KR19990022651A - Rapamycin-Based Control of Biological Events - Google Patents

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KR19990022651A
KR19990022651A KR1019970709226A KR19970709226A KR19990022651A KR 19990022651 A KR19990022651 A KR 19990022651A KR 1019970709226 A KR1019970709226 A KR 1019970709226A KR 19970709226 A KR19970709226 A KR 19970709226A KR 19990022651 A KR19990022651 A KR 19990022651A
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rapamycin
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frb
fkbp
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KR1019970709226A
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티모시 클랙슨
데니스 에이. 홀트
마이클 제트. 길만
Original Assignee
데이비드 엘. 버스테인
어리어드 진 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 생물학적 전환을 위한 배열 방법에 관한 것이고, 동물 세포에서 생물학적 사건을 조절하기 위해 유용한 신규의 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명은 단백질 FRAP, Tor1, Tor2, 및 FKBP:라파마이신에 결합할 수 있는 다른 단백질을 코드화하는 서열로부터 유도된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 구성물, FKBP의 일부 또는 전부를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 다른 재조합 DNA 구성물, 이들 구성물에 의해 코드화된 단백질, 1종 이상의 구성물로 형질감염된 세포(특히 동물 세포), 키메라 단백질에 결합되고 키메라 단백질의 다중 결합을 유도할 수 있는 작은 분자(다가 다중 결합제), 이들을 제조하고 사용하는 방법을 포함한다.The present invention relates to an array method for biological conversion and provides novel methods and materials useful for modulating biological events in animal cells. The present invention includes recombinant DNA constructs comprising DNA sequences derived from sequences encoding proteins FRAP, Tor1, Tor2, and other proteins capable of binding FKBP: rapamycin, DNA sequences encoding some or all of FKBP. Other recombinant DNA constructs, proteins encoded by these constructs, cells transfected with one or more constructs (especially animal cells), small molecules that bind to chimeric proteins and induce multiple bonds of chimeric proteins (multiple multiple binders) And methods for making and using them.

Description

생물학적 사건에 대한 라파마이신 기재 조절방법Rapamycin-Based Control of Biological Events

하기 화학식(1)의 라파마이신(Rapamycin)은 고친화도로 FK506-결합 단백질, 즉, FKBP에 결합하여 라파마이신:FKBP 복합체를 형성하는 천연 생성물이다. 상호작용에 대한 보고된 Kd값은 적어도 200pM이다. 라파마이신:FKBP 복합체는 고친화도로 큰 세포 단백질 FRAP와 결합하여 3 부분체, [FKBP:라파마이신]:[FKAP], 복합체를 형성한다. 이러한 3 부분체 복합체에서 라파마이신은 이합체화제 또는 어뎁터로 작용하여 FKBP를 FRAP에 결합시킨다. FKBP:라파마이신 복합체와 상호작용하는 FRAP 단백질의 부분은 이하 상세히 기술되는 FRB 도메인이라 일컬어진다. FKBP12와 FRAP라 일컬어지는 큰 포유동물 단백질의 라파마이신 의존 관계, RAFT1 또는 RAFT1과 이의 효모 유사체 DRR 및 TOR의 관계는 몇몇의 연구 그룹에 의해 논의되 바 있다[참조예, Brown et al., 1994, Nature 369: 756-758; Sabatini et al, 1994, Cell 78:35-43; Chiu et al, 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 203:1-7; Kunz et al, 1993 Cell 73:585-596; and Cafferkey et al, 1993 Mol. Cell. Biol. 13:6012-6023. 문헌[Chiu et al, supra, and Stan et al, 1994, J. Biol. Chem. 269:32027-32030]에는 FRB 도메인을 함유하는 FRAP의 작은 서브단위에 대한 FKBP12의 라파마이신 의존 결합에 기재되어 있다. FRAP, RAFT, RAPT 및 TOR 단백질은 각각 상동성 FRB 도메인을 함유하며 본 발명의 FRAP 단백질인 것으로 사료된다:Rapamycin of formula (1) is a natural product that binds to a FK506-binding protein, ie, FKBP, with high affinity to form a rapamycin: FKBP complex. The reported Kd value for the interaction is at least 200 pM. The rapamycin: FKBP complex binds to the large cellular protein FRAP with high affinity to form a tripartite, [FKBP: rapamycin]: [FKAP], complex. In these three-part complexes, rapamycin acts as a dimer or adapter to bind FKBP to FRAP. The portion of the FRAP protein that interacts with the FKBP: rapamycin complex is referred to as the FRB domain described in detail below. The rapamycin dependency of large mammalian proteins, called FKBP12 and FRAP, and the relationship between RAFT1 or RAFT1 and its yeast analogues DRR and TOR have been discussed by several research groups (see, for example, Brown et al., 1994, Nature 369: 756-758; Sabatini et al, 1994, Cell 78: 35-43; Chiu et al, 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 203: 1-7; Kunz et al, 1993 Cell 73: 585-596; and Cafferkey et al, 1993 Mol. Cell. Biol. 13: 6012-6023. See Chiu et al, supra, and Stan et al, 1994, J. Biol. Chem. 269: 32027-32030, describe rapamycin dependent binding of FKBP12 to small subunits of FRAP containing FRB domains. The FRAP, RAFT, RAPT and TOR proteins each contain homologous FRB domains and are believed to be FRAP proteins of the invention:

광범위한 천연의 FK506 결합단백질(FKBP)는 공지된 단백질이다[참조예, Kay, 1996, Bioche,m. J. 314:361-385]. FKBP 단백질은 문헌[Spencer et al, 1993, Science 262:1019-1024] 및 특허원 PCT/US94/01617호에 개시되어 있는 바와 같이 면역필린 기재 재조합 단백질의 리간드 중재된 다중결합화를 근거로 하는 생물학적 스위치에서 이들의 리간드 결합 특성이 사용된다. 반면 FK506의 면역억제 활성은 특히 동물에서 이합체화제로서 이의 유용성이 제한될 수 있지만 FK506(및 관련된 화합물)의 이량체는 그러한 면역억제활성이 결핍되어 있으며, FKBP로부터 유도된 리간드 결합 단백질을 함유하는 키메라 단백질을 이합체화시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.A wide range of natural FK506 binding proteins (FKBPs) are known proteins [see, eg, Kay, 1996, Bioche, m. J. 314: 361-385. FKBP proteins are biologically based on ligand mediated multibinding of immunophilin based recombinant proteins as disclosed in Spencer et al, 1993, Science 262: 1019-1024 and patent application PCT / US94 / 01617. Their ligand binding properties are used in the switch. On the other hand, immunosuppressive activity of FK506 may be limited in its usefulness as a dimerizing agent, especially in animals, but dimers of FK506 (and related compounds) lack such immunosuppressive activity, and contain chimeric containing ligand binding proteins derived from FKBP. It has been found to be effective in dimerizing proteins.

FK506과 같은 라파마이신은 천연의 단백질 이합체화제이며, 적절하게 디자인된 키메라 단백질을 이합체화시킬 수 있지만, 효능적인 면역억제 활성을 포함한 이의 현저한 생물학적 활성은 조작된 생물학적 스위치에서의 이의 용도, 특히 동물에서의 용도를 보다 더 심각하게 제한시킨다. 본 발명은 심각하고도 고유한 단점을 억제하면서 라파마이신(및 관련된 화합물)의 효능적인 이합체화를 가능하게 한다.Rapamycin, such as FK506, is a natural protein dimerization agent and can dimerize suitably designed chimeric proteins, but its significant biological activity, including potent immunosuppressive activity, has been shown in its use in engineered biological switches, particularly in animals. Further restricts the use of. The present invention allows for the efficient dimerization of rapamycin (and related compounds) while suppressing serious and inherent disadvantages.

도 1a는 전사활성화 도메인을 함유하는 FRAP 키메라와 함께 DNA 결합 도메인을 함유하는 FKBP 키메라의 라파마이신 의존 이합체화를 도시하는 도면이다.1A is a diagram showing rapamycin dependent dimerization of FKBP chimera containing a DNA binding domain with FRAP chimera containing a transcriptional activation domain.

도 1b는 어떠한 실험 실시예에 사용된 플라스미드를 나타내는 도면이다. 전사인자 융합 단백질은 사람 사이토메칼로바이러스(hCMV) 의사 조기 프로모터 및 증진제의 조건하에 생성된다. E는 에피토프 태그(tag)를 나타내며, N은 SV40T 항원 핵 위치화 서열을 나타내며, 둘 모두 전사인자의 N-말단에 융합된다. 수용체 유전자는 ZFHD1에 대해 세로로 반복된 결합부위에 의한 증진제 서열이 결여된 최소의 hCMV 프로모터로 구성된다.1B shows the plasmid used in certain experimental examples. Transcription factor fusion proteins are produced under the conditions of the human cytomegalovirus (hCMV) pseudo early promoter and enhancer. E represents the epitope tag, N represents the SV40T antigen nuclear localization sequence, and both are fused to the N-terminus of the transcription factor. The receptor gene consists of a minimal hCMV promoter lacking an enhancer sequence by the site of repeated binding to ZFHD1.

도 2는 라파마이신 및 라파마이신 유사체와 함께 도식의 형태로 도시된 본 발명의 융합 단백질의 다양한 FRAP 유도된 및 FKBP 유도된 도메인을 도시하는 도면이다.FIG. 2 depicts the various FRAP derived and FKBP derived domains of the fusion proteins of the invention shown in schematic form with rapamycin and rapamycin analogs.

도 3은 FRAP 및 FRBP 도메인의 다양한 다중체 및 형태의 구성물을 사용한 전사 검정에서 얻은 결과를 비교하는 도면이다.FIG. 3 is a comparison of the results obtained in transcriptional assays using constructs of various multimers and forms of FRAP and FRBP domains.

도 4는 일시적으로 형질감염된 세포(A,B) 및 안정하게 형질감염된 세포(C,D)에서의 다양한 라파마이신 농도에서 분비된 알카리성 포스파타제 활성의 생성으로 측정된 것으로서 라파마이신 의존 유전자 전사에 대한 용량 반응 곡선을 도시하는 도면이다. (A) ZFHD1-3FKBP 및 1FRB-p65(361-450)을 코드화하는 플라스미드가 pZHWTx12-CMV-SEAP 수용체 유전자와 함께 HT1080세포내로 형질감염된다. 성장 배지내로 분비된 SEAP 활성은 배양후에 라파마이신의 표시된 농도로 측정된다. (B) 표시된 플라스미드(-)는 제거되고 공발현 백터단독으로 대체된다. SEAP 활성은 배양후에 표시된 10nM의 라파마이신으로 또는 라파마이신 없이 측정된다. 형질감염은 사중으로 수행하고 평균값(상대적인 단위로)± 표준편차를 플롯팅하였다. 라파마이신 조절된 유전자는 안정한 세포주에서 발현된다. (C) pLH-ZHWTx12-IL2-SEAP 수용체 유전자, ZFHD1-3FKBP DNA 결합 도메인 및 1FRB-p65(361-550) 활성화 도메인은 3 단계로 HT1080 세포내로 안정하게 집적되어, 클론성 세포주 HT20-6을 생성시킨다. 성장 배지내로 분비된 SEAP 활성은 HT20-6 세포의 배양후에 표시된 농도의 라파마이신으로 측정된다. 검정은 삼중으로 수행하였으며, 평균값(상대적인 단위로) ± 표준편차를 플롯팅하였다. (D) 상부:단일의 전사에 의한 1FRB-p65(361-550) 및 ZFHD1-3FKBP을 발현하도록 사용된 IRES 함유 플라스미드. 하부: 제오신(zeocin)에 대한 내성을 주는 플라스미드와 함께 pCGNN-1FRB-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBP를 안전하게 집적된 pLH-ZHWTx12-IL2-SEAP 수용체 유전자를 이미 함유하고 있는 HT1080세포내로 형질감염시켰다. 제오신 내성 클론, HT23 세포의 풀(pool)을 표시된 농도의 라파마이신과 함께 배양하고, 성장 배지에 분비된 SEAP 활성를 측정하였다.4 is a dose for rapamycin dependent gene transcription as measured by the generation of alkaline phosphatase activity secreted at various rapamycin concentrations in transiently transfected cells (A, B) and stably transfected cells (C, D). It is a figure which shows a response curve. (A) Plasmids encoding ZFHD1-3FKBP and 1FRB-p65 (361-450) are transfected into HT1080 cells along with the pZHWTx12-CMV-SEAP receptor gene. SEAP activity secreted into growth medium is measured at the indicated concentration of rapamycin after culture. (B) The indicated plasmid (-) is removed and replaced with a coexpressed vector alone. SEAP activity is measured with or without rapamycin at the indicated 10 nM rapamycin after incubation. Transfections were performed in triplicate and plotted mean values (relative units) ± standard deviation. Rapamycin regulated genes are expressed in stable cell lines. (C) The pLH-ZHWTx12-IL2-SEAP receptor gene, ZFHD1-3FKBP DNA binding domain and 1FRB-p65 (361-550) activation domain were stably integrated into HT1080 cells in three steps, producing a clonal cell line HT20-6 Let's do it. SEAP activity secreted into the growth medium is measured with the indicated concentrations of rapamycin after culturing HT20-6 cells. The assay was performed in triplicate and plotted the mean values (relative units) ± standard deviation. (D) Top: IRES containing plasmid used to express 1FRB-p65 (361-550) and ZFHD1-3FKBP by single transcription. Bottom: HT1080 already containing pLH-ZHWTx12-IL2-SEAP receptor gene safely integrated with pCGNN-1FRB-p65 (361-550) -IRES-ZFHD1-3FKBP with plasmids resistant to zeocin The cells were transfected. A pool of zeocin resistant clones, HT23 cells, was incubated with the indicated concentrations of rapamycin and the SEAP activity secreted in the growth medium was measured.

도 5는 전사인자 융합 단백질의 다양한 형태에 대한 라파마이신 의존 유전자 전사실험의 결과를 도시하는 도면이다. 실험은 본 발명의 시스템에서의 라파마이신 결합 도메인에 대한 최적의 형태를 측정하는데 목적이 있다. HT1080세포는 표시된 ZFHD1-FKBP 및 FRB-p65(450-550) 융합 단백질을 코드화하는 플라스미드로 형질감염되었다. 형질감염된 세포는 10nM의 라파마이신을 함유한 배지에서 배양되었고, SEAP 활성을 측정하였다. 형질 감염은 삼중으로 수행하고, 평균값(상대적인 단위로) ± 표준편차를 플롯팅하였다. 면역 플롯 분석에서는 모든 융합물이 고수준으로 발현된 ZFHD1-1FKBP를 제외하고는 유사한 수준으로 발현됨을 나타냈다. 동일한 결과를 형질감염된 각각의 플라스미드의 양이 광범위한 범위로 변화되는 경우에서도 얻었다. 결과는 4 가지의 별도의 실험으로 나타낸다.5 shows the results of rapamycin dependent gene transcription experiments on various forms of transcription factor fusion proteins. The experiment aims to determine the optimal form for the rapamycin binding domain in the system of the present invention. HT1080 cells were transfected with plasmids encoding the indicated ZFHD1-FKBP and FRB-p65 (450-550) fusion proteins. The transfected cells were cultured in medium containing 10 nM rapamycin and the SEAP activity was measured. Transfection was performed in triplicate and plotted mean values (relative units) ± standard deviation. Immune plot analysis showed that all fusions were expressed at similar levels except ZFHD1-1FKBP, which was expressed at high levels. The same result was obtained even when the amount of each plasmid transfected varied over a wide range. The results are shown in four separate experiments.

도 6은 조작된 세포가 삽입되는 동물에 이합체화 제제를 생체내 투여하면 조절된 유전자가 발현되며 유전자 생성물이 생성 및 분비됨을 입증하는 도면이다. 형질감염된 HT1080 세포(동물당 전체 2×106, 상이한 4 부위에)를 숫컷 nu/nu 마우스에게 근육내 주입하였다. 약 한시간 후에, 동물에게 정맥내로 표시된 농도의 라파마이신을 투여하였다. 라파마이신 투여 17시간 후에 혈액 샘플을 수거하여 hGH 농도를 검정하였다. 라파마이신 처리는 혈청 hGH에서 용량 의존 증가를 나타냈다(X±SEM; 각각의 용량에서 n=5 이상). *는 각각 낮은 라파마이신 용량으로부터의 통계학적 중요성을 나타내며, +는 10배 이하인 라파마이신으로부터의 통계학적 중요성을 나타낸다(p＜0.05, 변화에 대한 한가지 분석 및 터키-크레머 다중 비교 시험: Tukey-kramer multiple comparison testing).FIG. 6 is a diagram demonstrating that when a dimerization agent is administered in vivo to an animal into which an engineered cell is inserted, a regulated gene is expressed and gene product is produced and secreted. Transfected HT1080 cells (total 2 × 10 6 per animal, at 4 different sites) were injected intramuscularly into male nu / nu mice. After about an hour, the animals received rapamycin at the indicated concentrations intravenously. Blood samples were collected 17 hours after rapamycin administration and assayed for hGH concentration. Rapamycin treatment showed a dose dependent increase in serum hGH (X ± SEM; n = 5 or higher at each dose). * Indicates statistical significance from low rapamycin doses respectively, + indicates statistical significance from rapamycin that is 10 times or less (p <0.05, one analysis of changes and Turkish-Cremer multiple comparison test: Tukey-kramer multiple comparison testing).

도 7은 실시예 4에 기재된 바와 같이 조작(또한 도 6 참조)되고 마우스내로 이식되어 정맥내 라파마이신 투여후 지연된 기간동안 hGH를 생성하는 HT1080의 능력을 입증한다. 마우스는 형질 감염된 HT1080 세포의 이식후에 10.0mg/kg의 라파마이신으로 처리하였다. 혈액샘플은 라파마이신 투여후 4, 8, 17, 24 및 42 시간에 수거였으며, 혈청 hGH 수준을 측정하였다(X±SEM, n=점당 4이상). hGH 반응의 최종 반감기는 11.4 시간인 것으로 계산되었다.FIG. 7 demonstrates the ability of HT1080 to be manipulated as described in Example 4 (see also FIG. 6) and implanted into mice to produce hGH for a delayed period following intravenous rapamycin administration. Mice were treated with 10.0 mg / kg of rapamycin after transplantation of transfected HT1080 cells. Blood samples were collected at 4, 8, 17, 24 and 42 hours after rapamycin administration and serum hGH levels were measured (X ± SEM, n = 4 per point). The final half life of the hGH response was calculated to be 11.4 hours.

도 8은 첫번째 투여의 효과가 사라진 후에 제 2의 라파마이신 투여에 의해 재자극되는 이식된 조작 세포의 능력을 입증한다. 라파마이신(10.0mg/kg)을 다수의 경우로 투여하였다(화살표). 날짜는 점당 X±SEM, n=4 내지 9 마우스로 플롯팅된다(실선). 실험 전체에 걸쳐서 순환되는 것으로 추정되는 라파마이신의 농도를 플톳팅하였다(파선). 라파마이신 농도를 통한 추정된 평평한 수평선은 라파마이신 약동학으로 계산된 라파마이신의 농도에 있어서 일정한 상태를 나타냈으며, 본 실험은 16시간의 투여간격으로 실험하였다. 80시간부터 시작되는 하향선은 4.6 시간의 제거 반감기를 나타내는 추정된 순환 라파마이신 농도를 나타낸다.8 demonstrates the ability of transplanted engineered cells to be restimulated by a second rapamycin administration after the effect of the first dose has disappeared. Rapamycin (10.0 mg / kg) was administered in many cases (arrows). Dates are plotted with X ± SEM per point, n = 4-9 mice (solid line). The concentration of rapamycin presumed to circulate throughout the experiment was plotted (dashed line). The estimated flat horizontal line through the rapamycin concentration showed a steady state in the concentration of rapamycin calculated by rapamycin pharmacokinetics. The downline starting from 80 hours represents an estimated circulating rapamycin concentration representing an elimination half-life of 4.6 hours.

도 9는 도 6에서 설명된 경쟁 FP 검정을 사용한 FKBP 결합 친화성에 대한 다양한 라파마이신 C24 옥심(실시예 5에서 제조됨)의 분석결과를 나타낸다. 분석결과는 두번의 별도의 실험에 대한 평균 ± SD를 나타낸다(C24 메틸 옥심 플롯은 단일 실험을 나타낸다).FIG. 9 shows analysis of various rapamycin C24 oximes (prepared in Example 5) for FKBP binding affinity using the competitive FP assay described in FIG. 6. Assays show mean ± SD for two separate experiments (C24 methyl oxime plot represents single experiment).

도 10은 지시약의 존재하에 His6-표지된 FKBP와 함께 배양된 다음, Ni-NTA 아가로우스상의 포착 및 용출후에 FRAP를 나타내는 파아지미드(pahgemid)의 특이적 풍부화를 나타내는 도면이다. 결과는 FRAP 파아지미드 대 비-디스플레이 대조 파아지미드의 비로 표시되며, 분류전의 비율은 1이다. 실험은 실시예 7에 상세히 나타낸다.FIG. 10 shows the specific enrichment of phagemids showing FRAP after incubation with His6-labeled FKBP in the presence of indicator, followed by capture and elution on Ni-NTA agarose. The results are expressed as the ratio of FRAP phagemid to non-display control phagemid, with a ratio of 1 before sorting. The experiment is detailed in Example 7.

도 11: FKBP 디스플레이 파아지를 제조하고 이의 결합특성을 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISA로 분석하였다. FKBP 파아지 입자의 분취량을 다양한 농도의 FK506과 함께 배양하고 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합된 비오티닐화된 FK506으로 도포된 웰에 가하였다. 파아지 결합을 HRP에 컨쥬게이트된 항파아지 다중클론성 항체로 가시화시켰다. 에러 막대는 삼중 측정에 대한 SD를 나타낸다. 결과는 파아지상에 디스플레이된 FKBP가 가용성 단백질의 값과 기본적으로 동일한 값으로 FK506과 상호작용함을 나타낸다(IC50=0.65nM).11: FKBP display phage was prepared and its binding characteristics were analyzed by ELISA as described in Example 7. Aliquots of FKBP phage particles were incubated with various concentrations of FK506 and added to wells coated with biotinylated FK506 bound to streptavidin. Phage binding was visualized with anti-phage polyclonal antibodies conjugated to HRP. Error bars represent SD for triple measurements. The results indicate that FKBP displayed on phage interacts with FK506 at essentially the same value as the value of soluble protein (IC50 = 0.65nM).

