KR19990063632A - 약물 운송용 트란스사이토시스 매개체 및 상승제 - Google Patents

약물 운송용 트란스사이토시스 매개체 및 상승제 Download PDF

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앤드류 데릭 써튼
아스라 바리 마릭
친나스와미 티럽파씨
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디 헤이쓰, 산드라 우드
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Abstract

GP60 수용체를 함유하는 내피, 상피 또는 중피를 횡단하는 통로를 따라 그 작용을 발휘하는 생리학적 활성제의 트란스사이토시스가, 알부민 및 그 단편, 항 GP60 항체 및 그 단편, GP60 펩티드 단편, 및 PDI(단백질 디술피드 아이소머라제) 및 그 단편으로부터 선택된 트란스사이토시스 상승체 또는 매개체와의 배합 또는 그들과의 결합에 의하여 강화된다.

Description

약물 운송용 트란스사이토시스 매개체 및 상승제
발명의 분야
본 발명은 약물 운송에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 GP60 수용체를 함유하는 내피, 상피 및 중피를 횡단하여 약물을 운송하고 약물의 통행을 강화시킬 수 있는 트란스사이토시스(transcytosis) 매개체 및 상승제에 관한 것이다.
발명의 배경
동맥내 또는 정맥내 루트에 의하여 투여되는 대부분의 치료용 약제에 있어서, 분자 활성의 목표 부위는 맥관 구조의 외부에 존재한다. 기로를 통하여 투여되는 약물에 있어서는 활성작용의 목표 부위는 통상적으로, 폐포상피, 세기관지상피 또는 기관상피의 제 1 세포 장벽을 넘어 있다. 양쪽 경우에 있어서, 약물이 그 효능을 매개시킬 수 있기 전에 반드시 횡단하여야 할 상피 또는 내피 장벽이 있다.
작은 친유성 약물에 있어서, 장벽 세포의 타이트한 접합부 사이에 파라세포형(paracelluar) 루트가 존재하는 것으로 보인다. 그러나, 친수성 약물 및 펩티드, 단백질, 유전자 또는 안티센스 뉴클레오티드와 같은 보다 큰 고분자 활성제에 있어서는 장벽을 횡단하는 루트는 오직 세포를 통하는 길뿐이다. 이것은 신속한 분해 또는 간에 의한 1회 통과 클리어런스(clearance) 때문에 극히 짧은 반감기를 지닌 정맥내 투여 약물에 있어서, 특정 문제점을 제기하게 된다. 이와같은 분해 및 분비 현상과 균형을 이루며 치료적 효과를 유지하기 위하여는 흔히 다량의 투여량 또는 주입이 필요하게 된다. 따라서, 당분야에 있어서, 세포 장벽을 횡단하여 약물을 운송하기 위한 보다 신속한 메카니즘이 명백히 필요하다.
세포 이물 흡수 작용을 매개하는 특정 수용체에 관한 다수의 보고서가 있는데, 여기서 리간드가 수용체와 결합한 후, 세포 흡수 작용과 유사한 방법으로, 수용체와 일체화, 복합화 된다. 이것은 리간드 수용체 복합물의 영역에 세포막의 함입 후, 완전히 밝혀지지는 않았으나, 한가지 방법에 의하여 리간드가 세포내로 방출되는 현상과 연관된다. LDL, 인슐린, 상피 성장 인자, 인슐린 유형 성장인자 및 tPA-PAI-I(하이브리드 분자)를 포함하는, 다수의 세포 이물 흡수 수용체 시스템이 보고되어 있다.
트란스사이토시스는 함입 및 리간드 수용체 복합물 주위에 소포 형성을 수반한 후, 측저막에서의 가역 함입 공정에 의한 방출과 함께 트란스사이토시스적 통행을 하게 된다. 트란스페린 수용체에 대한 모노클로날 항체가 독소와 결합되어, 혈액뇌 내피를 횡단하여, 트란스사이토시스를 수행할 수 있게 된다. 그러나, 당 분야에 있어서 맥관구조의 내피, 폐포상피 및 복막 중피와 같이, 혈액뇌 내피 이외의 세포장벽을 횡단하여 수용체-매개 트란스사이토시스에 의하여 약물을 운송 또는 약물의 통행을 상승시킬 수 있는 물질에 대한 필요성이 계속되어 왔다.
알본딘(albondin)리아고도 불리우는 GP60 수용체는 문헌(스니트저(schnitzer) 및 오우(Oh), J. Biol. Chem.269(8); 6072 - 6082 (1994))에 보고된 몇 개의 알부민 결합 단백질 중의 하나이다. 기타에는 SPARC(혈청 단백질, 산성, 시스테인에 부유화(Serum Protein, Acidic, Rich in Cystein), 오에스테오넥틴(oesteonectin) 또는 기저막 단백질 40, GP30, GP18 및 GP60이 포함된다. SPRAC 및 오에스테오넥틴은 세포외 단백질이다. GP60은, 항 SPRAC 항체를 이용하여 측정할 때, SPRAC와 일부 동질성을 공유한다(스니트저 및 오우, Am. J. Physiol.263: H1872 - H1879 (1992)).
GP18 및 GP30은 다양한 세포 형태에서 발견되는 막 글리콜 단백질이지만 대식세포내에서 특히 유행한다(스니트저 등, J. Biol. Chem. 267: 24544 - 24553 페이지(1992)). GP18 및 GP30은 세포 이물 흡수작용에 의하여 산화, 글리코실화 또는 인용된 형태의 알부민의 제거를 매개할 수 있는 소위 "청소부(scavenger) 수용체"인데, 다양한 기관을 위하여 알부민 이화작용에 있어서 일정한 역할을 하는 것으로 믿어진다(스니트저 및 브라보(Bravo), J. Biol. Chem.268(10): 7562 - 7570 페이지 (1993)).
GP18 및 GP30과는 대조적으로, 오직 GP60 수용체는 맥관구조의 연속적인 내피(스니트저, Am. J. Physiol.262: H246 - H254 (1992)), 폐포상피(김(Kim) 등, Am. J. Resp. and Crit. Care Med.151: A190(1994) 에만 및 추리적으로는 복막중피(고트로이브(Gotloib) 및 쇼스탁(Shostak), Kidney International.47: 1274 - 1284 페이지(1995))에서 발현되는 것으로 판명되었다. GP60은 미세혈관 내피에는 풍부한데, 흥미롭게도 혈액뇌 관문에는 결핍되어 있는데, 여기서는 알부민 유동이 거의 관측되지 않는다(루세아욱스(Rousseaux) 등, 효소학에서의 방법(Methods in Enzymology)121: 163 (1986)). 내피 GP60에 대한 폴리클로날 항체도 폐포 상피 GP60과 결합하는 것으로 나타났다(김 등, 상기 문헌). GP60 수용체는, 상피 및 내피 세포 장벽을 가로지르는 알부민의 수용체 매개 트란스사이토시스와 연관된다(김 등, 상기문헌; 티루파티(Tirrupathi) 등, 세포의 분자생물학(Molecular Biology of the Cell)4(Supp): 338a, 요약 No. 1964(1993)).
GP60 아미노산 서열은 당분야에 공지되어 있다(야마우치(Yamauchi) 등, Biochem. Biophys. Res. Comm.146: 1485(1987)).
발명의 요약
본 발명은 GP60 수용체를 함유하는 상피, 내피 및 중피를 횡단하여 약리학적 활성제를 운송할 수 있는 트란스사이토시스 매개체 및 상승제를 제공한다. GP60 수용체는 세포 장벽을 횡단하는 알부민의 수용체 매개 트란스사이토시스와 연관된다. 본 발명에 의하여, GP60 수용체 매개 트란스사이토시스는 알부민 뿐만 아니라, GP60 시스템을 경유하여, 상피, 내피 및 중피를 자연적으로 관통하지 못하는 생리학적 활성제의 운송용으로 개발될 수 있다.
본 발명의 트란스사이토시스 매개체 및 상승제는 알부민, 알부민 단편, 항-GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 항-GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체 단편 및 GP60 펩티드 단편을 포함한다. 또한 그들은 PDI(단백질 디술피드 이소메라제, Protein Disulfide Isomerase) 및 그들 단편을 포함한다(GP60 단편에 관한 임의의 후속 언급은 PDI 단편도 가르키는 것으로 해석될 수도 있다). 공통 요소는 PDI 및 GP60의 T1-44단편에서 발견되는 CGMC 모티프일 수 있다. 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제가 GP60 펩티드 단편이면, 알부민 또는 알부민 단편과 같은 본 발명의 기타 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제와 함께 공동 투여되는 것이 바람직하다. 브롬화 시아노겐을 사용하여 메티오닌 잔기에서의 개열에 의하여 14, 20 및 30 kDa의 적절한 단편이 생성될 수 있으며, 디술피드 가교의 환원에 의하여 크기가 다시 감소될 수 있다. 본 발명에 따라 트란스사이토시스 매개체 및 상승제로 유용한 항 GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2'및 Fv 단편을 내포한다. 바람직한 GP60 펩티드 단편은, GP60 단백질의 N-말단 18 아미노산에 대응하는 T3118 펩티드를 포함한다.
본 발명에 따라, 상기 화합물이 생리학적 활성제와 결합될 때, 여기서 그들을 "트란스사이토시스 매개체"라 부른다. 공동 투여되기는 하나 생리학적 활성제와 결합되지 않을 때, 상기 화합물은 "트란스사이토시스 상승제"라 부른다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 및 상승제는 맥관구조의 내피, 폐포상피 및 복막중피를 횡단하여 생리학적 활성제의 운송 또는 그 통행을 강화시키는데 유용하다.
발명의 상세한 설명
그 이름이 가르키는 바와 같이, GP60 단백질은 분자량이 약 60kDa인 것으로 당 분야에 보고되어 있다. 좀더 자세히 분석해 본 결과, 이 단백질의 "진정한" 분자량은 좀더 바람직하게는 약 57kDa라는 것이 발견되었다. 이와같은 분자량의 불일치는 단백질 제법 및 겔 조건의 차이 때문인 것으로 사료된다. 그러나, 당 분야와 일관성을 유지하기 위하여 여기서는 이 단백질을 GP60 수용체로 명명한다(하기 실시예 1에서는 제외).
