KR19990054645A - Method for preparing non-hepatitis virus surface antigen protein and non-hepatitis vaccine comprising the same - Google Patents

Method for preparing non-hepatitis virus surface antigen protein and non-hepatitis vaccine comprising the same Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg) 단백질을 포유동물 세포에서 발현시키고, 이를 이용하여 B형 간염 백신을 개발하기 위한 것이다. 즉, HBsAg 의 preS1, preS2 및 S 부분을 코딩하는 HBsAg 유전자가 CMV 프로모터와The present invention is to express a hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein in mammalian cells, and to develop a hepatitis B vaccine using the same. That is, the HBsAg gene encoding the preS1, preS2, and S portions of HBsAg is associated with the CMV promoter.

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg) 단백질을 포유동물 세포소성장 호르몬 폴리아데닐레이션 유전자 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 본 발명의 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터를 형질도입시킨 포유동물 세포주를 배양하여 얻은 재조합 HBsAg 단백질은 마우스를 이용한 동물실험 결과 면역 반응을 유도할 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명을 이용하면 현재 사용 중인 B형 간염 백신에서 지적되고 있는 문제점들을 개선한 B형 간염 백신의 개발이 가능하게 될 것이다.The present invention provides a mammalian cell line transduced with an HBsAg expression vector for a mammalian cell of the present invention, wherein the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein is inserted between a mammalian cell growth hormone polyadenylation gene. Recombinant HBsAg protein obtained by culturing was confirmed to be able to induce an immune response in animal experiments using mice. Therefore, the use of the present invention will enable the development of a hepatitis B vaccine that improves the problems pointed out in the current hepatitis B vaccine.

Description

비형 간염 바이러스 표면항원 단백질의 제조 방법 및 이를 포함하는 비형 간염 백신Method for preparing non-hepatitis virus surface antigen protein and non-hepatitis vaccine comprising the same

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg) 단백질을 포유동물 세포에서 발현시키는 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포유동물 세포에서 HBsAg를 발현할 수 있도록 고안된 벡터, 이 벡터가 형질도입된 포유동물 세포주, 이 세포주를 배양하여 HBsAg 단백질을 제조하는 방법, 그리고 이와 같이 포유동물 세포로부터 얻은 재조합 HBsAg 단백질을 포함하는 B형 간염 백신에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for expressing hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein in mammalian cells, and more particularly, a vector designed to express HBsAg in mammalian cells, a mammal transfected with the vector A cell line, a method of culturing the cell line to produce an HBsAg protein, and a hepatitis B vaccine comprising a recombinant HBsAg protein obtained from a mammalian cell as described above.

B형 간염 바이러스는 인간에게 감염되어 급성 및 만성 간염을 일으키는 병원체로, 간세포에서의 발현 과정을 통해 간세포를 괴사시키고 간암으로까지 발전시키는 치명적인 바이러스이다. 통계자료에 따르면 전세계적으로 2억 5천만 내지 3억 명에 이르는 B형 간염 바이러스 감염자가 존재하며 특히 전체 감염자의 75 %가 아시아권에 집중되어 있어(Mabell L. Halliday 등, An efficacy trial of a mammalian cell-derived recombinant DNA Hepatitis B vaccine in infants born to mothers positive for HBsAg, in Shanghai, China,International Journal of Epidemiology, 21:564 (1992)), 우리 나라의 경우에도 그 심각성이 강조되고 있다. 특히, 이들 감염자 자체가 본 바이러스의 전파를 매개할 수 있는 전염성을 가진 만성 보균자라는 데 문제가 확대되고 있다. 그럼에도 불구하고 아직까지 B형 간염에 대한 확실한 치료법은 개발되어 있지 않고, 현재로서는 바이러스 감염 이전에 예방하는 것만이 유일한 대응책으로 알려져 있다. 이에 따라, B형 간염 바이러스에 대한 보다 효과적인 백신의 필요성이 절실히 요구되고 있다.Hepatitis B virus is a pathogen that infects humans and causes acute and chronic hepatitis. It is a deadly virus that causes necrosis of liver cells and develops into liver cancer through the expression process in liver cells. Statistics show that there are between 250 and 300 million people with hepatitis B virus worldwide, with 75 percent of all infected in Asia (Mabell L. Halliday et al., An efficacy trial of a mammalian). Cell-derived recombinant DNA Hepatitis B vaccine in infants born to mothers positive for HBsAg, in Shanghai, China, International Journal of Epidemiology, 21: 564 (1992)). In particular, the problem is that these infected people themselves are chronic carriers of infectious diseases that can mediate the spread of the virus. Nevertheless, no definitive treatment has been developed for hepatitis B. At present, the only countermeasure is to prevent it before viral infection. Accordingly, there is an urgent need for a more effective vaccine against hepatitis B virus.

B형 간염 바이러스는 부분적으로 상보적인 염기서열을 가진 DNA 바이러스이며 감염자의 혈액이나 체액에 의한 접촉에 의해, 그리고 보균자인 산모로부터 신생아에게로 수직 감염되는 것으로 알려져 있다. B형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈중에서 발견되는 HBsAg은 B형 간염 바이러스의 표면 항원을 구성하는 단백질로서 감염된 간세포에 의해 과량으로 생성된다. 이 단백질은 바이러스의 유전자를 갖고 있지 않아 병원성이 없으므로 항원-항체 반응을 일으킬 수 있는 효과적인 물질로 생각되고 있다. 실제로 이 HBsAg에 대한 항체는 바이러스의 제거와 감염 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(David R. Milich, T- and B-cell recognition of Hepatitis B viral antigens,Immunology Today, 9:3807 (1988)).Hepatitis B virus is a DNA virus with a partially complementary sequence and is known to be vertically infected by newborns by contact with infected blood or body fluids and from mothers who are carriers. HBsAg, found in the blood of a patient infected with hepatitis B virus, is a protein constituting the surface antigen of hepatitis B virus and is excessively produced by infected hepatocytes. Since this protein does not contain a viral gene and is not pathogenic, it is thought to be an effective substance that can cause an antigen-antibody reaction. Indeed, these antibodies against HBsAg are known to be effective in removing viruses and preventing infection (David R. Milich, T- and B-cell recognition of Hepatitis B viral antigens, Immunology Today, 9: 3807 (1988)).

HBsAg은 동일한 아미노산 말단을 갖고 각기 다른 전사 시작 신호를 갖는 세 종류의 단백질로 구성되어 있는데, 각각 preS1 + preS2 + S, preS2 + S, S 단백질로 명명되어 있다. 이들은 혈중에서 지름 약 22 nm의 구형 입자 또는 필라멘트 구조를 이루며 응집된 상태로 존재한다(Darell L. Peterson, The Structure of Hepatitis B surface antigen and its antigenic sites,Bioassay, 6:258 (1987)).HBsAg consists of three proteins with the same amino acid termini and different transcription start signals, which are named preS1 + preS2 + S, preS2 + S, and S proteins, respectively. They exist in the blood in aggregates, forming spherical particles or filamentous structures of about 22 nm in diameter (Darell L. Peterson, The Structure of Hepatitis B surface antigen and its antigenic sites, Bioassay, 6: 258 (1987)).