도 12는 시그날 혈질 도입과정의 라파마이신 의존 대조군에 유용한 형태의 예를 도시하는 도면이다. M/E는 키메라 구성물을 막에 위치시키는 마이리스토일화 모티프 또는 세포외 수용체 도메인을 나타내며; EFF는 올리고머화시에 세포반응을 유도하는 이펙터 도메인을 나타낸다(예를들어, FAS의 치사 도메인을 포함한 폴리펩티드). 두 형태 모두 이펙터 도메인을 단일 이합체화 또는 이형이합체화하는데 사용될 수 있다(이종이합체화는 EFF와 EFF'에 의한 (a)에서 예시되고 있다). 많은 그밖의 가능한 형태가 관찰될 수 있다는 것을 주지해야 한다: 특히, 각각의 도메인의 순서 및 수는 적절하게 변화될 수 있다는 것을 주지해야 한다.FIG. 12 shows an example of a form useful for the rapamycin dependent control of signal hemostasis introduction. M / E represents a myristoylated motif or extracellular receptor domain that places the chimeric construct on the membrane; EFF represents an effector domain that induces a cellular response upon oligomerization (eg, a polypeptide comprising the lethal domain of FAS). Both forms can be used to single dimerize or heterodimerize effector domains (heterodimerization is illustrated in (a) by EFF and EFF '). It should be noted that many other possible forms can be observed: in particular, it should be noted that the order and number of each domain can be changed as appropriate.

도 13은 도 8에서 설명된 바와 같은 마이리스토일화 도메인, 사람 FRBP로부터의 도메인, hFKBP12로부터의 FKBP 도메인, 및 Fas의 세포내 도메인의 일부를 포함한 혼합된 키메라 단백질(a,b)를 발현하는 세포의 감소를 나타낸다. 실시예 8(c)는 AP1428의 존재하에는 이합체화하지만 라파마이신의 존재하에는 이합체화되지 않는 마이리스토일화 도메인, 두 FKBP 도메인 및 Fas 세포내 도메인을 함유하는 키메라를 사용한 대조실험을 예시하고 있다.FIG. 13 expresses a mixed chimeric protein (a, b) comprising a portion of the myristolisation domain as described in FIG. 8, the domain from human FRBP, the FKBP domain from hFKBP12, and the intracellular domain of Fas. Decrease in cells. Example 8 (c) illustrates a control experiment using a chimera containing a myristoylation domain, two FKBP domains, and a Fas intracellular domain that dimerize in the presence of AP1428 but not dimerize in the presence of rapamycin, have.

도 14는 Lex 결합 부위를 함유한 DNA와 함께 배양된 거의 동일량의 Lex-FKBP 및 Lex-FRAP 단백질을 함유한 결합반응에 대한 겔 이동성 변화 검정을 나타낸다. 라파마이신의 부재하에서는 특이적 결합이 검출되지 않는다(도 14, 레인 1). 결합반응에서의 라파마이신의 증가량은 이동성 이동 겔에서의 특이적 복합체 수반된 결과를 초래한다(도 14, 레인 2-4). 이러한 결과는 라파마이신이 LexA 표적 서열을 함유한 DNA에 결합될 수 있는 Lex-FKBP/Lex-FRAP 이종 이량체의 형성을 촉진한다는 결론을 지지한다(상세한 사항은 실시예 9 참조).FIG. 14 shows gel mobility change assays for binding reactions containing nearly equal amounts of Lex-FKBP and Lex-FRAP proteins incubated with DNA containing Lex binding sites. No specific binding is detected in the absence of rapamycin (FIG. 14, lane 1). Increasing amounts of rapamycin in binding reactions result in specific complexes involved in mobile migration gels (Figure 14, lanes 2-4). These results support the conclusion that rapamycin promotes the formation of Lex-FKBP / Lex-FRAP heterodimers that can bind to DNA containing LexA target sequences (see Example 9 for details).

이하 기재되는 정의 및 설명은 본 발명을 보다 상세히 이해하는데 도움이 될 것이다.The definitions and descriptions set forth below will help to understand the invention in more detail.

FRB 도메인은 FKBP 단백질 및 라파마이신(또는 라팔로그)과 3 부분 복합체를 형성할 수 있는 약 89 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 영역(단백질 도메인)이다. FRB 도메인은 사람 또는 그밖의 종으로부터의 FRAP 단백질(RAPT1 또는 RAFT로 문헌에서 일컬어짐); Tor1 및 Tor2를 포함한 효모 단백질; 및 칸디다(candida) FRAP 동족체를 포함하는 다양한 천연 단백질로 존재한다. 누클레오티드 서열, 클로닝 및 이들 단백질의 그밖의 특징에 관한 정보가 기술분야에 이미 공지되어 있어서, 예를들어, 공지된 방법 및 공지된 서열을 근거로 한 PCR 프라이머를 사용하여 바람직한 FRB 펩티드 서열을 코드하는 DNA를 합성하고 클로닝할 수 있다.The FRB domain is a polypeptide region (protein domain) of at least about 89 amino acid residues capable of forming a three part complex with the FKBP protein and rapamycin (or rapalog). FRB domains are FRAP proteins from human or other species (referred to in literature as RAPT1 or RAFT); Yeast proteins including Tor1 and Tor2; And candida FRAP homologs. Information on nucleotide sequences, cloning and other features of these proteins is already known in the art, for example, by using PCR primers based on known methods and known sequences to encode the desired FRB peptide sequences. DNA can be synthesized and cloned.

단백질 공급원Protein sources 참조/서열 수탁번호Reference / sequence accession number 사람 FRAPPerson frap Brown et al, 1994, Nature 369, 756-758:GenBank 수탁 번호 L34075, NCBI Seq ID 508481:Chiu et al, 1994 PANS USA 91, 12574-12578:Chiu et al, 1995 PANS USA 92, 4947-4951Brown et al, 1994, Nature 369, 756-758: GenBank Accession No. L34075, NCBI Seq ID 508481: Chiu et al, 1994 PANS USA 91, 12574-12578: Chiu et al, 1995 PANS USA 92, 4947-4951 쥐 RAPT1Rat RAPT1 상기 Chiu et al,Chiu et al, 효모 Tor1Yeast Tor1 Helliwell et al, 1994, Mol Cell Biol 5, 105-118:EMBL 수탁번호 X74857, NCBI Seq Id #468738Helliwell et al, 1994, Mol Cell Biol 5, 105-118: EMBL Accession No. X74857, NCBI Seq Id # 468738 효모 Tor2Yeast Tor2 Kunz et al, 1993, Cell 73, 585-596;EMBL 수탁번호 71416, NCBI Seq ID 298027Kunz et al, 1993, Cell 73, 585-596; EMBL Accession No. 71416, NCBI Seq ID 298027 칸디다 동족체Candida homologue WO95/33052WO95 / 33052

본 발명에 사용되는 FRB 도메인은 일반적으로 약 89 내지 100 아미노산 잔기를 함유한다. 상기 치우(Chiu)등의 도 2는 보존된 FRB 영역을 포함하는 사람 FRAP, 쥐 FRAP, 에스. 세레비시에(S. cerevisiae) TOR1 및 에스. 세레비시에 TOR2의 160 아미노산 스팬을 나타낸다. 전형적으로는 본 발명의 융합 단백질에 사용되도록 선택된 FRB 서열은 적어도 89 아미노산 서열 Glu-39 내지 Lys/Arg-127일 수 있다. 서열은 도면에 도시된 바와 같이 번호가 부여된다. 예를들어, 첸(Chen)등 또는 사비티니(Sabitini)등의 번호 부여방법을 이용하면, 89-아미노산 서열은 사람의 경우 Glu-2025 내지 Lys-2113, Tor2의 경우 Glu-1965 내지 Lys-2053, 및 Tor1의 경우, Glu-1962 내지 Arg-2050으로 번호가 부여된다. 본 발명의 융합 단백질에 사용하는 FRB 펩티드 서열은 라파마이신 또는 라팔로그에 결합된 FRBP의 복합체에 결합될 수 있으며(그러한 결합을 직접 또는 간접적으로 검출하는 어떠한 수단으로 측정), 상기 단백질의 표시된 89-아미노산 영역 또는 상동성 단백질의 상응하는 영역을 스패닝하는 천연의 펩티드 서열을 포함할 수 있고; 천연 서열에 관련된 영역내에 약 10까지(바람직하게는 1 내지 5)의 아미노산 치환체, 삽입체, 또는 삭제부를 함유할 수 있으며; 천연 FRB 영역을 코드화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 펩티드 서열일 수 있고; 천연 FRB 영역을 코드하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성될 수 있지만 유전자 코드의 변성는 아닌 NDA 서열에 의해 코드화될 수 있다.The FRB domain used in the present invention generally contains about 89-100 amino acid residues. FIG. 2 of Chiu et al. Shows human FRAP, rat FRAP, S. comprising conserved FRB regions. S. cerevisiae TOR1 and S. Celeb2 shows a 160 amino acid span of TOR2. Typically the FRB sequence selected for use in the fusion protein of the invention may be at least 89 amino acid sequences Glu-39 to Lys / Arg-127. Sequences are numbered as shown in the figure. For example, using the numbering method of Chen et al. Or Sabitini et al., The 89-amino acid sequence is Glu-2025 to Lys-2113 for humans and Glu-1965 to Lys-2053 for Tor2. , And Tor1, are numbered Glu-1962 to Arg-2050. The FRB peptide sequences used in the fusion proteins of the invention can be bound to rapamycin or a complex of FRBP bound to the rapalog (measured by any means that detects such binding directly or indirectly) and the indicated 89- of the protein. May comprise a native peptide sequence spanning an amino acid region or a corresponding region of a homologous protein; May contain up to about 10 (preferably 1 to 5) amino acid substituents, inserts, or deletions within a region related to the native sequence; May be a peptide sequence encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA molecule encoding a native FRB region; It may be selectively hybridized to a DNA molecule encoding a native FRB region but encoded by an NDA sequence that is not denaturation of the genetic code.

FKBP(FK 결합 단백질)은 FK506, FK520 및 라파마이신과 같은 맥크로리드(macrolide)에 대한 사이토솔(cytosol) 수용체이고, 종 세포주를 통해 아주 잘 보존된다. 본 발명의 목적에 있어서, FRBP는 본 발명의 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있고 FRB 함유 단백질과 3 부분 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 단백질 도메인이다. 다양한 FKBP종에 대한 누클레오티드 서열, 클로닝, 및 그밖의 특징과 관련된 정보는 기술분야에 공지되어 있어서, 예를들어, 공지된 방법 및 공지된 서열을 근거로 한 PCR 프라이머를 사용하여 바람직한 FKBP 펩티드 서열을 코드하는 DNA를 합성하고 클로닝할 수 있다[참조예: Staendart et al, 1990, Nature 346, 671-674(human FKBP12); Kay, 1996, Biochem. J. 314, 361-385]. 그밖의 포유동물종, 효모, 및 다른 유기체에서의 상동성 FKBP 단백질도 기술분야에 공지되어 있고 본원에 개시되는 융합 단백질에 사용될 수 있다[참조예: Kay, 1996, Biochem. J. 314, 361-385]. 본 발명에 사용된 FKBP 도메인의 크기는 사용되는 FKBP 단백질에 따라 다양할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용된 FKBP 펩티드 서열은 라파마이신 또는 라팔로그와 결합하고 FRB 함유 단백질과 3 부분 복합체를 형성할 수 있으며(그러한 결합을 직접 또는 간접적으로 검출하는 어떠한 수단으로 측정), 상기 사람 FKBP12 단백질로부터 유도된 천연 펩티드 서열(이하 예시됨), 또는 그밖의 사람 FKBP, 쥐 또는 다른 포유동물 FKBP, 또는 어떠한 동물, 효모 또는 균 FKBP로부터 유도된 펩티드 서열을 포함할 수 있고; 천연 서열에 관련된 영역내에 약 10까지(바람직하게는 1 내지 5)의 아미노산 치환체, 삽입체, 또는 삭제부를 함유할 수 있으며; 천연 FKBP 영역을 코드화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 펩티드 서열일 수 있거나, 천연 FKBP 영역을 코드화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성될 수 있지만 유전자 코트의 변성은 아닐 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화될 수 있다.FKBP (FK binding protein) is a cytosol receptor for macrolides such as FK506, FK520 and rapamycin and is well conserved through species cell lines. For the purposes of the present invention, FRBP is a protein or protein domain capable of binding to rapamycin or rapalog of the present invention and forming a three part complex with an FRB containing protein. Information related to nucleotide sequences, cloning, and other features for various FKBP species is known in the art, such as, for example, using a PCR primer based on known methods and known sequences to determine the desired FKBP peptide sequence. DNA encoding can be synthesized and cloned (see, eg, Staendart et al, 1990, Nature 346, 671-674 (human FKBP12); Kay, 1996, Biochem. J. 314, 361-385. Homologous FKBP proteins in other mammalian species, yeast, and other organisms are also known in the art and can be used in the fusion proteins disclosed herein. See, eg, Kay, 1996, Biochem. J. 314, 361-385. The size of the FKBP domain used in the present invention may vary depending on the FKBP protein used. The FKBP peptide sequence used in the fusion protein of the invention can bind to rapamycin or rapalog and form a three-part complex with an FRB containing protein (measured by any means that detects such binding directly or indirectly), and the human Natural peptide sequences derived from FKBP12 protein (illustrated below), or other human FKBPs, murine or other mammalian FKBPs, or peptide sequences derived from any animal, yeast or fungal FKBPs; May contain up to about 10 (preferably 1 to 5) amino acid substituents, inserts, or deletions within a region related to the native sequence; It may be a peptide sequence encoded by a DNA sequence that may be selectively hybridized to a DNA molecule encoding a native FKBP region, or may be selectively hybridized to a DNA molecule encoding a native FKBP region, but not a denaturation of the gene coat. Can be encoded by a DNA sequence.

본원에서 사용되는 표현 선택적으로 혼성시킬 수 있는은 당해기술분야에 종사하는 사람에 의해 선택되거나 용이하게 실험적으로 결정될 수 있는 혼성 조건하에서, DNA 분자가 존재함에도 불구하고, 두 개의 DNA 분자가 서로 혼성에 민감하다는 것을 의미한다. 이러한 처리법은 실온 내지 65-75℃의 온도 범위에서 0.2 내지 6×SSC를 함유하고/거나 0.1% 내지 1% SDS를 함유하는 완충액으로 배타적으로 세척함과 같은 매우 엄격한 조건을 포함한다. [참고문헌: F.M. Ausubel et al., Eds, Short Protocols in Molecular Biology, Units 6.3 and 6.4(John Wiley and Sons, New York, 3d Edition, 1995].As used herein, an expression selectively hybridizable is capable of hybridizing two DNA molecules to one another despite the presence of DNA molecules, under hybrid conditions that can be selected or readily determined experimentally by those skilled in the art. Means sensitive. Such treatments include very stringent conditions, such as washing exclusively with buffers containing 0.2-6 × SSC and / or 0.1% -1% SDS in the temperature range from room temperature to 65-75 ° C. [Reference: F.M. Ausubel et al., Eds, Short Protocols in Molecular Biology, Units 6.3 and 6.4 (John Wiley and Sons, New York, 3d Edition, 1995).

본원에서 사용되는 용어 재조합, 키메라 및 융합은 다양한 성분 도메인 또는 서열이 본질적으로 동일한 배열에서 함께 발생하지 않는다는 의미에서 상호간 이종 구조물임을 나타낸다. 보다 상세하게는, 성분 부분은 동일한 연속 폴리펩티드 또는 누클레오티드 서열 또는 분자에서 전혀 발견되지 않으며, 작게는 동일한 순서 또는 배향성 또는 본 발명의 키메라 단백질 또는 재조합 DNA 분자에 동일한 간격으로 존재하지 않는다.As used herein, the terms recombination, chimeric and fusion refer to heterologous structures that are mutually different in the sense that the various component domains or sequences do not occur together in essentially the same arrangement. More specifically, the component parts are not found at all in the same contiguous polypeptide or nucleotide sequence or molecule, and are not at least in the same order or orientation or at equal intervals in the chimeric protein or recombinant DNA molecule of the invention.

본원에서 사용되는 용어 이합체화, 올리고머화 및 다합체화는 본 발명을 실시함에 있어서, 각각의 상기 단백질을 공통 리간드에 결합시킴으로써 중재된 둘 이상의 단백질의 결합을 언급한다. FRB 도메인을 함유하는 단백질, FKBP 도메인을 함유하는 단백질, 및 라파마이신을 포함하는 세 갈래의 복합체의 형성은 이합체화의 한 예이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 융합 단백질은 FRAP 및/또는 FRB 도메인의 다수 복제물을 함유한다. 이러한 단백질의 복합체는 한 분자 이상의 라파마이신 또는 라팔로그(rapalog), 및 하나 이상의 구성 단백질의 하나 이상의 복제물을 함유할 수 있다. 심지어, 하나 이상이 다수의 복제물에 의해 나타내어질 지라도, 상기 다합체성 복합체는 세 형태의 구성 분자의 존재를 나타내기 위해 본원에서 여전히 세 갈래 복합체로서 언급된다.As used herein, the terms dimerization, oligomerization and multimerization refer to the binding of two or more proteins mediated by binding each of said proteins to a common ligand in the practice of the present invention. The formation of a tripartite complex comprising a protein containing the FRB domain, a protein containing the FKBP domain, and rapamycin is an example of dimerization. In certain embodiments of the invention, the fusion protein contains multiple copies of the FRAP and / or FRB domains. Complexes of such proteins may contain one or more molecules of rapamycin or rapalog, and one or more copies of one or more constituent proteins. Even if one or more is represented by multiple copies, the multimeric complex is still referred to herein as a three-part complex to indicate the presence of three forms of constituent molecules.

라팔로그는, 바람직하게는 5kD 이하, 보다 바람직하게는 2.5kD 이하의 분자량을 갖는 라파마이신 이외의 화합물이며, 상기 화합물은 FKBP 융합 단백질과 결합할 수 있으며, FKBP 융합 단백질 및 FRB 융합 단백질과의 복합체를 형성시킬 수 있다. 특히 중요한 라팔로그는 하기 화학식의 화합물의, 라파마이신 이외의, 화합물을 포함한다:Raphalogs are compounds other than rapamycin, preferably having a molecular weight of 5 kD or less, more preferably 2.5 kD or less, which compounds can bind to FKBP fusion proteins and are complexes with FKBP fusion proteins and FRB fusion proteins. Can be formed. Particularly important raphalogs include compounds other than rapamycin, of compounds of the formula:

상기 식에서,Where

U는 -H, -OR1, -OC(O)R1, -OC(O)NHR1, -SR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NH-SO2-R1또는 -R2이며; V는 -OR3또는 (=O)이며; W는 =O, =NR4, =NOR4, =NNHR4, -NHOR4, -NHNHR4, -OR4, -OC(O)R4, -OC(O)NR4, 또는 -H이며; Y는 -OR5, -OC(O)R5또는 -OC(O)NHR5이며; Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, -OC(O)R6또는 -OC(O)NR6이며; R2는 치환된 아릴 또는 알릴 또는 알킬아릴(예를 들어, 벤질 또는 치환된 벤질)이며; R3는 H, -R7, -C(O)R7, -C(O)NHR7또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이며; R1, R4, R5, R6및 R7은 개별적으로 용해된 입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포함하여, H, 알킬, 알킬아릴 또는 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 특히 중요한 라팔로그는, 본원에서 기술된 바와 같이, 하나 또는 둘의 수용체 도메인이 하나 이상의 아미노산 대체, 삭제 또는 첨가를 함유하는 상응하는 FKBP 및 FRAP 도메인을 함유하는 단백질에서 보다도 측정할 수 있을 정도의 저친화도를 갖는 천연 사람 FKBP 및 FRB 도메인을 포함하는 단백질과의 복합체를 형성한다.U is -H, -OR 1 , -OC (O) R 1 , -OC (O) NHR 1 , -SR 1 , -NHR 1 , -NHC (O) R 1 , -NH-SO 2 -R 1 or -R 2 ; V is -OR 3 or (= O); W is = O, = NR 4 , = NOR 4 , = NNHR 4 , -NHOR 4 , -NHNHR 4 , -OR 4 , -OC (O) R 4 , -OC (O) NR 4 , or -H; Y is -OR 5 , -OC (O) R 5 or -OC (O) NHR 5 ; Z is ═O, —OR 6 , —NR 6 , —H, —NC (O) R 6 , —OC (O) R 6 or —OC (O) NR 6 ; R 2 is substituted aryl or allyl or alkylaryl (eg benzyl or substituted benzyl); R 3 is H, —R 7 , —C (O) R 7 , —C (O) NHR 7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate; R 1 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are independently selected from H, alkyl, alkylaryl or aryl, including individually dissolved stereoisomers and mixtures thereof. Particularly important raphalogs are as low as measurable than those in proteins containing the corresponding FKBP and FRAP domains, where one or two receptor domains contain one or more amino acid substitutions, deletions or additions, as described herein. It forms a complex with a protein comprising native human FKBP and FRB domains with affinity.

상기에서 언급된 바와 같이, 키메라 단백질은 FRAP 또는 FKBP 단백질로부터 유도된 펩티드 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체 또는 리간드 결합 도메인, 및 수용체 도메인과 관련된 이종의, 하나 이상의 작용 도메인을 함유하지만, 키메라 단백질 분자의 올리고머화시에에는 세포의 또는 생물학적인 반응을 개시할 수 있다. 키메라 단백질의 작용 도메인은 키메라 단백질의 올리고머화 또는 클러스터링(clustering)시에 원하는 생물학적인 결과에 영향을 미칠 수 있는 광범위한 단백질 도메인으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 작용 도메인은 키메라 단백질을 특별한 세포 부위(막, 핵, 그 밖의 세포소기관 등), 또는, 예를 들어, 성장 인자 수용체 또는 시토킨 수용체의 세포내 도메인으로부터 유도되어, 클러스터링 또는 다합체화시에, 세포를 성장 또는 증식시키거나, 요망 유전자를 전사시키거나, 세포를 죽게하거나 또는 그 밖의 다른 원하는 결과를 유발시킬 수 있는 세포내 시그날 형질 도입 경로를 초기화할 수 있는 시그날링 도메인으로 유도할 수 있는 편재화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체 CD3 제타 도메인의 세포내 부분으로부터 유도된 작용 도메인을 함유하는 키메라 단백질의 클러스터링은 IL-2 프로모터 또는 이들의 유도체의 전사 조절하 유전자의 전사를 개시시킨다. 다른 구체예에서, 작용 도메인은 FAS 항원 또는 TNF-알파 수용체(TNF알파-R1)과 같은 단백질로부터 유도된 도메인을 포함하며, 작용 도메인은 올리고머화시에 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 개시할 수 있다. 더욱 또 다른 구체예에서, 작용 도메인은 키메라 단백질의 올리고머화가 DNA 결합 도메인(과 특이적 결합 상호 작용할 수 있는)에 의해 인지된 DNA 서열에 결합된 유전자의 전사를 개시하는 전사 인자 복합체의 회합을 대표하도록 쌍을 이룬, GAL4와 같은 DNA-결합 도메인 및 VP16과 같은 전사 활성 도메인을 포함한다.As mentioned above, a chimeric protein contains one or more receptor or ligand binding domains comprising peptide sequences derived from FRAP or FKBP proteins, and heterologous, one or more functional domains associated with the receptor domains, but of chimeric protein molecules The oligomerization may initiate a cellular or biological response. The functional domain of the chimeric protein may be selected from a wide range of protein domains that may affect the desired biological outcome upon oligomerization or clustering of the chimeric protein. For example, one domain of action is derived from a particular cell site (membrane, nucleus, other organelles, etc.), or, for example, the intracellular domain of a growth factor receptor or cytokine receptor, for clustering or Upon multimerization, the signaling domain is capable of initiating intracellular signal transduction pathways that can grow or proliferate cells, transcribe desired genes, kill cells, or cause other desired outcomes. Inducible localization domains may be included. For example, clustering of chimeric proteins containing functional domains derived from the intracellular portion of the T cell receptor CD3 zeta domain initiates transcription of the gene under transcriptional control of the IL-2 promoter or derivatives thereof. In another embodiment, the functional domain comprises a domain derived from a protein such as a FAS antigen or a TNF-alpha receptor (TNFalpha-R1), wherein the functional domain can initiate apoptosis of cells upon oligomerization. . In yet another embodiment, the functional domain represents the association of a transcription factor complex where oligomerization of the chimeric protein initiates the transcription of a gene bound to the DNA sequence recognized by the DNA binding domain (which can specifically bind to interact with). DNA-binding domains, such as GAL4, and transcriptional active domains, such as VP16, which are paired to a degree.

