KR19990044694A - 개선된 성능을 갖는 화학발광 1,2-디옥세탄 - Google Patents

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Abstract

신규 종류의 안정한 디옥세탄은 폴리시클릭 안정화기 및 아릴옥시 잔기를 가지고, 이의 산소 원자는 보호기와 함께 제공되며 상기 보호기는 디옥세탄과 함께 혼합된 효소적 또는 화학적 개시제에 의해서 제거될 수 있다.
폴리시클릭 안정화기는 바람직하게는 스피로아다만탄이다. 그러한 기는 또한 알콕시, 아릴옥시, 부분적으로 또는 전체적으로 할로겐, 특히 불소 및 염소로 치환된 아르알킬옥시 또는 시클로알킬옥시 잔기를 갖는다. 안정화 잔기, 아릴기 및 OR기에 대한 전자 활성기의 적당한 선택은 강화된 효소 반응속도, 우수한 광강도 및 여러 분석에서 우수한 검출 감도를 나타낸다.

Description

개선된 성능을 갖는 화학발광 1,2-디옥세탄
본 발명은 대기 조건하에서 안정한 1,2-디옥세탄에 관한 것이며, 이는 보호기가 제거될 때 빛의 방출과 함께 분해되는 옥시음이온을 남김으로써 화학발광을 유발할 수 있다. 디옥세탄은 전형적으로 스피로-결합될 수 있는 트리시클로알킬 잔기에 의해서 안정화되며, 이는 보호된 산소 원자 및 전자 활성 치환체가 결합된 아릴기를 갖는다. 또한, 본 발명의 디옥세탄은 2-탄소상에 할로겐화된 옥시 치환체를 함유한다. 디옥세탄은 개선된 성능, 강화된 감도를 나타내고, 여러 가지 분석 및 기타 검출 용도에서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 양수인인 트로픽스, 인크 (Tropix, Inc)사는 화학발광성 디옥세탄을 면역분석, 핵산분석, 인공 발광 재료 등을 포함하여, 여러 가지 용도로 사용하기 위하여 최초로 개발하여 상업화하였다. 부가적으로, 트로픽스사는 프로테아제 및 기타 내생 효소, 및 마커 (maker) 또는 라벨로서 널리 사용되는 예를 들어, 알칼리성 포스파타제와 같은 여러 가지 외생 효소를 포함하는, 효소의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 디옥세탄을 개발하였다.
그러한 화합물, 및 정제된 형태로 그들을 제조하는 방법은 미국 특허 제4,931,569호의 주제이다. 이러한 타입의 초기 시판 화합물은 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-포스포릴옥시)-페닐-1,2-디옥세탄 디소듐염으로, 일반적으로 AMPPD로 알려져 있으며, 매사추세츠주 베드포드 소재의 프로픽스, 인크사로부터 입수할 수 있다. 또한, 트로픽스, 인크사에 양도된 미국 특허 제4,931,223호의 다-분석물 분석을 포함한 여러가지 분석법으로 이러한 타입의 화합물을 확인해왔다. 또한, 본 명세서와 함께 양도된, 미국 특허 제4,978,614호에 구체적으로 발표되고 미국 특허 제5,330,900호에 광범위하게 서술되어 있는 바와 같이, 용이하게 검출되고(거나) 정량되는 화학발광 시그날를 생성하는 이러한 화합물의 용도가 "인핸서 (enhancer)" 조성물의 분석에 배합시킴으로써 개선될 수 있다. 전형적으로, 이들 인핸서는 4 급 오늄염 구조, 예를 들어 폴리(비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질 트리부틸포스포늄 클로라이드) 뿐 아니라 상응하는 포스포늄 및 술포늄염을 가지며, 이들은 화학발광성을 강화하기 위하여 수성 환경중에서 소수성 부위 또는 영역을 형성할 수 있다.
상업적으로 개발된 디옥세탄은 통상적으로 하기 구조식으로 나타낼 수 있다.
알려진 바와 같이, 상업적으로 개발된 "제1 세대" 디옥세탄 중에서, Y1, Y2및 Z는 수소이고 R은 메틸기이다. AMPPD 중의 X는 포스페이트기인 반면, 또한 다른 "제1 세대" 디옥세탄이 개발되어 기재되어 있으며, 여기서 X는 효소에 의해서 분해될 수 있는 상이한 기이다. X에 관하여 가능한 기들이 공지되어 있고, 포스페이트, 아세테이트, 여러 가지 갈락토시드 및 글루쿠로니드 뿐 아니라 통상적으로 효소에 의해서 분해되기 쉬운 임의의 기가 있다. 대표적인 것들은 G기와 동일한 것으로, 미국 특허 제4,978,614호의 표 1에 개시되어 있다. "제2 세대" 디옥세탄이 개발되었고, 입증되어 특허를 받았으며, 이는 화학발광성 강도, 화학발광성 반응 속도, 또는 양자 모두를 개선하기 위하여 상기 화학식 I의 Y1및(또는) Y21 개 이상이 수소 이외의 것들을 갖는다. 이러한 타입의 화합물은 스피로아다만틸기 상의 활성 치환체, 즉, Y1또는 Y2중 1 개 이상이 수소 이외의 기를 갖는다. 이러한 "제2 세대"의 특징적인 실시 태양에서, 브릿지헤드 탄소는 염소 치환체 (CSPD)를 갖는다. 여러 가지 기타 활성 체환체가 미국 특허 제5,112,960호 및 트로픽스, 인크사의 특허 양도된 다른 특허에 개시되어 있다. 염소 치환체 대신에, 아다만틸 고리는 트로픽스, 인크사의 미국 특허 제5,326,882호의 청구항 1에 기술된 대로, 메틸렌 치환체를 가질 수 있다. 효소 반응속도 (T1/2)에 대한 조절, 광강도 및 검출 감도의 중요성이 미국 특허 제5,112,960호에 강조되어 있다.
또한, 미국 특허 제5,326,882호에는 "제3 세대" 트리-치환된 페닐 화합물, 즉 상기 나타낸 구조의 디옥세탄 (여기서, Y1및 Y2각각은 수소이거나 활성기일 수 있으며, 페닐 고리는 산소 원자를 통하여 페닐에 결합된 효소 분해가능한 기에 부가하여, 효소 반응속도 및(또는) 화학발광성 강도에 영향을 주는 전자 활성 치환체를 갖는다)을 설명하고 청구하고 있다. 이러한 전자 활성기인 상기 화학식 중 Z는 얻어지는 화학발광성을 지체시키거나 가속화할 수 있다. 화학발광성은 적합한 디옥세탄을 X 잔기에 특이적인 상응하는 효소와 혼합하거나 결합시킴으로써 화학식 I의 효소 분해가능한 X기 분해 후에 생성된다. 이는 상기 서술한 바와 같이, 수성 시료 중에 서 또는 멤브레인 상에서 또는 기타 고상 지지체 상에서 달성될 수 있다. 트로픽스, 인크사의 미국 특허 제5,336,596호에 기재된 바와 같이, 멤브레인 및 유사한 고상 지지체는 화학발광 시그날 강도 및 검출 감도를 증가시키기 위하여 중합성 멤브레인을 공급함으로써 최적화될 수 있다.
상기 기술된 디옥세탄은 효소적 분석과 관련하여 사용하기 위하여 특이적으로 제조된다. 따라서, 제거됨으로 분해 및 화학발광성을 유도하는 X 치환체는 구체적으로 효소에 의해서 특이적으로 제거되도록 고안된다. 효소가 검사될 시료에서 표적 분석물일 수 있고, 또는 표적 분석물은 프로브 (probe)에 부착된 리포터 (reporter) 분자, 항원 또는 항체, 또는 특이 결합쌍의 나머지 구성원의 존재를 검출하기 위한 특이 결합쌍의 임의의 구성원이 될 수 있다. 이러한 타입의 분석 형태는 널리 공지되어 있으며, 디옥세탄 화학발광성은 분석을 개선시킴으로써 고도로 효율적이고 간단하며 특정 표적의 민감한 검출을 달성할 수 있게 한다.
또한, 효소에 의한 제거에 민감하지는 않지만, 특정 종류의 화학 물질에 의해해서 제거될 수 있는 X를 선택할 수 있다. 미국 특허 제4,956,477호에는 다양한 종류의 화학식 I (여기서, X는 효소-분해가능한 기이거나 화학적으로 분해가능한 기, 예를 들어, 수소 원자, 알카노일 또는 아로일에스테르, 알킬 또는 아릴 실릴옥시 또는 유사한 기일 수 있다)의 디옥세탄을 제조하는 다양한 합성법을 기재하고 있다. 또한, 이러한 타입의 화합물은 미국 특허 제4,962,192호Schaap에 기재되어 있고, 여기서, 화학식 I의 X 잔기는 효소에 의해서 분해가능하거나 화학 물질에 의해서 제거될 수 있다. 가장 간단한 형태의 X는 수소이고, 이의 이탈은 여러 가지 "활성화제"에 의해서 유발될 수 있으며, 이들 중 가장 간단한 것은 수산화나트륨이다. 분해하는 X기의 제거에 의한 분해 반응은 두 개의 카르보닐 화합물을 생산하기 위한 디옥세탄 고리 중의 O-O 결합의 분해를 통하여 광을 생성하므로, 활성화기가 화학 물질인 경우, 활성화제 1 몰 당 1 포톤 (photon)의 광을 생성할 수 있다. 이는 상기 토의된 효소-개시가능한 디옥세탄과 대조적이며, 여기서 효소는 촉매로서, 기질로서 존재하는 많은 디옥세탄 분자의 분해를 유발시킨다. 이러한 촉매적 배가 효과는 효소-유발가능한 디옥세탄의 상업적 개발 및 허용을 가져왔다. 앞선 화학적으로 (비-효소적으로) 유발가능한 디옥세탄은 1995년 10월 19일에 사건 번호 제4085-097-27호로 출원된 미국 특허 출원 제08/545,174호의 주제이다.