B형 간염 백신을 제조하기 위한 원료로서의 HBsAg은 만성 간염 환자의 혈중에서 분리하거나 효모에서 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조하고 있다(Subrat K. Panda 등, Comparative evaluation of the immunogenicity of yeast-derived(recombinant) and plasma-derived Hepatitis B vaccine in infants,Journal of Medical Virology, 35:297 (1991)). 이들 두가지 방법에 의해 얻어진 HBsAg을 원료로 한 백신은 그 역가가 충분히 인정되지만 몇 가지 문제점들이 지적되고 있다. 첫째는, 백신 접종 이후에도 항원-항체 반응이 일어나지 않는 비반응 사례가 20 % 정도 보고되고 있다는 것이다(Mabell L. Halliday 등, An efficacy trial of a mammalian cell-derived recombinant DNA Hepatitis B vaccine in infants born to mothers positive for HBsAg, in Shanghai, China,International Journal of Epidemiology, 21:564 (1992)). 이와 관련하여, 혈장 유래 HBsAg이나 효모 유래 재조합 HBsAg 단백질의 경우 모두, 위에서 언급한 세 종류의 단백질 중 preS 부분이 없는 S 단백질로 되어 있다는 것이 지적되고 있다. 최근 논문들에 의하면 preS 부분에 바이러스를 중화시킬 수 있는 중요한 에피토프 및 바이러스의 숙주세포로 침입하는데 필요한 결합부위가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 점을 고려하여, preS 부분을 백신으로 개발하고자 하는 집중적인 연구가 이루어지고 있다(Thomas R. Cupps 등,In vitroT cell immune response to the preS2 antigen of the Hepatitis B virus envelope protein in preS2+S vaccine recipients,Journal of Immunology, 151:3353 (1993)). 둘째, 혈장 유래 HBsAg는 인체에서 분리하는 것이므로 병원성 물질이나 핵산 등에 의한 오염이 있을 수 있어, 이에 따른 분리와 정제의 어려움이 지적되고 있다. 셋째, 재조합 단백질의 경우에는 단백질의 구조를 형성하는 당결합의 여부 또는 그 정도의 차이가 중요한 문제로 지적되는데, 당단백질을 만들 수 없는 박테리아라든가, 고등 포유동물 세포와는 다른 대사 기전을 갖는 효모 등 하등 진핵생물을 숙주로 하여 제조된 HBsAg은 인체에서 생성되는 HBsAg과는 다른 구조를 갖게 된다는 중대한 문제가 있다.HBsAg, a raw material for the production of hepatitis B vaccine, has been isolated from the blood of chronic hepatitis patients or produced by genetic recombination in yeast (Subrat K. Panda et al., Comparative evaluation of the immunogenicity of yeast-derived (recombinant)). and plasma-derived Hepatitis B vaccine in infants, Journal of Medical Virology, 35: 297 (1991)). Although vaccines based on HBsAg obtained by these two methods are sufficiently recognized for their titers, some problems are pointed out. First, about 20% of cases of non-responsiveness have not been reported after vaccination (Mabell L. Halliday et al., An efficacy trial of a mammalian cell-derived recombinant DNA Hepatitis B vaccine in infants born to mothers). positive for HBsAg, in Shanghai, China, International Journal of Epidemiology, 21: 564 (1992). In this regard, it has been pointed out that in the case of the plasma-derived HBsAg or yeast-derived recombinant HBsAg protein, all of the above-mentioned three proteins are S proteins without the preS portion. Recent papers have revealed that the preS region contains important epitopes that can neutralize the virus and the binding sites necessary to invade the host cell of the virus. In light of this, intensive studies have been conducted to develop preS into vaccines (Thomas R. Cupps et al., In vitro T cell immune response to the preS2 antigen of the Hepatitis B virus envelope protein in preS2 + S vaccine). recipients, Journal of Immunology, 151: 3353 (1993)). Second, since plasma-derived HBsAg is isolated from the human body, there may be contamination by pathogenic substances or nucleic acids, and thus the difficulty of separation and purification is pointed out. Third, in the case of recombinant proteins, whether or not the extent of the glyco bonds that form the structure of the protein is pointed out as an important problem, such as bacteria that can not produce glycoproteins, or yeast that has a different metabolic mechanism than higher mammalian cells There is a significant problem that HBsAg prepared using lower eukaryotes as a host has a different structure from HBsAg produced in the human body.

이처럼, 현재 사용되고 있는 B형 간염 백신의 문제점들을 보완하기 위하여 고등 포유동물 세포에서 HBsAg을 발현시키고자 하는 연구가 계속되어 왔으나(Marie-Louise Michel 등, Expression of amplified Hepatitis B virus surface antigen gene in chinese hamster ovary cells,Bio/technology, 3:561 (1985); F. Tron 등, Immunological properties of a recombinant Hepatitis B vaccine produced in mammalian cells and containing the S and preS2 sequences,Progress in Hepatitis B virus, 227(1990)), 위에서 언급한 바와 같이 preS1 및 preS2 부분을 포함하여 면역원성을 높인 HBsAg 단백질을 효과적으로 얻는 성과는 보여주지 못하고 있다.As such, studies to express HBsAg in higher mammalian cells have been continued to supplement the problems of the currently used hepatitis B vaccine (Marie-Louise Michel et al., Expression of amplified Hepatitis B virus surface antigen gene in chinese hamster ovary cells, Bio / technology, 3: 561 (1985); F. Tron et al., Immunological properties of a recombinant Hepatitis B vaccine produced in mammalian cells and containing the S and preS2 sequences, Progress in Hepatitis B virus, 227 (1990)) As mentioned above, it has not been shown to effectively obtain HBsAg protein with high immunogenicity, including preS1 and preS2 moieties.

이상과 같은 점을 고려할 때, 본 발명의 목적은 HBsAg 유전자를 포함하는 벡터를 형질도입시킨 포유동물 세포주를 이용함으로써, 혈장 유래 HBsAg 및 효모에서 얻는 재조합 HBsAg가 갖는 단점을 보완하여 면역 유발능이 우수한 재조합 HBsAg 단백질을 생산하여 좀더 효과적인 백신의 제조에 이를 이용하기 위한 것이다.In view of the above, an object of the present invention is to use a mammalian cell line transduced with a vector containing the HBsAg gene, thereby compensating for the disadvantages of recombinant HBsAg obtained from plasma-derived HBsAg and yeast and having excellent immunogenic ability. It is to produce HBsAg protein and use it to make more effective vaccines.

도 1은 본 발명의 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터 CMV4U의 제조방법을 모식적으로 나타낸 도면,1 is a view schematically showing a method for producing a HBsAg expression vector CMV4U for mammalian cells of the present invention;

도 2는 본 발명에 따라 제조된 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터 CMV4U의 구조를 보여주는 모식도,Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of the HBsAg expression vector CMV4U for mammalian cells prepared according to the present invention,

도 3은 본 발명의 포유동물 세포주 1B3의 배양 상등액으로부터 분리 정제된 단백질 분획의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 사진,Figure 3 is a photograph showing the SDS-PAGE results of the purified protein fraction separated from the culture supernatant of the mammalian cell line 1B3 of the present invention,

도 4는 본 발명의 포유동물 세포주 1B3의 배양 상등액으로부터 분리 정제된 HBsAg 단백질의 전자현미경 사진(X100,000),Figure 4 is an electron micrograph (X100,000) of purified HBsAg protein isolated from the culture supernatant of the mammalian cell line 1B3 of the present invention,

도 5는 본 발명에 따라 제조된 재조합 HBsAg 단백질의 면역 유발능을 보여주는 그래프로, 도 5a, 5b 및 5c는 각각 HBsAg의 1 차 투여, 2 차 투여 및 3 차 투여 후 실험군과 대조군 마우스에서 항원항체반응의 정도를 보여주는 그래프.Figure 5 is a graph showing the immunogenic ability of the recombinant HBsAg protein prepared according to the present invention, Figures 5a, 5b and 5c are antigen antibodies in experimental and control mice after the first, second and third administration of HBsAg, respectively Graph showing the degree of response.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)의 preS1, preS2 및 S 부분을 코딩하는 HBsAg 유전자가 CMV 프로모터와 소성장 호르몬 폴리아데닐레이션 유전자 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터, 이 벡터를 형질도입시킨 포유동물 세포주, 이 포유동물 세포주를 배양하고 그 상등액을 분리 정제하여 preS1, preS2 및 S 부분을 포함하는 HBsAg 단백질을 제조하는 방법 및 이와 같이 제조된 HBsAg 단백질을 포함하는 B형 간염 백신을 제공한다.In order to achieve the above object, in the present invention, the HBsAg gene encoding the preS1, preS2 and S portion of the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) is inserted between the CMV promoter and the ectopic hormone polyadenylation gene HBsAg expression vector for mammalian cells, a mammalian cell line transduced with the vector, a method for producing HBsAg protein comprising preS1, preS2 and S parts by culturing the mammalian cell line and separating and purifying the supernatant thereof Provided is a hepatitis B vaccine comprising the HBsAg protein.

본 발명은 유전자 재조합 기술을 바탕으로 효모보다 사람의 세포에 더 가까운 포유동물 세포를 이용하여 preS 부분을 포함하는 HBsAg을 생산함으로써, 종래 기술의 문제점들을 해결하여 면역 효과를 높일 수 있는 효과적인 B형 간염 백신을 제조할 수 있도록 하기 위한 것이다.The present invention produces an HBsAg containing a preS moiety using mammalian cells closer to human cells than yeast based on genetic recombination technology, thereby solving the problems of the prior art and effectively increasing the immune effect of hepatitis B. It is intended to be able to produce a vaccine.

