KR19990060704A - Novel AGARICUS BLAZEI IY709 Strains and Pharmacologically Active Polysaccharide Fractions Isolated therefrom - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약리학적 활성성분을 다량으로 생성하는 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP) 및 그로 부터 분리된 약리학적 활성 다당류 분획에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 항암작용, 면역증강작용 및 항산화작용을 갖는 약리학적 활성 다당류를 다량으로 생성하는 아가리쿠스 버섯의 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 균주(KCTC 0405BP) 및 이 균주로 부터 분리된 약리학적 활성이 우수한 고분자 다당류 분획에 관한 것이다.The present invention relates to a novel variant, Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP), which produces a large amount of pharmacologically active ingredient, and a pharmacologically active polysaccharide fraction isolated therefrom. More specifically, the present invention relates to Agaricus blazei IY709 strain (KCTC 0405BP), which is a novel variant of Agaricus mushroom, which produces a large amount of pharmacologically active polysaccharides having anticancer, immunopotentiating and antioxidant activity. The present invention relates to a polymer polysaccharide fraction having excellent pharmacological activity isolated from.
Description
본 발명은 항암작용, 면역증강작용 및 항산화작용 등의 약리학적 활성이 우수한 다당류 성분을 다량으로 생성하는 신규한 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 균주 및 이 균주로 부터 분리되는 약리학적 활성 다당류 분획에 관한 것이다. 더 구체적으로 설명하면, 본 발명은 항암작용, 인체내의 면역기능을 증진시켜 주는 면역증강작용 및 항산화작용 등의 약리학적 활성이 우수한 물질인 다당류를 생성하는 아가리쿠스 버섯의 신규한 변이주 및 그로 부터 분리된 약리학적 활성 고분자 다당류 분획에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Agaricus blazei IY709 strain that produces a large amount of polysaccharide components having excellent pharmacological activity such as anticancer activity, immunopotentiation activity and antioxidant activity, and a pharmacologically active polysaccharide fraction isolated from the strain. It is about. More specifically, the present invention provides a novel mutant strain of Agaricus mushrooms that produces polysaccharides, which are excellent in pharmacological activity, such as anticancer action, immune enhancing action and antioxidant action to enhance immune function in the human body, and isolated therefrom. Pharmacologically active polymer polysaccharide fractions.
최근에 담자균류들이 가지고 있는 여러 가지 약리작용이 보고됨에 따라 이에 대한 일반인들의 관심이 점차 높아지고 있다. 그중에서도 아가리쿠스 버섯은 1980 년 11 월 제 39 회 일본암학회에서 이토 박사에 의하여 항암효과가 발표된 이후에 더욱 새롭게 연구되는 버섯으로서 주성분은 항암작용, 혈압강하작용, 콜레스테롤 저하작용, 동맥경화 개선작용, 면역증강작용, 항산화작용 등의 약리학적 효과를 갖는 단백다당류로 알려지고 있으며, 이것은 다른 버섯 유래의 다당류에 비하여 단백질의 함량이 비교적 높은 것으로 확인되었다.Recently, many pharmacological actions of basidiomycetes have been reported. Among them, Agaricus mushroom is a new type of mushroom that was newly studied after the anticancer effect was announced by Dr. Ito at the 39th Japan Cancer Society in November 1980. The main ingredients are anticancer activity, blood pressure lowering effect, cholesterol lowering effect, arteriosclerosis improvement effect, It is known as a protein polysaccharide having pharmacological effects such as immuno-enhancing and antioxidant activity, it was confirmed that the content of protein is relatively higher than the polysaccharide derived from other mushrooms.
그러나 아가리쿠스 버섯은 품종과 재배 또는 배양방법 등에 따라 약리학적 활성성분이나 그의 함량에 많은 차이가 있는 것으로 확인되었으며, 따라서 목적하는 약리학적 활성성분을 다량으로 함유하는 특정의 아가리쿠스 버섯 균주를 선택하고 더 우수한 약리학적 활성성분을 생산할 수 있는 품종을 육성하는 것이 매우 바람직하다.However, agaricus mushrooms have been found to have many differences in pharmacologically active ingredients or their contents according to varieties, cultivation or culture methods, and therefore, a specific strain of agaricus mushrooms containing a large amount of the desired pharmacologically active ingredient is selected and superior. It is highly desirable to cultivate varieties capable of producing pharmacologically active ingredients.
이에 본 발명자들은 아가리쿠스 버섯 균주를 변이처리하여 우수한 약효성분을 갖는 균주를 개발하기 위하여 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 약리활성이 강한 단백다당류를 다량으로 함유하여 탁월한 항암작용, 면역증강작용 등의 약리학적 효과를 갖고 있으면서 균사체의 활력도 좋고 자실체의 모양이나 품질도 우수한 특정균주를 선별하게 되었다.Therefore, the present inventors conducted intensive studies to develop strains having excellent medicinal ingredients by mutating Agaricus mushroom strains, and as a result, they contained a large amount of protein saccharides with strong pharmacological activity, resulting in excellent anticancer activity and immune enhancing effect. Specific strains with pharmacological effects with good mycelial vitality and excellent fruiting body shape and quality were selected.
즉, 본 발명자들은 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) 버섯의 원균주를 다양한 변이제로 처리하여 수득되는 변이주들에 대하여 그들이 생성하는 유효성분의 약리학적 활성, 즉 항암작용, 면역증강작용 및 항산화작용 등을 검색하였으며, 그 결과 상기한 바와 같은 우수한 약리학적 활성성분을 다량으로 생산하는 특정한 신규의 변이주를 선별하여 수득하고 본 발명을 완성하게 되었다.That is, the present inventors have investigated the pharmacological activity of the active ingredients they produce, namely anticancer activity, immune enhancing activity and antioxidant activity, against the mutant strains obtained by treating the native strains of Agaricus blazei mushrooms with various mutants. As a result, specific novel mutants which produce a large amount of the excellent pharmacologically active ingredients as described above were selected and obtained, thus completing the present invention.
도 1 은 본 발명에 따르는 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 균사체의 현미경 사진이다.1 is a photomicrograph of the mycelium of a variant strain Agaricus blazei IY709 according to the present invention.
도 2 는 본 발명에 따르는 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체로부터 실시예 2-1) 의 방법(에탄올 침전법)에 따라 수득한 고분자 다당류 분획의 IR 스펙트럼이다.Fig. 2 is an IR spectrum of a polymer polysaccharide fraction obtained according to the method of Example 2-1) (ethanol precipitation method) from the fruiting body of the variant strain Agaricus blazei IY709 according to the present invention.
도 3 은 본 발명에 따르는 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 배양균사체로부터 실시예 2-2) 의 방법(한외여과법)에 따라 수득한 고분자 다당류의 IR 스펙트럼이다.Figure 3 is an IR spectrum of the polymer polysaccharide obtained according to the method of Example 2-2) (ultrafiltration) from the cultured mycelium of Agaricus blazei IY709, a mutant strain according to the present invention.