GP60 수용체 매개 트란스사이토시스는 알부민 뿐만 아니라, GP60 시스템을 경유하여 상피, 내피 및 중피를 자연적으로 관통하지 못하는 다수의 중요한 생리학적 활성제의 운송용으로 개발될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서 본 발명은 맥관구조의 내피, 폐포, 세기관지 및 기관 상피 및 복막 중피의 세포 장벽을 횡단하여, 50, 100, 150kDa 또는 그 이상과 같은 비교적 고분자량을 지닌 생리학적 활성제를 운송하는 개선된 방법을 제공한다. GP60 함유 내피, 상피 및 중피를 횡단하여 생리학적 활성제를 운송 또는 그 통행을 강화시킬 수 있는 트란스사이토시스 매개체 및 상승제는 알부민, 알부민 단편, 항 GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 항 GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체 단편, 및 GP60 펩티드 단편을 포함한다. 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제가 GP60 펩티드 단편이면, 알부민 또는 알부민 단편과 같은 본 발명의 기타 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제와 함께 바람직하게 공동투여된다.
포유 동물 알부민은 당 분야에 잘 알려져 있으며 용이하게 입수할 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 알부민은 환자와 동일한 포유동물류의 것이 된다. 예를들면, 환자가 인간인 경우, 인체 혈청 알부민이 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제로서 바람직하게 사용된다. 마찬가지로, 환자가 말 또는 소일 경우, 각각 말 또는 소혈청 알부민이 바람직하게 사용된다.
알부민 단편을 생성하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를들면, 브롬화 시아노겐에 의한 메티오닌 잔기에서 알부민을 개열하면 14, 20 및 32kDa의 3개의 특히 적절한 펩티드가 산출되는데, 이들은 디술피드 가교의 환원에 의하여 크기가 3.3∼20 kDa 범위인 펩티드로 다시 크기가 감소될 수 있다. 선택적인 방법으로, 알부민 펩티드 단편을 생성하는데 프로티아제 분해가 이용될 수 있다.
임의의 특정 알부민 단편이 본 발명에 따른 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제로서 유용한지의 여부는 아래의 일상적인 스크린 검정법에 의하여 결정될 수 있다. 하기 실시예에서 지적된 바와 같이, 트란스사이토시스 상승제로서 작용하는 소 및 인체 혈청 알부민 모두는 대조물 보다 2.5∼4배 이상 생리학적 활성제의 섭취를 자극한다는 것을 나타내고 있다.
항 GP60 폴리클로날 및 모노클로날 항체는, 내피, 상피 또는 중피로부터 정제된 GP60 수용체로부터 생성될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, GP60 수용체를 발현하는 내피, 상피 및 중피 세포는 맥관구조의 내피를 포함한다(모세관 내피 (기니아 (Ghinea) 등, J. Cell Biol.107: 231-239 페이지(1988); 동맥내피(실프린저-번보임 (Silflinger-Birnboim) 등, J. Cellular Physiology149: 575 - 584 페이지(1991); 대동맥 및 정맥 내피(스니트저 및 오우, Am, J. Physiol. (1992), 상기 문헌); 폐포조직의 상피(김 등, 상기 문헌); 및 복막의 중피(가트로이브(Gotloib) 및 쇼스탁(Shostak), 상기 문헌). GP60은 당분야에 공지된 방법(예를들면, 스니트저 및 오우, J. Biol. Chem. (1994), 상기 문헌을 참조할 것) 및 하기 실시예 1에 기재된 바에 따라 상피, 내피 및 중피로부터 정제될 수 있다.
정제된 GP60 또는 GP60 펩티드 단편(아래에 논의되는 T3118 펩티드와 같은)에 대한 폴리클로날 항체의 생성은, 당 분야에 공지된 기술에 따라 쥐, 토끼 또는 염소에서 일어날 수 있다. 하기 실시예 1에서, GP60 수용체는 토끼를 면역시키기 위하여 예비 SDS-PAGE 로부터 용출되었다. 동일 용적의 프로인드 완전 보조 물질과 혼합한 후 토끼당 약 50㎍ 단백질을 근육내 주사하였다. 2주후에 두 번째 주사가 시행되었다. 토끼는 두 번째 주사후 4∼6주째에 채혈되었으며 면역반응이 시험되었다. 다음에, 단백질 A-세파로우즈 칼럼을 사용하여 항혈청 IgG가 정제되었다.
공지기술에 따라 모노클로날 항체 제조도 발생할 수 있다(고딩(Goding), J. Immunol. Methods39: 285(1980); 오이(Oi) 및 헤르젠베르그(Herzenberg), 세포 면역학에 있어서 선택된 방법(Selected Methods in Cellular Immunology), P. 352 프리만(Freeman), 산프란시스코(1979)). 예를들면, Balb/c 생쥐가, 50 ∼150㎍의 GP60 또는 GP60 펩티드 단편으로 복막내 주사된다. 융해 3∼5일전, 양성 생쥐는 항원의 부스터 주사(50∼150㎍의 GP60 또는 GP60 단편)를 맞으며 다음에는 비장이 제거될 때까지 매일 10㎍ (정맥내 및 복막내 루트로) 주사된다. 비장세포는, 본질적으로 그로스(St. Groth) 등, 면역학 방법지(J. Immunology Methods) 35: 1 - 21(1980)에 따라 Sp2/O-Ag14 골수 세포로 융합된다. 배양주 상청액은 항원으로서 미결합 GP60 또는 GP60 단편을 이용하여 ELISA에 의하여 스크린된다. 다음에 양성 배양주는, 루츠(Lutz) 등, 실험적 세포연구(Experimental Cell Research) 175: 109 - 124(1988)에 기재된 바와 같이 cDNA-형질이입 COS-1 세포상에서 웨스턴 블롯트법 및 면역 형광 검사법으로 시험된다. 하이브리도마 분비 특정 항체는 부드러운 우무상에서 2회 클론화 된다. 각 하이브리도마는 혈청없는 배지 SFRI-4에 적응될 수 있다. 복수(腹水)를 제조하기 위하여 원래의 Balb/c 생쥐에 약 2 x 106 세포가 주입된다. 아이소타이핑 키트를 이용하여 클라스 및 서브 클라스의 결정이 수행된다. SFRI 배양주 상청액 및 복수 모두는 모노클로날 항체 공급원으로서 사용될 수 있다.
검토된 바와 같이, 본 발명의 항 GP60 플리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편은 GP60 수용체를 함유하는 내피, 상피 및 중피를 횡단하여 생리학적 활성제를 운송 또는 그 통행을 강화시킬 수 있는 트란스사이토시스 매개체 및 상승제로서 유용하다. 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제로서 유용한 항 GP60 항체 단편은 파파인 분해에 의하여 제조된 단일 (Fab) 항원 결합 영역을 함유하는 단편; 또는 제한된 펩신 분해에 의하여 제조된 F(ab')2단편을 포함한다(올손 (Olson) 및 카플란(Kaplan), 효소학에서의 방법(Methods in Enzymology)92: 3(1983)). 기타 적절한 단편에는 Fab' 및 Fv가 포함된다. 임의의 특정 항체 단편이 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제로서 유용한지의 여부는 아래에 기재된 바와 같은 일상적 스크린 검정법에 의하여 결정될 수 있다. 하기 실시예 3에서, 항 GP60 플리클로날 항체를 37℃에서 투여하면, 면역전 혈청 조절의 수준보다 생리학적 활성제의 섭취가 1.6 - 2배 증가한다.
본 발명에 의하면, 생쥐 및 쥐와 같은 인간 이외의 동물에서 발생된 항 GP60 항체가 외래 항체에 대하여 잘 알려진 면역부작용 때문에, 오직 단기간 투여(즉, 비만성 투여)에만 적합하다. 그러나, 인체에 쥐 모노클로날을 투여하는 문제점을 해결하기 위하여, 종래의 방법이 사용되어 GP60 수용체에 대한 인체 모노클로날 항체를 제조할 수 있는데, 그럼으로써 장기간 즉 만성 투여에 적합한 항체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 쥐 항체는 키메르 또는 CDR 그라프트에 의하여 "인간화"될 수 있다. 쥐 항체의 인식영역이 인강 항체의 적절한 영역으로 그라프트되어 환자에 있어서 면역 부작용을 회피 또는 제한할 수 있게 된다.
GP60 펩티드 단편도 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 및 상승제로서 유용하다. 특히 적절한 GP60 펩티드 단편은 GP60의 N-말단으로부터의 첫째 18 아미노산을 포함하는데, 이것은 소의 스트랫치(stretch), 막-결합 티로이드 호르몬(T3) 결합 단백질에 최소 80% 동질성인 것으로 발견되었다. 이와같은 GP60 펩티드 단편은 단백질 분해를 포함하는, 임의의 공지 효소적 또는 물리적 기술에 의하여 제조될 수 있다. 변형된 방법으로, GP60 단편은 합성적으로 제조될 수 있다. 하기 실시예 5에서 지적된 바와 같이, 첫째 18 잔기에 대응하는 GP60의 합성 N-말단 펩티드(T3118)는 고형상 합성에 의하여 제조될 수 있다. 트란스사이토시스의 작동물질로 작용하는 펩티드는 대조물보다 인체 알부민의 섭취를 5배 자극하였다.
본 발명의 트란스사이토시스 매개체를 생리학적 활성제에 결합시키는 방법은 당 분야의 숙련자에게는 용이하게 자명한 것인데, 이것만에 국한된 것은 아니나, 쉬프 염기 형성과 관련되는 글루타르알데히드 결합; 단백질 및 카르복실산 사이의 카르보디이미드 반응; 아민 함유 약물의 산무수물 활성화 후 카르보디이미드 연결; 3-(2-피리딜디티오) 프로피온에이트-N-숙신이미딜 무수물로 1차 아민 함유 약물을 활성화한 후, 단백질의 시스테인 그룹에 결합; 염화 시아누르산을 이용하여 당알코올을 단백질에 연결; 및 비스과산화(bisperoxidation)를 통하여 아민과 히드록실 그룹 사이를 연결하는 방법을 포함한다.