즉, 본 발명의 포유동물 발현용 벡터는 HBsAg 유전자를 포유동물 세포에서 발현할 수 있도록 고안된 Rc/CMV 플라스미드에 삽입한 것으로, 삽입된 유전자가 포유동물 세포에서 발현할 수 있게 하는 CMV 프로모터와, 전사된 mRNA의 안정성을 높이기 위한 소성장호르몬 폴리아데닐레이션 유전자가 있고, 이 사이에 삽입된 HBsAg 유전자에는 preS1, preS2, S 부분을 코딩하는 유전자가 포함된다. 이와 같은 본 발명의 벡터에는, 벡터를 가진 세포주만을 선택할 수 있게 해주는 Neor유전자를 포함시켜 제네티신(Geneticin)으로 선별이 가능하도록 하고, 삽입된 유전자의 증폭을 위해 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 유전자를 포함시키는 것이 바람직하다.That is, the mammalian expression vector of the present invention is inserted into the Rc / CMV plasmid designed to express the HBsAg gene in mammalian cells, and the CMV promoter and transcription that allow the inserted gene to be expressed in mammalian cells. There is a plastic growth hormone polyadenylation gene for enhancing the stability of the mRNA, and the HBsAg gene inserted therebetween includes genes encoding preS1, preS2, and S portions. As such, the vector of the present invention includes a Neo r gene, which allows selection of only a cell line having a vector, to be selected by Geneticin, and dihydrofolate reductase for amplification of the inserted gene. It is preferred to include the (DHFR) gene.

이와 같이 제조된 본 발명의 벡터를 포유동물 세포인 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 형질도입하고, 세포주의 선택과 증폭을 거쳐 HBsAg을 많이 생산하는 본 발명의 포유동물 세포주를 얻을 수 있다.The mammal of the present invention produces a large amount of HBsAg by transducing the vector of the present invention thus prepared by electroporation into CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, which are mammalian cells. Cell lines can be obtained.

또한, 상기 본 발명의 벡터를 포함하는 포유동물 세포주를 배양하여 얻은 배양 상등액을 농축, 정제하는 본 발명의 방법에 의하면, preS1, preS2 및 S의 단백질과 그들의 당단백질로 이루어진 HBsAg 단백질을 제조할 수 있다.In addition, according to the method of the present invention for concentrating and purifying the culture supernatant obtained by culturing the mammalian cell line comprising the vector of the present invention, HBsAg protein consisting of the proteins of preS1, preS2 and S and their glycoproteins can be prepared. have.

이와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 HBsAg 단백질은 B형 간염 바이러스로 인하여 인체에 형성되는 자연적인 HBsAg과 유사하고, 동물실험 결과 면역반응을 유발하여 항 HBsAg 항체를 생성시킬 수 있음이 확인되어, 보다 면역 유발능이 뛰어난 B형 간염 백신 제조에 사용할 수 있게 되었다.As such, the recombinant HBsAg protein prepared according to the method of the present invention is similar to the natural HBsAg formed in the human body due to the hepatitis B virus, and animal experiments confirmed that it can generate an anti-HBsAg antibody by inducing an immune response. It became possible to use for the production of the hepatitis B vaccine which was more excellent in immunogenic ability.

이하, 본 발명을 단계 별로 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail step by step.

1. 포유동물 세포 배양1. Mammalian Cell Culture

본 발명에서는 HBsAg을 발현시키기 위한 포유동물 세포로서 차이니즈 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포를 사용한다. 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자가 없는 DHFR-세포주를 HT(Hypoxanthine-Thymidine)배지에서 배양하여 사용한다.In the present invention, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are used as mammalian cells for expressing HBsAg. The DHFR - cell line without the dihydrofolate reductase (DHFR) gene is used in culture in a Hypoxanthine-Thymidine (HT) medium.

2. HBsAg을 발현시키기 위한 벡터 CMV4U의 제조2. Preparation of Vector CMV4U to Express HBsAg

HBsAg 유전자는 한국인에게서 가장 많이 발견되는 B형 간염 바이러스의 서브타입인 adr형(Yoshitaka Ono 등, The complete nucleotide sequence of the cloned Hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw,Nucleic Acids Research, 11:1747 (1983); 김 연수, 강 현삼, Cloning and expression of Hepatitis B virus surface antigen gene,Korean Biochem. J., 17:70 (1984))의 HBsAg을 포함하고 있는 pHBS1 플라스미드로부터 얻을 수 있다.The HBsAg gene is a complete subtype of hepatitis B virus found in Koreans (Yoshitaka Ono et al., The complete nucleotide sequence of the cloned Hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw, Nucleic Acids Research, 11: 1747 (1983). Kim Yeon-su, Kang Hyun-sam, Cloning and expression of Hepatitis B virus surface antigen gene, Korean Biochem. J., 17: 70 (1984)) can be obtained from the pHBS1 plasmid containing HBsAg.

pHBS1 플라스미드에서 preS1, preS2, S 및 3'-UTR 부분을 포함하는 1.76 Kb의 절편을 제한효소HindIII 및BamHI로 잘라내고 pcDNAI/Neo 플라스미드에 삽입하여 pcDNA 플라스미드를 제조한다. HBsAg의 절편이 삽입되었음을 확인한 후 pcDNA 플라스미드를HindIII 및NotI으로 절단하여 Rc/CMV 플라스미드의HindIII와NotI 부위에 삽입하여 본 발명의 CMV4U 벡터를 제조한다.A pcDNA plasmid was prepared by cutting 1.76 Kb fragments containing preS1, preS2, S and 3'-UTR moieties from the pHBS1 plasmid with restriction enzymes Hin dIII and Bam HI and inserting them into the pcDNAI / Neo plasmid. After confirming that the fragment of the HBsAg insert by cutting the plasmid pcDNA with Hin dIII and Not I to prepare a CMV4U vector of the present invention inserted into the Hin dIII and Not I site of Rc / CMV plasmid.

Rc/CMV 플라스미드는 삽입된 유전자를 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있도록 고안된 플라스미드로서 CMV 프로모터와 소성장호르몬(BGH) PolyA 유전자를 가지고 있다. 또한, 포유동물 세포에서 제네티신(Geneticin)을 이용하여 선별이 가능하도록 Neor유전자를 가지고 있으며, 메토트렉세이트(MTX)를 이용하여 삽입된 유전자를 증폭시킬 수 있도록 디하이드로폴레이트(DHFR) 유전자도 포함한다(Frederick M. Ausubel 등,Current protocol in molecular biology,Wiley Capter 9).The Rc / CMV plasmid is a plasmid designed to express the inserted gene in mammalian cells, and has a CMV promoter and a BGH polyA gene. In addition, the mammalian cell has a Neo r gene for selection using geneticin (Geneticin), and the dihydrofolate (DHFR) gene to amplify the inserted gene using methotrexate (MTX) (Frederick M. Ausubel et al., Current protocol in molecular biology, Wiley Capter 9).

완성된 벡터로 대장균 INVαF을 형질전환시키고 이 대장균을 대량배양하여 이로부터 본 발명의 CMV4U 벡터를 순수하게 분리한다.E. coli INVαF was transformed with the completed vector, and the E. coli was cultured in large quantities to purely isolate the CMV4U vector of the present invention.

3. 발현벡터 CMV4U를 포함하는 포유동물 세포주 1B3의 제조3. Preparation of Mammalian Cell Line 1B3 Containing Expression Vector CMV4U

먼저 CMV4U 벡터를 제한효소PvuI로 처리함으로써, 포유동물 세포에서의 발현에 필요한 유전자는 보존한 채로 선형화시킨다. 선형화된 CMV4U 벡터를 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 유전자 펄서(Gene Pulser)를 이용하여 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 형질도입한다.The CMV4U vector is first treated with restriction enzyme Pvu I to linearize the genes required for expression in mammalian cells. The linearized CMV4U vector is transduced into CHO (Chinese Hamster Ovary) cells by electroporation using a Gene Pulser.

