지만 이들로 국한되는 것은 아님)과 상호작용하는 세포내 단백질과 상호작용(예컨대, 결합하는) 화합물들, ObR과 ObR-매개 신호변환에 관여하는 막간 또는 세포내 단백질들 사이의 상호작용을 억제하는 화합물들, 및 obR 유전자의 활성을 조절하거나 ObR의 농도를 조절하는 화합물들을 동정하기 위해 설계되었다. obR 유전자 조절서열(예컨대, 프로모터 서열)에 결합하는 화합물 및 obR 유전자 발현을 조절할 수 있는 화합물들을 동정하는 분석방법도 이용될 수 있다. 예컨대, 본원에 전문이 참고자료로 첨부된 Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562 참조.The following assays include compounds that interact with (eg, bind to) ObR (including but not limited to an ECD or CD of ObR), ObR (including but not limited to an ECD or CD of ObR) and Compounds that interact with (eg, bind to) intracellular proteins that interact, compounds that inhibit the interaction between intercellular or intracellular proteins involved in ObR and ObR-mediated signal transduction, and obR gene activity. It was designed to identify compounds that regulate or control the concentration of ObR. Assays can also be used to identify compounds that bind to obR gene regulatory sequences (eg, promoter sequences) and compounds that can control obR gene expression. See, eg, Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. See 269: 28558-28562.

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물들은 펩타이드, 항체들 및 그의 단편들, 및 ObR의 ECD에 결합하거나 천연 리간드에 의해 개시된 활성을 그대로 나타내거나(즉, 작동물질) 천연 리간드에 의해 개시된 활성을 억제(즉, 길항물질)하는 다른 유기 화합물들(예컨대, 단백질유사물질); 그의 펩타이드, 항체 단편들, ObR(또는 그의 일부분)의 ECD와 동일하게 기능하거나 천연 리간드에 결합해서 그것을 "중화"시키는 다른 유기화합물들을 포함하지만, 반드시 이들로 한정되는 것은 아니다.Compounds that can be screened in accordance with the present invention bind to peptides, antibodies and fragments thereof, and to the ECD of ObR or exhibit activity initiated by natural ligands (ie agonists) or inhibit activity initiated by natural ligands. Other organic compounds (eg, antagonists) (eg, protein analogs); Peptides, antibody fragments thereof, and other organic compounds that function identically to the ECD of the ObR (or a portion thereof) or bind to and neutralize it by a natural ligand.

이러한 화합물들은 무작위 펩타이드 도서관(random peptide libraries) (Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354:84-86 참조)의 구성원들; 및 D- 및/또는 L- 형태 아미노산, 포스포펩타이드(무작위 또는 부분 퇴화, 포스포펩타이드 도서관의 구성원들을 포함하지만 반드시 이들로 제한되는 것은 아닌; Songyang, Z. et al,. 1993, Cell 72:767-778 참조), 항체(다클론, 단클론, 인체에서 유래된 것과 같은 성질로 만들어진, 항-이디오타입, 키메라 또는 단일 쇄 항체 및 Fab, F(ab')2 및 FAb 발현 도서관 단편들 및 그의 에피톱-결합 단편들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌) 및 작은 유기 또는 무기 분자들로 만들어진 조합 화학-유래 분자 도서관(combinatorial chemistry-derived library)의 구성원들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 가용성 펩타이드와 같은 펩타이드들을 포함한다.Such compounds are members of random peptide libraries (Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84; see Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86); And D- and / or L-form amino acids, phosphopeptides (including but not limited to members of random or partial degeneration, phosphopeptide libraries; Songyang, Z. et al, 1993, Cell 72: 767-778), an antibody (polyclonal, monoclonal, anti-idiotype, chimeric or single chain antibody and Fab, F (ab ') 2 and FAb expression library fragments made with properties such as those derived from the human body, and And members of the combinatorial chemistry-derived library, including but not limited to epitope-binding fragments thereof, and small organic or inorganic molecules. Peptides such as non-soluble peptides.

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 다른 분자들은 혈액-뇌 장벽을 횡단하고, 적당한 세포(예컨대, 맥락막총 또는 시상하부에 있는)내로의 입구를 확보하고 obR 유전자 또는 ObR 신호변환 경로에 관여하는 다른 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는(예컨대, 유전자 발현에 관련되는 조절부위 또는 전사요소들과의 상호작용에 의해) 작은 유기분자들; gp-130과 같은 ObR의 활성 또는 ObR 신호변환 경로에 관여하는 다른 세포내 요소들의 활성에 영향을 미치는(예컨대, CD의 효소활성을 억제하거나 활성화함으로써) 화합물들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.Other molecules that can be screened in accordance with the present invention cross the blood-brain barrier, secure entry into appropriate cells (eg, the choroid plexus or hypothalamus) and are involved in the obR gene or the ObR signaling pathway. Small organic molecules that may affect the expression of (eg, by interaction with regulatory regions or transcriptional elements involved in gene expression); Including but not limited to compounds that affect the activity of ObR, such as gp-130, or other cellular elements involved in the ObR signal transduction pathway (eg, by inhibiting or activating the enzymatic activity of CD). .

컴퓨터 모델링 및 검색 기술은 ObR 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물들의 동정 또는 이미 확인된 화합물들의 개량을 가능하게 한다. 이러한 화합물 또는 조성물이 이미 확인되었기 때문에, 활성 부위 또는 지역도 확인된다. 이러한 활성 부위들은 ObR 자체와의 Ob의 상호작용 도메인과 같은 리간드 결합부위일 수 있다. 활성부위는 펩타이드로부터의 아미노산 서열로부터, 핵산으로부터의 뉴클레오티드 서열로부터, 또는 관련 화합물 또는 조성물의 천연 리간드와의 복합체의 연구로부터 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 후자의 경우에, 화학적 또는 X-선 결정학 방법이 요소의 어느 부분에서 복합된 리간드가 발견되는지를 알아봄으로써 활성 부위를 찾는데 이용될 수 있다.Computer modeling and retrieval techniques allow for the identification of compounds capable of modulating ObR expression or activity or for the improvement of already identified compounds. Since such compounds or compositions have already been identified, active sites or regions are also identified. These active sites can be ligand binding sites, such as the interacting domain of Ob with the ObR itself. Active sites can be identified using methods known in the art from amino acid sequences from peptides, nucleotide sequences from nucleic acids, or from studies of complexes with natural ligands of related compounds or compositions. In the latter case, chemical or X-ray crystallographic methods can be used to find the active site by knowing where in the element the conjugated ligand is found.

다음으로, 활성부위의 3차원 기하학적 구조가 측정된다. 이것은 완전한 분자 구조를 측정할 수 있는, X-선 결정학 방법을 포함하는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 한편, 고체상 또는 액체상 NMR은 특정한 분자내 거리를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 구조 측정을 위한 임의의 다른 실험 방법이 부분적인 또는 완전한 기하학적 구조를 얻기 위해 이용될 수 있다. 기하학적 구조는 측정된 활성부위 구조의 정확성을 제고하기 위해 천연 또는 인조의, 복합된 리간드에 의해 측정할 수 있다.Next, the three-dimensional geometry of the active site is measured. This can be done by known methods, including X-ray crystallography, which can measure the complete molecular structure. Solid or liquid NMR, on the other hand, can be used to measure specific intramolecular distances. Any other experimental method for structural measurement can be used to obtain partial or complete geometry. Geometry can be measured by complex ligands, either natural or artificial, to enhance the accuracy of the measured active site structure.

불완전하거나 충분히 정확하지 못한 구조가 측정된다면, 완전한 구조를 얻거나 그의 정확성을 높이기 위해 컴퓨터에 기초한 수치 모델링 방법을 이용할 수 있다. 단백질 또는 핵산과 같은 특정한 생물고분자에 대해 특이적인 변수화된 모델(parameterized model), 계산된 분자 운동(computing molecular motion)에 기초한 분자 동력학 모델(molecular dynamics models), 열 앙상블에 기초한 통계적 역학 모델 또는 복합된 모델들을 포함하는 임의의 알려진 모델링 방법이 이용될 수 있다. 대부분의 유형의 모델의 경우에, 구성 원자들 및 기들 사이의 힘을 나타내는 표준 분자력장(standard molecular force fields)이 필요하고, 물리화학분야에서 알려진 역장으로부터 선택될 수 있다. 불완전하거나 또는 덜 정확한 실험적 구조들은 이들 모델링 방법에 의해 계산된 완전하고 더욱 정확한 구조들에 대해 제한으로 작용할 수 있다.If an incomplete or inaccurate structure is measured, computer-based numerical modeling methods can be used to obtain a complete structure or increase its accuracy. Parameterized models specific to specific biopolymers such as proteins or nucleic acids, molecular dynamics models based on computed molecular motion, statistical dynamics models based on thermal ensembles, or complex Any known modeling method including models can be used. For most types of models, standard molecular force fields representing the forces between constituent atoms and groups are needed and can be selected from force fields known in the physical chemistry art. Incomplete or less accurate experimental structures may act as a limitation to the complete and more accurate structures calculated by these modeling methods.

최종적으로, 실험적으로 또는 모델링에 의해 또는 양자를 병행하여 활성부위의 구조를 결정하고 나서, 후보 조절 물질들은 그들의 분자 구조에 대한 정보와 함께 화합물들을 포함하는 데이터베이스를 검색함으로써 확인될 수 있다. 이러한 검색은 측정된 활성부위 구조와 매치 되어 활성부위를 한정하는 기들과 상호작용하는 구조를 갖는 화합물을 찾는다. 이러한 검색은 수작업으로 행할 수도 있지만, 컴퓨터의 도움을 받아 행하는 것이 바람직하다. 이러한 검색에 의해 발견된 화합물들은 잠재적인 ObR 조절 화합물들이다.Finally, after determining the structure of the active site experimentally or by modeling or both, candidate regulatory substances can be identified by searching a database containing compounds with information about their molecular structure. This search finds compounds with structures that match the measured active site structure and interact with the groups defining the active site. Although such a search can be done by hand, it is preferable to carry out with the help of a computer. The compounds found by this search are potential ObR modulating compounds.

대안으로, 이들 방법들은 이미 알려진 화합물 또는 리간드들로부터 개량된 조절 화합물들을 확인하는데 이용될 수도 있다. 공지 화합물의 조성물은 변화될 수 있고, 그러한 변형의 구조적인 효과는 신규한 조성물에 적용했던 상술한 실험적 방법 및 컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 이어서 개량된 적합성 또는 상호작용이 결과되는지를 알아보기 위해, 변화된 구조들을 화합물의 활성부위 구조와 비교한다. 이러한 방식으로 측쇄의 변화에 의한 것과 같은 조성물내의 체계적인 변화는 향상된 특이성 또는 정확성을 갖는 변형된 조절 화합물 또는 리간드를 얻기 위해 신속하게 평가될 수 있다.Alternatively, these methods may be used to identify modified regulatory compounds from known compounds or ligands. The composition of known compounds can be varied and the structural effects of such modifications can be assessed using the experimental and computer modeling methods described above that have been applied to the novel compositions. The altered structures are then compared to the active site structure of the compound to see if an improved suitability or interaction is the result. In this way, systematic changes in the composition, such as by side chain changes, can be quickly assessed to obtain modified regulatory compounds or ligands with improved specificity or accuracy.

Ob, ObR, 및 관련된 전사 및 해독요소들의 활성부위의 확인에 기초하는 조절 화합물의 동정에 유용한 추가의 실험적 및 컴퓨터 모델링 방법들은 당업자들에게 자명할 것이다.Additional experimental and computer modeling methods useful for the identification of regulatory compounds based on the identification of active sites of Ob, ObR, and related transcriptional and translational elements will be apparent to those skilled in the art.

분자 모델링 시스템의 일례는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램(Polygen Corporation, Waltham, MA)이다. CHARMm은 에너지 최소화(energy minimization) 및 분자 동력학 기능(molecular dynamics functions)을 수행하고, QUANTA는 분자 구조의 구성, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA는 분자들 상호간의 거동의 상호작용적 구성, 변형, 가시화 및 분석을 가능하게 한다.Examples of molecular modeling systems are the CHARMm and QUANTA programs (Polygen Corporation, Waltham, Mass.). CHARMm performs energy minimization and molecular dynamics functions, while QUANTA performs the construction, graphical modeling and analysis of molecular structures. QUANTA enables the interactive construction, modification, visualization and analysis of the behavior between molecules.

다수의 논문들은 특수한 단백질과 상호작용하는 약물들의 모델링을 고찰하고 있다: 예를 들어, Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97 : 159-166 ; Ripka. New Scientist 54-57 (June 16, 1988) ; McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122 ; Perry and Davies, OSAR : Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989) ; Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 and 141-162 ; and, with respect to a model receptor for nucleic acid components, Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090. 화학약품을 스크리닝하고 그래픽으로 도시할 수 있는 다른 프로그램들은 BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), 및 Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario)와 같은 회사들로부터 입수할 수 있다. 이들이 일차적으로 특정한 단백질에 대해 특이적인 약물들에 적용하기 위하여 설계되었다고 해도, 이들은 일단 그 부위가 확인된다면, DNA 또는 RNA의 부위들에 대해 특이적인 약물의 설계에 적합하게 개량될 수 있다.A number of articles consider modeling drugs that interact with specific proteins: see, for example, Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166; Ripka. New Scientist 54-57 (June 16, 1988); McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111-122; Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 and 141-162; and, with respect to a model receptor for nucleic acid components, Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082-1090. Other programs that can screen and graphically display chemicals are available from BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), and Hypercube, Inc. Available from companies such as Cambridge, Ontario. Although they are primarily designed for application to drugs specific for a particular protein, they can be modified to suit the design of a drug specific for sites of DNA or RNA once the site is identified.

이상에서 결합을 변화시킬 수 있는 화합물의 설계와 생산에 관해 기술하였지만, 사람들은 천연 제품 또는 합성 화학약품, 및 단백질을 포함하는 생물학적으로 활성을 갖는 물질들을 포함하는 공지 화합물의 도서관들을 억제제이거나 또는 활성화제인 화합물들에 대해 스크리닝할 수도 있다.While the above has described the design and production of compounds that can change binding, people are inhibitors or activators of libraries of known compounds, including natural products or synthetic chemicals, and biologically active materials including proteins. It may also be screened for zein compounds.

본원에 기술된 것과 같은 분석방법을 통해 동정된 화합물들은 예를 들어, obR 유전자의 생물학적 기능을 조절하여 체중장애를 개선하는데 이용될 수 있다. 예컨대, 섹션 5.5.1 내지 5.5.3에 기술된 것과 같은 기술에 의해 동정된 화합물들의 유효성에 대한 시험은 이하의 섹션 5.5.4에서 논의한다.Compounds identified through assays such as those described herein can be used to ameliorate weight disorders, for example, by regulating the biological function of the obR gene. For example, tests for the effectiveness of compounds identified by techniques such as those described in sections 5.5.1 to 5.5.3 are discussed in section 5.5.4 below.

1. ObR에 결합하는 화합물들에 대한 생체외 스크리닝1. In vitro screening for compounds that bind to ObR

ObR(반드시 이들로 국한되는 것은 아니나 ObR의 ECD 또는 CD 포함)과 상호작용(예컨대, 결합)할 수 있는 화합물들을 동정하기 위해 생체외 시스템이 설계될 수 있다. 동정된 화합물들은 예컨대, 야생형 및/또는 돌연변이 obR 유전자 산물의 활성을 조절하는데 이용될 수 있고; ObR의 생물학적 기능을 조절하는데 이용될 수 있으며; 정상적인 ObR 상호작용을 파괴하는 화합물들을 확인하기 위한 스크리닝에 이용될 수 있고; 또는 그 자체가 이러한 상호작용을 파괴할 수도 있다.In vitro systems can be designed to identify compounds that can interact with (eg, bind to) ObR (including but not limited to the ECD or CD of ObR). Identified compounds can be used, for example, to modulate the activity of wild type and / or mutant obR gene products; Can be used to modulate the biological function of ObR; Can be used for screening to identify compounds that disrupt normal ObR interactions; Or itself may destroy this interaction.

ObR에 결합하는 화합물들을 동정하는데 이용된 분석방법의 기본원리는 ObR과 시험 화합물이 상호작용하고 결합하여, 반응 혼합물 내에서 제거 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 및 시간동안 ObR과 시험 화합물의 반응혼합물을 준비하는 과정을 포함한다. 이용된 ObR 종들은 스크리닝 분석의 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 천연 리간드의 작동물질을 찾고자 하는 경우에는, 전체 길이의 ObR 또는 가용성인 절두된 형태의 ObR(예컨대, 분자로부터 ECD 또는 CD가 결실된), ECD에 해당하는 펩타이드, 또는 분석 시스템에 이점을 제공해 줄 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드에 융합된 ObR ECD를 포함하는 융합단백질이 이용될 수 있다. 세포질 도메인과 상호작용할 수 있는 화합물을 찾고자 하는 경우에는, ObR CD 에 해당하는 펩타이드 또는 ObR CD를 포함하는 융합단백질이 이용될 수 있다.The basic principle of the assay used to identify compounds that bind to ObR is for a time and under conditions sufficient to allow the ObR and the test compound to interact and bind to form a complex that can be removed and / or detected in the reaction mixture. This includes preparing a reaction mixture of ObR and the test compound. ObR species used may vary depending on the purpose of the screening assay. For example, if you are looking for an agonist of a natural ligand, you can use a full length ObR or a soluble truncated form of ObR (eg, ECD or CD deleted from a molecule), a peptide corresponding to an ECD, or an assay system. Fusion proteins comprising ObR ECD fused to proteins or polypeptides that can provide advantages can be used. In order to find a compound that can interact with the cytoplasmic domain, a peptide corresponding to ObR CD or a fusion protein including ObR CD may be used.

스크리닝 분석은 여러 가지 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 하나의 분석 방법은 ObR 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합단백질 또는 시험 물질을 고체상에 부착하고, 반응의 말기에 고체상에 부착된 ObR/시험 화합물 복합체를 검출하는 과정을 포함한다. 이러한 방법의 하나의 구현예에서, ObR 반응물은 고체 표면에 부착되고, 부착되지 않은 시험 화합물은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다.Screening analysis can be performed in various ways. For example, one assay method involves attaching an ObR protein, polypeptide, peptide or fusion protein or test substance to a solid phase and detecting the ObR / test compound complex attached to the solid phase at the end of the reaction. In one embodiment of this method, the ObR reactant is attached to the solid surface and the unattached test compound can be labeled directly or indirectly.

실무상, 마이크로타이터 플레이트가 고체상으로 편리하게 이용될 수 있다. 부착된 성분들은 비공유결합 또는 공유결합에 의해 고정될 수 있다. 비-공유 부착은 고체 표면을 단순히 단백질 용액으로 코팅한 후 건조시켜 달성할 수 있다. 그렇지 않으면, 고정될 단백질에 대해 특이적인 고정된 항체, 바람직하게 단클론 항체를 이용하여 단백질을 고체 표면에 부착할 수도 있다. 표면들은 사전에 준비하여 보관할 수 있다.In practice, microtiter plates may be conveniently used in the solid phase. The attached components can be fixed by non-covalent or covalent bonds. Non-covalent attachment can be achieved by simply coating the solid surface with a protein solution and then drying. Alternatively, the protein may be attached to a solid surface using an immobilized antibody, preferably monoclonal antibody, specific for the protein to be immobilized. Surfaces can be prepared and stored in advance.

상기 분석을 행하기 위해, 고정되지 않은 성분은 부착된 성분을 포함하는 코팅된 표면에 첨가된다. 반응이 끝난 후, 미반응 성분들은 형성된 복합체들은 고체 표면에 고정된 채로 남아있게 하는 조건하에서 제거(예컨대, 세정에 의해)된다. 고체 표면상의 부착된 복합체의 검출은 다수의 방법으로 이루어질 수 있다. 고정되지 않은 성분이 사전에 표지된 경우에는, 표면상에 고정된 표지의 검출은 복합체의 형성을 가리킨다. 고정되지 않은 성분이 사전에 표지되지 않은 경우에는, 예컨대, 사전에 고정되지 않은 성분(이어서 표지된 항-Ig 항체에 의해 직접적으로 표지되거나 또는 간접적으로 표지될 수 있는 항체)에 대해 특이적인 표지된 항체를 이용하는 것과 같은 일례의 간접적인 표지가 표면상에 부착된 복합체를 검출하는데 이용될 수 있다.To perform the assay, an unfixed component is added to the coated surface that includes the attached component. After the reaction is finished, the unreacted components are removed (eg, by washing) under conditions such that the complexes formed remain fixed on the solid surface. Detection of attached complexes on solid surfaces can be accomplished in a number of ways. If an unimmobilized component is previously labeled, detection of the immobilized label on the surface indicates the formation of the complex. If an unimmobilized component is not previously labeled, for example, labeled specifically for an unimmobilized component (an antibody that can then be labeled directly or indirectly by a labeled anti-Ig antibody) Exemplary indirect labels, such as those using antibodies, can be used to detect complexes attached on the surface.

대안으로, 반응은 액체상에서 수행될 수 있는데, 반응생성물들은 미반응 성분들과 분리되고, 복합체들은 검출된다; 예컨대, 용액 중에 생성된 임의의 복합체들을 부착하기 위한, ObR 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합단백질 또는 시험 물질에 대해 특이적인 고정된 항체 및 부착된 복합체를 검출하기 위한, 가능한 복합체의 다른 성분에 대해 특이적인 표지된 항체를 이용하는 방법.Alternatively, the reaction can be carried out in the liquid phase, where the reaction products are separated from the unreacted components and the complexes are detected; For example, immobilized antibodies specific for ObR proteins, polypeptides, peptides or fusion proteins or test substances for attaching any complexes generated in solution and for other components of the possible complexes for detecting attached complexes. Methods of Using Specific Labeled Antibodies.

다른 방법으로, 세포-기초 분석이 ObR과 상호작용하는 화합물을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, ObR을 발현하는 세포주, 또는 ObR을 발현하도록 유전자조작(예컨대, ObR DNA의 형질도입 또는 형질전환에 의해)된 세포주(예컨대, COS 세포, CHO 세포, 섬유아세포 등)들이 이용될 수 있다. 시험 화합물과 숙주세포에 의해 발현된 obR의 ECD의 상호작용은 천연 Ob와의 비교 또는 경쟁을 통해서 확인될 수 있다.Alternatively, cell-based assays can be used to identify compounds that interact with ObR. For this purpose, cell lines expressing ObR, or cell lines genetically engineered to express ObR (eg, by transduction or transformation of ObR DNA) (eg, COS cells, CHO cells, fibroblasts, etc.) may be used. Can be. The interaction of the test compound with the ECD of the obR expressed by the host cell can be confirmed by comparison or competition with native Ob.

2. ObR과 상호작용하는 세포내 단백질의 분석2. Analysis of Intracellular Proteins Interacting with ObR

단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 적합한 임의의 방법은 ObR과 상호작용하는 막간 단백질 또는 세포내 단백질을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 이용 가능한 종래의 방법들 중에는, 동시-면역침강법(co-immunoprecipitation), 교차결합(crosslinking) 및 용해물내에서 ObR과 상호작용하는 단백질을 동정하기 위한 세포용해물 또는 세포용해물로부터 수득된 단백질 및 ObR의 경사 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제(co-purification)가 있다. 이러한 분석을 위해, 이용된 ObR 성분은 전길이 ObR, 막-부착 부위[membrane-anchoring region](예컨대, TM이 결실되어 CD에 융합된 ECD를 포함하는 절두된 분자가 되는 절두된 ObR)이 결여된 가용성 유도체, CD에 해당하는 펩타이드 또는 ObR의 CD를 포함하는 융합단백질일 수 있다. 일단 분리되면, 이러한 세포내 단백질은 동정될 수 있고 이어서 표준기술에 따라 그것과 반응하는 단백질들을 동정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, ObR과 상호작용하는 세포내 단백질의 아미노산 서열의 적어도 일부분이 에드만 분해 기술(Edman degradation technique)과 같은 당업자들에게 잘 알려져 있는 기술을 이용함으로써 확인될 수 있다 (예컨대, Creighto, 1983, "Proteins : Structures and Molecualr Principles", W.H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34-49 참조). 수득된 아미노산 서열은 이러한 세포내 단백질을 코드화하는 유전자 서열에 대한 스크리닝에 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼합물의 생성을 위한 가이드로 이용될 수 있다. 스크리닝은 예를 들어, 표준 혼성화 또는 PCR 기술에 의해 행해질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 혼합물의 생성 및 스크리닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. (예컨대, Ausubel, 상술한 것과 동일한 문헌, 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., eds. Academic Press, Inc. NY 참조).Any method suitable for detecting protein-protein interactions can be used to identify transmembrane proteins or intracellular proteins that interact with ObR. Among the conventional methods available are proteins obtained from cytolysates or cytolysates to identify proteins that interact with ObR in co-immunoprecipitation, crosslinking and lysates. And co-purification via a gradient or chromatographic column of ObR. For this analysis, the ObR component used lacks the full length ObR, the membrane-anchoring region (e.g., a truncated ObR in which the TM is deleted and becomes a truncated molecule comprising an ECD fused to CD). Soluble derivative, peptide corresponding to CD or fusion protein comprising CD of ObR. Once isolated, these intracellular proteins can be identified and then used to identify proteins that react with it according to standard techniques. For example, at least a portion of the amino acid sequence of an intracellular protein that interacts with ObR can be identified by using techniques well known to those skilled in the art, such as the Edman degradation technique (eg, Creighto, 1983). , "Proteins: Structures and Molecualr Principles", WH Freeman & Co., NY, pp. 34-49). The obtained amino acid sequence can be used as a guide for the generation of oligonucleotide mixtures that can be used for screening for gene sequences encoding such intracellular proteins. Screening can be done, for example, by standard hybridization or PCR techniques. Generation and screening techniques for oligonucleotide mixtures are well known in the art. (See, eg, Ausubel, the same literature as described above, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., Eds. Academic Press, Inc. NY).

또한, ObR과 상호작용하는 막간 또는 세포내 단백질을 코드화하는 유전자들의 동시적인 동정을 결과시키는 다수의 방법들이 이용될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, 표지된 ObR 단백질, 또는 ObR 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합단백질, 예컨대, 마커(예컨대, 효소, 형광물질, 발광 단백질, 또는 염료)에 융합된 ObR 폴리펩타이드 또는 ObR 도메인, 또는 Ig-Fc 도메인을 이용하는, 잘 알려진 λgt11 도서관의 항체 프로빙 기술과 유사한 방법으로의 발현 도서관의 프로빙을 포함한다.In addition, a number of methods may be used that result in the simultaneous identification of genes encoding transmembrane or intracellular proteins that interact with ObR. Such methods include, for example, an ObR polypeptide or ObR domain fused to a labeled ObR protein, or ObR polypeptide, peptide or fusion protein, such as a marker (eg, an enzyme, fluorescent substance, luminescent protein, or dye), or Probing of expression libraries in a manner similar to the well-known λgt11 library's antibody probing techniques using the Ig-Fc domain.

이하에서 생체내에서 단백질 상호작용을 검출하는 하나의 방법 2-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 예시의 목적으로 상세히 기술하겠지만, 이것은 제한적 의미로 해석되어서는 안된다. 이러한 시스템의 하나의 버젼을 설명할 것이고(Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88-9578-9582), 이들은 Clontech (Palo Alto, CA))로부터 구매할 수 있다.One method for detecting protein interactions in vivo will now be described in detail for purposes of illustration, but this should not be construed in a limiting sense. One version of such a system will be described (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88-9578-9582), which can be purchased from Clontech (Palo Alto, Calif.).

간단히 설명하면, 이러한 시스템을 이용함으로써, 두 개의 하이브리드 단백질들을 코드화하는 플라스미드들이 구성될 수 있다: 하나의 플라스미드는 ObR, ObR 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합단백질을 코드화하는 obR 뉴클레오티드 서열에 융합된 전사 활성화 단백질(transcription activator protein)의 DNA-결합 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드로 구성되고, 다른 하나의 플라스미드는 cDNA 도서관의 일부로서 이 플라스미드내에 재조합된 미지의 단백질을 코드화하는 cDNA에 융합된 전사 활성화 단백질의 활성화 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드로 구성된다. DNA-결합 도메인 융합 플라스미드 및 cDNA 도서관은 그의 조절부위들이 전사 활성화 결합부위를 포함하는 리포터 유전자(예컨대, HBS 또는 lacZ)를 포함하는 효모 균주 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)내에 형질전환된다. 양자의 하이브리드 단백질은 단독으로는 리포터 유전자의 전사를 활성화하지 못한다: DNA-결합 도메인 하이브리드는 활성화 기능을 제공하지 못하기 때문에 할 수 없고, 활성화 도메인 하이브리드는 액티베이터의 결합부위를 국재할 수 없기 때문에 할 수 없다. 두 개의 하이브리드 단백질들의 상호작용은 기능적인 활성화 단백질을 재구성하여 리포터 유전자 산물에 대한 분석을 통해 검출되는 리포터 유전자의 발현을 초래한다.Briefly, by using such a system, plasmids encoding two hybrid proteins can be constructed: one plasmid is a transcriptional activation protein fused to an ObR, ObR polypeptide, peptide or obR nucleotide sequence encoding a fusion protein. (transcription activator protein) consists of nucleotides encoding the DNA-binding domain, and the other plasmid is part of the cDNA library to encode the activation domain of the transcriptional activation protein fused to the cDNA encoding the unknown protein recombined within the plasmid It consists of nucleotides that encode. DNA-binding domain fusion plasmids and cDNA libraries are transformed into yeast strain Saccharomyces cerevisiae whose reporter sites include reporter genes (eg, HBS or lacZ) containing transcriptional activation binding sites. do. Both hybrid proteins alone do not activate transcription of the reporter gene: DNA-binding domain hybrids cannot do because they do not provide activation, and activation domain hybrids do not localize the binding site of the activator. Can not. The interaction of the two hybrid proteins reconstructs the functional activating protein resulting in the expression of the reporter gene that is detected through analysis of the reporter gene product.

2-하이브리드 시스템 또는 관련 방법론들은 활성화 도메인 도서관을 "미끼(bait)" 유전자 산물과 상호작용하는 단백질에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 제한적 의미가 아닌, 실시예로서, ObR은 미끼 유전자 산물로 이용될 수 있다. 전체 게놈 또는 cDNA 서열들은 활성화 도메인을 코드화하는 DNA에 융합된다. 이러한 도서관 및 DNA-결합 도메인에 융합된 미끼 obR 유전자 산물의 하이브리드를 코드화하는 플라스미드는 효모 리포터 균주에 동시에 형질전환되고, 그 결과로서 수득되는 형질전환체는 리포터 유전자의 발현에 대해 스크리닝된다. 제한적인 의미가 아닌, 단지 예로서, 도 1, 도 3 또는 도 6에 도시된 바와 같은 obR의 개방해독틀(또는 obR의 도메인)과 같은 미끼 obR 유전자 서열은 그것이 GAL4 단백질의 DNA-결합 도메인을 코드화하는 DNA에 해독상 융합되도록 벡터내에 클로닝될 수 있다. 이들 클론들은 정제되고 리포터 유전자 발현을 담당하는 도서관 플라스미드들은 분리된다. 이어서 DNA 서열결정을 이용하여 도서관 플라스미드에 의해 코드화되는 단백질을 동정한다.Two-hybrid systems or related methodologies can be used to screen the activation domain library for proteins that interact with the "bait" gene product. As an example, but not by way of limitation, ObR may be used as a bait gene product. The entire genome or cDNA sequences are fused to the DNA encoding the activation domain. Plasmids encoding hybrids of bait obR gene products fused to these libraries and DNA-binding domains are simultaneously transformed into yeast reporter strains, and the resulting transformants are screened for expression of reporter genes. By way of example, but not by way of limitation, a bait obR gene sequence, such as the open reading frame of obR (or the domain of obR) as shown in FIG. 1, 3, or 6, indicates that the DNA-binding domain of GAL4 protein is It may be cloned into a vector such that it is translationally fused to the DNA encoding. These clones are purified and library plasmids responsible for reporter gene expression are isolated. DNA sequencing is then used to identify the protein encoded by the library plasmid.

그로부터 미끼 obR 유전자 산물과 상호작용하는 단백질들이 검출되는 세포주의 cDNA 도서관은 당업계에서 일상적으로 행해지는 방법을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 특수한 시스템에 따라, cDNA 단편들은 그들이 GAL4의 전사활성화 도메인에 해독상 융합되도록 벡터내에 삽입될 수 있다. 이러한 도서관은 미끼 obR 유전자-GAL4 융합 플라스미드와 함께 GAL4 활성화 서열을 포함하는 프로모터에 의해 구동되는 lacZ 유전자를 포함하는 효모 균주내에 동시에 형질전환될 수 있다. 미끼 obR 유전자 산물과 상호작용하는, GAL4-전사활성화 도메인에 융합된 cDNA 코드화 단백질은 활성화 GAL4 단백질을 재구성하여 HIS3 유전자의 발현을 구동할 것이다. HIS3을 발현하는 콜로니들은 히스티딘을 포함하지 않는 반고체 아가에 기초하여 만든 배지를 포함하는 페트리 접시상에서의 성장에 의해 검출될 수 있다. 이어서 cDNA는 당업계에서 일상적으로 시행되는 방법을 이용함으로써 이들 균주로부터 정제되어, 미끼 obR 유전자-상호작용 단백질의 생산 및 분리에 이용될 수 있다.The cDNA library of cell lines from which proteins that interact with the bait obR gene product are detected can be made using routine methods in the art. For example, according to the particular system described herein, cDNA fragments can be inserted into a vector such that they are translationally fused to the transcriptional activation domain of GAL4. Such a library can be simultaneously transformed into a yeast strain comprising a lacZ gene driven by a promoter comprising a GAL4 activation sequence with a bait obR gene-GAL4 fusion plasmid. The cDNA encoded protein fused to the GAL4-transcriptional activation domain, which interacts with the bait obR gene product, will reconfigure the activating GAL4 protein to drive the expression of the HIS3 gene. Colonies expressing HIS3 can be detected by growth on a Petri dish containing a medium made based on semisolid agar without histidine. CDNA can then be purified from these strains using methods routinely practiced in the art and used for the production and isolation of bait obR gene-interacting proteins.

3. ObR/세포내 또는 ObR/막간 거대분자를 억제하는 화합물에 대한 분석3. Analysis of compounds that inhibit ObR / intracellular or ObR / intermembrane macromolecules

개론Introduction

ObR과 상호작용하는 거대분자들을 본 논의의 목적상 "결합 파트너(binding partners)"라 칭한다. 이들 결합 파트너들은 ObR 신호 변환 경로 및, 그에 따라 체중조절에 있어서의 ObR의 역할에 관여할 것이다. 따라서, 이러한 결합 파트너들과 ObR 활성의 조절 및 ObR 활성과 관련된 체중장애의 조절에 유용하게 이용될 수 있는 Ob의 이러한 결합을 억제하거나 붕괴시키는 화합물들을 동정하는 것이 바람직하다.Macromolecules that interact with ObR are called "binding partners" for the purposes of this discussion. These binding partners will be involved in the ObR signal transduction pathway and hence the role of ObR in weight control. Therefore, it is desirable to identify compounds that inhibit or disrupt this binding of Ob, which can be usefully used in the regulation of ObR activity and in the control of body weight disorders associated with ObR activity.

ObR와 그의 결합 파트너 또는 파트너들 사이의 상호작용을 억제하는 화합물들을 동정하는데 이용된 분석시스템들의 기본 원리는 상기 섹션 5.5.1 및 5.5.2에 기술된 바와 같은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합단백질과 결합 파트너를 포함하는 반응혼합물을 두 가지가 서로 상호작용 및 결합하여 복합체를 형성하는데 충분한 조건하에서 충분한 시간동안 제조하는 단계를 포함한다. 화합물들을 억제 활성에 대해 시험하기 위해, 반응혼합물을 시험 화합물의 존재 및 부재하에서 준비한다. 시험 화합물은 처음부터 반응혼합물에 포함되거나 또는 ObR 부분 및 그의 결합 파트너의 첨가 이후의 시간에 첨가될 수도 있다. 대조군 반응 혼합물들은 시험화합물 없이 또는 위약(플라시보)와 함께 인큐베이션된다. 이어서 ObR 부분과 그의 결합 파트너 사이의 임의의 복합체의 형성이 검출된다. 시험 화합물을 포함하는 반응혼합물에서는 아니지만, 대조군 반응에서의 복합체의 형성은 화합물이 ObR과 상호작용성 결합 파트너의 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다. 또한, 시험 화합물 및 정상 ObR 단백질을 포함하는 반응혼합물에서의 복합체의 형성도 시험 화합물 및 돌연변이 ObR 단백질을 포함하는 반응혼합물에서의 복합체의 형성과 비교될 수 있다. 이러한 비교는 돌연변이의 상호작용은 파괴하면서 정상 ObR의 상호작용은 파괴하지 않는 화합물들 동정할 필요가 있는 경우에 중요하다.The basic principles of the assay systems used to identify compounds that inhibit the interaction between ObR and its binding partner or partners are proteins, polypeptides, peptides or fusion proteins as described in sections 5.5.1 and 5.5.2 above. And preparing a reaction mixture including a binding partner for a sufficient time under conditions sufficient for the two to interact and bond with each other to form a complex. To test the compounds for inhibitory activity, the reaction mixture is prepared in the presence and absence of the test compound. The test compound may be initially included in the reaction mixture or added at a time after the addition of the ObR moiety and its binding partner. Control reaction mixtures are incubated without test compound or with placebo (placebo). Formation of any complex between the ObR moiety and its binding partner is then detected. In the reaction mixture comprising the test compound, but not the formation of the complex in the control reaction indicates that the compound inhibits the interaction of the ObR with the interactive binding partner. In addition, the formation of a complex in a reaction mixture comprising a test compound and a normal ObR protein can also be compared to the formation of a complex in a reaction mixture comprising a test compound and a mutant ObR protein. This comparison is important when it is necessary to identify compounds that disrupt the interaction of mutations but do not disrupt the normal ObR interaction.

ObR과 결합 파트너의 상호작용을 방해하는 화합물들에 대한 분석은 불균일(heterogeneous) 또는 균일(homogeneous) 포멧으로 수행될 수 있다. 불균일 분석은 ObR 부분 산물과 결합 파트너 중의 하나를 고체상에 부착시키고 반응의 종결시에 고체상에 부착된 복합체들을 검출하는 과정을 포함한다. 균일분석에서는, 전체 반응이 액체상에서 수행된다. 양자의 접근방법에 있어서, 반응물의 첨가 순서는 시험 대상 화합물에 대해 상이한 정보를 수득하기 위해 변화될 수 있다. 예를 들어, 경쟁에 의해 상호작용을 방해하는 시험 화합물들은 시험 물질의 존재하에서 반응을 수행함으로써 확인될 수 있다; 즉, 시험 물질을 ObR 부분 및 결합 파트너 이전에 또는 동시에 반응혼합물에 첨가함으로써. 대안으로, 복합체의 성분들 중 하나를 제거하는 높은 결합상수를 갖는 화합물과 같은 일례의 이미 형성된 복합체들을 파괴하는 시험 화합물들은 시험 화합물을 복합체가 형성된 후에 반응혼합물에 첨가함으로써 시험될 수 있다. 여러 가지 다양한 포멧들이 이하에서 간략하게 설명된다.Assays for compounds that interfere with the interaction of ObR with a binding partner can be performed in heterogeneous or homogeneous format. Heterogeneous analysis involves attaching one of the ObR moieties and one of the binding partners to the solid phase and detecting complexes attached to the solid phase at the end of the reaction. In homogeneous analysis, the entire reaction is carried out in the liquid phase. In both approaches, the order of addition of the reactants can be varied to obtain different information about the compound under test. For example, test compounds that interfere with the interaction by competition can be identified by carrying out the reaction in the presence of the test substance; Ie by adding the test substance to the reaction mixture either before or simultaneously with the ObR moiety and the binding partner. Alternatively, test compounds that destroy exemplary already formed complexes, such as compounds with high binding constants that remove one of the components of the complex, can be tested by adding the test compound to the reaction mixture after the complex is formed. Several different formats are briefly described below.

불균일 분석 시스템에서, ObR과 상호작용성 결합 파트너 중 하나는 고체 상에 부착되는 반면에, 비-부착 종들은 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 실무상, 마이크로타이터 플레이트가 편리하게 이용될 수 있다. 부착된 종들은 비공유결합 또는 공유결합적 부착에 의해 고정될 수 있다. 비-공유 부착은 고체 표면을 단순히 obR 유전자 산물 또는 결합 파트너의 용액으로 코팅한 후 건조시켜 달성할 수 있다. 그렇지 않으면, 고정될 종들에 대해 특이적인 고정된 항체를 이용하여 종들을 고체 표면에 부착할 수도 있다. 표면들은 사전에 준비하여 보관할 수 있다.In a heterogeneous assay system, one of the ObR and the interactive binding partner is attached to the solid phase, while the non-attached species are labeled directly or indirectly. In practice, microtiter plates may be conveniently used. Attached species can be fixed by non-covalent or covalent attachment. Non-covalent attachment can be achieved by simply coating the solid surface with a solution of the obR gene product or binding partner and then drying. Alternatively, the immobilized antibodies specific for the species to be immobilized may be used to attach the species to the solid surface. Surfaces can be prepared and stored in advance.

상기 분석을 행하기 위해, 고정된 종들의 결합 파트너는 시험 화합물을 포함하거나 포함하지 않는 코팅된 표면에 노출된다. 반응이 끝난 후, 미반응 성분들은 제거(예컨대, 세정에 의해)되고, 형성된 복합체들은 고체 표면에 고정된 채로 남아있게 된다. 고체 표면상의 부착된 복합체의 검출은 다수의 방법으로 이루어질 수 있다. 고정되지 않은 종들이 사전에 표지된 경우에는, 표면상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 가리킨다. 고정되지 않은 종들이 사전에 표지되지 않은 경우에는, 예컨대, 사전에 고정되지 않은 종들(이어서 표지된 항-Ig 항체에 의해 직접적으로 표지되거나 또는 간접적으로 표지될 수 있는 항체)에 대해 특이적인 표지 항체를 이용하는 것과 같은 일례의 간접적인 표지가 표면상에 부착된 복합체를 검출하는데 이용될 수 있다.To perform this assay, the binding partner of the immobilized species is exposed to a coated surface with or without the test compound. After the reaction is finished, unreacted components are removed (eg by washing) and the complexes formed remain fixed on the solid surface. Detection of attached complexes on solid surfaces can be accomplished in a number of ways. If unfixed species have been previously labeled, detection of the immobilized label on the surface indicates that the complex has formed. If the immobilized species are not previously labeled, for example, a label antibody specific for species that are not previously immobilized (an antibody that can then be labeled directly or indirectly by a labeled anti-Ig antibody). Exemplary indirect labels, such as those that can be used to detect complexes attached on the surface.

대안으로, 반응은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 액체상내에서 수행될 수 있는데, 반응생성물들은 미반응 성분들과 분리되고, 복합체들은 검출된다; 예컨대, 용액 중에 생성된 임의의 복합체들을 부착하기 위한 결합 성분들 중의 하나에 대해 특이적인 고정된 항체 및 부착된 복합체를 검출하기 위한 다른 파트너에 대해 특이적인 표지된 항체를 이용하는 방법. 다시 말하여, 액체상에 대한 반응물의 첨가 순서에 따라, 복합체를 억제하거나 또는 이미 형성된 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물들이 동정될 수 있다.Alternatively, the reaction can be carried out in the liquid phase in the presence or absence of the test compound, where the reaction products are separated from the unreacted components and the complexes are detected; For example, using a fixed antibody specific for one of the binding components for attaching any complexes generated in solution and a labeled antibody specific for the other partner for detecting the attached complex. In other words, depending on the order of addition of the reactants to the liquid phase, test compounds may be identified that inhibit the complex or disrupt the complex already formed.

본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 균일 분석법(homogeneous assay)이 이용될 수 있다. 이러한 접근방법에서는, 이미 형성된 ObR 부분과 상호작용성 결합 파트너의 복합체는 ObR 또는 그의 결합 파트너들은 표지되지만, 표지에 의해 생성되는 신호는 복합체의 형성에 의해 켄칭된다)(예컨대, 이러한 접근방법을 면역측정법에 이용한 루빈스타인의 미국특허 제 4,109,496호 참조). 이미 형성된 복합체로부터의 하나의 종과 경쟁하여 그것을 제거하는 시험 물질의 첨가는 배경(background)을 넘는 신호의 발생을 초래한다. 이러한 방법으로, ObR/세포내 결합 파트너 상호작용을 파괴하는 물질들이 동정될 수 있다.In other embodiments of the invention, a homogeneous assay can be used. In this approach, the complex of the already formed ObR moiety and the interactive binding partner is labeled ObR or its binding partners, but the signal generated by the label is quenched by the formation of the complex (eg, immune to this approach). See Rubinstein US Pat. No. 4,109,496 used in the assay. The addition of a test substance that competes with and removes one species from an already formed complex results in the generation of a signal beyond the background. In this way, substances that disrupt ObR / intracellular binding partner interactions can be identified.