따라서, 본 발명은 항암작용, 면역증강작용 및 항산화작용 등의 약리학적 활성이 우수한 물질을 다량으로 생성하는 아가리쿠스 버섯의 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to Agaricus blazei IY709, a novel strain of Agaricus mushroom, which produces a large amount of a substance having excellent pharmacological activity such as anticancer activity, immune enhancing effect and antioxidant activity.
본 발명은 또한 이 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 로 부터 분리되는 약리학적 활성 고분자 다당류 분획에 관한 것이다.The present invention also relates to a pharmacologically active polymer polysaccharide fraction isolated from this novel variant, Agaricus blazei IY709.
본 발명에 따르는 아가리쿠스 버섯 균주는 브라질 등지에서 입수한 아가리쿠스 버섯 균주를 UV 변이제로 처리하여 변이시킴으로써 얻어진 변이주로서, 이 균주는 아가리쿠스 브라제이 원균주와는 상이한 균학적성질 및 이화학적 성질을 가지고 있어 원균주와는 다른 신규한 균주인 것으로 판단되었으며, 이에 따라 이 균주를 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 로 명명하고, 1997 년 11 월 14 일자로 부다페스트 조약하에서의 국제기탁물로서 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하여 KCTC 0405BP 라는 기탁번호 부여받았다.Agaricus mushroom strain according to the present invention is a mutant strain obtained by mutating the Agaricus mushroom strain obtained from Brazil, etc. with a UV mutant, the strain has a different physiological properties and physicochemical properties than the Agaricus brazei strain It was considered to be a new strain different from the strain, and therefore, the strain was named Agaricus blazei IY709, and as an international deposit under the Treaty of Budapest on November 14, 1997, Korea Institute of Science and Technology It was deposited with an affiliated genetic bank and was given a deposit number of KCTC 0405BP.
본 발명에 따라 제공되는 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP) 는 여러 가지 면에서 원균주와는 다른 특성을 나타낸다. 즉, 아가리쿠스 브라제이 원균주는 대수증식기가 배양 시작후 5 일 정도에서 시작되고 최적 pH 는 6.0 이며, 배양온도는 27℃ 에서 생장이 우수하였으며 최적 영양원으로 요구되는 탄소원은 전분 0.1%, 포도당 1.5% 이며, 질소원으로 효모추출물 0.2%에서 균사체 생육이 우수하였다. 그러나 본 발명에 따르는 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)는 대수증식기가 4 일에서 시작되며, 최적 pH 는 6.2 이고, 배양온도는 28∼30℃에서 생장이 우수하였고 최적영양원으로 요구되는 탄소원은 포도당 2% 와 전분 0.2% 첨가시에 균사체의 생육이 가장 우수하였다. 질소원의 경우는 효모추출물 0.2%, 맥아추출물 0.2% 혼합첨가시 균사체의 생육능이 우수하였다. 기타 무기염류로서는 황산마그네슘, 인산제1칼륨염과 인산제2칼륨염 등을 사용하였으며, 이들은 약 0.05%∼0.01%를 첨가 배양시에 균사체의 배양이 우수한 것으로 확인되었다.The variant strain Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) provided according to the present invention exhibits characteristics different from that of the original strains in many respects. In other words, the agaricus brazei probiotics start at about 5 days after the start of the logarithmic growth stage, the optimum pH is 6.0, the growth temperature is excellent at 27 ℃, and the carbon source required for optimal nutrition is 0.1% of starch and 1.5% of glucose. The growth of mycelia was excellent in 0.2% of yeast extract as a nitrogen source. However, a novel variant of the present invention, Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP), has a logarithmic growth stage starting at 4 days, an optimal pH of 6.2, and an excellent growth temperature at 28 to 30 ° C. The most desirable carbon source for nutrition was the growth of mycelium with 2% glucose and 0.2% starch. In the case of nitrogen source, the mycelial growth was excellent when 0.2% yeast extract and 0.2% malt extract were added. As other inorganic salts, magnesium sulfate, monopotassium phosphate salt and dipotassium phosphate salt were used, and these were confirmed to have excellent culture of the mycelium upon addition culture of about 0.05% to 0.01%.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르는 신규한 아가리쿠스 버섯 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)는 다량의 약리학적 활성 고분자 다당류 분획을 생산하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)로 부터 약리학적 활성 고분자 다당류 분획을 분리하기 위해서는 당해 기술분야에서 통상적인 방법을 이용할 수 있는데, 예를들어 변이주 IY709(KCTC 0405BP)를 재배하거나 액체배양하여 얻은 자실체 또는 균사체를 물 또는 알카리 용액으로 추출한 후, 추출물을 한외여과(ultrafil- tration)하거나, 에탄올 또는 황산암모늄염 등으로 침전시키는 등의 방법을 이용함으로써 분리할 수 있다.As described above, the novel Agaricus mushroom mutant Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) according to the present invention was found to produce large amounts of pharmacologically active polymer polysaccharide fractions. In order to separate the pharmacologically active polymer polysaccharide fraction from the mutant strain Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP), a conventional method in the art may be used, for example, mutant strain IY709 (KCTC 0405BP) may be used. The fruiting body or mycelium obtained by cultivation or liquid culture is extracted with water or alkaline solution, and the extract can be separated by ultrafiltration or by precipitation with ethanol or ammonium sulfate.
이 방법에서 자실체나 균사체를 알카리 추출하는 경우에 사용될 수 있는 알카리 용액으로는 예를들어 NaOH, NaHCO3, KOH, 우레아 등이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 NaOH 를 사용한다. 또한, 본 발명에서 고분자 다당류라함은 일반적으로 분자량 10kD 이상의 것을 의미한다.Alkali solution that can be used in the case of alkali extraction of fruiting bodies or mycelium in this method may include, for example, NaOH, NaHCO 3 , KOH, urea, preferably NaOH. In addition, in the present invention, the polymer polysaccharide generally means a molecular weight of 10 kD or more.
상기한 방법에 의해 신규한 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)로부터 분리된 고분자 다당류 분획은 이하의 실험예를 통하여 입증되는 바와 같이 우수한 약리학적 작용, 특히 항암작용, 면역증강작용 및 항산화작용을 가지고 있어 임상적으로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)로부터 상술한 바와 같은 방법으로 분리된 고분자 다당류 분획을 활성성분으로 함유하는 항암제, 면역증강제 및 항산화제 조성물을 제공함을 또 다른 목적으로 한다.The polymer polysaccharide fraction isolated from the novel mutant strain Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) by the above-described method has excellent pharmacological action, in particular anticancer action, immune enhancing action and It has antioxidant activity and can be used clinically. Accordingly, the present invention also provides an anticancer, immunopotentiating and antioxidant composition containing, as an active ingredient, the polymer polysaccharide fraction isolated from Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) as described above. It is done.
본 발명의 고분자 다당류 분획을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 환자에게 투여될 총 일일용량은 체중 1㎏ 당 10㎎ 내지 20㎎ 의 범위가 바람직하나, 특정환자에 대한 특이용량 수준은 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 본 발명의 조성물을 사용하고자 하는 질환의 종류 및 중증도에 따라 변화될 수 있다.The total daily dose to be administered to the patient in a single dose or in separate doses when administering the polymer polysaccharide fraction of the present invention for clinical purposes is preferably in the range of 10 mg to 20 mg per 1 kg of body weight, but the specific dose level for a particular patient. May vary according to the weight, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, drug mixture, and the type and severity of the disease of the present invention.