예를들면, 생리학적 활성제의 아미노 당 성분은 과요오드산 나트륨 처리에 의하여 산화될 수 있으며, 후르비츠(Hurwitz) 등, Cancer Res.35: 1175 - 1181 페이지 (1975)에 기재된 방법에 따라 쉬프 염기 형성을 통하여 본 발명의 트란스사이토시스 매개체상의 라이신 잔기에 직접 부착된다. 선택적인 방법으로, 생리학적 활성제는, 후르비츠 등, Int. J. Cancer21: 747 - 755 페이지 (1978)에 기재된 방법에 따라 활성제의 아미노 그룹을 매개체상의 카르보닐 그룹에 또는 아미노 알킬 그룹에 카르보디이미드-매개 결합시킴으로써 본 발명의 트란스사이토시스 매개체에 연결될 수 있다. 생리학적 활성제는 또한, 벨레스-아이스레스(Belles-Isles) 등, Br. J. Cancer41: 841 - 842 페이지(1980)에 기재된 방법에 의하여, 활성제의 아미노 당 및 매개체의 아미노 그룹과 글루타르알데히드를 가교결합시킴으로써 본 발명의 트란스사이토시스 매개체와 열결될 수 있다.
생리학적 활성제를 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 중 하나와 결합시키는데 적절한 기타 결합부위는 일상 경험적으로 결정될 수 있다. 예를들면, 본 발명의 트란스사이토시스 매개체는, 인슐린과 같은 생리학적 활성제에 결합되기 전이나 후에 플루오레세인 또는125I로 라벨될 수 있다. 결합 및 라벨된 후, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 스크린 검정법이 사용되어 임의의 지정된 매개체/활성 결합체의 내피 세포 섭취, 상피 세포 유동, 또는 중피 세포 유동을 측정할 수 있다. 이와 같은 일상적인 스크린 검정법은 당 분야의 숙련자로 하여금 본 발명의 어떤 트란스사이토시스 매개체가 특정 부위에서 생리학적 활성제에 결합된 후에 트란스사이토시스를 이행할 능력을 지탱하는가를 결정할 수 있게 한다. 이와같은 검정법은 또한, 본 발명에 의한 트란스사이토시스 매개체 및 상승제로서 유용한 것을 결정하기 위하여, 대상 알부민 단편, 항 GP60 항체 단편 및 GP60 펩티드 단편의 일상적인 스크린에 유용하다.
생리학적 활성제를 본 발명의 트란스사이토시스 매개체와 결합시키면 다른 방법으로는 극히 짧은 혈청 반감기를 지니는 저분자량의 약물, 또는 혈류중 신속히 분해되거나 간에서 1회 통과 배설에 의하여 제거되는 펩티드 약물의 정맥내 운송에 특히 적합하다. 물론, 생리학적 활성제가 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 중 하나와 공유 결합되는 경우에는 치료제의 잔류 활성은 반드시 결합후에 평가되어야 한다. 치료제 활성의 검정 기술은 당분야에 잘 구축되어 있으며, 많은 치료제가 성공적으로 결합되어 실질적 활성을 유지한다. 예를들면, 문헌에는 혈액, 뇌장벽을 횡단하는 트란스사이토시스를 촉진하기 위하여 수용체 리간드, 또는 그 단편과 약물 사이의 결합을 기술하고 있다. 푸크타(Fukta) 등, Pharm. Research 11(12): 1681 (1994)는 호스 라디쉬 페록시다제(HRP, Horse Radish Peroxidase)와 인슐린의 결합을 기재하고 있는데, 이것은 HRP로 하여금 혈액, 뇌 장벽의 횡단을 가능케 한다. 조사자들은 인슐린 단편의 제조를 계속하였는데, 이들은 배양주의 소뇌 미소혈관 내피세포상에서 인슐린 수용체와의 결합능력을 위하여 스크린 되었다. 마찬가지로, 다른 트란스사이토시스 시스템은, 다른 것들 중, 트란스페린 수용체로 겨냥된 항체-메토트리세이트(프리덴(Friden) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 4771(1991)), 및 상피 성장인자 수용체로 겨냥된 항체-폴리라이신(첸(Chen) 등, FEBS Leff.338: 167 (1994))를 내포하는 활성 약물과 연결된 항체의 통행을 허용하게 한다.
트란스사이토시스 매개체와 대비하여, 본 발명의 트란스사이토시스 상승제는 생리학적 활성제와 결합되지 않는다. GP60 수용체를 함유하는 상피, 내피 및 중피상에 본 발명의 하나의 트란스사이토시스 상승제와 생리학적 활성제가 공존하면 충분히 세포 장벽을 횡단하여 제재의 섭취 및 그 통행을 강화시킨다는 것이 발견되었다. 이론적인 구속에 개의치 않고, 본 발명의 트란스사이토시스 상승제는 명백히 GP60 매개 트란스사이토시스 시스템을 "도발"시킴으로써 치료제를 포함하는 공존 거대 분자의 강화된 섭취를 자극한다.
상피, 내피 및 중피에 의한 또는 이를 횡단하는 생리학적 활성제의 섭취 또는 통행은, 본 발명의 임의의 트란스사이토시스 상승제만으로 또는 복수로 결합하여 유도 또는 강화될 수 있다. 예를들면, 하기 실험은 GP60 펩티드 T3118이 트란스사이토시스의 작동물질로 작용하여, 대조물보다 5배 이상 인체 알부민 섭취는 강화하였음을 과시하고 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 위에서 논의된 트란스사이토시스 매개체 결합물질 중의 하나가 본 발명의 하나 이상의 트란스사이토시스 상승제와 함께 투여될 때, 활성제의 운송이 달성될 수 있다.
트란스사이토시스 매개체 결합물질 및 본 발명의 트란스사이토시스 상승제 조성물(활성제를 내포하는)은 약리학적으로 수용 가능한 캐리어 또는 의약품 첨가제, 즉 결합물질 또는 조성물과 불리하게 작용하지 않는, 적용하기에 적합한 약리학적으로 수용 가능한 유기 또는 무기물질과 함께 투여될 수 있다. 이것만에 국한되는 것은 아니나,적절한 약리학적 수용 가능한 물질에는 물, 염용액, 알코올, 야채기름, 폴리에틸렌 글리콜, 겔라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 실릭산, 비스코우스 파라핀, 향료오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀루로우스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다. 약리학적 제재는 살균되며, 필요하면 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 조미 및/또는 방향 물질과 같이 결합물질과 불리하게 작용하지 않는 보조제와 혼합된다. 비경구적 적용을 위하여, 특히 적절한 제재는 용액, 바람직하게는 오일성 또는 수성 용액, 및 현탁액, 에멀죤 또는 좌약을 포함하는 이식편이다. 앰플은 편리한 단위 복용량이다. 내장의 적용을 위하여, 특히 적절한 제재는 활석 및/또는 탄수화물과 같은 캐리어 결합제를 지닌 타블렛, 당의정 또는 캡슐인데, 캐리어는 바람직하게는 락토오스 및/또는 옥수수 전분 및/또는 감자 전분이다. 시럽, 엘리서(elixir) 등이 사용될 수 있는데, 이 경우 감미롭게 된 매개체가 채용된다. 활성성분이 마이크로캡슐화, 다중 코팅등과 같이 상이하게 분해되는 피복에 의하여 보호되는 상태에서, 지효성 조성물이 이들을 내포하여 배합될 수 있다.
주사 또는 폐기로를 경유하는 방법을 포함하는 임의의 당분야 공지 기술에 의하여, 하나 이상의 생리학적 활성제 및 하나 이상의 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제를 포함하는 조성물 또는 그들 결합체가 투여될 수 있다. 주사가 맥관구조 및 복막에의 투여에 특히 적절한 반면에 폐기공은 기포에의 투여에 특히 적합하다. 폐에 투여를 위한 적절한 배합물은, 생리학적 활성제와 혼합된 하나 이상의 본 발명의 트란스사이토시스 상승제를 포함한다. 또다른 폐 투여용의 적절한 배합물은 활성제에 결합된 트란스사이토시스 매개체를 포함한다. 예를들면, 배합물은 아콘(Acorn) 또는 데빌비스(DeVilbiss) 제트 분무기와 분무 기구로부터 제조될 수 있는데, 여기서 활성제 및 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제는 분무 저장기내에서 수용액 상태로 존재한다. 선택적으로, 폐 투여를 위한 바람직한 구체예에서, 배합물은 건조 분말 흡입기(DPI, Dry Powder Inhaler) 장치로부터 방출된다. DPI 기구는 수톤(Sutton) 등에 의하여, 미국특허출원 제 08/487,420호 및 WO-9609814호에 기재되어 있다. 그들은 배합물을 2∼5㎛의 미세입자로 분무 건조시키는 것을 요구하는데, 이 크기는 폐포 침투에 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제가, 바람직하게는 약 20% w/v의 농도로 분무 건조용으로 사용된다. 분무될 제재는 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제 및 용매 또는 캐리어액 이외의 물질을 함유할 수 있다. 예를들면, 수성상은 안정제로서 설탕 및 중합체와 같은, 1∼20 중량%의 수용성 친수성 화합물을 함유할 수 있는데, 예를들면, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 겔라틴, 폴리글루탐산 및 전분, 덱스트란, 우무, 크산틴 등과 같은 다당류가 있다. 유사한 수성상이 캐리어액으로 사용될 수 있는데, 여기서 최종 미소구체 생성물은 사용전 부유된다. 대부분의 생리학적으로 수용 가능한 유화제를 포함하여, 유화제가 사용될 수 있는데(0.1∼5중량%), 예를들면, 겨란 레시틴 또는 대두 레시틴 또는 합성 레시틴 즉 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스타티딜콜린 또는 디스테아로일 포스파티딜콜린과 같은 포화 합성 레시틴 또는 디올레일 포스파티딜콜린 또는 디리노레일 포스파티딜콜린과 같은 불포화 합성 레시틴이 있다. 유화제는 또한, 유리 지방산, 유리 지방산과, 폴리옥시프로필렌 글리콜 및 폴리옥시에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시알킬렌 화합물과의 에스테르; 지방 알코올과 폴리옥시알킬렌 글리콜의 에테르; 지방산과 폴리옥시알킬화 소르비탄의 에스테르; 비누; 글리세롤-폴리옥시에틸렌 리시놀레이트; 폴리알킬렌 글리콜의 단중합체 및 공중합체; 폴리에톡시화 대두유 및 피마자유 및 수소화 유도체; 슈크로우즈 또는 기타 탄수화물과 지방산, 지방 알코올과의 에테르 및 에스테르, (이들은 임의로 폴리옥시알킬화 된다); 포화 또는 불포화 지방산, 글리세라이드 또는 대두유 및 슈크로우즈의 모노-, 디- 및 트리글리세라이드를 포함한다.