따라서, 적당한 발광 속도로 적당한 화학발광성을 생성하고, 효소 및 비-효소적 화학 물질의 활성화제에 의해서 개시가능한 디옥세탄을 얻음으로써, 고도의 광강도, 개선된 효소 반응속도 및 고도의 민감성이 요구되는 분석에 사용할 수 있도록 하는 것이 당업자의 과제로 남아 있다.
<발명의 요약>
상기 목적, 및 하기 제시된 바에 의해 분명해진 기타 목적은, 보호기에 의존하여 효소적 개시제 또는 화학적 개시제에 의한 분해 및 화학발광이 개시되고, 디옥세탄의 2-탄소 상에 할로-치환된 알콕시 잔기의 제공으로 안정화기 및 아릴기 상에 선택되는 치환체로 인하여 강화된 감도, 효소 반응속도 및 광강도를 나타내는 신규 디옥세탄에 의해서 충족된다.
디옥세탄은 하기 나타낸 화학식 II의 화합물이다.
T는 폴리시클로알킬 디옥세탄, 바람직하게는 아다만틸 디옥세탄, 및 가장 바람직하게는 스피로아다만탄이다. X는 페닐 또는 기타 아릴이다. 미국 특허 출원 출원 제08/059,903호의 부분 계속 출원인 1994년 4월 25일에 출원된 미국 특허 출원 제08/231,673호, 지금은 미국 특허 제5,538,847호에 설명된 바와 같이, 아릴 잔기는, OZ기에 부가하여 염소 또는 메톡시와 같은 1 내지 3 개의 전자 활성기를 갖는다. 그의 전체적인 개시 사항은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되어 있다. 이러한 전자-활성 치환체의 종류를 선택함으로써, 반감기, 양자 수율, S/N비 등을 포함하여, 디옥세탄의 화학발광성의 특정 성질을 변화시킬 수 있다.
Z는 포스파타제로 제거되는 포스페이트기와 같이, 효소에 의해서, 또는 예를 들어, 수소 또는 치환된 실릴 잔기와 같이, 염기의 첨가에 의해서 제거될 수 있는 화학적 개시제에 의해서 제거될 수 있는 보호기이다.
R 잔기는 탄소 원자 1 내지 20개의 기로, 알킬, 아릴, 아르알킬 또는 시클로알킬이며, 이들 각각은 P, N, O 또는 S일 수 있는 1 내지 2 개의 헤테로 원자를 함유할 수 있으며, R은 할로겐화된다. 가장 바람직하게, R은 트리할로알킬 잔기이다.
본 명세서에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,952,707호에 기술된 치환 패턴과 유사한 양식으로, X가 나프틸이고, OZ가 디옥세탄 고리에 대한 나프틸 고리의 부착점에 대하여 바람직하게는 나프틸 고리에의 부착점에 있는 경우, 이들 부착점을 분리하는 고리 원자의 총수는 부착점의 고리 원자를 포함하여 모두 홀수이다.
폴리시클릭기 T는 전자 공여기 및 전자 흡인기를 포함하는 전자 활성기로 환될 수 있거나 비치환될 수 있다. 바람직한 치환체로는 히드록실, 할로 (바람직하게는 F 및 Cl) 및 알킬이다. R로 바람직한 예로는 플루오르화된 알킬, 아릴, 시클로알킬 또는 시클로아릴, 헤테로알킬이 있으며, 여기서, 탄소는 부분적으로 또는 전체적으로 불소 또는 염소 원자로 치환된다.
이러한 구조의 디옥세탄은 효소 또는 염기와 같은 개시제의 존재를 검출하는데 사용될 수 있고, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 미국 특허 제5,112,960호에 기재되어 있는 바와 같이 면역분석에, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 미국 특허 제4,978,614호에 서술된 바와 같이 단독으로 또는 인핸서와 배합된 형태로 사용될 수 있다.
이러한 인핸서는 통상적으로 천연 및 합성의 수용성 거대 분자이며, 미국 특허 제5,145,772호에 기재되어 있다. 바람직한 강화제로는 암모늄염 폴리(비닐벤질트리메틸암모늄 클로라이드)(TMQ), 폴리(비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드)(TBQ) 및 폴리(비닐벤질디메틸벤질암모늄 클로라이드)(BDMQ)와 같은 수용성의 중합성 4 급 오늄염 뿐 아니라 그들의 포스포늄 및 술포늄 카운터파트 (counterpart)가 있다.
<발명의 상세한 설명>
하기 화학식 II를 갖는 본 발명의 디옥세탄은 선택된 치환체의 특정 종류에 따라서 개선된 광강도, 효소 반응속도 및(또는) 감도를 나타낸다.
치환체 T는 원칙적으로 안정화 잔기로서 선택된다. 그러한 안정화 잔기가 없는 디옥세탄은 자발적으로 분해하거나 온화하게 승온된 열적 조건하에서 분해된다. 아다만틸기와 같은 폴리시클릭 잔기는 전체적으로 디옥세탄에 안정성을 부여한다. 바람직한 실시태양에서, T는 스피로아다만탄이다. 한 쪽 브릿지헤드 탄소 또는 양쪽 모두는 전자 활성 치환체를 가질 수 있으며, 이들은 효소 반응속도 및 광강도에 영향을 줄 수 있다. 각각의 브릿지헤드 탄소 (아다만트-2-일리덴 치환체 상의 5 및 7 위치 )는 독립적으로 수소, 히드록실기, 할로 치환체, 특히 불소 또는 클로로, 비치환된 직쇄 또는 분지된 탄소 원자 1 내지 6 개의 저급 알킬기, 히드록시 및 1 내지 3 개의 할로겐 또는 유사한 치환체로 모노- 또는 디-치환된 저급 알킬기, 수소 또는 저급 알콕시 치환체로 치환되거나 비치환된 페닐기, 시아노기, 아미드기, 및 전자를 공여하거나 전자를 흡인하는 기타 치환체일 수 있다.
화학식 II 중의 X는 여러 종류의 전자 활성 치환체인 종류로 부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3 개의 A 기로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 이들은 페닐 또는 나프틸 잔기 상의 A 치환체의 중요한 특성은 발광 속도를 변화시킬 수 있지만, 디옥세탄의 화학발광 운동성을 제어하지 못한다는 것이다. 바람직한 전자-활성 치환체는 클로로 또는 플루오로와 같은 할로겐; 메톡시, o-니트로-벤질옥시, 또는 폴리틸렌옥시와 같은 알콕시; 플루오로페녹시 또는 4-히드록시-3-메틸-나프트-1-옥시와 같은 아릴옥시; 트리메틸암모늄 또는 트리헥실암모늄과 같은 트리알킬암모늄; N-메틸-아세트아미도 또는 N-페닐-아세트아미도와 같은 알킬아미도; 벤조일아미노 또는 N-메틸벤졸아미도와 같은 아릴아미도; 페닐카르바모일 또는 니트로페닐카르바모일와 같은 아릴카르바모일; N-메틸벤질카르바모일 또는 t-부틸카르바모일과 같은 알킬카르바모일; 시아노; 니트로; t-부톡시카르보닐과 같은 에스테르; N-메틸메탄술폰아미도와 같은 알킬술폰아미도; N-메틸톨루엔술폰아미도와 같은 아릴술폰아미도; 트리플루오로메틸; 페닐, 벤조티아졸-2-일 또는 퀴나졸린-4-온-2-일과 같은 헤테로아릴; 메틸, 부틸, 페네틸과 같은 알킬; 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴 또는 t-부틸디페닐실릴과 같은 트리알킬-, 트리아릴- 또는 알킬아릴실릴; 디부틸아미도술포닐 또는 디페닐아미도술포닐과 같은 알킬 또는 아릴아미도술포닐; 메탄술포닐, 트리플루오로메탄술포닐 또는 벤젠술포닐과 같은 알킬 또는 아릴술포닐; 메틸티오, 부틸티오 또는 페닐티오과 같은 알킬 또는 아릴티오에테르이다. A 치환체의 크기는 통상적으로 용해도에 대한 중요도에 따라서 제한된다. 알킬 또는 R, R' 등에서, 알킬 잔기는 1 내지 12 개의 탄소 원자를 가져야 한다. 적당한 아릴 잔기로는 예를 들어, 페닐 및 나프틸이 있다. 특별히 바람직한 종류는 클로로 및 알콕시이다. 4 및 5 위치에서의 치환이 특히 바람직하다.