본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다.The compositions of the present invention can be administered in injectable and oral formulations as desired.
주사용 제제, 예를들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.Injectable preparations, such as sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions, can be prepared using suitable dispersing agents, wetting agents, or suspending agents according to known techniques. Pharmaceutically acceptable solvents that can be used include water, Ringer's solution and isotonic NaCl solution and sterile fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. Any non-irritating fixed oil may be used for this purpose, including mono-, diglycerides, and also fatty acids such as oleic acid are used in the preparation of injectables.
경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 고분자 다당류 분획을 슈크로즈, 락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.The solid dosage form for oral administration may be in the form of capsules, tablets, pills, powders and granules, and particularly, capsules and tablets are useful. Tablets and pills are preferably prepared with enteric agents. Solid dosage forms can be prepared by mixing the polymer polysaccharide fraction according to the invention with one or more inert diluents such as sucrose, lactose, starch and the like and carriers such as lubricants such as magnesium stearate, disintegrants, binders and the like.
본 발명은 이하의 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명되나 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.The present invention is explained in more detail by the following examples and experimental examples, but the present invention is not limited in any way by these.
실시예 1 : 변이주 아가리쿠스 브라제이(Example 1 Variation strain Agaricus braze ( Agaricus blazeiAgaricus blazei ) IY709(KCTC 0405BP)의 선별) Screening of IY709 (KCTC 0405BP)
브라질로 부터 입수한 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) 원균주를 YM (효모추출물-맥아추출물) 액체배지중에서 온도 25-30℃ 및 습도 90-100% 의 조건하에 광원의 부재하에서 7 일 내지 14 일 동안 배양하여 수득한 균사체를 배지와 함께 1000×g에서 20 분간 원심분리하여 상등액은 버리고 균사체만 모아 멸균수로 2 회 세척한 후, 다시 5000rpm에서 5 분 동안 균질화시켰다. 여기에 멸균수 50㎖를 가하여 희석한 다음 페트리디시에 10㎖ 씩 나누어 넣고 30 분전에 미리 켜 놓은 자외선등(253.7㎚)을 이용하여 39 에르그(ergs)/㎠ 의 조사량으로 자석교반기로 교반하면서 각각 1, 5, 10, 30, 60 및 120 분씩 조사하였다. 자외선을 조사한 후에 복귀돌연변이를 방지하기 위하여 10 분 이상 암소에 방치한 다음, 멸균수로 10-1, 10-2, 10-3배 희석하여 YM 고체배지가 들어 있는 페트리디시에 균일하게 도말한 다음에 30℃에서 7 일 동안 배양하였다. 이렇게 수득한 각각의 변이주를 각각 액내배양용 배지(구성: 글루코즈, 옥수수전분, 효모추출물, 맥아추출물, 인산염 및 미량의 무기염류)에서 배양한 후에 그에 의해 생산된 다당류 분획이 후술하는 실험예에서 언급된 바와 같은 실험에 의해 약리활성이 가장 우수한 것으로 판단된 균주를 선별하여 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)로 명명하였다. 수득된 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)의 균사체의 현미경 사진은 도 1 에서 보는 바와 같다. Agaricus blazei strains obtained from Brazil were grown in YM (yeast extract-malt extract) liquid medium for 7 to 14 days in the absence of a light source under conditions of temperature 25-30 ° C and humidity 90-100%. The mycelium obtained by culturing was centrifuged at 1000 × g for 20 minutes with the medium, and the supernatant was discarded, and only the mycelium was collected and washed twice with sterile water, followed by homogenization at 5000 rpm for 5 minutes. 50 ml of sterile water was added thereto, diluted, and then divided into 10 ml of petri dishes and stirred with a magnetic stirrer at an irradiation dose of 39 ergs / cm 2 using an ultraviolet lamp (253.7 nm) which had been turned on 30 minutes beforehand. Irradiation was performed at 1, 5, 10, 30, 60 and 120 minutes. After irradiating with UV light, it was left in the cow for at least 10 minutes to prevent the reverse mutation, and then diluted 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 times with sterile water and evenly spread on Petri dishes containing YM solid medium. Incubated at 30 ° C. for 7 days. Each of the mutants thus obtained was incubated in an incubation medium (constitution: glucose, corn starch, yeast extract, malt extract, phosphate, and trace inorganic salts), and the polysaccharide fraction produced thereby was mentioned in the experimental example described below. As a result, the strains determined to have the best pharmacological activity were selected and named as Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP). The micrograph of the obtained mycelium of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) is as shown in FIG.
실시예 2 : 약리활성 물질의 추출 및 분리Example 2 Extraction and Separation of Pharmacologically Active Substances
1) 에탄올 침전에 의한 다당류의 분리1) Separation of Polysaccharides by Ethanol Precipitation
아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP) 의 종균을 볏집과 쌀겨를 주재료로 하는 퇴비를 도포한 재배상자에 넣어 온도 약 25℃에서 균사를 생장시킨 후, 복토하고 온도 약 25℃ 및 습도 80-90% 의 조건하에서 버섯을 재배하여 얻은 버섯 자실체를 1×2㎝ 의 크기로 세절하여 10 배량(w/v, %)의 물을 가해 110℃에서 30 분 동안 2 회 반복 추출하고, 75㎛ 의 체로 여과한 여액을 모아 1/8 량으로 농축하였다. 침전물에 3 배량의 에탄올을 가해 24 시간 동안 방치한 다음 3200×g 에서 원심분리를 실시하였다. 침전물을 분리하여 소량의 물을 가해 녹이고 비스킹 튜브(visking tube)에 넣어 흐르는 물에서 5 일간 투석한 후, 동결건조시켜 자실체 고분자 다당류 분획을 수득하였다. 수득된 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 고분자 다당류 분획의 IR 스펙트럼은 도 2에서 보는 바와 같다. 별도로 에탄올 상등액은 농축 및 동결건조시켜 자실체 저분자 다당류 분획을 수득하였다.The seeds of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) were placed in a growing box coated with compost mainly composed of crests and rice bran, and the mycelia were grown at a temperature of about 25 ° C. Mushroom fruit body obtained by cultivating mushrooms under the condition of -90% was cut into 1 × 2cm size, and 10 times (w / v,%) of water was added and extracted twice at 110 ° C. for 30 minutes, and 75㎛ The filtrate was filtered through a sieve and concentrated to 1/8. Three times the amount of ethanol was added to the precipitate and allowed to stand for 24 hours, followed by centrifugation at 3200 × g. The precipitate was separated, dissolved in a small amount of water, dialyzed into a visking tube and dialyzed in running water for 5 days, and then lyophilized to obtain a fruiting body polymer polysaccharide fraction. IR spectrum of the fruiting polymer polysaccharide fraction of the obtained Agaricus blazei IY709 is as shown in FIG. Separately, the ethanol supernatant was concentrated and lyophilized to yield the fruiting body low molecular weight polysaccharide fraction.