미소구체의 벽에 첨가제가 첨합되어 분산성, 전도성 및 수 침투성과 같은 물리적 특성을 변형시킬 수 있다. 유용한 첨가제 중에는, 지방, 왁스 및 고분자량의 탄수화물과 같이, 수 침투성을 저하시키기 위하여 벽을 "소수성화" 시킬 수 있는 화합물이 내포된다. 주입 가능한 캐리어내에서 미소구체의 분산성을 개선시키는 첨가제는 인지질과 같은 양친매성 화합물인데, 이들도 수침투성 및 생물학적 분해성의 속도를 증가시킨다. 벽의 전도성을 증가시키는 첨가제에는 이소프로필 미리스테이트 등과 같은 가소제가 포함된다. 벽에 첨합되는 첨가제의 양은 필요에 따라 극히 가변적이다. 일부 경우에 있어서, 전혀 첨가제가 사용되지 않는 반면에, 다른 경우에는 첨가제의 양이 벽의 중량에 약 20% 까지 도달할 수 있다.
하나 이상의 본 발명의 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제 및, 필요한 경우, 첨가제를 함유하는 용액은, 상술한 바와 같이 2∼5㎛의 분리된 미소구체 즉 마이크로캡슐을 초래하는 임의의 적절한 기술에 의하여 미립화 및 분무 건조된다. 여기서 사용한 바와 같이, "마이크로캡슐"은 공간을 에워쌓는 중공형 입자를 가르키는데, 공간은 임의의 고형 물질이 아닌 가스 또는 증기로 충전된다.
예를들면 가압하여 최소한 하나의 오리피스를 통하여 배합제를 밀어냄으로써, 또는 열기 또는 기타 불활성 가스의 챔버내에서 원심분리 분무기기를 사용함으로써, 미립화 공정은 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제 배합물의 에어로졸을 형성한다. 챔버는 축출된 최대 방울이 건조되기 전 벽과 충돌하지 않을 정도로 충분히 커야 한다. 챔버내의 가스 또는 증기는, 사용시 마이크로캡슐의 투여와 함께 수반되는 양으로 혈류에 투여될 때, 깨끗하고(바람직하게는 살균 상태 및 발열물질이 없는) 비독성이다. 제재로부터 액상의 증발 속도는 충분히 높아서 중공형 마이크로캡슐을 형성할 수 있어야 하나, 마이크로캡슐을 파열시킬 정도로 높아서는 안된다. 증발 속도는 가스 유속, 배합물의 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제의 농도, 액상 캐리어의 특성, 용액의 공급속도 및 보다 중요하게는, 에어로졸에 의하여 당면하게 되는 가스의 온도를 변형시킴으로써 조절될 수 있다. 예를들면, 수중 알부민 또는 알부민 단편의 농도가 15∼25%, 및 입구 가스온도가 최소 약 100℃, 바람직하게는 최소 110℃이면 충분히 중공성을 보장할 수 있으며, 온도는 캡슐이 파열되지 않는 상태에서 250℃까지 될 수 있다. 약 180∼240℃, 바람직하게는 약 210∼230℃ 및 가장 바람직하게는 약 220℃가 이상적이다. 에어로졸에 의하여 당면하는 가스의 온도가 또한, 에어로졸이 운송되는 속도 및 제재의 액체 함량에도 좌우되기 때문에, 챔버내의 적절한 온도를 확보하기 위하여 출구 온도를 감시할 수 있다. 출구 온도가 40∼150℃이면 적절하다. 유속을 조절하는 것은 온전한 중공형 입자의 수와 같은 기타 매개변수를 조절하는데 유용하다.
미소입자는 최소 50%, 좀더 바람직하게는 70% 또는 80% 및 가장 바람직하게는 90 중량%의 트란스사이토시스 상승제를 포함할 수 있다. 흡입기구에서의 사용을 위하여, 미소입자는 락토오스 또는 글루코오스와 같은 종래의 의약품 첨가물과 함께 배합될 수 있다. 생리학적 활성제의 양은, 그 특성 및 활성, 투여양식 및 당분야의 숙련자에게 공지된 기타 요소와 관련하여 선택된다. 예로서, 투여된 입자의 수는 100mg/일 α-1 항트립신을 운송하거나 또는 비클로메티손과 같은 활성제를 0.1mg/일 운송할 수 있다. 미소입자를 경유하여 투여될 수 있는 기타 가능한 생리학적 활성제가 아래에 제시된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 배합, 포장중에, 및 가장 중요하게는 폐포 피복층에 존재하는 동안에 활성제의 안정화를 용이하게 하기 위하여 생리학적 활성제를 트란스사이토시스 상승제와 함께 분무-건조하는 것이다. 이러한 환경에 있어서, 강한 단백질 분해 활성이 있을 수 있다. 이와같은 또는 다른 구체예에 있어서, 활성제는 분무-건조전에 개열 가능한 연결을 통하여 트란스사이토시스 매개체에 공유적으로 결합될 수 있다. 이 구체예는 활성제를 기구로부터 혈류 방향으로만 및 가능하게는 몸체내의 표적으로 운반하는 방법을 나타내고 있다. 이상적인 공기 역학적 크기를 지닌 입자의 형성이라는 것은 "물리적" 매개체가 활성제를 흡수의 부위로 운반한다는 것을 의미한다. 일단 기포상에 주입되면, "분자" 매개체는 다음에 P60 매개 트란스사이토시스 시스템을 통하여 혈류로의 통행을 보호 및 용이하게 하며, 혈류중에서는, 더욱 순환 반감기를 상승시키며, 심지어는 활성제를 GP60 수용체를 함유하는 것으로 판명되는 특정 부위로 향하게 한다. 적절한 연결 기술은 위에서 논의되었는데; 다시, WO-A-9317713호는 에스터라제-감응 폴리히드록시산 링커를 기재하고 있다. 분무-건조전 트란스사이토시스 매개체의 유도화에 사용된 이와같은 기술은, 활성제를 전신 맥관구조로 운송하기 위한 공유결합 캐리어 시스템의 제조를 가능케 한다. 이것은 잠재적으로 불안정한 성분을 보호하면서 기포를 횡단하며 장기간에 걸쳐 활성제를 운반하기 위하여 트란스사이토시스 매개체의 잠재력을 이용한다.
본 발명에서 사용된 생리학적 활성제가, 그들이 배합된 후에 미소입자에 흡수되거나 또는 결합될 수 있기는 하나, 그것은 바람직하게는 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제와 함께 배합된다. 그들 용해 속도를 저하시키고, 하이드로스코프적 성장을 보호하기 위하여, 미소입자는 최소한 부분적으로, 소수성 또는 지방산과 같은 수불용성 물질로 피복된다.
예를들면, 건조분말 흡입장치에 사용하기 위한 미소입자의 분무-건조 및 발생을 위한 방법 및 장치는 WO-A-9609814 및 미국특허출원 제 08/487,420호에 보다 상세히 기재되어 있는데, 이들 내용을 여기서 참고로 인용한다.
폐운송용 배합에 있어서의 트란스사이토시스 상승제에 대한 약물의 이상적 비율은 임의의 적절한 방법에 따라 결정될 수 있다. 시험관내 실험에서의 이상적인 배합은, 하기 실시예에서 기재된 바와 같이, 기공 필터상에서 단층으로 성장된 본래 인체 또는 불후화된 인체 상피 세포의 상피 세포 단층을 이용하는 방법을 수반한다. 다음에 역시 아래에 기재된 바와 같이, 약물 및 상승제의 조합이 트란스웰 유동 시스템(transwell flux system)의 상부 챔버에 적용될 수 있다. 라벨된 트레이서 또는 면역 검정법을 이용하여, 하부 층에 대한 약물 또는 유전자의 유출비가 측정된다. 이상적 배합은 제한적인 단층을 관통하는 최대 속도 및 범위를 나타내는 것으로 규정된다.
이상적인 배합의 선택적인 별도 방법은, 약물의 폐로부터 혈액까지의 통행을 생체내에서 조사하여 결정하는 방법을 수행한다. 쥐, 돼지 및 양에 관하여는 훌륭한 연구 보고가 있는데 (패톤(Patton) 등, 조절된 방출의 저널(Journal of Controlled Release)28: 79 (1994), 폴케손(Falkesson) 등, Acta. Physiol. Scand.147: 73(1993); 슈라이어(Schreier) 등, Pharm. Res.11: 1056 (1994)); 이들 보고는 약물 배합물을 기관 및 세기관지에 점적 또는 에어로졸화하며 면역 검정 또는 약물학적 활성에 의하여 혈액에 약물이 나타나는 현상을 평가하는 방법을 기재하고 있다. 배합의 이상화는 약물과 상승제의 비율을 달리하여 일련의 동물 제재를 수반하는데, 이상적인 배합이라는 것은, 약물에 대하여 소정의 약물학적 프로필과 부합하는 곡선하에서 가장 유익한 영역으로 규정된다. 예를들면, 약물은 단순히 최대 생체 이용을 나타내거나 또는 선택적으로는 연장된 즉 지연된 방출 양상을 나타내는 것이 요구될 수도 있다. 각각의 경우에 있어서, 배합에 첨합되는 상승제의 양에 대한 요구를 달리하는 것으로 보인다. 최대 이용율을 요구하는 약물에 있어서는 최대량의 상승제 및/또는 GP60 수용체에 대하여 최고의 활성 효과를 나타내는 상승제를 이용하는 것이 요망스럽다. 폐를 횡단하여 장기간의 지속이 요구되는 약물에 있어서는, 낮은 양의 상승제 및/또는 트란스사이토시스 GP60 수용체에 대하여 보다 낮은 활성 잠재력을 나타내는 상승제를 이용하는 것이 요망된다.
상승제 또는 매개체의 "강도"는, 리간드의 부재하에서의 트란스사이토시스의 수준에서, GP60 수용체 결합 리간드, 항체 또는 의태의 존재에 의하여 소정 트레이서의 트란스사이토시스가 상승작용을 받을 수 있는 정도로 규정될 수 있다. 상승제의 강도는 또한 어느 정도는 약물 의존적이다. 마아커 섭취의 상승은 마아커 및 트란스사이토시스 상승제의 특성에 다라 변화될 수 있다. 하기 표는 마아커, 상승제, 세포 시스템 및 마아커 세포 시스템 및 실험 형태를 달리하기 위하여 달성된 대비상에서, 상승작용의 정도를 나타내는 일람표이다.