본 발명의 안정한 디옥세탄은 페녹시 또는 나프틸옥시기의 탈보호에 의해서, Z기가 제거됨으로써 화학발광을 유발한다. Z는 염기 또는 염의 첨가에 의해서 제거가능한 보호기이거나 효소-분해가능한 잔기일 수 있다. 따라서, Z는 H 또는 E3Si (여기서, E는 독립적으로 수소, 각각 1 내지 12 개 탄소 원자의 알킬, 아릴 또는 아릴알킬이다)일 수 있다. 달리, Z는 효소-분해가능한 잔기일 수 있다. 따라서, 적합한 효소와 잘 접촉시키면, Z는 페닐 고리에 부착된 산소를 남겨두고 분자로부터 분리되어 페녹시 음이온이 남게된다. Z는 포스페이트, 갈락토시드, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세리드, 1-티오-D-글루코시드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, α-D-글루코시드, β-D-글루코시드, β-D-글루쿠로니드, α-D-만노시드, β-D-만노시드, β-D-프럭토푸라노시드, β-글루코시두로네이트, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 에스테르, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 아미드, 포스포릴 콜린, 포스포릴 이노시톨, 포르포릴 에탄올아민, 포스포릴 세린, 디아실글리세롤 포스페이트 디에스테르 및 모노아실글리세롤 포스페이트 디에스테르일 수 있다. 포스포릴 및 포스페이트 에스테르 잔기는 예를 들어, 포스파타제에 의해서 분해될 수 있는 포스페이트기를 생성하는 포스포리파제에 의해서 분해될 수 있다. Z기 효소-분해가능한 기라면, 바람직하게는 포스페이트, 갈락토시드 또는 글루쿠로니드, 가장 바람직하게는 포스페이트이다. 바람직하게는, 페닐 고리 상에 치환될 때, OZ는 디옥세탄 고리에 부착점에 대하여 메타 위치, 즉, 3 위치를 차지한다.
R기는 직쇄 또는 분지된 알킬, 아릴, 탄소 원자 1 내지 20 개의 시클로알킬 또는 아릴알킬이다. R기는 P, N, S 또는 O일 수 있는 1 내지 2 개 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 치환체 R은 할로겐화된다. 할로겐화도는 아다만틸기, 아릴기 상의 치환체의 선택 및 계획된 특별한 용도를 위한 바람직한 효소 반응속도에 따라서 변할 것이다. 바람직한 기로는 트리할로 저급 알킬, 즉 트리플루오로에틸, 트리플루오로프로필, 헵타플루오로부티릴, 헥사플루오로-2-프로필, α-트리플루오로메틸 벤질, α-트리플루오로메틸 에틸 및 디플루오로클로로 부틸 잔기가 있다. 치환체 R의 탄소 원자는 부분적으로 또는 전체적으로 할로겐으로 치환될 수 있다. R이 아릴인 경우, 바람직한 기는 1 개 이상의 클로로, 플루오로 또는 트리플루오로메틸기로 치환된 페닐 고리, 예를 들어, 2,5-디클로로페닐, 2,4-디플루오로페닐, 2,3,5-트리플루오로페닐, 2-클로로-4-플루오로페닐 또는 3-트리플루오로메틸 페닐이다. 브롬 및 요오드는 특별한 환경에서 사용될 수 있지만, 불소 및 염소는 특히 바람직한 치환체이다.
할로겐 원자는 특별히 강하게 전자 흡인기로, 아다만틸, 아릴 및 R 치환체 상에서 몇몇 상이한 타입의 상호 작용과 관련된다. 부가적으로, 폴리할로알킬기는 널리 공지된 용해제이다. 따라서, R기 상의 할로겐화도 및 타입의 선택은 아다만틸 및 아릴기 상의 할로겐의 종류 및 존재 뿐 아니라 디옥세탄에 대한 바람직한 특성을 기준으로 선택될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 하나의 특별히 바람직한 디옥세탄은
이다.
본 발명을 설명하기 위하여, 유사한 구조를 갖는 기타 화합물을 제시하고 있다. "스타(star)" 명을 갖는, 이들 중 몇몇은 본 발명의 범위 내에 속한다. CSPD 및 TFE를 포함하는 비교 화합물은 비교 목적으로 제시되었다. CSPD는 미국 특허 제5,112,960호의 대상이다. TFE는 미국 특허 출원 제08/339,085호에 발표되어 있다. 이들 화합물은 본 발명의 구성 부분은 아니지만, 비교 목적으로 제시된다.
TFE-ADP-Star는 하기 합성법에 의해서 제조될 수 있다.
4-클로로-3-메톡시벤조일 클로라이드
4-클로로-3-메톡시벤조산 3.7 g을 클로로포름 3 ml로 적시고, 티오닐 클로라이드 6 ml을 아르곤 대기하에서 가하였다. 생성되는 페이스트를 환류시켰다. 몇 분 후에, 담황빛의 용액을 실온으로 냉각시키고, 또다른 치환된 벤조산 4.0 g을 가하였다. 혼합물은 다시 1 시간 동안 환류시켰다. 클로로포름 및 과량의 티오닐 클로라이드를 가능한 최소한의 온도에서 증류시키기 위하여 스틸 헤드 (still head)를 플라스크에 더하였다. 그 후, 생성물을 함유하는 스틸 폿 (pot) 잔사를 고상화시켰다. 석유 에테르 5 ml을 가하고, 약간의 열을 가하면서 고체를 용해시켰다. 실온으로 냉각시키고, 모액을 피펫으로 가만히 제거한 후, 남아있는 고체를 진공에서 펌핑하여 4-클로로-3-메톡시벤조일 클로라이드 7.3 g을 담갈색 고체로서 얻었다. 덜 순수한 물질을 추가의 1.03 g을 모액으로부터 얻을 수 있다.
2,2,2-트리플루오로에틸 4-클로로-3-메톡시벤조에이트
4-클로로-3-메톡시벤조일 클로라이드 2.3 g (11.2 밀리몰)을 칭량하여 아르곤 대기하에 둥근 플라스크에 투입하였다. 3 A 분자체 상에서 건조시킨 메틸렌 클로라이드 20 ml을 가하고, 트리플루오로에탄올 0.9 ml을 가하였다. 트리에틸아민 1.7 ml을 적가하는 동안, 용액을 아르곤 대기하, 10 ℃의 수욕 중에서 교반하였다. 실온으로 가온한 후, 슬러리를 1 시간 동안 교반하였다. 물 20 ml 및 염화메틸렌 10 ml을 플라스크에 가하였다. 혼합물을 분리형 깔대기로 이동시키고, 반응 플라스크를 염화 메틸렌으로 세척하였다. 하부 유기층을 제거하였다. 수층을 염화메틸렌 10 ml로 추출하였다. 합한 유기물을 물로 몇 번 세척하고, 코튼 (cotton)을 통과시킨 후, 회전-증발시켜 담갈색의 고화된 오일 2.55 g을 얻었다. 고체 TLC는 Rf값이 0.68인 한 점 (K5F; SiO2/메틸렌 클로라이드:헥산, 1:1)을 나타내었다. 적외선 스펙트럼은 1737 cm-1에서 C=O (에스테르) 스트레치를 보였다.
2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시-트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데크-2-일리덴메틸)아니솔
티타늄 트리클로라이드 7.9 g (51.3 밀리몰)을 칭량하여 아르곤 대기하에 글로브 백 (glove bag) 중의 둥근 플라스크에 투입하였다. 신선하게 증류된 테트라히드로푸란 (LAH로부터) 60 ml을 아르곤 흐름하에 재빨리 가하였다. 이러한 첨가는 발열 반응일 수 있으므로 조심해야 한다. 자주색 현탁액을 플라스크 벽에 부착되어 있는 고체가 분쇄되도록 격렬하게 교반하였다. 15 분 후에, 아연 가루 5.2 g을 아르곤 대기하에 계속 교반하면서 즉시 모두 가하였다. 적당한 발열은 부유된 검은 고상물을 포함하지 않는 적갈색 혼합물을 생성하였다. 15 분 교반 후, 트리에틸아민 11 ml을 공기를 배제하고 가하였다. 그 후, 혼합물을 2 시간 동안 환류시켰다. 2-아다만타논 3.0 g (20 밀리몰)의 용액, 및 건조 THF 중의 2,2,2-트리플루오로에틸-4-클로로-3-메톡시벤조에이트 2.6 g (10 밀리몰)을 약 65 분에 걸쳐 환류하는 갈색 혼합물에 적가하였다. 16 시간 동안 밤새 환류를 계속하였다. 용매를 냉각시킨 반응 혼합물로부터 회전 증발시켜 흑갈색 검을 얻었다. 이러한 검을 헥산 100 ml 및 에틸 아세테이트 20 ml로 분쇄하였다. 황색빛-주황색 상징액을 기울여 따라내고, 분쇄 과정을 반복하였다. 10 분간 교반한 후, 트리에틸아민 및 메탄올 각각 5 ml을 가하였다. 검이 굳기 시작하여 결국 고체 덩어리가 되었다. 고체를 부수고, 상징액은 가만히 따라내었다. 한번의 최종 분쇄는 20 % 에틸 아세테이트-헥산으로 수행되었다. 따라내어 합한 상징액을 회전 증발시켜 담황색의 반고상 페이스트를 생성하였다. 혼합물을 고온의 헥산 50 ml으로 처리하고, 약간의 불용성 물질을 제거하기 위해서 여과시켰다. 여액의 회전 증발 후, 얻어진 잔사를 소량의 따듯한 헥산의 슬러리로서 활성 I 산화알루미늄의 2.1 X 20 cm 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 헥산으로 용출시켜 아다만틸리덴 아다만탄을 얻었다. 10 % 디클로로메탄-헥산으로 계속 용출시켜, 2 개의 주요 미드(mid) Rf, UV-활성 성분을 포함하는 오일을 얻었다. 오일을 고온의 헥산 소량 중에 용해시켰다. 냉각시키며 침전된, 융점이 108 내지 112 ℃인, 0.71 g의 무색 고상 결정을 얻었다.