특정한 실시양태에 있어서, ObR 융합단백질은 고정화(immobilization)를 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, ObR 또는 CD에 해당하는 것과 같은 펩타이드 단편은 그의 결합능력이 그 결과 융합 단백질에서도 유지되도록 하는 방법으로, pGEX-5X-1과 같은 융합 벡터를 이용하여 글루타치온-S-트랜스페라제(GST) 유전자에 융합될 수 있다. 상호작용성 결합 파트너는 정제되고 당업계에서 일상적으로 시행되고 상기 섹션 5.3에 기술된 바와 같은 방법을 이용함으로써 단클로항체를 만드는데 이용될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에서 일상적으로 시행되고 방법에 의해 방사성 동위원소¹²⁵I로 표지될 수 있다. 불균일 분석에서, 예컨대, GST-ObR 단백질은 글루타치온-아가로스 비드에 부착될 수 있다. 이어서 상호작용성 결합 파트너는 상호작용 및 결합이 일어나게 하는 방법으로 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 첨가될 수 있다. 반응 기간의 말기에, 결합되지 않은 물질은 제거되고 표지된 단클론 항체는 시스템에 첨가되어 복합체 성분들과 결합하도록 방치된다. obR 유전자 산물과 상호작용성 결합 파트너 사이의 상호작용은 글루타치온-아가로스 비드에 결합된 채 남아있는 방사능의 양을 측정함으로써 검출될 수 있다. 시험 화합물에 의한 상호작용의 성공적인 억제는 측정된 방사능을 감소시킬 것이다.In certain embodiments, the ObR fusion protein can be prepared for immobilization. For example, peptide fragments, such as those corresponding to ObR or CD, can be used to maintain glutathione-S-transferases using a fusion vector such as pGEX-5X-1 in such a way that their binding capacity is consequently maintained in the fusion protein. GST) gene. Interactive binding partners can be used to make monoclonal antibodies by using methods such as those purified and routinely practiced in the art and described in Section 5.3 above. Such antibodies are routinely practiced in the art and can be labeled with the radioisotope ¹²⁵ I by methods. In heterogeneous assays, for example, GST-ObR protein may be attached to glutathione-agarose beads. The interactive binding partner can then be added in the presence or absence of the test compound in a manner that allows interaction and binding to occur. At the end of the reaction period, unbound material is removed and labeled monoclonal antibodies are added to the system and left to bind the complex components. Interactions between the obR gene product and the interactive binding partner can be detected by measuring the amount of radioactivity remaining bound to glutathione-agarose beads. Successful inhibition of interaction by the test compound will reduce the measured radioactivity.

대안으로, GST-ObR 융합단백질과 상호작용성 결합 파트너는 고체 글루타치온-아가로스 비드가 없는 상태에서 액체내에서 서로 혼합될 수 있다. 시험 화합물은 종들이 반응하도록 방치되는 동안에 또는 그 이후에 첨가될 수 있다. 이어서 이러한 혼합물은 글루타치온-아가로스 비드에 첨가되고 결합되지 않는 물질은 세정에 의해 제거된다. 다시 ObR/결합 파트너 상호작용의 억제의 정도는 표지된 항체를 첨가하여 비드에 결합된 방사능을 측정함으로써 검출될 수 있다.Alternatively, the GST-ObR fusion protein and the interactive binding partner can be mixed with each other in the liquid in the absence of solid glutathione-agarose beads. Test compounds may be added during or after the species is allowed to react. This mixture is then added to the glutathione-agarose beads and the unbound material is removed by washing. Again, the degree of inhibition of ObR / binding partner interaction can be detected by adding labeled antibody to measure radioactivity bound to the beads.

본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 이들 기술들은 하나 또는 양자의 전체 길이의 단백질 대신에, ObR 및/또는 상호작용성 결합 파트너(결합 파트너가 단백질인 경우)의 결합 도메인에 상당하는 펩타이드 단편을 이용하여 사용될 수 있다. 당업계에서 일상적으로 사용되는 임의의 수의 방법들이 결합 부위를 확인하고 분리하는데 이용될 수 있다. 이들 방법들은 단백질들중의 하나를 코드화하는 유전자의 돌연변이유발 및 동시-면역침강분석법을 이용한 결합의 파괴에 대한 스크리닝을 포함하나 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 이어서 복합체내의 두 번째 종을 코드화하는 유전자에서의 보상 돌연변이(compensating mutations)가 선별될 수 있다. 각 단백질들을 코드화하는 유전자들의 서열분석에 의해 상호작용성 결합에 관여하는 단백질의 부위에 해당하는 돌연변이가 밝혀질 것이다. 다른 방법으로, 하나의 단백질은 상술한 방법에 의해 고체 표면에 부착되어, 트립신과 같은 단백질분해효소에 의해 처리된 표지된 결합 파트너와 상호작용하고 결합하도록 방치된다. 세정후, 결합 도메인을 포함하는 짧은, 표지된 펩타이드는 고체 물질에 결합된 채로 남아 있을 수 있고, 이것은 분리되어 아미노산 서열결정에 의해 동정될 수 있다. 또한, 일단 세포내 결합 파트너를 코드화하는 유전자가 수득되면, 짧은 유전자 분절은 그 단백질의 펩타이드 단편들을 발현하도록 유전자조잘될 수 있고, 이어서 결합능력에 대해 시험되고 정제 및 합성된다.In other embodiments of the present invention, these techniques utilize peptide fragments corresponding to the binding domains of ObR and / or interactive binding partners (if the binding partner is a protein) instead of one or both full length proteins. Can be used. Any number of methods routinely used in the art can be used to identify and isolate binding sites. These methods include, but are not limited to, screening for mutagenesis of genes encoding one of the proteins and disruption of binding using co-immunoprecipitation assays. Compensating mutations in the gene encoding the second species in the complex can then be selected. Sequencing of the genes encoding the respective proteins will reveal mutations corresponding to the sites of the proteins involved in the interactive binding. Alternatively, one protein is attached to a solid surface by the method described above, and left to interact and bind with a labeled binding partner treated by a protease such as trypsin. After washing, short, labeled peptides comprising binding domains can remain bound to a solid material, which can be isolated and identified by amino acid sequencing. In addition, once a gene encoding an intracellular binding partner is obtained, short gene segments can be genetically engineered to express peptide fragments of that protein, which are then tested, purified and synthesized for binding capacity.

제한적인 의미는 아니고, 단지 일례로, obR 유전자 산물은 GST-ObR 융합단백질을 제조하여 그것이 글루타치온-아가로스 비드에 결합되게 함으로써 상술한 바와 같이 고체 물질에 부착될 수 있다. 상호작용성 결합 파트너는 방사성 동위원소³⁵S에 의해 표지되고, 트립신과 같은 단백질분해효소에 의해 절단될 수 있다. 절단 생성물은 이어서 부착된 GST-ObR 융합 단백질에 첨가되어 결합하도록 방치된다. 결합되지 않는 펩타이드가 세정하에 의해 제거된 후, 세포내 결합 파트너 결합 도메인인, 표지된 결합 물질들은 용출 및 정제되고 주지의 방법에 의해 아미노산 서열에 대해 분석될 수 있다. 이와 같이 해서 동정된 펩타이드들은 합성에 의해 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 적당한 촉진 단백질에 융합시킴으로써 생산될 수 있다.In a non-limiting sense, only as an example, the obR gene product can be attached to a solid material as described above by preparing a GST-ObR fusion protein and allowing it to bind to glutathione-agarose beads. The interactive binding partner is labeled by the radioisotope ³⁵ S and can be cleaved by proteases such as trypsin. The cleavage product is then added to the attached GST-ObR fusion protein and left to bind. After unbound peptides are removed by washing, labeled binding agents, which are intracellular binding partner binding domains, can be eluted and purified and analyzed for amino acid sequences by known methods. Peptides thus identified can be produced synthetically or by fusing to suitable facilitating proteins using recombinant DNA technology.

4. 체중 장애를 개선하는 화합물들의 동정을 위한 분석4. Assay for Identification of Compounds That Improve Weight Disorder

상기 섹션 5.5.1 내지 5.5.3에 기술된 것과 같은 분석기술에 의해 동정된 결합 화합물들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 화합물들은, 비만을 포함하는 체중장애 증상의 개선 효과에 대해 시험될 수 있다. 상술한 분석방법은 ObR 활성에 영향을 미치는 화합물(예컨대, ObR에 결합하고, 천연 리간드의 결합을 방해하고, 신호변환을 활성화(작동물질) 또는 활성화를 차단(길항물질)하는 화합물 및 ObR의 천연 리간드에 결합하여 리간드 활성을 중화하는 화합물); 또는 obR 유전자 발현에 영향을 미침으로써 obR 유전자 활성에 영향을 미치는 화합물들(예컨대, 스플라이싱 이벤트에 영향을 주거나 방해하여 전체 길이 또는 절두된 형태의 ObR의 발현이 조절될 수 있도록 하는 단백질들 또는 작은 유기분자들을 포함)을 동정할 수 있다. 그러나, 기술된 분석방법들도 ObR 신호변환을 조절하는 화합물들(예컨대, ObR에 대한 Ob 결합에 의해 활성화되는 신호를 변환하는데 관여하는 티로신 키나제 또는 포스파타아제 활성의 저해물질 또는 인헨서와 같은 하류 신호 이벤트에 영향을 미치는 화합물들)을 동정할 수 있다는 사실을 유의해야 한다. obR 유전자 및 /또는 obR 유전자 산물이 관여하는 ObR 신호 변환 경로의 다른 스텝에 영향을 미치고, 이와 같은 경로에 영향을 미침으로써 체중장애의 발생에 대한 ObR의 영향을 조절할 수 있는, 이와 같은 화합물들의 동정 및 이용은 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 화합물들은 체중장애의 치료를 위한 치료방법의 일부로 이용될 수 있다.Compounds that include, but are not limited to, binding compounds identified by analytical techniques such as those described in sections 5.5.1 to 5.5.3 above, can be tested for improving effects of weight disorder symptoms, including obesity. have. The analytical methods described above include compounds that affect ObR activity (e.g., compounds that bind ObR, interfere with the binding of natural ligands, activate signal transduction (activators) or block activation (antagonists) and the natural nature of ObR Compounds that bind to ligands and neutralize ligand activity); Or compounds that affect obR gene activity by affecting obR gene expression (eg, proteins that affect or interfere with splicing events so that expression of ObR in full length or truncated form can be modulated, or Small organic molecules) can be identified. However, the described assays also have downstream compounds such as inhibitors or enhancers of compounds that modulate ObR signal transduction (eg, tyrosine kinases or phosphatase activity involved in converting signals activated by Ob binding to ObR). It should be noted that the compounds affecting signal events) can be identified. Identification of such compounds that may affect other steps in the ObR signal transduction pathway that the obR gene and / or obR gene product are involved in and affect the pathogenesis by affecting ObR on the development of weight disorders And use is within the scope of the present invention. Such compounds can be used as part of a treatment for the treatment of weight disorders.

본 발명은 체중장애 증상을 개선하는 능력을 시현하는 화합물들의 동정을 위한 세포-기초 및 동물 모델-기초 분석법을 포함한다. 이러한 세포-기초 분석 시스템은 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산된 Ob 및 Ob 돌연변이체를 포함하는, 천연 리간드, Ob의 순도 및 효능을 분석하는 "금본위제(gold standard)"로서 이용될 수도 있다.The present invention includes cell-based and animal model-based assays for the identification of compounds that demonstrate the ability to ameliorate symptoms of weight disorder. Such cell-based assay systems may be used as a "gold standard" for analyzing the purity and potency of natural ligands, Ob, including Ob and Ob mutants produced recombinantly or synthetically.

세포-기초 시스템들은 체중장애 증상들을 개선하는 작용을 할 수 있는 화합물들을 동정하는데 이용될 수 있다. 이러한 세포 시스템들은 예를 들어, obR 유전자를 발현하는 세포주와 같은 재조합, 또는 비-재조합 세포들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 맥락막총 세포, 시상하부 세포 또는 맥락막총 또는 시상하부로부터 유래된 세포주들이 이용될 수 있다. 또한, 예컨대, 화학적 또는 표현형상의 변화, 숙주세포 유전자의 유도, 이온(예컨대, Ca⁺⁺) 플럭스의 변화, 숙주세포 단백질의 티로신 인산화 등에 의해 측정할 때, 기능적인 ObR을 발현하고 천연 Ob 리간드에 의한 활성화에 반응하도록 유전자조작된 발현 숙주세포(예컨대, COS 세포, CHO 세포, 섬유아세포)들은 상기 분석에서 종점(end point)으로 이용될 수 있다.Cell-based systems may be used to identify compounds that may act to ameliorate weight disorder symptoms. Such cellular systems can include recombinant or non-recombinant cells such as, for example, a cell line expressing the obR gene. For example, choroid plexus cells, hypothalamus cells or cell lines derived from choroid plexus or hypothalamus can be used. In addition, functional ObR expression and natural Ob ligands, such as measured by chemical or phenotypic changes, induction of host cell genes, changes in ionic (eg Ca ⁺⁺ ) flux, tyrosine phosphorylation of host cell proteins, and the like Expression host cells (eg, COS cells, CHO cells, fibroblasts) that have been engineered to respond to activation by can be used as end points in the assay.

이러한 세포 시스템들의 이용에서, 세포들은 체중장애 증상을 개선하는 능력을 시현할 것으로 생각되는 화합물에, 노출된 세포에서 체중장애 증상의 개선이 유도되는데 충분한 농도에서 충분한 시간 동안, 노출될 수 있다. 노출 후에, 세포들은 예컨대, 세포 용해물들을 obR mRNA 전사체 또는 세포에서 발현된 ObR 단백질에 대해 분석(예컨대, 노던 블롯)함으로써 obR 유전자의 발현상의 변화를 측정하기 위해 분석될 수 있다: obR 유전자의 발현을 조절하거나 변화시키는 화합물들은 치료제로 좋은 후보물질이다. 대안으로, 하나 이상의 체중장애-유사 세포 표현형이 정상 또는 야생형, 비-체중장애 표현형, 또는 발생률이 낮거나 정도가 약한 장애 증상을 일으키는 표현형과 유사하게 변화되었는지를 확인하기 위해 세포들을 조사하였다. 더욱이, ObR이 일부분인 신호변환경로의 성분들의 발현 및/또는 활성 또는 ObR 신호 변환 경로 자체의 활성이 분석될 수 있다.In the use of such cellular systems, cells can be exposed to a compound that is thought to exhibit the ability to ameliorate weight disorder symptoms for a sufficient time at a concentration sufficient to induce improvement of weight disorder symptoms in exposed cells. After exposure, cells can be analyzed to determine changes in the expression of the obR gene, eg, by analyzing cell lysates (eg, Northern blots) against obR mRNA transcripts or ObR proteins expressed in the cells: Compounds that modulate or alter expression are good candidates for therapeutic use. Alternatively, the cells were examined to see if one or more weight disorder-like cell phenotypes changed similarly to a normal or wild type, a non-weight disorder phenotype, or a phenotype that causes a low or low incidence of symptoms. Moreover, the expression and / or activity of the components of the signal transduction pathway in which ObR is a part or the activity of the ObR signal transduction pathway itself can be analyzed.

예를 들어, 노출 후에, 노출되지 않는 대조군 세포들로부터 유래된 용해물과 비교하여, 세포용해물들은 숙주세포단백질의 티로신 인산화의 존재 여부에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석 시스템에서 시험 화합물들의 숙주세포 단백질의 티로신 인산화를 억제하는 능력은 시험화합물들이 ObR 활성화에 의해 개시되는 신호변환을 억제한다는 것을 의미한다. 세포 용해물들은 웨스턴 블롯 포멧을 이용함으로써 손쉽게 분석될 수 있다: 즉, 숙주세포 단백질들은 겔 전기영동되고, 옮겨지고, 항-포스포티로신 검출 항체(예컨대, 방사성표지, 형광표지 또는 효소와 같은 신호발생 화합물에 의해 표지된 항-포스포티로신 항체)를 이용하여 프로빙된다. (예컨대, Glenney et al., 1988, J. Immunol. Methods 109:277-285; Frackelton et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:1343-1352 참조). 다른 방법으로, ELISA 포멧이 이용될 수 있는데, 여기서는 ObR 신호 변환 경로에 관련되는 특정한 숙주세포 단백질이 표적 숙주세포 단백질에 대해 특이적인 부착 항체에 의해 고정되고, 고정된 숙주세포 단백질상의 포스포티로신의 존재 또는 부재를 표지된 항-포스포티로신 항체를 이용함으로써 검출한다. (King et al., 1993, Life Sciences 53:1465-1472 참고). 또 다른 접근방법에서는, 칼슘이온플럭스와 같은 이온 플럭스가 ObR 자극 신호변환의 종점으로 측정될 수 있다.For example, after exposure, cytolysates can be analyzed for the presence of tyrosine phosphorylation of host cell proteins, as compared to lysates derived from unexposed control cells. The ability to inhibit tyrosine phosphorylation of host cell proteins of test compounds in this assay system means that the test compounds inhibit signal transduction initiated by ObR activation. Cell lysates can be easily analyzed by using Western blot format: host cell proteins are gel electrophoresed, transferred and signaled such as anti-phosphotyrosine detection antibodies (e.g., radiolabels, fluorescent labels or enzymes). Probing using an anti-phosphotyrosine antibody labeled by the compound). (See, eg, Glenney et al., 1988, J. Immunol. Methods 109: 277-285; Frackelton et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1343-1352). Alternatively, the ELISA format can be used, where a particular host cell protein involved in the ObR signal transduction pathway is immobilized by an attachment antibody specific for the target host cell protein and the phosphotyrosine on the immobilized host cell protein. Presence or absence is detected by using labeled anti-phosphotyrosine antibodies. (See King et al., 1993, Life Sciences 53: 1465-1472). In another approach, ion flux, such as calcium ion flux, can be measured as the end point of the ObR stimulus signal transduction.

대안으로, 화합물이 ObR 매개 신호 변환을 조절하는 능력을 평가하기 위하여, STAT 단백질의 활성화 및 IL-6 반응성 유전자 요소를 통해 매개되는 전사의 자극을 측정할 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 리포터 유전자에 인접하게 클로닝된 IL6 반응성 요소 서열을 포함하도록 유전자조작될 수 있고, ObR 활성의 조절은 리포터 유전자 활성을 분석함으로써 측정될 수 있다. 이용될 수 있는 리포터 유전자들은 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT), 개똥벌레루시페라제 또는 사람 성장호르몬을 코드화하는 것들을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.Alternatively, to assess the ability of a compound to modulate ObR mediated signal transduction, the activation of STAT proteins and the stimulation of transcription mediated through IL-6 reactive gene elements can be measured. For example, the recombinant expression vector can be engineered to include an IL6 reactive element sequence cloned adjacent to the reporter gene, and regulation of ObR activity can be measured by analyzing reporter gene activity. Reporter genes that can be used include, but are not necessarily limited to, chloramphenicol acetyl transferase (CAT), firefly luciferase, or those encoding human growth hormone.

또한, ob, db, ob/db 마우스를 포함할 수 있는 동물-기초 체중 장애 시스템들은 체중장애-유사 증상들을 개선할 수 있는 화합물들을 동정하는데 이용될 수 있다. 이러한 동물 모델들은 이러한 장애의 치료에 효과적일 수 있는 약물, 약제, 치료방법 및 개입(intervention)의 확인을 위한 시험 기질로 이용될 수 있다. 예를 들어, 동물 모델은 체중장애 증상들을 개선할 수 있는 능력을 시현할 것으로 생각되는 화합물에 노출된 동물에서 체중장애 증상의 개선이 나타나는데 충분한 농도에서 및 충분한 시간동안 노출된다. 노출될 동물의 반응은 비만과 같은 체중장애와 관련된 장애의 회복을 평가함으로써 모니터될 수 있다. 개입과 관련하여서는, 체중장애-유사 증상의 임의의 양상을 회복시키는 임의의 치료방법이 사람 체중장애 치료 개입을 위한 후보로 고려되어야만 한다. 시험 약제의 용량은 이하 섹션 5.7.1에 언급된 바와 같이 도스-반응 곡선을 구함으로써 결정될 수 있다.In addition, animal-based weight disorder systems, which may include ob, db, ob / db mice, may be used to identify compounds that may ameliorate weight disorder-like symptoms. Such animal models can be used as test substrates for the identification of drugs, drugs, treatment methods and interventions that may be effective in the treatment of such disorders. For example, animal models are exposed at sufficient concentrations and for sufficient time to show improvement in weight disorder symptoms in animals exposed to a compound that is believed to exhibit the ability to ameliorate weight disorder symptoms. The response of the animal to be exposed can be monitored by assessing the recovery of a disorder associated with a weight disorder such as obesity. With regard to the intervention, any treatment that recovers any aspect of weight disorder-like symptoms should be considered as a candidate for human weight disorder treatment intervention. The dose of the test agent can be determined by obtaining a dose-response curve as mentioned in section 5.7.1 below.

F. 체중장애를 포함하는 체중의 치료F. Treatment of Weight Including Weight Disorders

본 발명은 체중을 변화시키는 방법 및 조성물 및 비만증, 카헥시(cachexia) 및 식욕부진을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아닌 체중장애의 치료방법 및 조성물에 관계한다. 정상적인 obR 유전자 산물 기능의 상실이 비만 표현형을 발생시키기 때문에, obR 유전자 산물 활성의 증가 또는 ObR 경로의 활성화(예컨대, 하향 활성화)는 obR 유전자 발현 및/또는 obR 활성이 부족한 비만한 개체에서 정상적인 체중 상태로 진전되는 것을 촉진할 것이다.The present invention relates to methods and compositions for changing weight and to methods and compositions for treating weight disorders, including but not limited to obesity, cachexia and anorexia. Since loss of normal obR gene product function results in an obesity phenotype, an increase in obR gene product activity or activation of the ObR pathway (eg, downward activation) may result in normal body weight status in obese individuals who lack obR gene expression and / or obR activity. Will facilitate progress.

대안으로, 정상 체중 표현형에 비해 체중이 적은, 카헥시와 같은 특정한 체중장애의 증상들은 obR 유전자 발현 및/또는 obR 활성의 수준을 낮추고/거나 ObR 경로의 활성을 하향조정(예컨대, 표적화 하향 신호 이벤트; targeting downstream signalling events)함으로써 개선될 수 있다. 다른 접근 방법은 후술한다.Alternatively, symptoms of certain weight disorders, such as carhexi, that are less than the normal weight phenotype may lower the level of obR gene expression and / or obR activity and / or downregulate the activity of the ObR pathway (eg, targeting down-signal events). can be improved by targeting downstream signaling events. Another approach is described later.

1. 체중증가를 촉진하기 위한 obR 발현 또는 obR 활성의 억제1. Inhibition of obR expression or obR activity to promote weight gain

Ob를 중화하거나 obR 유전자의 발현을 억제하는(전사 또는 해독)임의의 방법은 체중을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 접근방법은 식욕부진 또는 카헥시와 같은 체중장애의 치료에 이용될 수 있다. 이러한 방법은 농업적 적용에도 유용하다: 즉, 축산 동물들의 체중을 증가시킬 수 있다.Any method that neutralizes Ob or inhibits expression of the obR gene (transcription or translation) can be used to gain weight. This approach can be used to treat weight loss, such as anorexia or carhexis. This method is also useful for agricultural applications: it can increase the weight of livestock animals.

예를 들어, ObR에 대한 천연 리간드인 순환하는 Ob에 결합하여 "중화"하는 가용성 펩타이드, 단백질, 융합단백질, 또는 항체들(항-이디오타입 항체 포함)의 투여는 체중을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, ObR의 ECD에 해당하는 펩타이드, ObR의 가용성 결실 돌연변이체(예컨대, ΔTMObR 돌연변이체) 또는 다른 폴리펩타이드(예컨대, IgFc)에 융합된 이들 ObR 도메인들 또는 돌연변이체들이 이용될 수 있다. 대안으로, ObR ECD를 의태하여 Ob를 중화하는 항-이디오타입 항체들 또는 항-이디오타입 항체들의 Fab 단편들도 이용될 수 있다(섹션 5.3, 상술한 문헌 참조). 이러한 ObR 펩타이드, 단백질, 융합단백질, 항-이디오타입 항체들, 또는 Fab들은 Ob를 중화하여 체중을 증가시키는데 충분한 양으로 환자에게 투여된다.For example, administration of soluble peptides, proteins, fusion proteins, or antibodies (including anti-idiotype antibodies) that bind to and neutralize circulating Ob, a natural ligand for ObR, may be used to gain weight. Can be. For this purpose, these ObR domains or mutants fused to a peptide corresponding to the ECD of ObR, a soluble deletion mutant of ObR (eg ΔTMObR mutant) or other polypeptide (eg IgFc) can be used. . Alternatively, anti-idiotype antibodies or Fab fragments of anti-idiotype antibodies that neutralize Ob due to the ObR ECD can also be used (section 5.3, see supra). Such ObR peptides, proteins, fusion proteins, anti-idiotype antibodies, or Fabs are administered to a patient in an amount sufficient to neutralize Ob to gain weight.

아미노산 잔기 약 23부터 약 837까지인, 도 1 또는 도 6에 도시된 아미노산 서열을 갖는거나 또는 도 3에 도시된, 아미노산 잔기 약 21부터 약 839까지인 아미노산 서열을 갖는 서열 ECD에 해당하는 ObR 펩타이드들이 이용될 수 있다. 23 아미노산 소수성 부착 서열(예컨대, 도 1 또는 6의 아미노산 잔기 번호 838 내지 860인 서열 또는 도 3에서 약 840 내지 약 862인 서열)의 전부 또는 일부가 결실된 ObR ΔTM 돌연변이체들도 이용될 수 있다. ObR, ObR ECD, 또는 ΔTMObR의 IgFc에 대한 융합은 조제의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라, 생체내에서 ObR-Ig 융합단백질의 반감기 및 활성을 증가시킬 것이다. 융합단백질의 Ig 부분의 Fc 부위는 면역글로불린 이펙터 기능을 감소시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 하기 섹션 10 참조.ObR peptide corresponding to sequence ECD having an amino acid sequence shown in FIG. 1 or 6 with amino acid residues from about 23 to about 837, or having an amino acid sequence with amino acid residues from about 21 to about 839, shown in FIG. Can be used. ObR ΔTM mutants may also be used in which all or part of a 23 amino acid hydrophobic attachment sequence (eg, a sequence having amino acid residue numbers 838 to 860 of FIG. 1 or 6 or a sequence of about 840 to about 862 in FIG. 3) is deleted. . Fusion of ObR, ObR ECD, or ΔTMObR to IgFc will not only increase the stability of the preparation but also increase the half-life and activity of the ObR-Ig fusion protein in vivo. The Fc region of the Ig portion of the fusion protein may be further modified to reduce immunoglobulin effector function. See section 10 below.

본원에 기술된 특수한 실시양태에 있어서, 마우스 또는 사람 ObR의 세포외 도메인들은 IgG 불변부위에 융합되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 정제된 ObR-Ig는 세포 표면 ObR에 대한 AP-OB 융합단백질의 결합을 강력하게 억제하거나 중화할 수 있었다. (하기 섹션 10.4 참조).In a particular embodiment described herein, extracellular domains of mouse or human ObR were fused to IgG constant regions. As shown in FIG. 10, purified ObR-Ig was able to strongly inhibit or neutralize binding of AP-OB fusion protein to cell surface ObR. (See section 10.4 below).

순환하는 Ob를 중화하는 다른 실시양태에 있어서, 이러한 가용성이고 분비된 형태의 ObR을 발현하도록 유전자조작된 세포들은 환자에게 투여될 수 있고, 따라서 그들은 생체내에서 "생물반응기"로 작용하여 지속적으로 Ob 중화 단백질을 공급할 것이다. 이러한 세포들은 환자로부터 수득되거나 또는 MHC 조직적합성 공여자로부터 수득될 수 있고, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니나, 섬유아세포, 혈구(예컨대, 림프구), 아디포사이트, 근세포, 상피세포 등을 포함한다. 세포들은 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 생체외에서 ObR ECD, ΔTMObR 또는 ObR-Ig 융합단백질(예컨대, ObR-, ECD-, 또는 ΔTMObR-IgFc 융합단백질들)을 코드화하는 서열을 형질도입[transduction](바이러스 벡터 및 바람직하게 형질전환유전자를 세포 게놈에 통합시키는 벡터들을 이용함으로써)에 의해 또는 플라스미드, 코스미드, YACs, 일렉트로포레이션, 리포좀 등의 이용을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 트랜스펙션(transfection) 방법에 의해 세포내로 도입하기 위해 유전자조작된다. obR 코드화 서열은 강한 항구성 프로모터 또는 유도성 프로모터 또는 ObR 펩타이드 또는 융합단백질의 발현 및 분비를 실현시키는 프로모터/인헨서의 조절하에 놓일 수 있다. 목적 ObR 생성물을 발현시키고 분비시키는 유전자조작된 세포들은 환자에게 전신적으로, 즉, 순화내로, 복막내로, 맥락막총 또는 시상하부에 도입될 수 있다. 대안으로, 세포들은 매트릭스에 편입되어 체내에 이식될 수 있는데, 예를 들어, 유전자 조작된 섬유아세포들은 피부 이식용 조직편(graft)의 일부로 이식될 수 있고; 유전자조작된 상피세포들은 혈관 이식용 조직편으로 이식될 수 있다. (예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 첨부된, 앤더슨 등의 미국특허 제 5,399,349호; 및 멀리건 및 윌슨의 미국특허 제 5,460,959호 참조).In another embodiment of neutralizing circulating Ob, cells engineered to express this soluble and secreted form of ObR can be administered to a patient, so that they act as a "bioreactor" in vivo to continuously maintain Ob Will supply neutralizing protein. Such cells may be obtained from a patient or from an MHC histocompatibility donor and include, but are not necessarily limited to, fibroblasts, blood cells (eg, lymphocytes), adiposites, myocytes, epithelial cells, and the like. Cells may be transfected with viral DNA sequences to encode ObR ECD, ΔTMObR or ObR-Ig fusion proteins (eg, ObR-, ECD-, or ΔTMObR-IgFc fusion proteins) in vitro (viral vectors). And preferably by using vectors incorporating the transgene into the cell genome) or using, but not necessarily limited to, plasmids, cosmids, YACs, electroporations, liposomes, and the like. It is genetically engineered for introduction into cells by transfection). The obR coding sequence can be placed under the control of a promoter / enhancer that realizes the expression and secretion of a strong persistent or inducible promoter or ObR peptide or fusion protein. The engineered cells that express and secrete the desired ObR product can be introduced systemically to the patient, ie, intrapurified, intraperitoneally, choroid plexus or hypothalamus. Alternatively, cells can be incorporated into the matrix and transplanted into the body, eg, genetically engineered fibroblasts can be transplanted as part of a skin graft; The engineered epithelial cells can be transplanted into tissue pieces for vascular grafts. (See, eg, US Pat. No. 5,399,349 to Anderson et al., Incorporated herein by reference in its entirety; and US Pat. No. 5,460,959 to Mulligan and Wilson).

투여될 세포들이 비-오토로거스(non-autologous) 세포들이라면, 그들은 도입된 세포들에 대한 숙주 면역반응의 발생을 방지하는 주지의 기술을 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 접해 있는 세포외 환경에 의한 성분들의 변화는 가능하게 하지만, 도입된 세포들이 숙주 면역계에 의해 인식되지 않도록 하는 캡슐화된 상태로 도입될 수 있다.If the cells to be administered are non-autologous cells, they can be administered using known techniques to prevent the development of a host immune response against the introduced cells. For example, cells can be introduced in an encapsulated state that allows for changes in components by the extracellular environment in which they are encountered, but prevents the introduced cells from being recognized by the host immune system.

다른 실시양태에 있어서, 체중 증가 요법은 예컨대, obR mRNA 전사체의 해독을 억제하거나 방해하는 안티센스 또는 리보자임 접근방법; obR 유전자의 전사를 방해하는 삼중나선 접근방법; 또는 obR 유전자 또는 그의 내성 프로모터를 불활성화하거나 "녹-아웃"하는 표적화 상동재조합 접근방법을 이용함으로써, 내성 obR 유전자 발현의 수준을 감소시키도록 설계될 수 있다. obR 유전자는 맥락막총 및 시상하부를 포함하는 뇌에서 발현되기 때문에, 배송 기술은 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있도록 설계하는 것이 바람직하다 (본원에 참고자료로 첨부된 PCT WO89/10134호 참조). 대안으로, 본원에 기술된 안티센스, 리보자임, 또는 DNA 구조물들은 표적 세포를 포함하는 부위, 예컨대, 맥락막총 및/또는 시상하부에 직접 투여될 수 있다.In other embodiments, the weight gain therapy comprises, for example, an antisense or ribozyme approach that inhibits or interferes with the translation of obR mRNA transcripts; triple helix approach to disrupt transcription of the obR gene; Or by using targeting homologous recombination approaches that inactivate or “knock out” the obR gene or its resistance promoter. Because the obR gene is expressed in the brain, including the choroid plexus and hypothalamus, delivery techniques are preferably designed to cross the blood-brain barrier (see PCT WO89 / 10134, incorporated herein by reference). Alternatively, the antisense, ribozymes, or DNA constructs described herein may be administered directly to the site containing the target cell, such as the choroid plexus and / or hypothalamus.

안티센스 접근방법은 ObR mRNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 설계를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상보성 obR mRNA 전사체에 결합하여 해독을 방해할 것이다. 절대적인 상보성이 바람직하기는 하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 본원에서 논의될 때 RNA의 일부분에 대해 "상보성"인 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 이중나선을 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미한다; 이중가닥 안티센스 핵산의 경우에, 2중나선 DNA중 하나의 가닥이 시험되거나 삼중가닥 형성이 분석될 수 있다. 혼성화하는 능력은 안티센스 핵산의 상보성의 정도 및 길이 모두에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산의 길이가 길수록, 더 많은 RNA와의 부정합(mismatch)을 포함하게 되고, 여전히 안정한 이중가닥(또는 경우에 따라 삼중가닥)을 형성할 것이다. 당업자들은 혼성화된 복합체의 융점을 측정하는 표준방법을 이용함으로써 허용가능한 부정합의 정도를 확인할 수 있을 것이다.Antisense approaches include the design of oligonucleotides (DNA or RNA) complementary to ObR mRNA. Antisense oligonucleotides will bind to complementary obR mRNA transcripts and interfere with translation. Absolute complementarity is desirable but not required. As discussed herein, a sequence "complementary" to a portion of RNA refers to a sequence having sufficient complementarity to hybridize with RNA to form a stable double helix; In the case of double stranded antisense nucleic acids, either strand of double-stranded DNA can be tested or triple strand formation can be analyzed. The ability to hybridize will depend on both the degree and length of complementarity of the antisense nucleic acid. In general, the longer the hybridizing nucleic acid, the more mismatch with the RNA, and will still form a stable double strand (or optionally triple strand). Those skilled in the art will be able to ascertain the extent of acceptable mismatch by using standard methods for measuring the melting point of hybridized complexes.

예컨대, AUG 개시코돈을 포함하는 5' 비해독 서열과 같은, 메시지의 5' 말단에 대해 상보성인 올리고뉴클레오티드들은, 해독 억제에서 가장 효과적으로 작용할 것이다. 그러나, mRNA의 3' 비해독 서열에 대해 상보성인 서열들도 최근에 mRNA의 해독의 억제에 있어 효과적임이 입증되었다. 일반적으로 Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335 참조. 따라서, 도 1(쥐의 짧은 형태), 도 6(쥐의 긴 형태) 또는 도 3(사람 긴 형태)에 도시된 obR의 5' 또는 3' 비-해독, 비-암호화 부위에 대해 상보성인 올리고뉴클레오티드들은 안티센스 접근방법에서 내성 obR mRNA의 해독 억제에 이용될 수 있다. mRNA의 5' 비해독 부위에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드들은 AUG 개시코돈의 짝(complement)을 포함해야만 한다. mRNA 코드화 부위에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에 따라 이용될 수는 있지만, 덜 효율적인 해독 억제물질이다. obR mRNA의 5'-, 3'- 또는 코드화서열에 혼성화하도록 설계되든 어떻든 간에, 안티센스 핵산들은 적어도 6개의 아미노산의 길이이어야 하고, 바람직하게 6부터 약 50 뉴클레오티드 까지 범위내의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 특수한 양상에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 25 뉴클레오티드 또는 적어도 50 뉴클레오티드이다.Oligonucleotides that are complementary to the 5 'end of the message, such as, for example, the 5' untranslated sequence comprising the AUG initiation codon, will most effectively act in inhibition of translation. However, sequences that are complementary to the 3 'untranslated sequence of mRNA have also recently been shown to be effective in suppressing the translation of mRNA. See generally Wagner, R., 1994, Nature 372: 333-335. Thus, oligos that are complementary to the 5 'or 3' non-detoxifying, non-coding sites of obR shown in FIG. 1 (short form of rat), FIG. 6 (long form of rat) or 3 (long form of human) Nucleotides can be used to inhibit translation of resistant obR mRNA in an antisense approach. Oligonucleotides that are complementary to the 5 'non-poisonous portion of the mRNA should include a pair of AUG start codons. Antisense oligonucleotides complementary to mRNA encoding sites can be used in accordance with the present invention but are less efficient translation inhibitors. Whether designed to hybridize to the 5'-, 3'- or coding sequence of the obR mRNA, antisense nucleic acids should be at least six amino acids in length and are preferably oligonucleotides with a length in the range from 6 to about 50 nucleotides. In a particular aspect, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.

표적 서열의 선택과 무관하게, 유전자 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 확실히 하기 위해서 우선 생체외 시험을 행하는 것이 바람직하다. 이러한 연구는 안티센스 유전자 억제와 올리고뉴클레오티드의 비특이적 생물학적 효과를 구분하기 위해서 대조군을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 시험들은 표적 RNA 또는 단백질의 농도를 내부 대조군 RNA 또는 단백질의 농도와 비교하는 것도 바람직하다. 그리고, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수득된 결과들을 대조군 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 수득된 결과와 비교하는 것도 고려할 수 있다. 대조군 올리고뉴클레오티드는 시험 올리고뉴클레오티드와 거의 같은 길이이고, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 표적서열에 대한 특이적인 혼성화를 방해하는데 필요한 것 이상은 안티센스 서열과 상이한 것이 바람직하다.Irrespective of the choice of target sequence, it is preferred to first conduct in vitro testing to ensure the ability of antisense oligonucleotides to inhibit gene expression. For these studies, it is desirable to use a control to distinguish between antisense gene inhibition and the nonspecific biological effects of oligonucleotides. It is also desirable that these tests compare the concentration of target RNA or protein with the concentration of internal control RNA or protein. In addition, it may be considered to compare the results obtained using antisense oligonucleotides with the results obtained using control oligonucleotides. The control oligonucleotide is about the same length as the test oligonucleotide and the nucleotide sequence of the oligonucleotide is preferably different from the antisense sequence beyond what is necessary to interfere with specific hybridization to the target sequence.

올리고뉴클레오티드들은 DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물 또는 그의 유도체들 또는 변형된 버젼들로서, 단일 가닥 또는 중가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드들은 예컨대, 분자의 안정성, 혼성화를 향상시키기 위하여, 염기 부분, 당 부분, 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 펩타이드(예컨대, 생체내에서 숙주세포를 표적화하는), 세포막(예컨대, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 ; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652 ; 1988년 12월 15일에 공개된, PCT 국제공개 제 WO88/09810호 참조) 또는 혈액-뇌 방벽(예컨대, 1988, 4. 25에 공개된 PCT 국제공개 제 WO89/10134호), 혼성화 개시 절단 약제(예컨대, Krol et al., 1988, BioTechiques 6:958-976 참조) 또는 인터칼레이팅제(예컨대, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549 참조)와 같은 부가 그룹들을 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자들, 예컨대, 펩타이드, 혼성화-개시 가교제(hybridization-triggered cross-linking agent), 이송제(transport agent), 혼성화-개시 절단제(hybridization triggered cross-linking agent)등에 접합될 수 있다.Oligonucleotides may be single stranded or heavy stranded as DNA or RNA or chimeric mixtures or derivatives or modified versions thereof. Oligonucleotides can be modified, for example, in the base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone to enhance the stability, hybridization of the molecule. Oligonucleotides include peptides (eg, targeting host cells in vivo), cell membranes (eg, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; see PCT International Publication No. WO88 / 09810, published December 15, 1988) or blood-brain barrier (eg, published on April 25, 1988, April 25). PCT International Publication No. WO89 / 10134), hybridization initiation cleavage agents (see, eg, Krol et al., 1988, BioTechiques 6: 958-976) or intercalating agents (eg, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: Additional groups such as 539-549). For this purpose, oligonucleotides may be used in combination with other molecules such as peptides, hybridization-triggered cross-linking agents, transport agents, hybridization triggered cross-linking agents. Or the like.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만, 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 염기 부분을 포함할 수 있다: 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-이오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸 아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2, 2-디메틸구아닌-2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸, 2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세틱 애시드(v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥사아세틸 애시드 메틸에스테르, 우라실-5-옥사아세틱 애시드(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2, 6-디아미노퓨린.Antisense oligonucleotides may include, but are not necessarily limited to, at least one modified base moiety selected from the group consisting of: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethyl aminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, di Hydrouracil, beta-D-galactosylquaosin, inosine, N6-isopentyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2, 2-dimethylguanine-2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methyl Cytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl, 2-thiouracil, beta-D-mannosylquaosine, 5'-methoxycarboxy Methyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentyladenine, uracil -5-oxyacetic acid (v), wybutoxosine, pseudouracil, quaoxin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5- Methyluracil, uracil-5-oxaacetyl acid methylester, uracil-5-oxaacetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) Uracil, (acp3) w, and 2, 6-diaminopurine.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만, 아라비노오스, 2-플루오로아라비노오스, 크실룰로스(xylulose) 및 헥소오스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 당 부분을 포함할 수 있다.Antisense oligonucleotides will include, but are not necessarily limited to, at least one modified sugar moiety selected from the group consisting of arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose and hexose. Can be.

또 다른 실시양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 반드시 이들로 국한되는 것은 아니지만, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포름아세탈 또는 이들이 유사체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 포스페이트 골격 부분을 포함할 수 있다.In another embodiment, antisense oligonucleotides are not necessarily limited to these, but are not limited to phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidothioate, phosphoramidate, phosphoramidate, methylphosphate. At least one modified phosphate backbone moiety selected from the group consisting of phosphates, alkyl phosphoesters and formacetals or analogs thereof.

또 다른 실시양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 α-아노머릭 올리고뉴클레오티드이다. α-아노머릭 통상적인 β-단위와 반대로 올리고뉴클레오티드는 상보적인 RNA와 특수한 이중-가닥 하이브리드를 형성하는데, 가닥들은 서로에 대해 평행하게 주행한다(Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15 : 6625-6641). 올리고뉴클레오티드는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148)이거나 키메라 RNA-DNA 유사체이다(Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).In another embodiment, the antisense oligonucleotide is an α-anomeric oligonucleotide. α-anomeric In contrast to conventional β-units, oligonucleotides form a special double-stranded hybrid with complementary RNA, which strands run parallel to each other (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15). 6625-6641). Oligonucleotides are 2'-0-methylribonucleotides (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 자동화된 DNA 합성기(예를 들어, Applied Biosystems, Biosearch 등으로부터 구매가능한 것과 같은)를 이용함으로써 당업계에 알려진 표준 방법에 합성될 수 있다. 일례로, 포르포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 스타인 등의 방법에 의해 합성될 수 있고(Stein et al., 1988, Nucl. Acids. Res. 16:3209), 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 조정된 포어 글래스 폴리머 서포트의 이용에 의해 만들어질 수 있다(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451).Oligonucleotides of the present invention can be synthesized in standard methods known in the art by using automated DNA synthesizers (eg, such as those available from Applied Biosystems, Biosearch, etc.). In one example, the porothioate oligonucleotides can be synthesized by methods such as Stein et al. (Stein et al., 1988, Nucl. Acids. Res. 16: 3209) and the methylphosphonate oligonucleotides are modified pore. By the use of glass polymer support (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451).

obR 코드화 부위에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 이용될 수는 있지만, 전사된 비해독 부위에 대해 상보적인 것들이 가장 바람직하다. 예를 들어, 하기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명에 따라 이용될 수 있다.Antisense oligonucleotides complementary to the obR coding site can be used, but those complementary to the transcribed non-poisonous site are most preferred. For example, antisense oligonucleotides having the following sequence can be used in accordance with the present invention.

a) 도 3의 뉴클레오티드 -14 내지 +3에 대해 상보적인a) complementary to nucleotides -14 to +3 of FIG.

5'-CATCTTACTTCAGAGAA-3'5'-CATCTTACTTCAGAGAA-3 '

b) 도 3의 뉴클레오티드 -20 내지 +3에 대해 상보적인b) complementary to nucleotides -20 to +3 of FIG.