다음과 같은 부호가 사용된다:
125I-BSA125요오드-라벨 소 알부민125
I-IgG125요오드-라벨 면역글로부린 G
HSA 인체 알부민
BSA 소 알부민
FITC-인슐린 플루오레세인-라벨 인슐린
GP60 Ab 항-GP60 폴리클로날 항체
T3118 GP60의 N-말단 18 잔기로부터 유도된 항성 펩티드
마아커 상승제 세포 형태 상승 배수
125I-BSA GP60 Ab 소/내피/유동 1.6
125I-BSA GP60 Ab 소/내피/유동 2.0
항-BSA125I-IgG BSA 소/내피/유동 1.5
FITC-인슐린 HSA 인체내피/유동 2.5
FITC-인슐린 BSA 쥐 상피/유동 4
125I-BSA BSA/T3118 소내피/ 섭취 5
"생리학적 활성제"라는 용어는 핵산 분자와 의약 펩티드 및 단백질을 내포하는 약물을 의미한다. "생리학적 활성제"는 여기서 "약물", "활성제", "활성물질" 및 "치료제"라는 용어와 상호 대체하여 사용 가능하다. 내피 및 상피를 횡단하여 보다 신속한 트란스사이토시스로부터 효능을 얻을 수 있는 약물은, 황체 형성 호르몬(LH), 융모성 성선자극 호르몬, 심방 펩티드, 인터페론, 인터루킨 (I, II, III, IV, V, VI 및 VII)과 같은 다양한 림포킨 및 군체 자극 인자를 포함한다.
본 발명의 용도에 적절한 기타 약물에는, 성장 호르몬 방출 인자, 부신피질 자극 호르몬 방출인자, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 성장 호르몬 분비억제 호르몬, 칼시토닌, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP, Calcitonin Gene-Related Peptide), 트랜스퍼라제, 하이드로라제, 아이소마라제, 프로티아제, 리가제, 옥시도리덕타제, 에스터라제 및 포스파타제를 포함하여 효소와 같은 단백질, 소마토메딘, 상피성장 인자(EGF), 유로가스트론, 신경성장인자(NGF), 모양영양인자(CNTF, Ciliary Neurotrophic Factor), 뇌-유도 영양인자(BDNF), 신경교 유도 영양인자(GDNF), 선유아세포 성장인자(FGF), 인슐린형 성장인자, 종양괴사인자(TNF) 및 형질전환 성장인자(TGF)와 같은 다양한 성장 및 영양 인자를 포함한다. 또한 약물은 뇌수 및 엔돌핀과 같은 내인성 오피오이드 작용물질; 고나돌리베린, 멜라노스타틴, 멜로노리베린, 소마토스타틴, 티롤리베린, 물질 P 및 뉴로텐신과 같은 시상하부 호르몬; 부신피질자극 호르몬, 지방자극 호르몬, 멜라노트로핀, 루트로핀, 갑상선 자극 호르몬, 활체 자극 호르몬 및 성장 호르몬과 같은 선하수체 호르몬; 신경하수체 호르몬; 파라티린 및 칼시토닌과 같은 칼시트라픽(갑상선) 호르몬; 티모신, 티모포이에틴, 순환 흉선인자 및 흉선액성 인자와 같은 흉선인자; 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴과 같은 췌장 호르몬; 가스트린, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 위 억제 폴리펩티드, 혈장관 펩티드 및 모티린과 같은 위장관 호르몬; 이완 호르몬과 같은 난소 호르몬; 안기오텐신 및 브라디키닌과 같은 혈관 작동성 조직 호르몬; 및 디페록스티아민과 같은 인공 또는 슈도 펩티드; 및 부세레린, 데스로레린, 고나도레린, 고세레린, 히스트레린, 류프로레린, 나파레린, 또는 트리프로레린과 같은 LHRH 유사체를 포함한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였으나, 상기 본 발명은, 본 발명을 제한하려는 의도가 아니라 다만 설명하기 위하여 제시된 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해하게 된다.
실시예 1
내피 및 상피 단층의 성장
기재된 방법(델 베치오(Del Vecchio) 등, In Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A: 711-715 (1992))에 따라 소폐 미소혈관 내피세포 (BPMVEC, Bovine Pulmonary MicroVessel Endothelial Cells) 및 소폐 동맥 내피 세포(BPAEC, Bovine Pulmonary Artery Endothelial Cells)가 유리되어 배양되었다. 내피 세포는 20% FBS를 함유하는 DMEM으로 일상적으로 배양되었다. 플라스마 막을 유리하기 위하여, 내피세포가 850m3의 롤러병에서 배양되었다. 각 롤러병에, 75ml의 배지가 첨가되었다. 공기-CO2혼합물이 도입되었다. 다음에 세포는 37℃의 롤로병 배양기로 전이되고, 10 - 12일간 성장하도록 방치되었다.
유알(Uhal) 등의 Am. J. Physiol.257: C528 - C536 (1989)에 기재된 방법에 의하여 원래의 쥐 기포 상피 세포(AEC, Alveolar Epithelial Cells)가 유리되었다. 세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 2일이나 4일간 배양되었는데, 이 때 그들은 각각 형태 II 또는 형태 I 세포형 표현형을 나타내었다. 표현형은 유할 등의 Am. J. Physiol. Suppl.261: 110 - 117 (1991)에 기재된 방법에 의하여 확인되었다.
내피 세포막 유리
롤러병에서 성장된 내피세포가 인산염 완충작용 염수로 2회 세척되었다. 세포를 롤러병으로부터 긁어 모아 완충액-A (20mM HEPES/트리스, 0.15M NaCl, 0.1mM PMSF, pH7.4)에 부유되고 700xg으로 10분간 원심분리함으로써 2회 세척하였다. 6∼8 롤러병으로부터 얻은 세포는 75ml의 완충액-A에 부유되어, 1분간 총속력으로 폴리트론(Polytron) 균질화 장치를 사용하여 균질화 되었다. 균질화물은 3000xg로 10분간 원심분리되었다. 상청액은 수집되어 40,000xg로 60분간 원심분리되었다. 얻어진 펠렛은 다음에 완충액-A에 부유되고 40,000xg로 60분간 재원심분리된다. 최종 막 펠렛이 0.2mM EDTA를 함유하는 소량의 완충액에 부유되고 단백질 농도가 측정된다(로우리(Lawry) 등, J. Biol. Chem.193: 265 - 275 페이지(1951)). 플라스마 막 마아커 효소 활성이 측정되고 샘플은 다시 사용할 때까지 -70℃에서 저장된다.
리간드 블롯트법
내피 세포막이 1mM PMSF 및 0.5mM EDTA로 22℃에서 20분간 사전 배양된 후, 1.5 용적의 가용화 완충액(9M 요소, 2% SDS, 2% β-메르캅토에탄올, 0.1M 트리스, 0.02% 브로모페놀 블루 pH6.8)과 혼합함으로써 가용화 되었다. 혼합물은 22℃에서 30분간 배양되었다. 가용화된 단백질은, 적중 겔(stacking gel)중의 3% 아크릴아미드 및 분리 겔 중의 10% 아크릴아미드를 지닌 평판 겔 전기 영동 시스템을 이용하여 SDS-PAGE(라엠리(Laemmli) Nature (런던)227: 680 - 685 페이지(1970))에 의하여 분리되었다. 전기 영동법으로 처리 후, 단백질은 PVDF 또는 니트로셀루로오스 막으로 전이되었다. 전이는, 전이 완충액으로서 25mM 트리스, 192mM 글리신, 및 20% 메탄올을 사용하여 150 볼트에서 2시간 수행되었다. 비특정 결합은, 막을 TBS(20mM 트리스, 0.5M NaCl pH7.5) 중의 5mM CaCl2로 10분간 및 다음에 TBS 중의 0.5% 트윈-20으로 철야로 배양함으로써 차단되었다. 이 단계 후에, 막은 세척되어 두 조각으로 절단되었다. 한 조각은 1.5% 겔라틴을 함유하는 TBS 중의 0.6mg/ml 무 글로부린 BSA로 2시간 배양되고 다른 조각은 BSA 없이 배양되었다. 조각들은 세척되어 1.5% 겔라틴을 함유하는 TBS 중에서 60분간 항-소 BSA로 배양되었다. 다음에 막은 2회 세척되고 알카리성 포스파타제와 결합된 제 2 항체 (염소 항-토끼 IgG)로 배양되었다. 단백질 밴드는, 5-브로모-4-클로로-3-인도릴포스페이트 및 니트로블루 테트라졸리움 염을 첨가후에 국부화되었다.
단백질 정제
57 kDa 알부민 결합 단백질을 유리하기 위하여 BPMVEC 막이 사용되었다. 각 단계에서 이 단백질의 존재를 평가하기 위하여 리간드 블롯트 처리가 수행되었다. BPMVEC 막(100mg)은 1mM PMSF 및 0.5mM EDTA로 22℃에서 30분간 사전배양되었다. 막은 온화하게 저으면서 4℃에서 3시간 동안 최종 농도 2.5%의 콜산나트륨 및 4M 요소를 사용하여 가용화되었다. 단백질 농도는 가용화 동안에 4mg/ml로 조정되었다. 이 처리후, 현탁액은 100,000xg로 60분간 원심분리되었다. 상청액은 수집되어 5mM HEPES/트리스(pH7.2)에 대하여 투석되었다. 80% 이상의 막 단백질이 상청액에서 회수되었다. 투석된 현탁액은 4℃에서 60% 에탄올 침전에 의하여 농축되었다. 에탄올 침전물은 4℃에서 10,000xg로 30분간 원심분리하여 수집되고 완충액-A에 부유되었다. 이 침전물은 온화하게 저으면서 4℃에서 철야로 2.5% 트리톤 X-100으로 가용화되었다. 현탁액은 100,000xg로 60분간 원심분리되었다. 상청액은 수집되어 4ℓ의 50mM 트리스-HCl, 0.2mM EDTA, 0.15% 트리톤 X-100 및 0.1mM PMSF, pH8.0(완충액-B)에 대하여 투석되었다. 투석된 추출물은 DEAE-52 칼럼(10 x 13cm) 상에 적용되었다. 칼럼은 미리 완충액-B로 평형을 이루었다. 칼럼은 샘플을 적용한 후 50ml의 완충액 B로 세척되었다. 결합 단백질은 유속 15ml/hr로 완충액 B 중 80ml의 0∼500mM 선상 NaCl 경사의 칼럼으로부터 용리되었다. 개별 피크로부터의 유분이 별도로 수집되어 50% 아세톤 침전에 의하여 농축되었다. 아세톤 침전물은 리간드 블롯트 처리용으로 사용되었다. 오직 피크-I 만이 알부민 결합 활성을 보였다. 피크-I에 존재하는 단백질은 예비 SDS-PAGE(16cm x 16cm, 3m 두께 슬라브-겔)을 이용하여 다시 분리되고, 겔로부터 용리된 57kDa 단백질은 다음 조사를 위하여 사용되었다.