또한 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)를 액체배양하여 수득한 균사체 배양물를 후술하는 방법에 의해 배양균사체 총분획, 배양균사체 고분자 다당류 분획 및 배양균사체 저분자 다당류 분획으로 분리하였다. 즉, 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)를 액체배양(글루코즈, 옥수수전분, 효모추출물, 맥아추출물 및 미량의 KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O)하여 수득한 균사체 배양물에 3 배량의 증류수를 가하고 110℃에서 30 분 동안 2 회 반복 추출하고, 3200×g 에서 원심분리하여 수득한 상등액을 동결건조시켜 배양균사체 총분획으로 하였으며, 배양균사체 다당류 분획을 얻기 위해서는 균사체 배양물을 3200×g 에서 원심분리하여 얻어진 균사체에 3 배량의 증류수를 첨가하고 110℃에서 30 분 동안 2 회 반복 추출하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 1/8 배량으로 농축한 다음 3 배량의 에탄올을 가하여 4℃에서 하루동안 방치한 후 원심분리하였다. 원심분리하여 수득한 침전물과 상등액을 자실체로부터 고분자 분획과 저분자 분획을 수득하는 전술한 바와 같은 방법과 동일한 방법에 따라 처리하여 배양균사체의 고분자 다당류 분획 및 저분자 다당류 분획을 수득하였다.In addition, the mycelium culture obtained by liquid culture of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) was separated into the total mycelial fraction, the culture mycelium polymer polysaccharide fraction, and the culture mycelium polysaccharide fraction by the method described below. That is, Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) was obtained by liquid culture (glucose, corn starch, yeast extract, malt extract and trace amounts of KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 · 7H 2 O). Three times the amount of distilled water was added to one mycelium culture, extracted twice at 110 ° C. for 30 minutes, and the supernatant obtained by centrifugation at 3200 × g was lyophilized to obtain a total culture mycelium fraction, thereby obtaining a culture mycelium polysaccharide fraction. To this end, three times the amount of distilled water was added to the mycelium obtained by centrifuging the mycelium culture at 3200 × g, extracted twice at 110 ° C. for 30 minutes, and the supernatant obtained by centrifugation was concentrated to 1/8 times, Ethanol was added and left at 4 ° C. for one day before centrifugation. The precipitate and the supernatant obtained by centrifugation were treated in the same manner as described above to obtain the polymer fraction and the low molecular weight fraction from the fruiting body, thereby obtaining the polymer polysaccharide fraction and the low molecular polysaccharide fraction of the culture mycelia.
상기와 같은 방법에 의해 수득된 분획별 수득량은, 자실체의 고분자 다당류 분획이 3.6%, 저분자 다당류 분획은 46.2% 로 나타났다. 균사체 배양물의 경우에는 총분획이 0.52%, 고분자 다당류 분획 및 저분자 다당류 분획은 각각 0.17% 및 0.32% 로 나타났다. 이러한 결과는 다음 표 1 에 요약하여 나타내었다.The yield for each fraction obtained by the above method was 3.6% for the polymer polysaccharide fraction of the fruiting body and 46.2% for the low molecular polysaccharide fraction. In the mycelial culture, the total fraction was 0.52%, the polymer polysaccharide fraction and the low molecular polysaccharide fraction were 0.17% and 0.32%, respectively. These results are summarized in Table 1 below.
2) 한외여과(ultrafiltration)에 의한 고분자 다당류 분획의 분리2) Separation of Polymer Polysaccharide Fraction by Ultrafiltration
한외여과에 의한 다당류의 분리는 균사체 배양물에 대하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 즉, 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)를 액체배양(글루코즈, 옥수수전분, 효모추출물, 맥아추출물 및 미량의 KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O)한 균사체 배양물을 3200×g 에서 원심분리하여 수득한 균사체에 2 배량의 증류수를 첨가하고 최종적으로 2 노르말이 되도록 NaOH 를 첨가하여 24 시간 동안 알카리처리하고, 아세트산을 가하여 중화시킨 후 한외여과를 실시하였다. 한외여과는 여과막의 분자량이 10kD 의 것을 장착하여 수행하였으며, 분자량 10kD 이상의 고분자 다당류만을 수득하였다. 수득한 고분자 다당류 분획에 증류수를 15,000 배량 첨가하여 염을 제거하고, 동결건조시켜 0.23% 의 수득량으로 목적하는 고분자 다당류 분획을 수득하였다. 이렇게 하여 수득한 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)의 배양균사체의 고분자 다당류 분획의 IR 스펙트럼은 도 3에서 보는 바와 같다.Isolation of polysaccharides by ultrafiltration was carried out in the following way for mycelial culture. In other words, the mycelium of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) in liquid culture (glucose, corn starch, yeast extract, malt extract and trace amounts of KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 · 7H 2 O) To the mycelium obtained by centrifugation of the culture at 3200 × g, two times the amount of distilled water was added, and finally, NaOH was added to make 2 normal, and the resultant was alkali treated for 24 hours, neutralized by addition of acetic acid, and subjected to ultrafiltration. Ultrafiltration was carried out by mounting the molecular weight of the filter membrane of 10kD, only the polymer polysaccharide having a molecular weight of 10kD or more. To the obtained polymer polysaccharide fraction, 15,000 times the amount of distilled water was added to remove the salt, and lyophilized to obtain the desired polymer polysaccharide fraction in the yield of 0.23%. The IR spectrum of the polymer polysaccharide fraction of the cultured mycelium of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) obtained in this way is shown in FIG. 3.
3) 황산암모늄 침전에 의한 고분자 다당류 분획의 분리3) Separation of Polymer Polysaccharide Fraction by Ammonium Sulfate Precipitation
아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)를 배양(글루코즈, 옥수수전분, 효모추출물, 맥아추출물 및 미량의 KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O)하여 수득한) 균사체 배양물에 3 배량의 증류수를 가하고 110℃에서 30 분 동안 2 회 반복 추출하고, 3200×g 에서 원심분리하여 수득항 상등액에 빙냉하에서 최종적으로 80% 의 농도가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 4℃에서 하루동안 방치하고, 3200×g 에서 원심분리하여 수득한 침전물을 투석막(분자량 10kD)을 이용하여 2 일간 투석하여 염을 제거한 후에 동결건조시켰다. 이와 같은 방법으로 목적하는 고분자 다당류 분획을 0.12% 의 수득량으로 수득하였다.Mycelia of Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) obtained by culturing (glucose, corn starch, yeast extract, malt extract and trace amounts of KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 · 7H 2 O) Three times of distilled water was added to the culture, and the extract was repeatedly extracted at 110 ° C. for 30 minutes, and centrifuged at 3200 × g. Ammonium sulfate was added to the supernatant obtained under ice cooling at a final concentration of 80% at 4 ° C. The precipitate obtained by standing for 1 day and centrifuged at 3200 x g was dialyzed for 2 days using a dialysis membrane (molecular weight 10 kD) to remove salt and then lyophilized. In this way the desired polymer polysaccharide fraction was obtained in an yield of 0.12%.