I.R. (CH2Cl2): 2920, 2850, 1590, 1572, 1485, 1465, 1450, 1400, 1203, 1160, 1100, 1065, 1035, 993, 965, 870, 828 cm-1.
1H NMR (400 MHz-CDCl3): δ1.75-1.96(m, 14H) 2.60(s, 1H); 3.27(s, 1H); 3.70-3.76 (m, 2H-CH2CF3); 6.80-6.89(m, 2H); 7.31-7.33(m, 1H).
2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시 트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데크-2-일리덴메틸) 페놀
수소화 나트륨 (무기 오일 중 60 %) 0.12 g을 아르곤 대기하에 헥산으로 3 회 세척하였다. DMF 6 ml을 가하고, 슬러리를 빙욕 중에서 0 ℃로 냉각시켰다. 자기 교반 후, 에탄티올 0.206 ml을 수소 가스의 발산과 함께 적가하였다. 그 후, 혼합물을 15 분에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시 트리시클로[3.3.1.13.7]데크-2-일리덴메틸) 아니솔 0.70 g을 아르곤 흐름하에서 고체로서 가하였다. 플라스크를 120 ℃의 오일욕 중에 넣고, 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 냉각시킨 혼합물을 에틸 아세테이트 : 헥산(1:1) 20 ml로 희석시켰다. 동일한 용량의 수성 1 M NH4Cl을 격렬하게 교반하면서 가하였다. 두 개의 상을 분리형 깔대기로 이동시키고, 거기서 유기층을 0.5 M NH4Cl 용액 20 ml로 다시 추출하고, 물 20 ml 용량으로 2 회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고 나서, 진공에서 펌프하여 오일성 생성물을 얻었다. TLC는 Rf 0.56에서 단일한 UV-활성점을 나타내었다 (K5F; 염화메틸렌 : 헥산, 1:1).
IR(순수): 3540 (OH), 3455 (OH), 2910, 285, 1600, 1570, 1482, 1447, 1410, 1280, 1100, 1052, 996, 887, 855, 823, 800, 732 cm-1.
디소듐 2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시 트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데크-2-일리덴메틸) 페닐 포스페이트
2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시 트리시클로[3.3.1.13.7]데크-2-일리덴메틸) 페놀 490 mg (1.31 밀리몰)을 건조 THF 10 ml 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 238 마이크로리터를 아르곤 대기하에 시린지로 적가하였다. 2-클로로-2-옥소-1,3,2-디옥사포스폴란 143 마이크로리터를 적가하는 동안, 용액을 빙욕중에서 냉각시켰다. 슬러리를 실온으로 가온시키고 3 시간 동안 교반하였다. 상징액을 아르곤 흐름하에서 코튼-팁(tip)의 시린지를 사용하여 트로에틸아민 히드로클로라이드로부터 제거하였다. 고체를 건조 THF 2 분량, 각각 5 ml로 세척하였다. 용매를 모아진 여액으로부터 제거하고 짚풀색의 검을 얻었다. 이를 건조 DHF 4 ml 중에 용해시키고, 아르곤 대기하에 건조 NaCN 0.077 g으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 50 내지 55 ℃의 진공중에서 제거하였다. 얻어진 주황색 검을 무수 메탄올 5.0 ml 중에 용해시키고, 소듐 메톡시드의 메탄올성 용액 (4.3 M) 320 ml을 적가하여 처리하였다. 실온에서 45 분간 교반한 후, 시료를 폴리머 래버러토리즈 PLRS-S 폴리스티렌 역상 칼럼상의 HPLC 분석을 위해 옮겨졌다. 0.1 % 중탄산나트륨에 대한 아세토니트릴의 농도 구배는 12.24 분에 용출하는 생성물을 보였다. 메탄올을 반응 혼합물로부터 제거한 후, 잔사를 물 50 ml에 용해시켰다. 이러한 용액을 여과시키고, 예비적으로 1 인치의 큰 PLRP-S 칼럼 상에 2 회 주입으로 정제하였다. 아세토니트릴/물 농도 구배를 사용하여 주요 생성물이 2 개의 별도의 분획 중에 수집되도록 하였다. 이들을 모아서 동결 건조시켜 약간 바랜 백색의 솜털같은 고체를 517 mg 얻었다.
1H NMR (D2O): δ1.79-1.96 (m, 14H); 2.65 (s, 1H); 3.22 (s, 1H); 4.01-4.08(m, 2H); 7.02-7.04 (m, 1H); 7.45-7.50 (m, 2H). 이 데이터는 구조를 뒤받침한다.
디소듐 2-클로로-5-(4-(2,2,2-트리플루오로에톡시) 스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데칸}-4-일-페닐 포스페이트 (TEF-ADF-Srar)
크로마토그래피시킨 디소듐 2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시 트리시클로[3.3.1.13.7]데크-2-일리덴메틸) 페닐 포스페이트 480 mg을 튜브 중에 넣고, 무수 메탄올 4 ml로 적시었다. 클로로포름 40 ml을 가하여 용액을 얻었다. 그 후, 클로로포름 3 ml중의 테트라페닐포르핀 (TPP) 용액 6 mg을 가하여 분홍빛 자주색 반응 혼합물을 얻었다. 파스테르 피펫을 통하여 산소를 살포하는 동안, 용액을 빙욕중에서 냉각시켰다. 400 와트 나트륨 진공 램프로 조사된 용액을 3.0 mil 두께의 듀폰사의 카프톤 필름으로 여과시키는 동안, 기체 흐름은 계속되었다. 이를 40 분 후, 소량의 시료를 방출시켜 0.1 % NaHCO3을 함유하는 물에 용해시켰다. 출발 물질에 대하여 상기 기술된 조건하에 HPLC 분석 결과, 신규 생성물이 12.1 분에 용출되었음을 나타내었다. 12.5 분에 용출되는 출발 물질은 단지 극소량으로 존재하였다. 반응물에서 용매를 제거하고 펌프하여 흑적색의 거품을 얻었다. 이것을 0.5 M NaOH 5 방울을 함유하는 물 80 ml 중에 용해시켰다. 용액을 여과하여 불용성 물질을 제거하고, 예비적으로 1 인치 PLRP-S 칼럼 (Polymer laboratories) 상에서 아세토니트릴/물 농도 구배를 사용하여 크로마토그래피하였다. 생성물 피크를 앞부분과 뒤부분은 잘라내고, 단지 중간 컷(cut)만 수집하였다. 이러한 용출물을 동결 건조하여 백색 고체로서 생성물 293 mg을 얻었다. 생성물이 1,2-디옥세탄이라는것은 알칼리성 포스파타제와 함께 효소적으로 유발시킴으로써 빛을 생성하는 것으로 확인되었다.
1H NMR (400 MHz, D2O): δ 0.87-0.90 (d, 1H); 1.17-1.20 9d, 1H); 1.20-1.71 (m, 10H); 2.17(s, 1H); 2.86 (s, 1H); 3.83 (br.m, 2H); 7.11 (br.m, 1 H); 7.38-7.40 (m, 1H); 7.68 (br.m, 1H). 이 데이터는 화합물의 구조를 뒤받침한다.
TFE-CDP-Star는 하기 합성법으로 제조될 수 있다.