5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3'5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3 '

c) 도 3의 뉴클레오티드 -26 내지 +3에 대해 상보적인c) complementary to nucleotides -26 to +3 of FIG.

5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3'5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3 '

d) 도 3의 뉴클레오티드 -32 내지 +3에 대해 상보적인d) complementary to nucleotides -32 to +3 of FIG.

5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3'5'-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3 '

e) 도 3의 뉴클레오티드 -29 내지 +6에 대해 상보적인e) complementary to nucleotides -29 to +6 of FIG.

5'-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-35'-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3

f) 도 3의 뉴클레오티드 -29 내지 -1에 대해 상보적인f) complementary to nucleotides -29 to -1 of FIG.

5'-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-35'-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3

g) 도 3의 뉴클레오티드 -29 내지 -7에 대해 상보적인g) complementary to nucleotides -29 to -7 of FIG.

5'-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-35'-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3

h) 도 3의 뉴클레오티드 -29 내지 -13에 대해 상보적인h) complementary to nucleotides -29 to -13 of FIG.

5'-AAGTACACCCATAATCC-35'-AAGTACACCCATAATCC-3

안티센스 분자들은 생체내(예컨대, 맥락막총 및/또는 시상하부)에서 ObR을 발현하는 세포에 전달되어야 한다. 안티센스 DNA 또는 RNA를 세포에 전달하기 위하여 다수의 방법들이 개발되었다: 예컨대, 안티센스 분자는 조직부위에 직접 주입되거나 또는 목적 세포를 표적화하도록 설계된(예컨대, 안티센스가 표적세포 표면에 발현된 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 항체들에 연결된) 변형된 안티센스 분자들이 전신에 투여될 수 있다.Antisense molecules must be delivered to cells expressing ObR in vivo (eg, choroid plexus and / or hypothalamus). A number of methods have been developed for delivering antisense DNA or RNA to cells: for example, antisense molecules can be injected directly into tissue sites or designed to target cells of interest (e.g., with receptors or antigens where antisense is expressed on the target cell surface). Modified antisense molecules (linked to specifically binding peptides or antibodies) can be administered systemically.

그러나, 자주 내성 mRNA의 해독을 억제하는데 충분한 안티센스의 세포내 농도를 달성하는 것은 어렵다. 따라서, 바람직한 접근방법은 안티센스 뉴클레오티드가 강한 pol Ⅲ 또는 pol Ⅱ 프로모터의 조절하에 놓이는 재조합 DNA 구조물을 이용하는 것이다. 환자의 표적세포를 트랜스펙션하기 위해 이러한 구조물을 이용하면 내성 mRNA 전사체와 상보적인 염기쌍을 형성하여 obR mRNA의 해독을 방해하는 충분한 양의 단일가닥 RNA들의 전사를 초래할 것이다. 예를 들어, 하나의 벡터는 그것이 세포에 의해 흡수되어 안티센스 RNA의 전사를 유도하도록 생체내에 도입될 수 있다. 이러한 벡터는 그것이 전사되어 목적 안티센스 RNA를 생산해낼 수 있는한은 에피좀으로 존재하거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계의 표준적인 재조합 DNA 기술에 따라 제작될 수 있다. 벡터들은 플라스미드, 바이러스, 또는 포유동물세포내에서의 복제 및 발현을 위해 이용되는, 당업계에 공지된 그 밖의 것일 수 있다. 안티센스 RNA를 코드화하는 서열의 발현은 포유동물, 바람직하게 사람세포내에서 작용하는 것으로 당업계에 알려진 임의의 프로모터에 의할 수 있다. 이러한 프로모터들은 유동성이거나 항구성일 수 있다. 이러한 프로모터들은 반드시 이들로 국한되는 것는 아니지만 다음을 포함한다: SV4O 조기 프로모터 부위(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 로우스 사르코마 바이러스의 3' 말단 긴 반복부위에 포함된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42) 등. 임의의 유형의 플라스미드, 코드미드, YAC 또는 바이러스 벡터가 직접 조직(예컨대, 맥락막총 또는 시상하부)에 주입될 수 있어 재조합 DNA 구조물을 만드는데 이용될 수 있다. 그렇지 않으면, 목적 조직을 선택적으로 감염시킬 수 있는 바이러스 벡터들이 이용될 수 있다: (예컨대, 뇌의 경우 헤스페르바이러스 벡터들이 이용될 수 있다), 이 경우에, 투여는 다른 경로를 통해 이루어질 수 있다(예컨대, 전신적으로).However, it is often difficult to achieve intracellular concentrations of antisense sufficient to inhibit the translation of resistant mRNAs. Thus, a preferred approach is to use recombinant DNA constructs in which antisense nucleotides are placed under the control of strong pol III or pol II promoters. Using these constructs to transfect target cells of a patient will form base pairs complementary to resistant mRNA transcripts resulting in the transcription of a sufficient amount of single-stranded RNAs that interfere with the translation of obR mRNA. For example, one vector can be introduced in vivo such that it is taken up by the cell to induce transcription of antisense RNA. Such vectors may be present as episomes or incorporated into chromosomes as long as they can be transcribed to produce the desired antisense RNA. Such vectors can be constructed according to standard recombinant DNA techniques in the art. Vectors can be plasmids, viruses, or anything else known in the art used for replication and expression in mammalian cells. Expression of the sequences encoding antisense RNA can be by any promoter known in the art to act in mammals, preferably human cells. Such promoters may be fluid or permanent. These promoters include, but are not necessarily limited to: SV4O early promoter sites (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), promoters included in the 3 'terminal long repeat of Loose Sarcoma virus. (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), metallothionein gene Regulatory sequences (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42) and the like. Any type of plasmid, codemid, YAC or viral vector can be injected directly into tissue (eg, choroid plexus or hypothalamus) and used to make a recombinant DNA construct. Otherwise, viral vectors may be used that can selectively infect the tissue of interest (eg, hespervirus vectors may be used in the brain), in which case administration may be via other routes. (Eg systemically).

obR mRNA 전사체를 효소적으로 절단하도록 설계된 리보자임 분자(rybozyme)들도 obR mRNA의 전사 및 ObR의 발현을 억제하기 위해 이용될 수 있다. (예컨대, 1990년 10월 4일에 공개된, 국제공개 제 WO90/11364호 ; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225 참조). 특이적인 인식서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 obR mRNA를 파괴하기 위해 이용될 수 있지만, 헤머헤드 리보자임(hammerhead ribozyme)을 이용하는 것이 바람직하다. 헤머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 플랭킹 부위에 의해 정해지는 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 전제조건은 표적 mRNA가 다음과 같은 두 염기의 서열을 갖는다는 것이다: 5'-UG-3'. 헤머헤드 리보자임의 제작 및 생산은 당업계에 잘 알려져 있으며 Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591에 더욱 자세하게 기술되어 있다. 사람 obR cDNA(도 3)의 뉴클레오티드 서열내에는 수 백개의 잠재적인 헤머헤드 리보자임 절단부위가 존재한다. 바람직하게, 리보자임은 절단 인식부위가 obR mRNA의 5' 말단에 근접하여 위치하도록; 즉, 효율을 증가시키고 비-기능성 mRNA 전사체들의 세포내 축적을 최소화하도록 유전자조작된다.Ribozymes molecules designed to enzymatically cleave obR mRNA transcripts can also be used to inhibit transcription of obR mRNA and expression of ObR. (See, eg, International Publication No. WO90 / 11364; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225, published October 4, 1990). Ribozymes that cleave mRNA in specific recognition sequences can be used to destroy obR mRNA, but it is preferred to use a hammerhead ribozyme. Hemerhead ribozymes cleave mRNA at positions defined by flanking sites that form base pairs complementary to the target mRNA. The only prerequisite is that the target mRNA has a sequence of two bases: 5'-UG-3 '. The production and production of Hammerhead ribozymes is well known in the art and described in more detail in Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. There are hundreds of potential hammerhead ribozyme cleavage sites in the nucleotide sequence of human obR cDNA (FIG. 3). Preferably, the ribozyme is such that the cleavage recognition site is located close to the 5 'end of the obR mRNA; That is, engineered to increase efficiency and minimize intracellular accumulation of non-functional mRNA transcripts.

예를 들어, 다음과 같은 서열을 갖는 헤머헤드 리보자임들이 본 발명에 따라 이용될 수 있다:For example, Hammerhead ribozymes having the following sequence can be used in accordance with the present invention:

a) 도 3의 뉴클레오티드 -1과 1 사이의 사람 obR mRNA를 절단하는a) cleaving human obR mRNA between nucleotides -1 and 1 of FIG.

5'-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUACUUCAGAGAA-3'5'-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUACUUCAGAGAA-3 '

b) 도 3의 뉴클레오티드 -175과 -176 사이를 절단하는b) cleaving between nucleotides -175 and -176 of FIG.

5'-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGACCGGCUCGUG-3'5'-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGACCGGCUCGUG-3 '

c) 도 3의 뉴클레오티드 102과 103 사이를 절단하는c) cleaving between nucleotides 102 and 103 of FIG.

5'-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCCAAGGAGUAA-3'5'-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCCAAGGAGUAA-3 '

d) 도 3의 뉴클레오티드 994와 995 사이를 절단하는d) cleaving between nucleotides 994 and 995 of FIG.

5'-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGACACG-3'5'-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGACACG-3 '

e) 도 3의 뉴클레오티드 2142와 2143 사이를 절단하는e) cleaving between nucleotides 2142 and 2143 of FIG.

5'-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAACCGUAACAGUAUGU-3'5'-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAACCGUAACAGUAUGU-3 '

f) 도 3의 뉴클레오티드 2736과 2737 사이를 절단하는f) cleaving between nucleotides 2736 and 2737 of FIG.

5'-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAA5'-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAA

GAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3'GAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3 '

g) 도 3의 뉴클레오티드 3492와 3493 사이를 절단하는g) cleaving between nucleotides 3492 and 3493 of FIG.

5'-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAG5'-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAG

UUAGGUCACACAUC-3'UUAGGUCACACAUC-3 '

h) 도 3의 뉴클레오티드 3521과 3522 사이를 절단하는h) cleaving between nucleotides 3521 and 3522 of FIG.

5'-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGU5'-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGU

UUCUUC-3'UUCUUC-3 '

본 발명의 리보자임들은 테트라하이메나 써모필리아에서 자연적으로 존재하고(IVS, 또는 L-19 IVS RNA로 알려진) 토마스 세크 및 그의 동료들에 의해 자세하게 기술된 것과 같은 RNA 엔도리보뉴클레아제(이하에서 "세크-형 리보자임(Cech-type rybozyme)"이라 한다)도 포함한다(Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578 ; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; University Patents Inc.의 국제공개 제 WO 88/04300호 ; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). 세크-타입 리조자임들은 표적 RNA 서열에 혼성화하여 표적 RNA를 절단시키는 8 염기쌍 활성부위를 포함한다. 본 발명은 obR에 존재하는 8-염기쌍 활성부위를 표적화하는 세크-타입 리보자임들도 포함한다.The ribozymes of the present invention are naturally present in tetrahime or thermophilia (known as IVS, or L-19 IVS RNA) and RNA endoribonucleases as described in detail by Thomas Seck and colleagues. Also referred to as "Cech-type rybozyme" (Zaug, et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429-433; International Publication No. WO 88/04300 by University Patents Inc .; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216). Secret-type regiozymes include an 8 base pair active site that hybridizes to a target RNA sequence to cleave the target RNA. The present invention also includes sec-type ribozymes that target the 8-base pair active site present in obR.

안티센스 접근방법에서와 마찬가지로, 리보자임들은 예컨대, 향상된 안정성, 표적능력 등을 위해 변형된 올리고뉴클레오티드들로 구성될 수 있고, 생체내, 예컨대, 맥락막총 및/또는 시상하부에서 ObR을 발현하는 세포로 전달되어야 한다. 바람직한 배송방법은 강한 항구성 pol Ⅲ 또는 pol Ⅱ 프로모터의 조절하에 놓이는, 리보자임을 "코드화"하는 DNA 구조물을 이용하는 것을 포함하는데, 이로써 트랜스펙션된 세포들은 충분한 양의 리보자임을 생산하여 내성 obR 메시지를 파괴하고 해독을 억제할 것이다. 리보자임들은 안티센스 분자들과 달리, 촉매성이기 때문에, 낮은 세포내 농도가 효율상 요구된다.As in the antisense approach, ribozymes can be composed of modified oligonucleotides, for example, for improved stability, targetability, etc., and are directed to cells expressing ObR in vivo, such as the choroid plexus and / or hypothalamus. Must be communicated. Preferred delivery methods include the use of DNA constructs that "code" ribozymes, which are placed under the control of strong endurance pol III or pol II promoters, whereby the transfected cells produce a sufficient amount of ribozyme to produce a resistant obR message. Will destroy and detoxify. Because ribozymes are catalytic, unlike antisense molecules, low intracellular concentrations are required for efficiency.

내성 obR 유전자 발현은 obR 유전자 또는 그의 프로모터를 표적화 상동재조합을 이용하여 불활성화하거나 또는 " 녹-아웃"함으로써 감소될 수 있다. (예컨대, Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234 ; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51 :503-512 ; Thompson et al., 1989 Cell 5:313-321 참조; 각각 전문이 본원에 첨부자료로 첨부). 예를 들어, 생체내에서 ObR을 발현하는 세포를 트랜스펙션하기 위해서, 선택가능한 마커 및/또는 네거티브 선택 마커를 갖거나 갖지 않는, 내성 obR 유전자(obR 유전자의 코드화 부위 또는 조절부위)에 대한 DNA 상동물에 의해 측접된 돌연변이, 비-기능성 ObR(또는 완전히 무관한 DNA)이 이용될 수 있다. 표적화 상동재조합을 통한 DNA 구조물의 삽입은 obR 유전자의 불활성화를 초래한다. 이러한 접근방법은 ES 세포(배간세포)에 대한 변형이 불활성화 ObR을 갖는 동물 새끼를 만드는데 이용될 수 있는 농업분야에 특히 적합하다 (예컨대, Thomas & Capecchi, 1987 및 Thompson, 1989, 상술한 문헌 참조). 그러나, 이러한 접근방법은 사람에 적용될 수 있도록 개량될 수 있다.Resistant obR gene expression can be reduced by inactivating or "knock-out" the obR gene or its promoter using targeting homologous recombination. (See, eg, Smithies et al., 1985, Nature 317: 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5: 313-321; each incorporated herein in its entirety. Attached as material). For example, to transfect cells expressing ObR in vivo, DNA for an resistant obR gene (coding region or regulatory region of the obR gene), with or without a selectable marker and / or negative selection marker Mutations flanking by a mammal, non-functional ObR (or completely irrelevant DNA) can be used. Insertion of the DNA construct through targeting homologous recombination results in inactivation of the obR gene. This approach is particularly suitable for the agricultural sector where modifications to ES cells (germ cells) can be used to produce animal litters with inactivated ObR (see, eg, Thomas & Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, supra). ). However, this approach can be modified to be applicable to humans.

재조합 DAN 구조물이 직접 투여되거나, 예컨대, 뇌 조직에 배송하기 위한 헤르페스 바이러스 벡터와 같은 적당한 바이러스 벡터를 이용함으로써 생체내 필요 부위(예컨대, 시상하부 및/또는 맥락막총)에 표적화된다면 사람에서 이용할 수 있게 개량될 수 있다.Recombinant DAN constructs may be made available to humans if administered directly or if they are targeted to a site of interest (eg hypothalamus and / or choroid gun) in vivo by using a suitable viral vector, such as a herpes viral vector for delivery to brain tissue. Can be improved.

다른 방법으로, 내성 obR 유전자 발현은 obR 유전자의 조절부위(즉, obR 프로모터 및/또는 인헨서)에 대해 상보적인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 체내의 표적세포에서의 obR 유전자의 전사를 방해하는 삼중나선구조를 형성하도록 표적화함으로써 감소될 수 있다 (일반적으로, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann, N.Y. Accad. Sci., 660:27-36; 및 Maher, L.J., 1992, Bioassays, 14(12):807-15).Alternatively, resistant obR gene expression may be characterized by a triple helix that interferes with the transcription of the obR gene in target cells in the body by deoxyribonucleotide sequences complementary to the regulatory regions of the obR gene (ie, the obR promoter and / or enhancer). Can be reduced by targeting to form structures (generally, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6): 569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann, NY Accad. Sci., 660: 27-36; and Maher, LJ, 1992, Bioassays, 14 (12): 807-15).

본 발명의 또 다른 실시양태에 있어서, ObR의 활성은 체중을 증가시키기 위한 "도미넌트 네거티브(dominant negative)" 접근방법을 이용하여 감소될 수도 있다. 이러한 목적을 위하여, 결함이 있는 ObR을 코드화하는 구조물들이 적당한 표적 세포에서의 ObR 활성을 감소시키는 유전자요법적 접근방법에 이용될 수 있다. 예를 들어, CD(도 1의 아미노산 잔기 번호 861-894; 도 6 아미노산 잔기 번호 861-1162; 또는 도 3 아미노산 잔기 번호 863-1165) 또는 CD의 일부(박스 1 Jak 상호작용 서열; 도 1 및 도 6, 아미노산 잔기 861-884; 또는 도 3, 아미노산 잔기 863-886)가 결실되거나 돌연변이된, ObR의 숙주세포 발현을 지시하는 뉴클레오티드 서열들이 맥락막총 또는 시상하부의 세포내에 도입될 수 있다(상술한 생체내 또는 생체외 유전자 치료방법에 의해). 대안으로, 표적화 상동 재조합은 이러한 결실 또는 돌연변이를 대상의 시상하부 또는 맥락막총내의 내성 obR 유전자내에 도입하기 위해 이용될 수 있다. 유전자조작된 세포들은 비-기능성 수용체(즉, 그의 천연리간드에는 결합할 수 있지만, 신호변환은 할 수 없는 부착된 수용체)를 발현할 것이다. 맥락막총 또는 시상하부에 존재하는 이러한 유전자 조작된 세포들은 내성 Ob 리간드에 대해 감소된 반응을 나타내어 체중을 증가시켜야만 한다.In another embodiment of the present invention, the activity of ObR may be reduced using a "dominant negative" approach to gain weight. For this purpose, constructs encoding defective ObR can be used in genetic therapy approaches to reduce ObR activity in suitable target cells. For example, a CD (amino acid residue number 861-894 of FIG. 1; FIG. 6 amino acid residue number 861-1162; or FIG. 3 amino acid residue number 863-1165) or a portion of a CD (Box 1 Jak interaction sequence; FIG. 1 and 6, amino acid residues 861-884; or FIG. 3, amino acid residues 863-886) may be introduced into the choroid plexus or hypothalamus cells that direct host cell expression of ObR, deleted or mutated (described above). By in vivo or ex vivo gene therapy). Alternatively, targeted homologous recombination can be used to introduce such deletions or mutations into the resistant obR gene in the hypothalamus or choroid plexus of the subject. The engineered cells will express non-functional receptors (i.e., attached receptors that can bind to their natural ligands but cannot signal transduction). These genetically engineered cells present in the choroid plexus or hypothalamus must exhibit reduced response to resistant Ob ligands to increase body weight.

2. 체중손실을 촉진하기 위한 obR 발현 또는 활성의 회복 또는 증가2. Restoration or increase in obR expression or activity to promote weight loss

정상 obR 유전자 발현의 수준 및/또는 obR 유전자 산물 활성상의 증가와 관련하여, obR 핵산 서열들이 비만증을 포함하는 체중장애의 치료에 이용될 수 있다. 비만의 원인이 결함있는 ObR인 경우에, 치료는 예를 들어, 유전자 대체 요법(gene replacement therapy)의 형태로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 정상적인 기능을 시현하는 obR 유전자 산물의 생산을 유도하는 정상 obR 유전자 또는 obR 유전자의 일부분의 하나 이상의 사본들이, 리포좀과 같은, DNA를 세포내로 도입하는 다른 입자들이외에, 아데노-결합 바이러스, 레트로바이러스 및 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만 반드시 이들로 제한되는 것은 아닌 벡터들을 이용함으로써 환자 또는 동물 대상내의 적당한 세포내에 삽입될 수 있다.With regard to the level of normal obR gene expression and / or an increase in obR gene product activity, obR nucleic acid sequences can be used to treat weight disorders, including obesity. If the cause of obesity is a defective ObR, treatment can take place, for example, in the form of gene replacement therapy. Specifically, one or more copies of the normal obR gene or a portion of the obR gene that induces the production of an obR gene product that exhibits a normal function, besides other particles that introduce DNA into the cell, such as liposomes, By using vectors including, but not necessarily limited to, retroviral and herpes viral vectors, they can be inserted into appropriate cells in a patient or animal subject.

obR 유전자는 맥락막총 및 시상하부를 포함하는 뇌에서 발현되기 때문에, 이러한 유전자대체요법 기술은 obR 유전자 서열들을 환자내의 이러한 세포유형에 배송할 수 있어야만 한다. 따라서, obR 유전자 서열들을 배송하는 기술이 혈액-뇌 장벽을 쉽게 횡단할 수 있도록 설계되어야 하는데, 이들은 당업자들에게 잘 알려져 있다(예컨대, 본원에 첨부된 국제공개 제 WO89/10134호 참조). 또는 이러한 기술들은 obR 유전자 서열을 obR 유전자 서열이 발현될 세포의 부위에 대한 직접적인 투여를 포함해야 한다. 그렇지 않으면, 표적화 상동 재조합은 적당한 조직: 예컨대, 맥락막총 및/또는 시상하부내의 결함있는 내성 obR 유전자를 보정하는데 이용될 수 있다. 동물에서, 표적화 상동재조합은 보정된 형질을 갖는 자손을 만들기 위해서 ES 세포상의 결함을 바로잡는데 이용될 수 있다.Because the obR gene is expressed in the brain, including the choroid plexus and hypothalamus, this replacement therapy technique must be able to deliver the obR gene sequences to this cell type in the patient. Therefore, techniques for delivering obR gene sequences should be designed so that they can easily cross the blood-brain barrier, which are well known to those skilled in the art (see, eg, WO 89/10134, appended hereto). Or these techniques should include direct administration of the obR gene sequence to the site of the cell where the obR gene sequence is to be expressed. Alternatively, targeted homologous recombination can be used to correct defective resistant obR genes in suitable tissues such as choroid plexus and / or hypothalamus. In animals, targeting homologous recombination can be used to correct defects on ES cells to produce offspring with corrected traits.

obR 유전자 발현 및/또는 ObR 활성의 전체적인 수준을 증가시키는데 이용될 수 있는 추가적인 방법들은 적당한 ObR-발현 세포들, 바람직하게 자기이식 세포(autologous cell)를 환자에게 비만증을 포함하는 체중장애의 증상들을 개선하는데 충분한 위치에 충분한 수로 도입하는 것을 포함한다. 이러한 세포들은 재조합 세포이거나 또는 비-재조합 세포일 수 있다. 환자의 전체적인 obR 유전자 발현 수준을 증가시키기 위해 투여될 수 있는 세포들 중에는 정상 세포, 특히 obR 유전자를 발현하는 맥락막총 또는 시상하부 세포가 있다. 세포들은 뇌의 해부학적 위치에 투여되거나 체내의 다른 위치에 위치한 조직 이식 절편의 일부로 투여될 수 있다. 이러한 세포-기초 유전자 치료 기술은 당업자들에게 잘 알려져 있는데, 예를 들어, Anderson등의 미국특허 제 5,399,349호 ; Mulligan & Wilson, 미국특허 제 5,460,959호를 참조할 수 있다.Additional methods that can be used to increase the overall level of obR gene expression and / or ObR activity improve the symptoms of weight disorders, including obesity in patients with appropriate ObR-expressing cells, preferably autologous cells. To introduce a sufficient number of locations in a sufficient position. Such cells can be recombinant cells or non-recombinant cells. Among the cells that can be administered to increase the overall obR gene expression level in a patient are normal cells, particularly choroid plexus or hypothalamus cells expressing the obR gene. The cells may be administered at an anatomical location in the brain or as part of a tissue graft section located at another location in the body. Such cell-based gene therapy techniques are well known to those skilled in the art, see, for example, US Pat. No. 5,399,349 to Anderson et al .; See Mulligan & Wilson, US Pat. No. 5,460,959.

끝으로, 상술한 분석방법에 의해 동정된, 예를 들어, ObR 폭포에서 하향 신호 단백질(downstream signalling proteins)을 활성화하여 결함있는 ObR을 극복할 수 있게 함으로써, 활성화된 ObR에 의해 변환된 신호를 자극하거나 활성화하는 화합물들이 체중을 줄이기 위해 이용될 수 있다. 투여 제형 및 방법은 화합물의 물리-화학적 특성에 의존한다. 투여는 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있게 하는 공지기술을 포함해야 한다.Finally, the signal transformed by the activated ObR can be stimulated by activating downstream signaling proteins identified in the analytical method described above, for example, by activating downstream signaling proteins in the ObR cascade. Or activating compounds can be used to lose weight. Dosage formulations and methods depend on the physico-chemical properties of the compounds. Administration should include known techniques that allow for crossing the blood-brain barrier.

G. 약제 조제 및 투여 방법G. Preparation and Administration

obR 유전자 발현 또는 ObR 활성에 영향을 미치는 것으로 확인된 화합물들은 비만증, 카헥시 및 식욕부진을 포함하는 체중장애의 치료 또는 개선을 위해 치료유효 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료 유효 용량이란 체중장애의 증상들을 개선하는데 충분한 화합물의 양을 의미한다.Compounds found to affect obR gene expression or ObR activity can be administered to a patient at a therapeutically effective dose for the treatment or amelioration of weight disorders including obesity, carhexi and anorexia. By therapeutically effective dose is meant an amount of the compound sufficient to ameliorate the symptoms of weight disorder.

1. 유효 용량1. Effective capacity

그러한 화합물들의 독성 및 치료효능은 세포배양 및 실험동물에서의 표준제약과정에 의하여 결정될 수 있는 바, 즉 LD₅₀(50% 치사량)및 ED₅₀(50% 치료유효량)을 결정하는 것이다. 독성 및 치료효과 사이의 용량비는 치료지수이고, 이 지수는 LD₅₀/ED₅₀으로 표현될 수 있다. 치료지수가 큰 화합물이 우선 선택된다. 독성부작용을 보이는 화합물이 사용될 수 있는데, 그러한 화합물을 목표한 조직부위로 전달시키는 시스템을 설계하는데 있어서는 감염되지 않은 세포의 손상가능성을 최소화하고 그럼으로써 부작용을 줄일 수 있도록 주의가 요망된다.The toxicity and therapeutic efficacy of such compounds can be determined by cell cultures and standard pharmaceutical procedures in experimental animals, ie, to determine LD ₅₀ (50% lethal dose) and ED ₅₀ (50% therapeutically effective dose). The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index, which can be expressed as LD ₅₀ / ED ₅₀ . Compounds with a high therapeutic index are selected first. Compounds that exhibit toxic side effects can be used, and care should be taken in designing systems that deliver such compounds to the target tissue site to minimize the likelihood of damage to uninfected cells and thereby reduce side effects.

세포배양시험 및 동물연구에서 획득한 자료들은 사람이 복용하는데 있어서 용량의 범위를 정하는데 이용될 수 있다. 그러한 화합물 용량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 보이지 않는 ED₅₀농도의 범위 내에 있다. 이러한 범위내에서 용량은 복용형태 및 투여경로에 따라 다양하다. 본 발명의 방법에서 사용된 화합물들에 있어서, 치료효능 용량은 초기에 세포배양시험에서 측정할 수 있다. 용량은 세포배양에서 결정된 것과 같이 IC₅₀(50% 억제농도)을 포함하는 플라즈마(plasma) 농도범위에서 동물모델에 정형화될 수 있다. 그러한 정보는 사람에 있어서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 플라즈마 수준은 HPLC 등에 의해 결정될 수 있다.Data obtained from cell culture studies and animal studies can be used to determine the range of doses for human use. Such compound doses are preferably in the range of ED ₅₀ concentrations showing little or no toxicity. Within this range, the dosage will vary depending on the dosage form and route of administration. For the compounds used in the methods of the invention, the therapeutically effective dose can be measured initially in cell culture tests. Doses may be formulated in animal models in the plasma concentration range including IC ₅₀ (50% inhibitory concentration) as determined in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses for humans. Plasma levels can be determined by HPLC and the like.

2. 제형화 및 용법2. Formulation and Usage

본 발명에 따라 복용하기 위한 제약적 조성은 하나 이상의 생리학적으로 수용 가능한 담체나 부형제(exipient)을 사용하여 종래의 방법에 의하여 형성된다.Pharmaceutical compositions for taking in accordance with the present invention are formed by conventional methods using one or more physiologically acceptable carriers or excipients.

그러므로, 그 화합물들과 그들의 생리학적으로 수용 가능한 염이나 용매는 흡입(inhalation) 또는 취입(insufflation)(입 또는 코를 통하여), 혹은 경구(oral), 구강(buccal), 비경구적 또는 직장(rectal)으로 투여하기 위하여 형성된다.Therefore, the compounds and their physiologically acceptable salts or solvents may be inhalation or insufflation (through the mouth or nose), oral, buccal, parenteral or rectal. ) For administration.

경구투여에 있어서, 약제 조성물은 결합제 [예, 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 하이드로시프로필 메틸셀룰로오즈(hydroxypropyl methycellulose)]; 충전제(fillers) [예, 락토오즈, 마이크로크리스탈린 셀룰로오즈(microcrystalline cellulose) 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트(calcium hydrogen phosphate)]; 윤활유 [예, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc) 또는 실리카(silica)]; 정제분해제(disintegrants) [예, 감자전분 또는 소듐 스타취 글리콜레이트(sodium starch glycolate)]; 또는 습윤제 [예, 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulphate)]와 같은 제약적으로 허용가능한 부형제와 함께 종래의 방법에 의하여 마련된 알약이나 캡슐의 형태로 할 수 있다. 알약은 종래에 잘 알려진 방법에 의하여 코팅된다. 경구투여를 위한 액상 조제는 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있으며 또는 물이나 기타 적절한 매질과 함께 복용하기 위하여 건조한 형태로 제공될 수 있다. 상기 액상 조제는 현탁제[예, 소비톨 시럽(sorbitol syrup), 셀룰로오즈 유도체 또는 식용경화유(hydrogenated edible fat)]; 유화제 [예, 레시딘(lecithin) 또는 아카시아(acacia)]; 비수용성매질 [예, 알몬드 오일(almond oil), 오일리 에스터(oily esters), 에틸 알코올 또는 분류된 식물기름(fractionated vegetable oils)]; 그리고 방부제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트(propyl-p-hydroxybenzoates) 또는 소빅산(sorbic acid)] 등 첨가물과 함께 종래의 방법에의하여 제조될 수 있다. 조제는 또한 완충염, 향료, 착색 그리고 감미료를 적당량 함유할 수 있다.For oral administration, the pharmaceutical composition may comprise a binder (eg, pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methycellulose); Fillers (eg, lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); Lubricating oils (eg, magnesium stearate, talc or silica); Disintegrants (eg, potato starch or sodium starch glycolate); Or in the form of pills or capsules prepared by conventional methods together with pharmaceutically acceptable excipients such as wetting agents (eg, sodium lauryl sulphate). Pills are coated by methods well known in the art. Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or may be provided in dry form for use with water or other suitable medium. The liquid preparations include suspending agents (eg, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); Emulsifiers (eg, lecithin or acacia); Water-insoluble media (eg, almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); And preservatives (e.g. methyl or propyl-p-hydroxybenzoates or sorbic acid), such as additives. May contain appropriate amounts of flavorings, colorings and sweeteners.

경구투여를 위한 조제는 활성화합물을 통제 방출하기 위하여 적당하게 형성한다.Formulations for oral administration are suitably formed to provide controlled release of the active compound.

구강(buccal) 투여에 있어서 종래의 방식에 의하여 형성된 알약이나 로젠지(lozenges)와 같은 형태를 취할 수 있다.In buccal administration, it may take the form of pills or lozenges formed by conventional methods.

흡입에 의한 투여에 있어서, 본 발명에 따른 복용을 위한 화합물은 압축팩 또는 네불라이저(nebulizer)로부터 적절한 추진제, 예를 들면 디클로로테트라플루로로메텐, 카본 다이옥사이드 또는 기타 적당한 가스를 사용하여, 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 압축 에어로졸의 경우에 용량 단위는 밸브를 제공함으로써 결정된다. 흡입기나 취입기 사용을 위한 젤라틴 등의 캡슐과 카트리지는 상기 화합물과 락토오즈나 전분과 같은 적당한 분말 분말혼합물을 함유하여 형성된다.For administration by inhalation, the compounds for administration according to the invention are sprayed with aerosols using a suitable propellant, such as dichlorotetrafluoromerotene, carbon dioxide or other suitable gas, from a compression pack or nebulizer. It is conveniently delivered in the form. In the case of a compressed aerosol the dosage unit is determined by providing a valve. Capsules and cartridges, such as gelatin, for inhaler or blower use are formed by containing the compound and a suitable powder powder mixture such as lactose or starch.

본 발명의 화합물은 주사에 의한 비경구적 투여, 예를 들면 볼러스(bolus) 주사 또는 연속적인 주입을 위해 형성될 수 있다. 주사를 위해서는 단위용량형식으로 제공될 수 있는 바, 예를 들면 앰플이나 다용량컨테이너 형태로 첨가조제와 함께 제공될 수 있다. 본 합성물은 유질 또는 수용성 매질속에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정제 그리고/또는 분산제와 같은 형성제재를 함유한다. 한편, 활성조성물은 적당한 매질, 예를 들어 파이로젠이 제거된 멸균수와 함께 복용하기 위해 분말 형태로 제공될 수 있다.The compounds of the present invention may be formed for parenteral administration by injection, for example bolus injection or continuous infusion. It may be provided in unit dosage form for injection, for example in the form of ampoules or multidose containers, together with additives. The present compositions may take the form of suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous media and contain forming agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. On the other hand, the active composition may be provided in powder form for administration with a suitable medium, for example, sterile water from which pyrogen has been removed.

또한 본 화합물은 좌약, 관장제(retention anemas)같은 직장약으로 형성될 수 있는데, 이때에는 코코아 버터 또는 기타 글리세라아드와 같은 종래의 좌약을 함유한다.The compounds may also be formed as rectal medications, such as suppositories, retention anemas, which contain conventional suppositories such as cocoa butter or other glycerin.

상술한 형성방법에 더하여, 본 화합물은 또한 디포트(depot) 조제로도 형성될 수 있다. 그러한 장기 활성포뮬레이션은 이식(예를 들면 피하 혹은 근육내로의) 또는 근육주사(intramuscular injection)에 의하여 투여될 수 있다. 그러므로 예를 들어 본 화합물은 적절한 폴리머릭 또는 소수성 물질(예를 들어 적절한 오일에서의 유제) 또는 이온교환수지와 함께 형성될 수 있으며 또는 용해성 유도체, 용해염의 형태로 형성될 수 있다.In addition to the formation methods described above, the present compounds may also be formed as depot preparations. Such long acting formulations may be administered by implantation (for example subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. Thus, for example, the compounds may be formed with suitable polymeric or hydrophobic materials (eg emulsions in suitable oils) or ion exchange resins or in the form of soluble derivatives, dissolved salts.

본 화합물은 바람직하게는 활성성분을 함유한 하나 또는 그 이상의 단위 조제약을 포함하는 팩이나 분무기구로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면 블리스터(blister) 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일로 구성된다. 팩이나 분무기구에는 투여안내문을 첨부한다.The compound may preferably be provided in a pack or spray device comprising one or more unit preparations containing the active ingredient. The pack consists of a metal or plastic foil, for example a blister pack. Attach the dosing instructions to the pack or spray device.

Ⅵ. 실시예: obR의 제자리(in situ) 위치측정Ⅵ. Example: In situ Positioning of obR

여기에 제시된 실시예는 포유동물의 맥락막총조직(choroid plexus tissue)에서 Ob수용체에 높은 친화도를 보이는 Ob(랩틴)-AP [Ob(leptin)-alkaline phosphatase] 융합단백질을 가지고 결합연구를 통해 증명하였다. 더 나아가 관찰된 융합단백질 결합은 Ob-특이적이며, 비특이적 알칼라인 포스파타아제 자극에 의하여 조직속에서 생성되는 것(artifact)이 아님이 증명하였다.The examples presented here are demonstrated by binding studies with an Ob (laptin) -AP [leptin) -alkaline phosphatase] fusion protein that exhibits high affinity for Ob receptors in choroid plexus tissue in mammals. It was. Furthermore, the observed fusion protein binding proved to be Ob-specific and not to be produced in tissue by nonspecific alkaline phosphatase stimulation.

A. 재료 및 방법A. Materials and Methods

Ob-알칼라인 포스파타아제 융합단백질의 구성 및 발현Construction and Expression of Ob-Alkaline Phosphatase Fusion Protein

두 종류의 융합단백질이 생성되었다. 특이적으로 Ob-AP 융합단백질은 AP 부위가 융합단백질의 카복실 말단에 위치하고, AP-Ob 융합단백질은 AP 부위가 융합단백질의 아미노 말단에 위치한다.Two kinds of fusion proteins were produced. Specifically, in the Ob-AP fusion protein, the AP site is located at the carboxyl terminus of the fusion protein, and the AP-Ob fusion protein is located at the amino terminus of the fusion protein.

마우스와 사람의 Ob-AP 및 AP-Ob 융합단백질을 생성하기 위하여, cDNA 서열이 표준 PCR (polymerase chain reaction)방법으로 증폭되었다. 마우스 및 사람의 Ob-AP 융합에 있어서, 마우스의 전체 개방리딩프레임 (open reading frames) 및 사람의 Ob를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 각각 대응하는 cDNA로부터 증폭되었다. 증폭프라이머의 말단에 위치한 제한부위는 HindⅢ 및 BamHⅠ(마우스)으로 절단하고 APtag-2의 HindⅢ-Bg1Ⅱ 폴리링커 부위 사이 또는 HindⅢ-Bg1Ⅱ(사람)으로 삽입한 다음, APtag-2의 Bg1Ⅱ 부위로 삽입되었다. 마우스와 사람의 AP-Ob 융합구조에 있어서, AP 분자와 자신의 시그널 펩타이드를 발현하는 새로운 AP 융합벡터 가 APtag-2의 HindⅢ와 XhoⅠ사이의 서열을 태반의 알칼라인 포스파타아제(시그널 서열을 포함한다)의 PCR 증폭된 서열로 대체함으로써 처음 생성되었다(APtag-3). Bg1Ⅱ부위는 이 부위로 도입된 융합이 AP 단백질과 인프레임 되도록 놓여진다. 예견된 완결형태의 마우스 및 사람의 Ob 서열은 대응하는 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 증폭 프라이머 말단의 제한부위는 BamHⅠ과 Bg1Ⅱ로 절단되고 APTAG-3의 Bg1Ⅱ 부위로 삽입된다.To generate Ob-AP and AP-Ob fusion proteins in mice and humans, cDNA sequences were amplified by standard PCR (polymerase chain reaction) methods. In mouse and human Ob-AP fusions, the entire open reading frames of the mouse and the nucleotide sequences encoding human Ob were amplified from the corresponding cDNAs, respectively. The restriction sites located at the ends of the amplification primers were cut with HindIII and BamHI (mouse) and inserted between HindIII-Bg1II polylinker sites of APtag-2 or HindIII-Bg1II (human), and then inserted into Bg1II sites of APtag-2. . In the mouse-human AP-Ob fusion structure, a new AP fusion vector expressing an AP molecule and its signal peptide includes an alkaline placental phosphatase (signal sequence) of the placenta between HindIII and XhoI of APtag-2. Was first generated by replacement with a PCR amplified sequence (APtag-3). The Bg1II site is placed so that the fusion introduced into this site is in-frame with the AP protein. The predicted final mouse and human Ob sequences are PCR amplified from the corresponding cDNA. The restriction sites at the ends of the amplification primers were cleaved into BamHI and Bg1II and inserted into the Bg1II site of APTAG-3.

각 플라스미드는 순간적으로 COS-7 세포 (11.25 ㎍/150 mm 플레이트)로 트랜스펙트 된다. 3일 동안 조절배지에서 배양한 다음 원심분리후 0.45㎛ 필터로 여과하고 4℃ 20mM Hepes (pH 7.0)와 0.05% 소듐 아자이드에 저장한다. 호모아르기닌(homoarginine)이 모든 시험에서 제외된 것 외에 조절배지의 AP 활성을 플라나겐과 레더에 의해 기술된 방법에 따라 96-웰 플레이트 판독기로 테스트하고 정량한다(Flanagan, J.G. and Leder, P., 1990, Cell 63:185-194).Each plasmid is instantaneously transfected with COS-7 cells (11.25 μg / 150 mm plate). After culturing in a control medium for 3 days, centrifuged, filtered through a 0.45㎛ filter and stored in 4 ℃ 20mM Hepes (pH 7.0) and 0.05% sodium azide. In addition to the exclusion of homoarginine from all tests, the AP activity of the control medium is tested and quantified in a 96-well plate reader according to the methods described by Planagen and Leather (Flanagan, JG and Leder, P., 1990, Cell 63: 185-194).

제자리(IN situ) 융합단백질 결합. 마우스 뇌를 사등분하고 맥락막총을 분리하여 세포와 세포주를 12-웰 플레이트에서 HBHA로 한번 세정한다. 그 다음 조직을 Ap-Ob 융합, Ob-AP 융합을 함유한 조직배양 부유액 또는 대조부유액(예를 들어, 융합되지 않은 AP만 함유한 부유액, AP-Ob 및 Ob-AP 융합단백질과 E.coli 재조합 Ob 의 80배 몰을 함유한 부유액, 모조트랜스펙트 COS 세포 부유액)과 함께 75분 동안 부드럽게 회전시키며 실내온도에서 배양한다. 그 다음 시료를 종래에 기술된 방법으로 처리한다 (Cheng, H.J. and Flanagan, J.G., 1994, Cell 79:157-168).IN situ fusion protein binding. The mouse brain is divided into quarters and the choroid plexus is separated to wash cells and cell lines once with HBHA in 12-well plates. The tissue is then subjected to Ap-Ob fusion, tissue culture suspensions containing Ob-AP fusion or control suspensions (e.g., suspensions containing only unfused AP, AP-Ob and Ob-AP fusion proteins and E. coli recombination). Incubate at room temperature with gentle rotation for 75 min with suspension containing 80-fold molar of Ob, imitated transfected COS cell suspension. The sample is then processed in the manner previously described (Cheng, H.J. and Flanagan, J.G., 1994, Cell 79: 157-168).

B. 결 과B. Results

Ob-수용체를 조사하기 위하여 Ob-알칼라인 포스포타아제 융합단백질이 구성되었는 바, 이것은 Ob-결합을 컬러미터로 측정할 수 있다. 특이적으로, 마우스와 사람의 Ob 단백질을 코드화하는 cDNA분자는 상기 섹션 6.1.에서 기술한 바대로 발현벡터 APtag-2 APtag-3로 삽입된다. 발현벡터 APtag-2로의 삽입은 융합단백질의 N-말단에 Ob와 C-말단에 태반의 알칼라인 포스파타아제를 가진 융합단백질이 생긴다. 생성된 융합단백질은 Ob-AP로 부른다. 벡터 APtag-3로의 삽입은 N-말단에 AP를 가지고 C-말단에 완결된 형태의 Ob 단백질을 가진 융합단백질을 생성한다. 생성된 융합단백질은 AP-Ob로 부른다. 두 종류의 쥐(murine) 융합단백질은 분비되고 약 81 KDa의 분자량을 갖는다.An Ob-alkaline phosphatase fusion protein was constructed to examine the Ob-receptor, which can measure the Ob-binding with a color meter. Specifically, cDNA molecules encoding mouse and human Ob proteins are inserted into the expression vector APtag-2 APtag-3 as described in section 6.1 above. Insertion into the expression vector APtag-2 results in the fusion protein having an alkaline placenta phosphatase at the N-terminus of the fusion protein and Ob at the C-terminus. The resulting fusion protein is called Ob-AP. Insertion into the vector APtag-3 yields a fusion protein with an AP at the N-terminus and a complete Ob protein at the C-terminus. The resulting fusion protein is called AP-Ob. Both murine fusion proteins are secreted and have a molecular weight of about 81 KDa.