이들 키메라 단백질(및 표적 유전자를 코드화시키는 DNA 구조물과 같은 부속 구조물)의 발현을 코드화시키는 DNA 구조물은 숙주 세포의 유전 기술에서 사용하기 위해 제공된다. 본 발명의 유전적으로 기술 처리된 세포를 생성시키기 위해, 앞서의 DNA 구조물을 포함하여 원하는 키메라의 발현을 유도할 수 있는 숙주세포 재조합 DNA 분자중으로 도입시킨다. 또한, 어떠한 원하는 부속 구조물도 도입된다. 이러한 방법은 통상의 방법 및 물질을 사용하여 달성될 수 있고, 이의 다양한 예가 대규모로 달성된다. 원한기만 하면, 개질된 세포는 다른 세포로부터 선택, 분리될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 다시 배양될 수 있다. 본 발명의 기술 처리된 세포는 상기 키메라 단백질을 코드화시키는 하나 이상의 DNA 구조물을 함유하여 이를 발현시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포는 적합한 리간드의 존재시 다합체화할 수 있는 본 발명의 한쌍의 키메라 단백질을 코드화시키는 DNA를 함유 발현시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구체예에서, 세포는 다합체화된 키메라 단백질에 반응하는 DNA 요소의 발현 조절하에서 표적 유전자를 함유하는 표적 유전자 구조물을 추가로 함유한다. 기술 처리된 세포는 하나 이상의 도입 DNA 분자로 일시적으로 트렌스펙션되거나 안정하게 형질전환될 수 있다.DNA constructs that encode the expression of these chimeric proteins (and accessory constructs, such as DNA constructs that encode a target gene) are provided for use in genetic techniques of the host cell. To generate the genetically engineered cells of the present invention, the above DNA constructs can be incorporated into host cell recombinant DNA molecules capable of inducing expression of the desired chimera. In addition, any desired accessory structures are introduced. Such a method can be accomplished using conventional methods and materials, and various examples thereof are achieved on a large scale. As long as desired, the modified cells can be selected and isolated from other cells and cultured again by conventional methods. The treated cells of the present invention may contain and express one or more DNA constructs that encode the chimeric protein. In some embodiments, the cells can contain and express DNA encoding a pair of chimeric proteins of the invention that can multimerize in the presence of a suitable ligand. In yet another embodiment, the cell further contains a target gene construct containing the target gene under the control of expression of the DNA element responsive to the multimerized chimeric protein. The treated cells can be transiently transfected or stably transformed with one or more transgenic DNA molecules.

유용한 다합체화 리간드는 본 발명의 FRB 및 FKBP 도메인을 이합체화시킬 수 있는 라파마이신 및 라팔로그를 포함한다. 그러한 화합물은 2가 리간드이다. 즉, 상기 화합물은 각각 FRAP 및 FRB를 함유하는 둘 이상의 키메라 단백질 분자에 결합하고, 다합체화할 수 있다.Useful multimerization ligands include rapamycin and rapalog, which are capable of dimerizing the FRB and FKBP domains of the invention. Such compounds are divalent ligands. That is, the compound can bind and multimerize two or more chimeric protein molecules containing FRAP and FRB, respectively.

본 발명의 많은 구체예는 한쌍의 상이한 키메라 단백질을 코드화시키는 두 개의 재조합 DNA 분자(또는 동일 DNA 분자내에서 둘 이상의 DNA 서열)를 포함한다. 제 1 재조합 DNA 분자는 (i) 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있는 하나 이상의 FKBP 도메인 및 (ii) 하나 이상의 그러한 FKBP 도메인과 관련하여 이종의 하나 이상의 단백질(작용) 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코드화시킨다. 상기 키메라 단백질(단순히 FKKBP 키메라스라 함)은 라파마이신 또는 라팔로그에 결합하여, FKBP12와 같은 천연 FKBP 단백질을 라파마이신에 결합시킴으로써 형성된 복합체와 유사한, 복합체를 형성시킬 수 있다. 제 2 재조합 DNA 분자는 (i) 제 1 키메라 단백질 및 라파마이신 또는 라팔로그에 의해 형성된 복합체에 결합시킬 수 있는 하나 이상의 FRB 도메인 및 (ii) 하나 이상의 상기 FRB 도메인과 관련하여 이종의 단백질(작용) 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코드화시킨다. 이들 키메라 단백질을 단순히 FRAP 키메라스라 한다. FKBP 키메라스와 FRAP 키메라스의 쌍들은 예를 들어 공면역침전법(coimmunoprecipitation)을 포함하여 다양한 수단에 의해 검출될 수 있는 라파마이신 또는 라팔로그로 세갈래 복합체를 형성시킬 수 있다. 키메라에 대하여 다수의 FKBP 및/또는 FRB 도메인과 관련된 구체예는 라파마이신 또는 라팔로그의 존재하에 상위 등급의 멀티머를 형성시킬 수 있다. 몇몇 구체예는 하나 이상의 수용체 도메인과 관련하여 이종의 하나 이상의 FKBP 도메인, 하나 이상의 FRB 도메인 및 하나 이상의 작용 도메인을 함유하는 혼합된 키메라 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 분자를 포함한다. 혼합된 키메라스는 혼합된 키메라 단백질 분자를 라파마이신 또는 라팔로그에 상호 결합시킴으로써 단백질 호모다이머 또는 호모멀티머를 형성시킬 수 있다.Many embodiments of the present invention comprise two recombinant DNA molecules (or two or more DNA sequences within the same DNA molecule) encoding a pair of different chimeric proteins. The first recombinant DNA molecule comprises a chimeric protein comprising (i) at least one FKBP domain capable of binding to rapamycin or raphalog and (ii) at least one heterologous (working) domain of heterologous in relation to at least one such FKBP domain. Code it. The chimeric protein (simply referred to as FKKBP chimeras) can bind to rapamycin or raphalog to form a complex, similar to the complex formed by binding a natural FKBP protein such as FKBP12 to rapamycin. The second recombinant DNA molecule comprises (i) at least one FRB domain capable of binding to the first chimeric protein and a complex formed by rapamycin or raphalog and (ii) a heterologous protein in relation to at least one said FRB domain. The chimeric protein comprising the domain is encoded. These chimeric proteins are simply referred to as FRAP chimeras. Pairs of FKBP chimeras and FRAP chimeras can form three-part complexes with rapamycin or rapalog that can be detected by various means, including, for example, coimmunoprecipitation. Embodiments involving multiple FKBP and / or FRB domains for chimeras can form higher grade multimers in the presence of rapamycin or raphalog. Some embodiments include recombinant DNA molecules encoding mixed chimeric proteins containing heterologous one or more FKBP domains, one or more FRB domains, and one or more functional domains with respect to one or more receptor domains. Mixed chimeras can form protein homodimers or homomultimers by mutually binding the mixed chimeric protein molecules to rapamycin or raphalog.

출원인이 스펜서(Spencer) 등인 PCT/US94/01617호, PCT/US94/08008호에는, 예를 들어, 표적 유전자의 전사 활성, 세포사 또는 그 밖의 시그날 형질도입 경로, 세포 편재화 등을 위한 하나 이상의 리간드-결합(즉, 수용체) 도메인 및 하나 이상의 작용 도메인을 함유하는 키메라 단백질이 기술되어 있다. 리간드 중재된 유전자 녹아웃용 및 유전자 발현의 리간드 중재된 차단 또는 유전자 생성물 작용의 억제용으로 이러한 키메라 단백질의 디자인 및 용도는 PCT/US95/10591호에 기술되어 있다. 문헌[Pomeranz et al, 1995, Science 267:93-96]에는 표적 유전자의 조절된 전사를 포함하는 구체예에서 이용되는 결합에 참여하는 신규한 DNA 결합 도메인 및 DNA 서열이 기술되어 있다. 상기 참고문헌은 디자인, 구조, 및 유사 키메라스, 표적 유전자 구조물, 다가의 리간드를 코드화시키는 DNA 구조물의 용도, 및 본 발명의 실시자에게 또한 유용할 수 있는 그 밖의 양태과 관련된 실질적인 정보, 안내 및 실례를 제공한다(참조예: 출원인이 미토틱스 인코포레이티드(Mitotix, Inc.)인 PCT/US95/06722호). 상기 참조예의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.PCT / US94 / 01617, PCT / US94 / 08008, to Spenser et al., Disclose one or more ligands for, for example, transcriptional activity of target genes, cell death or other signal transduction pathways, cell localization, and the like. Chimeric proteins containing a binding (ie receptor) domain and one or more functional domains are described. The design and use of such chimeric proteins for ligand mediated gene knockout and for ligand mediated blockade of gene expression or for inhibition of gene product action is described in PCT / US95 / 10591. Pomeranz et al, 1995, Science 267: 93-96 describe novel DNA binding domains and DNA sequences that participate in the binding used in embodiments involving controlled transcription of target genes. The above references provide substantial information, guidance and examples relating to the design, structure, and similar chimeras, target gene constructs, use of DNA constructs to encode multivalent ligands, and other aspects that may also be useful to the practitioner of the present invention. (Reference: PCT / US95 / 06722, Applicant to Mititox, Inc.). The entire contents of the above reference examples are incorporated herein by reference.

키메라 단백질의 적합한 선택에 의해, 본 발명은 원하는 유전자를 활성화시키거나, 아폽토시스를 수행시키거나, PCT/US94/01617호 및 PCT/US94/08008호 및 상기에서 인용된 그 밖의 참조예에 기술된 시스템과 유사한 라파마이신- 또는 라팔로그 의존 방법으로 기술 처리된 세포에서 그 밖의 생물학적인 사건을 개시한다. 기술 처리된 세포, 바람직하게는 동물 세포는 배양액중에서 성장 또는 유지될 수 있거나, 사람의 유전자 치료, 유전자 전위 동물, 및 그 밖의 상기 응용분야의 경우에서와 같이, 모든 기관내에 존재할 수 있다. 라파마이신 또는 라팔로그 다합체화제는 상응하는 리간드 결합 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 다합체화하기에 유효량으로 세포 배양액 또는, 경우에 따라서는, 기술 처리된 세포를 함유하는 유기체에 투여된다(표적 유전자 전사, 아폽토시스 또는 그 밖의 생물학적인 방법)를 모니터링하여 간접적으로 관찰될 수 있는 바와 같음). 전체 유기체에 투여되는 경우에, 라파마이신 또는 라팔로그가 다합체화제 및 하나 이상의 허용되는 수의학적 또는 약제학적 희석제 및/또는 부형제를 함유하는 조성물의 형태로 투여될 수 있다.By appropriate selection of chimeric proteins, the present invention activates the desired gene, performs apoptosis, or the systems described in PCT / US94 / 01617 and PCT / US94 / 08008 and other references cited above. Other biological events are disclosed in cells that have been treated in a rapamycin- or raphalog-dependent method similar to. The treated cells, preferably animal cells, may be grown or maintained in culture or may be present in all organs, such as in human gene therapy, transgenic animals, and other such applications. Rapamycin or raphalog multimerization agents are administered to cell cultures or, optionally, to organisms containing the cells that have been treated, in an effective amount to multimerize the chimeric protein containing the corresponding ligand binding domain (target gene transcription). Apoptosis, or other biological method), which can be observed indirectly by monitoring). When administered to the whole organism, rapamycin or rapalog may be administered in the form of a composition containing a multimerizing agent and one or more acceptable veterinary or pharmaceutical diluents and / or excipients.

키메라 단백질중의 하나에 결합하지만 키메라 단백질과의 복합체를 형성시키지 않는 화합물이 다합체화 길항제로서 사용될 수 있다. 그러한 것으로서, (바람직하게는 전체 동물에 투여되는 경우 상기에서 기술된 바와 같은 조성물의 형태로) 다합체화제의 효과를 억제 또는 전환, 즉, 키메라 단백질의 다합체화를 억제하거나 방해하기 위한 유효량으로 기술 처리된 세포, 또는 이들을 함유하는 유기체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 라파마이신이 다합체화제로서 사용되는 경우에, FK506, FK520 또는 FKBP 및 FRAP와의 세갈래 복합체를 형성하지 않는 모든 많은 합성 FKBP 리간드가 길항제로서 사용될 수 있다.Compounds that bind to one of the chimeric proteins but do not form a complex with the chimeric protein can be used as the multimerization antagonist. As such, it is described in an effective amount to inhibit or convert the effect of the multimerizing agent (preferably in the form of a composition as described above when administered to the whole animal), ie to inhibit or inhibit the multimerization of chimeric proteins. Administered to the treated cells, or the organism containing them. For example, when rapamycin is used as a multimerizing agent, any number of synthetic FKBP ligands that do not form a trident complex with FK506, FK520 or FKBP and FRAP can be used as an antagonist.

본 발명의 한 일면은 리간드에 따른 원하는 유전자의 전사 활성을 위한 물질 및 방법을 제공한다. 이러한 하나의 구체예에서, 한 세트의 둘 이상의 상이한 키메라 단백질, 및 이들의 발현을 유발시키는 상응하는 DNA 구조물이 제공된다. 이러한 키메라 단백질은 작용성 도메인(들)으로서 하나 이상의 전사 활성 도메인을 함유한다. 그 밖의 키메라 단백질은 작용 도메인으로서 하나 이상의 DNA-결합 도메인(도 1)을 함유한다. 본 발명의 라파마이신 또는 라팔로그는 키메라스 둘 모두에 결합하여 이합성 또는 다합성 복합체를 형성함으로써 하나 이상의 DNA 결합 도메인 및 전사 활성 도메인을 함유한다. 표적 유전자 생성물의 존재 또는 농도를 직접 또는 간접적으로 모니터링하여 관찰되는 바와 마찬가지로, 이러한 복합체 형성으로 인해, 전사 조절 하에서, DNA-결합 도메인이 결합할 수 있는 DNA 서열에 연결된 표적 유전자의 전사 활성이 생성된다.One aspect of the invention provides materials and methods for the transcriptional activity of a desired gene according to the ligand. In one such embodiment, a set of two or more different chimeric proteins and corresponding DNA constructs that cause their expression are provided. Such chimeric proteins contain one or more transcriptional active domains as functional domain (s). Other chimeric proteins contain one or more DNA-binding domains (FIG. 1) as functional domains. Rapamycin or rapalog of the invention contain one or more DNA binding domains and transcriptional active domains by binding to both chimeras to form a dimeric or multisynthetic complex. As observed by direct or indirectly monitoring the presence or concentration of the target gene product, this complex formation results in the transcriptional activity of the target gene linked to the DNA sequence to which the DNA-binding domain can bind, under transcriptional regulation. .

바람직하게는, DNA 결합 도메인, 및 이를 함유하는 키메라는, 그 밖의, 종종 그 밖의 다수 DNA 서열이 존재함에도 불구하고, 선택된 DNA 서열에의 결합이 (직접 또는 간접적으로) 관찰될 수 있도록 충분한 선택도를 갖는 이의 인지된 DNA 서열에 결합된다. 바람직하게는, DNA-결합 도메인을 포함하는 키메라를 선택된 DNA 서열에 결합시키는 것은 체내 결합 연구, 또는 모든 대안적인 DNA 서열과 비교하여 선택된 DNA 서열과 관련된 유전자의 전사 속도 또는 수준을 측정함으로써 측정되는 바와 같이, 모든 대안적인 DNA 서열에 결합시키는 크기 보다도 2 이상, 바람직하게는 3 이상, 보다 더 바람직하게는 4 이상의 크기이다.Preferably, the DNA binding domain, and the chimera containing the same, have sufficient selectivity such that binding to the selected DNA sequence can be observed (directly or indirectly) despite the presence of other, often multiple, DNA sequences. Bound to its recognized DNA sequence. Preferably, binding a chimera comprising a DNA-binding domain to a selected DNA sequence is determined by in vivo binding studies, or by measuring the rate or level of transcription of a gene associated with the selected DNA sequence compared to all alternative DNA sequences. Likewise, it is at least two, preferably at least three and even more preferably at least four sizes larger than the size of binding to all alternative DNA sequences.

모든 원하는 부속 구조물과 함께, 상기 세트의 구조물을 함유하도록 유전학적 기술로 처리된 세포는, 원하는 유전자의 전사가 조절된다 하여도, 원하는 생물학적인 사건의 리간드 중재되고 조절된 작용, 아폽토시스와 같은 시그날 형질 도입 경로의 조절된 개시 등을 포함하는 응용분야에서 사용될 수 있다. 표적 유전자의 조절 가능한 발현을 위해 기술 처리된 세포는, 예를 들어, 표적 유전자에 의해 코드화된 원하는 단백질(또는 그 밖의 유전자 생성물)의 조절 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 통상의 수단을 사용하여 배양액중에서 배양될 수 있다. 세포를 함유하는 배양 배지중에 리간드의 첨가는 세포에 의한 표적 유전자의 발현 및 표적 유전자에 의해 코드화된 단백질을 생성시킨다. 유전자 발현 및 단백질 생성은 배지로부터 잔류 다합체화제를 제거하거나 다합체화 길항제 시약을 배지에 첨가시킴으로써 배지로부터 추가의 다합체화제를 보류시킴으로써 차단될 수 있다.Cells that have been genetically engineered to contain the set of constructs, along with all desired accessory constructs, signal traits such as ligand mediated and regulated actions of a desired biological event, apoptosis, even if transcription of the desired gene is regulated. It may be used in applications including controlled initiation of the route of entry and the like. Cells that have been treated for the controllable expression of the target gene can be used, for example, to regulate the production of the desired protein (or other gene product) encoded by the target gene. The cells can be cultured in culture using conventional means. The addition of ligands to the culture medium containing the cells results in expression of the target genes by the cells and proteins encoded by the target genes. Gene expression and protein production can be blocked by removing residual multimerization agent from the medium or withholding additional multimerization agent from the medium by adding a multimerization antagonist reagent to the medium.

본 발명의 기술 처리된 세포는 체내에서 생성 및/또는 사용되어 세포가 이들을 함유하는 동물내에서 원하는 단백질 또는 그 밖의 결과를 생성시키도록 전체 유기체, 바람직하게는 동물, 특히 사람을 개질시킬 수 있다. 상기 용도는 유전자 치료 응용을 포함한다.Techniques of the invention The treated cells can be produced and / or used in the body to modify the whole organism, preferably the animal, especially humans, such that the cells produce the desired proteins or other results in the animal containing them. Such uses include gene therapy applications.

아폽토시스의 조절 가능한 작용을 포함하는 구체예는 리간드 유도 세포사가 가능한 기술 처리된 세포를 제공한다. 상기 기술 처리된 세포가 원하지 않는 특성을 지니거나 전개시키거나, 또는 더 이상 유용하거나, 안전하거나 바람직하지 않을 경우, 의도적인 목적(예를 들어, 원하는 단백질 또는 그 밖의 생성물의 생성)으로 사용한 후에, 상기 기술 처리된 세포는 세포 배양액 또는 숙주 유기체로부터 제거될 수 있다. 제거는 라파마이신 또는 라팔로그를 배지에 첨가하거나, 숙주 유기체에 첨가함으로써 수행된다. 이러한 경우, 키메라스의 작용 도메인은 올리고머화 트리거 아폽토시스시 FAS 항원 또는 TNF-R1의 세포내 도메인과 같은 단백질 도메인이다.Embodiments that include a modulatory action of apoptosis provide for technology treated cells capable of ligand induced cell death. After the cells treated with the above techniques have undesired properties or develop or are no longer useful, safe or undesirable, they are used for intentional purposes (eg, production of the desired protein or other product), Cells treated as described above may be removed from the cell culture or host organism. Removal is performed by adding rapamycin or rapalog to the medium or to the host organism. In this case, the functional domain of the chimeras is a protein domain, such as the FAS antigen or the intracellular domain of TNF-R1 upon oligomerization trigger apoptosis.

이와 같이, 본 발명은 다합체화 리간드의 첨가에 대하여 내포에서의 생물학적인 효과를 달성하고자 하는 물질 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같이 기술 처리된 세포를 제공하고 세포를 리간드에 노출시키는 것을 포함한다.As such, the present invention provides materials and methods that seek to achieve a biological effect in the nest against the addition of a multimerization ligand. The method comprises providing a cell that has been treated as described herein and exposing the cell to a ligand.