2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)-(5'-클로로트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데크-2-일리덴메틸 아니솔
티타늄 트리클로라이드 10.1 g (65.6 밀리몰)을 칭량하여 아르곤 대기하에 글로브 백 중의 둥근 플라스크에 투입하였다. 신선하게 증류된 테트라히드로푸란 (LAH로부터) 70 ml을 아르곤 흐름하에 재빨리 가하였다 (이러한 첨가는 발열일 수 있으므로 조심해야 한다). 자주색 현탁액을 플라스크 벽에 부착되어 있는 고상 물이 분쇄되도록 격렬하게 교반하였다. 15 분 후에, 아연 가루 7.1 g을 아르곤 대기하에 계속 교반하면서 모두 즉시 가하였다. 적당한 발열은 부유된 흑색 고체를 포함하지 않는 적갈색 혼합물을 생성하였다. 20 분 교반 후, 혼합물을 빙욕중에서 냉각시키고, 트리에틸아민 몇 방울을 공기를 배제하고 가하였다. 발열 후, 부가적 N(Et)312 ml을 가하였다. 그 후, 혼합물을 2 시간 동안 환류시켰다. 5-클로로-2-아다만타논 3.7 g (20 밀리몰) 및 건조 THF 40 ml중의 2,2,2-트리플루오로에틸 4-클로로-3-메톡시벤조에이트 2.6 g (10 밀리몰)을 약 35 분에 걸쳐 환류하는 갈색 혼합물에 적가하였다. 2.5 시간 동안 환류를 계속하고, TLC 결과, 비반응된 에스테르 출발 물질을 보였다. 부가적 클로로아다만타논 1.10 g을 아르곤 흐름하에 고체로서 가하였다. 2.5 시간 더 환류시킨 후, 냉각시킨 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 냉각시킨 반응 혼합물로부터 회전 증발시켜 흑갈색의 검을 얻었다. 이러한 검을 헥산 100 ml 및 에틸 아세테이트 20 ml로 분쇄하였다. 황색빛 주황색의 상징액을 기울여 따라내고 분쇄 공정을 반복하였다. 10 분간 교반한 후, 트리에틸아민 및 메탄올을 각각 2 ml씩 가하였다. 검이 굳기 시작하였고, 결국 고체 덩어리가 되었다. 그 고체를 분쇄하고 상징액을 기울여 따라냈다. 한번의 최종적인 분쇄를 5 % 에틸 아세테이트-헥산으로 수행하였다. 가울여 따라내 합한 상징액을 것을 회전 증발시켜 담황색 오일을 얻었다. 여액을 회전 증발시킨 후 얻어진 잔사를 실리카겔의 2.1 x 20 cm 칼럼에 적용시켰다. 칼럼은 헥산 중의 5 내지 10 % 에틸아세테이트로 용출시켜, 보다 위와 아래에 요오드에 민감한 점으로 오염된 미드 Rf UV-활성점을 포함하는 5 개 분획으로 얻었다. 이러한 분획들을 회전 증발시켜 반고상의 페이스트 2.52 g을 얻었다. I.R 스펙트럼 결과, 1583 및 1567 cm-1에서 흡수를 나타내었다. 순수하지 못한 생성물이 다음 반응 단계에서 직접 사용되었다.
2-클로로-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시)-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데크-2-일리덴메틸)페놀
수소화나트륨 (60 % 분산액, 240 mg.; 6.0 밀리몰)을 아르곤 대기하에 헥산으로 3 회 세척하였다. DMF 17 ml을 가하였다. 냉각된 슬러리를 시린지로부터 에탄티올 (450 마이크로리터; 6 밀리몰)로 적가 처리하였다. 이 용액을 실온으로 가온한 후, 수소의 방출이 종결되었다. 용액을 아르곤 대기하에 피펫으로 진행중인 반응의 생성물에 가하였다. 혼합물을 교반하고 아르곤 대기하에 120 ℃에서 1.25 시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 반응 혼합물을 1 M 암모늄 클로라이드 용액 70 ml에 대하여 에틸 아세테이트 중의 40 % 헥산 70 ml로 분배하였다. 물로 3 회 다시 세척한 후, 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하고 잔사를 50:50 에틸 아세테이트/헥산, 그 후, 에틸아세테이트, 또는 마지막으로 에틸 아세테이트 중의 2 메탄올을 사용하여 산화알루미늄 상에서 크로마토그래피하였다. 보다 낮은 Rf 생성물을 2 분획으로부터 호박색 검으로서 0.58 g을 얻었다. PMR 스펙트럼은 불순물을 보였지만, 목적하는 생성물의 주요 흡수가 하기에서 발견되었다.
1H NMR (400 MHz-CDCl3): δ 1.56-2.21 (m, 13H); 2.73 (s, 1H); 3.45 (s, 1H); 3.70-3.76, (m, 2H-CH 2CF3); 5.62 (br. s., 1H); 6.78-7.33 (m, 3H).
생성물이 하기와 같은 시아노에틸 포스페이트 디에스테르 에놀 에테르로 전환되기에 충분히 순수하다는 것을 알았다.
건조 THF 12 ml 중 페놀 1.2 g (2.95 밀리몰)을 트리에틸아민 535 마이크로리터로 처리하였다. 2-클로로-2-옥소-1,3,2-디옥사포스폴란 (326 마이크로리터, 3.54 밀리몰)을 시린지로 적가하는 동안, 혼합물을 아르곤 대기하에 0 ℃에서 교반시켰다. 생성되는 현탁액을 실온에서 3 시간 동안 교반하고 아르곤 대기하에 여과시켰다. 침전물을 3:1의 건조 THF/건조 에테르를 3 X 10 ml로 세척하였다. 여액을 펌핑하여 호박색 오일을 생성하고 이를 무수 DMF 7 ml 중에 용해시켰다. 용액을 건조 NaCN 60 mg로 처리하고, 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 50 ℃의 진공에서 제거하여 주황색의 점착성 시아노에틸포스페이트 디에스테르를 얻고 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디소듐 3-(4-(2,2,2-트리플루오로에톡시)스피로{1,2-디옥세탄-3,2'(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.1 3.7 ]데칸}-4-일)페닐 포스페이트
포스페이트 디에스테르를 튜브내에 넣고 무수 메탄올 4 ml로 적시었다. 클로로포름 40 ml을 가하여 투명한 용액을 얻었다. 그 후, 클로로포름 3 ml 중 테트라페닐포르핀 (TPP) 용액 6 mg을 가하여 분홍빛 자주색 반응 혼합물을 얻었다. 파스테르 피펫으로 5 분간 산소를 살포하면서 용액을 빙욕 중에서 냉각시켰다. 3.0 mil 두께의 듀폰사의 카프톤 필름으로 여과시킨 용액을 400 와트 나트륨 진공 램프로 조사하는 동안, 기체 흐름은 계속되었고, 이를 3.0 mil 두께의 듀폰 캅톤 필름으로 여과하였다. 1.5 시간 후, 소량의 시료를 방출시켜 NaOH을 함유하는 물에 용해시켰다. 상기 기술된 조건하에 이렇게 염기화된 시료를 HPLC 분석한 결과, 주요 생성물이 12.6 분에 용출되었음을 나타내었다. 이러한 피크의 수집, pH 10의 수성 디에탄올아민 완충액으로 희석 및 과량의 알칼리성 포스파타제의 첨가로 3 분간 빛이 지속되는 폭발이 있었다. 반응물에서 용매를 제거하고 펌프하여 흑적색의 검을 얻었다. 이를 메탄올 10 ml중에 용해시키고, 메탄올 중의 4.37 M 소듐 메톡시드 690 마이크로리터로 처리하였다. 실온에서 40 분 후, 메탄올의 반을 회전 증발로 제거하였다. 물 60 ml을 가하고 용액을 0.45 미크론 나일론 필터를 통하여 여과시키고, 물 20 ml 부가적으로 세척하였다. 이러한 용액을 예비적으로 아세토니트릴/물 농도 구배를 사용하여 1 인치의 PLRP-S 칼럼 (Polymer laboratories) 상에서 크로마토그래피하였다. 생성물 피크를 앞부분과 뒤부분은 잘라내고, 단지 중간 컷만 수집하였다. 이러한 용출물을 동결 건조하여 백색 고체로서 생성물 605 mg을 얻었다.
1H NMR (400 MHz-D2O): δ 0.82-2.22 (m, 11H): 2.38 (br. s., 1H); 3.05(s, 1H); 3.86 (br. m., 2H); 7.10-7.71 (m, 3H)
위티히-호너-에몬스 (Wittig-Honer-Emmons) 합성 경로
본 발명의 플루오로알콕시 1,2-디옥세탄의 합성의 별법은 α-플루오로알콕시 아릴메탄 포스포네이트 에스테르를 2-아다만타논 또는 치환된 2-아다만타논과의 위티히-호너-에몬스 축합과 관련헌다. 코네니그크래머 및 짐머 (Konenigkrammer and Zimmer, J. Org. Chem., 45, 3994-3998. 1980)는 벤즈알데히드를 트리에틸포스파이트 및 클로로메틸실란과의 반응으로 디에틸 1-트리메틸실옥시-1-페닐메탄포스포네이트을 얻는다고 설명한다. 또한, 크리어리 및 운데리너 (Creary and Underiner, J. Org. Chem., 50, 2165-2170, 1985)는 관련된 α-트리메틸실옥시 치환된-페닐메탄포스포네이트 에스테르를 α-메실옥시 또는 α-트리플록시 유도체를 경유하여 상응하는 α-플루오로알콕시 포스포네이트로의 전환을 상세히 설명한다. 트리플루오로에탄올과 함께 이러한 경로를 이용하여, 가능한 플루오르화된 알코올 중의 하나, 4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드는 디에틸 1-(2,2,2-트리플루오로에톡시)-1-(4-클로로-3-메톡시페닐)메탄 포스포네이트를 생산한다. 그 후, 이를 5-클로로-2-아다만타논과 함께 축합하여 에놀 에테르를 얻고, 후속해서 제시된 실시예에 따라서 효소 유발가능한 디옥세탄으로 전환시켰다.
또는, 당업자는 적당한 알코올 또는 페놀을 나트륨염을 보조의 은염의 존재하에 알데히드의 벤질 할라이드 유도체와 반응시켜, 할로알킬 또는 할로아릴 아세탈을 얻을 수 있고, 그 후, 위티히-호너-에몬스 반응에 의해서 기타 아릴메틸 포스포네이트 및 에놀 에테르를 합성하는데 이용될 수 있다는 것을 알았다.