이하의 각각의 실험예에서 시료로는 본 발명에 따라 실시예 2-1) 에서 수득한 각각의 다당류 분획 및 동일한 방법에 의해 수득한 아가리쿠스 브라제이 원균주의 균사체 배양물의 고분자 다당류 분획을 각각 사용하였다. 또한 시료로서 고분자 및 저분자 분획의 구별없이 다당류 분획으로 표기한 것은 고분자 다당류 분획을 의미하는 것이다.In each of the following experimental examples, each of the polysaccharide fractions obtained in Example 2-1) according to the present invention and the polymer polysaccharide fractions of the mycelium culture of the mycelium culture of the strain of Agaricus braze obtained by the same method were used, respectively. In addition, as the sample, the polysaccharide fraction without distinguishing between the polymer and the low molecule fraction means a polymer polysaccharide fraction.
실험예 1 : 항암효과의 측정Experimental Example 1 Measurement of Anticancer Effect
1) 실험방법1) Experiment Method
항암효과를 측정하기 위한 이하의 실험에서 암세포로는 S-180 고형암 세포주를 사용하였다. ICR 계 마우스의 우측 서혜부에 0.1㎖(5×107세포/㎖)의 S-180 세포를 피하이식하고, 72 시간 후부터 시료를 20㎎/㎏ 농도로 1 일 1 회씩 10 일간 복강내로 투여하였다. 암세포를 이식한지 30 일째 되는 날에 마우스로부터 형성된 고형암을 적출하여 중량을 측정하였다. 고형암의 증식저지율은 생리식염수를 투여한 대조군과 비교하여 고형암 증식 저지백분율(Inhibition ratio: I.R., %)로 계산하여 나타내었다.In the following experiments for measuring anticancer effects, S-180 solid cancer cell line was used as a cancer cell. 0.1 ml (5 × 10 7 cells / ml) of S-180 cells were subcutaneously implanted in the right inguinal part of the ICR mouse, and the samples were administered intraperitoneally once a day at a concentration of 20 mg / kg for 10 days. On the 30th day after the cancer cell transplantation, the solid cancers formed from the mice were extracted and weighed. The proliferation inhibition rate of solid cancer was expressed by calculating the inhibition rate of solid cancer growth (Inhibition ratio: IR,%) compared with the control group administered with saline.
2) 실험결과2) Experiment result
상기와 같은 방법에 의해 각각의 다당류 분획의 항암활성을 측정한 결과는 다음 표 2 에 나타내었다.The results of measuring the anticancer activity of each polysaccharide fraction by the above method are shown in Table 2 below.
표 2 에서 보는 바와 같이, 아가리쿠스 브라제이 원균주 균사체로부터 분획화된 다당류는 68.4% 의 고형암 증식저지율을 나타냈으며, 본 발명에 따르는 신규한 변이주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 및 균사체로부터 분리한 각각의 분획들은 37.2%∼98.9% 의 고형암 증식저지율을 나타내고, 특히 본 발명의 변이주인 IY709 균주로부터 분리한 고분자 다당류 분획은 원균주의 다당류 분획에 비해 월등히 우수한 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 이들 결과로 부터 다당류중에서도 고분자분획에서 특히 항암활성이 높으며, 자실체와 균사체 각각으로 부터 수득한 다당류의 효과는 서로 유사함을 알 수 있었다.As shown in Table 2, polysaccharides fractionated from Agaricus braze mycelium mycelium exhibited a solid cancer growth inhibition rate of 68.4%, and from the fruiting bodies and mycelium of Agaricus blazei IY709, a novel variant according to the present invention. The separated fractions exhibited 37.2% to 98.9% solid cancer growth inhibition rate, and in particular, the polymer polysaccharide fraction isolated from the strain IY709 of the present invention was found to have an excellent anticancer activity compared to the polysaccharide fraction of the original strain. In addition, these results showed that the anti-cancer activity was particularly high in the polymer fraction among the polysaccharides, and the effects of the polysaccharides obtained from the fruiting bodies and the mycelium were similar.
실험예 2 : 항보체활성의 측정Experimental Example 2 Measurement of Anticomplement Activity
1) 실험방법1) Experiment Method
보체활성은 야마다 등의 방법[참조: Yamada, et. al.,Planta Med., 50, 163 (1984)]의 변형방법을 이용하여 측정하였으며, 보체와 헤모리신(hemolysin)에 대한 활성 역가를 측정하여 실험에 이용하였다. 시험관에 150㎕ 의 GVB2+완충액(0.15mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 1.8mM 나트륨바르비탈, 3.1mM 바르비투르산, 141mM NaCl 및 0.1% 젤라틴, pH 7.4)과 50㎕(50㎍/㎖)의 시료를 가한 다음, 100U/㎖ 로 조정된 기니아피그 보체 50㎕를 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시킨 후, GVB2+완충액을 가해 보체의 최종농도가 1 유니트/㎖ 되도록 조정하였다. 조정된 보체 혼합물을 1.0 유니트/㎖, 1.2 유니트/㎖ 및 1.6 유니트/㎖ 의 농도가 되도록 각 시험관에 분주한 후, 여기에 안티-양 헤모리신(anti-sheep hemolysn)(2MHU/㎖)과 동량의 양 적혈구(SRBC, 5×108세포)를 혼합하여 실온에서 30 분간 감작시켜 수득한 감작된 SRBC 2㎖ 씩을 가하고, GVB2+완충액으로 최종용량을 5㎖ 로 조정하여 37℃ 의 수욕상에서 60 분간 반응시켰다. 여기에 70㎕ 의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 중단시킨 다음 400×g 에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 얻고 541㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 항보체활성은 대조군 대비 총보체용혈율(50% of total complement hemolysin, TCH50, %)의 저지율(Inhibition of TCH50, ITCH50, %)로 나타내었다.Complement activity is described by Yamada et al. [Yamada, et. al., Planta Med ., 50, 163 (1984)] and the activity titers for complement and hemolysin were measured and used in the experiment. 50 μl (50 μg / ml) with 150 μl of GVB 2+ buffer (0.15 mM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 , 1.8 mM sodium barbital, 3.1 mM barbituric acid, 141 mM NaCl and 0.1% gelatin, pH 7.4) ) Was added, and then 50 µl of guinea pig complement adjusted to 100 U / ml was added and reacted at 37 DEG C for 30 minutes, and then GVB 2+ buffer was added to adjust the final concentration of the complement to 1 unit / ml. The adjusted complement mixture was dispensed into each test tube to a concentration of 1.0 units / ml, 1.2 units / ml and 1.6 units / ml, followed by anti-sheep hemolysn (2MHU / ml) and 2 ml of sensitized SRBC obtained by mixing the same amount of erythrocytes (SRBC, 5 × 10 8 cells) and sensitizing at room temperature for 30 minutes were added, and the final dose was adjusted to 5 ml with GVB 2+ buffer in a 37 ° C. water bath. The reaction was carried out for 60 minutes. 70 µl of 0.5 M EDTA was added thereto to stop the reaction, followed by centrifugation at 400 × g for 5 minutes to obtain a supernatant. The absorbance was measured at 541 nm. Anti-complement activity was expressed as inhibition rate of 50% of total complement hemolysin (TCH 50 ,%) compared to control group (Inhibition of TCH 50 , ITCH 50 ,%).