예를 들어, 본 발명은 세포의 표적 항원의 전사를 활성화시키기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 리간드 중재 다합체화시에 표적 유전자의 전사를 개시할 수 있는 본 발명의 한 세트의 키메라 단백질을 코드화시키는 DNA 구조물 및 (b) 다합체화 사건에 응하는 회합 동족 DNA 서열에 연결된 표적 유전자(예를 들어, 앞서 말한 키메라 단백질의 DNA 서열 인지된, 즉, 결합 가능한, DNA 결합 도메인)함유하는 세포를 제공하는 것을 포함한다. 방법은 표적 유전자를 발현시키기에 유효량으로 키메라 단백질에 결합시킬 수 있는 다합체화 리간드에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 세포가 배양액중에서 성장하는 경우에, 리간드에 세포를 노출시키는 것은 배양 배지에 리간드를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 세포가 숙주 유기체에 존재하는 경우에, 리간드에 세포를 노출시키는 것은 숙주 유기체에 리간드를 투여함으로써 수행된다. 예를 들어, 숙주 유기체가 사람 또는 비사람인 그러한 경우, 리간드는 적합한 부형제의 형태로 경구, 구강, 혀밑, 상피, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내 또는 흡입 투여에 의해 숙주 유기체에 투여된다. 재차, 키메라 단백질용 구조물의 디자인 및 모든 부속 구조물의 디자인에 따라, 리간드 중재된 생물학적인 사건은 세포 성장, 세포 증식, 유전자 전사, 또는 아폽토시스를 유발시키는 시그날 형질 도입과 같은 세포 작용의 활성화; 중요한 유전자의 삭제, 중요한 유전자 발현의 억제, 또는 중요한 유전자 생성물의 작용 억제; 중요한 유전자의 직접 형질 도입 등일 수 있다.For example, the present invention provides a method for activating transcription of a target antigen of a cell. The method is linked to (a) a DNA construct encoding a set of chimeric proteins of the invention capable of initiating transcription of a target gene upon ligand mediated multimerization and (b) an associated cognate DNA sequence in response to the multimerization event. Providing a cell containing a target gene (eg, the DNA sequence recognized, ie bindable, DNA binding domain of the aforementioned chimeric protein). The method includes exposing the cell to a multimerization ligand capable of binding the chimeric protein in an effective amount to express the target gene. When cells grow in culture, exposing the cells to the ligand can be performed by adding the ligand to the culture medium. When the cells are present in the host organism, exposing the cells to the ligand is performed by administering the ligand to the host organism. For example, where such host organism is human or non-human, the ligand is administered to the host organism by oral, buccal, sublingual, epithelial, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarticular or inhalation administration in the form of a suitable excipient. Again, in accordance with the design of the constructs for chimeric proteins and the design of all accessory constructs, ligand mediated biological events may include activation of cellular actions such as signal transduction that causes cell growth, cell proliferation, gene transcription, or apoptosis; Deletion of important genes, inhibition of important gene expression, or inhibition of the action of important gene products; Direct transduction of important genes, and the like.

본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 본 발명의 라파마이신 또는 라팔로그를 포함하는 약제학적인 조성물을 추가로 포함한다. 상기 약제학적인 조성물을 사용하여 전체 동물, 예를 들어, 사람 유전자 치료 분야에서 기술 처리된 세포의 본 발명의 키메라스의 다합체화를 촉진시키게 되면 본원에 기술된 어떠한 목적도 달성될 수 있다.The invention further comprises a pharmaceutical composition comprising a rapamycin or rapalog of the invention in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier and one or more pharmaceutically acceptable excipients. Any of the objectives described herein can be achieved if the pharmaceutical composition is used to facilitate the multimerization of the chimeras of the invention of whole animals, eg, cells treated in the field of human gene therapy.

상기와는 달리, 본 발명은 동물, 바람직하게는 요구에 의해서 본 발명의 기술 처리도니 세포를 함유하는 사람 환자에게서 어떠한 상기 목적, 예를 들어, 표적 유전자(전형적으로 치료 단백질용 이종 유전자)의 전사 활성, 세포 성장 또는 증식, 세포사 또는 그 밖의 몇몇 선택된 생물학적인 사건이라도 달성될 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법은 동물에 라파마이신 또는 라팔로그를 함유하는 약제학적인 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 투여 방법중 하나의 투여 방법에 의해 및 기술 처리된 세포중 적어도 일부에서 키메라 단백질의 다합체화를 야기시키는데 유효량으로 라파마이신 또는 라팔로그를 함유하는 약제학적 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함한다. 다합체화는 표적 유전자의 발현의 발생; 세포 성장, 증식 및 소멸; 또는 키메라스가 디자인되고 세포가 유전학적으로 기술처리된 그 밖의 대상물을 검출함으로써 직접 검출될 수 있다.Contrary to the above, the present invention is directed to the transcription of any of the above targets, eg, target genes (typically heterologous genes for therapeutic proteins) in animals, preferably human patients containing the cells of the present invention as required. Provided are methods in which activity, cell growth or proliferation, cell death or some other selected biological event can be achieved. The method comprises administering to the animal a pharmaceutical composition containing rapamycin or rapalog. Such methods include administering to the animal a pharmaceutical composition containing rapamycin or raphalog in an amount effective to cause multimerization of the chimeric protein by one of the methods of administration and in at least some of the cells treated with the technique. . Multimerization is the development of expression of target genes; Cell growth, proliferation and disappearance; Or can be detected directly by detecting other objects in which the chimeras are designed and the cells genetically engineered.

본 발명은 본 발명의 기술 처리된 세포에서 키메라 단백질의 다합체화 정도를 전체적으로 또는 부분적으로 억제하거나, 그렇지 않으면, 감소시켜서 표적 유전자의 전사를 탈활성화시키거나, 예를 들어, 또는 본 발명의 또 다른 생물학적인 결과를 차단시키기 위해 약제학적으로 허용되는 담체 및, 임의로, 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 본 발명의 다합체화 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 포함한다. 이와 같이, 약제학적 조성물을 제조하여 이들의 약리학적 결과를 달성시키기 위한 다합체화 시약 및 다합체화 길항 시약의 용도는 본 발명에 의해 포함된다.The present invention inhibits, or otherwise reduces, the degree of multimerization of chimeric proteins in whole or in part in the cells treated with the techniques of the present invention to deactivate the transcription of the target gene, for example, or another of the present invention. Also included is a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and, optionally, a multimerization antagonist of the invention in admixture with a pharmaceutically acceptable excipient to block biological consequences. As such, the use of multimerization reagents and multimerization antagonist reagents to prepare pharmaceutical compositions and achieve their pharmacological results is encompassed by the present invention.

본 발명은 본 발명의 다합체화 리간드에 반응하는 숙주 유기체, 바람직하게는 동물, 전형적으로는 비사람 포유루 또는 사람 대상물을 제공하기 위한 방법을 또한 제공한다. 방법은 본 발명에 따라 기술 처리된, 즉, 키메라 단백질 등을 코드화시키는 하나 이상의 DNA 구조물을 함유하는 유기체 세포중으로 도입시키는 것을 포함한다. 기술 처리된 세포는 숙주 유기체내로 도입시키기 전에 다양한 물질 및 방법을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 포유류의 하나 이상의 세포로 DNA의 혼입, 및 주입에 의해 또는 카테터를 경유한 DNA의 도입 등을 허용하는 조건하에서, 본 발명의 DNA 구조물을 숙주 유기체, 예를 들어, 포유류에 도입시킬 수 있다.The invention also provides a method for providing a host organism, preferably an animal, typically a non-human mammal, or a human subject, which responds to the multimerization ligand of the invention. The method comprises introducing into an organism cell that has been treated according to the invention, ie, containing one or more DNA constructs that encode chimeric proteins and the like. Techniques Treated cells can be encapsulated using a variety of materials and methods prior to introduction into the host organism. Alternatively, the DNA constructs of the present invention may be prepared under conditions that permit, for example, the incorporation of DNA into one or more cells of a host mammal using viral vectors, and the introduction of DNA by injection or via a catheter, and the like. For example, it can be introduced into a mammal.

본 발명의 라파마이신 또는 라팔로그에 반응하는 세포 도입용 킷이 또한 제공된다. 상기 킷은 리간드 중재된 올리고머화시에 원하는 생물학적인 반응을 개시하는 키메라스를 코드화시켜서 이를 발현시킬 수 있는 하나 이상의 DNA 구조물을 함유한다. 상기 킷은 킷의 DNA 구조물(들)에 의해 코드화된 키메라 단백질 분자를 다합체화시킬 수 있는 다량의 올리고머화 리간드(라파마이신 또는 라팔로그)를 함유하며, 추가하여 다량의 다합체화 길항제를 함유할 수 있다. 상기 킷은 다합체화된 키메라 단백질 분자의 존재하에 동족 DNA 서열에 연결된 유전자의 전사를 허용하는 다합체화된 키메라 단백질에 의해 인지되는 동족 DNA 서열에 연결된 표적 유전자(또는 클로닝 부위)를 코드화시키는 DNA 구조물을 추가로 포함한다. DNA 구조물은 진핵생물에서 복제에 이용되는 그 밖의 통상의 벡터 요소 뿐만 아니라 트렌스펙턴트(transfectant)를 용이하게 선택하기 위해서, 원핵생물에서 발현시키기 위해서는 하나 이상의 선택 마커와 혼합되는 것이 바람직할 것이다. 선택 마커는 각각의 상이한 DNA 구조물에 대해서 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각의 상기 DNA 구조물(들)을 함유하는 세포 선택을 허용할 것이다.Also provided are kits for cell introduction in response to rapamycin or rapalog of the present invention. The kit contains one or more DNA constructs that can encode and express chimeras that initiate the desired biological response upon ligand mediated oligomerization. The kit may contain a large amount of oligomerizing ligand (rapamycin or rapalog) capable of multimerizing chimeric protein molecules encoded by the kit's DNA structure (s), and in addition may contain large amounts of multimerization antagonists. have. The kit comprises a DNA construct encoding a target gene (or cloning site) linked to a cognate DNA sequence recognized by a multimerized chimeric protein that allows transcription of a gene linked to a cognate DNA sequence in the presence of the multimerized chimeric protein molecule. Additionally included. The DNA constructs will preferably be mixed with one or more selection markers for expression in prokaryotes to facilitate selection of transfectants as well as other conventional vector elements used for replication in eukaryotes. The selection marker may be the same or different for each different DNA construct and will allow for cell selection containing each said DNA construct (s).

동족 DNA 서열과 혼합된 표적 유전자를 세포중으로 도입시키기 위한 부속 구조물은 표적 유전자 대신에 클로닝 부위를 함유할 수 있다. 상기 구조물을 함유하는 킷은 유전자의 조절 가능한 발현을 위한 세포의 기술처리가 당업자에 의해 제공될 수 있도록 한다.An accessory construct for introducing a target gene mixed with a cognate DNA sequence into a cell may contain a cloning site instead of the target gene. Kits containing the constructs allow for the articulation of cells for the controllable expression of genes by those skilled in the art.

본 발명의 그 밖의 킷은 전사 활성화제 또는 DNA 결합 단백질을 대신하여 하나 이상의 클로닝 부위를 함유하는 키메라 단백질용으로 하나 또는 둘 (또는 그 이상)의 DNA 구조물을 함유할 수 있다. 상기 킷은 상기에 기술된 바와 같은 다른 요소, 예를 들어, 미리 선택된 DNA 결합 도메인용 동족 DNA 서열 존재 또는 부재시에 표적 유전자 DNA 구조물을 임의로 포함한다.Other kits of the present invention may contain one or two (or more) DNA constructs for chimeric proteins containing one or more cloning sites in place of transcriptional activators or DNA binding proteins. The kit optionally includes a target gene DNA construct in the presence or absence of other elements as described above, eg, cognate DNA sequences for preselected DNA binding domains.

어떠한 킷이라도 리간드에 세포의 노출에 반응하는 (CAT, 베타-갈락토시다아제 또는 모든 용이하게 검출 가능한 유전자 생성물에 대해서) 리포터 유전자를 발현시키는 본 발명의 구조물로 안정하게 형질 전환된 양성 대조군 세포를 또한 함유할 수 있다. 리포터 유전자의 발현을 검출하고/거나 수량화하기 위한 시약이 또한 제공될 수 있다.Any kit can be used to generate positive control cells stably transformed with a construct of the present invention that expresses a reporter gene (for CAT, beta-galactosidase or any readily detectable gene product) in response to cell exposure to a ligand. It may also contain. Reagents for detecting and / or quantifying expression of reporter genes may also be provided.

FKBP 키메라스FKBP Chimeras

FKBP 키메라 단백질은 FKBP의 펩티드 서열중 전부 또는 일부를 함유하는 하나 이상의 리간드 결합 도메인, 및 하나 이상의 이종 작용 도메인을 포함한다. 이러한 키메라 단백질은 직접 결합 측정(예를 들어, 형광 퀸칭), 경쟁 결합 측정(예를 들어, FK506과 대비), FKBP 효소 활성의 억제(로타마아제), 또는 그 밖의 검정법을 사용하여 측정되는 Kd 값이 바람직하게는 약 100nM 미만, 보다 바람직하게는 약 10nM 미만 및 더욱 바람직하게는 1nM 미만인 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있어야 한다. 전형적으로, 키메라 단백질은, 예를 들어, 국제특허출원 PCT/US94/01617호에 기술된 바와 같이, FKBP12의 서열에 상응하는 펩티드 서열을 포함하는 하나 이상의 단백질 도메인을 함유할 것이다. 상기 펩티드 서열은 개질되어 10 이하, 바람직하게는 5 이하의 아미노산 잔기의 대체, 삽입 또는 삭제로 결합 특이도가 조정될 수 있다. 이러한 개질은 특정 구체예에서 선택되어 하기의 결합 프로파일중 하나 또는 둘 모두를 제공한다: (a) 기술 처리하고자 하는 숙주 세포에 내생하는 FKBP12 또는 FKBP에서 보다도 더 나은 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 둘 이상, 더욱 바람직하게는 셋 또는 넷 이상의 크기인 개질된 FKBP 도메인, 또는 이를 함유하는 키메라에 라팔로그를 결합시킴; 및 (b) 기술 처리하고자 하는 숙주 세포에 내생하는 FRAP 또는 그 밖의 FRB-함유 단백질에서 보다 (어떠한 측정에 의해서 라도) 더 나은 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 둘 이상, 더욱 더 바람직하게는 셋 이상의 크기로 제 2 키메라(하기에 기술된 바와 같이 하나 이상의 FRB 도메인을 함유)에 라파마이신 또는 라팔로그를 갖는 FKBP 키메라에 의해서 형성된 복합체의 결합.FKBP chimeric proteins include one or more ligand binding domains containing all or part of the peptide sequence of FKBP, and one or more heterologous domains. Such chimeric proteins are Kd measured using direct binding measurements (eg, fluorescence quenching), competitive binding measurements (eg, as compared to FK506), inhibition of FKBP enzyme activity (rotamases), or other assays. The value should be able to bind to rapamycin or raphalog, which is preferably less than about 100 nM, more preferably less than about 10 nM and even more preferably less than 1 nM. Typically, chimeric proteins will contain one or more protein domains comprising a peptide sequence corresponding to the sequence of FKBP12, as described, for example, in International Patent Application PCT / US94 / 01617. The peptide sequence can be modified to adjust binding specificity by replacement, insertion or deletion of amino acid residues of 10 or less, preferably 5 or less. This modification is selected in certain embodiments to provide one or both of the following binding profiles: (a) preferably one or more, more preferably, better than in FKBP12 or FKBP endogenous to the host cell to be treated Binds the raphalog to a modified FKBP domain, or chimer containing it, that is at least two, more preferably three or four sizes in size; And (b) more preferably (by any measurement) more preferably one or more, more preferably two or more, even more preferably than FRAP or other FRB-containing proteins endogenous to the host cell to be treated by the technique. Binding of the complex formed by the FKBP chimera with rapamycin or raphalog to the second chimera (containing one or more FRB domains as described below) in three or more sizes.

FKBP 키메라는 하나 이상의 이종의 작용 도메인, 즉, 비-FKBP 펩티드 서열을 함유하는 단백질 도메인을 또한 함유한다. 작용 도메인은, 예를 들어, 본원 또는 PCT/US94/01617호 또는 그 밖의 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같이. DNA-결합 도메인, 전사 활성 도메인, 세포 편재화 도메인, 세포내 시그날 형질 도입 도메인일 수 있다. 일반적으로 말하자면, 작용 도메인은 또 다른 작용 도메인과 회합 또는 응집시, 예를 들어, 동일한 또는 상이한 작용 도메인을 함유하는 단백질의 다합체화시, 키메라 단백질을 선택된 세포 부위에 유도하거나 생물학적인 효과를 초기화할 수 있다.FKBP chimeras also contain one or more heterologous functional domains, ie, protein domains containing non-FKBP peptide sequences. The functional domain is, for example, as described herein or in PCT / US94 / 01617 or other cited references. DNA-binding domain, transcriptional activation domain, cell localization domain, intracellular signal transduction domain. Generally speaking, a functional domain may induce a chimeric protein at a selected cell site or initiate a biological effect upon association or aggregation with another functional domain, eg, upon multimerization of a protein containing the same or different functional domains. Can be.

상기 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA는 어미 FKBP 단백질, 예를 들어, 사람의 FKBP12를 코드화시키는 DNA를 선택적으로 혼성시킬 수 있을 것이다. 이들 키메라 단백질은 또 다른 단백질, 예를 들어, Gal1, VP16, FAS, CD3 제타 쇄 등으로부터 유도된 작용 도메인을 함유하며, 키메라 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA는 상기 다른 단백질을 코드화시키는 DNA에 또한 선택적으로 혼성시킬 수 있으며, 유전자 코드의 변성이 없다면 상기의 혼성이 수행될 수 있었을 것이다.Recombinant DNA encoding the protein may selectively hybridize the parent FKBP protein, eg, DNA encoding human FKBP12. These chimeric proteins contain functional domains derived from another protein, such as Gal1, VP16, FAS, CD3 zeta chains, etc., and the recombinant DNA encoding the chimeric protein is optionally selectively added to the DNA encoding the other protein. Hybridization would be possible, and hybridization would have been possible without genetic code denaturation.

하기 추가의 상세한 설명에서 설명된 FRAP 키메라 단백질 뿐만 아니라, 본 발명의 FKBP 키메라 단백질은 하나 이상의 상이한 리간드 결합 도메인중의 하나 이상의 복제물 및 하나 이상의 작용 도메인중의 하나 이상의 복제물을 함유할 수 있다. 리간드 결합 도메인(들)은 N-말단, C-말단일 수 있거나, 작용 도메인(들)에 관하여 산재될 수 있다. 수용체 도메인의 다수 복제물을 포함하는 구체예는 일반적으로는 2, 3 또는 4의 그러한 복제물을 가질 것이다. 예를 들어, FKBP 키메라는 2, 3 또는 4 FKBP 도메인을 함유할 수 있다. FKBP 키메라스(및 하기에 설명된 FRAP 키메라스)의 다양한 도메인은 인접한 도메인중의 하나로부터 유도되거나 이종물일 수 있는 결합 펩티드 영역에 의해 임의로 분리된다.In addition to the FRAP chimeric proteins described in the further detailed description below, the FKBP chimeric proteins of the invention may contain one or more copies of one or more different ligand binding domains and one or more copies of one or more functional domains. The ligand binding domain (s) can be N-terminal, C-terminal, or can be interspersed with respect to the functional domain (s). Embodiments involving multiple copies of the receptor domain will generally have 2, 3 or 4 such copies. For example, FKBP chimeras may contain 2, 3 or 4 FKBP domains. The various domains of the FKBP chimeras (and FRAP chimeras described below) are optionally separated by binding peptide regions, which may be derived or heterologous from one of the contiguous domains.

본 발명을 실시함에 유용한 FKBP 키메라스의 예는 출원인이 스탠포드 앤 하바드(Stanford Harvard)인 PCT/US94/01617호, 출원인이 스탠포드 앤 하바드인PCT/US94/08008호, 스펜서 등, 출원인이 아리아드(ARIAD)인 PCT/US95/10591호 및 출원인이 미토틱스 인코포레이티드(Mitotix, Inc.)인 PCT/US9506722호에 기술된 FKBP 융합 단백질; 하기의 실시예에 기술된 FKBP 융합 단백질; 하나 이상의 FKBP 도메인중에서 10 미만(바람직하게는 1-5) 아미노산 삽입부분, 삭제부분 또는 대체 부분을 함유하며, 라파마이신 또는 라팔로그에 여전히 결합할 수 있는 앞서 말한 모든 FKBP 융합 단백질의 변이체; 천연 FKBP 도메인을 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화되어 라파마이신 또는 라팔로그에 여전히 결합할 수 있는 FKBP 도메인의 하나 이상의 복제물을 함유하는 앞서 말한 모든 FKBP 융합 단백질의 변이체; 하나 이상의 이종 작용 도메인이 상이한 이종 작용 도메인으로 삭제되거나, 대체되거나 보충되는 앞서의 모든 변이체; 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있으며, 비사람원으로부터 유도된 FKBP 도메인을 함유하는 앞서 말한 모든 FKBP 융합 단백질의 변이체; Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42, Phe46, Phe48, Glu54, Val55, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산에 의해 대체되는 사람의 FKBP12의 Phe99에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하며, 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있는 앞서 말한 모든 FKBP 융합 단백질의 변이체를 포함한다.Examples of FKBP chimeras useful in practicing the present invention include PCT / US94 / 01617, Applicant's Stanford Harvard, PCT / US94 / 08008, Applicant's Stanford & Harvard, Spencer et al. FKBP fusion proteins described in PCT / US95 / 10591, ARIAD) and PCT / US9506722, Applicant of Mitotix, Inc .; FKBP fusion proteins described in the Examples below; Variants of all of the aforementioned FKBP fusion proteins, which contain less than 10 (preferably 1-5) amino acid insertions, deletions or replacements in one or more FKBP domains and which are still able to bind rapamycin or rapalog; Variants of all of the aforementioned FKBP fusion proteins containing one or more copies of the FKBP domain encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding a native FKBP domain and still bind to rapamycin or a rapalog; All previous variants wherein one or more heterologous domains are deleted, replaced, or supplemented with a different heterologous domain; Variants of all the aforementioned FKBP fusion proteins capable of binding to rapamycin or rapalog and containing FKBP domains derived from non-human sources; Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42, Phe46, Phe48, Glu54, Val55, or one or more amino acid residues corresponding to Phe99 of FKBP12 in humans in which one or more amino acid residues are replaced by different amino acids, and in rapamycin or raphalog It includes all the aforementioned variants of the FKBP fusion protein that can bind.