4-클로로-3-메톡시페닐(2,2,2-트리플루오로에톡시)디에틸-포스포네이트의 합성
2,2,2-트리플루오로에톡시디에틸포스포네이트 (하기 화합물 3)를 4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드 디클로로아세탈 (하기 화합물 1)로부터 얻어진 비스(2,2,2-트리플루오로에틸)4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드 아세탈 (하기 화합물 2)로부터 합성하였다.
4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드 디클로로아세탈 (1)
4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드 (1.5 g, 8.8 밀리몰)을 아르곤 대기하에 PCI5(2.45 g, 11.8 밀리몰)에 가하고 15 분간 교반시켰다. 그 동안, 용해된 혼합물로부터 열이 발산되었다. 염화메틸렌 (3 ml)을 가하고, 그 용액을 실온에서 밤새 교반하였다; TLC 분석 결과, 남겨진 출발 벤즈알데히드로부터 소량의 UV 활성을 보였다. 부가적 CH2Cl215 ml 및 포화된 NaHCO3용액 (40 ml)을 가하고, 그 용액을 1 시간 동안 실온에서 교반시키고 반응물을 급냉시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2및 물 사이에 분배시키고, 수층을 CH2Cl2로 일단 세척한 후, 합한 유기층을 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증발시킨 후 생성물을 회수하고 펌프하여 고압의 진공하에서 건조시켰다. 4 % EtOAc/헥산으로 용출시키는 실리카겔 상에서 오일을 정제한 후, 담황색 오일로서 디클로로아세탈 1을 1.73 g (87 %) 얻었다.
1H NMR (CDCl3ppm): 3.94 (3H, s); 6.65 91H, s); 7.03 (1H, dd, J=2 Hz, 8 Hz); 7.15 (1H, d, J=2 Hz); 7.35 (1H, d, J=8 Hz)
비스(2,2,2-트리플루오로에틸)4-클로로-3-메톡시벤즈알데히드 아세탈 (2)
디클로로아세탈 1 (835 mg, 3.7 밀리몰)을 2,2,2-트리플루오로에탄올 (4 ml) 중에 용해시키고, 0 ℃로 냉각하였다. 수소화나트륨 (429 mg, 오일 중 60 %, 10.7 밀리몰)을 저온에서 용액 중에 분할 첨가하여, 동일계내에서 소듐 2,2,2-트리플루오로에타노에이트를 생성하였다. 무수 탄산은 (2.1 g, 7.6 밀리몰)을 가한 후, 반응 혼합물을 1 시간 동안 80 ℃에서 가열하고 아세틸화를 수행하였다. 냉각 후, 물 및 EtOAc를 교반하면서 가하고, 그 용액을 코튼 플러그 (plug)를 통하여 여과시켜 고체를 제거하였다. 고체를 EtOAc로 충분히 세척하고, 생성되는 유기 용액을 EtOAc 및 물로 분배시켰다. EtOAc 용액을 Na2SO4상에서 건조시키고, 기울여 따라내 증발시켜 오일을 얻고 실리카겔 칼럼 (0 내지 1 % EtOAc/헥산)상에서 정제하여 트리플루오로에틸아세탈 2를 오일로서 1.13 g (86 %) 얻었다. 소량의 생성물 (42 mg)을 분광 분석용으로 예비 TLC 플레이트 상에서 추가 정제하였다.
IR (CHCl3, nm-1): 2940, 1590, 1580, 1482, 1457, 1405, 1267, 1164, 1064, 1029, 964, 870
1H NMR (CDCl3ppm): 3.83-3.94 (4H, m); 3.90 (3H, s); 5.82 (1H, s); 7.00-7.02 (2H, m); 7.39 (1H, d, J=8.5 Hz)
4-클로로-3-메톡시페닐(2,2,2-트리플루오로에톡시)디에틸포스포네이트 (3)
트리에틸 포스페이트 (530 ㎕, 3.1 밀리몰) 및 보로 트리플루오리드 에테레이트 (420 ㎕, 3.4 밀리몰)을 0 ℃의 아르곤 대기하에, CH2Cl2(10 ml)중에 용해된 트리플루오로아세탈 2 (1.09 g, 3.1 밀리몰)에 가하였다. 반응 혼합물을 3 시간에 걸쳐 교반하면서 실온으로 가온시켰다. 이 시간 동안, 부가적 트리에틸 포스파이트 (100 ㎕, 0.6 밀리몰) 및 보론 트리플루오라이드 에테레이트 (250 ㎕, 2.0 밀리몰)을 가하고 반응을 종결하였다. 그 용액을 CH2Cl2및 희석된 염수 간에 분배시키고, 수층을 CH2Cl2로 잘 세척하였다. 그 후, 합한 유기층을 포화된 NaHCO3로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시켜 기울여 따라내고 증발시켰다. 무색 오일을 헥산으로 충전된 실리카겔 칼럼 상에서 정제하고 0 내지 50 % EtOAc/헥산으로 용출시켜, 투명한 오일로서 포스포네이트 3을 752 mg (62 %) 얻었다. 소량의 오일 시료 (47 mg)를 추가로 분광 분석용으로 예비 TLC 플레이트 상에서 추가 정제하였다.
IR (CHCl3, nm-1): 2990, 1590, 1581, 1484, 1460, 1410, 1277, 1255, 1165, 1113, 1051, 1030, 970
본 발명자들은 하기 디옥세탄에 대한 화학발광성 반감기 (t1/2)를 비교하였다.
디포스포릴화된 디옥세탄의 화학발광성 반감기의 측정
각 디옥세탄 (0.004 밀리몰)의 1 ml 분량을 pH 10, 1 mM MgCl2, 0.1 M 디에탄올아민 중에서 30 ℃로 평형시켰다. 알칼리성 포스파타제 (1.05 X 10-9M의 최종 농도에서)를 테스트 튜브에 가하고 화학발광 시그날 반응속도를 터너 (Turner) TD-20E 발광측정기 (luminometer)로 10 내지 20 분 동안 측정하였다. 반감기를 Log RLU 대 시간의 플롯으로부터 계산하였다. TFE 및 TFE-ADP-Star에 대하여, 또한 화학발광 반감기를 사피르 (Sapphire) II 인핸서 (0.1 M 디에탄올아민, 1 mM MgCl2, 10 % 폴리비닐벤질트리부틸 암모늄 클로라이드 1 mg/ml)의 존재하에 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
디옥세탄 T1/2 (분)
TFE-ADP-Star 2.0
TFE 0.9
ADP-Star 2.7
CDP-Star 1.2
CSPD 0.6
TFE/사피르 II 15.5
TFE-ADP-Star/사피르 II 5.0
디포스포릴화된 디옥세탄의 피크 광강도의 측정
디옥세탄 (0.004 밀리몰)의 0.5 ml 분량을 pH 10, 1 mM MgCl2, 0.1 M 디에탄올아민 중에서 30 ℃로 평형시켰다. 알칼리성 포스파타제 (1.05 X 10-9M의 최종 농도)를 튜브에 가하고 화학발광 시그날를 터너 TD-20E 발광측정기로 10 내지 20 분간 측정하였다. 피크 광강도를 기록하고 표 2에 나타내었다.
디옥세탄 피크의 강도(RLU)
TFE-ADP-Star 390
TFE 282
ADP-Star 682
CDP-Star 863
CSPD 200
나일론 멤브레인 상에서 바이오티닐화된 pBR322 (35 mer)의 검출
바이오티닐화된 pBR322 (35 mer)의 일련의 희석물을 트로필론-플러스 (Tropilon-Plus) 나일론 멤브레인 위에 점을 찍었다. 그 점들은 바이오티닐화된 pBR322 (35 mer)의 210 pg, 70 pg, 23.3 pg, 7.7 pg, 2.6 pg, 0.86 pg, 0.29 pg, 0.10 pg, 32.0 fg, 10.7 fg, 3.6 fg 및 1.2 fg에 상응한다. 점을 찍은 후, DNA를 UV 고정에 의해서 멤브레인에 교차결합시키고, 멤브레인을 포스페이트 완충된 염수 (PBS) 중의 0.2 % I-블록, 5 % 소듐 도데실 술파이트 (SDS)로 차단시키고, 차단 완충액 중의 Avidx-AP 1 내지 5000 희석물을 30 분간 인큐베이션하고, PBS 중의 5 % SDS로 5 분 동안 2 회 세척하고 분석 완충액으로 2 회 세척한 후, 분석 완충액 중 0.25 mM의 디옥세탄 중에서 5 분간 인큐베이션하고 5 분 동안 X-레이 필름에 노출시켰다. 멤브레인 스트립(strip)을 CSPD와 함께 인큐베이션시키고, TFE를 pH 9.5, 1 mM MgCl2, 0.1 M 디에탄올아민로 세척하였다. CSPD 및 TFE에 대한 분석 완충액은 pH 9.5, 1 mM MgCl2, 0.1 M 디에탄올아민이었고, CD-Star 및 TFE-ADP-Star에 대한 분석 완충액은 pH 9.0의 동일한 완충액이다. 5 분 정도 노출 후에 얻어진 검출 감도를 표 3에 나타내었다.