2) 실험결과2) Experiment result
상기한 방법으로 측정된 각 시료의 항보체활성은 하기 표 3 에 나타내었다.Anti-complement activity of each sample measured by the above method is shown in Table 3 below.
표 3 에서 보는 바와 같이, 아가리쿠스 브라제이 원균주의 항보체활성은 26.2% 로 나타났으며, 본 발명에 따르는 신규한 변이균주인 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 및 균사체로부터 분리한 각각의 분획들의 항보체활성은 2.7%∼43.2% 로 나타났고, 특히 고분자 다당류 분획의 항보체활성이 매우 높은 것으로 나타났다. 이들 결과로 부터, 본 발명에 따르는 변이주 IY709 의 고분자 다당류 분획은 각각 43.2% 및 34.8% 의 항보체활성을 나타내어 아가리쿠스 브라제이 원균주의 고분자 분획에 비해 훨씬 큰 항보체 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 변이주 IY709 로부터 분리한 고분자 다당류 분획이 원균주의 고분자 다당류 분획에 비해서 월등히 우수한 면역활성을 나타냄을 알 수 있다.As shown in Table 3, the anti-complement activity of the agaricus braze strain was 26.2%, and each fraction isolated from the fruiting bodies and mycelium of Agaricus blazei IY709, a novel strain according to the present invention. The anti-complement activity of these was found to be 2.7% to 43.2%, and the anti-complement activity of the polymer polysaccharide fraction was very high. From these results, it can be seen that the polymer polysaccharide fraction of the mutant strain IY709 according to the present invention showed 43.2% and 34.8% anticomplementary activity, respectively, and thus exhibited much greater anticomplement activity than the polymer fraction of Agaricus braze. It can be seen that the polymer polysaccharide fraction isolated from the mutant strain IY709 of the present invention exhibits superior immunological activity compared to the polymer polysaccharide fraction of the original strain.
실험예 3 : 용혈반형성세포수의 측정Experimental Example 3 Measurement of Hemolytic Hematopoietic Cell Count
1) 실험방법1) Experiment Method
용혈반형성세포수의 측정은 져니(Jerne)와 노르딘(Nordin)의 방법[참조:Science, 140, 405(1963)]에 따라 행하였다. ICR 마우스 5 마리를 1 군으로 하여 20㎎/㎏ 농도의 시료를 5 일간 연속해서 복강내 투여하고 5 일이 지난 다음 1×107세포/㎖ 의 SRBC 를 복강주사하여 면역시켰다. 5 일후에 마우스를 치사시키고 비장을 분리하여 빙냉 HBSS(Hank's balanced salt solution)에 넣고 분쇄하여 비장세포를 유리시키고 400×g 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 트리스 완충 염화암모늄(pH 7.3)에 부유시켜 적혈구를 용해시켰다. 다시 빙냉 HBSS 용액으로 3 회 세척한 다음 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 세포수를 측정하였다. 용혈반형성세포수를 측정하기 위해 비장세포 0.1㎖(1×108세포/㎖)와 0.1㎖ 의 10% SRBC 를 0.7% 한천용액 2㎖ 와 혼합하여 1.5% 한천 기저평판에 균일하게 분주한 후, 37℃에서 60 분간 감작시켰다. 여기에 보체로서 10% 의 기니아피그 혈청을 2.5㎖ 씩 가하여 37℃ 에서 30 분간 반응시킨 후, 용혈반형성 세포수를 8 배 확대현미경하에서 측정하였다.The hemolytic plaque cell number was measured according to the method of Jerne and Nordin ( Science 140, 405 (1963)). Five ICR mice were used as a group, and a 20 mg / kg sample was continuously intraperitoneally administered for 5 days. After 5 days, 1 × 10 7 cells / ml of SRBC was intraperitoneally immunized. After 5 days, the mice were killed and spleens were separated, put into ice-cold Hank's balanced salt solution (HBSS) and ground to release splenocytes and centrifuged at 400 × g for 5 minutes. After removing the supernatant, the red blood cells were dissolved by floating in Tris buffered ammonium chloride (pH 7.3). After washing three times with ice-cold HBSS solution, the number of cells was measured using a hemocytometer. To determine the number of hemolytic hematopoietic cells, 0.1 ml (1 × 10 8 cells / ml) of splenocytes and 0.1 ml of 10% SRBC were mixed with 2 ml of 0.7% agar solution. And sensitized at 37 ° C. for 60 minutes. After adding 2.5 ml of 10% guinea pig serum as a complement thereto and reacting at 37 ° C for 30 minutes, the hemolytic plaque cell number was measured under an 8-fold magnification microscope.
2) 실험결과2) Experiment result
아가리쿠스 브라제이 원균주 배양균사체로부터 분획화한 다당류와 신규한 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 및 배양 균사체의 고분자 다당류 분획이 마우스의 항체생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 상기한 바와 같은 방법에 따라 항원으로서 SRBC를 사용하여 실험한 결과는 하기 표 4 에 나타내었다.A method as described above to examine the effect of the polysaccharide fractionated from the agaricus braze cultured mycelium and the fruiting body of the novel variant strain Agaricus blazei IY709 and the polymer polysaccharide fraction of the cultured mycelium on the antibody production in mice The results of experiments using SRBC as an antigen are shown in Table 4 below.
상기 표 4 에 기재된 결과에서 보는 바와 같이, 아가리쿠스 브라제이 원균주 균사체로부터 분획화한 고분자 다당류 분획은 약 2.1 배, 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 고분자 다당류 분획의 경우는 약 2.7 배, 균사체 고분자 다당류 분획은 2.3 배의 항체생성 촉진효과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 원균주보다는 변이주의 다당류가 항체생성 촉진효과가 우수하며, 따라서 체내의 체액성 면역에 관여하는 효능체(effector) B 세포의 수를 증가시킴으로써 면역증강제(adjuvant)의 기능을 수행할 수 있을 것으로 생각된다.As shown in the results shown in Table 4, the polymer polysaccharide fraction fractionated from the agaricus brazei strain mycelium was about 2.1 times, and the fruiting body polysaccharide fraction of the mutant strain Agaricus blazei IY709 was about 2.7 times, The mycelia polymer polysaccharide fraction showed a 2.3-fold increase in antibody production. These results indicate that the polysaccharides of the mutant strains, rather than the original strains, have an excellent effect of promoting antibody production, and thus increase the number of effector B cells that are involved in humoral immunity in the body to function as an adjuvant. I think I can.