예를 들어, 많은 경우에, FKBP 융합 단백질은 ACTAGA에 의해 코드화된 2-아미노산 링커 The-Arg에 의해 분리된, 사람 FKBP12의 아미노산 1-107을 함유하는 FKBP 도메인의 다수의 복제물을 포함한다. 하기 표는 앞서 말한 FKBP12 서열을 토대로 한 변종 FKBP 도메인의 부그룹을 설명하기 위해 제공된다:For example, in many cases, the FKBP fusion protein comprises multiple copies of the FKBP domain containing amino acids 1-107 of human FKBP12, separated by a 2-amino acid linker The-Arg encoded by ACTAGA. The following table is provided to illustrate the subgroups of the variant FKBP domains based on the FKBP12 sequences mentioned above:

F36AF36A Y26AY26A F48HF48H F36V/F99AF36V / F99A F36VF36V Y26VY26V F48LF48L F36V/F99GF36V / F99G F36MF36M Y26SY26S F48AF48A F36M/F99AF36M / F99A F36SF36S D37AD37A E54AE54A F36M/F99GF36M / F99G F99AF99A 190A190A F54KF54K F99GF99G 191A191A V55AV55A F46HF46H W59AW59A F46LF46L H87WH87W F46AF46A H87RH87R 유의 : 엔트리는 단일 문자 코드 및 서열 위치에 이어 돌연변이체내 아미노산 치환에 의한 네이티브 아미노산을 확인한다. 따라서, F36V는 36 위치의 페닐아닐린이 발린에 의해 치환된 사람 FKBP12 서열을 나타낸다. F36V/F99A는 36 및 99 위치의 페닐알라닌이 발린 및 알라닌으로 각각 치환된 이중 돌연변이를 나타낸다.Note: The entry identifies the native amino acid by single letter code and sequence position followed by amino acid substitution in the mutant. Thus, F36V represents the human FKBP12 sequence where the phenylaniline at position 36 is substituted by valine. F36V / F99A represents a double mutation in which phenylalanine at positions 36 and 99 is substituted with valine and alanine, respectively.

FRAP 키메라 단백질FRAP chimeric protein

FRAP 키메라 단백질로 언급되는 제 2 유형의 키메라 단백질은 하나 이상의 FRB 도메인(이것은 다른 경우에 언급된 바와 같이 전부 또는 일부의 FRAP 단백질의 펩티드 서열 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다)과 하나 이상의 이종 단백질(작용) 도메인을 함유한다.A second type of chimeric protein, referred to as a FRAP chimeric protein, comprises one or more FRB domains (which may include the peptide sequence of all or part of the FRAP protein or variants thereof, as mentioned elsewhere) and one or more heterologous proteins ( Action) contains a domain.

일반적으로, FRB 도메인 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 천연 FRB 도메인을 포함하는 단백질을 코드화하는 DNA 분자, 예를 들어, 사람 또는 기타 포유 동물 FRAP 단백질 또는 어느 한 이스트 단백질, 즉, Tor-1 또는 Tor-2 또는 이미 언급된 칸디다 FRB-함유 단백질을 코드화하는 DNA 분자에 대해 선택적으로 혼성화할 수 있는 DNA 분자에 의해 코드화된다. 본 발명의 FRB 도메인은 FKBP 단백질 및 라파마이신 또는 라파로그의 복합체에 결합할 수 있는 것들을 포함한다. 본원에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 라파로그는 하기 화학식의 화합물을 포함한다:Generally, a FRB domain or chimeric protein comprising the same is a DNA molecule encoding a protein comprising a native FRB domain, eg, a human or other mammalian FRAP protein or any yeast protein, ie Tor-1 or Tor- 2 or a DNA molecule capable of selectively hybridizing to a DNA molecule encoding a Candida FRB-containing protein already mentioned. FRB domains of the invention include those capable of binding to a complex of FKBP protein and rapamycin or rapalogue. As described in more detail herein, the rapalogs comprise a compound of the formula:

상기 식에서,Where

U는 -H 또는 -OR1, -OC(O)R1또는 -OC(O)NHR1, -SR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NHSO2-R1또는 -NHSO2-R2이고, 여기서 R2는 치환된 아릴 도는 알릴 도는 아킬아릴(예를 들어, 벤질 또는 치환된 벤질)이고,U is -H or -OR 1 , -OC (O) R 1 or -OC (O) NHR 1 , -SR 1 , -NHR 1 , -NHC (O) R 1 , -NHSO 2 -R 1 or -NHSO 2 -R 2 , where R 2 is substituted aryl degree or allyl degree or alkylaryl (eg, benzyl or substituted benzyl),

V는 -OR3또는 (=O)이고,V is -OR 3 or (= O),

W는 =O, =NR4=NOR4또는 =NNHR4, -NHOR4또는 -NHNHR4, -OR4, -OC(O)R4또는 -OC(O)NR4, 또는 -H이고,W is = O, = NR 4 = NOR 4 or = NNHR 4 , -NHOR 4 or -NHNHR 4 , -OR 4 , -OC (O) R 4 or -OC (O) NR 4 , or -H,

Y는 -OR5, -OC(O)R5또는 -OC(O)NHR5이고,Y is -OR 5 , -OC (O) R 5 or -OC (O) NHR 5 ,

Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, 또는 OC(O)R6또는 -OC(O)NR6이고, 여기서, R3는 H, -R7, -C(O)R 또는 -C(O)NHR7또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이고, R4는 H 또는 알킬이고,Z is = O, -OR 6 , -NR 6 , -H, -NC (O) R 6 , or OC (O) R 6 or -OC (O) NR 6 , where R 3 is H, -R 7 , -C (O) R or -C (O) NHR 7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate, R 4 is H or alkyl,

여기에서, R1, R4, R5, R6및 R7은 독립적으로 H, 알킬, 알킬아릴 또는 아릴로부터 선택된다.Wherein R 1 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are independently selected from H, alkyl, alkylaryl or aryl.

FRAP 키메라 단백질은 FKBP 키메라과 라파마이신 또는 라파로그에 의해 형성된 복합체에 결합할 수 있어야 한다. 바람직하게는 FRAP 키메라는 통상적인 방법에 의해 측정되는 바와 같이 Kd 값이 200μM 미만, 바람직하게는 10μM 미만인 복합체에 결합한다. FRB도메인은 라파미이신 또는 라파로그와 FKBP 키메라의 복합체에 대해 고친화성을 유지하도록 충분한 길이 및 조성이 될 것이다. 일부 구체예에서, FRB 도메인은 길이가 약 150 아미노산보다 적으며, 일부 경우에서는 약 100 아미노산보다 적다. 이와 같은 어느 한 영역은 Val2012에서 Tyr2144에 이르는 사람 FRAP의 133 아미노산 영역을 포함한다[참조: Chiu et al., 1994, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:12574-12578]. 특히 가치있는 FRB 영역은 사람 FRAP의 Glu2025에서 Gln2114에 이르며, FKBP12-라파마이신에 대한 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서 Q2214는 상기 89-아미노산 FRB도메인을 내어주는 90-아미노산 서열로부터 제거된다. FRB 펩티드 서열은 일반적으로, 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산을 치환, 삽입 또는 삭제하여 결합 특이성을 조절하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 내인성 FKBP 및 FRAP 단백질과 라파마이신/라파로그의 복합체의형성에 대하여 하나 이상의 FKBP 키메라, FRAP 키메라 및 라파마이신 또는 라파로그 분자를 포함하는 복합체의 형성을 우선적으로 달성하도록 특정 구체예에서 선택된다. 바람직하게는, 하나 이상, 보다 바람직하게는 두개 이상, 매우 바람직하게는 3개로 크기 순서(측정에 의해)로 우선한다.The FRAP chimeric protein must be able to bind to the complex formed by the FKBP chimera and rapamycin or raphalog. Preferably the FRAP chimera binds to a complex having a Kd value of less than 200 μM, preferably less than 10 μM as measured by conventional methods. The FRB domain will be of sufficient length and composition to maintain high affinity for rapamycin or a complex of rapamycin and FKBP chimera. In some embodiments, the FRB domain is less than about 150 amino acids in length and in some cases less than about 100 amino acids. One such region includes the 133 amino acid region of human FRAP, ranging from Val 2012 to Tyr 2144. Chiu et al., 1994, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91: 12574-12578. Particularly valuable FRB regions range from Glu 2025 to Gln 2114 of human FRAP and have affinity for FKBP12-rapamycin. In some embodiments Q2214 is removed from the 90-amino acid sequence giving rise to the 89-amino acid FRB domain. FRB peptide sequences can generally be modified to control binding specificity by substitution, insertion or deletion of up to 10, preferably up to 5 amino acids. Such modifications are selected in certain embodiments to preferentially achieve formation of a complex comprising one or more FKBP chimeras, FRAP chimeras and rapamycin or raphalog molecules relative to the formation of a complex of endogenous FKBP and FRAP proteins with rapamycin / lapalog do. Preferably, one or more, more preferably two or more, very preferably three, prevail in size order (by measurement).

이러한 단백질을 코드화하는 재조합 DNA는 FRAP 종을 코드화하는 DNA를 선택적으로 혼성화시킬 수 있거나, 유전 코드의 변성이 없는 경우에 혼성화시킬 수 있다. 다시 말하면, 이러한 키메라 단백질은 또 다른 단백질, 예를 들어, Gal14, VP16, Fas, CD3 제타 사슬 등으로부터 유도된 작용 도메인을 함유하기 때문에 키메라 단백질을 코드화하는 재조합 DNA는 이러한 기타 단백질을 코드화하는 DNA에 대해 선택적으로 혼성화되거나. 유전 코드의 변성 없이 이러한 혼성화를 가능하게 할 수 있다.Recombinant DNA encoding such proteins can selectively hybridize DNA encoding FRAP species, or hybridize in the absence of denaturation of the genetic code. In other words, since such chimeric proteins contain functional domains derived from other proteins, such as Gal14, VP16, Fas, CD3 zeta chains, and the like, recombinant DNA encoding chimeric proteins may be incorporated into the DNA encoding these other proteins. Selectively hybridized to This hybridization can be enabled without denaturation of the genetic code.

본 발명의 실시에 유용한 FRB 키메라의 예시적 예에는 키메라가 FKBP 단백질 및 라파마이신 또는 라파로그에 의해 셩성된 복합체에 결합할 수 있는 경우에 한하여, 하기의 실시예에 기재된 것들, 이들의 하나 이상의 이종 도메인이 선택적인 이종 도메인으로 치환되거나 하나 이상의 추가 이종 도메인으로 보충된 변이체, 이들의 하나 이상의 FRB 돔인이 사람이 아닌 펩티드 서열 기원(예를 들면 Tor 또는 칸디다)의 도메인인 변이체, 및 FRB 도메인이 본원에 기술된 바와 같이 아미노산 치환, 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변이체가 포함된다. 예시적 FRB 융합 단백질은 이미 언급된 바와 같이 SpeI-XbaI 부위의 연결에 의해 형성된 링커 Thr-Arg에 의해 분리된 사람 FRAP의 잔기 2025-2113을 함유하는 하나 이상의 89-아미노산 FRB를 함유한다. 본 발명의 융합 단백질에서 이러한 제한 부위 또는 링커는 부위-유도 돌연변이생성과 같은 통상적인 기법을 사용하여 삭제, 치환 또는 연장될 수 있다.Illustrative examples of FRB chimeras useful in the practice of the present invention include those described in the Examples below, one or more of these, as long as the chimera can bind to FKBP protein and complexes synthesized by rapamycin or rapalogue. Variants wherein the domain is substituted with an optional heterologous domain or supplemented with one or more additional heterologous domains, variants wherein one or more of these FRB domes is a domain of non-human peptide sequence origin (eg, Tor or Candida), and FRB domains Variants modified by amino acid substitutions, substitutions, or insertions as described below are included. Exemplary FRB fusion proteins contain one or more 89-amino acid FRBs containing residues 2025-2113 of human FRAP separated by linker Thr-Arg formed by linkage of the SpeI-XbaI site, as already mentioned. Such restriction sites or linkers in the fusion proteins of the invention can be deleted, substituted or extended using conventional techniques such as site-induced mutagenesis.

이종 도메인Heterogeneous domain

상기 언급된 바와 같이, FKBP 및 FRAP 키메라의 이종 작용 도메인은 이르 함유하는 키메라 단백질의 상호 결합에 관련하여, 표적 유전자의 DNA-결합 및/또는 전사을 유도(또는 억제)하거나, 세포 성장, 분화, 증식 또는 아폽토시스(apoptosis)를 활성화시키거나, 특정 세포의 위치에 단백질을 유도하거나 기타 생물학적 사건을 활성화시킬 수 있는 단백질 도메인이다.As mentioned above, the heterologous domains of FKBP and FRAP chimeras induce (or inhibit) DNA-binding and / or transcription of target genes, or induce cell growth, differentiation, and proliferation in relation to the mutual binding of chimeric proteins containing Ir. Or a protein domain capable of activating apoptosis, inducing proteins at specific cell locations or activating other biological events.

조절가능한 유전자 전사를 포함하는 구체예는 제 1 및 제 2 키메라 단백질의 이종 도메인의 결합 또는 다중결합화에 반응성인 DNA 성분의 전사 조절하에서 표적 유전자(이는 가치있는 폴리펩티드, 안티센스 RNA, 리보자임 등을 코드화한다)를 포함하는 표적 유전자 구성물을 사용하는 것을 포함한다.Embodiments that include controllable gene transcription include target genes (which are valuable polypeptides, antisense RNAs, ribozymes, etc.) under the transcriptional control of DNA components that are responsive to binding or multiple binding of heterologous domains of the first and second chimeric proteins. Encoding target gene construct).

전사가 직접적인 활성화에 관련하는 본 발명의 구체예에서, 제 1 및 제 2 키메라 단백질의 이종 도메인은 하기에 기재되는 Gal4와 같은 DNA 결합 도메인 또는 ZFHD1과 같은 키메라 DNA 결합 도메인 또는 VP16 또는 p65 각각으로부터 유도된 것과 같은 전사 활성화 도메인을 포함한다. DNA 결합 도메인을 함유하는 키메라 단백질에 대한 이러한 전사 활성화 도메인을 함유하는 키메라 단백질의 다중결합화는 DNA 결합 도메인이 결합하는 프로모터 성분에 대해 전사 활성제를 표적으로 하며, 이에 따라 상기 프로모터 성분에 연결된 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. 전사 활성 도메인을 생략시키거나 전사 활성 도메인 대신에 억제 도메인을 치환하는 것은 표적 유전자의전사를 억제하는 데 유용한 유사 키메라를 제공하게 한다. 복합 DNA 결합 단백질 및 이들이 결합하는 DNA 서열은 본원에서 참고문헌으로 인용된 상기 포메란츠 등(1995)의 문헌에 기재되어 있다. 이러한 복합 DNA 결합 도메인은 복합 DBD가 결합하는 유사(cognate) DNA 서열을 함유하는 표적 유전자 구성물과 함께 본 발명의 실시에서 DNA 결합 도메인으로 사용될 수 있다.In embodiments of the invention in which transcription relates to direct activation, the heterologous domains of the first and second chimeric proteins are derived from DNA binding domains such as Gal4 or chimeric DNA binding domains such as ZFHD1 or VP16 or p65 respectively. A transcriptional activation domain such as that shown. Multiplexing of chimeric proteins containing such transcriptional activation domains to chimeric proteins containing DNA binding domains targets transcriptional activators to the promoter component to which the DNA binding domain binds, thus targeting genes linked to the promoter component Activates transcription. Omitting the transcriptional activation domain or substituting the inhibitory domain instead of the transcriptional activation domain allows to provide similar chimeras useful for inhibiting transcription of the target gene. Complex DNA binding proteins and the DNA sequences to which they bind are described in the above Pomeranz et al. (1995), incorporated herein by reference. Such complex DNA binding domains may be used as DNA binding domains in the practice of the present invention in conjunction with target gene constructs containing cognate DNA sequences to which complex DBDs bind.

전사의 간접적인 활성에 관련되는 구체예에서, 키메라의 이종 도메인은 집성화 또는 다중결합화시에 반응성 프로모터의 조절하에서 전사의 활성을 유도하는 시그날 단백질의 이펙터(effactor) 도메인이다. 예를 들어, 시그날 도메인은 T 세포 수용체의 제타 하위단위 세포내 도메인일 수 있으며, 이는 집성화시에 IL-2 프로모터 또는 이들이 유도체(예를 들어, 반복된 NF-AT 결합 부위)에 연결된 유전자의 전사를 유도한다.In embodiments related to indirect activity of transcription, the heterologous domain of the chimera is the effector domain of a signal protein that induces the activity of transcription under the control of a reactive promoter upon aggregation or multibinding. For example, the signal domain may be a zeta subunit intracellular domain of the T cell receptor, which, upon aggregation, is responsible for the IL-2 promoter or genes to which they are linked to derivatives (eg, repeated NF-AT binding sites). Induce transcription.

본 발명이 또 다른 관점에서, 이종 도메인은 상호 결합시에 세포 치사를 유도할 수 있는 단백질 도메인이다. 이러한 도메인의 예로는 Fas 항원 또는 TNF R1의 세포내 도메인이다. Fas 도메인을 함유하는 키메라 단백질은 PCT/US94/01617의 내용과 유사하게 고안되어 생성될 수 있다.In another aspect of the invention, the heterologous domain is a protein domain capable of inducing cell death upon mutual binding. Examples of such domains are Fas antigens or intracellular domains of TNF R1. Chimeric proteins containing Fas domains can be designed and produced similarly to the contents of PCT / US94 / 01617.

조작된 수용체 도메인Engineered Receptor Domain

이미 언급된 바와 같이, FKBP 및 FRB 도메인은 천연 FKBP 및 FRB 도메인의 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 서열을 함유할 수 있다. 천연 발생 서열은 사람 FKBP12의 서열 및 사람 FRAP의 FRB 도메인을 포함한다. 선택적으로, 펩티드 서열은 이러한 천연 펩티드 서열로부터 유도될 수 있으나, 하나 또는 두개의 이러한 펩티드 서열내에는 일반적으로 10개 이하, 바람직하게는 1 내지 5개의 돌연변이 물질을 포함한다. 본원에서 보다 상세하게 기재되고, 도 2에 도시된 바와 같이, 이러한 돌연변이물질은 많은 중요한 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, FKBP 도메인은 변형되지 않은 FKBP 도메인에 대해 라파로그를 우선적으로, 즉 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 또 4개(크기의 순서에 따라 보다 효과적임) 결합시킬 수 있도록 변형될 수 있다. FRB 도메인은 변형되지 않은 FRB 도메인에 대해 (변형된 또는 변형되지 않은) FKBP 라파로그를 우선적으로, 즉 하나 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 (크기의 순서에 따라 보다 효과적임) 결합시킬 수 있도록 변형될 수 있다. FKBP 및 FRB 도메인은 라파로그와, 또는 라파마이신과의 3부 복합체를 우선적으로 즉 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개(크기의 순서에 따라 보다 효과적임) 결합시킬 수 있도록 변형될 수 있다. 도 2a-e는 단지 예시의 목적으로 제시된 것이며, 기타 관련된 여러 변형된 라파로그와 보상 돌연변이 물질을 함유하는 수용체 도메인의 조합이 또한 본 발명에 포함되며 여러 용도로 적용될 수 있다.As already mentioned, the FKBP and FRB domains may contain peptide sequences selected from the peptide sequences of native FKBP and FRB domains. Naturally occurring sequences comprise the sequence of human FKBP12 and the FRB domain of human FRAP. Alternatively, peptide sequences may be derived from such native peptide sequences, but generally comprise one or two such peptide sequences, generally no more than 10, preferably 1-5 mutants. As described in more detail herein and shown in FIG. 2, such mutants can confer many important properties. For example, the FKBP domain preferentially prioritizes the raplogs, i.e. one or more, preferably two, more preferably three or four (more effective in order of size) for the unmodified FKBP domain. It can be modified to engage. FRB domains preferentially (ie, at least one, preferably two, more preferably three (more in order of size) FKBP raphalogs (modified or unmodified) over unmodified FRB domains Can be modified to bond. The FKBP and FRB domains can preferentially bind three-part complexes of rapalogues with rapamycin, namely one or more, preferably two, more preferably three (more effective in order of size). Can be modified to be. 2A-E are for illustrative purposes only, a combination of several related modified rapalogs and a receptor domain containing a reward mutant is also encompassed by the present invention and may be applied for various purposes.

(a) FKBP(a) FKBP

여러 치환기(범프(bump))를 함유하는 FK506의 유도체와의 향상된 결합능을 부여하는 FKBP 돌연변이 물질을 확인하는 방법은 PCT/US94/01617호에 기재되어 있다. 유사한 방법이 우선적으로로 범핑된 라파마이신 유도체, 즉, 라파로그를 결합시키는 변형된 FKBP를 얻는 데 사용될 수 있다. 라파마이신과 FKBP12 간의 복합체 구조는 공지되어 있다[참조예: Van Duyne et al., J. Am. Chem. Soc.(1991) 113, 7433-7434]. 이러한 데이타는 다양한 라파로그 치환기와 충돌할 수 있는 아미노산 잔기를 밝혀내는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법에서, 분자 모델화는 라파로그 치환기를 수용할 수 있는 FKBP 도메인내에서 캔디데이트(candidate) 아미노산 치환물질을 확인하는 데 사용되며, 이후 부위 유도된 돌연변이생성은 이와 같이 확인된 단백질 돌연변이 물질을 조작하는 데 사용된다. 돌연변이체는 표준 방법으로 발현되며, 이들의 라파로그에 대한 결합 친화성은 예를 들어, 로타마제(rotamase) 활성 억제에 의해, 또는 돌연변이체가 충분한 활성/친화성을 보유하는 경우에 FK506과 같은 분자와의 결합 경합에 의해 측정된다.Methods for identifying FKBP mutants that confer enhanced binding to derivatives of FK506 containing several substituents (bumps) are described in PCT / US94 / 01617. Similar methods can be used to obtain preferentially bumped rapamycin derivatives, ie modified FKBPs that bind rapalogues. The complex structure between rapamycin and FKBP12 is known. See, eg, Van Duyne et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113, 7433-7434. This data can be used to identify amino acid residues that may conflict with various Rapalog substituents. In this approach, molecular modeling is used to identify candidate amino acid substitutions within the FKBP domain that can accept Rapalog substituents, and then site-directed mutagenesis is used to manipulate the protein mutants thus identified. Used to. Mutants are expressed by standard methods, and their binding affinity to the rapalogs is, for example, by inhibition of rotamase activity, or when a mutant possesses sufficient activity / affinity with a molecule such as FK506. It is measured by the binding contention of.