항체 제조 및 정제
예비 SDS-PAGE로부터 용리된 57kDa 알부민 결합 단백질을 사용하여 토끼를 면역처리 하였다. 동일 용적의 프로인드 완전 보조물질과 혼합한 후 약 50㎍ 단백질(토끼 당)을 근육내 주사하였다. 제 2차 주사는 2주후 시행되었다. 토끼는 제 2차 주사후 4∼6주에 채혈되었으며 면역반응을 조사하였다. 단백질 A-세파로우스 칼럼을 이용하여 면역전 혈청 IgG 및 항혈청 IgG가 정제되었다.
면역 블롯트 법
내피세포막이 SDS-PAGE(라엠리, 상기 문헌)처리되고, 전기 영동적으로 니트로셀루로오스 또는 PVDF 막으로 전이되었다. 비특정 결합은 22℃에서 5시간 동안 TBS 중의 3% 겔라틴으로 차단되었다. 막은 TBS 중의 0.5% 트윈-20으로 2회 세척되고, 1% 겔라틴을 함유하는 TBS 중에서 희석된 항혈청으로 배양되었다. 배양은 4∼6시간 수행되고 2회 세척된 후, 제2 항체(알카리성 포스파타제에 결합된 염소 항-토끼 IgG)로 60분간 배양되었다. 배양후, 막은 2회 세척되고, 단백질 밴드는 "리간드 블롯트법"에 기재된 바와 같이 국부화되었다. 단백질의 분자량은 공지의 마아커 단백질을 이용하여 측정되었다.
단층 결합 조사
BPMVEC가 6개의 웰 코닝 조직 배양판에 파종(3 x 105 세포/웰)되어 성장되었다. 단층은 무혈청 배지(20mM HEPE/DMEM pH7.4)로 2회 세척되고, 조직 배양기에서 15∼20시간 동안 무혈청 배지로 배양되었다. 이 배양후, 단층은 결합완충제(20mM HEPES/트리스 HBSS pH7.4)로 2회 세척되고, 결합은 결합 완충제에 1ml의 1 μM125I-BSA를 첨가함으로써 개시되었다. 배양은 4℃에서 60분간 수행되었다. 결합은 단층을 결합 완충제로 3회 세척함으로써 종결되었다. 1N NaOH로 세포를 용융시킨 후에 완충과 관련된 방사능성이 측정되었다(티루파티(Tiruppathi) 등, Am. J. Physiol. (Lung. Cell. Mol. Physiol.) L595∼L601 (1992)). 비특정 결합은 결합 공정 동안에 라벨되지 않은 BSA(40mg/ml)의 혼재물에 의하여 측정되었다. 시험 성분, 면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa-IgG는125I-BSA 첨가전에 단층으로 30분간 사전배양되었다.
세포통과 유동 실험
배양된 내피 단층내의 경내피(transendothelial)125I-알부민 유동 속도가, 경내피 알부민 운송을 평가하기 위하여 이용되었다. 이 연구를 위하여 이용된 시스템은 이미 기재되어 있다(쿠우퍼(Cooper) 등, J. Appl. Physiol. 62: 1076 - 1083(1987); 가르시아(Garcia) 등, J. Cell. Physiol. 128: 96 - 104(1986); 델베치오(Del Vecchio) 등, Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A: 711-715(1992) 및 시플링커-번본(Siflinger- Birnboirn) 등, J. Cell. Physiol.132: 111 - 117 (1987)). 시스템은 정수압 및 코로이드 침투압 부재하에 트레이서 거대 분자의 경내피 운동을 측정한다. 이것은 폴리카보네이트 미공성 필터(0.8㎛ 기공 직경)에 의하여 분리된 루미날(luminal) 및 아브루미날(abluminal) 구획으로 구성된다. BPMVEC가 105 세포/필터로 파종되어 3∼4일간 성장되었다. 양 구획은 동일배지(20mM HEPES-DMEM, pH7.4)를 각각 60ml 및 25ml의 용적으로 함유하였다. 루미날 구획은 스티로포옴(Styrofoam) 외부 고리와 맞추어지고, 아브루미날 배지에 "표류"되어, 아브루미날 구획으로부터의 반복적인 샘플링 후에도 유동량이 동일하게 유지되도록 한다. 아브루미날 구획은 연속적으로 교반되며, 전체 시스템은 자동온도 조절식의 수조에 의하여 37℃로 유지된다.125I-알부민의 경내피 클리어런스는, 아브루미날 챔버로 클리어된 루미날 챔버 방사능성의 용적으로 측정된다. 시간에 대한 용적 변화는, 계량된 최소 자승법 비-선상 회귀 분석에 의하여 측정된 ㎕/분의125I-알부민 클리어런스를 제공한다(BMDP Statistical Software, 버클리, CA).
실험 초기에, 루미날 구획은 아브루미날 배지에 표류되고, 약 6μCi/ml125I-알부민을 함유하는 배지로 충전된다. 아브루미날 샘플 400㎕가 60분동안 10분 간격으로 수집되고, 감마 카운터를 사용하여 방사능성이 측정되었다. 실험 종결단계에서, 12% TCA 침전을 이용하여 루미날 및 아브루미날 구획내의 유리125I가 측정되고, 경내피125I-알부민 유동 속도가 유리125I에 대하여 정정되었다.
실험 전날, BPMVEC 단층은 20mM HEPES-DMEM pH7.4(무혈청 배지)로 2회 세척되고 12 - 15시간 동안 무혈청 배지를 지닌 세포 배양장치에서 37℃로 배양되었다. 이 배양기간 후에, 시험성분(면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa-IgG)이 무혈청 배지에서 희석되고 소정 기간동안 단층으로 배양되었다. 이들 단층은 다음에 경내피 알부민 이송 측정용으로 사용되었다.
경상피(trans-epithelial) 유출속도는 내피 세포에 대하여 기술한 방법을 약간 변형한 방법으로 측정되었다. 유출 속도는 트란스웰 필터(코스타)에 대하여 기재한 바와 같이 배양된 프라이머리 AEC 또는 A549 인체 폐암세포주상에서 측정되었다(에반스(Evans) 등, Exper, Cell Res.184: 375 - 387 페이지(1989)). 단층의 완전성은 경상피 전기 저항이 500 오옴/cm2이상인 것에 의하여 규정된다. 온전한 단층을 지닌 필터가, 웰상 1ml 무혈청 DMEM을 함유하는 24 웰 배양판에 놓였다(아브루미날 챔버). 루미날 챔버는 이름있는 트레이서 분자 (FITC-인슐린)를 함유하는 200㎕ 무혈청 DMEM으로 충전되었다. 정수압을 배출하는 두 구획내의 유출량은 동일하였다. 필터 시스템은 사전 배양되었고 (30분) 다음에 유출 실험 전반에 걸쳐 CO2배양기에서 37℃로 유지되었다. 한시간 및 두 시간에서, 아브루미날 챔버로부터 300㎕ 샘플을 꺼낸 후 즉시 무혈청 DMEM으로 대체하였다. 트란스사이토시스 작용된 물질(transcytosed material)의 형광은 평판 리터상에서 기록되고, 결합 대 유리 FITC의 비율은 아브루미날 샘플의 겔 필터 크로마토그라피에 의하여 측정되었다.
액틴 필라멘트 분포 125
I-알부민 글리어런스 비율의 측정에 사용된 것과 동일한 조건하에서, 필터에서 성장된 내피 세포 단층에서의 세포 골격 변화 및 액틴 필라멘트, 분포가 조사되었다. 시험구간에 대하여 필요한 사전 처리 가간이 지난 후, 필터상의 단층은 10% 완충 포르말린(팔레신세스사 (Pallescences Inc.), 와링톤, PA)에 고정되고, 10% 노니뎃(Nonidet) P40 (시그마사)으로 투과성화 되고, 필립스(Phillips) 및 트산(Tsan), J. Histochem, Cytochem. 36: 551 - 554(1988)에 기재된 바와 같이 로다민 팔로이딘(Molecular Probes, Inc., 유진, OR)으로 착색되었다. 단층을 함유하는 온전한 필터는 웰로부터 제거되어 커버 글라스위에 놓이고, 인산염-완충 염수중의 글리세린 1:1 용액으로 피복된 후 둥근 커버 글라스로 덮혀 밀봉되었다. 니콘 라브 다이아포트(Nikon Lab Diaphot)형광 현미경(니콘사, 멜빌레, 뉴욕)을 사용하여 슬라이드가 분석되고, TRI x Pan 400 ASA 코닥 필름을 사용하여 사진촬영되었다.