형질도입된 CHO 세포들을 제네티신 선택배지로 배양하면, CMV4U 벡터에 포함되어 있는 Neor유전자의 제네티신 저항성에 의해 CMV4U 벡터가 숙주의 염색체에 삽입된 세포 만이 콜로니를 형성하게 되므로, 이와 같이 형성된 콜로니를 선별한다. 또한, 형질도입된 세포주는 MTX가 첨가된 배지에서 배양하면 MTX에 대한 저항작용으로 DHFR 유전자의 수를 증가시키게 되는데, 이 과정에서 같이 존재하는 HBsAg 유전자의 수도 증가하게 되어, 결국 더욱 많은 재조합 HBsAg 단백질을 얻을수 있게 된다. 따라서, 앞서 선별한 콜로니를 MTX의 농도가 연속적으로 증가하는 증폭배지에서 배양하여 숙주세포의 염색체에 도입된 HBsAg 유전자를 증폭시킨다. 이와 같이 배양한 후 그 상등액을 취해, I125로 표지된 항 HBsAg 항체를 이용한 방사성면역분석(radioimmunoassay)을 실시하여 양성 반응이 나온 세포주를 선택한다.When the transduced CHO cells were incubated with a gene for gene selection, only cells in which the CMV4U vector was inserted into the host chromosome form colonies due to the gene resistance of the Neo r gene included in the CMV4U vector. Selected colonies are screened. In addition, when the transduced cell line is cultured in a medium containing MTX, it increases the number of DHFR genes due to its resistance to MTX, which in turn increases the number of HBsAg genes present, resulting in more recombinant HBsAg protein. You will get Therefore, the colonies selected above are cultured in an amplification medium in which the concentration of MTX continuously increases to amplify the HBsAg gene introduced into the chromosome of the host cell. After culturing in this way, the supernatant is taken and subjected to radioimmunoassay using an anti-HBsAg antibody labeled with I 125 to select a cell line with a positive response.

HBsAg을 분비하는 것으로 확인된 세포주를 제한 희석하여 개별적인 단일 클론으로 분리하여 배양하고, 다시 이들 세포 배양액으로 동일한 분석을 행하여 많은 양의 HBsAg을 분비하는 세포주를 선별한다. 이와 같은 서브클로닝을 1 회 더 실시하여 많은 양의 HBsAg를 안정적으로 분비하는 세포주(1B3)를 확립한다.Cell lines identified to secrete HBsAg are limited to dilution, isolated into individual monoclonal cells, cultured, and the same assay is performed again with these cell cultures to select cell lines that secrete large amounts of HBsAg. Such subcloning is performed once more to establish a cell line 1B3 which stably secretes a large amount of HBsAg.

4. 1B3 세포주 배양액으로부터 HBsAg의 분리 및 정제4. Isolation and Purification of HBsAg from 1B3 Cell Line Cultures

HBsAg을 분비하는 세포주를 MTX 100 nM의 증폭배지에서 배양하여 얻은 상등액을 원심분리하여 세포 등의 불순물을 제거한 후 여과법으로 농축하고 황산암모늄을 가해 단백질을 침전시킨다. 상등액을 제거한 후 침전만을 PBS에 현탁시켜 KBr 농도구배 원심분리를 실시한다. 즉, HBsAg의 밀도는 1.21 g/㎖로서 KBr 농도구배 원심분리하에서는 튜브의 상층부로 집중된다고 알려져 있다(Beth A. Antoni 등, Site-directed mutagenesis of cysteine residues of Hepatitis B surface antigen analysis of two single mutants and the double mutant,Eur. J. Biochem., 222:121 (1993)). 원심분리가 끝난 튜브 내의 시료를 분획하고 방사성면역분석법을 실시하여 양성반응이 나타나는 분획만을 수집한다. 이러한 조작을 2회 더 반복하고 최종적으로 분리, 정제된 농축시료의 일부를 희석하여 방사성면역분석법과 SDS-PAGE를 실시하여, 기존의 알려진 HBsAg의 분자량인 45 - 47 kDa, 37 - 39 kDa, 25 - 27 kDa와 유사한 크기의 단백질들을 확인한다.The supernatant obtained by culturing HBsAg-secreting cell line in MTX 100 nM amplification medium was centrifuged to remove impurities such as cells, concentrated by filtration and precipitated by adding ammonium sulfate. After removing the supernatant, the precipitate was suspended only in PBS and subjected to KBr concentration gradient centrifugation. In other words, the density of HBsAg is 1.21 g / mL, and it is known that the concentration of HBsAg is concentrated in the upper part of the tube under KBr gradient gradient centrifugation (Beth A. Antoni et al. the double mutant, Eur. J. Biochem., 222: 121 (1993)). Samples in the tube after centrifugation are fractionated and radioimmunoassay is performed to collect only the fractions with a positive reaction. This operation was repeated two more times, and finally a portion of the separated and purified concentrated sample was diluted to carry out radioimmunoassay and SDS-PAGE to determine the molecular weight of the known HBsAg of 45-47 kDa, 37-39 kDa, 25 Identify proteins of similar size to 27 kDa.

이와 같이 분리 정제된 HBsAg을 그리드에 부착시키고 네가티브 염색을 한 후 전자현미경으로 관찰하여, HBsAg 특유의 22 nm 구형 입자를 확인한다Thus separated purified HBsAg was attached to the grid and negatively stained and observed under an electron microscope to identify HBsAg-specific 22 nm spherical particles.

5. 포유동물 세포주로부터 발현된 재조합 HBsAg의 면역 유발능 실험5. Immuno-induced Experiment of Recombinant HBsAg Expressed from Mammalian Cell Line

포유동물 세포주 1B3의 배양 상등액으로부터 분리 정제된 재조합 HBsAg의in vivo에서의 면역 유발능을 확인한다. 정제된 HBsAg를 완전 프로인트 보조제(CFA) 또는 불완전 프로인트 보조제(IFA)와 혼합하여 마우스 1마리당 10 ㎍씩 3 주 간격으로 3 차례 복강내 투여한다. 각 시기에 혈정을 얻어 I125를 이용한 방사성면역분석법과 HBsAg에 대한 항체를 이용한 ELISA에 적용하여 마우스 혈중에 있는 항 HBsAg 항체를 검색하므로써, 1B3 배양 상등액으로부터 정제된 HBsAg의 면역 유발 능을 검사한다.In vivo immunogenic ability of purified recombinant HBsAg isolated from the culture supernatant of mammalian cell line 1B3 is confirmed. Purified HBsAg is mixed with complete Freund's adjuvant (CFA) or incomplete Freund's adjuvant (IFA) and administered three times intraperitoneally at 10 μg per mouse three weeks apart. At each time, blood serum was obtained and subjected to radioimmunoassay using I 125 and ELISA using antibodies against HBsAg to examine the immunogenic ability of HBsAg purified from 1B3 culture supernatant by searching for anti-HBsAg antibodies in mouse blood.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이고, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are only examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these.

실시예Example

1. 포유동물 세포 배양1. Mammalian Cell Culture

차이니즈 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포로서 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자가 없는 CHO DHFR-세포주(ATCC CRL-9096)를 HT(하이포크산틴-티미딘) 배지(소 태아 혈청 15 %, HT 첨가제 1 %, 페니실린-스트렙토마이신 1 %, 겐타마이신 0.1 %)에서 배양하였다. 이 배지는 Gibco BRL(Gibco BRL Life Technologies, New York, USA) 재료를 사용하여 제조하였으며 37 ℃, 5 % CO2배양기에서 배양하였다.As Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, CHO DHFR - cell line (ATCC CRL-9096) without the dehydrofolate reductase (DHFR) gene was transferred to HT (hypoxanthine-thymidine) medium (fetal bovine serum 15). %, HT additive 1%, penicillin-streptomycin 1%, gentamicin 0.1%). This medium was prepared using Gibco BRL (Gibco BRL Life Technologies, New York, USA) material and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.

2. HBsAg을 발현시키기 위한 벡터 CMV4U의 제조2. Preparation of Vector CMV4U to Express HBsAg

pHBS1 벡터(임 동수 박사, 생명공학 연구소, Korea)를 제한효소HindIII(New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA)와BamHI(New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA)로 처리하여 preS1, preS2, 3'-UTR을 포함하는 S 유전자인 1.76 kb의 절편을 잘라내고, 이를 pcDNAI/Neo(Invitrogen, Califonia, USA) 플라스미드에 삽입하여 pcDNA 플라스미드를 제조하였다. 이 pcDNA 플라스미드를HindIII와NotI(New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA)으로 처리하여 HBsAg 유전자를 잘라내어 Rc/CMV(Invitrogen, California, U.S.A.)의 폴리클로닝 사이트인HindIII와NotI 사이트에 삽입하여 CMV4U 벡터를 제조하였다.pHBS1 vectors (Dr. Lim Dong-soo, Biotechnology Research Institute, Korea) were treated with restriction enzymes Hin dIII (New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA) and Bam HI (New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA). A pcDNA plasmid was prepared by cutting the 1.76 kb fragment, which is the S gene including preS2 and 3′-UTR, and inserting it into the pcDNAI / Neo (Invitrogen, Califonia, USA) plasmid. This pcDNA plasmid was treated with Hin dIII and Not I (New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA) to cleave the HBsAg gene to the Hin dIII and Not I sites, the polycloning sites of Rc / CMV (Invitrogen, California, USA). Inserted to produce a CMV4U vector.