디옥세탄 DNA 농도 (피코그람)
TFE-ADP-Star 0.0107
TFE 7.7
CDP-Star 0.86
CSPD 23.3
실험 데이터의 비교 결과, AMPPD (TFE) 상의 할로알콕시 치환체의 존재는 완충 용액 내에서 화학발광성 반감기 (AMPPD에 대한 t1/2은 2.1 분이고, TFE에 대한 t1/2은 0.9 분이다)를 감소시킨다고 나타났지만, 인핸서의 존재에서 t1/2은 15 분으로 증가하였다. 이들 디옥세탄은 용액 인핸서 (예를 들어, TBQ, TB, 또는 LumiPhos 430같은 CTAB-형광 (fluorescenin) 중에서 또는 표면 인핸서 (예를 들어, 나일론 멤브레인)에 의해서 강화되는 경우 특히 공업적으로 유용하다. 그러나, 페닐 고리상에 전자 활성 치환체가 없는 TFE는 어떠한 잇점도 주지 않는다. 또한, 완충액 중의 그 자체로도, CSPD 반감기가 TFE보다 더 짧았다. 표 2의 피크 강도 데이터는 화학발광 시그날 강도의 비교 또는 상대적 발광 효능을 나타낸다. 그 결과, TFE-ADP-Star가 보다 높은 강도 시그날를 생성함을 뚜렷하게 나타내었다. 보다 우수한 통상적인 유용성이 TFE-ADP-Star에 의해서 제시되었다.
표 3은 나일론 멤브레인 상의 DNA 검출용 블롯팅 (blotting) 용도에서 이들 디옥세탄의 비교를 나타내었다. 이 데이터는 TFE 또는 기타 화합물는 존재하지 않는 TFE-ADP-Star의 예상외의 유용성을 보였다. TFE-ADP-Star는 TFE보다 거의 1000 배보다 적은 DNA를 검출한다. 이러한 특별한 적용에서, TFE-ADP-Star는 또한 CDP-Srar보다 좀더 민감하다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 디옥세탄은 시료 중의 효소 뿐 아니라 핵산의 존재를 검출하는 리포터 분자의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 디옥세탄을 이용할 수 있는 광범위한 분석 및 분석 형태가 있으며, 모두가 탈보호된 옥시음이온 분해의 시각적으로 검출가능한 화학발광성을 이용하여 시료 중에 특별한 물질의 존재 및(또는) 농도를 나타낸다.
예를 들면, 본 발명을 사용하여 시료 중의 효소를 검출할 때, 시료를 효소에 의해서 분해될 수 있는 기를 함유하는 디옥세탄과 접촉시켜 검출한다. 효소는 디옥세탄의 효소 분해가능한 기를 분해하여 음으로 하전된 치환체 (예를 들어, 산소 음이온)를 형성한다. 이렇게 음으로 하전된 치환체가 이번에는 디옥세탄을 불안정화하여 분해시키고 광에너지를 발산하는 형광 발색단를 형성한다. 효소의 존재를 나타내는 것으로써 검출되는 것이 이 발색단이다. 또한, 발광의 강도를 측정함으로써 시료 중 효소 농도도 측정할 수 있다.
상기 설명된 디옥세탄은 허용가능한 조건하에서 임의의 리포터 분자를 기재로한 분석에 사용될 수 있다. 그러한 분석의 예로, 예를 들어 δ- 또는 β-hCG와 같은 항원 또는 항체를 검출하는 면역 분석; 효소 분석; 예를 들어, 칼륨 또는 나트륨 이온을 검출하는 화학 분석; 및 예를 들어, 비루스 (예를 들어, HTLT III 또는 사이토메갈로비루스(cytomegalovirus)) 또는 세균 (예를 들어, 이. 콜리 (E.Coli)) 및 특정 세포 기능들 (예를 들어, 리포터 결합 위치)를 검출하는 핵산 분석이 있다.
검출성 물질이 항체, 항원, 또는 핵산인 경우, 디옥세탄의 효소 분해가능한 기를 분해할 수 있는 효소가 바람직하게는, 예를 들어, 항원, 항체 또는 핵산 프로브와 같은 검출성 물질에 대하여 특이적 친화성을 갖는 물질 (즉, 검출성 물질에 특이적으로 결합하는 물질)에 결합된다. 종래 방법, 예를 들어, 카르보디이미드 커플링 방법은 효소를 특이적 친화성 물질에 결합시키는데 사용되며, 바람직하게는 아미드 결합을 통하여 결합된다.
통상, 분석은 하기와 같이 수행된다. 검출성 물질을 포함한다고 생각되는 시료를, 검출성 물질에 대하여 특이적 친화성을 갖는 물질에 결합된 효소를 함유하는 완충된 용액과 접촉시킨다. 생성되는 용액을 인큐베이션하고, 검출성 물질로 하여금 특이적 친화성-효소 복합체의 특이적 친화성 부분에 결합할 수 있도록 한다. 과량의 특이적 친화성-효소 복합체를 세척하고, 특이적 친화성-효소 복합체의 효소 부분에 의해서 분해가능한 기를 갖는 디옥세탄을 가한다. 효소는 효소 분해가능한 기를 분해하여, 디옥세탄으로 하여금 2 개의 카르보닐 화합물 (예를 들어, 에스테르, 케톤 또는 알데히드)로 분해한다. 따라서, 효소 분해가능한 기가 결합되어 있는 발색단은 여기되어 발광한다. 발광은 (큐베트(cuvette), 또는 카메라 발광측정기 중의 광-민감성 필름, 또는 광전자 세포 또는 광배율기 튜브를 사용하여) 검출되고, 검출성 물질의 존재도 동일하게 검출된다. 발광 강도를 측정하여 물질의 농도를 결정한다.
고체 상태 분석에서, 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,336,596호의 특이적 멤브레인이 특히 유용하게 사용될 수 있다. 분석에서 기타 멤브레인 뿐 아니라 다른 고체상의 사용으로, 예를 들어, BSA 또는 젤라틴과 같은 비특이적 단백질로 전처리함으로써 고체상 매트릭스에 결합하는 비-특이적 결합을 차단함으로써 개선시킬 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,326,882호에 서술된 바와 같이, 비-특이적 결합은 멤브레인에 여러 가지 중합성 4 급 오늄염을 사용함으로써 차단시킬 수 있다.
별법으로, 미국 특허 제4,978,614호 및 계류중인 미국 특허 출원 제08/031,471호에 기술된 것과 같이, 중합성 4 급 오늄 (포스포늄, 술포늄 및 암모늄) 4 급 염을 사용할 수 있다. 이들 인핸서는 단독으로 또는 Zelec DP와 같은 계면활성제와 배합하여 사용될 수 있다. 수성 상태에서의 이들 인핸서는 소수성 탈보호된 옥시음이온을 격리시키고, 실질적으로 물을 분해 및 화학발광이 일어나는 미세 환경 (microenvironment)으로부터 배제시킨다. 물은 화학발광을 "급히 중지시키는" 경향이 있기 때문에, 소수성 인핸서에 의한 물의 배제는 상기 실험에서 기술한 바와 같이 화학발광성을 극적으로 개선할 수 있다.
본 발명의 디옥세탄, 및 그들의 용도 및 제조법을 통상적으로, 또한 특이적 실시예를 들어 설명하였다. 실시예는 제한하고자 제시된 것이 아니다. 당업자들은 발명적 고안없이도 기타 치환체의 종류, 특성 및 분석을 알 수 있을 것이다. 하기 제시된 청구항의 표현 서술에 의해서 제외되지 않는 한, 그러한 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식의 화합물.
    상기 식에서,
    T는 한 쪽 또는 양쪽 브릿지헤드 탄소에서 치환되거나 비치환된 스피로아다만틸이며, 상기 치환체는 히드록실기, F, Cl, 비치환된 직쇄 또는 분지쇄의 탄소 원자 1 내지 6 개의 알킬기, 히드록시 또는 1 내지 3 개의 할로겐 원자로 모노-, 디- 또는 트리-치환된 탄소 원자 1 내지 6 개의 알킬기, 페닐기, 시아노기 및 아미드기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    X는 1 내지 3 개의 전자 활성 치환체를 갖는 페닐 또는 나프틸이며, 상기 전자 활성 치환체는 각각 할로겐, 알콕시, 아릴옥시, 트리알킬암모늄, 알킬아미도, 아릴아미도, 아릴카르바모일, 알킬카르바모일, 시아노, 니트로, 에스테르, 알킬- 또는 아릴술폰아미도, 트리플루오로메틸, 아릴, 알킬, 트리알킬, 트리아릴실릴, 알킬아릴실릴, 알킬- 또는 아릴아미도술포닐, 알킬- 또는 아릴술포닐, 및 알킬- 또는 아릴티오에테르 (여기서, 각 경우에 알킬 또는 아릴 잔기 각각은 탄소원자 1 내지 12 개로 이루어진다)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    Z는 효소 분해가능한 잔기, H 또는 E3Si (여기서, 각 E는 독립적으로 H, 탄소 원자 1 내지 12 개의 알킬, 아릴 또는 아르알킬이다)이고;
    R은 탄소 원자 1 내지 20 개의 알킬, 아릴, 아르알킬 또는 시클로알킬이며, 이들은 P, N, S 및 O로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2 개의 헤테로 원자를 함유할 수 있고, R은 1 개 이상의 할로겐 치환체를 갖는다.