실험예 4 : 탐식능의 측정Experimental Example 4 Measurement of Phagocytic Activity
1) 실험방법1) Experiment Method
탐식능은 카나리(Kanari) 등의 방법[참조:Chem. Pharm. Bull., 37, 3191 (1989)]에 따라 탄소제거율(carbon clearance rate)로서 측정하였다. 시료를 20㎎/㎏ 의 농도로 ICR 마우스의 복강내에 연속 5 일간 투여하고, 24 시간 후에 마우스의 미정맥에 탄소 부유액(Perikan drawing ink 17 black 3㎖, 생리식염수 4㎖ 및 3% 젤라틴 4㎖ 의 혼합액)을 0.25㎖/마우스 씩의 양으로 주사하고 3 분, 6 분 및 9 분후에 안와정맥에서 30㎕를 채혈한 즉시 3㎖ 의 0.1% Na2CO3를 가하여 용혈시킨 후, 675㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 시료 대신에 생리식염수 0.25㎖ 씩을 동일한 방식으로 투여하였다. 탄소제거율은 아래 식에 의해 계산하였다.The phagocytic ability is described by Kanari et al. [ Chem. Pharm. Bull ., 37, 3191 (1989)], as a carbon clearance rate. Samples were administered for 5 consecutive days intraperitoneally in ICR mice at a concentration of 20 mg / kg, and after 24 hours, 3 ml of carbon suspension (Perikan drawing ink 17 black, 4 ml of physiological saline and 4 ml of 3% gelatin) 3 ml, 6 and 9 minutes later, 30 μl was collected from the orbital vein immediately, and 3 ml of 0.1% Na 2 CO 3 was added to hemolyzed and absorbed at 675 nm. Was measured. The control group was administered with 0.25 ml of saline instead of the sample in the same manner. Carbon removal rate was calculated by the following formula.
상기 계산식에서 t1은 초기시간(initial time, 분)을 의미하며, OD1은 t1에서의 OD 값을 의미하고, OD2는 t2에서의 OD 값을 의미한다.In the above formula, t 1 means an initial time (minute), OD 1 means an OD value at t 1 , and OD 2 means an OD value at t 2 .
2) 실험결과2) Experiment result
본 발명에 따르는 신규한 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 및 배양균사체의 고분자 다당류 분획이 대식세포에 미치는 영향은 상기한 바와 같은 방법에 따라 탄소제거율(t1/2)로서 측정하여 다음 표 5 에 나타내었다.The effect of the polymer polysaccharide fraction of the fruiting body and culture mycelium of the novel variant strain Agaricus blazei IY709 according to the present invention on macrophages was measured as carbon removal rate (t 1/2 ) according to the method described above. Table 5 shows.
상기 표 5 에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 시료 대신에 생리식염수를 투여한 대조군에서는 10.6 분, 변이주의 자실체 및 균사체의 고분자 다당류 분획 처리군에서는 각각 8.8 분 및 8.9 분으로 나타났으며, 원균주의 균사체 고분자 다당류 분획 처리군에서는 8.0 분으로 나타났다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 신규한 변이주 IY709 로부터 분리한 고분자 다당류 분획은 대조군과 비교하여 빠른 탄소 입자의 제거능을 보임으로서 대식세포의 탐식능을 증진시킴을 알 수 있었다.As can be seen from the results shown in Table 5, the control group administered physiological saline instead of the sample was found to be 10.6 minutes, 8.8 minutes and 8.9 minutes in the polysaccharide fraction treatment group of the fruiting body and mycelium of the mutant strain, respectively. In the mycelium polymer polysaccharide fraction treatment group, it was 8.0 minutes. From these results, it can be seen that the polymer polysaccharide fraction isolated from the novel mutant strain IY709 of the present invention exhibited a fast removal of carbon particles compared to the control group, thereby enhancing the phagocytic activity of macrophages.
실험예 5 : 지질과산화 억제능 측정Experimental Example 5 Measurement of Lipid Peroxidation Inhibition
1) 실험방법1) Experiment Method
(1) 간 균질물의 분리(1) Separation of Liver Homogenates
마이크로좀은 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 펜토바르비탈 45㎎/㎏을 복강내로 투여하여 마취시킨 흰쥐를 개복하여 50㎖ 용 주사기로 50mM 트리스-Cl 완충액(pH 7.4) 30㎖ 를 문맥에서 하대정맥으로 혈액이 흘러나오도록 관류를 행하였다. 이후 간을 적출하여 50mM 트리스-Cl 과 150mM KCl 이 함유된 완충액(pH 7.4)으로 세척하고 잘게 썰어 호모게나이저(homogenizer; PolytroneR, PT 10/35, 스위스연방)를 이용하여 빙냉하에서 균질화를 실시하였다. 수득된 균질화물을 8,000×g 에서 20 분간 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 상등액은 105,000×g 에서 60 분 동안 초원심분리를 실시한 후, 침전부분을 50mM 트리스-Cl 과 150mM KCl 이 함유된 완충액(pH 7.4)으로 현탁시켜 단백질의 농도가 20㎎/㎖ 되도록 조정하였다. 분리된 마이크로좀은 -70℃ 에 보존하면서 실험목적에 따라 사용하였다.Microsomes were obtained by the following method. Anesthetized rats were administered intraperitoneally with 45 mg / kg of pentobarbital, and 30 ml of 50 mM Tris-Cl buffer (pH 7.4) was flowed into the inferior vena cava in a portal vein with a 50 ml syringe. The liver was then extracted, washed with 50 mM Tris-Cl and 150 mM KCl buffer (pH 7.4), and chopped to homogenize under ice-cooling using a homogenizer (Polytrone R , PT 10/35, Switzerland). It was. The homogenate obtained was centrifuged at 8,000 g for 20 minutes to obtain a supernatant. After the supernatant was subjected to ultracentrifugation for 60 minutes at 105,000 × g, the precipitate was suspended in buffer (pH 7.4) containing 50 mM Tris-Cl and 150 mM KCl to adjust the protein concentration to 20 mg / ml. The separated microsomes were used according to the experimental purpose while preserving at -70 ℃.