완성된 벡터를 대장균 INVαF(Invitrogen, Califonia, USA)에 섞고 42 ℃에서 1분 간 가열하여 형질전환시킨 후, 암피실린(Amresco, Ohio, USA)이 포함된 고체 한천 배지에 도말하여 37 ℃에서 12 시간 배양하였다. 배지에 생긴 콜로니를 액체 LB배지(NaCl 1 %, 트립톤 1 %, 효모 추출물 0.5 %)로 옮겨 37 ℃에서 12시간 진탕 배양한 후, 배양된 대장균을 수확하여 위저드 미니프렙스 DNA 정제 시스템(Wizard Minipreps DNA purification systems; Promega, Wisconsin, USA)을 사용하여 지정된 방법에 따라 벡터를 분리하였다. 분리된 벡터를HindIII와NotI 제한효소로 잘라 목적하는 1.76 Kb 크기의 HBsAg 유전자가 삽입된 벡터를 선별하고, 이 벡터를 가진 대장균을 액체 LB 배지에서 대량 배양하여 이로부터 CMV4U벡터를 순수하게 분리하였다(QIAGEN plasmid Maxi kit; QIAGEN, Germany).The finished vector was mixed with E. coli INVαF (Invitrogen, Califonia, USA), heated at 42 ° C for 1 minute, transformed, and plated on solid agar medium containing Ampicillin (Amresco, Ohio, USA) for 12 hours at 37 ° C. Incubated. The colonies formed on the medium were transferred to a liquid LB medium (NaCl 1%, tryptone 1%, yeast extract 0.5%), shaken and cultured at 37 ° C for 12 hours, and the cultured Escherichia coli was harvested to obtain a Wizard minipreps DNA purification system (Wizard). Vectors were isolated according to the designated method using Minipreps DNA purification systems (Promega, Wisconsin, USA). The isolated vector was cut with Hin dIII and Not I restriction enzymes, and the vector containing the desired 1.76 Kb-sized HBsAg gene was selected. The E. coli carrying the vector was cultured in liquid LB medium, and the CMV4U vector was purified from the purified vector. (QIAGEN plasmid Maxi kit; QIAGEN, Germany).

도 1은 본 발명의 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터 CMV4U의 제조방법을 모식적으로 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명에 따라 제조된 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터 CMV4U의 구조를 보여주는 모식도이다.Figure 1 schematically shows a method for producing a mammalian cell HBsAg expression vector CMV4U, Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of the mammalian cell HBsAg expression vector CMV4U prepared according to the present invention.

3. 발현벡터 CMV4U를 포함하는 포유동물 세포주 1B3의 제조3. Preparation of Mammalian Cell Line 1B3 Containing Expression Vector CMV4U

상기 단계에서 얻은 발현벡터 CMV4U를 제한효소PvuI(New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA)로 처리하고 0.8 % 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 겔 용출 및 알콜 침전 처리하여 선형화된 벡터만을 분리하였다. 미리 배양하고 있던 CHO DHFR­세포를 트립신(Gibco BRL Life Technologies, New York, USA)을 이용하여 수확하여 1 × 107개/㎖의 농도로 HT 배지에 희석하였다. 희석된 세포 현탁액을 유전자 펄서 큐벳(Gene Pulser Cuvettes; Bio-Rad, California, USA)에 0.8 ㎖ 넣고, 위에서 선형화시킨 CMV4U 벡터를 40 ㎍ 가하였다. 시료가 들어 있는 큐벳을 유전자 펄서(Gene Pulser; Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 250 V, 500 μF 조건으로 처리함으로써 선형화된 벡터를 CHO 세포에 형질도입하였다. 형질도입된 CHO 세포를 50 ㎖ 배양 플라스크에서 HT 배지로 2 일간 배양하여 안정화시켰다.The expression vector CMV4U obtained in the above step was treated with restriction enzyme Pvu I (New England Biolabs, Inc., Massachusetts, USA) and electrophoresed on 0.8% agarose gel, followed by gel elution and alcohol precipitation to separate only linearized vectors. It was. CHO DHFR which was incubated beforehand ­ Cells were harvested using trypsin (Gibco BRL Life Technologies, New York, USA) and diluted in HT medium at a concentration of 1 × 10 7 cells / ml. 0.8 ml of the diluted cell suspension was placed in Gene Pulser Cuvettes (Bio-Rad, California, USA), and 40 µg of the CMV4U vector linearized above was added. Linearized vectors were transduced into CHO cells by treating the cuvette containing samples with 250 V, 500 μF conditions using a Gene Pulser (Bio-Rad, California, USA). Transduced CHO cells were stabilized by incubating for 2 days in HT medium in a 50 ml culture flask.

HT 배지에서 안정화시킨 세포들을 제네티신(Geneticin; Gibco BRL Life Technologies, New York, USA)이 800 ㎍/㎖의 농도로 포함된 선택배지(투석 혈청(소 태아 혈청) 10 %, 페니실린-스트렙토마이신 1 %, 겐타마이신 0.1 % 및 제네티신 800 ㎍/㎖)에서 7 일 동안 배양하여 형질도입된 세포 만을 선별하였다.Cells stabilized in HT medium were selected in medium containing 800 mg / ml of Geneticin (Gibco BRL Life Technologies, New York, USA) (dialysis serum (fetal bovine serum) 10%, penicillin-streptomycin) Only transduced cells were selected by culturing for 7 days in 1%, gentamicin 0.1% and genetisin 800 ug / ml).

이어서, 삽입된 유전자의 증폭을 위해 10 nM 메토트렉세이트(Sigma chemical company, Missouri, USA)가 포함된 증폭배지(투석 혈청(소태아 혈청) 10 %, 페니실린-스트렙토마이신 1 %, 겐타마이신 0.1 % 및 메토트렉세이트(MTX) 10 nM) 로 배양하였다(Marie-Louise Michel 등, Expression of amplified Hepatitis B virus surface antigen gene in chinese hamster ovary cellsBio/technology3:561 (1985)). 각 형질도입된 세포들을 10일 동안 배양한 후, 배양 상등액에 대하여 다음과 같이 방사성면역분석법을 실시하여 양성반응을 보인 세포주를 선별하였다. 다시 HBsAg 유전자의 증폭을 위해 MTX 농도를 100 nM로 증가시켜 배양하고 마찬가지로 방사성면역분석법을 실시하여 HBsAg의 분비가 증가된 세포주를 선별하였다.Subsequently, amplification medium containing 10 nM methotrexate (Sigma chemical company, Missouri, USA) for amplification of the inserted gene (dialysis serum (fetal bovine serum) 10%, penicillin-streptomycin 1%, gentamicin 0.1% and methotrexate (MTX) 10 nM) (Marie-Louise Michel et al., Expression of amplified Hepatitis B virus surface antigen gene in chinese hamster ovary cells Bio / technology 3: 561 (1985)). After culturing each transduced cells for 10 days, the cell line showing positive reaction was selected by performing radioimmunoassay on the culture supernatant as follows. In order to amplify the HBsAg gene, the MTX concentration was increased to 100 nM and cultured. Similarly, radioimmunoassay was performed to select cell lines with increased HBsAg secretion.

(방사성면역분석법)(Radioimmunoassay)

I125가 표지된 항 HBsAg 항체를 가지고 있는 오스리아 II 키트(Ausria II kit; Abbott Laboratories, Illinois, USA)를 사용하여 방사성면역분석을 실시하였다. 항 HBsAg 항체가 붙어있는 비드를 웰에 넣고 여기에 세포 배양 상등액을 200 ㎕씩 넣어 45 ℃에서 2시간 반응시켰다. 웰에 들어있는 배양 상등액을 흡입기를 이용하여 제거하고 비드를 탈이온수로 4번 세척한 후, 세척된 비드에 I125로 표지된 항 HBsAg 항체가 들어있는 반응액을 200 ㎕씩 넣고 45 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 비드를 탈이온수로 4번 세척하고 시험관에 넣어 감마 카운터(Wallac, USA)로 계측하였다.Radioimmunoassays were performed using an Ausria II kit (Abbott Laboratories, Illinois, USA) with anti-HBsAg antibody labeled I 125 . Beads with anti-HBsAg antibody were added to the wells, and 200 μl of the cell culture supernatant was added thereto and reacted at 45 ° C. for 2 hours. Remove the culture supernatant from the well using an inhaler, wash the beads 4 times with deionized water, and add 200 µl of the reaction solution containing the anti-HBsAg antibody labeled with I 125 to the washed beads at 45 ° C. The reaction was time. After the reaction, the beads were washed four times with deionized water and placed in a test tube and measured by a gamma counter (Wallac, USA).