특히, C-13 또는 C-14에서 변형된 라파마이신 유도체(즉, Y가 -OH 이외의 치환기이고/또는 Z가 =O이 아닌 라파로그)는 하나 이상의 잔기, 즉, Tyr26, Phe36, Asp37, Tyr82 및 Phe99가 보다 작은 측쇄(예를 들어, Gly, Ala, Val, Met 및 Ser과 같은)를 가지는 아미노산으로 치환된 FKBP에 우선적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 26 또는 36위치에서 변형된 돌연변이 FKBP의 예는 상기표 예시적 돌연변이 FKBP에 기재되어 있다. 유사하게, C20에서 변경된 라파로그(즉, R4가 -H 가 아닌 라파로그)는 Tyr82 및/또는 Ile56이 기타 아미노산, 특히 보다 작은 측쇄를 갖는 것들에 의해 치환되는 FKBP에 우선적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 추가의 실시예에서, C24에서 변경 부분을 함유하는 라파로그(즉, W가 =O가 아닌 라파로그)는 하나 이상의 Phe46, Phe48 및 Val55이 기타 아미노산, 특히 보다 작은 측쇄를 갖는 것들에 의해 치환되는 FKBP에 우선적으로 결합하는 것으로 여겨진다.In particular, the rapamycin derivatives modified at C-13 or C-14 (ie, rapalogues where Y is a substituent other than -OH and / or Z is not = 0) are one or more residues, ie Tyr26, Phe36, Asp37, It is believed that Tyr82 and Phe99 bind preferentially to FKBP substituted with amino acids having smaller side chains (eg, Gly, Ala, Val, Met and Ser). Examples of mutant FKBPs modified at position 26 or 36 are described in the table Exemplary Mutant FKBPs above. Similarly, altered rapalogs (ie, rapalogs in which R 4 is not -H) are believed to bind preferentially to FKBP where Tyr82 and / or Ile56 are substituted by other amino acids, especially those with smaller side chains. . In a further embodiment, the rapalog containing the altering moiety at C24 (ie, the rapalog where W is not = 0) is substituted by one or more Phe46, Phe48 and Val55 by other amino acids, especially those with smaller side chains. It is believed to bind preferentially to FKBP.

또한, C28 및/또는 C30에서 변경 부분을 함유하는 라파로그(즉, R가 H가 아니고/또는 V가 =O가 아닌 라파로그)는 Glu54가 또 다른 아미노산, 특히 보다 작은 측쇄를 갖는 것에 의해 치환되는 FKBP에 우선적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 특정 실시예가 선행하는 표에 기재되어 있다.In addition, the raphalogs containing a modification at C28 and / or C30 (ie, raphalogs in which R is not H and / or V is not = O) are substituted by Glu54 having another amino acid, especially a smaller side chain. It is believed to bind preferentially to the FKBP. Specific examples are listed in the preceding table.

반복 조작 및 단일 또는 복합 돌연변이체의 시험의 대안으로는 하나 이상의 라파로그 또는 라파마이신 치한기에 접촉하거나 인접하고 있는 구조적으로 확인된 잔기를 공동으로 무작위화시키는 것이다. 확인된 위치(앞 문단에서 기재된 바와 같은)에서 무작위화된 FKBP 도메인을 함유하는 폴리펩티드의 수집물은 예를 들어, 통상적인 합성 또는 유전 방법을 사용하여 제조된다. 이러한 수집물은 하나 이상의 이러한 위치에서 치환 아미노산을 함유하는 일련의 FKBP 도멘을 나타낸다. 수집물을 스크리닝시키고, 목적하는 라파로그 결합 특성을 갖는 FKBP 변이체를 선택한다. 일반적으로, 수 개의 무작위화 잔기는 동시에 측쇄간의 유리한 협조적 상호작용 가능성을 최대화시키므로써 소정의 범핑된 라파로그에 대해 보다 높은 친화성과 특이성의 보상 돌연변이체를 생성시키는 것으로 예상된다. 불연속 위치에서 무작위화된 라이브러리를 제조하는 기법은 공지되어 있으며 변성 올리고누클레오티드, 변성 올리고누클레오티드와의 PCR, 및 변성 올리고누클레오티드와의 돌연변이생성을 사용하는 프라이머 유도된 돌연변이생성을 포함한다[참조예: Lowman, H.B. and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol. 1991.3, 205-216; Dennis, M.S. and Lazarus, R.A. 1994. J. Biol. Chem. 269, 22129-22136; and 본원에 인용문헌].An alternative to repeat manipulations and testing of single or complex mutants is to jointly randomize structurally identified residues that are in contact with or adjacent to one or more rapalogues or rapamycin periods. Collections of polypeptides containing randomized FKBP domains at identified locations (as described in the preceding paragraph) are prepared, for example, using conventional synthetic or genetic methods. This collection represents a series of FKBP domains containing substituted amino acids at one or more such positions. The collections are screened and FKBP variants are selected that have the desired rapalog binding properties. In general, several randomized residues are expected to produce compensating mutants of higher affinity and specificity for a given bumped rapalog by maximizing the likelihood of advantageous cooperative interactions between the side chains at the same time. Techniques for preparing randomized libraries at discrete positions are known and include primer induced mutagenesis using denatured oligonucleotides, PCR with denatured oligonucleotides, and mutagenesis with denatured oligonucleotides. , HB and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol. 1991.3, 205-216; Dennis, M.S. and Lazarus, R. A. 1994. J. Biol. Chem. 269, 22129-22136; and cited herein.

또한, 많은 경우에, 라파마이신내 소정의 위치내에 있거나 인접하여 직접 접촉하는 단지 소수의 잔기의 무작위하는 최적으로 라파로그 치환기(범프)를 수용할 수 있는 FKBP 구조에서 모든 가능한 변이를 완전하게 조사할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 구조는 구조적 고려사항을 기초로 하지 않는 무작위 치환기를 함유하는 공평한 라이브러리로 관찰되어 범핑된 라파로그에 우선적으로 결합하는 민감한 돌연변이 물질 또는 그의 조합물을 확인한다. 몇몇 적합한 돌연변이 생성 개요가 기재되어 있으며, 알라닌-주사 돌연변이생성(참조: Cunningham and Wells(1989) Science 244, 1081-1085), PCR 오혼입 돌연변이 생성(참조예: Cadwell and Joyce, 1992, PCR Meth. Applic. 2, 28-33), 및 DNA 셔플링(shuffling)(참조: Stemmer, 1994, Nature 370, 389-391 and Crameri et al, 1996, Nature Medicine 2, 100-103)을 포함한다. 이러한 기법은 무작위 돌연변이체의 라이브러리 또는 일련의 단일 돌연변이체를 생성시킨 후, 스크리닝 또는 선택법에 의해 조사된다.In many cases, it is also possible to fully investigate all possible variations in the FKBP structure that can accommodate random optimally rapalogue substituents (bumps) of only a few residues within or adjacent to a predetermined position in rapamycin. It is not possible. Thus, the structure is observed with an equilibrium library containing random substituents that are not based on structural considerations to identify sensitive mutants or combinations thereof that preferentially bind to bumped raphalogs. Some suitable mutagenesis outlines have been described, alanine-injection mutagenesis (Cunningham and Wells (1989) Science 244, 1081-1085), PCR misincorporation mutagenesis (see Cadwell and Joyce, 1992, PCR Meth. Applic. 2, 28-33), and DNA shuffling (Stemmer, 1994, Nature 370, 389-391 and Crameri et al, 1996, Nature Medicine 2, 100-103). Such techniques are investigated by screening or selection after generating a library of random mutants or a series of single mutants.

많은 경우에, 소정의 범프의 우선적인 결합에 대해 최적의 돌연변이체를 확인하기 위한 효과적인 방법은 구조를 기초로 하며 공평한 접근법을 조합한 것이다[참조: Clackson adn Wells, 1994, Trends Biotechnology 12, 173-184(review)]. 예를 들어, 주요 접촉 잔기가 변성 올리고누클레오티로 PCR에 의해 무작위화되지만, 무작위 부위에서 추가의 돌연변이 물질을 도입하는 에러-증진 조건을 사용하여 수행되는 증폭화가 함께 하는 라이브러리의 구성이 있는 것으로 여겨진다.In many cases, an effective method for identifying optimal mutants for preferential binding of a given bump is a combination of structure-based and equitable approaches. Clackson adn Wells, 1994, Trends Biotechnology 12, 173- 184 (review)]. For example, although the major contact residues are randomized by PCR with denaturing oligonucleotides, there is a construct in the library that is accompanied by amplification performed using error-promoting conditions that introduce additional mutants at random sites. Is considered.

목적하는 돌연변이 물질에 대한 라이브러리의 스크리닝은 이스트 2-혼성계를 사용하여 수행될 수 있다[참조: Fields and Song(9189) Nature 340, 245-246]. 예를 들어, FRBVP16 융하물은 하나의 벡터에 도입될 수 있으며, 무작위화된 FKBP 서열의 라이브러리는 별개의 GAL4 융합 벡터에 클론될 수 있다. 이스트 공동-형질전환체는 범핑된 라파마이신(즉, 라파로그)으로 처리되며, 보상 FKBP 돌연변이체를 포함하는 것은 예를 들어, 베타-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 생성(스크린), 또는 경우에 따라 사용된 벡터에 대해 필수 영양소가 결핍되어 있는 판상에서의 생존(선택)에 의해 확인된다. FKBP-FRAP 상호작용을 브릿지하는 범핑된 라파마이신에 대한 필수조건은 잘못된 양성물질을 제거하기 위한 유용한 스크린이다.Screening of libraries for mutants of interest can be performed using a yeast two-hybrid system (Fields and Song (9189) Nature 340, 245-246). For example, the FRBVP16 melt can be introduced into one vector and a library of randomized FKBP sequences can be cloned into separate GAL4 fusion vectors. Yeast co-transformants are treated with bumped rapamycin (ie, rapalogue), and the inclusion of a compensating FKBP mutant, for example, in the production of beta-galactosidase or luciferase (screen), or This is confirmed by survival (selection) on a plate that lacks essential nutrients for the vector used. A prerequisite for the bumped rapamycin that bridges the FKBP-FRAP interaction is a useful screen to remove false positives.

FKBP(또는 FRB)의 라이브러리로부터 변형된 리간드-결합 도메인을 단리시키기 위한 또 다른 방법에서는 휴(Hu)등의 문헌(Hu, J. C., et al. 1990, Science, 250:1400-1403; 재조사를 위한 참조: Hu, J.C. 1995. Structure. 3:431-433)에 기재된 작용성 이량체 형성을 위한 유전자 선택법을 사용한다. 이 방법은 박테리오파아지 람다 억제제 cI가 동종이량체로서 DNA와 결합하며, 이러한 동종이량체의 오퍼레이터 DNA와의 결합이 파아지의 생존 주기의 세포 용해 경로와 관련된 파아지 유전자의 전사를 억제한다는 사실을 이용한다. 따라서, 작용성 람파 억제제를 발현시키는 박테리아 세포는 면역되어 파아지 람타를 초감염시키브로써 용해된다. 억제 단백질은 40 아미노산 연성 링커에 의해 카르복시 말단 이합체화 도메인에 결합된 아미노산 말단 DNA 결합 도메인(아미노산 1-92)를 포함한다. 단리된 N-말단 도메인은 비효과적인 이량체 형성으로 인해 친화성이 낮은 DNA와 결합한다. 고친화성 DNA 결합은 GCN4 류신 지퍼와 같은 이종 이합체화 도메인으로 회복될 수 있다. 휴등의 문헌에는 파아지 면역성이 유전자 선택으로서 사용되어 거대 군집의 서열롭터 람다 억제제 이량체를 매개할 수 있는 GCN4 류신 지퍼 돌연변이체를 분리시키는 시스템이 기재되어 있다[참조: Hu et al., 1990].Another method for isolating modified ligand-binding domains from a library of FKBP (or FRB) is described in Hu et al., Hu, JC, et al. 1990, Science, 250: 1400-1403; for reexamination. See, Hu, J. C. 1995. Structure. 3: 431-433), a gene selection method for functional dimer formation is used. This method takes advantage of the fact that the bacteriophage lambda inhibitor cI binds to DNA as a homodimer and that binding of the homodimer to the operator DNA inhibits the transcription of the phage gene associated with the cell lysis pathway of the phage's survival cycle. Thus, bacterial cells expressing functional lambpa inhibitors are immunized and lysed as phage lambta as a superinfection sieve. The inhibitory protein comprises an amino acid terminal DNA binding domain (amino acids 1-92) bound to the carboxy terminal dimerization domain by a 40 amino acid soft linker. Isolated N-terminal domain binds to low affinity DNA due to ineffective dimer formation. High affinity DNA binding can be restored to heterologous dimerization domains such as GCN4 leucine zippers. Hue et al. Describe a system for isolating GCN4 leucine zipper mutants capable of using phage immunity as gene selection to mediate large populations of sequencer lambda inhibitor dimers (Hu et al., 1990).

예를 들어, 범핑된 라파로그에 보충적인 FRAP 돌연변이체를 확인하도록 람다 억제제 시스템을 사용하기 위해, 돌연변이 FRAP 서열을 함유하는 람다 억제제-FRAP 라이브러리를 야생형 람다 억제제-FKBP 단백질을 발현시키는 대장균을 형질전환시킨다. FRAP 돌연변이체를 발현시키는 플라스미드를 높은 적정 농도의 람다 파아지 및 범핑된 라파마이신 화합물을 함유하는 박테리아 판상의 용해에서 생존하는 콜로니로부터 단리시킨다. 다르게는, FKBP 돌연변이체를 단리시키기 위해서, 상기 방법을 야생형 람다 억제제-FRAP 단백질을 발현시키는 대장균에 형질도입된 돌연변이체 FKBP 서열을 함유하는 람다 억제제-FKBP 라이브러리로 반복한다.For example, to use a lambda inhibitor system to identify FRAP mutants that are complementary to bumped rapalogs, a lambda inhibitor-FRAP library containing a mutated FRAP sequence may be transformed into E. coli expressing the wild-type lambda inhibitor-FKBP protein. Let's do it. Plasmids expressing FRAP mutants are isolated from colonies that survive in lysis on bacterial plates containing high titers of lambda phage and bumped rapamycin compounds. Alternatively, to isolate the FKBP mutant, the method is repeated with a lambda inhibitor-FKBP library containing the mutant FKBP sequence transduced into Escherichia coli expressing the wild type lambda inhibitor-FRAP protein.

또 다른 대안으로는 무작위화된 FKBP 서열을 파아지 디스플레이를 위한 벡터에 클로닝시켜, 시험관내에서 라파로그에 최적합하게 결합하는 변이체를 선택할 수 있도록 한다.Another alternative is to clone the randomized FKBP sequence into a vector for phage display, allowing the selection of variants that optimally bind to the rapalog in vitro.

시험관내에서의 친화성 선택은 여러 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 라파로그를 친화성 핸들(예를 들어, 헥사-히스티딘 택(tag), 또는 GST)로 태깅된 재조합 FRAP의 존재하에 용액중에서 라이브러리 파아지 푸울(pool)로 혼합하고, 생성된 복합체를 적합한 친화성 매트릭스상에서 포획하여 보충 돌연변이 물질을 함유하는 파아지 디스플레이 FKBP를 풍부하게 한다. 파아지 디스플레이는 문헌에 기재되어 있으며, 다른 시험관내 선별 시스템이 또한 고려된다(예를 들어, 람다 파아지상의 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 바쿨로바이러스상의 디스플레이). 도한, 선별 및 스크리닝 방법은 또한 생체내 증진된 안정성과 같은 본 발명의 출원에서 기타 유리한 특성을 개선시키는 데 사용될 수 있다[참조예: Clackson, T. and Wells, J. A. 1994. Trends Biotechnol. 12, 173-184].In vitro affinity selection can be performed in a number of ways. For example, the rapalogs are mixed into a library phage pool in solution in the presence of recombinant FRAP tagged with an affinity handle (eg, hexa-histidine tag, or GST), and the resulting complex is mixed. Capture on suitable affinity matrix to enrich for phage display FKBP containing supplemental mutants. Phage display is described in the literature and other in vitro selection systems are also contemplated (eg, display on lambda phage, display on plasmid, display on baculovirus). In addition, screening and screening methods can also be used to improve other advantageous properties in the present application, such as enhanced stability in vivo. See, eg, Clackson, T. and Wells, J. A. 1994. Trends Biotechnol. 12, 173-184.

(b) FRAP(b) FRAP

유사한 고려사항이 FRAP-결합 이펙터 도메인내 라파마이신과 관련하여 변경물질(즉, 범핑된)을 함유하는 라파로그에 우선적으로 결합하는 돌연변이체 FRB 도메인의 생성에 적용된다. 예를 들어, 하나 이상이 잔기 Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, Trp2101 및 Asp2102에 대한 아미노산 치환물질을 함유하는 것을 제외하고 사람 FRAP FRB 펩티드 서열을 기재로 하는 FRB와 함게 C7에서 -OMe 이외의 치환기를 함유하는 라파로그를 사용하여 우선적으로 결합할 수 있다. 예시적 돌연변이 물질로는 Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2021A, T2098A, T2098N 및 T2098가 포함된다. C28에서 -OH 이외의 치환기 및/또는 C30에서 =O 이외의 치환기를 함유하는 라파로그는 Glu2032에 대해 아미노산 치환물질을 함유하는 FRAP 단백질에 우선적으로 결합하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 돌연변이 물질로는 E2032A 및 E2032S가 포함된다. 상기 위치에 하나 이상의 아미노산 치환물질, 이러한 위치(즉, 이러한 잔기에서 치환된 여러 아미노산을 함유하는)에서 무작위화된 단백질 또는 펩티드의 라이브러리, 전체 단백질 도메인을 무작위화하는 라이브러리, 또는 이러한 일련의 돌연변이의 조합물이 우선적으로 범핑된 라파로그에 결합하는 돌연변이 FRAP를 확인하기 위해 상기 기재된 절차를 사용하여 이루어진다.Similar considerations apply to the generation of mutant FRB domains that preferentially bind to rapalogues containing modifiers (ie, bumped) with respect to rapamycin in the FRAP-binding effector domains. For example, a substituent other than -OMe in C7 with FRB based on a human FRAP FRB peptide sequence, except that at least one contains amino acid substitutions for residues Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, Trp2101 and Asp2102. It can bind preferentially using the containing rapalog. Exemplary mutants include Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2021A, T2098A, T2098N and T2098. Raphalogs containing substituents other than -OH at C28 and / or substituents other than = O at C30 can be used to preferentially bind to FRAP proteins containing amino acid substitutions for Glu2032. Exemplary mutants include E2032A and E2032S. At least one amino acid substitution at that position, a library of proteins or peptides randomized at this position (ie, containing multiple amino acids substituted at these residues), a library that randomizes the entire protein domain, or a series of such mutations The combination is made using the procedure described above to identify mutant FRAP that binds preferentially bumped raphalogs.

라파로그와 착화된 FKBP 단백질의 복합체에 대한 캔디데이트 돌연변이체 FRB이 친화성은 여러 방법에 의해 검정될 수 있다; 예를 들어, 약제의 존재하에서 GST-FKBP에 대한 시험관애 변역된 FRB 돌연변이체이 결합(참조: Chen et al. 1995. Proc. natl. Acad. Sci. USA 92, 4947-4951); 또는 이스트 이중 혼성 검정에서 적합한 FKBP 융해 단백질과의 라파로그-의존 전사 활성 복합체로의 관여 능력.The affinity of the Candidate mutant FRB for the complex of the Rapalog and the complexed FKBP protein can be assayed by several methods; For example, in vitro transformed FRB mutants to GST-FKBP in the presence of a drug bind (Chen et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4947-4951); Or ability to involve rapalog-dependent transcriptional activity complexes with a suitable FKBP fusion protein in a yeast double hybrid assay.

목적한 결합 특정을 가지는 FRB 돌연변이체를 다양한 분류 방법을 사용하여 파아지 상에 디스플레이된 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 라파로그를 친화성 핸들(예를 들어, 헥사-히스티딘 택(tag), 또는 GST)로 태깅된 재조합 FRAP의 존재하에 용액중에서 라이브러리 파아지 푸울(pool)로 혼합하고, 생성된 복합체를 적합한 친화성 매트릭스상에서 포획하여 보충 돌연변이 물질을 함유하는 파아지 디스플레이 FKBP를 풍부하게 한다.FRB mutants with the desired binding specificity can be isolated from libraries displayed on phage using various sorting methods. For example, the rapalogs are mixed into a library phage pool in solution in the presence of recombinant FRAP tagged with an affinity handle (eg, hexa-histidine tag, or GST), and the resulting complex is mixed. Capture on suitable affinity matrix to enrich for phage display FKBP containing supplemental mutants.

본 발명이 여러 구체예에서 다양하게 될 수 있는 FRB 융합 단백질이 추가 특성은 사용된 FRB 도메인의 정확한 서열이다. 일부 사용에 있어서, 최소(89 아미노산) FRB 도메인보다 큰 FRB의 부분을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이들은 잔기 Glu2025로의 N-말단 연장(바람직하게는 적어도 Art2018 또는 Ile2021로의 연장) 뿐만 아니라 위치 2113을 지나는 C-말단 연장(예를 들어 위치 2113, 2141 또는 2174 또는 이를 지남) 포함하며, 이는 몇몇 경우에 중첩된 FRB 도메인의 안정성 및/또는 발현의 효율을 개선시킬 수 있다. 상이한 FRB 서열 말단이 사용될 수 있는 다른 적용으로는 긴 링커가 예를 들어, 세포막에 또는 DNA상에 FRB-매개된 단백질-단백질 결합에 요구되는 폴리펩티드 사슬의 변형을 수용하도록 FRB 도메인의 어느 한측 또는 양측상에 입체적 근거에 적합한 것이 포함된다. 반대로, 다른 적용에 있어서 FRB 도메인이 한측 또는 양측상의 짧은 링커는 생물학적 기능에 적합하게 이종 작용 도메인(들)을 제공하기에 바람직하거나 요구될 수 있다. 사람 유전자 치료 적용에 있어서, 이러한 링커에 대한 천연 사람 FRAP 서열의 사용은 일반적으로 이종 서열의 도입에 바람직하거나 숙주 유기체내 면역 반응을 일으키는 위험성을 감소시킬 것이다.A further feature of the FRB fusion proteins, in which the invention may be varied in various embodiments, is the exact sequence of the FRB domain used. For some uses, it may be desirable to use a portion of FRB that is larger than the minimum (89 amino acid) FRB domain. These include the N-terminal extension to residue Glu2025 (preferably at least to Art2018 or Ile2021) as well as the C-terminal extension past position 2113 (eg, positions 2113, 2141 or 2174 or beyond), which in some cases It may improve the stability and / or efficiency of expression of overlapping FRB domains. Other applications in which different FRB sequence termini can be used include either or both sides of the FRB domain such that the long linker accommodates modification of the polypeptide chain required for FRB-mediated protein-protein binding, eg, on cell membranes or on DNA. Suitable for three-dimensional basis is included in the image. In contrast, in other applications short linkers on one or both sides of the FRB domain may be desirable or required to provide heterologous functional domain (s) suitable for biological function. In human gene therapy applications, the use of native human FRAP sequences for such linkers will generally reduce the risk of introducing an heterologous sequence or causing an immune response in the host organism.