Ob 수용체를 발현하는 세포나 조직을 알아내기 위하여 여러 방법들이 사용된다. 여기에 기술된 대로 시험한 각각의 세포, 세포주와 조직은 체중조절에 강하게 관련되어 있다. 처음 방법은 직접적으로 Ob-AP와 AP-Ob 융합단백질과의 결합시험을 하는 것이다. 이 방법에 의해 사용된 세포주는 태반 세포주 Be Wo (ATCC No. CCL98) 및 JAR (ATCC No. HTB144); 근육세포주 L6 (ATCC No. CRL1458) 및 BC3H (ATCC No. CRL1443); 신경세포주 PC12 (ATCC No. CRL1721) 및 NB41A3 (ATCC No.CCL147); 프리아디포스(preadipose) 세포주 3T3-L1 (ATCC No. CRL173); 그리고 간세포주 Hepa1-6 (ATCC No. CRL1830)이다. 뇌하수체세포의 일차배양과 대뇌세포의 일차배양도 이 방법에 의하여 시험되었다. 이중 어느 시험에서도 양성반응이 검출되지 않았다.Several methods are used to identify cells or tissues expressing Ob receptors. Each cell, cell line and tissue tested as described herein is strongly involved in weight control. The first method is to test the binding of Ob-AP and AP-Ob fusion proteins directly. Cell lines used by this method were placental cell lines Be Wo (ATCC No. CCL98) and JAR (ATCC No. HTB144); Muscle cell lines L6 (ATCC No. CRL1458) and BC3H (ATCC No. CRL1443); Neuronal cell lines PC12 (ATCC No. CRL1721) and NB41A3 (ATCC No. CCL147); Preadipose cell line 3T3-L1 (ATCC No. CRL173); And hepatic cell line Hepa1-6 (ATCC No. CRL1830). Primary cultures of pituitary cells and primary cultures of cerebral cells were also tested by this method. None of the tests detected a positive reaction.

두 번째 시도는 Ob 수용체를 발현하는 세포주를 확인하기 위하여 재조합 Ob 단백질에 반응하는 유전자발현 변화를 조사하였다. 이론적 근거는 유전자 발현의 변화로, 그것이 ObR 유전자 발현 또는 Ob/ObR-관련 신호 변환 과정에서 더 아래단계의 유전자 발현이던 간에, ObR이 존재하는 세포를 확인할 수 있다는 것에 있다. 이러한 분석은 Ob-처리된 세포와 미처리된 세포로부터 유도된 RNA의 표준특이표시 분석에 의하여 행하였다(미국특허 제 5,262,311호 참조). 간략히 말하자면, RNA가 Ob에 노출되거나 노출되지 않았던 세포로부터 분리되었고 RT-PCR 방법으로 증폭되었으며 그러한 방식에 의해 Ob-비처리 세포주에 대한 Ob-처리 세포주의 개별적인 전사량을 직접 정량비교할 수 있었다. 이러한 방법에 의해 테스트된 Ob 세포주는 INS-1, 3T3-L1, Hepa1-6, L6, PC12, NB41A3 및 BC3H 였다. 뇌하수체의 1차 배양에 대해서도 실험하였으나 이 세포들 중에는 감지할 수 있을 정도의 정량적인 차이를 보이는 세포주가 없었다.The second trial examined gene expression changes in response to recombinant Ob proteins to identify cell lines expressing Ob receptors. The rationale is that a change in gene expression can identify cells in which ObR exists, whether it is gene expression at a lower level in the course of ObR gene expression or Ob / ObR-related signal transduction. This analysis was done by standard-specific analysis of RNA derived from Ob-treated and untreated cells (see US Pat. No. 5,262,311). Briefly, RNA was isolated from cells exposed or not exposed to Ob and amplified by RT-PCR method, which allowed direct quantitative comparison of individual transcription levels of Ob-treated cell lines against Ob-untreated cell lines. Ob cell lines tested by this method were INS-1, 3T3-L1, Hepa1-6, L6, PC12, NB41A3 and BC3H. The primary culture of the pituitary gland was also tested, but none of these cells showed a detectable quantitative difference.

세 번째 시도는 재조합 Ob 단백질을 세포에 처리하여 만들어진 Ob 수용체를 발현하는 세포를 확인하고 신호 변환 경로 활성화의 신호를 분석하는 것이다. 특이적으로 cAMP 변화는³H 업테이크(uptake)로 모니터링하고 타이로신 포스포릴레이션 변화는 안티-포스포타이로신 항체를 처리한 웨스턴 블럿으로 분석한다. 20세포주 이상이 이러한 방법으로 분석되었다. 특이적으로 이러한 세포주는 마우스 세포주 Y1(부신피질; ATCC No. CCL79), BC3H(평활근, 뇌종양; ATCC No. CRL1443), P19 (태생기암; ATCC No. CRL1825), 3T3L1 (프리아디포싸이트; ATCC No. CRL173), Hepa1-6 (간암; ATCC No. CRL1830), C2C12 (근아세포; ATCC No. CRL1772), NMUMG (유선, 정상상피; ATCC No. CRL1636), MM5MT (유선; ATCC No. CRL1637), NB41A3 (신경아세포증; ATCC No. CCL147), AtT20 (뇌하수체; ATCC No. CCL89), N MU LI (간; ATCC No. CRL 1638), BNL CL2 (간; ATCC No. TIB73), 그리고 NCTC-1469 (간; ATCC No. CCL91); L6 (근아세포; ATCC No. CRL1458), PC12 (부신 크롬친화성; ATCC No. CRL1721), 그리고 H-4-Ⅱ-E (간암; ATCC No. CRL1548); 및 사람세포주 SW872 (지방육종; ATCC No. HTB92), Hepa G2 (간; ATCC No. HB8065), 및 신경아세포종 세포주 SK-N-SH (ATCC No. HTB11)를 포함한다. 세포주중 어느것도 Ob-의존성 분화를 보이지 않았다.The third attempt is to identify cells expressing Ob receptors produced by processing recombinant Ob proteins into cells and to analyze the signals of signal transduction pathway activation. Specifically cAMP changes are monitored by ³ H uptake and tyrosine phosphorylation changes are analyzed by Western blot treated with anti-phosphotyrosine antibody. More than 20 cell lines were analyzed in this way. Specifically, these cell lines are mouse cell lines Y1 (adrenal cortex; ATCC No. CCL79), BC3H (smooth muscle, brain tumor; ATCC No. CRL1443), P19 (fetal cancer; ATCC No. CRL1825), 3T3L1 (priadiphosphate; ATCC No CRL173), Hepa1-6 (liver cancer; ATCC No. CRL1830), C2C12 (myoblasts; ATCC No. CRL1772), NMUMG (wired, normal epithelium; ATCC No. CRL1636), MM5MT (wired; ATCC No. CRL1637), NB41A3 (neuroblastoma; ATCC No. CCL147), AtT20 (pituitary gland; ATCC No. CCL89), N MU LI (liver; ATCC No. CRL 1638), BNL CL2 (liver; ATCC No. TIB73), and NCTC-1469 ( Liver; ATCC No. CCL91); L6 (myoblasts; ATCC No. CRL1458), PC12 (adrenal chromium affinity; ATCC No. CRL1721), and H-4-II-E (liver cancer; ATCC No. CRL1548); And human cell line SW872 (lipa sarcoma; ATCC No. HTB92), Hepa G2 (liver; ATCC No. HB8065), and neuroblastoma cell line SK-N-SH (ATCC No. HTB11). None of the cell lines showed Ob-dependent differentiation.

포유동물 세포주와 조직의 광범위한 탐색후에, 상기 섹션 6.1.에서 기술한 조직학적 방법을 사용하여 성숙한 마우스 뇌를 사등분하고 AP-Ob 융합단백질로 처리하고 세척한 후 융합단백질의 결합 AP 활성을 테스트하였다. 재현성있는 AP-Ob 융합단백질의 결합이 설치류 뇌 맥락막총(측뇌와 제3뇌실)에서 관찰되었다. 그러나 맥락막총을 둘러싼 뇌에서는 AP-Ob 착색은 발견되지 않았다. 맥락막총은 대체로 대뇌척수액의 생성을 담당하고 있는 조직이다. 나아가 맥락막총 조직은 혈액-뇌막의 "감시인"으로 생각되고 있다. 대조군 AP 염색은 비융합된 AP로 처리된 조직과 과잉 비융합된 Ob 존재하에 AP-Ob로 처리된 조직에서 수행되었다. AP-Ob 융합단백질에서 관찰되었던 것과 비슷한 착색은 이들 대조군중 어느것에서도 관찰되지 않았으며, 이것은 AP-Ob 결합이 Ob-특이적이며, AP자극에 의한 생성물질(artifact)이 아님을 증명한다.After extensive exploration of mammalian cell lines and tissues, the histological method described in section 6.1 above was used to test the binding AP activity of the fusion protein after quartered, treated and washed with AP-Ob fusion protein. . Binding of reproducible AP-Ob fusion proteins was observed in rodent cerebral choroid plexuses (lateral brain and third ventricle). But AP-Ob staining was not found in the brain surrounding the choroid plexus. The choroid plexus is usually the tissue responsible for the production of cerebrospinal fluid. Furthermore, choroid plexus tissue is thought to be the "watcher" of the blood-meninges. Control AP staining was performed on tissues treated with AP-Ob in the presence of excess unfused Ob and tissues treated with unfused AP. Similar staining to that observed for AP-Ob fusion proteins was not observed in any of these controls, demonstrating that AP-Ob binding is Ob-specific and not an AP stimulus artifact.

약술하면, 여러 방법을 사용한 결과 세포표면분자가 Ob위치에 결합하고, 이 세포표면분자는 뇌의 특이한 부위 즉 맥락막총(choroid plexus) 안에서 발견되었다.In short, using several methods, cell surface molecules bind to the Ob position, which is found in a specific region of the brain, the choroid plexus.

Ⅶ. 실시예: 쥐(murine)의 obR 유전자의 클로닝Iii. Example Cloning of the murine obR Gene

아래 섹션 7.2.1.에 기술한 것은 쥐의 맥락막총 RNA를 사용하여 구성된 발현 도서관으로부터 Ob 수용체의 cDNA 단편인 famj5312을 성공적으로 클로닝한 것이다. 발현 도서관은 상기 섹션 6에서 제시된 실시예에서 기술한 바대로 AP-Ob 융합단백질을 이용하여 스크린되었다. 섹션 7.2.2.는 Ob 수용체 코딩부위 단편의 뉴클레오티드 서열을 기술하고 나아가 Ob 수용체 단백질의 단편의 아미노산 서열을 기술한다. 섹션 7.2.3에는 분리된 cDNA에 의하여 코드화된 단백질은 마우스와 사람 Ob 단백질에 높은 친화성을 보이는 수용체임을 증명하는 경쟁적 결합연구를 기술한다. 섹션 7.2.4에는 분리된 ObR cDNA 클론의 확실성을 증명하는 연구를 기술한다. ObR에 의한 Ob 결합의 높은 친화성은 클래스 I 사이토카인 수용체와의 상동성과 연관되어 있고 아래 기술된 바와같이 그것은 ObR이 Ob 리간드에 결합함으로써 유발된 신호 변환을 경유하여 포유동물의 체중조절과 관련되어 있다는 것을 가리키는 것이다.Described below in Section 7.2.1., Is the successful cloning of the faD53 fragment, the fa receptor 53D fragment of the Ob receptor, from an expression library constructed using mouse choroid plexus RNA. Expression libraries were screened using AP-Ob fusion proteins as described in the examples presented in section 6 above. Section 7.2.2 describes the nucleotide sequence of the Ob receptor coding region fragment and further describes the amino acid sequence of the fragment of the Ob receptor protein. Section 7.2.3 describes a competitive binding study demonstrating that proteins encoded by isolated cDNAs are receptors with high affinity for mouse and human Ob proteins. Section 7.2.4 describes studies demonstrating the certainty of isolated ObR cDNA clones. The high affinity of Ob binding by ObR is associated with homology with class I cytokine receptors and as described below it is associated with mammalian weight control via signal transduction caused by binding of ObR to Ob ligand To indicate that.

A. 재료 및 방법A. Materials and Methods

맥락막총 mRNA 분리. 분자 생물학에 대한 현행 프로토콜(4.2.3 부록 14)인 알. 세던에 의해 기술된 바와 같은 처윈 등의 1979, 비이오케미스트리 18:5294 (Chirgwin et al. 1979, Biochemistry 18:5294)의 구아니디니움 이소티오시아네이트/CSCl 방법을 사용하여 100 배치의 300 마우스 맥락막총으로부터 총 RNA를 분리하였다. RNA의 양을 측정한 후에, 증류된 탈이온수내에 1 mg/ml로 희석하고 동부피의 DNase 용액(TE내 20mM MgCl2, 2mM DTT, 0.1 유닛 DNase, 0.6 유닛 RNase 저해제)과 함께 37℃에서 30분간 배양하여 오염 DNA를 제거하였다. 페놀/클로로포름/이소아밀로 RNA를 추출하고, 에탄올을 침전시켰다. 260 nm에서 양 측정한 후, 분취량을 전기영동하여 완전함을 체크하였다. 총 RNA중 총 320㎍이 정제되었다.Choroid plexus mRNA isolation. Egg, the current protocol for molecular biology (4.2.3 Annex 14). 300 mice in 100 batches using the guanidinium isothiocyanate / CSCl method of Chuwinwin et al. 1979, Biochemistry 18: 5294, as described by Sherwin et al. 1979, Biiochemistry 18: 5294. Total RNA was isolated from the choroid plexus. After measuring the amount of RNA, dilute to 1 mg / ml in distilled deionized water and incubate for 30 minutes at 37 ° C with eastern blood DNase solution (20 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 unit DNase, 0.6 unit RNase inhibitor in TE). Contaminating DNA was removed. RNA was extracted with phenol / chloroform / isoamyl and ethanol was precipitated. After quantitative determination at 260 nm, aliquots were checked for completeness by electrophoresis. A total of 320 μg of total RNA was purified.

제조자의 지시에 따라 퀴아겐(미국 캘리포니아 채츠워드 소재)으로부터 구입한 올리고텍스-dT 키트(카탈로그 # 70042)를 사용하여 폴리 A +RNA를 분리하였다. 양 측정한 후에, mRNA를 에탄올 침전하고 증류된 탈이온의 DEPC-처리수에 1 mg/ml 로 재현탁하였다. 폴리 A+ RNA중 총 11㎍이 정제되었다.Poly A + RNA was isolated using an oligotex-dT kit (Catalog # 70042) purchased from Qiagen (Chatsward, Calif.) According to the manufacturer's instructions. After volume determination, mRNA was ethanol precipitated and resuspended at 1 mg / ml in DEPC-treated water of distilled deion. A total of 11 μg of poly A + RNA was purified.

도서관 구성. 라이프 테크놀로지스(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재)로 부터 구입한 수퍼스크립트 플라스미드 cDNA 합성키트(카탈로그 #시리즈 8248)를 사용하여 구블러 및 호프만의 문헌(Gubler and Hoffman, Gene, 1983, 25:263)의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 이전에 기술한 바와 같은 SRα프로모터를 사용한, pME18S의 변형물인 포유동물 발현벡터 pMET7의 NatI/SalI 부위내로 상기 수득한 cDNA를 결합시켰다 (Takebe, Y. et al., 1988, Mol. Cel. Bio. 8:466). 이 벡터가 COS7 세포에서 발현되고, AMP 내성 유전자를 함유하며 단지 길이가 3.0 kb인 강한 진핵 프로모터를 가지고 있기 때문에, 이를 선택하였다. 큰 cDNAs를 클로닝시키는 가능성을 증가시키므로 작은 크기의 벡터가 중요하다. 필적할 만한 다른 벡터는 보다 큰 4.8kb로서, 불완전한 복제의 기회를 증가시키며, 큰 cDNAs를 클로닝시키는 가능성을 감소시킨다. 결합된 cDNA를 에탄올 침전시키고 증류된, 탈이온의 DEPC-처리수에 25ng/ml로 재현탁하였다. 0.1cm 크벳내에서 전기허용 DH10B E. Coli 40 ㎕당 1㎕의 DNA를 일렉트로포레이션하여 형질전환시켰다.Library composition. Using Superscript Plasmid cDNA Synthesis Kit (Catalog #Series 8248) from Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Gubler and Hoffman, Gene, 1983, 25: 263 CDNA was synthesized according to the method. The cDNA obtained above was bound into the NatI / SalI site of mammalian expression vector pMET7, a variant of pME18S, using the SRα promoter as previously described (Takebe, Y. et al., 1988, Mol. Cel. Bio. 8: 466). This vector was chosen because it is expressed in COS7 cells, contains an AMP resistance gene and has a strong eukaryotic promoter of only 3.0 kb in length. Small sized vectors are important because they increase the likelihood of cloning large cDNAs. Another comparable vector is a larger 4.8 kb, which increases the chance of incomplete replication and reduces the chance of cloning large cDNAs. Bound cDNA was ethanol precipitated and resuspended in distilled, deionized DEPC-treated water at 25 ng / ml. Transformation was performed by electroporation of 1 μl of DNA per 40 μl of the electropermitted DH10B E. Coli in 0.1 cm kvet.

cDNA는 2배로 합성되었으며, 두 개의 개별적인 마우스 맥락막총 도서관을 구성하는데 사용하였다: mCP(마우스 맥락막총) A 및 mCP D.cDNA was synthesized twice and used to construct two separate mouse choroid plexus libraries: mCP (mouse choroid plexus) A and mCP D.

DNA 제조. cDNA 형질전환의 역가를 기초로 하여, 96-딥웰 플레이트를 1 ml의 LB-amp 내의 150 cfu/웰의 일차 형질전환체로 접종하였다. 분취하기 전에 37℃에서 단지 1시간 성장시킨 일차 형질전환체를 사용하여 150 cfu 풀에서 보다 작은 삽입물 클론의 과성장과 이에 따른 보다 큰 클론의 저출현을 피하였다. 탄산가스 포화하여 37℃에서 15-16 시간 배양물을 성장시켰다. 미숙한 성장 이전에, 100㎕의 세포 현탁액을 제거하고 100㎕의 50% 글리세롤을 가하여 혼합한 다음 -80℃에 저장하였다.(글리세롤 동결 플레이트). 96-웰 포멧에 대한 변형을 이용하는 WizardTM 미니프렙스 DNA 정제 시스템(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가에서 구입, 카탈로그 # A7100)을 사용하여 DNA를 제조하였다. 프로토콜은 다음과 같았다:DNA manufacturing. Based on the titer of cDNA transformation, 96-deep well plates were inoculated with 150 cfu / well primary transformants in 1 ml LB-amp. Primary transformants grown at 37 ° C. for only 1 hour prior to preparative were used to avoid overgrowth of smaller insert clones and consequently lower expression of larger clones in the 150 cfu pool. Carbon dioxide was saturated to grow the culture at 37 ° C. for 15-16 hours. Prior to immature growth, 100 μl of cell suspension was removed, 100 μl of 50% glycerol was added and mixed and stored at −80 ° C. (glycerol freeze plate). DNA was prepared using a WizardTM Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, Wisconsin, Catalog # A7100) using modifications to the 96-well format. The protocol was as follows:

1) 4℃에서 10 분간 3200 rpm으로 96-딥웰 플레이트의 배양물을 원심분리하였다. 상청액은 제거하였다.1) The culture of 96-deep well plate was centrifuged at 3200 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Supernatant was removed.

2) 세포 현탁 용액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A), 세포 용균 용액(0.2 M NaOH ; 1.0 % SDS) 및 중화용액(1.32 M 아세트산칼륨, pH 4.8)의 각 140 μl를, 잘 혼합시키기 위해 첨가 후 14 초간 교반시키면서 가하였다.2) Cell suspension solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 μg / ml RNase A), cell lysis solution (0.2 M NaOH; 1.0% SDS) and neutralization solution (1.32 M potassium acetate, pH 4.8 140 μl of each) was added with stirring for 14 seconds after addition to ensure good mixing.

3) 플레이트를 얼음물에 15 분간 두었다.3) The plate was placed in ice water for 15 minutes.

4) 4℃에서 10 분간 3200rpm으로 시료를 원심분리하였다.4) The samples were centrifuged at 3200 rpm for 10 minutes at 4 ° C.

5) 상청액을 96-웰 폴리필트로닉스 폴리프로필렌 필터플레이트(10 미크론, 0.8 ml)으로 옮겼다.5) The supernatants were transferred to 96-well polyfiltronics polypropylene filterplates (10 microns, 0.8 ml).

6) 500㎕ WP 수지를 가하고 실온에서 3-5 분 배양하고 ; 플레이트에 흡입법을 적용시켰다.6) 500 μl WP resin was added and incubated for 3-5 minutes at room temperature; Suction was applied to the plates.

7) 640㎕ 의 현탁용액으로 시료를 3 회 세척하였다.7) The sample was washed three times with 640 μl of suspension solution.

8) 실온에서 5 분간 3200 rpm으로 시료를 원심분리하여 잔류 완충액을 제거하였다.8) The sample was centrifuged at 3200 rpm for 5 minutes at room temperature to remove residual buffer.

9) 40㎕ 의 실온수로 2-5 분간 시료를 용리하였다.9) The sample was eluted with 40 μl of room temperature water for 2-5 minutes.

10) 용리된 DNA를 실온에서 5 분간 3200 rpm으로 마이크로웰 플레이트를 통해 원심분리하였다.10) The eluted DNA was centrifuged through a microwell plate at 3200 rpm for 5 minutes at room temperature.

11) DAN를 정량하였다.11) DAN was quantified.

풀링(pooling) 방법. 트랜스펙션 및 검출을 위한 최적 크기의 풀, 1200 cfu를 제공하고 150 의 보다 작은 풀에 대한 신속한 붕괴를 제공하기 위해 풀 제조 전략을 고안하였다. 일단 150의 양성 풀이 확인되면, 이 풀을 표현하기 위해서는 400 내지 800 의 개별 클론이 필요하다. 초기에 1200 cfu 의 단일 풀을 사용하는 것은 더 적은 DNA 프로브를 의미하며, 최종 확인 단계에서 더 많은 개별 클론(3200-6400)이 필요하지 않는데, 이로써 양성 클론을 확인하기 위해 상당히 더 많은 시간이 필요하다.Pooling method. The pool preparation strategy was devised to provide an optimal size pool for transfection and detection, 1200 cfu, and to provide rapid decay to 150 smaller pools. Once 150 positive pools have been identified, 400 to 800 individual clones are needed to express this pool. Initially using a single pool of 1200 cfu means fewer DNA probes, and no more individual clones (3200-6400) are needed in the final validation step, which requires significantly more time to identify positive clones Do.

총 5㎍의 DNA를 8 웰, 1 칼럼과 동등하게 폴로 제조하여 총 1200 cfu를 제공하였다. 따라서, 각 96-웰 플레이트는 COS-7 세포 내로의 트랜스펙션에 대한 12 풀 DNA 상승을 제공하였다. 양성 풀이 확인되면, 풀을 구성하고 있는 각각의 8 개의 웰로 부터 DNA를 제조하고 COS-7 세포내로 재트랜스펙션시켰다. 양성 웰이 확인되면, 7,000 개의 개별 콜로니가 수득되도록 그 웰의 글리세롤 동결물의 분취량을 외부에 플레이팅함으로써 웰을 분해시켰다.A total of 5 μg of DNA was prepared in Pall equivalent to 8 wells, 1 column, giving a total of 1200 cfu. Thus, each 96-well plate provided 12 pool DNA elevations for transfection into COS-7 cells. Once a positive pool was identified, DNA was prepared from each of the eight wells that make up the pool and retransfected into COS-7 cells. Once positive wells were identified, the wells were digested by externally plating an aliquot of the glycerol frozen product of the wells to yield 7,000 individual colonies.

각 양성 웰에 대해, 400 내지 800 콜로니를 선택하여 96-웰 포멧에 배열하고, 상기한 바와 같이 DNA를 수득하여, 24 웰로 부터의 DNA를 트랜스펙션용 풀로 만들었다. 양성 열로 부터 각각의 개별 클론을 나타내는 DNA를 분리하고 최종 확인을 위해 트랜스펙션시켰다.For each positive well, 400-800 colonies were selected and arranged in 96-well format, DNA was obtained as described above to make DNA from 24 wells into pools for transfection. DNA representing each individual clone from the positive row was isolated and transfected for final identification.

Ob 세포 표면 결합의 정량 검정. 본질적으로 키트-AP에 대해 이전에 기술한 바와 같이 AP-Ob 융합 단백질로 세포 표면 결합 정량 검정을 수행하였다 (Flanagan, J.G. and Leder, P., 1990, Cell 63 ; 185-194).Quantitative Assay of Ob Cell Surface Binding. In essence, cell surface binding quantitative assays were performed with AP-Ob fusion proteins as previously described for Kit-AP (Flanagan, J.G. and Leder, P., 1990, Cell 63; 185-194).

Ob 단백질. 본원에 사용된 재조합 마우스 Ob 단백질은 이미 기술되어 있다 (Campfield et al., 1995, Science 269:546-549). 본원에 사용된 재조합 사람 Ob 단백질은 사람 Ob에 대항하는 모노클로날 항체를 포함하고 있는 모노클로날 항체 칼럼을 수반한 바쿨로바이러스 상청액으로 부터 정제하였다. 정제된 재조합 사람 Ob 단백질을 표준 쿠마시 블루 염색한 결과 95 % 이상의 순도로 판단되었다.Ob protein. The recombinant mouse Ob protein used herein has already been described (Campfield et al., 1995, Science 269: 546-549). As used herein, the recombinant human Ob protein was purified from baculovirus supernatant with a monoclonal antibody column containing monoclonal antibodies against human Ob. Standard Coomassie blue staining of purified recombinant human Ob protein was determined to be at least 95% purity.

DNA 서열결정. 이미 기술한 바와 같이 (International Polycystic kidney Consortium., 1995, Cell 81:289-298) 서열 결정 및 서열 조합을 수행하였다.DNA sequencing. As previously described (International Polycystic kidney Consortium., 1995, Cell 81: 289-298), sequencing and sequence combinations were performed.

노던 분석. 마우스 ObR 세포외 도메인을 암호화하는 서열로 부터 증폭된 표지 DNA를 수반하여, 표준 기술 (Chirgwin, J.M. et al. 1979, Biochemistry 18:5294-5299)을 사용하여 여러 가지 조직으로 부터의 폴리 A+ mRNA(클론테크)를 노던 블롯하였다.Northern analysis. Accompanying labeled DNA amplified from sequences encoding mouse ObR extracellular domains, poly A + mRNA from various tissues using standard techniques (Chirgwin, JM et al. 1979, Biochemistry 18: 5294-5299) Clontech) Northern blot.

rt-PCR. 표준 기술(Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372:425-432)을 이용하여 1㎍ 총 RNA에 대해 역전사 PCR (rt-PCR) 반응을 수행하였다. 특히, 무작위 육량체를 사용하여 제 1 가닥 cDNA를 제조하였다. 그런 다음 ObR 세포외 도메인을 암호화하는 서열로 부터 유래된 프라이머나 G3PDH 대조 프라이머를 사용하여 제 1 가닥 cDNA를 PCR 증폭시켰다.rt-PCR. Reverse transcription PCR (rt-PCR) reactions were performed on 1 μg total RNA using standard techniques (Zhang, Y. et al., 1994, Nature 372: 425-432). In particular, the first strand cDNA was prepared using random hexamers. The first strand cDNA was then PCR amplified using primers derived from sequences encoding the ObR extracellular domain or G3PDH control primers.

B. 결 과B. Results

1. 마우스 맥락막총 Ob 수용체의 클로닝1. Cloning of Mouse Choroid Plexus Ob Receptor

섹션 6에 있는 실시예에서, 상기한 마우스 맥락막총에 대한 AP-Ob 융합 단백질의 강한, Ob-특이적 결합은 Ob 수용체가 이 조직내에서 고수준으로 발현될 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, Ob 수용체를 암호화하는 cDNA를 클로닝시키기 위해, 300 마리 마우스로 부터 맥락막총을 해부하여, 이 조직으로 부터 총 11㎍의 폴리 A+ RNA를 분리하고 섹션 7.1에서의 상기한 바와 같은 cDNA 도서관을 구성하기 위해 사용하였다.In the example in section 6, the strong, Ob-specific binding of the AP-Ob fusion protein to the mouse choroid plexus described above suggests that the Ob receptor can be expressed at high levels in this tissue. Thus, to clone the cDNA encoding the Ob receptor, the choroid plexes were dissected from 300 mice to isolate a total of 11 μg of poly A + RNA from this tissue and construct the cDNA library as described above in section 7.1. It was used to.

처음에는, 마우스 맥락막총 cDNA 도서관 A를 구성하는데 사용될 cDNA를 생성하기 위해 3㎍ 폴리 A+를 사용하였다. 생성된 cDNAs 중 크기가 500 bp 보다 큰 cDNA 모두(261ng)를 풀로 만들어 90ng을 pMET7에 결합시켰다. 이 결합된 cDNA를 전기허용 DH10B 이. 콜라이(E. coli) 내로 형질전환시켜 1 kb 의 평균 크기를 갖는 약 7.2 x 105 cfu 의 도서관을 생성하였다.Initially, 3 μg poly A + was used to generate cDNA to be used to construct mouse choroid plexus cDNA Library A. Of the cDNAs generated, all cDNAs larger than 500 bp (261 ng) were pooled and 90 ng were bound to pMET7. This combined cDNA was electrolysed in DH10B. Transformation into E. coli produced a library of about 7.2 × 10 5 cfu with an average size of 1 kb.

cDNA 도서관 A 가 통계학상 적당한 빈도로 수용체를 암호하기에 충분히 큰 삽입물을 함유하는 클론을 충분한 수로 포함하고 있지 않으므로, 이차적인 3㎍ 의 폴리 A+ RNA를 사용하여 758ng의 cDNA를 제조하였다. cDNA 중 가장 큰 두 개의 분획을 나타내는 cDNA 32 ng을 풀로 만들고 pMET7 내로 결합시켰다. 이 결합된 cDNA 분자를 형질전환시켜 2 kb 의 평균 삽입물 크기와 2.4 x 105 cfu를 갖는 마우스 맥락막총 도서관 D를 제조하였다. cDNA 중 가장 큰 두 개의 분획만을 사용했으므로, 이 도서관이 큰 cDNAs 라는 경향이 있다. 이것은 10 개 클론의 삽입물 크기를 특정화함으로써 확인되었다 ; 7 개의 클론은 2 kb 길이 보다 긴 삽입물을 가졌으며 1 kb 보다 작은 길이의 삽입물을 갖는 클론은 보여지지 않았다. 이것은 도서관 A와 대조적인데, 20 클론 중 16 개가 1 kb 보다 작았다.Since cDNA Library A did not contain a sufficient number of clones containing an insert large enough to encode a receptor at a statistically reasonable frequency, 758ng of cDNA was prepared using secondary 3 μg poly A + RNA. 32 ng of cDNA representing the two largest fractions of cDNA were pooled and bound into pMET7. This bound cDNA molecule was transformed to produce mouse choroid plexus library D with an average insert size of 2 kb and 2.4 × 10 5 cfu. Since only the two largest fractions of cDNA were used, this library tends to be large cDNAs. This was confirmed by specifying the insert size of 10 clones; Seven clones had inserts longer than 2 kb in length and no clones with inserts less than 1 kb in length were seen. This is in contrast to Library A, where 16 out of 20 clones were smaller than 1 kb.

마우스 맥락막총 도서관 A로부터 6 X 105 cfu를 나타내는 DNA (40 플레이트)를 제조하여 풀로 만들었다. 마우스 맥락막총 도서관 D로 부터 2.4 X 105 cfu를 나타내는 DNA (16 플레이트)를 제조하였다.DNA (40 plates) representing 6 × 10 5 cfu was prepared from mouse choroid plexus library A and pooled. DNA (16 plates) representing 2.4 × 10 5 cfu from mouse choroid plexus library D was prepared.

선별하기 위해, 도서관을 각 트랜스펙션(즉, 1200 클론/ 트랜스펙션)에 사용할 8 풀의 혼합물과 함께, 150 클론으로 된 풀로서 제조하였다. 풀로 만든 DNA를 COS-7 세포내로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 이 세포를 마우스 AP-Ob 융합 단백질을 함유하는 상청액과 배양함으로써 선별하여, 세척한 다음 상기 섹션 6.1 과 6.2 모두에서 기술한 바와 같이 정상소재의 AP 활성도에 대해 염색하였다.For screening, libraries were prepared as pools of 150 clones, with a mixture of 8 pools to be used for each transfection (ie 1200 clones / transfection). Pooled DNA is temporarily transfected into COS-7 cells, selected by incubation with supernatant containing mouse AP-Ob fusion protein, washed and normal as described in both sections 6.1 and 6.2 above. Staining was performed for AP activity of the material.

일단 양성 풀이 확인되면, 8 개의 개별 아풀(subpool)을 따로따로 시험하고, 결과적으로 생성된 양성 아풀을 단일 양성 클론이 확인될 때까지 더 재분할하였다. 도서관 A 및 D로 부터 총 632 DNA 풀을 유도하였으며, 총 10개의 독립적인 양성 풀이 확인되었다. 이들 양성 풀 모두를 각각 150 클론의 아풀로 성공적으로 분해시키고, 단일 양성 클론이 확인될 때까지 하나의 양성 아풀을 더 재분할하였다. 5.1 KB cDNA 삽입물을 함유하는 클론을 famj5312 라 명명하였다.Once positive pools were identified, eight separate subpools were tested separately and the resulting positive subpools were further subdivided until a single positive clone was identified. A total of 632 DNA pools were derived from libraries A and D, and a total of 10 independent positive pools were identified. All of these positive pools were successfully digested into 150 clones of each pool, and one subdivided into more pools until a single positive clone was identified. Clones containing 5.1 KB cDNA inserts were named famj5312.

2. Ob 수용체(ObR)와 ObR 유전자2. Ob receptor (ObR) and ObR gene

섹션 7.2.1에 상기한 바와 같이 분리된 famj5312 마우스 ObR cDNA 클론은 약 5.1 kb 의 삽입물을 함유했다. 이 클론으로 부터 수득된 뉴클레오티드 서열은 도 1 (서열 1)에 도시되어 있다.The famj5312 mouse ObR cDNA clone, isolated as described above in section 7.2.1, contained an insert of about 5.1 kb. The nucleotide sequence obtained from this clone is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).

이 클론의 뉴클레오티드 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임을 나타냈으며, ObR 은 역시 도 1 (서열 2)에 도시되어 있는 아미노산 서열을 유도했다. 마우스 ObR 단백질 중 연역된 894 아미노산 서열은 해독 개시부위를 구성하는 DNA 서열 내부의 코돈인 메티오닌과 함께 시작한다.The nucleotide sequence of this clone showed a single open reading frame, and ObR also derived the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). The deduced 894 amino acid sequence in the mouse ObR protein starts with methionine, a codon inside the DNA sequence that constitutes the translation start site.

ObR 아미노산 서열은, 막-관련 또는 막-분비되는 단백질인 아미노산 잔기 1-23으로 부터의 소수성 시그널 서열과 함께 시작한다.The ObR amino acid sequence starts with a hydrophobic signal sequence from amino acid residues 1-23, which are membrane-associated or membrane-secreted proteins.

마우스 Ob 수용체 단백질은 아미노산 잔기 838-860으로 부터의 단일 소수성 막전위 도메인을 포함하는데, 이것은 Ob 수용체가 세포막에 걸쳐 있음을 의미한다.The mouse Ob receptor protein comprises a single hydrophobic membrane potential domain from amino acid residues 838-860, which means that the Ob receptor spans the cell membrane.

막전위 도메인의 위치는, 성숙한 마우스 ObR 단백질의 세포외 부분이 아미노산 잔기 24에서 아미노산 잔기 837 까지 걸쳐있다는 것을 나타낸다. 데이터베이스 서치 결과 ObR의 세포외 도메인은 싸이토카인 수용체의 클래스 I 족내에 ObR 이 위치해 있는 상동 부위를 함유하고 있었다 (예를들어, Heldin, C.-H., 1995, Cell 80 ; 213-223 ; 및 Kishimoto, T. and Tetsuya, T., 1994, Cell 76:252-253 참조). ObR은 IL-6 수용체, GSF 수용체 및 LIF 수용체의 gp130 시그널 형질도입 성분과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 여겨진다. ObR 과 gp130 아미노산 서열의 배열 연구 결과, 두 단백질간의 전체 서열 상동성이 비록 낮을지라도, 특징적인 보존 시스테인 잔기, Trp-Ser-X-Trp-Ser 모티프, 및 단백질의 클래스 I 족 내에 보존된 다른 아미노산 잔기는 아주 분명하였다.The location of the membrane potential domain indicates that the extracellular portion of the mature mouse ObR protein spans amino acid residue 24 to amino acid residue 837. Database search showed that the extracellular domain of ObR contained a homologous site where ObR is located within the Class I family of cytokine receptors (eg, Heldin, C.-H., 1995, Cell 80; 213-223; and Kishimoto , T. and Tetsuya, T., 1994, Cell 76: 252-253). ObR is believed to be closely related to the gp130 signal transduction component of IL-6 receptor, GSF receptor and LIF receptor. Arrangement studies of the ObR and gp130 amino acid sequences show that, although the overall sequence homology between the two proteins is low, characteristic conserved cysteine residues, the Trp-Ser-X-Trp-Ser motif, and other amino acids conserved within the class I family of proteins The residue was very clear.

단일 막통과 도메인 다음, 마우스 Obr 단백질은 34 아미노산의 짧은 세포질 도메인을 함유한다(즉, 아미노산 잔기 861-894). 상동성 비교 결과 obR 세포질 도메인 중 맨 처음 23 아미노산이 LIF 수용체의 막 인접 서열과 30 % 동일성을 나타냈다. 총 RNA로 부터 obR mRNA를 역전사 PCR 증폭한 결과 맥락막 총내에 obR 전사체 (약 5 kb 의 단일 밴드)이 존재한다는 것이 확인되었으며, 또한 시상하부에 존재한다는 것이 입증되었다. 게다가, 여러 마우스 조직으로 부터 유래된 폴리 A+ RNA를 노던 블롯 분석한 결과 obR mRNA 가 폐 및 신장 같은 부가 조직에 존재한다는 것이 밝혀졌다.Following a single transmembrane domain, the mouse Obr protein contains a short cytoplasmic domain of 34 amino acids (ie amino acid residues 861-894). Homology comparison showed that the first 23 amino acids in the obR cytoplasmic domain were 30% identical to the membrane flanking sequence of the LIF receptor. Reverse transcription PCR amplification of obR mRNA from total RNA confirmed the presence of the obR transcript (a single band of about 5 kb) in the choroid plexus, and also the hypothalamus. In addition, Northern blot analysis of poly A + RNA from several mouse tissues revealed that obR mRNA was present in additional tissues such as lung and kidney.

3. OB 수용체는 OB 단백질과 강하게 결합한다.3. OB receptors bind strongly to OB proteins.

상기 섹션 7.2.2에 기술한 바와 같이, obR cDNA에 의해 암호화되는 ObR에 대한 AP-Ob 의 결합 분석을 수행하였다. 이 분석 결과는 도 2에 도시되어 있으며, 이것은 ObR이 마우스 및 사람 ob 단백질에 강하게, Ob-특이적으로 결합한다는 것을 입증한다.As described in section 7.2.2 above, binding analysis of AP-Ob to ObR encoded by obR cDNA was performed. The results of this assay are shown in FIG. 2, which demonstrates that ObR binds strongly and Ob-specifically to mouse and human ob proteins.

AP 융합 단백질 결합의 정량 분석은 도 2에 나타나 있다. ObR 클론을 COS 세포내로 일시적 트랜스펙션시킨 후, 1 nM 마우스 AP-Ob의 강한 결합이 검출되었다. (모조 트랜스펙션 COS 세포 또는 비융합된 AP와 배양한 ObR 트랜스펙션 COS 세포와 비교)(도 2A). 이 결합은 100 nM의 꼬리표 없는(untagged) 재조합 마우스 또는 사람 렙틴 단백질에 의해 거의 완전히 저해되는데, 이것은 이 수용체가 천연 ob와 결합할 수 있음을 의미한다. AP와 사람 Ob 간의 융합 역시, N-말단에서의 마우스 렙틴과 C-말단에서의 AP(Ob-AP)와의 융합 단백질과 결합하는 바와 같이, 고친화성으로 마우스 ObR 과 결합한다.Quantitative analysis of AP fusion protein binding is shown in FIG. 2. After transient transfection of the ObR clones into COS cells, strong binding of 1 nM mouse AP-Ob was detected. (Compared with mock transfected COS cells or ObR transfected COS cells incubated with unfused AP) (FIG. 2A). This binding is almost completely inhibited by 100 nM untagged recombinant mouse or human leptin protein, which means that this receptor can bind to native ob. Fusion between AP and human Ob also binds to mouse ObR with high affinity, as it binds to a fusion protein of mouse leptin at the N-terminus and AP (Ob-AP) at the C-terminus.

마우스 AP-Ob 결합의 스캐차드 분석(도 2B)으로 0.7 X 10-9 M 의 해리 상수(KD)에 대한 값이 산출되었다.Scatchard analysis of mouse AP-Ob binding (FIG. 2B) yielded values for the dissociation constant (KD) of 0.7 × 10 −9 M.

4. famj5312 클론의 진정성(authenticity)4.authenticity of the famj5312 clone

분리된 obR famj5312 클론의 진정성을 여러 방식으로 시험하였다. 첫째, 8 개의 독립적으로 분리된 클론(각 150 클론으로 된 아풀)을 종결코돈의 obR 서열 3'에 대해 제조한 프라이머로 PCR 증폭시켰다. 서열결정한 결과 8 개 클론 모두가 동일한 3' 비해독 서열을 함유하고 있음이 확인되었다. 또한, ObR C-말단을 코드화하는 5 개의 독립적으로 분리된 클론의 부분을 서열결정한 결과 각각이 동일한 종결코돈을 이용한다는 것이 밝혀졌다. 최종적으로, cDNA 도서관으로 부터 유래된 것 보다 다른 마우스 균주(C57/BLKs J)로 부터 분리된 맥락막총의 총 RNA를 역전사 PCR (rt-PCR)한 결과 동일한 위치에서 종결코돈을 함유하는 동일한 PCR 산물이 생성되었다. 이들 데이터는, 분리된 famj5312 cDNA 클론이 키메라 클론이 아니라는 것을 의미하는데, 이것은 드문 이상 접합 사건의 결과이지만, 클론이 맥락막총내 ObR 수용체의 우성 형태를 암호함을 나타낸다.The authenticity of the isolated obR famj5312 clone was tested in several ways. First, eight independently isolated clones (150 clones each) were PCR amplified with primers prepared for the obR sequence 3 ′ of the stop codon. Sequencing confirmed that all eight clones contained the same 3 'non-toxic sequence. In addition, sequencing portions of five independently isolated clones encoding the ObR C-terminus revealed that each used the same stop codon. Finally, reverse transcription PCR (rt-PCR) of choroid plexus total RNA isolated from a different mouse strain (C57 / BLKs J) than from the cDNA library resulted in the same PCR product containing a stop codon at the same location. Was created. These data mean that the isolated famj5312 cDNA clone is not a chimeric clone, which is the result of a rare abnormal conjugation event, but indicates that the clone encodes the dominant form of the ObR receptor in the choroid plexus.

5. 마우스 긴 형태 ObR 코드화 핵산의 클로닝5. Cloning of Mouse Long Form ObR-Encoded Nucleic Acids

본원에 기술한 바와 같이, 우리는 마우스 ObR의 긴 형태를 클로닝하였다.As described herein, we cloned the long form of mouse ObR.

사람의 긴 형태 obR 유전자(도 3)의 마우스 상동성을 발견하기 위해, 마우스 시상하부, Ks 및 맥락막총, db와 ks로부터 분리한 제 1 가닥 cDNA에 대해, 사람 긴 형태로 부터 분기하는 마우스 짧은 형태 출발 직전 부위의 5' 프라이머와, 사람 ObR 상동 세포간 부위로 부터 고안된 프라이머를 생성하는 3' 과 함께 세미-네스티드 PCR을 수행하였다. 완전한 전사체는 3' RACE를 특징으로 한다.To find mouse homology of the human long form obR gene (FIG. 3), the mouse short branched from the human long form, for the mouse hypothalamus, Ks and choroid plexus, first strand cDNA isolated from db and ks Semi-nested PCR was performed with the 5 'primer at the site just before the start of morphology and 3' producing primers designed from human ObR homologous intercellular sites. Complete transcripts are characterized by 3 'RACE.

C57B1/KS(KS) 및 C57B1/KS-db(db) 맥락막총과 시상하부로 부터 총 mRNA를 제조하였다. 깁코- 비알엘(GIBCO-BRL)로 부터의 수퍼스크립트리버스 트랜스크립타제를 이용하여, 프라이머로서 무작위 육량체나 올리고 dT를 사용하여 1㎍의 mRNA 중 1㎍의 cDNA로 부터 cDNA를 역전사하였다. 총 24㎍의 cDNA 가 생성되었다.Total mRNA was prepared from C57B1 / KS (KS) and C57B1 / KS-db (db) choroid plexus and hypothalamus. Using superscriptrevers transcriptase from Gibco-BRL, cDNA was reverse transcribed from 1 μg cDNA in 1 μg mRNA using random hexamers or oligo dTs as primers. A total of 24 μg cDNAs were produced.

PCR 용으로, cDNA를 1:200 희석하고 희석된 cDNA 3 ㎍을 25㎕반응에 사용하였다.For PCR, cDNA was diluted 1: 200 and 3 μg of diluted cDNA was used for 25 μl reaction.