방사성면역분석법에서 양성반응을 보인 선별된 세포주를 제한 희석방법을 통해 96 웰 플레이트에 1 세포/웰, 5 세포/웰이 되도록 분배하여 MTX 농도가 100 nM인 배지에서 7일동안 배양하였다. 각 웰의 배양 상등액을 얻어서 방사성면역분석법을 실시하여 가장 HBsAg의 분비가 많은 세포주를 선별하여 1B3로 명명하였다. 선별된 세포주 1B3가 안정적으로 HBsAg을 분비하는가를 확인하기 위하여 MTX 100 nM 증폭배지를 넣고 4 일 동안 매일 배양 상등액을 취하여 각각의 상등액 중의 HBsAg의 양을 방사성면역분석법을 통하여 검사하였다. 이후 다시 한 번 서브클로닝을 하여 안정적으로 가장 많은 HBsAg을 분비하는 세포주를 확립하였다.Selected cell lines positive for radioimmunoassay were distributed to 96 well plates by 1 dilution / well and 5 cells / well through restriction dilution and incubated for 7 days in a medium with MTX concentration of 100 nM. The culture supernatant of each well was obtained, radioimmunoassay was performed to select the cell lines with the highest HBsAg secretion and named 1B3. To confirm whether the selected cell line 1B3 secreted HBsAg stably, MTX 100 nM amplification medium was added to the culture supernatant for 4 days, and the amount of HBsAg in each supernatant was examined by radioimmunoassay. Subcloning was then performed again to establish a cell line stably releasing the most HBsAg.

이와 같이 본 발명의 발현벡터 CMV4U를 포함하는, HBsAg을 분비하는 포유동물 세포주 1B3는 생명공학연구소에 1997년 12월 11일자 기탁번호 KCTC 0416BP로 기탁되어 있다.Thus, mammalian cell line 1B3 releasing HBsAg, including the expression vector CMV4U of the present invention, was deposited with the accession number KCTC 0416BP dated December 11, 1997 at the Biotechnology Research Institute.

4. 1B3 세포주 배양액으로부터 HBsAg의 분리 및 정제4. Isolation and Purification of HBsAg from 1B3 Cell Line Cultures

1B3 세포주를 MTX 100 nM의 증폭배지에서 배양하여 얻은 배양 상등액 3 ℓ를 2000 rpm에서 10분동안 원심분리(Brushless D. C motor centrifuge VS-5000, Vision Scientific Co., LTD, Korea)하여 세포 및 파편을 제거하였다. 상등액을 한외여과셀(ultrafiltration cell; Amicon, Massachusetts, USA)에 넣어 2 Nℓ/min의 압력의 N2가스로 여과하면서 농축하였다. 여과에 사용한 필터는 분자량 한계 300,000 Da인 XM300(Amicon, Massachusetts, USA)이었다. 농축과 동시에 인산염 완충액(PBS; 50 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4·7H2O, 1.4 mM KH2PO4, 0.02 % 아지드화나트륨)으로 세척하여 원하지 않는 단백질들을 제거하였다. 농축액에 황산암모늄(Sigma chemical company, Missouri, USA)을 녹이면서 가하여 최종 농도를 45 %로 한 후 4 ℃에서 12시간 방치하여 단백질 침전이 생기도록 하였다. 침전이 생긴 용액을 12,000 rpm에서 2시간 원심분리하였다(J21-MC, JA-20 rotor, Beckman, USA). 상등액을 제거하고 남은 침전을 PBS에 녹인 후 분자량 한계가 3,000 Da인 센트리플러스 농축기(Centriplus concentrators; Amicon, Massachusetts, USA)를 사용하여 침전 중에 남은 황산암모늄을 제거하면서 PBS로 완충액 조성을 바꾸고 시료를 농축하였다.Cell cultures and debris were obtained by centrifuging 3 l of the culture supernatant (Brushless D. C motor centrifuge VS-5000, Vision Scientific Co., LTD, Korea) at 2000 rpm for 10 minutes. Was removed. The supernatant was concentrated in an ultrafiltration cell (Amicon, Massachusetts, USA), filtered with N 2 gas at a pressure of 2 NL / min. The filter used for filtration was XM300 (Amicon, Massachusetts, USA) with a molecular weight limit of 300,000 Da. Concurrent with washing was removed with phosphate buffer (PBS; 50 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 .7H 2 O, 1.4 mM KH 2 PO 4 , 0.02% sodium azide) to remove unwanted proteins. . Ammonium sulfate (Sigma chemical company, Missouri, USA) was added to the concentrate while melting to a final concentration of 45% and left at 4 ° C for 12 hours to allow protein precipitation. The precipitated solution was centrifuged at 12,000 rpm for 2 hours (J21-MC, JA-20 rotor, Beckman, USA). After removing the supernatant and dissolving the remaining precipitate in PBS, using a Centriplus concentrators (Amicon, Massachusetts, USA) with a molecular weight limit of 3,000 Da to remove the ammonium sulphate remaining during precipitation, the buffer composition was changed to PBS and the sample was concentrated. .

농축된 시료에 KBr(Sigma chemical company, Missouri, USA)을 녹여 밀도가 1.28 g/㎖이 되도록 한 후 이를 28,000 rpm으로 4 ℃에서 38시간 동안 고속원심분리(L-80, 28Ti rotor, Beckman, USA)하여, 상대적으로 밀도가 작은(1.21 g/㎖) HBsAg이 위로 떠오르도록 하였다(Beth A. Antoni 등, Site-directed mutagenesis of cysteine residues of Hepatitis B surface antigen analysis of two single mutants and the double mutant,Eur. J. Biochem., 222:121 (1933)). 원심분리가 끝난 후 튜브의 아랫쪽을 18게이지 주사바늘로 뚫고 1 ㎖씩 분취하고, 각 분액들을 1/10로 희석하여 위와 마찬가지로 방사성면역분석법을 실시하였다. 양성 반응이 나온 분액들을 모아 상기와 같은 KBr 농도구배 원심분리를 2회 더 실시하여 HBsAg을 더욱 정제하였다.KBr (Sigma chemical company, Missouri, USA) was dissolved in the concentrated sample to a density of 1.28 g / mL, which was then centrifuged at 28,000 rpm for 38 hours at 4 ° C (L-80, 28Ti rotor, Beckman, USA). The relatively dense (1.21 g / mL) HBsAg floated up (Beth A. Antoni et al., Site-directed mutagenesis of cysteine residues of Hepatitis B surface antigen analysis of two single mutants and the double mutant, Eur J. Biochem., 222: 121 (1933)). After the centrifugation, the bottom of the tube was punched out with an 18-gauge needle and 1 ml aliquots were diluted. Each aliquot was diluted 1/10, and radioimmunoassay was performed as above. Aliquots of the positive reaction were collected and subjected to two more KBr concentration gradient centrifugations as described above to further purify HBsAg.

KBr 농도구배 원심분리의 각 단계의 시료와 최종적으로 분리된 HBsAg 양성반응 분액을 시료로 하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyarcrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다(Joseph Sambrook 등,Molecular cloning,2nd ed. Chapter 18). 각 시료를 전체 시료에 대하여 동일한 비율이 되도록 취하여, 2-머캡토에탄올의 최종 농도 5 %, SDS 농도 2 %인 로딩 완충액과 섞어 100 ℃에서 7분 동안 끓였다. 이것을 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 적재 겔(stacking gel)에서는 60 V로, 용해 겔(resolving gel)에서는 100 V로 전개시켰다. 전개가 끝난 후 겔을 분리하여 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R250)로 염색하였다. 이상의 방법은 Laemmli(1970)의 방법에 따른 것이고, 시료의 성질에 맞게 약간 변형하여 실시하였다(Joseph Sambrook 등,Molecular cloning,2nd ed. Chapter 18; Constance M. T. Mangold 등, Secretion and antigenicity of Hepatitis B virus samll envelope proteins lacking cysteins in the major antigenic region,Virology, 211:535 (1995)).Sodium dodecyl sulfate-polyarcrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed using samples of each stage of KBr concentration gradient centrifugation and finally separated HBsAg positive reaction samples (Joseph Sambrook et al., Molecular cloning, 2nd ed. 18). Each sample was taken in equal proportions to the entire sample, mixed with a loading buffer of 5% final concentration of 2-mercaptoethanol and 2% SDS concentration and boiled at 100 ° C. for 7 minutes. This was loaded onto a 10% SDS-polyacrylamide gel and developed to 60 V on a stacking gel and 100 V on a resolving gel. After completion of development the gels were separated and stained with Coomassie Brilliant Blue R250. The above method was based on the method of Laemmli (1970) and was slightly modified to suit the properties of the sample (Joseph Sambrook et al., Molecular cloning, 2nd ed. Chapter 18; Constance MT Mangold et al., Secretion and antigenicity of Hepatitis B virus samll envelope proteins lacking cysteins in the major antigenic region, Virology, 211: 535 (1995)).