일부 라파로그, 특히 C28, C30, C7 및 C24상에 있는 것들과 같이 FKBP 결합 도메인 및 FRAP 결합 도메인 사이의 경계에 인접하여 있는 것으로 여겨지는 위치에서 변경 물질 또는 치환기(라파마이신에 비해)를 가지는 라파로그는 라파마이신에 비해 두개의 포유동물 FKBP 및 FRB 도메인, 특히 천연 사람 펩티드 서열을 함유하는 도메인을 가지는 복합체를 형성하는 능력이 감소된다. 이러한 감소된 복합체 형성능은 본원에서 언급된 직접 또는 간접 검정 방법에 의해 측정되는 감소된 결합 친화성 또는 T 세포 증식 검정과 같은 적합한 검정에서 측정되는 감소된 면역억제 활성으로 분명해질 수 있다. 이러한 경우에서, 반복 절차가 천연 사람 펩티드 서열을 함유하는 상응하는 도메인보다 효과적으로 라파로그와 착화될 수 있는 돌연변이 FKBP 및 돌연변이 FRB 쌍을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 먼저 앞서 의된 바와 같이 라파로그에 결합할 수 있는 보충의 변경된 FKBP 도메인을 확인할 수 있고, 이후 라파로그와의 복합체에서 친화성 매트릭스로서 상기 돌연변이 FKBP 도메인을 사용하여 상기 복합체와 결합할 수 있는 보충의 변경된 FRB 도메인을 선택할 수 있다. 이러한 돌연변이 생성 및 스크리닝의 수개의 사이클은 단백질 쌍을 최적화시키기 위해 사용될 수 있다.Rapa with altering substances or substituents (relative to rapamycin) at positions believed to be adjacent to the boundary between the FKBP binding domain and the FRAP binding domain, such as those on some rapalogues, particularly those on C28, C30, C7 and C24. The log has a reduced ability to form a complex having two mammalian FKBP and FRB domains, especially a domain containing native human peptide sequences, compared to rapamycin. Such reduced complex-forming ability can be evident with reduced immunoaffinity activity measured in suitable assays such as reduced binding affinity or T cell proliferation assays measured by the direct or indirect assay methods mentioned herein. In such cases, repeat procedures can be used to identify mutant FKBP and mutant FRB pairs that can be complexed with rapalogs more effectively than the corresponding domains containing native human peptide sequences. For example, first, a modified FKBP domain of a supplement capable of binding to rapalog can be identified as described above, and then using the mutant FKBP domain as an affinity matrix in the complex with rapalog to bind to the complex. One can choose to supplement the altered FRB domain. Several cycles of such mutation generation and screening can be used to optimize protein pairs.

일부 구체예에서, 단백질-단백질 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 돌연변이 물질을 함유하는 FRB 및/또는 FKBP 도메인을 사용하는 것이 바람직할 것이다(참조예: 도 2E). 예를 들어, 라파마이신 또는 소정의 라파로그에 결합되는 경우, 돌연변이 FRB에 비해 어느 정도 덜 효과적으로 내인성 FRB과 착화될 수 있는 돌연변이 FKBP 도메인이 특히 가치가 있다. 또한, 내인성 FKBP와 라파마이신의 복합체보다는 어느 정도 보다 효과적으로 돌연변이 FKBP와 라파마이신 또는 소정의 파라로그의 복합체와 결합할 수 있는 돌연변이 FRB 도메인이 가치가 있다. 이미 기재된 것과 유사한 선택 및 스크리닝 접근법이 (i) 라파마이신 또는 라파로그 및 내인성 FRB를 가지는 3부 복합체를 형성하는 도메인의 능력을 어느 정도 감소시키는 FKBP 도메인으로 아미노산 치환기, 결실물, 또는 삽입물을 확인하기 위해, (ii) 라파마이신 또는 라파로그 및 내인성 FKBP를 가지는 3부 복합체를 형성하는 도메인의 능력을 어는 정도 감소시키는 FKBP 도메인으로 아미노산 치환기, 결실물, 또는 삽입물을 확인하기 위해, (iii) 상대 단백질내의 보충 돌연변이 물질을 선택 및/또는 이와 다르게는 확인하기 위해 사용될 수 있다. 3부 복합체 형성에 효율이 감소된 적합한 돌연벼이 FKBP이 예로는, 하나 또는 두개의 His87 및 Ile90이 거대한 측쇄 그룹을 함유하는 Arg, Trp, Phe, Tyr 또는 Lys와 같은 아미노산으로 치환된 포유동물, 바람직하게는 사람 FKBP; FRB 도메인 함유 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 사람의 FRB 도메인을 포함하며, 펩티드 서열은 상기에 기재된 바와 같이 돌연변이화되어 돌연변이 FKBP 및 라파마이신 또는 소정의 라파로그와 3부 복합체를 형성할 수 있는 보충 변이체를 생성할 수 있다. H87W 또는 H87R hFKBP12와 함께 유용할 수 있는 예시적 FRB 돌연변이물질에는 Y2038이 V, S, A 또는 L로 교체되고, F2039가 A로 교체되고/또는 R2042가 L, A 또는 S로 교체된 사람 FRB가 포함된다. I90W 또는 I90R hFKBP12와 함께 유용할 수 있는 예시적 FRB 돌연변이 물질에는 K2095가 L, S, A 또는 T로 교체된 사람 FRB가 포함된다.In some embodiments, it will be desirable to use FRB and / or FKBP domains containing mutants that can affect protein-protein interactions (see, eg, FIG. 2E). For example, mutant FKBP domains that are capable of complexing with endogenous FRBs to some extent less effectively than mutant FRBs are particularly valuable when bound to rapamycin or a given rapalogue. It is also worth noting that a mutant FRB domain capable of binding to a complex of mutant FKBP and rapamycin or a given paralog more effectively than the complex of endogenous FKBP and rapamycin. Selection and screening approaches similar to those already described (i) identify amino acid substituents, deletions, or inserts with FKBP domains that somewhat reduce the ability of rapamycin or a domain to form a three-part complex with raplog and endogenous FRB. To identify (ii) amino acid substituents, deletions, or inserts with a rapamycin or FKBP domain that reduces the ability of the domain to form a three-part complex with rapamycin and endogenous FKBP to (iii) a relative protein. Supplementary mutants within can be used to select and / or otherwise identify. Suitable mutant FKBPs with reduced efficiency in the formation of a three-part complex are examples of mammals in which one or two His87 and Ile90 are substituted with amino acids such as Arg, Trp, Phe, Tyr or Lys containing large side chain groups. Let FKBP; FRB domain containing preferably a FRB domain of a mammal, more preferably a human, wherein the peptide sequence can be mutated as described above to form a three-part complex with the mutant FKBP and rapamycin or a given rapalogue Complementary variants can be generated. Exemplary FRB mutants that may be useful with H87W or H87R hFKBP12 include human FRBs with Y2038 replaced with V, S, A or L, F2039 replaced with A and / or R2042 replaced with L, A or S. Included. Exemplary FRB mutants that may be useful with I90W or I90R hFKBP12 include human FRBs where K2095 has been replaced with L, S, A or T.

추가로, 본 발명의 수용체 도메인을 최적화하는 데 있어서, 폴리펩티드 서열의 면역생성은 MHC 단백질에 의한 펩티드의 결합 및 내인성 T-세포 수용체에 의한 외래로서 제시된 펩티드의 인식을 필요로 하는 것으로 인지되어야 한다. 적어도 사람 유전자 치료 적용에 있어서, 펩티드 서열 연결을 포함하는 소정의 외래 펩티드 서열을 맞추는 것이, 즉, 사람에게 면역학적으로 제시되는 가능성을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 사람 MHC 제 1류 분자에 결합하는 펩티드는 결합된 펩티드에서의 중요한 '고정' 위치에 특정한 잔기에 반드시 필요하다. 예를 들어 HLAA2는 위치 2에 류신, 메티오닌 또는 이소류신을 필요로 하고, C-말단에 류신 또는 발린을 필요로 한다[참조예: Stern and Wiley(1994) Structure 2, 145-251]. 따라서, 본 발명의 실시에서 단백질을 조작함에 있어서, 이러한 잔기의 주기성은 특히 사람 유전자 치료 적용에 있어서 피하는 것이 바람직하다. 상기 적용은 점 돌연변이를 수용체 도메인에 조작하는 것을 제한하지 않은 것을 포함하는 본 발명의 모든 단백질을 조작하는 양태와 다양한 단백질 도메인간의 경계를 선택하거나 설계하는 데 적용한다.In addition, in optimizing the receptor domain of the present invention, it should be appreciated that immunogenicity of the polypeptide sequence requires binding of the peptide by the MHC protein and recognition of the peptide as foreign by the endogenous T-cell receptor. For at least human gene therapy applications, it may be desirable to fit certain foreign peptide sequences, including peptide sequence linkages, ie to minimize the possibility of being immunologically presented to humans. For example, a peptide that binds to a human MHC class 1 molecule is essential for a residue specific to an important 'fixed' position in the bound peptide. For example, HLAA2 requires leucine, methionine or isoleucine at position 2 and leucine or valine at the C-terminus (see, eg, Stern and Wiley (1994) Structure 2, 145-251). Thus, in manipulating proteins in the practice of the present invention, the periodicity of such residues is preferably avoided, especially in human gene therapy applications. The application applies to selecting or designing the boundaries between various protein domains and embodiments of engineering all proteins of the invention, including but not limited to engineering point mutations in the receptor domain.

기타 성분, 설계 특성 및 적용Other ingredients, design features and applications

키메라 단백질은 이종 도메인으로서 막보유 도메인과 같은 세포 국소화 도메인을 함유할 수 있다[참조예: PCT/US94/01617, 특히 페이지 26-27]. 간단히, 막보유 도메인은 숙주 세포에 대해 내인성이든지 아니든지 용이한 막 결합 단백질로부터 단리될 수 있다. 막보유 도메인은 많은 수용체를 포함하는 막통과 보유 도메인, 즉 세포 표면 단백질이 경우에서와 같이 막을 통과하여 연장되는 아미노산일 수 있다. 막통과 펩티드 서열은 또한 세포외 및/또는 세포내 도메인의 일부 또는 전체에 연장될 수 있다. 다르게는, 막보유 도메인은 세포 표면 막의 지질과 결합하도록 하는 미리스토일화 또는 팔미토일화 부위와 같은 지질 막 보유 도메인일 수 있다. 지질 막 보유 도메인은 상기 막에 결합하는 N-말단 결합을 위한 코드화 서열의 5' 말단에, 그리고, C-말단 결합을 위한 3' 말단에 인접하여 첨가되는 것이 일반적일 것이다. 지질 막 결합에 제공되는 후번역 과정을 포함하는 펩티드 서열은 문헌에 기재되어 있다[참조: Carr, et al., PNAS USA(1988) 79, 6128; Aitken, et al., FEBS Lett.(1982) 150, 314; Henderson, et al., PNAS USA(1983) 80, 319; Schulz, et al., Virology(1984), 123, 2131; Dellman, et al., Nature(1985) 314, 374; Ann. Rev. of Biochem. (1988) 57, 69에서는 검토됨]. 가치있는 아미노산 서열은 서열 M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R을 포함한다. 다양한 DNA 서열이 사용되어 본 발명의 여러 키메라 단백질에 있는 이러한 서열을 코드화할 수 있다. 기타 국소화 단백질은 소기관-표적 도메인 및 -K-D-E-L 및 -H- D-E-L과 같은 서열(이들은 소포체에 이들을 함유하는 단백질을 표적화한다) 뿐만 아니라 (직접) 전사 조절을 위해 구상된 키메라 단백질에 특히 유용한 핵 국소화 서열을 포함한다. 여러 세포 국소화 서열 및 시그날이 당업에 널리 공지되어 있다.Chimeric proteins may contain a cell localization domain, such as a membrane-bearing domain, as a heterologous domain (see, eg, PCT / US94 / 01617, in particular pages 26-27). In brief, membrane-bearing domains can be isolated from easy membrane binding proteins, whether or not endogenous to the host cell. The membrane-bearing domain may be a transmembrane and retention domain containing many receptors, ie amino acids in which cell surface proteins extend across the membrane as in the case. The transmembrane peptide sequence may also extend to some or all of the extracellular and / or intracellular domains. Alternatively, the membrane bearing domain can be a lipid membrane bearing domain such as a myristoylated or palmitoylated site that allows binding to lipids of the cell surface membrane. Lipid membrane retention domains will generally be added at the 5 'end of the coding sequence for N-terminal binding to the membrane and adjacent to the 3' end for C-terminal binding. Peptide sequences comprising post-translational processes provided for lipid membrane binding are described in the literature (Carr, et al., PNAS USA (1988) 79, 6128; Aitken, et al., FEBS Lett. (1982) 150, 314; Henderson, et al., PNAS USA (1983) 80, 319; Schulz, et al., Virology (1984), 123, 2131; Dellman, et al., Nature (1985) 314, 374; Ann. Rev. of Biochem. (1988) 57, 69]. A valuable amino acid sequence comprises the sequence M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R. Various DNA sequences can be used to encode such sequences in the various chimeric proteins of the invention. Other localization proteins are particularly useful for chimeric proteins designed for (direct) transcriptional regulation as well as organelle-target domains and sequences such as -KDEL and -H-DEL (they target proteins containing them in the endoplasmic reticulum). It includes. Several cell localization sequences and signals are well known in the art.

CD3 제타 사슬과 같은 세포질 시그날 개시 도메인을 포함하는 다양한 작용 도메인, 기타중에서 VP16 및 GAL4를 포함하는 핵전사 인자 도메인, Fas 세포질 도메인 및 기타 도메인을 포함하는 아폽토시스를 일으킬 수 있는 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 코드하하는 구성물의 설계, 집합 및 용도와관련하여 본 발명의 실시예 사용될 수 있는 추가의 상세한 내용은 PCT/US94/01617 및 PCT/US95/10591에 기재되어 있다. 후자의 국제 출원은 추가로 생약제학적 연구에 있어서 질병 모델로 사용될 수 있는 유전적으로 조작된 동물의 생성에 특별하게 적용할 수 잇는 추가의 특성이 기재되어 있다. 이러한 특성에는 키메라 단백질의 발현을 위한 구성물에 있어서 조직 특이적 조절 성분의 사용 및 lox P 서열에 의해 측면에 위치하는 관심있는 유전자를 제거하도록 유도하는 표적 유전자로서 Cre 재조합효소의 발현에 대해 조절된 전사가 적용되는 것이 포함된다. 이러한 특성은 본 발명에 적용될 수 있다.Chimeric proteins containing various functional domains, including cytoplasmic signal initiation domains, such as the CD3 zeta chain, among others, nuclear transcription factor domains including VP16 and GAL4, Fas cytoplasmic domains, and other domains capable of apoptosis Further details that can be used in the embodiments of the present invention in connection with the design, assembly, and use of coded components are described in PCT / US94 / 01617 and PCT / US95 / 10591. The latter international application further describes additional properties that are particularly applicable to the generation of genetically engineered animals that can be used as disease models in herbal medicine research. These properties include transcription regulated for expression of Cre recombinase as a target gene that induces the use of tissue specific regulatory components in constructs for the expression of chimeric proteins and the removal of genes of interest flanked by lox P sequences. This includes applying. This property can be applied to the present invention.

여러 가지 경우에, 특히 본 발명에 따라 처리되는 세포를 함유하는 전동물을 포함하는 구체예에서, 요구되는 일부 경우에 종종 키메라 단백질의 다양한 도메인이 숙주 세포와 동일한 종의 단백질로부터 유도되는 것이 바람직하다. 이와 같이, 사람 세포의 유전자 처리에 있어서, 종종 이종 도메인(뿐만 아니라 FKBP 및 FRB 도메인)이 박테리아, 이스트 또는 다른 비사람 공급원보다는 사람 기원인 것이 바람직하다.In many cases, especially in embodiments involving whole animals containing cells treated according to the invention, in some cases where desired, it is often desirable for the various domains of the chimeric protein to be derived from a protein of the same species as the host cell. . As such, in gene processing of human cells, it is often desirable that the heterologous domains (as well as the FKBP and FRB domains) are of human origin rather than bacteria, yeast or other non-human sources.

발명자들은 또한 에피토프 택이 본 발명의 키메라 단백질내로 혼합되어 편리하게 검출할 수 있는 것을 언급하고 있다.The inventors also mention that the epitope tag can be mixed into the chimeric protein of the invention and conveniently detected.

세포형 특이성 발현의 조직 특이성Tissue Specificity of Cell Type Specificity Expression

일부 구체예에서, 키메라 단백질은 세포 특이성 또는 조직 특이성 방식으로 발현되는 것이 바람직하다. 발현의 상기 특수성은 세포형 특이성 전사 조절 서열(예를 들어 프로모터/인헨서)에 키메라 단백질을 코드화시키는 DNA 서열 하나 이상을 실시가능하게 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 수많은 세포형 특이성 전사 조절 서열은 공지되어 있다. 다른 서열은 세포 특이성 방식으로 발현되는 유전자로부터 수득될 수 있다. 예를 들어 PCT/US95/10591 호, 특히 36 및 37 페이지를 참조한다.In some embodiments, the chimeric protein is preferably expressed in a cell specific or tissue specific manner. Such specificity of expression can be achieved by operatively binding one or more DNA sequences encoding a chimeric protein to a cell type specific transcriptional regulatory sequence (eg, promoter / enhancer). Numerous cell type specific transcription control sequences are known. Other sequences can be obtained from genes expressed in a cell specific manner. See for example PCT / US95 / 10591, in particular pages 36 and 37.

예를 들어, 키메라 단백질을 발현시키는 구성물은 선택된 조직에서 특이성 발현을 위해 공지된 유전자로부터 유도된 조절 서열을 함유할 수 있다. 대표적인 실시예가 하기에 기재되어 있다:For example, constructs expressing chimeric proteins may contain regulatory sequences derived from known genes for specific expression in selected tissues. Representative examples are described below:

표적 유전자 구성물Target gene constructs

키메라 단백질이 이것의 다중 결합이 표적 유전자의 전사를 활성화시키도록 설계된 본 발명의 구체예서, 적당한 표적 유전자 구성물은 또한 처리된 세포에서 사용된다. 적당한 표적 유전자 구성물은 표적 유전자 및 키메라 단백질의 다중 결합에 응답하는 프로모터 및/또는 인헨서와 같은 동족 전사 조절 요소를 함유하는 것이다. 전사의 직접적인 활성화를 포함하는 구체예에서, 응답은 본 발명의 키메라 단백질의 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 DNA 서열(즉, 키메라 단백질이 결합하는 DNA 서열) 하나 이상의 표적 유전자 구성물의 존재에 의해 달성될 수 있다. 전사의 간접적인 활성화를 포함하는 구체예에서, 응답은 키메라 단백질의 다중 결합에 의해 발생되는 세포간 시그날에 의해 활성화되는 프로모터 및/또는 인헨서 서열의 표적 유전자 구성물에의 존재에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질이 TCR 제타 사슬 세포간 도메인을 함유하는 경우, 표적 유전자는 IL-2-프로모터 영역의 발현 조절하에서 결합된다.In embodiments of the invention in which the chimeric protein is designed such that multiple binding thereof activates the transcription of the target gene, suitable target gene constructs are also used in the treated cells. Suitable target gene constructs are those containing cognate transcriptional regulatory elements such as promoters and / or enhancers that respond to multiple binding of target genes and chimeric proteins. In embodiments involving direct activation of transcription, the response may be achieved by the presence of one or more target gene constructs of the DNA sequence recognized by the DNA binding domain of the chimeric protein of the invention (ie, the DNA sequence to which the chimeric protein binds). Can be. In embodiments involving indirect activation of transcription, the response can be achieved by the presence of a promoter and / or enhancer sequence in the target gene construct that is activated by intercellular signals generated by multiple binding of chimeric proteins. . For example, if the chimeric protein contains a TCR zeta chain intercellular domain, the target gene is bound under the control of expression of the IL-2-promoter region.

본 발명은 또한 (a) 동족 DNA 서열, 예를 들어 본 발명의 DNA 결합 키메라 단백질이 결합할 수 있는 DNA 서열(또는 상기에 설명된 바와 같이 간접적인 활성화를 이루기 쉬운 DNA 서열), 및 (b) 숙주 세포에 내인성인 원하는 표적 유전자의 유전자좌로부터의 플랭킹 DNA 서열을 함유하는 표적 DNA 구성물을 제공한다. 이러한 구성물은 내인성 표적 유전자와 관련된 숙주 세포내에서 동족 DNA 서열의 동종 재조합을 가능케 한다. 다른 구체예에서 구성물은 원하는 유전자 및 원하는 유전자좌내로의 표적 유전자의 동종 재조합을 가능케하는 표적 유전자좌로부터의 플랭킹 DNA 서열을 함유한다. 상기 표적 구성물은 또한 동족 DNA 서열을 함유할 수 있거나, 동족 DNA 서열은 유전자좌에 의해 제공될 수 있다.The invention also relates to (a) a cognate DNA sequence, eg, a DNA sequence to which the DNA binding chimeric protein of the invention can bind (or a DNA sequence that is prone to indirect activation as described above), and (b) A target DNA construct is provided that contains flanking DNA sequences from the locus of a desired target gene that is endogenous to the host cell. Such constructs allow homologous recombination of cognate DNA sequences in host cells associated with endogenous target genes. In other embodiments the construct contains a flanking DNA sequence from a target locus that allows homologous recombination of the desired gene and target gene into the desired locus. The target construct may also contain cognate DNA sequences, or cognate DNA sequences may be provided by loci.

상기 구체예중 어느 하나의 표적 유전자는 예를 들어 표면막 단백질(예컨대, 수용체 단백질), 분비 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, Cre과 같은 재조합제, 리보짐 또는 안티센스 RNA를 코드화시킬 수 있다. 일반적인 설계 및 구성물의 상세한 설명을 위해 그리고 유전자 치료를 포함하는 다양한 적용을 위해 PCT/US94/01617를 참조하고 질병의 동물 모델에 관련된 적용을 위해 PCT/US95/10591을 참조한다.The target gene of any of the above embodiments may encode, for example, surface membrane proteins (eg, receptor proteins), secretory proteins, cytoplasmic proteins, nuclear proteins, recombinants such as Cre, ribozyme or antisense RNA. See PCT / US94 / 01617 for detailed descriptions of general designs and constructs and for various applications including gene therapy and PCT / US95 / 10591 for applications related to animal models of disease.

본 발명은 키메라 단백질에 대한 여러 가지 배열을 포함한다. 그러나, 표적 유전자 전사의 활성화를 포함하는 모든 경우에, 키메라 단백질은 하기의 중요한 특징을 갖는다: 키메라를 코드화시키는 구성물을 함유하는 세포 및 표적 유전자 구성은 다중 결합 리간드의 부재보다는 이의 존재하에서 표적 유전자를 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3 또는 4개 이상 또는 더 많은 크기로 발현시킨다. 최상으로, 선택된 유전자의 발현은 세포가 다중 결합 리간드이거나 이에 노출되지 않는 경우에 관찰되지 않는다.The present invention includes various arrangements for chimeric proteins. However, in all cases involving activation of target gene transcription, the chimeric protein has the following important features: Cells containing constructs encoding chimeric and target gene constructs target genes in their presence rather than in the absence of multiple binding ligands. One or more, preferably two or more, more preferably three or four or more sizes. Bestly, expression of the selected gene is not observed when the cell is or is not exposed to multiple binding ligands.