알부민 결합 단백질의 확인
분획 원심분리법에 의하여 BPMVEC로부터 플라스마 막을 우선 유리하고, 이 막 분획에 존재하는 알부민 결합 단백질이 리간드 블롯트법 (상기 참조)을 이용하여 확인되었다. 내피세포막의 천연 알부민 결합 단백질을 확인하기 위하여 간단한 방법이 개발되었다. SDS-PAGE를 이용하여 막 단백질이 분리된 후 PVDF 또는 니트로셀루로오스로 이전되었다. 비특정 결합은, 막 스트립을 트윈-20으로 배양하여 차단된 후, 무 글로부린 모노마성 천연 BSA로 처리되었다. BSA-결합 영역은, 천연 BSA에 대하여 발생된 폴리클로날 항체를 이용하여 확인되었다. 천연 BSA에 대하여 막 스티립을 노출시키지 않은 상태에서, 항 BSA는 67kDa 폴리펩티드만을 인식하였는데, 이것은 내피 세포막에 결합된 현저한 양의 BSA가 존재한다는 것을 가르킨다. 그러나, 스트립이 BSA로 처리되면, 항 BSA 항체는 3개의 추가 폴리펩티드(110kDa, 57kDA 및 18kDa)와 반응하였다. 이들 폴리펩티드 중, 항체는 57kDa와 가장 강렬하게 반응하는데, 이것은 57kDa 폴리펩티드가 주된 천연 알부민 결합 단백질이 된다는 것을 가르킨다. 총 내피세포막 분획(BPMVEC 및 BPAEC로부터의 100,000xg 미립자 분획)도 마련되어 리간드 블롯트 용으로 사용되었다. 이들 미립자 분획도 BSA와 57kDa 폴리펩티드의 주된 상호 작용만을 나타내었다.
57kDa 알부민 결합 단백질의 유리
천연 알부민의 결합이 주로 57kDa 단백질과 이루어지는 것으로 나타나기 때문에, BPMVEC 막으로부터 이 단백질을 유리하기 위한 방법이 개발되었다. 정제중에 이 단백질의 존재를 평가하기 위하여 리간드 블롯트 법이 채택되었다. BPMVEC 막은 우선 2.5% 콜산나트륨 및 4M 요소로 가용화되고 추출물은 투석 및 60% 에탄올 침전에 의하여 농축되었다. 이 침전물은 트리톤 X-100 (상기 참조)으로 재추출되었다. 트리톤 X-100 가용돠 추출물은 DEAE 칼럼상에서 크로마토그라피 처리되고, 결합 단백질은 선상 경사(0∼500mM NaCl)로 용리되었다. 단백질은 3 피크로서 용리되었다. 각 피크로부터의 분획은 수집 및 리간드 블롯트 검정법을 사용하여 알부민 결합을 위하여 스크린되었다. 단지 하나의 피크(I)만이 57kDa 단백질 영역과의 알부민 결합을 보였다.
쿠마시 브릴리안트 블루 R-250으로 착색한 후에, 천연 BPMVEC 막 및 DEAE 칼럼 피크 I로부터의 단백질을 이용하여 SDS 전기 영동법이 수행되었다. 알부민 결합에 대응하는 57kDa 단백질의 존재가 천연 막 및 DEAE 피크 I 모두에서 리간드 블롯트법으로 관측되었다. SDS-PAGE도 비환원 조건(βME 부재하에)에서 수행되고, 알부민 결합은 57kDa 영역만으로 관측되었는데, 이것은 이 단백질에 디술피드 결합이 존재하지 않는다는 것을 암시한다. 이 단백질은 예비 SDS-PAGE를 이용하여 다시 정제되고, 겔로부터 용리된 단백질은 항체 제조용으로 사용되었다.
면역 블롯트법
BPMVEC 및 BPAEC 막 단백질이 SDS-PAGE를 이용하여 분리되고 니트로스셀루로오스 스트립으로 전이되었다. 스트립은 57kDa 항혈청으로 면역 블롯트 처리되었다. 면역전 혈청은 BPMVEC 및 BPAEC 막으로부터 어떤 단백질도 인식하지 못했다. 항 혈청은 양쪽 막 제재에서 2개의 주단백질(57kDa 및 36kDa)과 하나의 부 단백질 (49kDa)을 인식하였다. BPMVEC 및 BPAEC로부터의 미립상 분획은 또한 면역 블롯트법용으로 사용되었다. 항체는 미립상 분획내의 이들 3개의 단백질만을 인식하였다. 이와같은 현상은 알부민 결합 단백질이 명백한 동질성으로 정제되었음을 암시한다.
내피 막-결합 및 분비된(SPARC) 알부민 결합 단백질 사이의 제안된 구조적 관계를 조사하기 위하여, 정제된 소 SPARC에 대하여 발생된 항체로 BPMVEC막의 면역 블롯트 처리가 수행되었다. 정제된 소 SPARC에 대하여 발생된 항 혈청은 BPMVEC막의 67kDa, 61kDa, 57kDa, 43kDa 및 36kDa 폴리펩티드를 인식하였다. 항-SPARC-NH2말단 펩티드 항혈청은 36kDa 폴립펩티드와 강하게 및 43kDa 폴립펩티드와는 약하게 반응하였다. 이것은 청소부 수용체는 천연 알부민 수용체와는 판이하게 다르다는 것을 암시한다.
125 I-BSA와 BPMVEC 단층의 결합에 대한 항-57kDa-IgG의 효과
면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa-IgG가 단백질-A 세파로우스 칼럼을 이용하여 친화성-정제 되었다. 4℃에서125I-BSA와 BPMVEC의 결합에 대한 IgG 분획의 영향이 조사되었다: 비특정 결합 범위는 40∼50%. 면역전 혈청-IgG는 BPMVEC 단층에 대한125I-BSA의 특정 결합에 현저한 영향은 미치지 않았다. 대조적으로, 항-57kDa-IgG는 약물 의존방식에 있어서 BPMVEC 단층에 대한125I-BSA의 특정 결합을 감소시켰다. 감소는 항-57kDa-IgG에 있어서 200㎍/ml 농도에서 최대 (40∼50%) 였으며, 1000㎍/ml 까지 불변을 유지하였다.
이들 결과는 57kDa 단백질에 대하여 개발된 항체는 수용체에서 알부민 결합 영역을 완전히는 인식하지 못하거나 또는 천연 알부민이 내피 세포 표면상의 다른 결합부위와 상호작용할 수 있다는 것을 암시한다.
내피세포 형태 변화 부재하에 항-57kDa-IgG에 의한 경내피 알부민 유출의 활성화
알부민의 경내피 운송에 대한 항-57kDa-IgG의 영향을 조사하기 위하여, BPMVEC 단층의 경내피125I-BSA 클리어런스 속도가 측정되었다. 단층은 면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa-IgG로 15분, 30분 및 60분간 사전배양된 후, 경내피125I-BSA 클리어런스 속도가 60분까지 측정되었다. 투과성에 있어서의 항-57kDa-IgG-유도 증가는 시간 의존적이었다. 항-57kDa-IgG의 30분간 사전배양결과 면역전 IgG 보다125I-BSA 클리어런스 속도에 있어서 2배 증가를 초래하였다. 15분 사전 배양내에서는 투과성에 있어서 현저한 증가는 보이지 않았으며, 항-57kDa-IgG가 60분까지 단층으로 사전배양되었을 때 40∼50%의 변화가 감지되었다. 면역전 혈청-IgG는 시험된 모든 사전배양기간에 있어서 경내피 알부민 수송에 전혀 영향이 없었다.125I-알부민의 투과성에 대한 항-57kDa-IgG 효과는 4℃에서 복귀되었다.
면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa-IgG로 처리한 후의 내피세포의 형태 변화를, 기존에 기재된 기술(필립스(Phillips) 및 트산, 상기 문헌; 시플린저-번보임 등, Lab. Invest.67: 24 - 30 페이지(1992))을 사용하여 연구하였다. 뉴클레오포어 필터(nucleopore filter)상에서 성장된 BPMVEC는 면역전 혈청-IgG 및 항-57kDa IgG로 30분간 사전배양되고, 단층은 로다민 팔로이딘(상기 참조)으로 착색되었다. 어떤 경우에도 세포 "라운딩("rounding") 또는 내피 세포간 간격의 형성은 관측되지 않았다.
이들 결과는 항-57kDa 알부민 결합 단백질 항체가 알부민 운송을 활성화시킨다는 것을 암시한다. 다른 가능성이 있는데, 즉 이 항체는 내피 세포간 경계 간격을 넓힘으로써, 알부민의 세포 주변 운송을 비특정적으로 증가시킬 수도 있다는 것이다. 이를 묘사하기 위하여, 내피 세포 형태학에 대한 항-수용체 IgG 및 면역전 혈청 IgG의 영향이 검토되었다. BPMVEC 단층을 면역적 혈청-IgG 또는 항-수용체-IgG로 사전 처리하는 것은 내피세포간 경계 간격에 대한 영향이 전혀 없었다. 57kDa 알부민 결합 단백질에 대한 이 항체는 알부민의 트란스사이토시스를 활성화 시킬 수도 있다. 이 항체의 투과성 증가 효과는 4℃에서 일어나지 않는데, 이것은 항체가 온도-민감성인 것으로 판명된, 매개체의 형성을 통하여 알부민 트란스사이토시스를 활성화하였다는 결론을 지지하는 것이다(로(Lo) 등, J. Cell. Physiol. 151: 63 - 70(1992)).
실시예 2
GP60에 대하여 발생된 항체
실시예 1에 기재된 바와 같이 상피막 추출물을 탐사하기 위하여 내피 세포로부터 GP60에 대하여 발생된 항체가 사용되었다. 항-GP60 항체는 상피 추출물에서 발견된 60kDa 단백질을 인수하였다. 이것은 면역학적으로 관련되는 단백질이 이 시스템내에 존재한다는 것을 명백히 보여주고 있다.
용질 유동에 대하여 적절한 반응성을 나타내는 융합성 단층을 제조하기 위하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 상피 및 내피 세포가 단층으로 성장되었다. 항-GP60 항체(200∼500㎍/ml)가 4℃에서 단층으로 배양되어, GP60의 내재화를 초래할 수 있는 신진대사 작용의 부재하에, 수용체에 대한 항체와 결합한다. 이들 조건하에서의 항-GP60 항체의 결합은, 내피 단층에 의한125I-BSA 결합을 80 - 90% 감소시키게 된다. 상피 단층은 다시 1차 항-GP60 항체에 대한 제 2 항체로 배양되어 수용체를 가교결합시킨다. 양쪽 단층은 세척된 후 상피 세포에 대한125I-BSA 또는 내피 단층에 대한125I항-BSA 면역 글로부린으로 37℃에서 배양되어,125I-라벨 트레이서의 공-트란스사이토시스 및 수용체-항체 복합체의 내재화를 허용하게 된다. 항-GP60 항체로 배양하면 면역전 혈청 조절의 수준보다 섭취량에 있어서 1.6∼2배의 증가를 초래하게 된다. 따라서, 항-GP60 항체에 의하여 GP60 수용체를 결합하면 트란스사이토시스 메카니즘의 활성화가 초래되어, 함입막의 경계에서의 거대 분자의 섭취를 강화하게 된다.