(2) 시험관 내에서의 지질과산화 유발 및 측정(2) Induction and Measurement of Lipid Peroxidation in Vitro
마이크로좀을 이용한 시험관내 지질과산화 반응의 유도는 키조(Kiso) 등의 방법[참고:Planta Med., 50, 298-303(1984)]을 약간 변형한 방법에 따라 후술하는 바와 같이 실시하였다. 즉, 아스코르베이트와 Fe2+첨가에 의한 비효소적 지질과산화 유발의 경우는 37.2mM 의 트리스-Cl/167mM KCl(pH 8.0), 0.2mM 의 아스코르베이트, 10μM 의 FeSO4, 물에 용해시킨 시료(최종농도 1㎎/㎖) 및 상기한 바와 같이 제조된 마이크로좀(2㎎/㎖)을 첨가하여 최종반응액이 1㎖ 가 되게 조정한 후, 37℃에서 20 분간 반응시켰다. 효소적 지질과산화 유발의 경우는 37.2mM 의 트리스-Cl/167mM KCl(pH 8.0), 1mM 의 ADP(adenosine 5-diphosphate), 0.2mM 의 NADPH(β-니코틴아미드 아데닌디뉴클레오타이드 포스페이트, 환원형), 10μM 의 FeCl3, 물에 용해시킨 시료(최종농도 1㎎/㎖) 및 상기한 바와 같이 제조된 마이크로좀(2㎎/㎖)을 첨가하여 최종반응액이 1㎖ 가 되게 조정한 후, 37℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 각 경우에 대조군에는 시료 대신에 물을 첨가하였다. 반응이 완료된 후, 지질과산화 정도는 리(Lee) 등의 방법[참고:Kor. J. Pharmacogn., 27, 159(1996)]을 이용하여 생성된 말론디알데히드(MDA)의 양을 측정하였다. 표준물질로 1,1,3,3-테트라메톡시프로판(TMP)을 이용하여 시료내의 MDA 의 양을 정량하였으며, 저해율은 다음 식에 의하여 계산하였다.Induction of in vitro lipid peroxidation reaction using microsomes was carried out as described below according to a method slightly modified by Kiso et al. ( Planta Med ., 50, 298-303 (1984)). In other words, non-enzymatic lipid peroxidation induced by addition of ascorbate and Fe 2+ was dissolved in 37.2 mM Tris-Cl / 167 mM KCl (pH 8.0), 0.2 mM Ascorbate, 10 μM FeSO 4 , and water. The sample (final concentration 1 mg / ml) and the microsome (2 mg / ml) prepared as described above were added to adjust the final reaction solution to 1 ml, followed by reaction at 37 ° C. for 20 minutes. For enzymatic lipid peroxidation induction, 37.2 mM Tris-Cl / 167 mM KCl (pH 8.0), 1 mM ADP (adenosine 5-diphosphate), 0.2 mM NADPH (β-nicotinamide adeninedinucleotide phosphate, reduced form), The final reaction solution was adjusted to 1 ml by adding 10 μM of FeCl 3 , a sample dissolved in water (final concentration 1 mg / ml), and microsomes prepared as described above (2 mg / ml), followed by 37 ° C. The reaction was carried out for 20 minutes at. In each case control was added water instead of sample. After the reaction was completed, the degree of lipid peroxidation was measured by Lee et al . [ Kor. J. Pharmacogn. , 27, 159 (1996)] was used to determine the amount of malondialdehyde (MDA) produced. The amount of MDA in the sample was quantified using 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) as a standard, and the inhibition rate was calculated by the following equation.
2) 실험결과2) Experiment result
상술한 방법에 따라 아가리쿠스 브라제이 원균주 균사체로 부터 분획화한 다당류와 신규 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709 의 자실체 및 배양균사체의 분획물들의 지질과산화 억제활성을 조사하기 위하여 시험관내에서 간 마이크로좀에 시료를 가한 후, 생성된 MDA 의 양을 측정한 결과는 표 6 에 기재하였다.Liver microsomes in vitro to investigate the lipid peroxidation inhibitory activity of the polysaccharides fractionated from Agaricus braze mycobacterial mycelium and the fractions of the fruiting bodies and culture mycelium of the new variant strain Agaricus blazei IY709 according to the above-described method. After adding the sample to the sample, the result of measuring the amount of MDA produced is shown in Table 6.
표 6 에 기재된 바로부터 알 수 있는 바와 같이, 지질과산화 유발물질로 아스코르베이트와 Fe2+를 사용한 경우에 대조군은 ㎖ 당 38.9nM 의 MDA 를 생성시켰으며, 고분자 및 저분자 다당류 분획들에서 대부분 지질과산화 억제능을 나타내었다. 특히 본 발명에 따른 변이주의 자실체 고분자 다당류 분획은 5.2nM/㎖ 의 MDA 를 생성시켜 가장 높은 지질과산화 억제효과를 나타내었다. 양성 대조물질로 사용한 BHT 는 2.8nM/㎖ 로 나타났다. 한편, 효소적 지질과산화 유발방법인 ADP/NADPH/Fe3+를 사용한 경우는 자실체 고분자 다당류 분획과 균사체 고분자 다당류 분획에서 각각 ㎖ 당 9.5nM 과 7.4nM 의 MDA 를 생성시켜 가장 우수한 지질과산화 억제효과를 나타내었다.As can be seen from Table 6, when ascorbate and Fe 2+ were used as lipid peroxidation agents, the control produced 38.9 nM MDA per ml, with most lipids in the polymer and low molecular polysaccharide fractions. Peroxidation inhibitory activity was shown. In particular, the fruiting body polysaccharide fraction of the mutant strain according to the present invention produced 5.2 nM / ㎖ MDA showed the highest lipid peroxidation inhibitory effect. The BHT used as a positive control was found to be 2.8 nM / ml. On the other hand, in the case of using ADP / NADPH / Fe 3+ which is a method of enzymatic lipid peroxidation, the fruiting polymer polysaccharide fraction and the mycelium polymer polysaccharide fraction produced 9.5 nM and 7.4 nM MDA per ml, respectively, to provide the best lipid peroxidation inhibition effect. Indicated.
상기의 실험결과에 의해 신규한 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP) 버섯 자실체와 균사체로 부터 분리한 다당류 분획, 특히 고분자 다당류 분획은 효소적 또는 비효소적인 지질과산화 유발에 대한 보호효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 생체내에서는 정상적 또는 외부의 물리적 자극이나 독성물질의 생체내 대사과정중에 생성된 활성화 산소유리기들이 래디칼, 과산화물, 알데히드, 에폭사이드 등의 다양한 활성 종을 발생시키고, 이들은 DNA, RNA, 단백질, 세포 및 세포소기관의 막구조를 형성하는 불포화 지방산의 구조를 와해시켜 세포막 또는 세포구조에 손상을 줌으로서 다양한 질병을 유발하는 것으로 알려졌다. 이와같이 본 발명에 따른 신규한 변이주 아가리쿠스 브라제이(Agaricus blazei) IY709(KCTC 0405BP)의 자실체 및 배양균사체로 부터 분리한 고분자 다당류 분획이 나타내는 지질과산화 효과는 이러한 고분자 다당류 분획이 다양한 질병의 치료 및 예방에 기여할 수 있는 물질로 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있음을 입증하는 것이다.According to the above experimental results, a novel mutant strain, Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP), a polysaccharide fraction, especially a polymer polysaccharide fraction, isolated from mushroom fruiting bodies and mycelium, has a protective effect against enzymatic or non-enzymatic lipid peroxidation. It was confirmed to represent. In vivo, activated oxygen free radicals generated during normal or external physical stimuli or in vivo metabolism of toxic substances generate various active species such as radicals, peroxides, aldehydes, and epoxides. It is known to cause various diseases by disrupting the structure of unsaturated fatty acids that form the membrane structure of organelles and damaging the cell membrane or cell structure. As described above, the lipid peroxidation effect of the polysaccharide fraction isolated from the fruiting bodies and culture mycelium of the novel variant strain Agaricus blazei IY709 (KCTC 0405BP) according to the present invention is such that the polymer polysaccharide fraction is used for the treatment and prevention of various diseases. It proves that it has the potential to be used as a contributing material.
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