도 3은 본 발명의 포유동물 세포주 1B3의 배양 상등액으로부터 분리 정제된 단백질 분획의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 사진이다. 여기에서 보면, 환원 조건하에서 시료를 전개시킨 결과 방사성면역분석법에서 양성 반응이 나타난 분획에서만 나타나는 단백질들의 존재를 확인할 수 있고, 이 단백질들이 기존의 알려진 HBsAg의 분자량인 45 - 47 kDa, 37 - 39 kDa, 25 - 27 kDa(Klaus H. Heermann 등, Large surface proteins of Hepatitis B virus containing the pre-s sequence,Journal of Virology, 52:396 (1984))와 유사한 크기임을 확인할 수 있다.Figure 3 is a photograph showing the SDS-PAGE results of purified protein fractions isolated from the culture supernatant of the mammalian cell line 1B3 of the present invention. Here, the results of the development of the sample under reducing conditions confirm the presence of proteins that appear only in the fractions that showed positive reactions in the radioimmunoassay. These proteins are known to have molecular weights of 45-47 kDa, 37-39 kDa. , 25-27 kDa (Klaus H. Heermann et al., Large surface proteins of Hepatitis B virus containing the pre-s sequence, Journal of Virology, 52: 396 (1984)).

한외여과셀에 의해 농축된 시료와 센트리플러스에 의해 20배로 농축된 시료, 그리고 형질도입된 CHO 세포주의 세포 배양액을 시료로 하여, 네가티브 염색 기법(Bond 및 Hall, 1972)을 이용해서 전자현미경으로 관찰하였다. 즉, 시료를 지지막이 부착된 메쉬 그리드에 올려 놓은 후 여과지로 유출시키고 증류수로 세척한 다음, 1 % 우라닐아세테이트로 염색한 그리드를 탄소 코팅하여 전자현미경(Jeol, Japan)으로 관찰하였다.Samples were concentrated by ultrafiltration cells, samples 20 times concentrated by Sentriplus, and cell cultures of transduced CHO cell lines, and observed by electron microscopy using negative staining (Bond and Hall, 1972). It was. That is, the sample was placed on the mesh grid to which the support membrane was attached, and then flowed out with filter paper, washed with distilled water, and carbon-coated the grid stained with 1% uranyl acetate and observed with an electron microscope (Jeol, Japan).

도 4는 본 발명의 포유동물 세포주 1B3의 배양 상등액으로부터 분리 정제된 HBsAg 단백질의 전자현미경 사진(X100,000)이다. 여기에서 보면, HBsAg 단백질의 특징인 22 nm 정도 크기의 구형 입자를 확인할 수 있다.Figure 4 is an electron micrograph (X100,000) of purified HBsAg protein isolated from the culture supernatant of the mammalian cell line 1B3 of the present invention. Here, it can be confirmed that the spherical particles of about 22 nm size that are characteristic of the HBsAg protein.

5. 포유동물 세포주로부터 발현된 재조합 HBsAg의 면역 유발능 실험5. Immuno-induced Experiment of Recombinant HBsAg Expressed from Mammalian Cell Line

이상과 같이 1B3 세포주 배양 상등액으로부터 분리 정제된 HBsAg 단백질의 면역 유발능력을 Balb/c 마우스(Charles River, Japan)를 이용하여 실험하였다.As described above, the immunogenic ability of HBsAg protein purified from 1B3 cell line culture supernatant was tested using Balb / c mice (Charles River, Japan).

마우스 8마리를 실험군 5마리, 대조군 3마리로 나누고 실험군에는 1 마리당 1B3 세포주 배양 상등액으로부터 정제된 HBsAg 10 ㎍에 보조제로서 완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant; CFA, Sigma, USA) 또는 불완전 프로인트 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant; IFA, Sigma, USA) 50 ㎕를 식염수와 혼합한 것을, 그리고 대조군에는 CFA 또는 IFA 50 ㎕ 만을 식염수와 혼합한 것을 충분히 섞이도록 흔든 후 주사기를 이용하여 마우스의 복강에 3 주 간격으로 3 회 주사하였다. 실험 기간 동안 마우스는 20 ℃, 65 %의 습도가 유지되는 동물 사육장에서 사육하였으며 필터를 통해 여과된 공기가 공급되도록 하였다.Eight mice were divided into five experimental groups and three control groups, and each group contained 10 Freq of HBsAg purified from 1B3 cell line culture supernatant as a supplement. Incomplete Freund's Adjuvant; IFA, Sigma, USA Three injections. During the experiment, the mice were raised in an animal kennel maintained at 20 ° C. and 65% humidity, and filtered air was supplied through the filter.

각 시기에 투여한 용액의 조성은 다음과 같다.The composition of the solution administered at each time is as follows.

(1) 1, 2차 투여(1) 1st, 2nd administration

실험군: HBsAg 10 ㎍ 대조군:Experimental group: HBsAg 10 ㎍ control:

CFA 50 ㎕ CFA 50 ㎕50 μl CFA 50 μl CFA

식염수 적당량 식염수 적당량Saline Proper Amount Saline Proper Amount

100 ㎕/마우스 100 ㎕/마우스100 μl / mouse 100 μl / mouse

(2) 3차 투여 때는 보조제를 CFA에서 IFA로 바꾸어 투여하였다.(2) In the third administration, the adjuvant was changed from CFA to IFA.

각 투여 후 10일이 지나서 안구 뒷면의 모세혈관으로부터 혈액을 50 ㎕씩 취하여 실온에서 1시간 방치하여 응고시킨 후 25 ℃, 8,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 혈장 성분만을 얻었다. 이 혈장중에 포함된 항 HBsAg 항체를 다음과 같이 방사성면역분석법(Ausab Kit; Abbott, USA) 및 ELISA법으로 검색하였다.After 10 days after each administration, 50 μl of blood was taken from the capillaries on the back of the eye, allowed to stand at room temperature for 1 hour to coagulate, and centrifuged at 25 ° C. and 8,000 rpm for 10 minutes to obtain only plasma components. Anti-HBsAg antibody contained in this plasma was searched by radioimmunoassay (Ausab Kit; Abbott, USA) and ELISA method as follows.

(방사성면역분석법)(Radioimmunoassay)

HBsAg이 붙어있는 비드를 웰에 넣고 여기에 실험군 5 마리와 대조군 3 마리로부터 얻은 혈장을 각각 100 배로 희석하여 비드가 잠기도록 첨가한 후 상온에서 18시간 반응시켰다. 웰에 들어있는 시료를 흡입기를 이용하여 제거하고 비드를 탈이온수로 4 회 세척하였다. 세척된 비드에 I125로 표지된 HBsAg 단백질이 들어있는 반응액을 200 ㎕씩 넣고 상온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응후 비드를 탈이온수로 4번 세척하여 시험관에 넣고 감마 카운터(Wallac, USA)로 계측하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.The beads with HBsAg were added to the wells, and the plasma obtained from five experimental groups and three control groups was diluted 100-fold and added to submerse beads, followed by reaction at room temperature for 18 hours. Samples in the wells were removed using an inhaler and the beads were washed four times with deionized water. 200 씩 of the reaction solution containing HBsAg protein labeled with I 125 was added to the washed beads, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours. After the reaction, the beads were washed four times with deionized water, placed in a test tube, and measured by a gamma counter (Wallac, USA). The results are shown in Table 1 below.

표 1에서 보듯이, 실험군의 마우스 5 마리로부터 얻은 혈장 모두에서 양성 반응이 나타나, 비록 개체 차가 있다 하더라도 모두 면역반응을 보여주었음을 알 수 있다.As shown in Table 1, all of the plasma obtained from the five mice in the experimental group showed a positive reaction, even if there is an individual difference, it can be seen that all showed an immune response.