제 1 회 PCR 반응에는, 마우스 ObR 단백질 서열 PNPKNCSW를 코드화하는 5' 프라이머-이것은 뉴클레오티드 5'-CCA AAC CCC AAG AAT TGT TCC TGG-3'로 구성되어 있음-와 사람 긴 형태의 카르복시 말단에 근접한, KIMENKMCD를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 역변성 프라이머-이것은 뉴클레오티드 5'-TC(GA)CA CAT (CT)TT (GA)TT (GATC)CC CAT TAT CTT-3'으로 구성되어 있음 -를 사용하였다.In the first PCR reaction, the 5 'primer encoding the mouse ObR protein sequence PNPKNCSW, which consists of the nucleotide 5'-CCA AAC CCC AAG AAT TGT TCC TGG-3', and close to the human long carboxy terminus, An inverted primer complementary to the nucleotide sequence encoding KIMENKMCD was used, which consists of the nucleotide 5'-TC (GA) CA CAT (CT) TT (GA) TT (GATC) CC CAT TAT CTT-3 '. .

제 2 회 PCR 반응에 있어, 3' 프라이머는 동일하였고, 5' 프라이머는 예상한 5' 프라이머의 내부로서 마우스 ObR 단백질 서열 AQGLNFQK-이것은 뉴클레오티드 5'-GCA CAA GGA CTG AAT TTC CAA AAG-3'으로 구성되어 있음 -를 코드화한다.For the second PCR reaction, the 3 'primers were identical and the 5' primer was the inside of the anticipated 5 'primer, the mouse ObR protein sequence AQGLNFQK-this was the nucleotide 5'-GCA CAA GGA CTG AAT TTC CAA AAG-3' Coded-is configured.

다음을 제외하고는 상기한 바와 같이 PCR 반응을 수행하였다:네스티드 PCR 프로필은 3 분간 94℃ ; 30 순환에 대해 30 초간 94℃, 30 초간 57℃, 40 초간 72℃ ; 1 순환에 대해 5 분간 72℃. 택 사이클 서열결정 키트(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스에서 구입)를 사용하여 자동 ABI 373 A 및 377 DNA 서열결정기 상에서 DNA 서열결정을 수행하였다. 서열결정기를 사용하여 서열 분석을 수행하였다.PCR reactions were performed as above except for the following: Nested PCR profiles were 94 ° C. for 3 minutes; 94 ° C. for 30 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 40 seconds; 72 ° C. for 5 minutes for 1 cycle. DNA sequencing was performed on automated ABI 373 A and 377 DNA sequencers using a tack cycle sequencing kit (purchased from Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Sequencing was performed using a sequencer.

마우스 긴 형태 ObR의 세포간 도메인을 코드화하는 핵산의 세미-네스티드 PCR 역시 시상하부로 부터 분리한 mRNA 상에서 수행하여 마우스 긴 형태 obR 유전자를 코드화하는 특이 PCR 산물의 충분한 양을 수득하였다. PCR 산물을 서열결정한 결과 (도 6) 이 DNA가 긴 형태 ObR의 마우스 상동체를 코드화한다는 것이 확인되었다. 짧은 형태와 긴 형태의 전사체는 짧은 형태의 종결코돈 중 5' 제 5 코돈 이 완전히 분기될 때까지 동일한데, 이것은 선택적인 접합을 암시한다. 마우스 긴 형태 및 사람 ObR로 부터의 연역 아미노산 서열은 암호화 부위의 길이 전체가 상동성이며 75 % 동일성을 공유한다(도 7).Semi-nested PCR of nucleic acids encoding the intercellular domain of mouse long form ObR was also performed on mRNA isolated from the hypothalamus to obtain sufficient amounts of specific PCR products encoding mouse long form obR genes. Sequencing the PCR products (FIG. 6) confirmed that this DNA encodes the mouse homologue of the long form ObR. The short form and the long form transcript are the same until the 5 'fifth codon in the short form codon is fully branched, suggesting selective conjugation. The deduced amino acid sequences from mouse long form and human ObR are homologous throughout the length of the coding site and share 75% identity (FIG. 7).

6. ObR mRNA의 발현 프로필6. Expression Profile of ObR mRNA

ObR의 조직분포를 이해하는 제 1 단계로서, 그것의 mRNA의 발현을 여러 마우스 조직으로 조사하였다. 여러 마우스 조직(심장, 뇌, 췌장, 폐, 간, 골격근, 신장 및 고환 ; 미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 구입)으로 부터 유래된 폴리 A+ mRNA(2 μg/레인)의 노던 블롯 분석을 ObR 세포외 도메인을 코드화하는 서열로 부터 증폭된 표지 DNA로 탐지시켰다. 제조자의 지시에 따라 65℃에서 래피드-하이브(Rapid-hyb) 완충액으로 혼성화를 수행하였다.As a first step in understanding the tissue distribution of ObR, expression of its mRNA was examined in various mouse tissues. Northern blot analysis of poly A + mRNA (2 μg / lane) derived from several mouse tissues (heart, brain, pancreas, lung, liver, skeletal muscle, kidney and testicles; purchased from Clontech, Palo Alto, Calif.) The ObR extracellular domain was detected with labeled DNA amplified from the sequence encoding. Hybridization was carried out with Rapid-hyb buffer at 65 ° C. according to the manufacturer's instructions.

대부분 조직에서, obR mRNA는 5 Kb 보다 약간 큰 단일 밴드로서 나타났는데, 이것은 본원에서 기술한 5.1 kb cDNA 클론이 완전한-길이라는 것을 의미한다. 분석 조직 중에서, 발현은 폐, 신장 및 총 뇌에서 발견되었다.In most tissues, obR mRNA appeared as a single band slightly larger than 5 Kb, meaning that the 5.1 kb cDNA clones described herein are full-length. Among the analyzed tissues, expression was found in the lungs, kidneys and total brain.

총 RNA로 부터의 ObR mRNA를 RT-PCR 증폭한 결과 맥락막총에 이 전사체가 존재한다는 것이 확인되었으며 시상하부에서도 그것의 존재가 입증되었다. 마우스 맥락막총이나 시상하부로 부터 분리한 1 μg 의 총 RNA에 대해 RT-PCR 반응을 수행하였다.RT-PCR amplification of ObR mRNA from total RNA confirmed the presence of this transcript in the choroid plexus and its hypothalamus. RT-PCR reactions were performed on 1 μg of total RNA isolated from mouse choroid plexus or hypothalamus.

db/db 마우스(C57B1/BLKsJ 배경) 또는 +/+ 한 배 마우스 대조로 부터 조직을 분리하였다. 무작위 육량체를 사용하여 제조한 제 1 가닥 cDNA를, ObR 세포외 도메인을 코드화하는 서열로 부터 유래된 프라이머나 G3PDH 대조 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 병행하여 실행한 모조 역전사 총 RNA 대조물의 증폭으로 부터는 어떠한 밴드도 검출되지 않았다.Tissues were isolated from db / db mice (C57B1 / BLKsJ background) or + / + doubling mouse controls. First strand cDNA prepared using random hexamers was PCR amplified using primers derived from sequences encoding the ObR extracellular domain or G3PDH control primers. No bands were detected from amplification of the simulated reverse transcription total RNA control run in parallel.

VIII. 실시예 : obR 유전자는 db 유전자이다.VIII. Example: The obR gene is a db gene.

하기한 실험 및 연구는, obR 유전가 db 유전자 위치에 지도상 위치해 있고, db 마우스의 obR 유전자는 obR의 돌연변이 형태이므로, 106 뉴클레오티드 삽입물을 갖는 이상 접합된 mRNA 의 전사체가 마우스 짧은 형태 ObR과 동일한 절단된 긴 형태의 마우스 ObR 단백질을 생산한다는 것을 입증한다.The experiments and studies described below show that the obR gene is located at the db gene position and the obR gene in db mice is a mutant form of obR, so that the transcript of the abnormally conjugated mRNA with 106 nucleotide inserts is the same as the mouse short form ObR. Produces long form mouse ObR protein.

A. ObR 유전자는 db 유전자 간격 내에 위치해 있다.The A. ObR gene is located within the db gene interval.

본원 실시예에서는, obR 유전자는 db 유전자 위치가 지도상에 위치한 곳과 동일 부위를 나타내는 마우스 염색체 4 상의 4 내지 5 cM 부위에 위치한다는 것을 나타내주는 연구가 기술되어 있다.In the examples herein, studies have been described that indicate that the obR gene is located at the 4-5 cM site on mouse chromosome 4 which represents the same site as where the db gene location is located on the map.

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

PCR 증폭. 하기 famj5312-유래 프라이머를 마우스 게놈 DNA 증폭에 사용하였다:PCR amplification. The following famj5312-derived primers were used for mouse genomic DNA amplification:

정방향 프라이머 : 5'-GCTGCACTTAACCTGGC-3'Forward primer: 5'-GCTGCACTTAACCTGGC-3 '

역방향 프라이머 : 5'-GGATAACTCAGGAACG-3'Reverse primer: 5'-GGATAACTCAGGAACG-3 '

PCR 반응 혼합물은 6 ul 의 주형 DNA (10 ng/ul), 1.4 ul 의 10 X 퍼킨 엘머(미국 코네티컷 노르워크 소재) PCR 완충액, 1, 12 ul dNTPs(2.5 mM), 1,05 ul 정방향 프라이머(6.6 uM), 1.05 ul 역방향 프라이머(6.6 uM), 0.38 uL 의 H2O 및 3 ul 의 AmpliTaq HotstartTM 폴리메라제(퍼킨 엘머에서 구입 ; 0.5 U/ul).The PCR reaction mixture consisted of 6 ul of template DNA (10 ng / ul), 1.4 ul of 10 X Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut) PCR buffer, 1, 12 ul dNTPs (2.5 mM), 1,05 ul forward primer ( 6.6 uM), 1.05 ul reverse primer (6.6 uM), 0.38 uL of H2O and 3 ul of AmpliTaq HotstartTM polymerase (purchased from Perkin Elmer; 0.5 U / ul).

증폭 프로필은 다음과 같다 : 94℃에서 2 분간 둔 다음 ampliTaq을 가하고, 90℃에서 40 초, 55℃에서 50 초 및 72℃에서 30 초간 30 회 반복하였다.The amplification profile was as follows: 2 minutes at 94 ° C. and ampliTaq was added and repeated 30 times for 40 seconds at 90 ° C., 50 seconds at 55 ° C. and 30 seconds at 72 ° C.

두 번째 프라이머 세트는 55℃를 52℃로 실시하는 것을 제외하고는 동일한 조건하에서 사용하였다.The second primer set was used under the same conditions except that 55 ° C. was performed at 52 ° C.

정방향 프라이머 : 5'-CACTATTTGCCCTTCAG-3'Forward primer: 5'-CACTATTTGCCCTTCAG-3 '

역방향 프라이머 : 5'-GCCTGAGATAGGGGTGC-3'Reverse primer: 5'-GCCTGAGATAGGGGTGC-3 '

전기영동. 시료를 45 W, 실온에서 3 시간 동안 비변성 8 % 아크릴아미드 겔에서, 20 W, 4℃에서 2.5 시간 동안 비변성 10 % 아크릴아미드 SSCP(단일 가닥 입체형체 다형성) 겔에서 런닝시켰다.Electrophoresis. Samples were run on an unmodified 8% acrylamide gel at 45 W for 3 hours at room temperature, and an unmodified 10% acrylamide SSCP (single strand conformation polymorphic) gel at 20 W, 2.5 hours at 4 ° C.

두 형태의 겔을 SYBR 그린 I (SYBR Green I)으로 염색하고 MD 플루오리메이저(MD Fluorimager)로 스캐닝하여 판단가능한 결과를 얻었다.Both types of gels were stained with SYBR Green I and scanned with MD Fluorimager to obtain determinable results.

2. famj 5312 obR cDNA 클론의 지도작성2. Mapping of the famj 5312 obR cDNA Clone

8.1 섹션에 기술한 바와 같이, famj 5312 cDNA 의 암호화 서열로부터 PCR 프라이머를 만들었다. 이들 프라이머는 C57B1/6J 게놈 DNA 의 192 bp 단편을 증폭시키는데, 이는 obR cDNA 내 두 개의 프라이머 간의 염기쌍 길이와 무스 스프레투스 균주(Mus Spretus strain) SPRET/Ei에서 유래한 야생형의 195 bp 단편과 양립한다. 무스 스프레투스 대립유전자내 3 bp 의 삽입물은 아미노산 #45와 #46 사이의 부가적인 Asn을 코드화한다. obR의 무스 스프레투스 195 bp 대립유전자의 유전적 분리는 단일 가닥 입체 형태 다형성(SSCP)겔 전기영동과 크기를 결정하기 위한 비변성 겔 전기영동에 의해, (C57B1/6J x 무스 스프레투스)F1 암컷 X c57B1/6J 수컷을 교배시켜 182 마리의 역교배 자손에 대해 실시하였다. 무스 스프레투스 대립유전자의 분리 형태는 이 역교배 패널에서 지도작성한 226 개의 유전적 위치의 분리 형태에 필적하였다. obR 과 다른 표식 간의 다중 교배의 수를 최소화함으로써, 표식 D4Mit9에서 약 2.2 ± 1.6 cM 떨어지고 표식 D4Mit46에 4.6 ± 1.6 cM 근접한, 마우스 염색체 4에 대하여 obR을 지도작성하였다. obR의 유전 지도 위치는 부가적인 유전자 표식을 지도작성함으로써 더욱 순화시켰다. obR 유전자는 D4Mit255로부터 0.6 ± 0.6 cM 정도 떨어져 있으며 D4Mit155에 0.6 ± 0.6 cM 근접해 있다(도 8 참조).As described in section 8.1, PCR primers were made from the coding sequence of famj 5312 cDNA. These primers amplify 192 bp fragments of C57B1 / 6J genomic DNA, which is compatible with base pair lengths between the two primers in the obR cDNA and wild type 195 bp fragments derived from the Mus Spretus strain SPRET / Ei. . A 3 bp insert in the mousse spreadus allele encodes additional Asn between amino acids # 45 and # 46. Genetic isolation of the mousse spreadus 195 bp allele of obR was achieved by (C57B1 / 6J x mousse spreadus) F1 females by single-strand conformation polymorphism (SSCP) gel electrophoresis and non-denatured gel electrophoresis to determine size X c57B1 / 6J males were crossed and performed on 182 backcross offspring. The isolation form of the mousse spurtus allele was comparable to that of the 226 genetic sites mapped in this backcross panel. By minimizing the number of multiple crosses between obR and other markers, obR was mapped to mouse chromosome 4, approximately 2.2 ± 1.6 cM at marker D4Mit9 and 4.6 ± 1.6 cM close to marker D4Mit46. The genetic map position of obR was further refined by mapping additional gene markers. The obR gene is about 0.6 ± 0.6 cM away from D4Mit255 and 0.6 ± 0.6 cM close to D4Mit155 (see FIG. 8).

C57B1/6 J 게놈 DNA 무스 스프레투스 종 SPRET/Ei에서 유래한 야생형간의 SSCP 겔에 대한 다형성을 밝혀내 FAMJ5312 cDAN 의 3' 서열로부터 부가적인 프라이머쌍을 제작하였다.(정방향 프라이머 = CACTATTTGCCCTTCAG ; 역방향 프라이머 = GCCTGAGATAGGGGTGC). 이젠 클론의 다른 단편을 사용하여 이것을 반복함으로써 famj5312 cDNA 의 유전자 지도작성이 가능하게 하였다. 이러한 다형성의 지도작성은 상기 보고된 famj5312 의 지도와 일치하는데, 이것으로 obR의 지도를 확인하였으며 famj5312 cDNA 클론이 키메라화되지 않았음을 시사한다.Additional primer pairs were constructed from the 3 'sequence of FAMJ5312 cDAN by revealing polymorphism for wild-type SSCP gels derived from C57B1 / 6 J genomic DNA mousse spp. Species SPRET / Ei. (Forward primer = CACTATTTGCCCTTCAG; GCCTGAGATAGGGGTGC). It is now possible to repeat this using different fragments of the clone, allowing for gene mapping of the famj5312 cDNA. The mapping of this polymorphism is consistent with the map of famj5312 reported above, confirming the map of obR and suggesting that the famj5312 cDNA clone was not chimerized.

3. 마우스 db 유전 부위의 결정3. Determination of mouse db genetic region

우선 마우스 db 유전자를 마우스 염색체 4에 대하여 지도작성하였다 (Hummel, K. -P. et al., 1966, Science 153:1127-1128). 이 유전적 위치는 dB 가 오르니틴 탈탄산효소 4(Odc4)위치와 표식 D4Rck22와 D4Rck69에서 떨어져 있는 미지의 것 사이에 유전적인 간격 1.5 cM 이내에 위치하는 것으로 구분되었다. (Bahary, N. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87:8642-8646 ; Bahary, N. et al., 1993, Genomics 16:113-122) . 또한 바하리 등의 1993 문헌에는 Odc4에 대해 D4Mit205 가 1.1 cM 근접해 있는 것으로 보고되었다. 그러나, D4Mit205에 비해 db 유전자는 약 2.2 cM 떨어져 있었다.Mouse db genes were first mapped to mouse chromosome 4 (Hummel, K.-P. et al., 1966, Science 153: 1127-1128). This genetic position was determined to be within 1.5 cM of the genetic interval between the ornithine decarboxylase 4 (Odc4) position and the unknown one at the markers D4Rck22 and D4Rck69. (Bahary, N. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 8642-8646; Bahary, N. et al., 1993, Genomics 16: 113-122). In addition, Bahari et al., 1993, reported that D4Mit205 is close to 1.1 cM for Odc4. However, compared to D4Mit205, the db gene was about 2.2 cM away.

db 대립유전자는 처음에 C57B1/BLKs J 동종에서 나타났다. db 돌연변이를 다른 유전적 배경에 전이시켜 선천종(congenic strain)을 형성하였다.db allele initially appeared in the C57B1 / BLKs J homolog. db mutations were transferred to other genetic backgrounds to form congenic strains.

선천종인 C57B1/6J-m db 동물을 유형화함으로써, db 유전자가 마우스 염색체 4에 소재하도록 유전 간격을 결정하는 것이 가능하였다.By typing the congenital C57B1 / 6J-m db animals, it was possible to determine the genetic spacing so that the db gene is located on mouse chromosome 4.

이러한 분석으로, db 유전자를 함유하는 간격이 DNA 표식 D4Mit255에 근접해 있는 익명의 것과 표식 D4Mit331 과 D4Mit31에서 떨어져 있는 익명의 것 사이에서 약 4 cM 씩인 것으로 결정하였다 (Mit 지도에 대하여 결정된 유전적 거리 ; Dietrich, W.F et al., 1994, Nature Genetics 7:220-245 ; Copeland, N.G. et al., 1993, Science 262:67, Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Genetic Map of the Mouse, Database Release 10, April 28, 1995). 바하리 등의 1993, 상기문헌에서 정의된 간격이 본원에서 정의된 부위에 몇 센티모르간 근접한 것으로 나타난 것에 주의해야 한다. D4Mit255와 D4Mit31 간의 거리가 약 5.1 cm로 나타나 있는 도 8을 참조하라.This analysis determined that the interval containing the db gene was about 4 cM between the anonymous near the DNA marker D4Mit255 and the anonymous away from the markers D4Mit331 and D4Mit31 (genetic distance determined for the Mit map; Dietrich , WF et al., 1994, Nature Genetics 7: 220-245; Copeland, NG et al., 1993, Science 262: 67, Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Genetic Map of the Mouse, Database Release 10, April 28, 1995). It should be noted that the spacing defined in Bahari et al. 1993, supra, appears to be a few centimeters close to the site defined herein. See FIG. 8 where the distance between D4Mit255 and D4Mit31 is shown at about 5.1 cm.

상기한 db 지도작성 데이터와 famj5312에 대한 지도작성 데이터를 비교하여, famj5312 의 위치, D4Mit255에서 0.6 ± 0.6 cM 떨어진 위치 및 D4Mit155에 0.6 ± 0.6 cM 근접한 위치는 obR에 의해 완벽하게 db 유전자이다.Comparing the above db mapping data with the mapping data for famj5312, the position of famj5312, 0.6 ± 0.6 cM away from D4Mit255 and 0.6 ± 0.6 cM close to D4Mit155 is perfectly db gene by obR.

B. db 마우스내 obR 돌연변이는 절두된 긴 형태 수용체를 만든다.The obR mutation in B. db mice produces truncated long form receptors.

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

총 mRNA는 C57B1/KS (KS) 및 C57B1/KS-db(db)맥락막총과 시상하부에서 준비하였다. 깁코-비알엘(GIBCO-BRL)에서 구입한 수퍼스크립트 역전사효소를 수반하는 프라이머로서 올리고 dT 또는 무작위 6 량체를 이용하여 mRNA 의 cDNA 1 ug으로부터 cDNA를 역전사시켰다. 총 24 ug 의 cDAN를 얻었다. PCR을 위해, cDNA를 1:200 희석하고 희석된 cDNA 중 3 ug을 25 ul 반응에 사용하였다. 마우스 짧은 형태 cDNA 클론, famj 5312 및 긴 형태 cDNA 클론(도 6 참조)으로부터, 긴 형태 및 짧은 형태의 obR cDNA 둘다를 코드화하는 전체 부위를 커버하도록 프라이머를 제조하였다. 평균 600 bp 크기의 중복 PCR 단편을 각 시료에서 생산하였다. 0.8 % 저융점 아가로스 겔 상에서 PCR 산물을 전기영동시켰다. DNA를 겔에서 분리하였다. 말단 프라이머와 내부 프라이머로 DNA 단편의 서열을 결정하였다.Total mRNA was prepared from C57B1 / KS (KS) and C57B1 / KS-db (db) choroid plexus and hypothalamus. CDNA was reverse transcribed from cDNA 1 ug of mRNA using oligo dT or random hexamers as a primer with superscript reverse transcriptase purchased from Gibco-BRL. A total of 24 ug of cDAN was obtained. For PCR, cDNA was diluted 1: 200 and 3 ug in diluted cDNA was used for 25 ul reaction. Primers were prepared from mouse short form cDNA clones, famj 5312 and long form cDNA clones (see FIG. 6) to cover the entire site encoding both long form and short form obR cDNA. Duplicate PCR fragments of average 600 bp size were produced in each sample. PCR products were electrophoresed on 0.8% low melting agarose gel. DNA was isolated from the gel. The terminal and internal primers determined the sequence of the DNA fragments.

PCR 조건. 25 ul 의 PCR 반응물은 2 mM MgCl2, 0.5 mM 의 각 프라이머, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 각각 200 uM 및 1 X Taq 폴리메라제 완충액내 0.5 단위의 Taq 폴리메라제(퍼킨-엘머에서 구입)를 함유하였다. 모든 PCR 반응은 진앰프 PCE 시스템 9600(퍼킨-엘머에서 구입 ; GeneAmp PCR System 9600)에서 실시하였다. 달리 기술하지 않는 한, 일반적인 PCR 프로필은 94℃에서 3 분간 ; 94℃에서 10 초간 ; 57℃에서 10 초간, 72℃에서 40 초간 35 회 반복한 다음에 72℃에서 5 분간 1 회 실시하였다.PCR conditions. 25 ul of PCR reaction was performed with 2 mM MgCl 2, 0.5 mM of each primer, dATP, dTTP, dCTP and dGTP 200 uM and 1 × Taq polymerase buffer, respectively, 0.5 units of Taq polymerase (purchased from Perkin-Elmer). Contained. All PCR reactions were performed in GeneAmp PCR System 9600 (purchased from Perkin-Elmer). Unless otherwise stated, typical PCR profiles were run at 94 ° C. for 3 minutes; 10 seconds at 94 ° C; Repeated 35 times for 10 seconds at 57 ℃, 40 seconds at 72 ℃, and then once for 5 minutes at 72 ℃.

DNA 서열결정 및 서열 분석. Taq 주기 서열결정 키트(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스에서 구입)를 사용한 377 DNA 서열결정기와 오토매틱 ABI 373 A 상에서 DNA 의 서열을 결정하였다. 서열 분석은 서열결정기를 이용하였다.DNA sequencing and sequencing. DNA was sequenced on 377 DNA sequencer and Automatic ABI 373 A using Taq Cycle Sequencing Kit (purchased from Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Sequence analysis was performed using a sequencer.

2. 결 과2. Results

KS와 db 마우스의 맥락막총에서 분리한 mRNA에 대해 세미-네스티드 PCR(somi-nested PCR)을 실시하였다. 주형으로서 db cDNA를 사용하여 생성시킨 PCR 산물은 주형으로 Ks DNA를 사용한 것보다 약 100 bp 더 길었다. 두 PCR 산물 모두 곧바로 서열을 결정하였다. 이들 마우스의 맥락막총에서 발현된 mRNA 종의 짧은 형태 암호화 서열에서 서열 차이는 검출되지 않았다. 그러나, 두 형태가 공유하는 막통과 도메인에서 시작하여 긴 형태에 대해 특이한 세포내 도메인에서 끝나도록 생성시킨 PCR 산물의 서열을 결정할 경우에, 몇몇 조직에서 db/db와 대조간의 맹백한 차이에 주목하였다.MRNA isolated from choroid plexus of KS and db mice was subjected to semi-nested PCR. The PCR product generated using db cDNA as a template was about 100 bp longer than using Ks DNA as a template. Both PCR products were sequenced immediately. No sequence difference was detected in the short form coding sequence of mRNA species expressed in the choroid plexus of these mice. However, when determining the sequence of PCR products that started in the transmembrane domain that the two forms shared and ended in the intracellular domain specific for the long form, some tissues noticed the blind differences between db / db and control. .

서열결정 데이터는, 추정할 수 있는 obR의 db 긴 형태가 정상적인 긴 형태 전사체 내에 부가적인 106 bp 삽입물을 갖는 것으로 나타났다(도 9 참조). 이 106 bp는 마지막 5 개 아미노산을 코드화하는 서열, 종결 코돈 및 88 bp 의 3' UTR 짧은 형태 부위를 포함한다. db 긴 형태는 세포내 도메인이 결핍된 짧은 형태와 동일한 절두된 ObR 단백질을 생산한다. 우리는 모든 db 조직에서의 정상적인 긴 형태이나 대조 조직내 db 긴 형태 중 어느것도 검출하지 못했다.Sequencing data showed that the presumably db long form of obR had an additional 106 bp insert in the normal long form transcript (see FIG. 9). This 106 bp contains a sequence encoding the last 5 amino acids, a stop codon and a 88 bp 3 'UTR short form site. The db long form produces the same truncated ObR protein as the short form lacking the intracellular domain. We did not detect either normal long form in all db tissues or db long form in control tissues.

이러한 외관상의 스플라이싱 에러 메카니즘을 이해하기 위해, 우리는 db/db와 대조 마우스 간의 obR 유전 서열을 비교하였다.To understand this apparent splicing error mechanism, we compared the obR genetic sequence between db / db and control mice.

G → T로의 단일 뉴클레오티드 치환은 db/db 마우스내 106 bp 삽입 부위 바로 다음 2 bp에서 발견하였다. 이러한 치환으로 106 bp 단편을 db 긴 형태에 삽입된 엑손으로 치환시킨 스플라이스 공여자를 생성시켰다. 이러한 삽입으로 인해, db 긴 형태는 세포내 단일 도메인을 갖지 않는 절두된 단백질만을 생산한다. obR 과 가장 밀접하게 관련된 제 I 부류의 싸이토카인 수용체가 모두 긴 세포간 도메인을 가지기 때문에, 긴 형태는 긴 세포간 도메인은 세포내 신호 변환을 개시하는 데 중요하다. 이러한 데이터는 무게 변형에 대한 이 수용체의 역할을 뒷받침하며, db/db 마우스내 심각한 비만 표현형의 원인으로서 obR 긴 형태를 생산하는 데는 실패하였다.Single nucleotide substitutions from G to T were found at 2 bp immediately following the 106 bp insertion site in db / db mice. This substitution resulted in the splice donor replacing the 106 bp fragment with an exon inserted into the db long form. Due to this insertion, the db long form produces only truncated proteins that do not have a single intracellular domain. Since the class I cytokine receptors most closely associated with obR all have long intercellular domains, long forms are important for initiating intracellular signal transduction. These data support the role of this receptor on weight modification and failed to produce obR long forms as a cause of the severe obesity phenotype in db / db mice.

IX. 실시예: 사람 ObR을 코드화하는 핵산 클로닝IX. EXAMPLES Nucleic Acid Cloning Encoding Human ObR

본원은 사람 obR을 코드화하는 cDNA와 게놈 DNA를 클로닝하고 확인하는 것에 대하여 기술하고 있다.The present application describes cloning and identifying cDNA and genomic DNA encoding human obR.

A. 사람 obr cDNA 클로닝A. human obr cDNA cloning

스트라타진(Stratagene ; 미국 캘리포니아 라 졸라 소재)에서 구입한 Uni-Zap XR 벡터에서 사람 태아 뇌의 cDNA 도서관을 확인하기 위해 famj5312 cDNA 삽입물을 사용하였다. 태아의 뇌에서 유도한 cDNA 도서관은 그것이 맥락막총을 포함한 전체 뇌에 존재하는 cDNA, 마우스 obR cDNA 이 조직원(tissue source) 뿐만 아니라 시상하부에 존재하는 cDNA를 포함할 가능성이 있기 때문에 선택하였다.The famj5312 cDNA insert was used to identify the cDNA library of the human fetal brain in a Uni-Zap XR vector purchased from Stratagene (La Jolla, Calif.). The fetal brain-derived cDNA library was chosen because it is likely that cDNA, mouse obR cDNA, present in the entire brain, including the choroid plexus, may contain a tissue source as well as a cDNA present in the hypothalamus.

cDNA 도서관은 약 50,000 pfu/플레이트씩 20 개의 플레이트에 두었다. 애머샴 하이본드-N 나일론막 필터가 달린 각 플레이트에서 필터 리프트를 반복하여 실시하였다. 필터를 변성시켜 중화시킨 다음 표준 방법에 따라 교차-결합시켰다. 32P 표지된 뉴클레오티드 존재시에 무작위 초회항원자극시킴으로써 프로브를 방사성 표지하였다. 65℃ 의 추어치 완충액(Church's buffer ; 7 % SDS, 250 mM NaHPO4, 2uM EDTA, 1 % BSA)내에서 프로브와 함께 필터를 밤새 혼성화시켰다. 다음날, 필터를 65℃에서 2 XSSC/0/1 % SDS로 20 분간 세척한 다음 0.1 XSSC/0.1 % SDS로 10 분간 세척하였다.The cDNA library was placed on 20 plates at approximately 50,000 pfu / plate. Filter lifts were repeated on each plate with an Amersham Highbond-N nylon membrane filter. The filter was denatured and neutralized and then cross-linked according to standard methods. Probes were radiolabeled by randomized superantigen stimulation in the presence of 32P labeled nucleotides. Filters were hybridized overnight with probes in Chuch's buffer at 65 ° C. (7% SDS, 250 mM NaHPO 4, 2 uM EDTA, 1% BSA). The next day, the filter was washed for 20 minutes with 2 XSSC / 0/1% SDS at 65 ° C. and then for 10 minutes with 0.1 XSSC / 0.1% SDS.

그런 다음-80℃에서 코닥 필름에 5 시간 동안 노출시켰다. 반복하여 필터와 조화시킨 후, 13 개의 중복된 신호를 수득하였다. 플레이트 후에 이차적으로 각 주요 마개에 10 ul 의 1:1000 희석액을 플레이팅하였다. 동일한 프로브, 혼성 조건 및 세척 조건을 상기와 같이 사용하였다. 필름을 80℃에서 2 시간동안 노출시켰다. 본래 13 개의 양성 중 1 개 만이 필름상에서 중복 신호를 나타냈다.It was then exposed to Kodak film for 5 hours at -80 ° C. After repeated matching with the filter, 13 duplicated signals were obtained. Secondly after the plate was plated 10 ul of a 1: 1000 dilution on each major stopper. The same probes, hybrid conditions and wash conditions were used as above. The film was exposed at 80 ° C. for 2 hours. Only one of the 13 positives originally showed a duplicate signal on the film.

양성 플레이트에서 4 개의 독립적인 플라크를 처리하여 스트라타진에 기술한 바와 같이 엑사시스트 헬퍼 파지(ExAssist helper phage), XL1-블루 세포 및 SOLR 세포로 절단하였다. 절단된 생성물을 LB/Amp 플레이트에 플레이팅한 다음, 37℃에서 밤새 배양하였다. 흰색 콜로니 1 개를 각 플레이트에서 꺼내 액체 LB/Amp에서 밤새 37℃로 성장시켰다. 다음날 프로메가 위차드 미니-프렙 키드(Promega Wizard Mini-Prep Kit)로 미니프렙을 실시하였다. 삽입물의 크기는 EoRI 과 XhoI으로 미니-프렙 산물을 절단함으로써 결정하였다.Four independent plaques were treated in positive plates and cut into ExAssist helper phage, XL1-blue cells and SOLR cells as described for stratazine. The cleaved product was plated on LB / Amp plates and then incubated overnight at 37 ° C. One white colony was removed from each plate and grown overnight at 37 ° C. in liquid LB / Amp. The next day miniprep was performed with the Promega Wizard Mini-Prep Kit. Insert size was determined by cleaving the mini-prep product with EoRI and XhoI.

네 개의 클론 중 하나(d)는 약 6 kb 의 삽입물을 갖는다. 서열결정을 위한 DNA는 키아젠 플라스미드 맥시 키트를 이용하여 제조하였다.One of the four clones (d) has an insert of about 6 kb. DNA for sequencing was prepared using the Kyagen Plasmid Maxi Kit.

도 3은 신호 서열을 코드화하는 사람 obR cDNA 의 뉴클레오티드 서열(서열 3)(아미노산 잔기 1 내지 약 20), 세포외 도메인(아미노산 잔기 약 21 내지 약 839), 막통과 도메인(아미노산 잔기 약 840 내지 약 862) 및 세포질 도메인(아미노산 잔기 863 내지 1165)을 나타낸다.Figure 3 shows the nucleotide sequence of human obR cDNA encoding a signal sequence (SEQ ID NO: 3) (amino acid residues 1 to about 20), extracellular domain (amino acid residues about 21 to about 839), transmembrane domain (amino acid residues about 840 to about 862) and cytoplasmic domains (amino acid residues 863-1165).

B. 사람 obR 게놈 DNA 클로닝B. Human obR Genomic DNA Cloning

본원에 기술한 바와 같이, 우리는 사람 obR 게놈 DNA를 클로닝하였다. famj5312 cDNA 삽입물은 게놈 시스템스 인코포레이티드(Genome Systems Inc. ; 카탈로그 번호 FPAC-3386)에서 구입한 사람 고밀도 PAC 필터를 확인하는 데 사용하였다. 프로브는 프라임-이트 키트Prime-It Kit ; 스트라타진에서 구입 ; 카탈로그 번호 300392)를 이용하여 무작위 프라임 표지하였다. 혼성화는 제조자의 권고에 따라 애머샴 래피드-하이브 완충액(Amersham Rapid-hyb buffer)에서 실시하였다. 필터를 65℃에서 2 XSSC/1 % SDS로 세척한 다음 -80℃에서 코닥 필름에 노출시켰다.As described herein, we cloned human obR genomic DNA. The famj5312 cDNA insert was used to identify human high density PAC filters purchased from Genome Systems Inc. (Cat. No. FPAC-3386). Probes include Prime-It Kit; Purchase from stratazin; Randomized prime label using cat. No. 300392). Hybridization was carried out in Amersham Rapid-hyb buffer according to the manufacturer's recommendations. The filter was washed with 2 XSSC / 1% SDS at 65 ° C and then exposed to Kodak film at -80 ° C.

11 개의 추정가능한 양성 PAC 클론을 확인하였다. 기준이 되는 양성을 결정하였고 게놈 시스템스 인코포레이티드에서 클론을 구입하였다.Eleven presumable positive PAC clones were identified. Criteria positive were determined and clones were purchased from Genome Systems Inc.

obR 전사 해독 프레임의 5'(obrF4 및 obRR4) 및 3' (obRS 및 obRO) 말단의 프라이머쌍으로 PCR 실험함으로서 전체 ObR 암호화 명역을 함유하는 지에 대해, hobr-p87 이라 명명한, 기준이 되는 양성 P298-K6 클론을 더 확인하였다. 이러한 확인에 사용한 프라이머는 다음과 같다 :Positive P298, the reference positive homing for p298, designated hobr-p87 for containing the entire ObR coding region by PCR experiments with primer pairs at the 5 '(obrF4 and obRR4) and 3' (obRS and obRO) ends of the obR transcription translation frame -K6 clones were further identified. The primers used for this identification are as follows:

obRF 4 : 5'-CTGCCTGAAGTGTTAGAAGA-3'obRF 4: 5'-CTGCCTGAAGTGTTAGAAGA-3 '

obRR 4 : 5'-GCTGAACTGACATTAGAGGTG-3'obRR 4: 5'-GCTGAACTGACATTAGAGGTG-3 '

obRS : 5'-ACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGAC -3'obRS: 5'-ACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGAC -3 '

obRO : 5' -TGTGAGCAACTGTCCTCGAGAACT-3'obRO: 5 '-TGTGAGCAACTGTCCTCGAGAACT-3'

hobr-p87 클론은 1995년 12월 28일에 ATCC에 기탁하였다.The hobr-p87 clone was deposited with the ATCC on December 28, 1995.

X. 실시예 : ObR 면역 글로불린 융합 단백질의 구성X. Example: Construction of ObR Immunoglobulin Fusion Proteins

A. OBR-IG 융합 단백질의 제조A. Preparation of OBR-IG Fusion Proteins

면역글로불린 불변 부위에 결합한 융합 단백질로서 사람 ObR의 세포외 부분을 제조한다. 면역글로불린 불변 부위는 면역글로불린 구조에 고유한 효과인자 활성도를 감소시키거나 없애는 것을 포함한 유전적 변형을 함유할 것이다(예를들어, 1988년 9월 22일자 공개된 PCT 공개 번호 제 WO88/07089 호 참조). 간단히, PCR 중복 확장은 사람 IgG1 의 접번, CH2 및 CH3 부위를 코드화하는 DNA에 대해 사람 ObR의 세포외 부분을 코드화하는 DNA를 결합시키기 위해 가한다. 이것은 다음 부항목에 기술한 바와 같이 달성된다.An extracellular portion of human ObR is prepared as a fusion protein that binds to an immunoglobulin constant region. Immunoglobulin constant regions will contain genetic modifications, including reducing or eliminating effector activity inherent in immunoglobulin structures (see, eg, PCT Publication No. WO88 / 07089, published September 22, 1988). ). Briefly, PCR overlap extension is applied to bind DNA encoding the extracellular portion of human ObR to DNA encoding the junctional, CH2 and CH3 sites of human IgG1. This is accomplished as described in the next subsection.

B. 유전자 융합물(Fusions)의 제조B. Preparation of Gene Fusions

PCR 반응물은 최종 부피 100㎕로 제조되는데, 이는 Pfu 폴리메라아제와 프라이머(각 1uM), dNTPs(각 200uM) 및 1나노그램(ng)의 주형 DNA를 포함하는 버퍼(Stratagene)로 구성된다.The PCR reaction is prepared in a final volume of 100 μl, consisting of a Pfu polymerase and a buffer (Stratagene) containing primers (1 uM each), dNTPs (200 uM each) and 1 nanogram (ng) of template DNA.

DNA 단편은 DNA 서열 코드화 ObR ECD 또는 ob가 결합된 그것의 단백질에 대응하는데, 이는 완전한 사람의 ObR ECD를 코드화한 서열은 물론 소량의 5' 난코딩(noncoding) 서열을 확장하기 위해 설계된 프라이머 한쌍을 이용한 폴리메라아제 연쇄반응(PCR)에 의해 제조된다. 예를 들어, 정방향 프라이머:The DNA fragment corresponds to the DNA sequence coding ObR ECD or its protein to which ob is bound, which is a pair of primers designed to extend a small amount of 5 'noncoding sequence as well as the sequence encoding the complete human ObR ECD. It is prepared by the polymerase chain reaction (PCR) used. For example, forward primers:

5'-GTCACGATGTCGACGTGTACTTCTCTGAAGTAAGATGATTTG-3'5'-GTCACGATGTCGACGTGTACTTCTCTGAAGTAAGATGATTTG-3 '

는 5' 말단에 추가로 14 뉴클레오티드(SalI 위치를 포함한다)를 갖는 도3의 뉴클레오티드 -20에서 8까지에 대응한다. 역방향 프라이머:Corresponds to nucleotides -20 to 8 of Figure 3 with an additional 14 nucleotides (including the SalI position) at the 5 'end. Reverse primer:

5'-GTCAGGTCAGAAAAGCTTATCACTCTGTGTTTTTCAATATCATCTTGAGTGAA-3'5'-GTCAGGTCAGAAAAGCTTATCACTCTGTGTTTTTCAATATCATCTTGAGTGAA-3 '

는 5' 말단에 추가로 18 뉴클레오티드(HindIII 위치를 포함한다)를 갖는 도3의 뉴클레오티드의 보체(Complement) +2482에서 +2517까지에 대응한다. 사람의 ObR을 엔코팅한 cDNA는 여분세포의 도메인을 확장하기 위한 주형으로서 공급한다. 이들 프라이머를 갖는 PCR 확장은 ObR 여분세포 도메인을 코드화하는 DNA 단편을 생성한다.Corresponds to the complement +2482 to +2517 of the nucleotide of FIG. 3 with an additional 18 nucleotides (including the HindIII position) at the 5 'end. The cDNA, which is encoded by human ObR, serves as a template for expanding the domain of extra cells. PCR extension with these primers produces DNA fragments encoding the ObR extracellular domain.

두 번째 PCR 반응에 있어서, 프라이머의 두 번째 집합(Set)은 IgG 대조부위(힌지, CH₂, 및 CH₃, 도메인)을 확장하기 위해 설계되었는데, 역방향 프라이머는 독특한 제한위치를 갖으며, 정방향 프라이머의 서열은 ObR ECD 확장에 이용되는 역방향 프라이머의 5' 말단부위 즉, (예를 들어, 5'-AAGCTTTTCTGACCTGACNNN-3')에 대해 보완적인 5' 말단을 갖고, 이러한 것으로 ObR 코드화 뉴클레오티드내 개방리딩프레임은 도처에 길이가 확장된 IgG 뉴클레오티드 서열을 연속시킬 수 있을 것이다. 이 반응에 있어서, 주형 DNA는 사람 IgG 대량 연쇄 게놈 DNA의 2000 뉴클레이티드 세그먼트이다 (Ellison et al., 1982, Nuc. Acides. Res 10:4071-4079).In the second PCR reaction, a second set of primers was designed to extend the IgG control sites (hinge, CH ₂ , and CH ₃ , domain), with the reverse primer having a unique restriction site and a forward primer The sequence of has a 5 'end of the reverse primer used for ObR ECD extension, i.e., a 5' end that is complementary to (e.g., 5'-AAGCTTTTCTGACCTGACNNN-3 '), which is an open reading frame in the ObR encoded nucleotide. Will be able to sequence IgG nucleotide sequences of extended length everywhere. In this reaction, the template DNA is the 2000 nucleotide segment of human IgG bulk strand genomic DNA (Ellison et al., 1982, Nuc. Acides. Res 10: 4071-4079).

완전한 사람의 obR-IgG 융합 세그먼트는 추가 PCR 반응에 의해 제조된다. 상기 두 PCR 반응의 순수한 생성물을 서로 보완하는 두 단편의 말단을 단련시키기 위해 혼합하고, 변성시키고(95℃, 1분), 그리고 54℃에서 30분간 방치한다. 이들 성분(요소)은 dNTPs 및 Taq 폴리메라아제를 이용하여 충전되고, 완전한 단편은 첫 번째 PCR 반응의 정방향 PCR 프라이머와 두 번째 PCR 반응의 리버스 PCR 프라이머를 이용하여 충전된다. 발현벡터 속으로 편하게 클로닝하기 위해서, 최종 단편이 첫 번째 PCR 반응의 정방향 PCR 프라이머와 두 번째 PCR 반응의 리버스 PCR 프라이머안에 설계된 위치에서 인식된 제한 효소와 함께 쪼개어 진다. 다음 이 소화된 단편은 이들 제한효소로 처리된 발현벡터속으로 클로닝 된다.The complete human obR-IgG fusion segment is prepared by further PCR reaction. The pure products of the two PCR reactions are mixed to anneal the ends of the two fragments that complement each other, denatured (95 ° C., 1 minute), and left at 54 ° C. for 30 minutes. These components (urea) are filled using dNTPs and Taq polymerase, and the complete fragment is filled using the forward PCR primer of the first PCR reaction and the reverse PCR primer of the second PCR reaction. For convenient cloning into the expression vector, the final fragment is cleaved with restriction enzymes recognized at positions designed in the forward PCR primer of the first PCR reaction and the reverse PCR primer of the second PCR reaction. This digested fragment is then cloned into an expression vector treated with these restriction enzymes.