실시예 3
거대 분자를 지닌 알부민의 이용
BSA의 존재하에 내피 단층이 4℃에서 배양되어, GP60에 대한 BSA의 결합을 개시하게 되나, 리간드 수용체 복합체의 내재화는 방지하게 된다. 미결합 BSA를 제거하기 위하여 광범위하게 세척한 후, 세포는 거대분자 트레이서로서,125I-라벨 항-BSA 면역 글로부린으로 37℃에서 배양되었다. BSA로 사전 처리하면 라벨되지 않은 항-BSA 면역 글로부린으로 사전 배양된 대조 세포보다 면역 글로부린 트레이서의 트란스사이토시스를 1.5배 강화시키게 된다. 또한, 37℃에서 배양된 세포가 세척되고 즉시 동일 프로토콜을 통하여 섭취되면 거대 분자 유출이 전혀 관측되지 않는데; 이것은, 일단 내재화되면, GP60 수용체는 리간드 결합용으로 이용 가능성이 없다는 것을 가르킨다. 따라서 대분자(150kDa)는 GP60 시스템을 이용하여 HSA와 함께 공-트란스사이토시스 될 수 있다.
실시예 4
펩티드를 지닌 알부민의 이용
실시예 1에 기재된 바와 같이, 인체 및 쥐 상피 단층이 성장되었다. 다음에 세포는, 상술한 경세포 유동 시스템에서 FITC-인슐린(1mg/ml) 또는 FITC-인슐린 및 BSA(각 1mg/ml)로 37℃에서 배양되었다. 인체 및 쥐 상피 단층에 있어서, FITC-인슐린만의 조절보다도 FITC-인슐린 유출에 있어서 2.5 또는 4배 증가되었다. 따라서 알부민 또한 GP60을 함유하는 상피세포를 횡단하여 소분자량의 공-트란스사이토시스를 자극한다.
실시예 5
GP60의 N-말단 펩티드 1-18의 이용
고체상 펩티드 합성법에 의하여, 제1 18잔기에 대응하는 GP60의 합성 N-말단 펩티드(T3118)가 제조되었다. 서열(SEQ ID NO. 1)은 소, 막-결합 티로이드 호르몬(T3)-결합 단백질과 80% 이상의 동질성을 나타낸다(야미우치(Yamauchi) 등, Biochem. Biophys, Res. Comm.146: 1485 (1987)). 그것은 PDI와 97%의 동질성을 갖는다.
T3118에 대하여 토끼에서 항체가 발생되어, 내피막 추출물을 탐사하는데 이용되어, 하술하는 바와 같이, 항-GP60 항체에 의하여 인식된 단백질과의 교차 반응성을 측정하게 된다. BPMVEC 막 단백질(100㎍)이 SDS-PAGE 상에서 분리되어 니트로셀루로오스 막 스트립으로 이전되었다. 비특정 결합은 트리스-완충 염수중의 5% 비지방 우유로 차단되었다. 항혈청은 차단 용액으로 희석되고, 4℃에서 4∼5시간 배양되며, 세척 및 알카리성 포스파타제와 결합된 염소-항-토끼-IgG로 처리되었다. 단백질 밴드는 공지의 분자량 마아커 단백질을 이용하여 확인되었다. 항-T3118 항체는 GP60 단백질에 대한 반응성만 나타낼 뿐, 항-GP60 항체에 의하여 인식된 SPARC 펩티드에 대하여는 나타내지 않았다.
다음에 T3118 펩티드는, 알부민 인식 및 섭취의 길항작용 물질로서 작용하는지의 여부를 결정하기 위하여, 내피 섭취 실험에 사용되었다. 내피 단층은125I-BSA 또는125I-BSA와 T3118 펩티드의 존재하에, 4℃에서 배양되었다. 배양후, 세포는 철저히 세척되고 용해되어 트레어서 섭취로 취급되었다. 놀랍게도, 길항작용 물질로서 작용하기 보다는, T3118 펩티드는 알부민만의 조절보다 사실상 알부민의 섭취를 5배 자극하였다. 강화작용은 500㎛의 T3118 펩티드 농도에서 포화가능 상태였다. 이들 데이터는, 길항작용물질로 작용하는 T3118 펩티드가 알부민내에서의 배좌적 변경을 의미할 수 있는데, 이것은 GP60에 의한 인식을 강화하며 또는 내피 세포에 의한 섭취를 나타내는 신호가 된다.
당분야의 숙련자는 본 발명 또는 그 구체예의 취지 또는 범위를 이탈함이 없이 폭 넓은 범위의 동등한 매개변수인, 조성, 농도, 투여형태 및 조건에서 본 발명이 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
서열목록
(1) 일반 정보
(i) 출원인:
(A) 성명: 안다리스 리미티드
(B) 가: 1 메어 웨이
(C) 시: 루딩톤
(D) 주: 노팅햄
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편코드(ZIP): 엔지1 5에이큐
(ii) 발명의 명칭: 약물 운송용 트란스사이토시스 매개체 및 상승제
(iii) 서열의 수: 1
(iv) 컴퓨터 판독가능 형태
(A) 매개체형: 플롭피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 양립성
(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리즈 #1.0, 버존 #1.30 (EPO)
(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길이: 18 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 쇄의수:
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열기재: SEQ ID NO: 1:
Lys Pro Asp Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Val Lys Gly Asn Phe
1 5 10 15
Asp Val

Claims (17)

  1. GP60 수용체를 함유하는 내피, 상피 또는 중피를 횡단하는 통로를 따라 그 작용을 발휘하는 생리학적 활성제, 및 알부민과 그 단편, 항-GP60 항체와 그 단편, GP60 펩티드 단편, 및 PDI(단백질 디술피드 아이소머라제)와 그 단편으로부터 선택된 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체를 포함하는 조성물 또는 상기 활성제 및 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체의 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체가 CGMC 모티프를 내포하는 조성물 또는 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체가 알부민 또는 알부민 단편을 포함하는 조성물 또는 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체가 항-GP60 항체 또는 항-GP60 항체 단편을 포함하는 조성물 또는 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 트란스사이토시스 상승제 또는 매개체가 GP60 펩티드 단편을 포함하는 조성물 또는 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 트란스사이토시스 매개체가 GP60 펩티드 단편과 함께 알부민 또는 알부민 단편을 포함하는 조성물 또는 결합체.
  7. 제5항 또는 6항에 있어서, GP60 펩티드 단편이 SEQ ID NO. 1을 포함하는 조성물 또는 결합체.
  8. 제1항 내지 제7항중 임의의 한항에 있어서, 생리학적 활성제가 황체 형성 호르몬(LH), 융모성 성선자극 호르몬, 심방 펩티드, 인터페론, 림포킨 I, 림포킨 II, 림포킨 III, 림포킨 IV, 림포킨 V, 림포킨 VI 및 림포킨 VII, 군체 자극 인자, 성장 호르몬 방출 인자, 부신피질 자극 호르몬 방출인자, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 성장 호르몬 분비억제 호르몬, 칼시토닌, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), 트랜스퍼라제, 하이드로라제, 아이소마라제, 프로티아제, 리가제, 옥시도리덕타제, 에스터라제, 포스파타제, 신경성장인자(NGF), 모양영양인자(CNTF), 뇌-유도 영양인자(BDNF), 신경교 유도 영양인자(GDNF), 상피성장 인자(EGF), 선유아세포 성장인자(FGF), 인슐린형 성장인자, 종양괴사인자(TNF), 형질전환 성장인자(TGF), 뇌수, 엔돌핀, 고나돌리베린, 멜라노스타틴, 멜로노리베린, 소마토스타틴, 티롤리베린, 물질 P, 뉴로텐신, 부신피질자극 호르몬, 지방자극 호르몬, 멜라노트로핀, 루트로핀, 갑상선 자극 호르몬, 활체 자극 호르몬 성장 호르몬, 신경하수체 호르몬; 파라티린, 칼시토닌, 티모신, 티모포이에틴, 순환 흉선인자, 흉선액성 인자, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 가스트린, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 위 억제 폴리펩티드, 혈장관 펩티드, 모티린, 이완 호르몬, 안기오텐신, 브라디키닌, 소마토메딘, 유로가스트론, 디페록사민, 부세레린, 데스로레린, 고나도레린, 고세레린, 히스트레린, 류프로레린, 나파레린 및 트리프로레린으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 조성물 또는 결합체.
  9. 제1항 내지 8항중 임의의 한 항에 규정된 생리학적 활성제 및 트란스사이토시스 상승제를, 상기 활성제를 이용하는 치료용 약제의 제조에 사용하는 방법.
  10. 제1항 내지 8항중 임의의 한 항에 규정된 결합체를, 상기 활성제를 이용하는 치료용 약제의 제조에 사용하는 방법.
  11. 포유동물에 생리학적 활성제를 투여하는 방법에 있어서, 제1항 내지 7항중 임의의 한 항에 규정된 바와 같은 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제와 결합되거나 또는 혼합된 상기 활성제를 투여하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 트란스사이토시스 매개체 또는 상승제가, GP60 수용체를 함유하는 상피, 내피 또는 중피를 횡단하여 상기 생리학적 활성제를 운반 또는 그 통행을 강화하는, 개선된 방법.
  12. 제11항에 있어서, 투여가 맥관구조, 폐기로, 또는 복막에 시행되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 주사를 통하여 맥관구조 또는 복막에 투여되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 건조 분말 흡입을 통하여 폐기로에 투여되는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 생리학적 활성제가 제 8항에 규정된 바와 같은 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서 쉬프 염기 형성법을 이용하는 글루타르알데히드 결합, 단백질 및 카르복실산의 카르보디이미드 반응, 약물 함유 아민의 산무수물 활성화 후에 카르보디이미드 연결, 약물 함유 1차 아민을 3-(2-피리딜디티오) 프로피온에이트-N-숙신이미딜 무수물로 활성화 후 단백질의 시스테인 그룹에 결합, 염화 시아누르산을 이용하여 당알코올을 단백질에 결합 및 비스과산화를 통하여 아민과 히드록실 그룹을 결합시키는 방법으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 방법에 의하여 상기 생리학적 활성제가 상기 트란스사이토시스 매개체와 결합되는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
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