  2. 제1항에 있어서,
    T가 비치환되고,
    X가 1 내지 3 개 염소 원자로 치환된 페닐이고,
    Z는 포스페이트, 갈락토시드, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세리드, 1-티오-D-글루코시드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, α-D-글루코시드, β-D-글루코시드, β-D-글루쿠로니드, α-D-만노시드, β-D-만노시드, β-D-프럭토푸라노시드, β-글루코시두로네이트, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 에스테르, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 아미드, 포스포릴 콜린, 포스포릴 이노시톨, 포스포릴 에탄올아민, 포스포릴 세린, 디아실글리세롤 포스페이트 디에스테르, 모노아실글리세롤 포스페이트 디에스테르, H 및 E3Si (여기서, 각 E는 독립적으로 수소, 탄소 원자 1 내지 12 개의 알킬, 아릴 또는 아르알킬이다)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 분해가능한 잔기이고,
    R은 3 개 이상의 할로겐 원자를 갖는, 탄소 원자 1 내지 20 개의 알킬인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    T가 한 쪽 또는 양쪽의 브릿지헤드 탄소에서 치환되고,
    X가 1 내지 3 개의 염소 원자로 치환된 페닐이고,
    Z는 포스페이트, 갈락토시드, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세리드, 1-티오-D-글루코시드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, α-D-글루코시드, β-D-글루코시드, β-D-글루쿠로니드, α-D-만노시드, β-D-만노시드, β-D-프럭토푸라노시드, β-글루코시두로네이트, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 에스테르, p-톨루엔술포닐-L-아르기닌 아미드, 포스포릴 콜린, 포스포릴 이노시톨, 포스포릴 에탄올아민, 포스포릴 세린, 디아실글리세롤 포스페이트 디에스테르, 모노아실글리세롤 포스페이트 디에스테르, H 및 E3Si (여기서, 각 E는 독립적으로 수소, 탄소 원자 1 내지 12 개의 알킬, 아릴 또는 아르알킬이다)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 분해가능한 잔기이고,
    R은 3 개 이상의 할로겐 원자를 갖는, 탄소 원자 1 내지 20 개의 알킬인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    T가 1 또는 2 개의 염소기로 치환되고,
    X가 파라 위치에서 염소기로 치환된 페닐이고,
    Z는 포스페이트기이고, 또한
    R이 탄소 원자 1 내지 6 개의 트리플루오로알킬인 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    T가 비치환되고,
    X가 파라 위치에서 1 개의 염소기로 치환된 페닐이고,
    Z가 포스페이트기이고,
    R이 탄소 원자 1 내지 6 개의 트리플루오로알킬인 화합물.
  6. 제4항에 있어서, R이 트리플루오로에틸인 화합물.
  7. 제5에 있어서, R이 트리플루오로에틸인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, X가 4 또는 5 위치에서 1 또는 2 개의 치환체를 갖는 페닐인 화합물.
  9. 제1항의 디옥세탄 및 수성 환경중에서 상기 디옥세탄과 혼합시 Z를 제거하는 개시제로 이루어진 키트.
  10. 제9항에 있어서, Z가 효소 분해가능하고, 상기 개시제가 상기 Z기를 분해하는 효소인 키트.
  11. 제9항에 있어서, Z가 비-효소적 화학 물질에 의해서 개시가능하고, 상기 개시제가 염기인 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140039213A (ko) * 2011-05-03 2014-04-01 라이프 테크놀로지스 코포레이션 섬광 및 백열광 １,２-디옥세탄들

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR8707399A (pt) * 1986-07-24 1988-09-13 Quest Systems Inc Metodo de detectar uma substancia usando decomposicao enzimaticamente induzida de dioxetanos
USRE36536E (en) * 1986-07-24 2000-01-25 Tropix. Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US6022964A (en) 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
ATE215696T1 (de) * 1993-12-23 2002-04-15 Tropix Inc Chemilumineszenz-assay mittels energietransfer
US5679803A (en) * 1995-10-25 1997-10-21 Tropix, Inc. 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
WO1997014692A1 (en) * 1995-10-17 1997-04-24 Tropix, Inc. 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
AU6443498A (en) 1997-03-07 1998-09-22 Tropix, Inc. Protease inhibtor assay
US6660529B2 (en) 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
JP4519320B2 (ja) 1998-07-28 2010-08-04 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ベンゾチアゾールジオキセタン類
CN1211387C (zh) 1998-09-08 2005-07-20 布里奇·P·吉利 化学发光的1,2－二氧丁环
AU4342100A (en) * 1999-04-16 2000-11-02 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
CA2511012C (en) 2002-12-20 2018-02-27 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
US7390670B2 (en) 2003-02-20 2008-06-24 Lumigen, Inc. Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide
US6970240B2 (en) 2003-03-10 2005-11-29 Applera Corporation Combination reader
EP2186913B1 (en) 2003-11-26 2016-02-10 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
EP2423326B1 (en) 2004-05-07 2014-01-08 Celera Corporation Genetic polymorphism associated with liver fibrosis methods of detection and uses thereof
US20060079699A1 (en) * 2004-08-27 2006-04-13 Brooks Edwards Intermediate compounds and methods for synthesizing chemiluminescent dioxetane substrates
WO2006099365A2 (en) 2005-03-11 2006-09-21 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof
US7799530B2 (en) 2005-09-23 2010-09-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
CA2666346C (en) 2006-10-20 2016-02-23 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof
WO2008094678A2 (en) 2007-01-31 2008-08-07 Applera Corporation A molecular prognostic signature for predicting breast cancer distant metastasis, and uses thereof
US8163074B2 (en) * 2007-02-06 2012-04-24 Xerox Corporation Phase change inks containing colorant compounds
US7736426B2 (en) * 2007-02-06 2010-06-15 Xerox Corporation Phase change inks containing colorant compounds
EP2183386A1 (en) 2007-05-31 2010-05-12 Yale University A genetic lesion associated with cancer
US8039212B2 (en) 2007-11-05 2011-10-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof
US20090221620A1 (en) 2008-02-20 2009-09-03 Celera Corporation Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
EP3093351B1 (en) 2008-07-09 2018-04-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
EP2264183B1 (en) 2009-06-09 2016-12-07 Gendiag.exe, S.L. Risk markers for cardiovascular disease
WO2010151841A2 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Yale University Single nucleotide polymorphisms in brca1 and cancer risk
US20110269735A1 (en) 2010-04-19 2011-11-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
US20120108651A1 (en) 2010-11-02 2012-05-03 Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof
WO2023194369A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Fundació Institut Mar D'investigacions Mèdiques (Imim) Genetic markers for severe covid-19

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5616729A (en) * 1986-07-17 1997-04-01 Board Of Governors Of Wayne State University Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers
US4962192A (en) * 1986-07-17 1990-10-09 Board Of Governors Of Wayne State University Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
CA1340590C (en) * 1986-07-24 1999-06-08 John C. Voyta Chemiluminescence enhancement
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5177241A (en) * 1987-12-31 1993-01-05 Bronstein Irena Y Synthesis of 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US5112960A (en) * 1989-07-17 1992-05-12 Bronstein Irena Y Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5220005A (en) * 1986-07-24 1993-06-15 Tropix, Inc. Substituted adamantyl dioxetanes
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US5605795A (en) * 1986-07-24 1997-02-25 Tropix, Inc. Assays using chemiluminescent, enzymatically cleavable substituted 1,2-dioxetanes and kits therefor
US5330900A (en) * 1987-12-31 1994-07-19 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5089630A (en) * 1987-12-31 1992-02-18 Bronstein Irena Y Dioxetanes for use in assays
US5538847A (en) * 1989-07-17 1996-07-23 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US4931569A (en) * 1988-09-14 1990-06-05 Tropix, Inc. Purification of stable water-soluble dioxetanes
US5326882A (en) * 1989-07-17 1994-07-05 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes
US5831102A (en) * 1990-08-30 1998-11-03 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5547836A (en) * 1990-08-30 1996-08-20 Tropix, Inc. Enhancement of chemiluminescent assays
JPH0767394B2 (ja) * 1991-03-20 1995-07-26 三洋化成工業株式会社 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット
US5336596A (en) * 1991-12-23 1994-08-09 Tropix, Inc. Membrane for chemiluminescent blotting applications
US5501952A (en) * 1992-07-17 1996-03-26 Aprogenex, Inc. Analogues of reporter groups as background reducers in hybridization assays
ATE215696T1 (de) * 1993-12-23 2002-04-15 Tropix Inc Chemilumineszenz-assay mittels energietransfer
US5773628A (en) * 1994-11-14 1998-06-30 Tropix, Inc. 1,2-dioxetane compounds with haloalkoxy groups, methods preparation and use
US5591591A (en) * 1995-02-09 1997-01-07 Tropix, Inc. Dioxetane compounds for the chemiluminescent detection of proteases, methods of use and kits therefore
US5679803A (en) * 1995-10-25 1997-10-21 Tropix, Inc. 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5800999A (en) * 1996-12-16 1998-09-01 Tropix, Inc. Dioxetane-precursor-labeled probes and detection assays employing the same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140039213A (ko) * 2011-05-03 2014-04-01 라이프 테크놀로지스 코포레이션 섬광 및 백열광 １,２-디옥세탄들

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Publication number Publication date
US5847161A (en) 1998-12-08
US5679803A (en) 1997-10-21
US5981768A (en) 1999-11-09

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