서열 분석은 구조를 확인하는데 이용되고, 그 구성은 일시적인 발현을 테스트하기 위해 COS 세포를 트랜스펙션 하는데 이용된다.Sequence analysis is used to confirm the structure and the construct is used to transfect COS cells to test transient expression.

본 발명의 기술에는 원하는 유전정보의 전사 및 해독 조절을 성취하기 위해 필요한 동종의 숙주 유기체 및 요소들과 같은 클로닝된 obR-IgG 융합단백질 속에서의 여러 가지 발현벡터에 영향을 주는 여러 가지 고찰을 포함하고 있다. 예를 들어, 만약 일시적 발현을 원하면 상기에서 생성된 obR-IgG 퓨젼 세그먼트를 발현벡터 pcDNA-1(Invitrogen) 속으로 클론되게 한다. 선택적으로, 융합 단백질의 안정한 발현은 발현벡터 pcDNA-3(Invitrogen) 속으로 obR-IgG 융합 세그먼트가 클로닝 됨으로써 성취될 수 있다.Techniques of the present invention include several considerations that affect various expression vectors in cloned obR-IgG fusion proteins, such as homologous host organisms and elements necessary to achieve transcriptional and translational control of desired genetic information. Doing. For example, if transient expression is desired, the generated obR-IgG fusion segments are cloned into the expression vector pcDNA-1 (Invitrogen). Alternatively, stable expression of the fusion protein can be achieved by cloning the obR-IgG fusion segment into the expression vector pcDNA-3 (Invitrogen).

선택적으로, 마우스 및/또는 사람의 obR-IgG 융합 단백질은 이를테면 이미 IgG 불변부위에 들어있는 CD5-IgG1 벡터(Aruffo et al., 1990, Cell, 61:1303-1313)와 같은 발현벡터를 사용하여 만들 수 있다. 이 방법에 의해, 도메인을 코드화 한 개방리딩프레임을 연속시키기 위한 PCR 반응에서 그리고 IgG 대조부위를 코드화한 프레임내에서 ObR 여분세포의 도메인을 코드화한 DNA 단편이 만들어진다.Optionally, mouse and / or human obR-IgG fusion proteins may be expressed using expression vectors, such as the CD5-IgG1 vector (Aruffo et al., 1990, Cell, 61: 1303-1313) already contained in IgG constant regions. I can make it. By this method, DNA fragments encoding domains of ObR extra cells are produced in PCR reactions for continually opening domain-encoding open reading frames and in frames encoding IgG control regions.

예를 들어, 마우스와 사람 ObR의 여분세포 도메인(신호 펩티드를 포함한다)은 Extaq(Panvera Crop.)와 함께 PCR 확장된다. 첫 번째 만들어진 발현 구성 안에서 다음의 프라이머를 마우스와 사람 ObR의 확장을 위해 사용하였다.For example, extracellular domains (including signal peptides) of mouse and human ObR are PCR extended with Extaq (Panvera Crop.). In the first construct of expression, the following primers were used for expansion of mouse and human ObR.

마우스mouse

정방향 프라이머: 5'-CCCAATGTCGACATGATGTGTCAGAAATTCTAT-3'Forward primer: 5'-CCCAATGTCGACATGATGTGTCAGAAATTCTAT-3 '

역방향 프라이머: 5,-AAAAAGGATCCGGTCATTCTGCTGCTTGTCGAT-3'Reverse primer: 5, -AAAAAGGATCCGGTCATTCTGCTGCTTGTCGAT-3 '

사람Person

정방향 프라이머: 5'-CCCAATGTCGACATGGTGTACTTCTCTGAAGTA-3'Forward primer: 5'-CCCAATGTCGACATGGTGTACTTCTCTGAAGTA-3 '

역방향 프라이머: 5,-TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3'Reverse primer: 5, -TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3 '

상기 각 정방향 프라이머에는 SalI 제한위치에 들어있고, 각 역방향 프라이머는 BamHI 제한위치에 들어있다. 주형으로서 마우스와 사람 obR cDNAs를 이용하여 확장시킨 후 최종 PCR 단편은 CD%-IgG 벡터(Aruffo et al., 1990, Cell)의 XhoI/BamHI 위치 속으로 클로닝 된다. 이 최종 벡터는 일시적으로 COS 세포속에 감염되고, 조건부 매개체가 만들어진다.Each forward primer is in the SalI restriction site, and each reverse primer is in the BamHI restriction site. After expansion using mouse and human obR cDNAs as templates, the final PCR fragment is cloned into the XhoI / BamHI position of the CD% -IgG vector (Aruffo et al., 1990, Cell). This final vector is transiently infected with COS cells and conditional mediators are made.

단백질 A를 갖는 대조 배지의 면역침강법(Immunoprecipitation, IP)과 SDS PAGE에 의한 분석은 마우스 ObR IgG 융합이 사람 ObR-IgG 보다 많게 발현되 것으로 나타났다. 사람 ObR-IgG의 발현을 향상시키기 위하여 프라이머는 사람 ObR의 여부세포 도메인이 확장되도록 설계되어야 하며, 이 단편은 CD5-IgG 벡터 속으로 마우스의 신호 펩티드가 코드화된 서열을 같이 동여메야 한다. 다음의 프라이머를 마우스 ObR 신호펩티드에 융합한 사람 ObR ECD 단편의 확장에 사용하였다:Analysis by immunoprecipitation (IP) and SDS PAGE of control medium with protein A showed that mouse ObR IgG fusion was expressed more than human ObR-IgG. In order to enhance the expression of human ObR-IgG, the primers should be designed to expand the human ObR epithelial cell domain, and the fragments should also incorporate the sequence encoded by the signal peptide of the mouse into the CD5-IgG vector. The following primers were used to expand human ObR ECD fragments fused to mouse ObR signal peptides:

정방향 프라이머: 5'-TTTAACTTGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGC-3'Forward primer: 5'-TTTAACTTGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGC-3 '

역방향 프라이머: 5'-TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3'Reverse primer: 5'-TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3 '

확장, 제한효소 흡수(digestion) 및 서브클로닝 후, 최종 구성은 일시적으로 COS 세포내에 발현된다. 최종 조건부 매개체의 IP 및 SDS-PAGE 분석은 170 KD 사람 ObR IgG 융합의 성공적인 발현을 보여주는 것이다. 면역글로불린 융합 단백질의 발현을 향상시키기 위해 택한 방법은 ObR 여분세포 도메인을 CD5 신호 펩티드가 성숙한 여분세포 도메인에 녹아 들어가도록 하기 위한 방법으로 CD5-IgG1 벡터속에 삽입하는 것을 포함한다. 이러한 신호 펩티드 융합은 면역글로불린 융합 단백질의 발현이 향상되는 것을 보여주는 것이다.After expansion, restriction digestion and subcloning, the final construct is transiently expressed in COS cells. IP and SDS-PAGE analysis of the final conditional mediators show successful expression of 170 KD human ObR IgG fusions. The method chosen to enhance the expression of the immunoglobulin fusion protein involves inserting the ObR extracellular domain into the CD5-IgG1 vector to allow the CD5 signal peptide to melt into the mature extracellular domain. This signal peptide fusion shows that the expression of immunoglobulin fusion proteins is enhanced.

C. 변형된 CH₂도메인의 제조C. Preparation of Modified CH ₂ Domains

위에서 만들어진 obR-IgG 유전자 융합의 뉴클레오티드 서열은 Fc 수용체에 대한 IgG 결합 및 보완 활성화가 요구되는 것으로 보이는 CH₂도메인내에서 세린 잔기 및/또는 아미도산을 갖는 힌지(hinge) 부위에서 시스테인(cysteine) 잔기를 대체하기 위해 변형될 수 있다.The nucleotide sequence of the obR-IgG gene fusion made above is a cysteine residue at the hinge site with serine residues and / or amido acids in the CH ₂ domain which appears to require IgG binding and complement activation to the Fc receptor. It can be modified to replace.

Fc 수용체에 대한 결합내에 포함되는 아미노산을 대체하기 위한 CH2의 변형환은 다음과 같이 성취된다. 위에서 만들어진 플라스미드 구성은 ObR-IgCγ1 CH2 도메인의 변형을 위한 주형을 제공한다. 이 주형은 상기 첫 번째 PCR 반응에서 설명한 정방향 PCR 프라이머 및 Leu to Ala, Leu to Glu 및 Gly to Ala로부터 아미노산 234, 235 및 237(Canfield, S.M. and Morrison, S.L. (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491)을 바꾸기 위해 설계된 5개의 뉴클레오티드 치환물 이외의 IgG1의 CH2 도메인의 5' 말단 단백질에 일치하도록 설계된 역방향 프라이머 이용하여 확장시킨 PCR이다. 이들 PCR 프라이머를 갖는 확장은 CH2 도메인의 변경된 단백질로 구성된 DNA 단편을 초래한다. 두 번째 PCR 반응에 있어서, 주형은 상기 두 번째 PCR 반응에서 이용된 역방향 프라이머를 확장시킨 PCR이고, 정방향 프라이머는 Ig 단백질 분자에 대해 상보적이고 CH2 아미노산 대체물을 필요로 하는 다섯 개의 뉴클레오티드 변환체가 들어있다. 이들 프라이머를 갖는 PCR 확장은 CH2 도메인, 인트론, CH3 도메인 및 3' 부가 서열의 변경된 단백질로 구성된 단편을 초래한다. 변경된 CH2 도메인으로 구성된 완전한 obR-IgCγ1 세그멘트는 추가 PCR 반응에 의해 제조되었다. 상기 두 개의 PCR 반응의 순수한 생성물을 단련에 의해 두 단편의 서로 보완적인 말단을 유지하기 위하여 혼합하고, 95℃에서 1분간 변성하고, 다음 54℃에서 30분간 방치하였다. 이들 성분을 dNTP 및 Taq 폴리메라아제를 이용하여 충전하고, 완전한 단편은 첫 번째 PCR 반응의 정방향 PCR 프라이머 및 두 번째 PCR 반응의 리버스 PCR 프라이머를 이용하여 확장시켰다. 발현벡터를 클로닝하기 위하여, 다음 최종 단편은 첫 번째 PCR 반응의 정방향 PCR 프라이머 및 두 번째 PCR 반응의 리버스 PCR 프라이머에 대해 특정한 위치를 기억하는 제한효소와 함께 분할 시켰다. 다음 소화 단편을 발현벡터 속으로 클로닝하고, 이들 제한효소와 함께 처리하였다.A modified ring of CH2 to replace the amino acid contained in the binding to the Fc receptor is achieved as follows. The plasmid construct made above provides a template for modification of the ObR-IgCγ1 CH2 domain. This template was prepared using the forward PCR primers described in the first PCR reaction and amino acids 234, 235 and 237 from Leu to Ala, Leu to Glu and Gly to Ala (Canfield, SM and Morrison, SL (1991) J. Exp. Med. 173 : PCR expanded with reverse primers designed to match the 5 'terminal protein of the CH2 domain of IgG1 other than the 5 nucleotide substitutions designed to alter (1483-1491). Expansion with these PCR primers results in DNA fragments consisting of altered proteins of the CH2 domain. In the second PCR reaction, the template is a PCR that extends the reverse primer used in the second PCR reaction, and the forward primer contains five nucleotide transformants that are complementary to the Ig protein molecule and require a CH2 amino acid replacement. PCR extension with these primers results in fragments consisting of altered proteins of the CH2 domain, intron, CH3 domain and 3 ′ addition sequence. Complete obR-IgCγ1 segments composed of altered CH2 domains were prepared by further PCR reactions. Pure products of the two PCR reactions were mixed by annealing to maintain complementary ends of the two fragments, denatured at 95 ° C. for 1 minute, and then left at 54 ° C. for 30 minutes. These components were filled with dNTP and Taq polymerases, and the complete fragments were expanded using the forward PCR primer of the first PCR reaction and the reverse PCR primer of the second PCR reaction. To clone the expression vector, the following final fragment was split with restriction enzymes that store specific positions for the forward PCR primer of the first PCR reaction and the reverse PCR primer of the second PCR reaction. The digested fragments were then cloned into expression vectors and treated with these restriction enzymes.

서열 분석은 구성 및 구조를 확인하기 위해 사용하였으며, 일시적인 발현을 알아보기 위한 COS 세포의 트랜스펙션하는데 사용하였다. hIgG ELISA는 대략적으로 100ng 단백질/㎖ 세포 상청액과 동등한 일시적 발현 수준을 알아보기 위해 사용되었다. CHO 세포주는 융합단백질의 영구적인 발현을 위해 트랜스펙션시켰다.Sequence analysis was used to confirm construction and structure, and to transfect COS cells to examine transient expression. hIgG ELISA was used to determine transient expression levels approximately equivalent to 100 ng protein / ml cell supernatant. CHO cell lines were transfected for permanent expression of the fusion protein.

D. OBR-Ig 중화 Ob 단백질D. OBR-Ig Neutralizing Ob Protein

ObR-IgG 융합단백질이 생체외에서 그리고 쥐(mice)에게서 OB 단백질(랩틴: laptin) 경합 및 중화시킬 수 있는지를 알아보기 위해서, 293 세포내에서 마우스 ObR-IgG 융합 단백질을 이용하여 크기가 큰 일시적인 트랜스펙션을 실행하였다. ObR-IgG 단백질은 단백질 A 칼럼에서 동질성을 가질 정도로 정제되었으며, 세포 표면 PbR에 대하여 알카라인 포스파타제-OB 융합단백질(AP-OB)의 결합을 억제할 수 있는 가능성에 대해 분석하였다.To determine if the ObR-IgG fusion protein can compete and neutralize OB protein (laptin) in vitro and in mice, a large transient transfection using mouse ObR-IgG fusion protein in 293 cells We ran the specification. The ObR-IgG protein was purified to homogeneity in the Protein A column and analyzed for the possibility of inhibiting the binding of alkaline phosphatase-OB fusion protein (AP-OB) to cell surface PbR.

COS 세포는 마우스 obR cDNA에 일시적으로 감염되었으며, o.5nM AP-OB을 결합하기 위한 이들의 능력에 대해 테스트 하였다. 도10에서 알 수 있는 바와 같이, 정제된 ObR-IgG는 세포 표면 ObR에 대한 AP-OB 융합단백질의 억제, 또는 중화, 결합에 대해 효과적이다.COS cells were transiently infected with mouse obR cDNA and tested for their ability to bind o.5nM AP-OB. As can be seen in FIG. 10, purified ObR-IgG is effective against inhibition, neutralization, or binding of AP-OB fusion proteins to cell surface ObR.

도 10에서, 컬럼1은 ObR-IgG 융합단백질 존재하에서 관찰된 높은 수준의 뚜렷한 결합을 보여준다. 컬럼2, 및 4는 정제된 ObR-IgG의 3개의 서로 다른 컬럼 단편에서 관찰된 결합의 가장 완벽한 억제를 보여준다.In Figure 10, column 1 shows the high level of pronounced binding observed in the presence of ObR-IgG fusion protein. Columns 2, and 4 show the most complete inhibition of binding observed in three different column fragments of purified ObR-IgG.

ⅩⅠ. 긴 형태의 OBR은 IL-6 타입의 싸이토카인(cytokine) 수용체의ⅩⅠ. The long form of OBR is a type of cytokine receptor of the IL-6 type.

시그널링 능력을 갖는다.Has signaling capability.

클로닝 된 ObR 이소포옴(isoforms)이 신호에 대해 요구에 맞는지의 여부를 알아보기 위해, ObR 유전자를 설계된 조직배양 세포주내에 삽입하고, OB 처리에 대한 세포 응답을 이것을 구조상 관계있는 IL-6 타입 싸이토카인 수용체에 의해 전달한 것과 비교하였다. 이 실시예에서 나타난 결과는 ObR 긴 형태가 신호에 감염되는 분자라는 증거를 제공하고, 기능적인 특성 IL-6 타입의 싸이토카인 수용체과 같다는 것을 의미한다.To determine whether cloned ObR isoforms meet the requirements for the signal, the ObR gene is inserted into a designed tissue culture cell line and the cellular response to OB treatment is linked to structurally relevant IL-6 type cytokine receptors. Compared to that delivered by. The results presented in this example provide evidence that the ObR long form is the molecule that is infected with the signal and means that it is the same as the functional trait IL-6 type cytokine receptor.

A. 재료 및 방법A. Materials and Methods

1. 세포1. Cell

COS-1, COS-7, H-35 (Baumann, et al., 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci. 557:280-297), HepG2 및 Hep3B (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:23254-23257) 세포는 다음과 같이 배양하였다. 세포를 0.5% 태아 송아지의 장액이 단독으로 들어 있어나 여기에 1μM의 덱사메타손(dexa metasone), 0.1-1000ng/㎖의 사람 OB, 1000ng/㎖의 마우스 OB, IL-6(genetics Institute) 또는 G-CSF(Imunex Corp.)가 보충적으로 함께 들어 있는 배지에 처리하였다. gp130에 의한 신호를 차단하기 위해서 세포에 사람의 gp130, B-R3 및 144(20㎍/㎖)에 대항하는 두 개의 판블로킹(panblocking) 모노클로날(monoclonal) 항체의 조합에 의해 처리하였다 (Chevalier, et al., 1995, N.Y. Acad Sci. 762:482-484).COS-1, COS-7, H-35 (Baumann, et al., 1989, Ann. NY Acad. Sci. 557: 280-297), HepG2 and Hep3B (Lai, et al., 1995, J. Biol. 270: 23254-23257) cells were cultured as follows. Cells contained only 0.5% fetal calf intestinal fluid but contained 1 μM of dexamethasone, 0.1-1000 ng / ml of human OB, 1000 ng / ml of mouse OB, IL-6 (genetics Institute) or G- Treated with medium supplemented with CSF (Imunex Corp.) supplementally. Cells were treated with a combination of two panblocking monoclonal antibodies against human gp130, B-R3 and 144 (20 μg / ml) to block the signal by gp130 (Chevalier). , et al., 1995, NY Acad Sci. 762: 482-484).

2. 발현인자 및 고양이 리포터 유전자 구성2. Composition of expression factor and cat reporter gene

긴 형태의 사람 ObR 및 짧은 형태의 마우스 ObR의 발형벡터는 상기 섹션 7-9에 설명되어 있다. 잘라버린 사람의 G-CSFR(27) (Ziegler, et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:2384-2390) 및 쥐(rat)의 STAT1, STAT3 및 STAT5B (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Ripperger, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:29998-30006)이 설명되어 있다. 변이된 박스 3 서열(Y1141F)을 갖는 ObR은 특정 아미노산 치환물을 코드화한 합성 유기뉴클레오티드를 사용한 확장 PCR을 오버랩함에 의해 만들어진다(Higuchi, et al., 1988, Nucleic Acids Res., 12:5707-5717). y1141F는 위치 1141의 펜아일아미노(phenyalamino)에 티로신(tyrosine)이 대체되어 있다. 쥐(rat) STAT3가 들어있는 플라스미드 SV-SPORT!(Life Technologies, Inc.)는 두 개의 코돈에 대해 코돈 716 및 717의 변환에 의해 만들어진 55 카르복시-말단 잔기에 의해 절단되었다. 이 CAT 리포터 유존자 구성, pHRRE-CAT 및 pIL-6RE-CAT는 이전에 설명한 바 있다(Lia, etal., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem.,270:8298-8310)Footprint vectors of the long form of human ObR and the short form of mouse ObR are described in sections 7-9 above. G-CSFR (27) (Ziegler, et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 2384-2390) in rats and rats STAT1, STAT3 and STAT5B (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Ripperger, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 29998-30006. ObR with a mutated Box 3 sequence (Y1141F) is made by overlapping extended PCR with synthetic organic nucleotides encoding specific amino acid substitutions (Higuchi, et al., 1988, Nucleic Acids Res., 12: 5707-5717 ). y1141F is substituted for tyrosine at phenyalamino at position 1141. Plasmid SV-SPORT! (Life Technologies, Inc.) containing rat STAT3 was cleaved by 55 carboxy-terminal residues made by conversion of codons 716 and 717 for two codons. This CAT reporter adjuvant composition, pHRRE-CAT and pIL-6RE-CAT, has been described previously (Lia, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Morella, et al., 1995 , J. Biol. Chem., 270: 8298-8310)

3. 세포 트랜스펙션 및 분석3. Cell Transfection and Analysis

COS-, H-35 및 Hep3B 세포는 DEAE-덱스트란 방법에 의해서는 플라스미드 DNA와 함께 감염되고(Lopata, et al., 1989, Nucleic Acids Res., 12:5707-5717), 칼슘 포스페이트 방법에 의해서는 HepG2 세포와 함께 감염되며(Graham, etal., 1973, Virology, 52:456-461), 그리고 리포펙타민(lipofectamine) 방법에 의해서는 COS-7 세포와 함께 감염된다. COS 세포의 2차 배양은 15분 동의안 싸이토카인(cytokins) 처리에 의한 STAT 단백질의 활성화 이전에 세륨이 없는 배지에서 16시간 동안 유지하였다. STAT 단백질에 의해 결합된 DNA는 사도우스키(sadowski) 등 (1993, Science, 26:1739-1744) 이 설명한바 있듯이 전체 세포의 추출 도중에 EMSA에 의해 결정된다.COS-, H-35 and Hep3B cells are infected with plasmid DNA by the DEAE-dextran method (Lopata, et al., 1989, Nucleic Acids Res., 12: 5707-5717) and by the calcium phosphate method. Is infected with HepG2 cells (Graham, et al., 1973, Virology, 52: 456-461), and with COS-7 cells by the lipofectamine method. Secondary cultures of COS cells were maintained for 16 hours in media without cerium prior to activation of STAT protein by cytokine treatment in 15 minutes. DNA bound by the STAT protein is determined by EMSA during the extraction of whole cells, as described by Sadowski et al. (1993, Science, 26: 1739-1744).

높은 친화력을 갖는 SIEm67(Sadowski, etal., 1993, Science, 26:1739-1744) 및 TB-2(Ripperger, etal., 1995, J. Biol. Chem., 270:29998-30006)용 두 성분의 오기노뉴클레오티드는 EMSA 기질로서 채워진다. CAT 유전자가 감염된 세포 배양균은 24시간 동안 싸이토카인 이나 OB와 함께 처리되었다. CAT 활성물은 세포추출물의 희석물을 테스트 함에 의해 양을 결정하였고, 동시 감염된 메이커 플라스미드 pIE-MUP (Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310)의 발현을 위해 표준화 하였으며, 각 실험에 있어서 무처리 대조배지를 기준으로 비교 표시하였다 (as=1.0으로 정의한다).Of the two components for high affinity SIEm67 (Sadowski, et al., 1993, Science, 26: 1739-1744) and TB-2 (Ripperger, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 29998-30006) Oginonucleotides are filled as EMSA substrates. Cell cultures infected with CAT genes were treated with cytokines or OBs for 24 hours. CAT activity was determined by testing the dilution of the cell extracts and the expression of the co-infected maker plasmid pIE-MUP (Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 8298-8310). Standardization was performed for each experiment. In each experiment, untreated control medium was compared and expressed (as as defined as 1.0).

퀀티테이티브(quantitative) 세포 표면에 결합된 AP-OB 융합 단백질(섹션 6)은 필연적으로 챈(Cheng)과 프라나겐(Flanagen)에 의해 정립된 것과 같다 (Cheng & Flanagan, 1994, Cell, 79:157-168).AP-OB fusion proteins (section 6) bound to quantitative cell surfaces are inevitably the same as those established by Cheng and Flanagen (Cheng & Flanagan, 1994, Cell, 79: 157-168).

B. 결과 및 토의B. Results and Discussion

1. OBR은 STAT 단백질을 활성화한다.1. OBR activates the STAT protein.

ObR이 세포의 신호 머쉬너리(machinery)를 보충하는 능력을 가졌는지 여부를 알아보기 위하여, COS 세포를 두 개의 대표적인 ObR, 즉 마우스 짧은 형태(db/db 마우스에서 검출된 성숙한 형태에 대응하는) 및 사람의 긴 형태용 발현벡터와 함께 일시적으로 감염시켰다. 감염 2일 후 알카라인 포스포타제-OB(AP-OB) 융합단백질의 특정 결합에 의해 나타난 것과 같이 검출된 1nM의 사람 또는 마우스 알카라인 포스포타제-OB 세포 표면 발현된 ObR내에 배양하였다. 짧은 형태의 ObR의 트랜스펙션은 대략적으로 긴 형태에 비하여 10-배(fold) 높은 결합을 같은 것으로 나타났다.To determine whether ObR had the ability to supplement the cell's signal machinery, COS cells were divided into two representative ObRs, namely the mouse short form (corresponding to the mature form detected in db / db mice) and humans. It was temporarily infected with the long form of the expression vector. Two days after infection, the cells were cultured in 1 nM of human or mouse alkaline phosphatase-OB cell surface expressed ObR detected as indicated by specific binding of the alkaline phosphatase-OB (AP-OB) fusion protein. Transfection of the short form of ObR showed the same 10-fold higher binding than the long form.

다수의 AP-OB 농도에서 실행한 스켓차드(scatchard) 변형의 결합 데이터는 긴 형태에서 관찰된 보다 낮는 결합이 세포 표면 발현의 감소에 주원인이 있다는 것을 지시하는 것이다. 마우스의 짧은 형태는 0.7nM 근방에서 쥐(murine) 및 사람 리간드에 모두 결합되고, 사람의 긴 형태는 1.0nm 근방에서 쥐와 사람 리간드 모두에 결합된다.Binding data of the scatchard modifications performed at multiple AP-OB concentrations indicate that the lower binding observed in the long form is the main cause of the decrease in cell surface expression. The short form of the mouse is bound to both murine and human ligands near 0.7 nM and the long form of human is bound to both rat and human ligands near 1.0 nm.

COS-1 세포는 사람 또는 마우스 ObR(2㎍/㎖) 및 여러종류의 STAT 단백질(3㎍/㎖)용 발현 벡터들과 함께 동시에 감염된다. ObR 및 여러종류의 STAT 리소포옴용 발현벡터의 동시감염은 특정 STAT 단백질의 리간드-감소 활성이 있다는 분석을 가능케 한다. 감염된 세포를 쥐의 OB(100ng/㎖)의 존재 또는 부존재하에서 15분간 처리하고, STAT 단백질이 결합된 DNA 활성을 특징적인 오기노뉴클레오티드 기질 STE 또는 TB-2를 이용한 EMSA에 의해 확인하였다. 이 실험에서, 오로지 긴 형태의 ObR은 내생적인 COS STAT 단백질이나 동시에 발현된 STAT1, STAT3 또는 STAT5B에 의해 활성화된다. 모든 STAT 리소포옴의 ObR에 의한 활성은 리간드에 독립적이다. 반면에, 짧은 형태의 ObR은 표면 발현이 높았음에도 불구하고 내생적이거나 동시 감염된 STAT 단백질 어떠한 것에 대해서도 활성이 불가능하다. 긴 형태의 ObR은 G-CSFR, LIFR 및 gp130(Kishimoto, et al., 1995, Blood, 86:1243-1254; Lia, et al., 1995, J.Biol. Chem., 270:23254-23257)에 의해, 모든 STAT 단백질에 의해 활성화 되며, 긴 형태의 ObR은 특정한 IL-6 형태의 시토신 수용체와 함께 전사되는 것을 자극하기 위한 것이라는 것을 예견해 준다.COS-1 cells are simultaneously infected with expression vectors for human or mouse ObR (2 μg / ml) and several STAT proteins (3 μg / ml). Co-infection of the expression vector for ObR and several STAT lipoforms allows analysis of the ligand-reducing activity of a particular STAT protein. Infected cells were treated for 15 minutes in the presence or absence of mouse OB (100 ng / ml), and DNA activity with STAT protein binding was confirmed by EMSA using the characteristic iognonucleotide substrate STE or TB-2. In this experiment, only the long form of ObR is activated by the endogenous COS STAT protein or simultaneously expressed STAT1, STAT3 or STAT5B. ObR activity of all STAT lipoforms is ligand independent. On the other hand, the short form of ObR is inactive against any endogenous or co-infected STAT protein despite its high surface expression. Long forms of ObR are G-CSFR, LIFR and gp130 (Kishimoto, et al., 1995, Blood, 86: 1243-1254; Lia, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257) It is activated by all STAT proteins and predicts that the long form of ObR is intended to stimulate transcription with a particular IL-6 form of cytosine receptor.

2. OBR 신호들은 유전자 발현을 유도한다2. OBR Signals Induce Gene Expression

설치류와 사람의 간암 세포주는 지정된 장소 이외의 곳에 발현되는 해마토프로테인(hematoprotein) 수용체의 유전자 감소 현상을 확인하는데 이용되었다(Baumann, et al., Mol. Cell. Biol., 14:138-146). c3개의 상보적인 간암 세포주를 ObR 시그널링을 특정화하는데 이용하였다. 긴 형태 또는 짧은 형태의 ObR 또는 사람 G-CSFR을 HRRE-CAT 리포터 유전자 구성과 함께 쥐의 H-35 세포에 삽입하였는데, 이것의 발현이 많은 해마토프로테인 수용체의 신호에 의해서 이들 세포안에서 향상되었다(Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310). 2차 배양체를 24시간 동안 세륨이 없는 배지 또는 싸이토카인(mOB, LiF 또는 IL-6)이 들어있거나 덱사메타손이 들어있어나 들어있지 않은 배지 안에서 처리하였다. 긴 형태의 ObR은 CAT 유전자 발현에 감응하여 리간드에 독립적으로 전달되었다. 이러한 행동(활성)은 덱사메타손에 의해 향상된다. ObR에 의해 전달된 세포 응답은 내생적은 IL-6R과는 비슷하지만 특별히 내생적인 LIFR과는 차이가 있다. 반면에, 짧은 형태의 ObR은 박스 1과 관련된 모티브(motif)의 존재에도 불구하고 34 잔기 세포질(cytoplasmic) 도메인을 지시하는 유전자 발현을 감소시키는데 실패했으며, 세포 시그널링 요소의 보충에도 소용이 없었다. 27 잔기가 잘려진 키토프라스믹 도메인을 갖는 G-CSFR이 리간드 존재하여 여전히 유전자 전사를 감소시킨다는 사실은 세포가 짧고 박스-1이 들어있는 해마토프로테인 수용체의 키토플라스믹 도메인으로부터 유도된 신호에 대해 응답 가능하다는 것을 설명해 주는 것이다. G-CSFR 감염 대조세포에서 CAT 유전자 발현의 유도 부족은 H-35 세포가 감염 ObR의 존재하에 OB에 대하여 응답하지 않는다는 것을 설명해 주는 것이다.Rodent and human hepatocellular carcinoma cell lines have been used to identify gene reduction in hematoprotein receptors expressed outside of designated sites (Baumann, et al., Mol. Cell. Biol., 14: 138-146). . c3 complementary liver cancer cell lines were used to characterize ObR signaling. Long or short form of ObR or human G-CSFR, along with HRRE-CAT reporter gene construct, was inserted into mouse H-35 cells, the expression of which was enhanced in these cells by the signals of many haematoprotein receptors ( Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 8298-8310). Secondary cultures were treated for 24 hours in medium without cerium or medium with or without cytokines (mOB, LiF or IL-6) or with or without dexamethasone. Long forms of ObR were delivered ligand-independently in response to CAT gene expression. This behavior is enhanced by dexamethasone. The cellular response delivered by ObR is endogenous to IL-6R, but different from endogenous LIFR. On the other hand, the short form of ObR failed to reduce gene expression indicative of the 34 residue cytoplasmic domain, despite the presence of a motif associated with Box 1, and was of no use in supplementation of cell signaling elements. The fact that G-CSFR with a truncated chitoprasmic domain of 27 residues is still present in the ligand and still reduces gene transcription is responsive to signals derived from the chitoplasmic domain of the haematoprotein receptor, which is short in cells and contains Box-1. Explain that it is possible. Lack of induction of CAT gene expression in G-CSFR infected control cells explains that H-35 cells do not respond to OB in the presence of infected ObR.

3. OBR은 gp-130과 무관하게 기능한다3. OBR functions independently of gp-130

상술한 결과는 긴 형태의 ObR이 IL-6R의 그것과 유사하게 시그널링 경로를 재편성한 모델을 제공한다. 다음, gp130이 기능적인 ObR의 일부인지를 결정하기 위하여, 긴 형태의 ObR을 HRRE-CAT 또는 IL-6RE-CAT와 함께 HepG2 세포속에 집어넣고, 항 gp130 항체의 억제 효과를 알아보았다.The above results provide a model in which the long form of ObR reorganizes signaling pathways similar to that of IL-6R. Next, in order to determine if gp130 is part of a functional ObR, long form ObR along with HRRE-CAT or IL-6RE-CAT was inserted into HepG2 cells and the inhibitory effect of anti-gp130 antibody was examined.

감염된 HepG2 세포를 마우스나 사람의 OB와 함께 처리하는 것은 IL-6에 의해 생산된 것(30-40배 자극)의 범주에서와 같은 강한 유도를 이끌어낸다. 용량 응답 분석은 100ng/㎖ Ob에서 최대의 조절이 얻어질 수 있었다는 것을 확인해 준다. 4개의 독립적인 실험에서, 1-5ng/㎖ OB가 최대의 절반에 해당하는 자극을 생산하고, 100ng/㎖에서 최대값 보다 작은 자극이 얻어진다는 것을 확인하였다. 인강의 gp130에 대항하는 단일세포의 항체 존재하에서, IL-6 타입의 싸이토카인 수용체에 의해 시그널링을 방해한다는 것을 알았으며(Chevalier, et al., 1995, N.Y. Acad. Sci., 762:482-484), IL-6에 의한 유전자 발현의 자극이 기대된 바와 같이 폐지되었다. 이러한 결과는 ObR이 기능적으로 gp130(항 gp130에 대해서는 민감)에 대해 독립적이고, 신호의 개시가 수용체 호모-올리고머라이제이션(homo-oligomerization)에 의해 트리거 된다는 사실을 확인해 주는 것이다.Treatment of infected HepG2 cells with mouse or human OBs leads to strong induction as in the category of those produced by IL-6 (30-40 fold stimulation). Dose response analysis confirms that maximum control at 100 ng / ml Ob could be obtained. In four independent experiments, it was confirmed that 1-5 ng / ml OB produced up to half of the stimuli and a stimulus less than the maximum was obtained at 100 ng / ml. In the presence of a single cell antibody against gp130 in the lumen, it was found to interfere with signaling by an IL-6 type cytokine receptor (Chevalier, et al., 1995, NY Acad. Sci., 762: 482-484). , Stimulation of gene expression by IL-6 was abolished as expected. These results confirm that ObR is functionally independent of gp130 (sensitive to anti gp130) and that the initiation of the signal is triggered by receptor homo-oligomerization.

4. OBR의 박스 3 서열 및 STAT3는 시그널링에 포함된다4. Box 3 sequence of OBR and STAT3 are included in signaling

IL-6 RE를 경유한 전사의 유도는 그들의 키토프라스믹 도메인에 적어도 1 사본 이상의 박스 3 모티브(YXXQ)가 들어있는 IL-10R의 해마토프로테인 수용체로 특징되어진다 (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257). 이 박스 3 서열은 수용체 결합 키나아제에 의한 활성의 일부로서 수용체에 대하여 보충된 STAT3 내에 포함된다(Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Stahl, et al., 1995, Science 267:1349-1353). 긴 형태의 ObR(도3)은 STAT3의 활성과 IL-6RE-CAT의 전사자극에 대한 원인 되는 1 사본의 박스 3 모티브 아미노산 위치 1141과 1144 사이에 들어있다. ObR 및 STAT3의 박스 3 모티브가 ObR의 유전자 감소 효과내에 포함되는지를 알아보기 위해, 두 개의 상보적인 리간드를 이용하였다: 박스 3- 돌연변이체 ObR 및 도미넌트 네거티브 STAT3. 긴 형태의 ObR 내의 박스 3 서열은 아미노산 위치 1141에서 페닐알라닌(phenylalanine)(Y1141F)에 위치한 돌연변이 티로신(tyrosine)에 의해 확인되었다. Hep G2와 H-35 세포는 야생형의 ObR 또는 ObRY1141F(2㎍/㎖)에 대한 발현벡터와 함께 감염되는데, 이때 pHRRE-CAT 또는 pIL-6RE-CAT 중 어느 하나도 함께 감염된다. 세포를 사람 OB(100ng/㎖)으로 처리하고, CAT 활성에서의 관련 변화를 측정하였다. HepG2 세포 속에 감염된 돌연변이 ObR은 야생형 ObR 보다 HRRE-CAT와 IL-6RE-CAT 리포터 유전자 구성 모두에 비해 자극이 낮은 것으로 나타났다. 예를 들어, HREE-CAT 발형의 자극은 HepG2 세포 및 H-35 세포에서 40배 감소하였다. Il-6RE-CAT의 자극은 HepG2 세포에서 20배 감소하였으며, H-35 세포에서는 100배 감소하였다. 조절실험은 돌연변이 ObR의 감소된 시그널링 활성이 AP-OB 경합에서 나타난 바와 같이 표면 발현에 의한 것이 아님을 확인해 준다. 돌연변이의 관련 효과는 HRRE에서 보다 IL-6RE에서 더 두드러진다. H-35 세포에서 진행한 유사 실험에서 박스 3 돌연변이가 IL-6RE 조정의 손실에 상호 관련이 있음을 보여준다. 여기서 HRRE 조정이란 최소의 영향을 미치는 것이다. 이러한 결과는 세포주에서의 관찰과 일치하며, STAT3의 보충은 HRRE를 통한 것보다는 IL-6RE를 통한 유전자 유발에 있어서 더 중요하다(Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257; Morella, et al., J. Biol. Chem., 270:8298-8310; Wang, et al., 1995, Blood 86: 1671-1679).Induction of transcription via IL-6 RE is characterized by the hematotoprotein receptor of IL-10R, which contains at least one copy of the box 3 motif (YXXQ) in their chitopractic domain (Lai, et al., 1995 J. Biol. Chem., 270: 23254-23257). This Box 3 sequence is included in STAT3 supplemented to the receptor as part of its activity by receptor binding kinases (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Stahl, et al. , 1995, Science 267: 1349-1353). The long form of ObR (Figure 3) is contained between amino acid positions 1141 and 1144 of one copy of the box 3 motif that is responsible for STAT3 activity and transcriptional stimulation of IL-6RE-CAT. To see if the Box 3 motifs of ObR and STAT3 fall within the gene reducing effect of ObR, two complementary ligands were used: Box 3- mutant ObR and dominant negative STAT3. The Box 3 sequence in the long form ObR was identified by mutant tyrosine located at phenylalanine (Y1141F) at amino acid position 1141. Hep G2 and H-35 cells are infected with expression vectors for wild-type ObR or ObRY1141F (2 μg / ml), with either pHRRE-CAT or pIL-6RE-CAT. Cells were treated with human OB (100 ng / ml) and relevant changes in CAT activity were measured. Mutant ObR infected in HepG2 cells showed less stimulation than wild type ObR compared to both HRRE-CAT and IL-6RE-CAT reporter gene constructs. For example, the stimulation of HREE-CAT phenotype was reduced by 40-fold in HepG2 cells and H-35 cells. Stimulation of Il-6RE-CAT decreased 20-fold in HepG2 cells and 100-fold in H-35 cells. Regulation experiments confirm that the reduced signaling activity of the mutant ObR is not due to surface expression as shown in AP-OB competition. The relevant effect of the mutation is more pronounced in IL-6RE than in HRRE. Similar experiments in H-35 cells show that Box 3 mutations correlate with loss of IL-6RE coordination. HRRE coordination here has minimal impact. These results are consistent with those observed in cell lines, and supplementation of STAT3 is more important for gene induction via IL-6RE than via HRRE (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Morella, et al., J. Biol. Chem., 270: 8298-8310; Wang, et al., 1995, Blood 86: 1671-1679).

Y1141F ObR 돌연변이체의 감소된 유전자-조정 효과는 또한 STAT 단백질의 낮은 활성과 일치한다. 돌연변이체 ObR이 야생형의 ObR에 대한 것처럼 COS-1 세포속으로 감염되었을 때, 내생적인 COS STAT 단백질의 활성은 발견되지 않았다. 또한 ObR Y1141F는 대략 야생형 ObR에 비해 활성 과발현된 STAT1과 STAT3에서 10배 덜 효과적이었다. 그러나 STAT5B의 활성은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. ObR Y1141F에 의한 STAT 활성의 거동은 박스 3-부족한 gp130(Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257), G-CSFR(Morella, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310)에 대해 관찰한 것에 일치하며, 리포터 유전자 구성의 조정에 있어서의 특정한 변화를 설명해준다.The reduced gene-modulating effect of the Y1141F ObR mutant is also consistent with the low activity of the STAT protein. When the mutant ObR was infected with COS-1 cells as for wild type ObR, no endogenous COS STAT protein activity was found. ObR Y1141F was also approximately 10-fold less effective at STAT1 and STAT3 overexpressing activity than wild-type ObR. However, the activity of STAT5B was not affected by the mutation. The behavior of STAT activity by ObR Y1141F was found to be box 3-deficient gp130 (Lai, et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257), G-CSFR (Morella, et al., 1995, J). Biol. Chem., 270: 8298-8310), explaining specific changes in the adjustment of reporter gene composition.

STAT3의 신호 도입 룰은 과발현된 STAT3-55C 및 유전자 전사에 대해 STAt3 행동의 유력한 음성 억제자로서 행동하는 55 잔기 카르복시 말단을 절단한 돌연변이 STAT3에 의해 결정되었다. 여기에서 분석한 DNA 결합은 상기 섹션 11.2.1.에서 설명하였으며, 효과적으로 DNA에 활성 STAT3-55C의 결합을 활성화하는 긴 형태의 ObR에서 확인되었다. 필수적으로 ObR이 폐지된 STAT3-55C는 IL-6Re의 감소를 가져오고, HRRE에 비해 50% 감소된다. 이러한 데이터는 간장세포내 대한 것이며, ObR은 IL-6 타입의 싸이토카인 수용체에 의해 이용되고 STAT3-55C에 민감한 신호 변환(transduction) 경로에 관여한다.The signal transduction rule of STAT3 was determined by mutant STAT3 truncated 55 residue carboxy terminus, which acts as a potent negative inhibitor of STAt3 behavior for overexpressed STAT3-55C and gene transcription. The DNA binding analyzed here is described in section 11.2.1 above and has been identified in the long form of ObR which effectively activates the binding of active STAT3-55C to DNA. Essentially obR abolished STAT3-55C results in a reduction of IL-6Re and a 50% reduction over HRRE. These data are for hepatic cells and ObR is used by IL-6 type cytokine receptors and is involved in signal transduction pathways that are sensitive to STAT3-55C.

5. OBR은 STAT3 및 STAT5 유전자 유도를 모두 이용할 수 있다5. OBR can use both STAT3 and STAT5 gene induction

개 론Introduction

HepG2 또는 H-35 세포에서의 선택된 리포터 유전자 구성의 유발은 최대이고, 과발현 야생형 STAT 단백질에 의해 두드러지게 향상되지 않는다. STAT 단백질이 ObR 플레이 양성 매개자 룰에 의해 활성화되는 것인지 알아보기 위하여, 사람 Hep3B 세포를 PiL-6RE-CAT 또는 pHRRE-CAT 중 어느 하나와 함께 사람 ObR에 감염시켰다. 사람 OB(100ng/㎖)에 의한 CAT 활성의 자극은 무처리 대조군에 비해 상태겆으로 측정되었다(mean ± S.D.; N=3 to 4). 이들 간암 세포는 기능적인 IL-6R의 발현을 계속 유지하였으나, 다른 IL-6 타입 싸이토카인에 대한 수용체가 부족하였다 (Baumann, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:138-146). 게다가 이들 세포는 STAT3 및 -5에 비해 상대적으로 낮은 수준을 유지하였으며, 따라서 ObR의 시그널링 시험이 STAT 단백질의 발현을 통한 기능 증대에 의해 가능하다. 이러한 실험 결과는 과발현된 STAT3가 IL-6RE 15배의 유발을 전달한다는 것을 나타내는 것이다. 과발현된 STAT1 및 STAT5b의 강화된 ObR은 각각 HrRRE-CAT의 5배와 30배의 유발을 전달하게 된다.Induction of selected reporter gene constructs in HepG2 or H-35 cells is maximal and is not significantly enhanced by overexpressing wild-type STAT proteins. To determine if the STAT protein is activated by the ObR play positive mediator rule, human Hep3B cells were infected with human ObR with either PiL-6RE-CAT or pHRRE-CAT. Stimulation of CAT activity by human OB (100 ng / ml) was measured in status 겆 compared to untreated control (mean ± S.D .; N = 3 to 4). These liver cancer cells continued to maintain functional IL-6R expression, but lacked receptors for other IL-6 type cytokines (Baumann, et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 138-146). In addition, these cells maintained relatively low levels compared to STAT3 and -5, so signaling testing of ObR is possible by enhanced function through expression of STAT proteins. These experimental results indicate that overexpressed STAT3 delivers 15-fold induction of IL-6RE. Enhanced ObR of overexpressed STAT1 and STAT5b delivers 5- and 30-fold inductions of HrRRE-CAT, respectively.