구분division 항 HBsAg 항체의양(cpm)Amount of anti HBsAg antibody (cpm) 분석 기준: 양성* Analytical Criteria: Positive * 4134.14134.1 분석 기준: 음성* Analysis criteria: negative * 81.281.2 대조군Control 1One 125.45125.45 22 122.75122.75 33 84.1584.15 실험군Experimental group 1One 3529.053529.05 22 6920.356920.35 33 307.35307.35 44 599.2599.2 55 413.7413.7

*분석 기준: 양성 및 음성 값은 분석 키트의 제조사에서 제공한 것임. * Analytical Criteria: Positive and negative values provided by the manufacturer of the assay kit.

(ELISA 법)(ELISA method)

임상에서 이미 사용되고 있는 HBV 백신을 PBS로 희석하여 2 ㎍/㎖의 농도가 되도록 한 후 100 ㎕씩을 96 웰 플레이트(Maxisorp Immunoplate; Nunc, Denmark)에 가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 12 시간 배양한 후 아지드화나트륨이 0.02 % 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 차단 완충액(PBS 중 1 % 소혈청알부민(BSA), 0.02 % 아지드화나트륨)을 웰마다 120 ㎕ 씩 가하여 실온에서 2시간 방치한 후, PBS로 웰을 3회 세척하였다. 이와 같이 준비된 플레이트에, 상기 실험군과 대조군으로부터 분리한 혈장들을 희석 완충액(PBS 중 0.1 % BSA, 0.05 % 트윈 20, 0.02 % 아지드화나트륨)으로 250배, 1250배, 6250배, 31250배 희석하여 웰마다 100 ㎕ 씩 넣었다. 다시 실온에서 3 시간 반응시킨 후 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 알칼리 포스파타제(AP)가 결합된 염소 항-마우스 Ig을 희석 완충액으로 1 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하여 웰마다 100 ㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, AP의 기질인 p-니트로페닐포스페이트를 기질 완충액(NaHCO30.02 M, Na2CO30.01 M, MgCl2·6H2O 1 %, 증류수 적당량)에 1 ㎎/㎖ 농도로 녹여 각 웰마다 100 ㎕씩 가하였다. 실온에서 반응시켜 충분히 발색된 후 파장 405 nm에서 흡광도를 측정하여(Emax precision microplate reader; Molecular Devices, USA) 반응정도를 평가하였다.The HBV vaccine already used in the clinic was diluted with PBS to a concentration of 2 μg / ml, and then 100 μl was added to a 96 well plate (Maxisorp Immunoplate; Nunc, Denmark). The plate was incubated at 4 ° C. for 12 hours and washed three times with PBS containing 0.02% sodium azide. 120 μl of blocking buffer (1% bovine serum albumin (BSA) in PBS, 0.02% sodium azide) was added to each well and left at room temperature for 2 hours, after which the wells were washed three times with PBS. In the plate prepared as described above, the plasma separated from the experimental group and the control group was diluted 250 times, 1250 times, 6250 times, 31250 times with dilution buffer (0.1% BSA in PBS, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide). 100 μl was added per well. After reacting for 3 hours at room temperature, the plate was washed three times with PBS. Alkaline phosphatase (AP) -bound goat anti-mouse Ig was diluted to a concentration of 1 μg / ml with dilution buffer, and 100 μl of each well was added and reacted at room temperature for 2 hours. After washing the plate three times with PBS, 1 mg of p-nitrophenylphosphate, a substrate of AP, in substrate buffer (NaHCO 3 0.02 M, Na 2 CO 3 0.01 M, MgCl 2 · 6H 2 O 1%, distilled water) The solution was dissolved at a concentration of / ml and 100 µl was added to each well. After reacting sufficiently at room temperature, the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm (Emax precision microplate reader; Molecular Devices, USA) to evaluate the degree of reaction.

도 5는 본 발명에 따라 제조된 재조합 HBsAg 단백질의 면역 유발능을 보여주는 그래프로, 도 5a, 5b 및 5c는 각각 HBsAg의 1 차 투여, 2 차 투여 및 3 차 투여 후 실험군과 대조군 마우스에서의 항원항체반응의 정도를 보여주고 있다. 여기에서 보듯이, 실험군의 모든 개체가 대조군 보다 높은 역가의 항 HBsAg을 포함하고 있음을 알 수 있다.5 is a graph showing the immunogenic ability of the recombinant HBsAg protein prepared according to the present invention, Figures 5a, 5b and 5c are antigens in experimental and control mice after the first, second and third administration of HBsAg, respectively The degree of antibody response is shown. As shown here, it can be seen that all individuals in the experimental group contain higher titers of anti-HBsAg than the control group.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따르면 유전자 재조합 기술을 바탕으로 하여 B형 간염 바이러스로부터 유래되는 자연적인 HBsAg와 유사한 재조합 HBsAg 단백질을 포유동물 세포주에서 얻을 수 있었으며, 이와 같이 제조된 재조합 HBsAg 단백질은 마우스를 이용한 동물실험 결과 면역반응을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.As described above, according to the present invention, a recombinant HBsAg protein similar to the natural HBsAg derived from hepatitis B virus based on genetic recombination technology was obtained in a mammalian cell line. Animal experiments using mice were confirmed to induce immune responses.

따라서, 본 발명을 이용하면 현재 사용 중인 B형 간염 백신에서 지적되고 있는 문제점들을 개선한 B형 간염 백신의 개발이 가능하게 될 것이다.Therefore, the use of the present invention will enable the development of a hepatitis B vaccine that improves the problems pointed out in the current hepatitis B vaccine.

Claims (8)

B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)의 preS1, preS2 및 S 부분을 코딩하는 HBsAg 유전자가 CMV 프로모터와 소성장 호르몬 폴리아데닐레이션 유전자 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 포유동물 세포용 HBsAg 발현 벡터.A HBsAg expression vector for mammalian cells, wherein the HBsAg gene encoding the preS1, preS2, and S portions of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) is inserted between the CMV promoter and the ectopic hormone polyadenylation gene. 제 1 항에 있어서, Neor유전자 및 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 유전자를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.The vector of claim 1, further comprising a Neo r gene and a dihydrofolate reductase (DHFR) gene. 제 2 항에 있어서, 벡터 CMV4U3. The vector CMV4U according to claim 2 제 1 항의 벡터를 형질도입시킨 포유동물 세포주.A mammalian cell line transduced with the vector of claim 1. 제 4 항에 있어서, 포유동물 세포주가 차이니즈 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary; CHO)인 것을 특징으로 하는 세포주.5. The cell line of claim 4, wherein the mammalian cell line is Chinese Hamster Ovary (CHO). 제 5 항에 있어서, 세포주 1B3 (기탁번호 KCTC 0416BP).The cell line 1B3 (Accession No. KCTC 0416BP) according to claim 5. 제 4 항의 세포주를 배양하고, 그 상등액을 분리 정제하여 preS1, preS2 및 S 부분을 포함하는 HBsAg 단백질을 제조하는 방법.A method of producing an HBsAg protein comprising preS1, preS2, and S portions by culturing the cell line of claim 4 and separating and purifying the supernatant. 제 7 항의 방법에 따라 제조된 HBsAg 단백질을 포함하는 B형 간염 백신.Hepatitis B vaccine comprising the HBsAg protein prepared according to the method of claim 7.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030012321A (en) * 2001-07-31 2003-02-12 (주)코아바이오텍 Expression vectors useful in animal cells and expression vectors for preparing hbv surface antigen
KR100472920B1 (en) * 2002-05-17 2005-03-08 씨제이 주식회사 Vector for dna vaccine having high expression effects and vaccine for hepatitis using the vector
KR100836745B1 (en) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 An hbv vaccine and a process of preparing the same
CN102851313A (en) * 2008-01-28 2013-01-02 多贝尔有限公司 Hepatitis b vaccine and preparation technology thereof

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030012321A (en) * 2001-07-31 2003-02-12 (주)코아바이오텍 Expression vectors useful in animal cells and expression vectors for preparing hbv surface antigen
KR100472920B1 (en) * 2002-05-17 2005-03-08 씨제이 주식회사 Vector for dna vaccine having high expression effects and vaccine for hepatitis using the vector
KR100836745B1 (en) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 An hbv vaccine and a process of preparing the same
WO2008093976A1 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Dobeel Co., Ltd. An hbv vaccine and a process of preparing the same
JP2010516807A (en) * 2007-01-31 2010-05-20 トゥビエル カンパニー，リミテッド HBV vaccine and method for producing the same
CN102851313A (en) * 2008-01-28 2013-01-02 多贝尔有限公司 Hepatitis b vaccine and preparation technology thereof

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