C. 결 과C. Results

결과적으로 완전한 길이의 ObR 이 IL-6-유형의 싸이토카인 수용체에 관련된 작용 형태를 갖는 신호 변환 수용체인 것으로 상기에 나타나 있다. 또한 데이터는, 여러 조직에서 발현되거나 db 돌연변이 전사체에 의해 암호화되는 짧은 형태와 같은 절두된 ObR 변이체가 여기에 가하는 기구에 의해 검출할 수 없는 감소된 신호를 나타내거나 부적격한 신호를 보낸다는 가설을 뒷받침한다. OB 반응을 재구성하여 간세포에서의 유전자 발현 수준을 달성한다는 사실은, 완전한 길이의 ObR을 정상적으로 발현하는 시상하부 세포나 그외의 세포 유형에서 동일한 과정이 일어날 수 있음을 뒷받침한다.As a result, it is shown above that the full length ObR is a signal transduction receptor having a form of action related to the IL-6-type cytokine receptor. The data also hypothesizes that truncated ObR variants, such as short forms expressed in various tissues or encoded by db mutant transcripts, exhibit reduced or ineligible signals that are not detectable by the instrument to which they are added. Support. The fact that reconstructing the OB response to achieve gene expression levels in hepatocytes supports that the same process can occur in hypothalamic cells or other cell types that normally express full length ObR.

STAT 단백질을 사용한 특이 신호 경로에 대한 ObR의 연관성 및 확인가능한 DNA 결합 성분을 통한 대조 유전자에 대한 이들 단백질의 특이성에 관한 지식은, 생체내 OB 작용의 이해와 관련된 즉각적인 ObR 효과를 확인하는 데 도움이 될 것이다. 상기한 실험 시스템 또는 만약 존재한다면, 긴 형태의 기능상 조절시 ObR의 자연발생적인 짧은 형태의 기능상 역할에 대한 의문점을 해결하는 데 사용할 수 있다.Knowledge of the association of ObR to specific signal pathways using STAT proteins and the specificity of these proteins to control genes via identifiable DNA binding components helps to identify immediate ObR effects associated with understanding of OB action in vivo. Will be. The experimental system described above or, if present, can be used to address questions about the naturally occurring short form of ObR's functional role in long form functional control.

12. OBR의 돌연변이 분석12. Mutation Analysis of OBR

유전자의 활성화에 중요한 ObR 세포질 부위를 확인하기 위하여, ObR 돌연변이체의 수를 세고 분석하였다. 하기한 이들 연구로, 유전자 발현의 도입에 중요한 두 개의 상이한 ObR 세포질 도메인 부위를 확인하였다.To identify ObR cytoplasmic sites important for gene activation, the number of ObR mutants was counted and analyzed. These studies, identified below, identified two different ObR cytoplasmic domain sites important for the introduction of gene expression.

12. 재료 및 방법12. Materials and Methods

12.1.1 세포12.1.1 cells

COS-1, COS-7 및 H-35 세포를 바우만 등의 1989, 앤.엔.와이. 아카드. 사이. 557:280-297 (Baumann et al., 1989, Ann, N.Y. Acad. Sci. 557:280-297) 문헌에 기술된 바와 같이 배양하였다.COS-1, COS-7 and H-35 cells were described by Baumann et al. 1989, N.W. Akkad. between. 557: 280-297 (Baumann et al., 1989, Ann, N. Y. Acad. Sci. 557: 280-297) and cultured as described.

100 ng/ml 의 사람 렙틴[로케(Roche)에서 구입], IL-6 (제네틱스 인스티튜트에서 구입) 또는 G-CSF (임뮤넥스 코포레이션)를 보충한 동일 배지로 세포를 처리하거나 0.5 % 우태아혈청 및 1 uM 덱사메타손을 함유하는 배지로 세포를 모조 자극시켰다.Treat cells with the same medium supplemented with 100 ng / ml of human leptin (purchased from Roche), IL-6 (purchased from Genetics Institute) or G-CSF (Immunex Corporation) or 0.5% fetal bovine serum and The cells were simulated stimulated with medium containing 1 uM dexamethasone.

12.1.2 발현 벡터 및 CAT 리포터 유전자 구조물12.1.2 Expression Vectors and CAT Reporter Gene Constructs

사람 ObR의 긴 형태에 대한 발현 벡터를 상기하고(9 섹션 참조), 랫의 STAT1, STAT3 및 STAT5B는 앞서 기술하였다(Lal et., 1995, J. Biol. Chem. 270-23254-23257 ; Ripperger et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 ; 29998-30006). 카르복시 말단이 절두된 사람 ObR을 코드화하는 모든 pOB-R△ 1115-11645, pOB-R△1065-1165 pOB-R△965-1165를 PCR에 의해 생산하였다. 간단히, 특정한 아미노산에 대한 프레임내 종결 코돈 3'을 생성시키키 위해 사람 ObR의 세포내 도메인에 미치는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. PCR 단편을 EcoRV와 XbAI으로 절단하고, EcoRV와 XbaI으로 절단한 사람 ObR 내로 서브클로닝하였다. 내성 사람 ObR 서열을 치환시킨 MscI-XbaI 단편을 생성시키는 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 pOB-R△868을 생성시키는 데 유사한 전략을 사용하였다. 돌연변이된 박스 3 서열을 갖는 사람 ObR을 코드화하는 pOB-RY1141F를 11.1.2 섹션에 기술한 바와 같이 제조하였다. ObR 박스 1 모티프(아미노산 876 및 878)내에 PNP 내지 SNS 치환체를 함유하는 ObR 돌연변이체 pOB-R(box1mt) 및 pOB-RY987F 및 pOB-RY1079F 돌연변이체를, 특정한 Tyr을 Phe로 치환시킨 아미노산을 코드화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 중복확장 PCR로 생성시켰다 (Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:7351-7367). CAT 리포터 유전자 구조물, pHRRE-CAT 및 pIL-6-CAT은 앞서 기술하였다. (Lai et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 ; 23254-23257 ; Morella et al, 1995, J. Biol. Chem. 270 ; 8298-8310).Expression vectors for the long form of human ObR were recalled (see section 9), and STAT1, STAT3 and STAT5B in rats were described above (Lal et., 1995, J. Biol. Chem. 270-23254-23257; Ripperger et. al., 1995, J. Biol. Chem. 270; 29998-30006). All pOB-RΔ 1115-11645, pOB-RΔ1065-1165 pOB-RΔ965-1165 encoding carboxy terminal truncated human ObR were produced by PCR. Briefly, oligonucleotides that affect the intracellular domain of human ObR were used to generate in-frame termination codons 3 'for specific amino acids. PCR fragments were digested with EcoRV and XbAI and subcloned into human ObR digested with EcoRV and XbaI. A similar strategy was used to generate pOB-RΔ868, except for using primers to generate MscI-XbaI fragments substituted with resistant human ObR sequences. POB-RY1141F, which encodes a human ObR with mutated Box 3 sequence, was prepared as described in section 11.1.2. The ObR mutants pOB-R (box1mt) and pOB-RY987F and pOB-RY1079F mutants containing PNP to SNS substituents in the ObR box 1 motif (amino acids 876 and 878) encode the amino acids in which a specific Tyr is substituted with Phe It was generated by double extension PCR using synthetic oligonucleotides (Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 7351-7367). The CAT reporter gene construct, pHRRE-CAT and pIL-6-CAT, were described above. (Lai et al., 1995, J. Biol. Chem. 270; 23254-23257; Morella et al, 1995, J. Biol. Chem. 270; 8298-8310).

12.1.3 세포 트랜스펙션 및 분석12.1.3 Cell Transfection and Analysis

COS-1 및 H-35 세포를 DEAE-덱스트란 방법에 의해 트랜스펙션시키고 (Lopata et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12:5707-5717), 리포펙타민 방법에 의해 COS-7 세포를 트랜스펙션시켰다(Tartaglia et al., 1995, Cell 83 ; 1263-1271). STAT 단백질 활성화를 분석하기 위해, 무혈청 배지에 16 시간동안 COS 세포를 넣어 둔 다음 100 ng/ml 의 렙틴이나 G-CSF로 15 분간 세포를 처리하였다.COS-1 and H-35 cells were transfected by the DEAE-dextran method (Lopata et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12: 5707-5717) and COS-7 cells by the lipofectamine method. Transfection (Tartaglia et al., 1995, Cell 83; 1263-1271). To analyze STAT protein activation, COS cells were placed in serum-free medium for 16 hours and then treated with 100 ng / ml of leptin or G-CSF for 15 minutes.

CAT 검정의 경우, 트랜스펙션된 세포 배양물을 세분하여 리간드로 24 시간동안 처리하였다. CAT 리포터 활성도를 측정하고, 일련의 각 실험물에 대하여 비처리 대조 배양물에서 수득한 값과 비교하여 나타내었다. STAT 단백질에 의한 DNA 결합은 사도우스키 등의 1993, 사이언스 26:1739-1744 (Sadowski et al. 1993, Science 26:1739-1744)에 기술된 바와 같이 전체 세포 추출물을 이용한 전기유동 이동 검증법(EMSA)에 의해 분석하였다. 방사성표지된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 SIEm67 (STAT1 및 STAT3 의 경우) 및 TB-2(STAT5B 의 경우)는 EMSA에서 결합 기질로 작용하였다. COS 세포내 수용체 발현은 쳉 및 플라나겐의 1994, 셀 79 :157-168 (Cheng and Flanagen 1994, Cell 79:157-168) 문헌에 기술된 바와 같이 AP-OB 융합 단백질의 측량가능한 세포 표면 결합으로 분석하였다.For CAT assays, transfected cell cultures were subdivided and treated with ligand for 24 hours. CAT reporter activity was measured and compared to the values obtained in untreated control cultures for each series of experiments. DNA binding by the STAT protein was characterized by electrofluid transfer assays using whole cell extracts as described in Sadowski et al. 1993, Science 26: 1739-1744 (Sadowski et al. 1993, Science 26: 1739-1744). Analysis by EMSA). Radiolabeled double stranded oligonucleotides SIEm67 (for STAT1 and STAT3) and TB-2 (for STAT5B) served as binding substrates in EMSA. COS intracellular receptor expression was assessed by measurable cell surface binding of the AP-OB fusion protein as described in Cheng and Flanagen 1994, Cell 79: 157-168. Analyzed.

12.1.4 면역블로팅12.1.4 Immunoblotting

모든 면역블로팅은 바우만 등의 문헌(BAUMANN et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 93:XXX-XXX)에 기술되어 있는 바와 같이 실시하였고, 면역반응성 단백질은 제작자(애머샴)가 기술한 바와 같이 증가된 화학발광 검출에 의해 가시화하였다. STAT5B에 특이한 토끼의 다클론 항혈청은 산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 입수하였다.All immunoblotting was performed as described in Baumann et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: XXX-XXX, and immunoreactive proteins were prepared by the producer (Amersham). Visualization was by increased chemiluminescence detection as described. Rabbit polyclonal antiserum specific for STAT5B was obtained from Santa Cruz Biotechnology.

12.2 결과 및 토의12.2 Results and Discussion

상기 언급한 바와 같이, ObR은 제 1 부류 싸이토카인 수용체 상과의 일부이다. 이 부류의 수용체는 고유의 티로신 키나아제 활동도가 없고 리간드 유도 수용체의 동종-이합체화 또는 이종-이합체화에 의해 활성화된다. 대부분의 경우, 활성화는 야누스과(JAKs)의 수용체-관련 키나아제의 활성화가 필요하다(Ihle et al., 1994, Trends. Biol. Sci., 19:222 -227). JAKs는 싸이토카인 수용체의 세포내 부분 막에 가까운 도메인과 관련있고, 리간드 유도 수용체의 활성화에 이은 신호 전달 경로의 시작을 제공한다. JAK 단백질의 하류 표적 중 전사 인자[아일 등. 1994, 트렌드, 바이올, 사이, 19:222 -227 (Ihle et al., 1994, Trends. biol. sci.)]의 STAT[신호변환체 및 전사 활성화인자(signal Transducers and Activators of Transcription)]와 일부를 포함한다.As mentioned above, ObR is part of the first class cytokine receptor superfamily. This class of receptors has no intrinsic tyrosine kinase activity and is activated by homo-dimerization or hetero-dimerization of ligand-induced receptors. In most cases, activation requires the activation of receptor-associated kinases from Janus (Ihle et al., 1994, Trends. Biol. Sci., 19: 222-227). JAKs are associated with domains close to the intracellular partial membranes of cytokine receptors and provide the beginning of signal transduction pathways following activation of ligand-induced receptors. Transcription factors [isle et al.] Among downstream targets of JAK protein. 1994, Trend, Viol, Sai, 19: 222-227 (Ihle et al., 1994, Trends. Biol. Sci.) And STAT [signal transducers and Activators of Transcription] and some It includes.

STATs는 인산화 티로신 잔기를 통해 수용체 분자와 상호 작용하는 Src-상동(SH2)도메인을 포함하는 DNA 결합 전사인자이다. STAT 단백질은 티로신의 인산화에 의해 활성화되어 이종 이합체 또는 동종이합체를 형성한 다음, 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사를 조절한다.STATs are DNA binding transcription factors, including Src-homologous (SH2) domains that interact with receptor molecules via phosphorylated tyrosine residues. STAT proteins are activated by phosphorylation of tyrosine to form heterodimers or homodimers, which then migrate to the nucleus to regulate transcription of target genes.

12.2.1 OBR 세포내 도메인은 적어도 두 개의,12.2.1 OBR intracellular domains are at least two,

신호변환에 중요한 부분을 포함한다.Includes important parts in signal conversion.

신호변환에 필요한 ObR 세포질 도메인 부분을 확인하기 위해 C-말단 제거 돌연변이의 시리즈를 만들었다(도 11a). 상기 돌연변이체를 암호화한 cDNA는 IL-6RE-CAT 또는 HRRE-CAT 리포터 구조체와 함께 H-35 세포를 일시적으로 트랜스펙션시켜 이들이 전사를 촉진시키는 것을 분석한다(도 11b) ObR의 3 서열 박스(aa 1141-1144)를 없앤 C-말단 제거는 IL-6-RE (도 11b ; 윗 패널)의 전사 활성화를 막는 것이다. 이 결과는 3 서열의 단일 박스 또는 ObR에서의 Y에서 F 까지의 돌연 변이가 H-35 세포에서 IL-6 RE (섹션 11.2.4)을 경유하는 신호변환을 완전히 막는다는 것과 일치한다.A series of C-terminal clearance mutants was made to identify the ObR cytoplasmic domain portion required for signal transduction (FIG. 11A). The cDNAs encoding the mutants are transiently transfected with H-35 cells with IL-6RE-CAT or HRRE-CAT reporter constructs to analyze that they promote transcription (FIG. 11B) 3 sequence box of ObR (FIG. 11B). C-terminal elimination without aa 1141-1144) prevents transcriptional activation of IL-6-RE (FIG. 11B; top panel). This result is consistent with Y to F mutations in a single box of three sequences or ObR completely block signal transduction via IL-6 RE (section 11.2.4) in H-35 cells.

반대로, HRRE를 통하는 ObR 신호변환은 제일 끝의 C-말단 서열을 제거함으로써 최소로 감소되고, 868 과 965 (도 11b)사이의 약 97 개의 아미노산을 제거할 때까지는 완전히 차단되어지지 않는다. 표면에 분포된 수용체 단백질의 합성과 연관된 다양한 ObR 돌연변이체의 발현 인자를 확인하기 위해 각각의 구조물로 트랜스펙션시킨 COS 세포를 수용체 발현을 위한 AP-OB 결합 연구에 의해 분석하였다. ObR의 C-말단 제거는, 표면에서 발현되고 리간드와 결합하는 단백질을 생성한다(도 12). 게다가, ObR의 발현정도는 세포내 도메인의 연속적인 절단으로 증가한다. 상기 언급한 바와 같이, IL-6 RE를 경유하는 ObR 유전자 유도는 STAT 1 과 STAT 3 의 활성화와 관련있는데 반해서 HRRE를 경우하는 ObR 유전자 유도는 STAT 5 B 의 활성화와 관련있다.In contrast, the ObR signal transduction via HRRE is reduced to a minimum by removing the last C-terminal sequence and is not completely blocked until about 97 amino acids between 868 and 965 (FIG. 11B) are removed. COS cells transfected with each construct were analyzed by AP-OB binding studies for receptor expression to identify expression factors of various ObR mutants associated with the synthesis of receptor proteins distributed on the surface. C-terminal clearance of ObR produces a protein expressed on the surface and binding to the ligand (FIG. 12). In addition, the expression level of ObR increases with continuous cleavage of intracellular domains. As mentioned above, ObR gene induction via IL-6 RE is associated with activation of STAT 1 and STAT 3, whereas ObR gene induction with HRRE is associated with activation of STAT 5 B.

HRRE 의 자극과 STAT5B 의 활성화와의 관련성을 더욱 평가하기 위해 COS 세포를 STAT5B 및 ObR 제거 돌연변이의 발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 이러한 세포가 제조한 추출물에 행해진 면역블로팅은 STAT5B 가 각각의 트랜스펙션된 배양물에서 비교적 동량으로 발현되었다고 나타낸다. 세포를 렙틴으로 처리한다. EMSA 분석을 행하고 STAT 단백질의 양을 웨스턴 블로팅에 의해 정량하였다.To further assess the association between stimulation of HRRE and activation of STAT5B, COS cells were transfected with expression plasmids of STAT5B and ObR clearance mutants. Immunoblotting performed on extracts prepared by these cells indicated that STAT5B was expressed in relatively equal amounts in each transfected culture. Treat cells with leptin. EMSA analysis was performed and the amount of STAT protein was quantified by western blotting.

ObR의 연속적 C-말단 제거는 STAT5B를 활성화시키는 기능을 감소시키고, 탐지할 수 있는 STAT5B 의 활성화는 막에 가까운 ObR 부분(구조물 POBR△868-1165)의 제거로 인해서만 없어진다. 따라 ObR STAT5B 활성화의 상실과 HRRE를 경우하는 유전자 유도사이의 관련성이 확인된다. HRRE를 경우하는 ObR에 의한 신호변환을 위해 보존된 세포내 도메인의 티로신 잔기 및 막에 가까운 박스 1 모티브의 중요성을 확인하고자 돌연변이체 OB-RY1141F, OB-RY986F, OB-RY1079F 및 OB-R(박스 1 모티브)을 만들었다(제 13A도) COS 세포에서 분석할 때 AP-OB 결합연구는 야생형 ObR 뿐만 아니라 이러한 돌연변이체가 거의 막 표면에서 발현됨을 증명한다. H-35 세포에 트랜스펙션시켰을 때에는 OB-RY986F 및 OB-RY1079F 가 HRRE를 조절하는 그들의 기능이 변하지 않는다. 반대로, ObR 박스 1 모티브의 돌연변이는 상기 요소를 통한 유전자 유도 조절의 완전한 상실이 나타난다. 따라서, ObR의 박스 1 모티브가, HRRE를 경우하는 유전자 유도를 조절할 수 있는 경로를 활성화하는 ObR 기능의 중요한 결정인자이다. IL-6RE를 통하는 ObR에 의한 유전자 유도는 ObR의 맨끝 c-말단에 가까운 서열이 필요하다(도 11b). 반대로, HRRE를 통하는 ObR 유전자 유도는 상기 C- 말단 서열이 필요하지 않는다. 게다가, 이러한 요소를 경유하는 유전자 유도가 965-1165 아미노산 사이의 약 200 아미노산의 ObR 세포내 도메인 서열의 제거로 인해 매우 약한 영향을 받지만, 868-965 아미노산 사이의 약 17 개의 아미노산의 막에 가까운 서열에 대해서는 상기 유전자 유도가 좌우된다.Subsequent C-terminal clearance of ObR reduces the ability to activate STAT5B, and detectable activation of STAT5B is lost only by removal of the ObR moiety close to the membrane (structure POBRΔ868-1165). The association between loss of ObR STAT5B activation and gene induction for HRRE is thus identified. The mutants OB-RY1141F, OB-RY986F, OB-RY1079F, and OB-R (boxes) were identified to identify the importance of tyrosine residues in conserved intracellular domains and the membrane closest to the membrane for signal transduction by ObR for HRRE. 1 motif) (Figure 13A) AP-OB binding studies, when analyzed in COS cells, demonstrate that these mutants, as well as wild type ObR, are expressed almost at the membrane surface. When transfected into H-35 cells, OB-RY986F and OB-RY1079F do not change their function of regulating HRRE. In contrast, mutations in the ObR box 1 motif show a complete loss of gene induction regulation through these elements. Thus, the Box 1 motif of ObR is an important determinant of ObR function that activates pathways that can regulate gene induction in the case of HRRE. Gene induction by ObR via IL-6RE requires a sequence close to the terminal c-terminus of ObR (FIG. 11B). In contrast, ObR gene induction via HRRE does not require the C-terminal sequence. Furthermore, gene induction via these elements is very weakly affected by the removal of the ObR intracellular domain sequence of about 200 amino acids between 965-1165 amino acids, but close to the membrane sequence of about 17 amino acids between 868-965 amino acids. The gene induction depends on.

결과적으로, 제시된 ObR의 박스 2 모티브[리 등., 1996, 네이쳐(Lee et al., 1996, Nature) 379:632-635][휴먼 오비알에이에이(human obR aa) 1066-1075]는 HERE를 통한 유전자 유도에 기여하지 않는다. EMSA 분석은 STAT5B를 활성화하기 위한 ObR의 기능과 연관된 HRRE 의 유전자 유도를 제안한다. 흥미롭게도, 모든 세포내 도메인의 티로신 잔기와 모든 가능한 SH2 결합 부위를 제거한 OB-R△ 965-1165 가 낮은 수준의 STAT5B 활성화 및 HRRE를 통한 전사 촉진이 가능하다. ObR의 막에 가까운 서열을 제거했을 경우(OB-R△868-1165)에만 HRRE 유전자 유도와 STAT5B 활성화가 완전히 없어진다. 이와 일치하여, 변이된 박스 1 모티브를 포함하는 OB-R (box-1 mt)은 유사하게도 HRRE를 통한 유전자 유도가 불가능하고 따라서 STAT 5B 의 활성화도 불가능함을 알 수 있다.As a result, the Box 2 motif of the presented ObR (Lee et al., 1996, Nature 379: 632-635) [human obR aa 1066-1075] is the HERE. Does not contribute to gene induction. EMSA analysis suggests gene induction of HRRE associated with ObR's ability to activate STAT5B. Interestingly, OB-RΔ 965-1165, which removes tyrosine residues of all intracellular domains and all possible SH2 binding sites, is capable of low levels of STAT5B activation and transcriptional promotion via HRRE. Only when the sequence close to the ObR membrane is removed (OB-RΔ868-1165), HRRE gene induction and STAT5B activation are completely lost. Consistent with this, it can be seen that OB-R (box-1 mt) containing the mutated Box 1 motif is similarly unable to induce genes via HRRE and thus also to activate STAT 5B.

13. ObR의 다합체화(multimerization)13. Multimerization of ObR

ObR의 1 차 구조는 IL-6 형태의 싸이토카인 수용체의 신호 소 단위체와 매우 관련있다. 이 그룹의 일부는 이종이합체화 또는 동종이합체화 (Kishimoto et al., 1994, cell) 76:253-262 ; Heldin et al., 1995, cell, 80:213-223)에 의해 활성화 될 수 있다. 이종 이합체화의 경우에는 IL-6, 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M, IL-ll 및 섬모의 신경친화성 인자(CNTF)의 수용체이며, 이들 모두 공통의 신호변환자, gp 130(kishimoto et al., 1994, cell, 76:253-262 ; Taga et al., 1989, Cell, 58:573-581)을 공유한다. 그러나, 앞에서 본 바와 같이 ObR은 gp 130 (Baumann et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:XXX-XXX)에 대해 독립적으로 신호변환한다. 따라서, ObR은, IL-3, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 IL-5 (IL-3RB), 또는 IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-9 (IL-2Rγ)의 수용체에 의해 사용된 공통의 신호 소단위체와 같이 다른 보조 사슬이 존재할 때에 제 기능을 할 수 있다. 그러나, 간암세포에서의 ObR 신호는 IL-3 Rβ 또는 IL-R γ (Wang et al., 1995, lood, 86:1671-1679 ; Morella et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310)을 발현하지 않는다. 선택적으로, ObR 이 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(G-CSFR)(Fukanaga et al., 1991, EMBO J., 10:2855-2865; Ishezaka-Ikeda et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90:123-127)에서 발견되기 때문에 동종이합체에 의해 활성화될 수도 있다. 따라서, ObR 이 이합체가 되어 동종이합체로 신호 전달을 하는 기능을 가지고 있는지를 결정하기 위해, ObR의 세포내 도메인과 연결된 G-CSFR의 세포외 도메인을 암호화한 키메라 수용체 또는, G-CSFR의 세포내 도메인과 연결된 ObR의 세포외 도메인을 갖는 역의 수용체를 만들고 분석하였다(도 14a).The primary structure of ObR is highly related to the signaling subunits of the cytokine receptor of the IL-6 form. Part of this group are heterodimerization or homodimerization (Kishimoto et al., 1994, cell) 76: 253-262; Heldin et al., 1995, cell, 80: 213-223). In the case of heterodimerization, they are receptors for IL-6, leukemia inhibitory factor (LIF), oncostatin M, IL-ll and cilia neuroaffinity factor (CNTF), all of which are common signal transducers, gp 130 (kishimoto). et al., 1994, cell, 76: 253-262; Taga et al., 1989, Cell, 58: 573-581). However, as previously seen, ObR signals independently for gp 130 (Baumann et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: XXX-XXX). Thus, ObR is IL-3, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), and IL-5 (IL-3RB), or IL-2, IL-4, IL-7 and IL-9 (IL It can function when other auxiliary chains are present, such as the common signal subunits used by the receptor of -2Rγ). However, ObR signals in liver cancer cells are characterized by IL-3 Rβ or IL-R γ (Wang et al., 1995, lood, 86: 1671-1679; Morella et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 8298-8310). Optionally, ObR is granulocyte-colony stimulating factor receptor (G-CSFR) (Fukanaga et al., 1991, EMBO J., 10: 2855-2865; Ishezaka-Ikeda et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 123-127), which may be activated by homodimers. Thus, in order to determine whether ObR is a dimer and has a function of signaling to homodimers, the chimeric receptor encoding the extracellular domain of G-CSFR linked to the intracellular domain of ObR or intracellular of G-CSFR Reverse receptors with the extracellular domain of ObR linked to the domain were made and analyzed (FIG. 14A).

13.1 실험 재료 및 방법13.1 Experimental Materials and Methods

13.1.1 세포13.1.1 cells

COS -1 , COS-7 및 H-35 세포를 바우만 등. 1989, 앤. 엔. 와이, 아카드. 사이(Baumann et al., 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci) 557:280-297에서 기술한 바와 같이 배양한다. 세포를 0.5 % 우태아혈청과 1 μM 덱사메타손을 포함하는 배양액에서 모조 자극시키거나, 상기 배양액에 100 ng/ml 사람 렙틴[로케(Roche)], IL-6 [유전 연구소(Genetics Insititute)], 또는 G-CSF [이뮤넥스 코프.(Immunex Corp.)]를 보충한 배약액으로 처리한다.Bauman et al. COS-1, COS-7 and H-35 cells. 1989, Ann. yen. Y, Akkad. Cultures are described as described in Baumann et al., 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci. 557: 280-297. Cells are simulated in simulated cultures containing 0.5% fetal bovine serum and 1 μM dexamethasone, or 100 ng / ml human leptin [Roche], IL-6 [Genetics Insititute], or Treat with dosing solution supplemented with G-CSF [Immunex Corp.].

13.1.2 벡터와 CAT 리포터 유전자 구조물의 발현13.1.2 Expression of Vector and CAT Reporter Gene Constructs

사람 ObR의 긴 형태 발현 벡터는 상기 (섹션 9)에 언급되어 있고 충분한 길이의 G-CSFR 또는 절단된 G-CSFR (△ cyto)(Eiegler et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:2384-2390], 쥐의 STAT1, STAT 3 및 STAT5B는 이미 언급한 바 있다. (LaI et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257 ; Ripperger et al., 1995, J. Biol. Chem., 270-29998-30006]. 상기된 용어 "△ cyto"는 세포질 도메인의 약자이다.Long form expression vectors of human ObR are mentioned above (section 9) and of sufficient length G-CSFR or truncated G-CSFR (Δ cyto) (Eiegler et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 2384-2390], rat STAT1, STAT 3 and STAT5B have already been mentioned (LaI et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Ripperger et al., 1995, J. Biol. Chem., 270-29998-30006] The term “Δ cyto” above is an abbreviation for the cytoplasmic domain.

G-CSFR/obR 키메라 수용체는 PCR에 의해 제조하였고 사람 ObR의 막통과 도메인과 세포내 도메인(aa 829-1165)에 연결된 사람 G-CSFR의 세포외 도메인(aa 1-598)을 해독한다. obr/G-CSFR 키메라 수용체는 PCR에 의해 제조하였고 사람 G-CSFR의 세포내 도메인(aa 631-813)에 연결된 쥐의 ObR 세포외 도메인 및 막통과 서열(aa 1-860)을 해독한다. CAT 리포터 유전자 구조물, pHRRE-CAT 및 pIL-6-CAT는 이미 언급한 바 있다 (Lai et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:23254-23257 ; Morella et al. 1995, J. Biol, Chem., 270:8298-8310).The G-CSFR / obR chimeric receptor was prepared by PCR and decodes the extracellular domain (aa 1-598) of human G-CSFR linked to the transmembrane domain and intracellular domain of human ObR (aa 829-1165). The obr / G-CSFR chimeric receptor was prepared by PCR and decoded the mouse ObR extracellular domain and transmembrane sequence (aa 1-860) linked to the intracellular domain (aa 631-813) of human G-CSFR. CAT reporter gene constructs, pHRRE-CAT and pIL-6-CAT, have already been mentioned (Lai et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 23254-23257; Morella et al. 1995, J. Biol) , Chem., 270: 8298-8310).

13.1.3 세포 트랜스펙션 및 분석13.1.3 Cell Transfection and Analysis

COS-1 및 H-35 세포는 DEAE-덱스트란 방법 (Lopata et al., 1984, Nucleic Acids Res., 12:5707-5717)에 의해, COS-7 세포는 리포펙트아민 방법(Tartaglia et al., 1984, cell, 83:1263-1271)에 의해 트랜스펙션시켰다. STAT 단백질 활성화의 분석을 위해, COS 세포를 16 시간 동안 무혈청 배양액에 둔 다음, 15 분 동안 100 ng/ml 의 렙틴 또는 G-CSF로 세포를 처리하였다.COS-1 and H-35 cells were treated by DEAE-dextran method (Lopata et al., 1984, Nucleic Acids Res., 12: 5707-5717), while COS-7 cells were detected by lipofectamine method (Tartaglia et al. , 1984, cell, 83: 1263-1271). For the analysis of STAT protein activation, COS cells were placed in serum-free culture for 16 hours and then treated with 100 ng / ml leptin or G-CSF for 15 minutes.

CAT 분석의 경우, 트랜스펙션된 세포 배양물을 세분하고 24 시간 동안 리간드로 처리하였다. CAT 리포터의 활성도를 측정하고 각 실험 시리즈를 위한 리간드를 처리하지 않은 대조 배양물에서 얻은 값과 비교한다. STAT 단백질에 의한 DNA 결합을 사도우스키 등, (Sadowski et al., 1993, Science, 26:1739-1744)에 언급된 전체 세포 추출물을 사용한 전기유동 이동 검증법 (EMSA)에 의해 분석하였다. 방사선표지된 이중가닥 올리고뉴클레티드 SIEm67 ( STAT1 및 STAT3 용) 및 TB-2(STAT5B 용 )은 EMSA에서 결합 기질의 역할을 한다.For CAT assays, transfected cell cultures were subdivided and treated with ligand for 24 hours. The activity of the CAT reporter is measured and compared with the values obtained in the control culture without the ligand for each experimental series. DNA binding by the STAT protein was analyzed by electrofluid transfer assay (EMSA) using whole cell extracts mentioned in Sadowski et al., 1993, Science, 26: 1739-1744. Radiolabeled double-stranded oligonucleotides SIEm67 (for STAT1 and STAT3) and TB-2 (for STAT5B) serve as binding substrates in EMSA.

COS 세포에서의 수용체 발현은 쳉과 플라나간(Cheng and Flanagan, 1994, Cell, 79:157-168] 이 설명한 AP-OB 합동 단백질의 세포 표면 결합에 의한 정량 분석을 하였다.Receptor expression in COS cells was quantitatively analyzed by cell surface binding of the AP-OB joint protein described by Cheng and Flanagan, 1994, Cell, 79: 157-168.

13.1.4 면역블로팅13.1.4 Immunoblotting

모든 면역블로팅은 바우만 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 93:XXX-XXX)이 설명한 대로 행하였고 면역반응 단백질은 제조자[아메르샴(Amersham)]가 설명한 향상된 화학발광 감지법에 의해 눈에 보이게 했다.All immunoblotting was done as described by Bauman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: XXX-XXX) and immunoreactive proteins were subjected to the improved chemiluminescence detection described by the manufacturer (Amersham). Made visible by.

STAT5B를 위한 토끼의 다클론 항혈청은 산타 크루즈 바이오테크놀리지(Santa Cruz Biotechnology)로 부터 얻었다. 박테리아에 의해 발현된 G-CSF-R의 세포외 도메인에 반한 염소의 다클론 항혈청은 로즈웰 파크 암 연구 스프링빌 실험실(Rosewell Park Cancer Institute Springville Laboratories)에서 제조하였다.Rabbit polyclonal antiserum for STAT5B was obtained from Santa Cruz Biotechnology. Goat's polyclonal antiserum against the extracellular domain of G-CSF-R expressed by bacteria was prepared at the Rosewell Park Cancer Institute Springville Laboratories.

13.2 결과 및 토의13.2 Results and Discussion

ObR 세포질 부분의 이합체화로 신호변환이 충분한 반면, 높은 차수 동종-올리고머는 리간드 결합으로 인해서 형성될 수 있다는 것을 다음 실험에 설명하였다.Dimerization of the ObR cytoplasmic moiety is sufficient for signal transduction, while higher order homo-oligomers can be formed due to ligand binding in the next experiment.

13. 2.1 OBR 세포내 도메인의 동종이합체화가13. 2.1 Homodimerization of OBR Intracellular Domains

신호변환에 충분할 수 있다.May be sufficient for signal conversion.

키메라 수용체 복합물이 싸이토카인 수용체 활성화의 메카니즘 분석을 위한 생산물로 잘 알려져 있기 때문에 (Morella et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:8298-8310 ; Vigon et al., 1993, Oncogene, 8:2607-2615 ; Baumann et al., 1994, Mol. cell. Biol., 14:138-146), obR/G-CSFR 및 G-CSFR/ObR 키메라를 생산하여 ObR 신호 전달 메카니즘(도 14)을 분석하기 위한 수단으로 연구하였다. G-CSFR/ObR 키메라 수용체가 야생형 ObR 처럼 리간드 유도 신호를 전달시킬 수 있는지 분석하기 위해 키메라를 STAT 활성화 및 전사 촉진에 대해 시험하였다. G-CSFR/obR 과 STAT 의 공동 트랜스펙션으로 STAT1, STAT 3 및 STAT 5B 의 G-CSF-유도 활성화를 얻었다. 이 결과는 ObR 트랜스펙션 세포에서의 OB에 의해 유도된 STAT 단백질 활성화와 유사하다.(섹션12) 키메라 수용체의 발현은 G-CSFR/ObR로 트랜스펙션시킨 배양물의 면역블롯 분석에 의해 확인되었다. 이러한 결과로 ObR 세포질 부분의 이합체를 중재한 G-CSF 가 STAT 단백질의 ObR-형태의 활성화를 일으킬 수 있음을 알 수 있다. 게다가, G-CSFR/ObR 키메라 다음의 수용체와 IL-6 RE 및 HRRE 리포터 구조물과 공동-트랜스펙션시킨 H-35 세포에서 유전자 유도의 양을 감지함으로써 전사를 조절할 수 있다(도 14b).Because chimeric receptor complexes are well known as products for analyzing mechanisms of cytokine receptor activation (Morella et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 8298-8310; Vigon et al., 1993, Oncogene, 8: 2607-2615; Baumann et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 138-146), producing obR / G-CSFR and G-CSFR / ObR chimeras to analyze the ObR signaling mechanism (FIG. 14). As a means to study. Chimeras were tested for STAT activation and transcriptional promotion to analyze whether G-CSFR / ObR chimeric receptors could deliver ligand-induced signals like wild-type ObR. Co-transfection of G-CSFR / obR and STAT resulted in G-CSF-induced activation of STAT1, STAT 3 and STAT 5B. This result is similar to STAT protein activation induced by OB in ObR transfected cells. (Section 12) Expression of chimeric receptors was confirmed by immunoblot analysis of cultures transfected with G-CSFR / ObR. . These results indicate that G-CSF mediating dimers of the ObR cytoplasmic moiety can induce activation of the ObR-form of the STAT protein. In addition, transcription can be regulated by sensing the amount of gene induction in H-35 cells co-transfected with receptors following the G-CSFR / ObR chimera and the IL-6 RE and HRRE reporter constructs (FIG. 14B).

이 결과는 ObR 또는 내생 IL-6 R에 의한 리포터 유전자 구조물의 유도와 유사하다.This result is similar to the induction of reporter gene constructs by ObR or endogenous IL-6 R.

이러한 결과로 2 개의 ObR 세포질 도메인의 동종이합체 ObR에 의해 신호 전달이 시작될 수 있고 이것은 야생형 G-CSFR에 의한 신호변환 메카니즘과 유사하다는 것을 알 수 있다. 그러나, G-CSFR/ObR 키메라는 OB 리간드가 ObR 세포외 도메인을 이합체화 할 수 있다는 것을 확실하게 입증할 수 없다. 결과적으로, G-CSFR 세포내 도메인과 연결된 ObR 세포외 도메인을 포함하는 역의 키메라에 의한 신호변환 활성도를 분석하였다(도 14a).These results indicate that signal transduction can be initiated by the homodimer ObR of two ObR cytoplasmic domains, which is similar to the signal transduction mechanism by wild type G-CSFR. However, the G-CSFR / ObR chimera cannot reliably demonstrate that the OB ligand can dimerize the ObR extracellular domain. As a result, the signal transduction activity by the reverse chimera including the ObR extracellular domain linked to the G-CSFR intracellular domain was analyzed (FIG. 14A).

게다가, ObR/G-CSFR 키메라는 야생형 ObR, G-CSFR/ObR 및 야생형 G-CSFR(도 14b)와 비교할 만한 유전자 유도를 주도할 수 있다.In addition, the ObR / G-CSFR chimera can lead to gene induction comparable to wild type ObR, G-CSFR / ObR and wild type G-CSFR (FIG. 14B).

따라서, ObR은 신호변환을 위해 부수적 사슬이 필요하지 않고 두 개의 ObR 세포내 도메인의 결합은 수용체 활성화에 충분하다.Thus, ObR does not require ancillary chains for signal transduction and the binding of two ObR intracellular domains is sufficient for receptor activation.

리간드-유도 활성화 다음의 신호 형성에 2 개의 ObR 세포내 도메인의 결합이 충분하다는 사실은 ObR 이 수용체 동종이합체에 의해 작용할 수 있음을 나타낸다. ObR에 의한 신호변환에 신호 전달이 부족한 동종이합체를 이루는 짝의 과더 발현으로 인해 이상이 생기고, 이것은 수용체 티로신 키나아제과의 일부에서 보여진 바와 같다 (Paulson et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 ; Svenson et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:20863-20868 ; Wen et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:2512-2518 ; Fantl et al., 1993, Annu. Rev. Biochem., 62:453-481). 상기 언급한 바와 같이(섹션 12), 세포질 도메인의 막에 가까운 6 개의 아미노산을 포함하는 ObR은 불완전한 신호변환을 나타낸다.(도 11B).The fact that the binding of two ObR intracellular domains is sufficient for signal formation following ligand-induced activation indicates that ObR can act by receptor homodimers. Abnormalities occur due to overexpression of a pair of homodimers that lack signal transduction in the signal transduction by ObR, as shown by some of the receptor tyrosine kinases (Paulson et al., 1989, J. Biol. Chem., 264). : 17615-17618; Svenson et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 20863-20868; Wen et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 2512-2518; Fantl et al., 1993, Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481). As mentioned above (section 12), ObR containing six amino acids close to the membrane of the cytoplasmic domain shows incomplete signal transduction (FIG. 11B).

결과적으로, 신호체계에 결함이 있는 절두된 ObR의 발현이 완전한 길이의 ObR에 의해 저해되는 지를 결정하기 위해 이들 실험을 실시하였다. 완전한 길이의 ObR 과 관련된, 증가량의 절두된 수용체 OB-R△868-1165와 공동으로 세포를 트랜스펙션시키고, 수용체 유전자의 발현을 자극하는 이들 복합체의 능력을 분석하였다. 증가량의 절두된 ObR을 공동트랜스펙션시키면, 야생형 수용체에 의한 신호가 감소한다(도 15A 참조). 그러나 대량의 초과된, 완전한 길이의 절두된 수용체에서 조차도 과발현에 의한 G-CSFR 신호 저해 및 신호체계에 결합이 있는 절두된 G-CSFR에서 관찰된 정도의 감소만큼 신호 감소가 관찰되지는 않았다(도 15a 및 도 15c 참조) ObR 과 G-CSFR에서 관찰된 주요 음성 저해에 대한 민감성 차이는 수용체 키메라에 관한 주요 음성 연구에 나타나 있는 바와 같이 세포외 도메인의 특성이었다(도 15b 및 도 15c 참조).As a result, these experiments were conducted to determine whether the expression of truncated ObR with signaling defects was inhibited by full length ObR. The ability of these complexes to transfect cells and stimulate expression of receptor genes in conjunction with increasing amounts of truncated receptor OB-RΔ868-1165, associated with full length ObR, was analyzed. Cotransfection of an increased amount of truncated ObR decreases the signal by the wild type receptor (see FIG. 15A). However, even in large excess, full-length truncated receptors, no signal reduction was observed as much as G-CSFR signal inhibition by overexpression and a decrease observed in truncated G-CSFR with binding to signaling systems (FIG. 15A and FIG. 15C) The difference in sensitivity to major negative inhibition observed in ObR and G-CSFR was characteristic of the extracellular domain as shown in the major negative studies on receptor chimeras (see FIGS. 15B and 15C).

이러한 ObR 불충분한 주요 음성 저해에 대하여 설명할 수 있는 것은, 두 개의 ObR 분자가 수용체의 세포내 부위에 존재하는 기능성 도메인을 필요로 한다는 것이다. 이러한 가능성을 알아보기 위해, ObR 박스 3 모티프내 단일 아미노산 치환(Y1141F)에 의해 신호체계에 결함이 생긴 돌연변이 수용체에 의한 ObR의 주요 음성 저해를 실험하였다. 상기한 바와 같이, 이 돌연변이는 H-35 세포내 IL-6RE를 통한 유전자 유도를 변이시키는 ObR의 능력이 완전히 없어졌다(12 섹션 참조). 결과적으로, 이러한 인헨서 성분을 통한 야생형 ObR의 신호변환을 저해하는 OB-R(Y1141F)의 능력을 조사하였다.One explanation for this ObR-deficient major negative inhibition is that two ObR molecules require a functional domain that is present at the intracellular site of the receptor. To determine this possibility, we examined the major negative inhibition of ObR by mutant receptors whose signaling system was defective by single amino acid substitution (Y1141F) in the ObR box 3 motif. As noted above, this mutation completely eliminated ObR's ability to mutate gene induction through IL-6RE in H-35 cells (see section 12). As a result, the ability of OB-R (Y1141F) to inhibit the signal transduction of wild type ObR through this enhancer component was investigated.

이러한 연구로, 야생형 수용체에 대하여 트랜스펙션된 돌연변이체인 OB-RY1141F 의 비율 증가는 그다지 신호변환을 저해하지 못했음이 밝혀졌다(도 15E 참조). 따라서, ObR 박스 3 돌연변이체와 OB-R△ 868-1165는 양생형 ObR에 의한 신호변환-저해 능력에 있어서 유사하게 작용한다. 흥미롭게도, 절두된 ObR 수용체나 박스 3 돌연변이 ObR 수용체 중 하나의 저수준의 발현으로 야생형 ObR에 의한 신호변환이 약간 증가된다. 더욱이, 증가량의 절두된 OB-R△868-1165 의 존재시에 ObR /G-CSFR 신호변환에 대해서도 유사한 것으로 관찰되었다(도 15A, 15B 및 15C 참조).In this study, it was found that the increase in the ratio of OB-RY1141F, a transfected mutant to the wild type receptor, did not inhibit signal transduction very much (see FIG. 15E). Thus, the ObR Box 3 mutant and OB-RΔ 868-1165 act similarly in signal transduction-inhibiting ability by the curing type ObR. Interestingly, low levels of expression of either the truncated ObR receptor or the Box 3 mutant ObR receptor result in a slight increase in signal transduction by the wild type ObR. Moreover, similar observations were made for ObR / G-CSFR signal transduction in the presence of increasing amounts of truncated OB-RΔ868-1165 (see FIGS. 15A, 15B and 15C).

상기 논의한 바와 같이(11 섹션), ObR은 IL-6-형태의 싸이토카인 수용체의 신호 변환 성분인 gp 130에 대한 중화 항체의 존재시에 간암 세포에서 신호를 보낼 수 있다. 게다가, 이들 간암은 싸이토카인 수용체 부사슬인 IL-2Rγ 또는 IL-3 Rβ 의 특징인 다른 것을 발현하지 않는다 (Wang et al, 1995, Blood 86:1671-1679 ; Morella et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:8298-8310). 결과적으로, ObR은 수용체 호모이합체화에 관련된 메카니즘에 의해 작용하는 것이 가능하다.As discussed above (section 11), ObR can signal in liver cancer cells in the presence of neutralizing antibodies to gp 130, a signal transduction component of the IL-6-form cytokine receptor. Moreover, these liver cancers do not express anything characteristic of the cytokine receptor side chains IL-2Rγ or IL-3 Rβ (Wang et al, 1995, Blood 86: 1671-1679; Morella et al., 1995, J. Biol) Chem. 270: 8298-8310). As a result, ObR can act by mechanisms involved in receptor homodimerization.

제 I 부류의 싸이토카인 수용체과의 멤버 중에서, G-CSFR에 의한 신호변환이 리간드-유도 수용체 호모이합체화에 의해 개시되는 것으로 예상된다(Fukanaga et al., 1991, EMBO J. 10:2855-2865 ; Ishezaka-Ikeda et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:123-127). 상기 언급한 바와 같이, 키메라 수용체 복합체는 싸이토카인 수용체 활성화 메카니즘 분석을 위해서만 생산하여 실험하였다[모렐라 등의 1995, 상기 문헌; 비곤 등의 1993, 상기문헌 ; 바우만 등의 1994 상기 문헌(Morella et al., 1995, supra ; Vigon et al., 1993, supra ; Baumann et al., 1994, supra). ObR/G-CSFR 및 G-CSFR/ObR 키메라는 ObR 신호변환 메카니즘을 분석하기 위한 수단으로 생산하여 연구하였다. 이들 연구로, G-CSFR/ObR 키메라가 IL-6 RE-CAT 및 HRRE-CAT 리포터 구조물 둘다의 전사를 상당히 활성화할 수 있음이 밝혀졌다. G-CSF 가 결합할 때 G-CSFR은 호모이합체를 형성하므로, 이것은 두 세포내 ObR 도메인의 응집이 수용체 신호변환 개시에 충분함을 시사한다.Among members of the class I cytokine receptor, signal transduction by G-CSFR is expected to be initiated by ligand-induced receptor homodimerization (Fukanaga et al., 1991, EMBO J. 10: 2855-2865; Ishezaka Ikeda et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 123-127). As mentioned above, chimeric receptor complexes were produced and tested only for the analysis of cytokine receptor activation mechanisms [Morella et al., 1995, supra; 1993, supra; Bauman et al., 1994, supra (Morella et al., 1995, supra; Vigon et al., 1993, supra; Baumann et al., 1994, supra). ObR / G-CSFR and G-CSFR / ObR chimeras were produced and studied as a means to analyze the ObR signal transduction mechanism. These studies have shown that the G-CSFR / ObR chimera can significantly activate transcription of both IL-6 RE-CAT and HRRE-CAT reporter constructs. Since G-CSFR forms a homodimer when G-CSF binds, this suggests that aggregation of two intracellular ObR domains is sufficient to initiate receptor signal transduction.

비슷한 방식으로, ObR/G-CSFR 키메라도 IL-6RE 및 HRRE를 통한 전사 활성화를 중재한다(도 14B). 이 결과는 렙틴 결합이 두 개의 ObR 세포외 사슬을 이합체화여 최소한 두 개의 세포간 G-CSFR 도메인의 결합과 수용체 복합체의 활성화를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 더욱이, 이 결과는 두 ObR 사슬의 단일 교차 결합을 통하여 ObR 작동물질로서 작용하는 작은 분자 또는 항체를 생성하는 것이 가능하다는 것을 암시한다.In a similar manner, the ObR / G-CSFR chimera also mediates transcriptional activation via IL-6RE and HRRE (FIG. 14B). These results indicate that leptin binding can dimerize two ObR extracellular chains to induce binding of at least two intercellular G-CSFR domains and activation of receptor complexes. Moreover, these results suggest that it is possible to produce small molecules or antibodies that act as ObR agonists through a single crosslinking of two ObR chains.

수용체가 단일 호모이합체화에 의해 활성화된다는 것을 예상한 바와 같이, 완전-길이의 G-CSFR 과 G-CSFR/ObR 키메라에 의한 신호변환은 신호변환이 결여된 호모이합체 파트너와의 공동-발현에 의해 크게 감소될 수 있다. 그러나, OB-R△868-1165는 완전-길이 ObR 이나 ObR/G-CSFR 키메라에 의한 신호변환을 효율적으로 억제할 수 없었다. 따라서, 세포 표면 수용체에 결합하는 렙틴은 IL-10 수용체 복합체 (Tan et al., 1995, J. Biol. Chem. 21:12906-12911) 및 액티빈/TGF-βR 족 의 막(Brand et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:11500-11503); Weiser et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13:7239-7247; Wrana et al., 1994, Cell 71:1003-1014; Moustakas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:22215-22218; Henis et al., 1994, J. Cell Biol. 126:139-154)에 대해 밝혀진 바와 같이 보다 높은 차수로 소중합체화 될 수 있다(수용체수 > 2/복합체). 이 모델에 따라, 완전-길이의 ObR 이나 ObR/G-CSFR 키메라에 의해 결합되는 리간드는 둘 이상의 수용체 사슬 집합을 초래할 수 있으나, 단지 근접한 2 개의 세포간 도메인 이 시그널 생성에 충분하다. 그와 같은 복합체가 우세한 음성 억제에 매우 내성일 것으로 예상된다. G-CSFR/ObR 키메라를 포함하는 복합체에 있어 G-CSFR(△ 사이토)에 의한 신호변환의 강한 억제는, ObR 세포간 도메인이 단일의 호모이합체 구조의 환경에 위치해 있을 때 효과적으로 억제될 수 있다는 것을 입증한다. OB-R△868-1165 가 야생형 ObR 이외의 다른 막 부분에 위치하는 것이 가능하지만, ObR 세포간 도메인 (Y1114F) 의 단일 티로신 잔기가 돌연변이되어 변경된 수용체 막 편재화가초래될 것으로 여겨지지 않는다. 따라서, OB-R△868-1165 나 OB-RY1141F에 의해 중재되는 유사 억제 효과에 관한 우리의 관찰은 우리의 결과가 변경된 막 편재화에 기인한 것이 아니라는 것을 암시한다. 이 효과는 리간드 출현 (Andres et al., 1989, J. Cell Biol. 109:3137-3145 ; Massaugue et al., 1992, Cell 69:1067-1070 ; Lin et al., 1993, Trends. Cell Biol. 3: 14 -19)이나 TNF 용체에 대한 이미 관찰된 리간드 통과 (Tartaglia 등, 1993, J. Biol. Chem. 268:18542-18548)에 기인하는 것이다.As anticipated that the receptor is activated by single homodimerization, signal transduction by full-length G-CSFR and G-CSFR / ObR chimeras is achieved by co-expression with homodimeric partners lacking signal transduction. Can be greatly reduced. However, OB-RΔ868-1165 could not efficiently suppress signal transduction by full-length ObR or ObR / G-CSFR chimeras. Thus, leptin that binds to cell surface receptors is characterized by the IL-10 receptor complex (Tan et al., 1995, J. Biol. Chem. 21: 12906-12911) and the membranes of the activin / TGF-βR family (Brand et al. , 1993, J. Biol. Chem. 268: 11500-11503); Weiser et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13: 7239-7247; Wrana et al., 1994, Cell 71: 1003-1014; Moustakas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 22215-22218; Henis et al., 1994, J. Cell Biol. 126: 139-154) and may be oligomerized to higher orders (receptor number> 2 / complex). According to this model, ligands bound by full-length ObR or ObR / G-CSFR chimeras can result in more than one receptor chain aggregation, but only two adjacent intercellular domains are sufficient for signal generation. Such complexes are expected to be very resistant to prevailing negative inhibition. In complexes containing G-CSFR / ObR chimeras, strong inhibition of signal transduction by G-CSFR (Δ cytokines) can be effectively inhibited when the ObR intercellular domain is located in the environment of a single homodimeric structure. Prove it. While it is possible for OB-RΔ868-1165 to be located in a membrane portion other than wild type ObR, it is not believed that a single tyrosine residue of the ObR intercellular domain (Y1114F) will be mutated resulting in altered receptor membrane localization. Thus, our observations of the similar inhibitory effects mediated by OB-RΔ868-1165 or OB-RY1141F suggest that our results are not due to altered membrane localization. This effect is attributed to ligand appearance (Andres et al., 1989, J. Cell Biol. 109: 3137-3145; Massaugue et al., 1992, Cell 69: 1067-1070; Lin et al., 1993, Trends.Cell Biol. 3: 14-19) or already observed ligand passage to the TNF solution (Tartaglia et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 18542-18548).

상기한 바와 같이,짧은 형태의 ObR이 신체에 수송 또는 정화 기능을 제공하는 것이 가능하다(Tartaglia et al., 1995, Cell 83:1263-1271)]. 그러나, 긴 형태 및 짧은 형태의 ObR이 기능적으로 상호작용할 수 있다는 것은 ObR의 짧은 형태가 긴 형태의 활성도를 조절할 수 있다는 것을 암시한다. 이것은 마우스의 자연 발생적인 비-신호변환 짧은 형태의 ObR (34 아미노산 세포간 도메인 포함) 이 db/db 마우스에 형성된 돌연변이 ObR에 상응하고, 긴 형태의 수용체 신호변환을 억제할 수 있다는 사실에 의해 지지된다.As mentioned above, it is possible for short forms of ObR to provide transport or purification functions to the body (Tartaglia et al., 1995, Cell 83: 1263-1271). However, the ability of the long form and the short form of ObR to interact functionally suggests that the short form of the ObR can regulate the activity of the long form. This is supported by the fact that naturally occurring non-signaling short forms of mouse ObR (including 34 amino acid intercellular domains) correspond to mutant ObRs formed in db / db mice and can inhibit long form receptor signaling. do.

14. 미생물의 기탁(deposit)14. Deposit of Microorganisms

다음의 미생물을 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC), 로크빌(Rockville), 메릴랜드(Maryland)에 하기 날짜에 기탁하였으며, 지정 기탁번호를 받았다:The following microorganisms were deposited with the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland on the following dates and received a designated accession number:

미생물 클론(clone) ATCC 기탁번호 기탁일Microbial Clone ATCC Deposit Number Deposit Date

이. 콜라이 균주 fami5312 69952 1995. 11. 22.this. E. coli strain fami5312 69952 Nov. 22, 1995

5312B4F35312B4F3

이. 콜라이 fahj5312d 69963 1995. 12. 5.this. Coli fahj5312d 69963 December 5, 1995

h-ObRDh-ObRD

이. 콜라이 h-ObR-p87 69972 1995. 12. 28.this. E. coli h-ObR-p87 69972 1995. 12. 28.

h-ObR-p87h-ObR-p87

본 발명은 이상에서 설명한 특정 실시예에 의해 한정되지 않으며, 본 발명과 기능적으로 비슷한 방법과 요소들은 모두 본 발명의 범위내에 속한다. 실제로 본 발명에서 설명한 것에 대한 여러 가지 변형은 상술한 설명과 도면으로부터 본 발명의 기술분야에 종사하는 당업자라면 명백히 알 수 있을 것이다. 이러한 변형은 청구범위의 범위내에 속한다.The present invention is not limited by the specific embodiments described above, and methods and elements that are functionally similar to the present invention are all within the scope of the present invention. Indeed, various modifications to what has been described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and drawings. Such modifications fall within the scope of the claims.

서열 목록Sequence list

(1) 일반적 정보 :(1) General Information:

(i) 출원인 : 타타글리아 루이스 에이.(i) Applicant: Tataglia Lewis A.

테퍼 로버트 아이.Taper Robert Ai.

쿨페퍼 자니스 에이.Cool Pepper Janice A.

화이트 데이비드 더블유.White David W.

(ii) 발명의 명칭 : OB 수용체 및 비만의 진단 및 치료방법(ii) Name of the invention: OB receptor and method of diagnosis and treatment of obesity

(iii) 서열수 : 50(iii) SEQ ID NO: 50

(iv) 통신주소(iv) communication address

(A) 수신인 : 피시 앤드 리챠드슨, 피.씨.(A) Recipients: Fish and Richardson, P.C.

(B) 거리 : 225 프랭클린 스트리트(B) Street: 225 Franklin Street

(C) 도시 : 보스톤(C) City: Boston

(D) 주: 매사추세츠(D) Note: Massachusetts

(E) 국가: 미국(E) Country: United States

(F) 우편번호 : 02110-2804(F) ZIP Code: 02110-2804

(v) 컴퓨터 판독 형태(v) computer-readable form

(A) 매체 유형 : 플로피 디스켓(A) Medium type: floppy diskette

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형(B) Computer: IBM PC compatible

(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS(C) operating system: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 워드퍼팩트 (버젼 5.1)(D) Software: Word Perfect (Version 5.1)

(vi) 현재 출원 자료 :(vi) Current application data:

(A) 출원번호 : US 08/708,123(A) Application number: US 08 / 708,123

(B) 출원일 : 1996년 9월 3일(B) Application date: September 3, 1996

(C) 분류(C) classification

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/638,524(A) Application number: US 08 / 638,524

(B) 출원일 : 1996년 4월 26일(B) Application date: April 26, 1996

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/599,455(A) Application number: US 08 / 599,455

(B) 출원일 : 1996년 1월 22일(B) Application date: January 22, 1996

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/583,153(A) Application number: US 08 / 583,153

(B) 출원일 : 1995년 12월 28일(B) Application date: December 28, 1995

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/570,142(A) Application number: US 08 / 570,142

(B) 출원일 : 1995년 12월 11일(B) Application date: December 11, 1995

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/569,485(A) Application number: US 08 / 569,485

(B) 출원일 : 1995년 12월 8일(B) Application date: December 8, 1995

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/566,622(A) Application number: US 08 / 566,622

(B) 출원일 : 1995년 12월 4일(B) Application date: December 4, 1995

(vii) 우선권자료(vii) priority data;

(A) 출원번호 : US 08/562,663(A) Application number: US 08 / 562,663

(B) 출원일 : 1995년 11월 27일(B) Application date: November 27, 1995

(viii) 변호사/대리인 정보 :(viii) Attorney / Agent Information:

(A) 성명 : 메이켈존, 피에이치.디., 애니타 엘.(A) Statement: Macel-John, P.D., Anita L.

(B) 등록번호 : 35, 283(B) Registration Number: 35, 283

(C) 참고/도킷 번호 : 07334/019001(C) Note / Dockit Number: 07334/019001

(ix) 전기통신 정보 :(ix) Telecommunication information:

(A) 전화번호 : (617) 542-5070(A) Phone number: (617) 542-5070

(B) 팩스번호 : (617) 542-8906(B) FAX: (617) 542-8906

(C) 텔렉스 : 200154(C) Telex: 200154

(2) 서열 번호 1에 대한 정보 :(2) Information about SEQ ID NO: 1

(i) 서열 특징 :(i) Sequence features:

(A) 서열의 길이: 3097 염기쌍(A) Sequence length: 3097 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 2본쇄(C) Number of chains: 2 strands

(D) 토폴로지 : 미지(unknown)(D) Topology: unknown

(ii) 분자유형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(ix) 특징(ix) features

(A) 성명/키 : CDS(A) Name / Key: CDS

(B) 위치 : 61..2742(B) Location: 61..2742

(xi) 서열설명 :(xi) Sequence description:

1 One

(2) 서열 번호 2에 대한 정보 :(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열의 특징 :(i) Characteristic of the sequence:

(A) 길이 : 894 아미노산(A) Length: 894 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(C) 토폴로지 : 미지(C) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 단백질(ii) Molecular form: protein

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 3에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 3

(i) 서열 특징 :(i) Sequence features:

(A) 서열의 길이 : 3871 염기쌍(A) Sequence length: 3871 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 2본쇄(C) Number of chains: 2 strands

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : cDNA(ii) Molecular Type: cDNA

(ix) 특징(ix) features

(A) 성명/키 : CDS(A) Name / Key: CDS

(B) 위치 : 194..3688(B) Location: 194..3688

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 4에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 4

(i) 서열 특징 :(i) Sequence features:

(A) 서열의 길이 : 1165 아미노산(A) Sequence length: 1165 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 단백질(ii) Molecular form: protein

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 5에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 5

(i) 서열 특징 :(i) Sequence features:

(A) 서열의 길이 : 488 아미노산(A) Sequence length: 488 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 단백질(ii) Molecular form: protein

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 6에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 6

(i) 서열 특징 :(i) Sequence features:

(A) 서열의 길이 : 5 아미노산(A) Sequence length: 5 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 펩타이드(ii) Molecular Form: Peptide

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 7에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 7

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 8에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 8

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 23 염기쌍(A) Sequence length: 23 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 9에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 9

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 29 염기쌍(A) Sequence length: 29 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 10에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 10

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 35 염기쌍(A) Sequence length: 35 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 11에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 11

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 35 염기쌍(A) Sequence length: 35 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 12에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 12

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 29 염기쌍(A) Sequence length: 29 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 13에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 13

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 23 염기쌍(A) Sequence length: 23 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 14에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 14

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 15에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 15

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 56 염기쌍(A) Sequence length: 56 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 16에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 16

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 57 염기쌍(A) Sequence length: 57 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 17에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 17

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 56 염기쌍(A) Sequence length: 56 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토롤로지 : 미지(D) Thorology: Unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 18에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 18

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 50 염기쌍(A) Sequence length: 50 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 19에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 19

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 61 염기쌍(A) Sequence length: 61 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열의 설명 :(xi) Description of sequence:

(2) 서열 번호 20에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 20

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 69 염기쌍(A) Sequence length: 69 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 21에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 21

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 61 염기쌍(A) Sequence length: 61 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열의 설명 :(xi) Description of sequence:

(2) 서열 번호 22에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 22

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 53 염기쌍(A) Sequence length: 53 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : RNA(ii) Molecular Type: RNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 23에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 23

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 24에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 24

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 16 염기쌍(A) Sequence length: 16 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명(xi) sequence description

(2) 서열 번호 25에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 25

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 26에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 26

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 27에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 27

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 28에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 28

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 17 염기쌍(A) Sequence length: 17 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 29에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 29

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 8 아미노산(A) Sequence length: 8 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 펩타이드(ii) Molecular Form: Peptide

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 30에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 30

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍(A) Sequence length: 24 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 31에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 31

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 9 아미노산(A) Sequence length: 9 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 펩타이드(ii) Molecular Form: Peptide

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 32에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 32

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 26 염기쌍(A) Sequence length: 26 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 33에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 33

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 8 아미노산(A) Sequence length: 8 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 펩타이드(ii) Molecular Form: Peptide

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 34에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 34

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍(A) Sequence length: 24 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 형태 : DNA(ii) Molecular form: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 35에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 35

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 20 염기쌍(A) Sequence length: 20 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 형태 : DNA(ii) Molecular form: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 36에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 36

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍(A) Sequence length: 21 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 형태 : DNA(ii) Molecular form: DNA

(xi) 서열 설명(xi) sequence description

(2) 서열 번호 37에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 37

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 25 염기쌍(A) Sequence length: 25 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 38에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 38

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍(A) Sequence length: 24 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 39에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 39

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 42 염기쌍(A) Sequence length: 42 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 40에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 40

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 53 염기쌍(A) Sequence length: 53 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 41에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 41

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍(A) Sequence length: 21 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 42에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 42

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 3854 염기쌍(A) Sequence length: 3854 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 더블(C) the number of chains: double

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : cDNA(ii) Molecular Type: cDNA

(ix) 특징 :(ix) Features:

(A) 성명/키 : CDS(A) Name / Key: CDS

(B) 위치 : 61..3546(B) Location: 61..3546

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 43에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 43

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 1162 아미노산(A) Sequence length: 1162 amino acids

(B) 유형 : 아미노산(B) Type: amino acid

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 형태 : 단백질(ii) Molecular form: protein

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 44에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 44

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 16 염기쌍(A) Sequence length: 16 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 더블(C) the number of chains: double

(D) 토폴로지 : 미지(D) topology: unknown

(ii) 분자 유형 : cDNA(ii) Molecular Type: cDNA

(xi) 서열 설명:(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 45에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 45

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 33 염기쌍(A) Sequence length: 33 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 46에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 46

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 33 염기쌍(A) Sequence length: 33 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 47에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 47

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 33 염기쌍(A) Sequence length: 33 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 48에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 48

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 30 염기쌍(A) Sequence length: 30 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 49에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 49

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 48 염기쌍(A) Sequence length: 48 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

(2) 서열 번호 50에 대한 정보(2) information about SEQ ID NO: 50

(i) 서열의 특징:(i) sequence characteristics:

(A) 서열의 길이 : 30 염기쌍(A) Sequence length: 30 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 직쇄상(D) topology: linear

(ii) 분자 유형 : DNA(ii) Molecular Type: DNA

(xi) 서열 설명 :(xi) Sequence description:

Claims

obR 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of the obR gene.

다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 Ob 수용체 또는 그의 단편을 코드화하는 분리된 핵산분자:An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor or fragment thereof having the following nucleotide sequence:

(a) 도 1에 도시된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁번호 69952로 기탁된 cDNA 클론 famj5312내에 포함된 cDNA에 의해 코드화된 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열; 또는(a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. 1 or the cDNA encoded by cDNA contained in cDNA clone famj5312 deposited with ATCC 69952 to ATCC; or

(b) 도 6에 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열; 또는(b) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. 6; or

(c) 도 3에 도시된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁번호 제 69963으로 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d 또는 ATCC에 기탁된 게놈 클론, h-obR-p87내에 포함된 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열; 또는(c) the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. 3 or the cDNA clone fahj5312d deposited with ATCC at Accession No. 69963 or the genomic clone deposited with ATCC, amino acid sequence contained in h-obR-p87; or

엄격성 조건하에서 뉴클레오티드 서열 (a), (b), 또는 (c) 또는 그의 보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열.A nucleotide sequence that hybridizes to nucleotide sequence (a), (b), or (c) or complement thereof under stringent conditions.

Ob 수용체 단백질 또는 막간 도메인 또는 세포질 도메인이 결실된 Ob 수용체 단백질의 결실 돌연변이체의 세포외, 막간, 또는 세포질 도메인에 상당하는 폴리펩타이드를 코드화하는 분리된 뉴클레오티드 서열.An isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide corresponding to an extracellular, intermembrane, or cytoplasmic domain of an Ob mutant that is deleted from an Ob receptor protein or an intermembrane domain or cytoplasmic domain.

이종 폴리펩타이드(heterologous polypeptide)에 융합된 제 3항의 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 단백질을 코드화하는 분리된 뉴클레오티드 서열.An isolated nucleotide sequence encoding a chimeric protein comprising the polypeptide of claim 3 fused to a heterologous polypeptide.

제 4항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드가 면역글로불린의 불변부위인 분리된 뉴클레오티드 서열.The isolated nucleotide sequence of claim 4, wherein said heterologous polypeptide is a constant region of an immunoglobulin.

제 1, 2, 3, 4, 또는 5항 중 어느 하나의 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 벡터.A nucleotide vector comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1, 2, 3, 4, or 5.

숙주세포에서의 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 조절서열과 작동가능하게 결합되어 있는, 제 1, 2, 3, 4, 또는 5항 중 어느 하나의 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터.An expression vector comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1, 2, 3, 4, or 5, operably linked to a nucleotide regulatory sequence that regulates expression of a nucleotide sequence in a host cell.

제 7항에 있어서, 상기 조절서열이 싸이토메갈로바이러스 hCMV 조기 유전자, SV40 아데노바이러스의 조기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파아지 λ의 주된 오퍼레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절부위, 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 산 포스파타아제의 프로모터 및 효모 α-메이팅 펙터의 프로모터로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 발현 벡터.8. The method according to claim 7, wherein the regulatory sequence is cytomegalovirus hCMV early gene, early or late promoter of SV40 adenovirus, lac system, trp system, TAC system, TRC system, major operator and promoter site of phage λ, fd coat An expression vector selected from the group consisting of a regulatory region of a protein, a promoter of 3-phosphoglycerate kinase, a promoter of acid phosphatase, and a promoter of yeast α-mating factor.

제 1, 2, 3, 4, 또는 5항 중 어느 하나의 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자조작된 숙주세포.A genetically engineered host cell comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1, 2, 3, 4, or 5.

숙주세포에서의 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 조절서열과 작동가능하게 결합되어 있는, 제 1, 2, 3, 4, 또는 5항 중 어느 하나의 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자조작된 숙주세포.A genetically engineered host cell comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1, 2, 3, 4, or 5, operably linked to a nucleotide regulatory sequence that regulates expression of a nucleotide sequence in a host cell.

제 10항에 있어서, 상기 숙주세포가 섬유아세포, 차이니즈 햄스터 난소세포, COS 세포, VERO 세포, 시상하부 세포 또는 맥락막총 세포인 유전자조작된 숙주세포.11. The engineered host cell of claim 10, wherein said host cell is a fibroblast, Chinese hamster ovary cell, COS cell, VERO cell, hypothalamus cell or choroid plexus cell.

분리된 Ob 수용체 단백질.Isolated Ob Receptor Protein.

도 1, 3 또는 6에 도시된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁번호 69952로 기탁된 cDNA 클론 famj5312내에 포함된 cDNA에 의해 코드화된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁번호 제 69963으로 기탁된 cDNA 클론 fahj5312d내에 포함된 cDNA에 의해 코드화된 아미노산 서열 또는 ATCC에 기탁된 게놈 클론, h-obR-p87에 의해 코드화된 아미노산 서열을 갖는 분리된 Ob 수용체 단백질.Amino acid sequence encoded by cDNA contained in amino acid sequence shown in FIG. 1, 3 or 6 or cDNA clone famj5312 deposited with ATCC at deposit number 69952 or cDNA contained in cDNA clone fahj5312d deposited with ATCC 69963 at ATCC An isolated Ob receptor protein having an amino acid sequence encoded by the genomic clone deposited in ATCC or an amino acid sequence encoded by h-obR-p87.

Ob 수용체 또는 막간 도메인 또는 세포질 도메인이 결실된 Ob 수용체 단백질의 결실 돌연변이체의 세포외, 막간, 또는 세포질 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.A polypeptide having an amino acid sequence corresponding to an extracellular, intermembrane, or cytoplasmic domain of an Ob mutant or deletion of an Ob receptor protein that lacks an intermembrane domain or cytoplasmic domain.

이종 폴리펩타이드에 융합된 제 14항의 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 단백질.A chimeric protein comprising the polypeptide of claim 14 fused to a heterologous polypeptide.

제 15항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드가 면역글로불린의 불변부위인 키메라 단백질.16. The chimeric protein of claim 15, wherein said heterologous polypeptide is a constant region of an immunoglobulin.

제 12항 또는 제 13항의 Ob 수용체에 면역특이적으로 결합하는 항체.An antibody that immunospecifically binds to the Ob receptor according to claim 12 or 13.

제 14항의 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체.An antibody that immunospecifically binds to the polypeptide of claim 14.

환자 시료내의 obR 유전자 발현을 측정하는 과정을 포함하는 포유동물의 체중장애의 진단방법.A method for diagnosing weight disorders in a mammal comprising measuring obR gene expression in a patient sample.

제 19항에 있어서, 상기 발현이 obR 유전자의 mRNA 전사체를 검출함으로써 측정되는 방법.The method of claim 19, wherein said expression is measured by detecting mRNA transcripts of the obR gene.

제 19항에 있어서, 상기 발현이 obR 유전자 산물을 검출함으로써 측정되는 방법.The method of claim 19, wherein said expression is measured by detecting an obR gene product.

포유동물의 게놈에 포함된 obR 유전자 돌연변이를 검출하는 과정을 포함하는 포유동물의 체중장애의 진단방법.A method for diagnosing weight disorders in a mammal comprising detecting obR gene mutations in the mammal's genome.

화합물들을 obR 유전자를 발현하는 배양된 숙주세포와 접촉시키는 단계 및 obR 유전자 발현상의 변화, 배양된 세포에 의해 발현된 obR 유전자 산물의 활성상의 변화 또는 숙주세포 단백질의 티로신인산화상의 변화, 또는 숙주세포에서의 이온플럭스상의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 체중장애의 치료에 유용한 화합물들의 스크리닝방법.Contacting the compounds with a cultured host cell expressing the obR gene and changing the obR gene expression, a change in the activity of the obR gene product expressed by the cultured cell, or a change in tyrosine phosphorylation of the host cell protein, or in a host cell. A method for screening compounds useful for the treatment of weight disorders comprising detecting a change in the ion flux of a.

제 23항에 있어서, obR 유전자의 발현이 obR 유전자의 mRNA 전사체를 측정함으로써 검출되는 방법.The method of claim 23, wherein the expression of the obR gene is detected by measuring the mRNA transcript of the obR gene.

제 23항에 있어서, obR 유전자의 발현이 Ob 수용체 단백질을 측정함으로써 검출되는 방법.The method of claim 23, wherein expression of the obR gene is detected by measuring an Ob receptor protein.

제 23항에 있어서, 숙주세포 단백질의 티로신인산화가 항-포스포티로신 항체를 이용하여 분석되는 방법.The method of claim 23, wherein tyrosine phosphorylation of the host cell protein is analyzed using an anti-phosphotyrosine antibody.

내성 Ob에 의한 Ob 수용체의 활성화를 억제하는데 충분한 양으로 화합물을 포유동물에 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 저체중 장애(low body weight disorder)의 치료방법.A method of treating a low body weight disorder in a mammal comprising administering the compound to the mammal in an amount sufficient to inhibit activation of the Ob receptor by resistant Ob.

제 27항에 있어서, 상기 저체중 장애가 식욕부진, 카헥시, 불리미아, AIDS-관련 쇠약(AIDS-related wasting) 또는 암-관련 쇠약(cancer-related wasting)인 방법.28. The method of claim 27, wherein the underweight disorder is anorexia, carhexi, bullia, AIDS-related wasting or cancer-related wasting.

제 27항에 있어서, 상기 화합물이 시상하부 또는 맥락막총에 배송되는 방법.The method of claim 27, wherein said compound is delivered to the hypothalamus or choroid plexus.

제 27항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체에 결합하여 수용체의 활성화를 억제하는 길항물질인 방법.The method of claim 27, wherein the compound is an antagonist that binds to the Ob receptor and inhibits the activation of the receptor.

제 27항에 있어서, 상기 화합물이 내성 Ob에 결합하여 Ob 활성을 중화하는 방법.The method of claim 27, wherein said compound binds to resistant Ob to neutralize Ob activity.

제 31항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체 또는 세포외 도메인 또는 Ob와 결합하는 세포외 도메인의 일부분에 해당하는 폴리펩타이드, 막간 도메인 또는 세포질 도메인이 결실된 결실돌연변이 Ob 수용체 단백질, 또는 이종 폴리펩타이드에 융합된, Ob 수용체의 세포외 도메인 또는 Ob와 결합하는 세포외 도메인의 일부분, 막간 도메인 결실 돌연변이체를 포함하는 키메라 융합 단백질인 방법.32. The deletion mutant Ob receptor protein according to claim 31, wherein the compound comprises a polypeptide, an intermembrane domain or a cytoplasmic domain corresponding to an Ob receptor or extracellular domain or a portion of an extracellular domain that binds Ob. Fused, an extracellular domain of an Ob receptor or a portion of an extracellular domain that binds Ob, a chimeric fusion protein comprising an intermembrane domain deletion mutant.

제 32항에 있어서, 상기 키메라 융합단백질의 이종 폴리펩타이드가 면역글로불린의 불변부위인 방법.33. The method of claim 32, wherein the heterologous polypeptide of the chimeric fusion protein is a constant region of an immunoglobulin.

제 32항 또는 제 33항에 있어서, 상기 화합물이 포유동물에서 폴리펩타이드 또는 융합단백질을 발현하여 분비하는 유전자조작된 숙주세포를 투여함으로써 포유동물에 배송되는 방법.The method of claim 32 or 33, wherein the compound is delivered to the mammal by administering a engineered host cell that expresses and secretes the polypeptide or fusion protein in the mammal.

제 31항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체의 세포외 도메인을 의태한 것이거나 내성 Ob를 중화하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 Fab 부분인 방법.32. The method of claim 31, wherein said compound is an extracellular domain of the Ob receptor or is an anti-idiotype antibody or Fab portion thereof that neutralizes resistant Ob.

생체내에서 Ob 수용체의 발현을 억제하는데 충분한 양으로 화합물을 포유동물에 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 저체중 장애의 치료방법.A method for treating a low weight disorder in a mammal comprising administering the compound to the mammal in an amount sufficient to inhibit expression of the Ob receptor in vivo.

제 36항에 있어서, 상기 저체중 장애가 식욕부진, 카헥시, 불리미아, AIDS-관련 쇠약 또는 암-관련 쇠약인 방법.37. The method of claim 36, wherein the underweight disorder is anorexia, carhexi, bullia, AIDS-related breakdown or cancer-related breakdown.

제 36항에 있어서, 상기 화합물이 시상하부 또는 맥락막총에 배송되는 방법.The method of claim 36, wherein said compound is delivered to the hypothalamus or choroid plexus.

제 36항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체를 코드화하는 mRNA 전사체의 해독을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.The method of claim 36, wherein said compound is an antisense oligonucleotide that inhibits translation of an mRNA transcript encoding an Ob receptor.

제 36항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체를 코드화하는 mRNA 전사체의 해독을 억제하는 리보자임(rybozyme)인 방법.37. The method of claim 36, wherein said compound is a ribozyme that inhibits the translation of mRNA transcripts encoding the Ob receptor.

제 36항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체 유전자의 조절부위와 삼중나선을 형성하여 전사를 억제하는 올리고뉴클레오티드인 방법.37. The method of claim 36, wherein said compound is an oligonucleotide that inhibits transcription by forming triple helices with regulatory regions of the Ob receptor gene.

제 36항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체 유전자 또는 그의 조절부위를 표적화 상동재조합(targeted homologous recombination)에 의해 불활성화하는 재조합 DNA 구조물인 방법.37. The method of claim 36, wherein said compound is a recombinant DNA construct that inactivates an Ob receptor gene or regulatory region thereof by targeted homologous recombination.

Ob 수용체에 대한 내성 Ob의 결합에 의해 유도되는 신호변환(signal transduction)을 억제하는데 충분한 양으로 화합물을 포유동물에 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 저체중 장애의 치료방법.A method for treating a low weight disorder in a mammal comprising administering the compound to the mammal in an amount sufficient to inhibit signal transduction induced by binding of the resistant Ob to the Ob receptor.

제 43항에 있어서, 상기 저체중 장애가 식욕부진, 카헥시, 불리미아, AIDS-관련 쇠약 또는 암-관련 쇠약인 방법.44. The method of claim 43, wherein the underweight disorder is anorexia, carhexi, bullia, AIDS-related breakdown or cancer-related breakdown.

제 43항에 있어서, 상기 화합물이 시상하부 또는 맥락막총에 배송되는 방법.The method of claim 43, wherein the compound is delivered to the hypothalamus or choroid plexus.

제 43항에 있어서, 상기 화합물이 Ob 수용체-유도 신호변환(Ob receptor-induced signal transduction)의 세포내 중개자(intracellular mediator)의 활성을 억제하는 방법.44. The method of claim 43, wherein said compound inhibits the activity of an intracellular mediator of Ob receptor-induced signal transduction.

제 46항에 있어서, 상기 화합물이 티로신 키나제 또는 티로신 포스파타제를 억제하는 방법.47. The method of claim 46, wherein said compound inhibits tyrosine kinase or tyrosine phosphatase.

제 43, 44, 또는 45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화합물이 체내의 표적세포에서 신호-불능 수용체(signalling-incompetent receptor)의 발현을 유도하는 조절서열에 의해 조절된 신호-불능 Ob 수용체를 코드화하는 올리고뉴클레오티드 구조물인 방법.46. The signal-incapable Ob receptor of any one of claims 43, 44, or 45, wherein said compound is regulated by a regulatory sequence that induces expression of a signaling-incompetent receptor in target cells in the body. An oligonucleotide construct encoding a.

제 48항에 있어서 상기 올리고뉴클레오티드 구조물이 세포질 도메인의 전부 또는 일부가 결실된 Ob 수용체의 신호-불능 결실 돌연변이체(signalling-incompetent deletion mutant)를 코드화하는 방법.49. The method of claim 48, wherein said oligonucleotide construct encodes a signaling-incompetent deletion mutant of an Ob receptor that has deleted all or part of its cytoplasmic domain.

포유동물에서 기능성 Ob 수용체의 발현을 상승조절하는데 충분한 양으로 화합물을 포유동물에 투여하는 과정을 포함하는 포유동물의 비만 치료방법.A method of treating obesity in a mammal comprising administering the compound to the mammal in an amount sufficient to upregulate expression of the functional Ob receptor in the mammal.

제 50항에 있어서, 상기 화합물이 시상하부 또는 맥락막총에 배송되는 방법.51. The method of claim 50, wherein said compound is delivered to the hypothalamus or choroid plexus.

제 50 또는 51항에 있어서, 상기 포유동물이 결함이 있는 Ob 수용체를 발현하고 상기 화합물이 포유동물내의 표적세포에서 기능적인 수용체의 발현을 유도하는 조절서열에 의해 조절된 기능성 Ob 수용체를 코드화하는 뉴클레오티드 구조물인 방법.The nucleotide of claim 50 or 51, wherein the mammal expresses a defective Ob receptor and the compound encodes a functional Ob receptor regulated by a regulatory sequence that induces expression of a functional receptor in target cells in the mammal. Method that is a structure.

제 50 또는 51항에 있어서, 상기 포유동물이 돌연변이 Ob 수용체를 발현하고 상기 화합물이 표적화 상동재조합을 통해서 내성 돌연변이를 보정하는 야생형 Ob 수용체를 코드화하는 뉴클레오티드 구조물인 방법.The method of claim 50 or 51, wherein the mammal is a nucleotide construct that encodes a wild type Ob receptor that expresses a mutant Ob receptor and the compound corrects resistance mutations through targeting homologous recombination.

도 3에 도시된 아미노산의 서열 1-868 아미노산들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor having a nucleotide sequence encoding SEQ ID NOs: 1-868 amino acids of the amino acids shown in FIG. 3.

도 3에 도시된 아미노산의 서열 1-965 아미노산들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor having a nucleotide sequence encoding amino acids SEQ ID NOs: 1-965 shown in FIG. 3.

도 3에 도시된 아미노산 서열 1-1065의 아미노산들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor having a nucleotide sequence encoding the amino acids of amino acid sequences 1-1065 shown in FIG. 3.

도 3에 도시된 아미노산 서열 1-1115의 아미노산들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor having a nucleotide sequence encoding the amino acids of amino acid sequences 1-1115 shown in FIG. 3.

IL-6RE 매개 유전자 발현을 유도할 수 있는 Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor capable of inducing IL-6RE mediated gene expression.

HRRE 매개 유전자 발현을 유도할 수 있는 Ob 수용체를 코드화하는 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding an Ob receptor capable of inducing HRRE mediated gene expression.

제 54항 내지 제 57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 분자가 도 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드화하는 분리된 핵산 분자.59. The isolated nucleic acid molecule of any one of claims 54-57, wherein said molecule encodes an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of FIG.

제 59항에 있어서, 상기 분자가 도 3의 아미노산 1 내지 965의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드화하는 분리된 핵산 분자.60. The isolated nucleic acid molecule of claim 59, wherein said molecule encodes an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of amino acids 1 to 965 of FIG.

다음 단계들을 포함하는 시험 약제가 체중장애의 치료에 이용가능한 약제인지 여부를 검정하는 방법으로서:A method of assaying whether a test agent comprising the following steps is a drug available for the treatment of a weight disorder:

(a) ObR 폴리뉴클레오티드를 코드화하는 유전자를 발현하는 진핵세포를 상기 시험 약제에 노출시키는 단계; 및(a) exposing eukaryotic cells expressing a gene encoding an ObR polynucleotide to said test agent; And

(b) 상기 시험 약제의 존재하에서 상기 진핵세포에 의한 상기 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하고;(b) measuring the expression of said gene by said eukaryotic cell in the presence of said test agent;

상기 시험약제의 존재하에서의 상기 유전자의 발현이 상기 시험약제가 존재하지 않는 상태하에서의 상기 진핵세포에 의한 상기 유전자의 발현과 상이한 경우 상기 시험 약제를 체중장애의 치료에 이용가능한 약제로 판정하는 시험 약제의 검정방법.Wherein if the expression of the gene in the presence of the test agent differs from the expression of the gene by the eukaryotic cells in the absence of the test agent, the test agent is determined to be a drug available for the treatment of weight disorder. Assay Method.

제 62항에 있어서, 상기 방법이 상기 시험 약제의 부재하에서의 상기 진핵세포에 의한 상기 유전자의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.63. The method of claim 62, wherein said method further comprises measuring expression of said gene by said eukaryotic cells in the absence of said test agent.

(a) ObR 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 발현하는 진핵세포를 상기 시험 약제에 노출시키는 단계; 및(a) exposing eukaryotic cells expressing a gene encoding an ObR polypeptide to the test agent; And

(b) 상기 시험 약제의 상기 진핵세포에 대한 결합을 측정하는 단계를 포함하고;(b) measuring the binding of the test agent to the eukaryotic cell;

여기서, 상기 시험약제의 상기 진핵세포에 대한 결합이, 상기 유전자를 발현하지 않지만, 그 면 이외의 다른 모든 면에서는 상기 유전자를 발현하는 상기 진핵세포와 동일한 대조군 진핵세포에 대한 상기 시험 약제의 결합과 상이할 경우, 상기 시험 약제를 체중장애의 치료에 이용가능한 약제로 판정하는 시험 약제의 검정방법.Wherein the binding of the test agent to the eukaryotic cell does not express the gene, but in all other respects the binding of the test agent to the same control eukaryotic cell as the eukaryotic cell expressing the gene. Wherein if different, the test agent is determined to be a drug that can be used to treat a weight disorder.

제 64항에 있어서, 상기 방법이 상기 대조군 진핵세포에 대한 상기 시험 약제의 결합을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.65. The method of claim 64, wherein the method further comprises measuring binding of the test agent to the control eukaryotic cell.

(a) ObR 폴리펩타이드를 상기 시험 약제에 노출시키는 단계; 및(a) exposing the ObR polypeptide to the test agent; And

(b) 상기 시험 약제의 상기 ObR 폴리펩타이드에 대한 결합을 측정하는 단계를 포함하고;(b) measuring the binding of the test agent to the ObR polypeptide;

상기 시험약제가 상기 ObR 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 경우에, 상기 시험 약제를 체중장애의 치료에 이용가능한 약제로 판정하는 시험 약제의 검정방법.If said test agent selectively binds said ObR polypeptide, said test agent is determined to be a drug usable for the treatment of a weight disorder.

제 62, 64, 또는 66항에 있어서, 상기 ObR 폴리펩타이드가 ObR의 세포질 도메인을 포함하는 방법.67. The method of claim 62, 64, or 66, wherein said ObR polypeptide comprises a cytoplasmic domain of ObR.

제 67항에 있어서, 상기 세포질 도메인이 도 3의 아미노산 861-1165를 포함하는 방법.68. The method of claim 67, wherein said cytoplasmic domain comprises amino acids 861-1165 of FIG.

제 67항에 있어서, 상기 ObR 폴리펩타이드가 ObR의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 방법.68. The method of claim 67, wherein said ObR polypeptide further comprises an extracellular domain of ObR.

제 66항에 있어서, 상기 ObR 폴리펩타이드가 검출가능한 표지(detectable label)에 융합되는 방법.67. The method of claim 66, wherein said ObR polypeptide is fused to a detectable label.

제 62항 또는 제 64항에 있어서, 상기 진핵세포가 맥락막총 세포인 방법.65. The method of claim 62 or 64, wherein said eukaryotic cell is a choroid plexus cell.

제 62항 또는 제 64항에 있어서, 상기 유전자가 재조합 유전자인 방법.65. The method of claim 62 or 64, wherein said gene is a recombinant gene.