재생시키기 위해, 키메라 단백질은 라파미신 또는 라파로그 리간드에 세포의 노출시에, 즉 키메라의 다중 결합 이후에 처리된 세포내에서 표적 유전자의 전사의 검출될 수 있는 수준을 초기화시킬 수 있다. 이와 같이, 표적 유전자의 전사는 키메라 단백질 분자를 다중 결합시킬 수 있는 라파미신 또는 라파로그 리간드에 세포의 노출 이후에 본 발명의 유전적으로 처리된 세포내에서 활성화될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 유전적으로 처리된 세포는 상기에 설명된 바와 같이 키메라 단백질을 함유하고 상기 키메라 단백질 분자를 다중 결합시킬 수 있는 라파미신 또는 라파로그 리간드의 존재 및/또는 농도에 응답한다. 상기 응답은 표적 유전자의 전사의 활성화에 의해 증명된다. 상기 전사 활성도는 표적 유전자의 전사에 대한 모든 통상적인 검정에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 다른 구체예에서, 키메라의 리간드 중재 다중 결합에 대한 생물학적 응답은 표적 유전자의 전사의 직접적인 활성화보다는 세포 치사 또는 다른 생물학적 사건이다.To regenerate, the chimeric protein can initiate a detectable level of transcription of the target gene in the treated cells upon exposure of the cells to rapamycin or rapalogue ligands, ie after multiple binding of the chimeric. As such, transcription of the target gene can be activated in the genetically treated cells of the present invention following exposure of the cells to rapamycin or rapalogue ligands capable of multiplexing chimeric protein molecules. In other words, the genetically treated cells of the present invention respond to the presence and / or concentration of rapamycin or rapalogue ligands that contain chimeric proteins and are capable of multiplexing the chimeric protein molecules as described above. The response is evidenced by the activation of transcription of the target gene. The transcriptional activity can be readily detected by all conventional assays for the transcription of target genes. In other embodiments, the biological response to ligand mediated multiple binding of the chimera is cell death or other biological event rather than direct activation of transcription of the target gene.

세포내로 구성물의 주입Injection of components into cells

본 발명은 동물 세포의 처리 및 상기 처리된 동물 세포의 사용을 포함하는 적용에 특히 유용하다. 동물 세포는 곤충, 벌레 또는 포유류 세포일 수 있다. 말, 소, 양, 개, 고양이, 쥐, 및 비사람 영장류 세포를 포함하여, 다양한 포유류 세포가 사용될 수 있을지라도, 사람 세포가 특히 관심의 대상이 되고 있다. 다양한 종 중에서, 소페의 다양한 유형, 예를 들어 조혈성, 신경계, 신경교, 간엽, 피부, 점막, 간질, 근육(평활근 세포 포함), 지라, 망상, 상피, 내피, 간장, 신장, 위장, 폐, 섬유아 세포, 및 다른 세포 유형이 사용될 수 있다. 특히 관심있는 세포는 에리트로이드, 림프구 또는 골수성 단구 계열 이외에 근모 세포 및 섬유아 세포과 관련된 유핵 세포중 어느 하나를 포함할 수 있는 조혈성 세포이다. 또한 관심있는 세포는 가계 및 선조 세포, 예컨대 조혈성, 신경계, 간질, 근육, 간장, 폐, 위장 및 간염 가계 세포이다.The invention is particularly useful for applications involving the treatment of animal cells and the use of such treated animal cells. Animal cells may be insect, worm or mammalian cells. Human cells are of particular interest, although various mammalian cells can be used, including horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, and nonhuman primate cells. Among various species, various types of vesicles, such as hematopoietic, nervous system, glial, mesenchymal, skin, mucous membranes, epilepsy, muscle (including smooth muscle cells), spleen, reticular, epithelial, endothelial, liver, kidney, gastrointestinal, lung, Fibroblasts, and other cell types, can be used. Cells of particular interest are hematopoietic cells which may comprise any of the nucleated cells associated with myoblasts and fibroblasts in addition to the erythroid, lymphocyte or myeloid monocyte lineage. Also of interest are household and progenitor cells such as hematopoietic, nervous system, epilepsy, muscle, hepatic, lung, gastrointestinal and hepatitis household cells.

세포는 자기 세포, 공통 유전자 세포, 동종 세포일 수 있고, 일부 경우에는 의도된 숙주 유기체와 관련된 이종 세포일수도 있다. 세포는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 프로필을 변화시키고, 세포 파괴 활성등과 관련된 유전자의 발현을 증가시키거나 억제함으로써 세포 파괴 가능성을 증가시키거나 불활성화시키는, MHC 분자 하나 이상을 발현시키기 위해 제공되는, 작용성 부류 I MHC 분자의 형성, 부류 II 분자의 불활성화를 방지하기 위해 β2-마이크로글로불린을 불활성화시킴으로써 변형될 수 있다.The cells may be self cells, consensus gene cells, allogeneic cells, and in some cases may be heterologous cells associated with the intended host organism. The cells are provided for expressing one or more MHC molecules, which change the major histocompatibility complex (MHC) profile and increase or inactivate cell disruption potential by increasing or inhibiting expression of genes associated with cell disruption activity, etc. It can be modified by inactivating β 2 -microglobulin to prevent the formation of functional class I MHC molecules, inactivation of class II molecules.

일부 경우에 특이성 클론 또는 올리고클론 세포가 관심이 될 수 있고, 이 경우의 세포는 특정 항원 특이성 또는 귀소 표적 부위 특이성을 갖는 T 세포 및 B 세포와 같이, 특정한 특이성을 갖는다.In some cases specific clone or oligoclonal cells may be of interest, in which case the cells have specific specificities, such as T cells and B cells having specific antigen specificity or homing target site specificity.

본 발명의 키메라 단백질 및 표적 유전자를 코드화시키는 구성물은 구성물을 함유하는 숙주 세포의 선택을 고려하는 하나 이상의 마커와 관련있는 많은 경우에, 하나 이상의 DNA 분자 또는 구성물과 같이 세포내로 주입될 수 있다. 구성물은 통상적인 방식으로 제조될 수 있고, 코딩 서열 및 조절 영역은 단리되고, 적절하게 결찰되고, 적당한 클로닝 숙주에서 클론되고, 한정 또는 서열화, 또는 다른 편리한 수단에 의해 분석될 수 있다. 특히, PCR을 사용하여, 작용성 단위 전부 또는 일부를 포함하는 개개의 단편은 단리될 수 있고, 변이 하나 이상이 적절하게 프라이머 리페어(repair), 결찰, 체외 변이 유발을 이용하여 주입될 수 있다. 일단 구성물이 적당한 서열을 가지도록 완성되고 표시된 후 어느 편리한 수단에 의해서나 숙주 세포내로 주입될 수 있다. 구성물은 에피좀 복제가 가능한 벡터(예를 들어, BPV 또는 EBV 벡터) 또는 숙주 세포의 염색제내로의 통합을 위해 설계된 벡터내로 포함될 수 있다. 구성물은 감염 또는 세포내로의 형질주입을 위해, 레트로바이러스를 포함하여, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 또는 단순 포진 바이러스(HSV) 또는 다른 것과 유사한 비복제성, 결손 바이러스 게놈내로 통합되고 패키지될 수 있다. 대안적으로, 구성물은 DNA 등의 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 바이오리스틱스, 칼슘 포스페이트 형질 전환, 리포펙션, 마이크로인젝션에 의해 주입될 수 있다. 숙주 세포는 일부 경우에 구성물의 주입전에 배양물에서 성장되고 전개될 것된 후, 구성물의 주입 및 구성물의 통합을 위해 적절하게 처리될 것이다. 그 후 세포는 구성물내에 존재하는 마커에 의해 전개되고 스크린될 것이다. 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 마커는 hprt, 네오미신 저항 물질, 티미딘 키나제, 히그로미신 저항 물질 등을 포함하고, Tac, CD8, CD3, Thy1 및 NGF 수용체와 같은 다양한 세포 표면 마커가 있다.Constructs encoding the chimeric proteins and target genes of the invention may be injected intracellularly, such as one or more DNA molecules or constructs, in many cases involving one or more markers that allow for the selection of host cells containing the constructs. Constructs can be prepared in a conventional manner, and coding sequences and regulatory regions can be isolated, appropriately ligated, cloned in appropriate cloning hosts, and analyzed by definition or sequencing, or other convenient means. In particular, using PCR, individual fragments comprising all or a portion of the functional units can be isolated and one or more mutations can be injected using appropriate primer repair, ligation, in vitro mutation induction. Once the construct is complete and marked to have the proper sequence, it can be injected into the host cell by any convenient means. The construct may be included in a vector capable of episomal replication (eg, a BPV or EBV vector) or a vector designed for incorporation into a stain of host cells. The constructs are integrated and packaged into a nonreplicating, defective virus genome, similar to adenovirus, adeno-associated virus (AAV), or herpes simplex virus (HSV) or others, including retroviruses, for infection or intracellular transfection. Can be. Alternatively, the construct can be injected by protoplasm fusion, electroporation, biolithography, calcium phosphate transformation, lipofection, microinjection, such as DNA. The host cell will in some cases be grown and developed in culture prior to injection of the construct and then appropriately processed for infusion of the construct and integration of the construct. The cells will then be developed and screened by markers present in the construct. Various markers that can be used successfully include hprt, neomycin resistant materials, thymidine kinase, hygromycin resistant materials, and the like, and there are various cell surface markers such as Tac, CD8, CD3, Thy1 and NGF receptors.

일부 경우에, 구성물은 동종 재조합을 위한 표적 부위를 가질 수 있고, 구성물이 특정 유전자좌에서 통합되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 구성물은 본 발명의 재조합 표적 구성물을 갖는 내인성 유전자를 삭제시키고/거나 대체시킬 수 있다(동일한 유전자좌 또는 다른 위치에서 이루어짐). 동종 재조합에 있어서, 세포는 일반적으로 Ω 또는 O-벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Thomas 및 Capecchi, Cell(1987) 51, 503-512; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352; 및 Joyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156.In some cases, the construct may have a target site for homologous recombination and it is desirable for the construct to be integrated at a particular locus. For example, constructs may delete and / or replace endogenous genes having recombinant target constructs of the invention (done at the same locus or at other locations). For homologous recombination, cells can generally use Ω or O-vectors. See, eg, Thomas and Capecchi, Cell (1987) 51, 503-512; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352; And Joyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156.

구성물은 유전자 모두를 코드화시키는 단일 DNA 분자, 또는 유전자 하나 이상을 갖는 상이한 DNA 분자와 같이 주입될 수 있다. 구성물은 각각 동일하거나 상이한 마커와 함께, 동시에 또는 연속적으로 주입될 수 있다.Constructs can be injected with a single DNA molecule encoding all of the genes, or with different DNA molecules having one or more genes. The constructs can be injected simultaneously or sequentially, each with the same or different markers.

복제의 박테리아 또는 이스트 기원과 같이 유용한 요소, 선택성 및/또는 증폭성 마커, 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 발현을 위한 프로모터/인헨서 요소, 및 포유류 발현 조절 원소 등을 함유하는 벡터(구성물 DNA의 주를 제조하고 형질 전환을 수행하는데 사용될 수 있음)는 종래 기술에 공지되어 있고, 많이 시판되고 있다.Vectors containing useful elements such as bacterial or yeast origin of replication, selectable and / or amplifiable markers, promoters / enhancer elements for expression in prokaryotic or eukaryotic cells, and mammalian expression control elements, etc. Can be used to prepare and perform transformation) are known in the art and are commercially available.

동물내로 구성물의 주입Injection of components into the animal

DNA 구성물로 생체외에서 변형되는 세포는 선택 조건하에서 배양물에서 성장할 수 있고, 원하는 구성물을 갖도록 선택되는 세포는 전개된 후, 예를 들어 숙주 세포내의 구성물의 존재를 결정하기 위한 폴리머라아제 사슬 반응 및/또는 원하는 유전자 생성물의 생성을 위한 검정을 이용하여, 추가로 분석될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 확인된 후, 계획대로 사용될 수 있는데, 예를 들어 배양물에서의 성장 되거나 숙주 유기체내로 주입될 수 있다.Cells that are ex vivo modified with the DNA construct can be grown in culture under selected conditions, and the cells selected to have the desired construct can be developed, for example, after the polymerase chain reaction to determine the presence of the construct in the host cell, and And / or using assays for the production of desired gene products. Modified host cells can be identified and used as planned, for example, grown in culture or injected into the host organism.

세포의 특성에 따라, 세포는 숙주 세포, 예를 들어 포유류내로, 여러 방식으로 주입될 수 있다. 조혈성 세포는 통상적으로 약 104이상의 세포 및 일반적으로 약 1010이하의 세포가 있는 혈관 시스템내로 주사에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 세포의 수는 많은 상황, 주입의 목적, 세포의 수명, 사용되는 프로토콜, 예를 들어, 투여 회수, 증식되는 세포의 능력, 치료제의 안정도, 치료제에 대한 생리학적 요구 등에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 예를 들어 근모세포, 섬유아세포에 있어서, 세포의 수는 약 104이상 및 약 109이하일 것이고 분산액과 같이 도포될 수 있고, 일반적으로 관심 부위 또는 근처에 주사될 수 있다. 세포는 일반적으로 생리학적으로 허용될 수 있는 매질일 것이다.Depending on the nature of the cell, the cell can be injected into the host cell, for example a mammal, in a number of ways. Hematopoietic cells may be administered by injection into a vascular system, which typically has about 10 4 or more cells and generally about 10 10 or less cells. The number of cells used will vary depending on many circumstances, the purpose of the infusion, the life of the cells, the protocol used, for example the number of doses used, the ability of the cells to proliferate, the stability of the therapeutic agent, the physiological demand for the therapeutic agent, and the like. Generally, for example, for myoblasts, fibroblasts, the number of cells will be at least about 10 4 and up to about 10 9 and may be applied as a dispersion and generally injected at or near the site of interest. The cells will generally be a physiologically acceptable medium.

본 발명에 따라 처리되는 세포는 또한 치료 단백질의 생성을 위해 숙주 유기체 또는 환자내로 주입되기 전에, 통상적인 생체적합성 물질 및 방법을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Hguyen et al, Tissue Implant Systems and Methods for Sustaining viable High Cell Densities within a Host, US 특허 제 5,314,471(Baxter International, Inc.); Uludag and Sefton, 1993, J Biomed. Mater. Res. 27(10):1213-24(HepG2 세포/히드록시에틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트 막); Chang et al, 1993, Hum Gene Ther 4(4):433-40 (mouse Ltk-cells expressing hGH/immunoprotective perm-selective alginate microcapsules; Reddy et al, 1993, J Infect Dis 168(4):1082-3(alginate); Tai and Sun, 1993, FASEB J 7(11):1061-9 (mouse fibroblast expressing hGH/alginate-poly-L-lysine-alginate membrane); Ao et al, 1995, Transplanation Pro. 27(6):3349, 3350(alginate); Rajotte et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):3389 (alginate); Lakey et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):3266 (alginate); Korbutt et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):3212 (alginate); Dorian et al, US 특허 제 5,429,821 호(alginate); Emerich et al, 1993, Exp Neurol 122(1):37-47 (polymer0encapsulated PC12 cells); Sagen et al, 1993, J Neurosci 13(6):2415-23 (bovine chromaffin cells encapsulated in semipermeable polymer membrane and implanted into rat spinal subarachnoid space); Aebischer et al, 1994, Exp Neurol 126(2):151-8(polymer-encapsulated rat PC12 cells implanted into monkeys. 또한 하기 문헌을 참조한다: Aebischer, WO 92/19595); Savelkoul et al, 1994, PNAS USA 91(6):2324-8 (engineered BHK cells expressing human nerve growth factor encapsulated in an immunoisolation polymeric device and transplanted into rats); Emerich et al, 1994, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18(5):935-46 (polymer-encapsulated PC 12 cells implanted into rats); Kordower et al, 1994, PNAS USA 91(23):10898-902 (polymer-encapsulated engineered BHK cells expressing hNGF implanted into monkeys) and Butler et al WO 95/04521 (encapsulated device). 그 후 세포는 캡슐화된 형태로 동물 숙주, 바람직하게는 포유류 및 더욱 바람직하게는 세포를 필요로 하는 사람에게 주입될 수 있다. 바람직하게 캡슐화 물질은 반투과성이고, 캡슐화된 세포에 의해 제조되는 분비 단백질의 숙주내로의 방출을 가능케 한다. 많은 구체예에서, 반투과성 캡슐화는 캡슐화된 세포를 캡슐화된 세포가 주입되는 숙주 유기체로부터 면역학적으로 단리시킨다. 상기 구체예에서, 캡슐화되는 세포는 숙주종의 단백질 및/또는 바이러스 단백질 또는 숙주종과 다른 종으로부터의 단백질로부터 유도된 성분 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 하나 이상 발현시킬 수 있다. 예를 들어 상기 경우에서 키메라는 GAL4 및 VP16으로부터 유도된 요소를 함유할 수 있다. 세포는 수혈자와 다른 한 사람 이상의 개개인으로부터 유도될 수 있고 수혈자 유기체 또는 환자의 것과 다른 종으로부터 유도될 수 있다.Cells treated according to the invention can also be encapsulated using conventional biocompatible materials and methods prior to infusion into the host organism or patient for the production of therapeutic proteins. See, eg, Hguyen et al, Tissue Implant Systems and Methods for Sustaining viable High Cell Densities within a Host, US Pat. No. 5,314,471 to Baxter International, Inc .; Uludag and Sefton, 1993, J Biomed. Mater. Res. 27 (10): 1213-24 (HepG2 cells / hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate membrane); Chang et al, 1993, Hum Gene Ther 4 (4): 433-40 (mouse Ltk-cells expressing hGH / immunoprotective perm-selective alginate microcapsules; Reddy et al, 1993, J Infect Dis 168 (4): 1082-3 ( alginate); Tai and Sun, 1993, FASEB J 7 (11): 1061-9 (mouse fibroblast expressing hGH / alginate-poly-L-lysine-alginate membrane); Ao et al, 1995, Transplanation Pro. 27 (6) : 3349, 3350 (alginate); Rajotte et al, 1995, Transplantation Proc. 27 (6): 3389 (alginate); Lakey et al, 1995, Transplantation Proc. 27 (6): 3266 (alginate); Korbutt et al, 1995, Transplantation Proc. 27 (6): 3212 (alginate); Dorian et al, US Pat. No. 5,429,821 alginate; Emerich et al, 1993, Exp Neurol 122 (1): 37-47 (polymer0 encapsulated PC12 cells); Sagen et al, 1993, J Neurosci 13 (6): 2415-23 (bovine chromaffin cells encapsulated in semipermeable polymer membrane and implanted into rat spinal subarachnoid space); Aebischer et al, 1994, Exp Neurol 126 (2): 151-8 (polymer-encapsulated rat PC12 cells implanted into monkeys. See: Aebischer, WO 92/19595); Savelkoul et al, 1994, PNAS USA 91 (6): 2324-8 (engineered BHK cells expressing human nerve growth factor encapsulated in an immunoisolation polymeric device and transplanted into rats); Emerich et al, 1994, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18 (5): 935-46 (polymer-encapsulated PC 12 cells implanted into rats); Kordower et al, 1994, PNAS USA 91 (23): 10898-902 (polymer-encapsulated engineered BHK cells expressing hNGF implanted into monkeys) and Butler et al WO 95/04521 (encapsulated device). The cells can then be injected in an encapsulated form into animal hosts, preferably mammals and more preferably humans in need of the cells. Preferably the encapsulating material is semipermeable and allows release of the secreted protein produced by the encapsulated cells into the host. In many embodiments, semipermeable encapsulation immunologically isolates the encapsulated cells from the host organism into which the encapsulated cells are injected. In such embodiments, the cell to be encapsulated may express one or more chimeric proteins containing component domains derived from proteins of the host species and / or viral proteins or proteins from other species. For example, in this case the chimera may contain elements derived from GAL4 and VP16. The cell may be derived from a recipient or one or more other individuals and may be derived from a species other than that of the recipient organism or patient.

세포의 생체외 발현 대신에, 많은 상황에서 발명자는 세포를 생체내 변형을 바랄 수 있다. 이러한 목적을 위해, 다양한 기술이 생체내 표적 조직 및 세포의 변형을 위해 개발되어 왔다. 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 수많은 바이러스 벡터는 형질전환이 고려되고, 일부 경우에 숙주내에 바이러스의 통합이 고려된다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Dubensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda et al., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-17293 and Ferry, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381. 벡터는 주사, 예를 들어 혈관내 주사 또는 근육내 주사, 흡입, 또는 다른 비경구성 모드에 의해 투여될 수 있다. 비바이러스 운반 방법, 예를 들어 리포좀을 갖는 복합체를 통한 DNA의 투여, 주사, 카테테르 또는 바이로리스틱스에 의한 투여 방법이 사용될 수 있다.Instead of ex vivo expression of a cell, in many situations the inventor may wish to modify the cell in vivo. For this purpose, various techniques have been developed for modification of target tissues and cells in vivo. Numerous viral vectors such as adenoviruses, adeno-associated viruses and retroviruses are considered for transformation, and in some cases, for the integration of viruses into the host. See, eg, Dubensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda et al., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-17293 and Ferry, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381. The vector may be administered by injection, eg, by endovascular injection or by intramuscular injection, inhalation, or other parenteral mode. Non-viral delivery methods can be used, for example administration of DNA through injections with liposomes, injection, catheters or by virolytics.

생체내 유전자 변형에 따라, 변형 방식은 조직의 특성, 요구되는 세포형 변형의 효율, 특정 세포를 변형시키는 회수, 주입하려는 DNA 구성체에 조직의 영향력등에 따라 변할 수 있다. 표적 전사 초기화 영역을 운반하는 독소가 약화되거나 변형된 바이러스를 사용함으로써, 원하는 경우, 피상체 전사 인자 구성물 중 하나를 사용하는 바이러스를 활성화시켜, 바이러스가 제조되고 주위 세포를 형질 전환시킬 수 있다.Depending on the genetic modification in vivo, the manner of modification may vary depending on the characteristics of the tissue, the efficiency of the required cell type modification, the number of times to modify the particular cell, and the influence of the tissue on the DNA construct to be injected. By using a virus that has attenuated or modified toxins that carry the target transcription initiation region, the virus can be produced and transformed with surrounding cells, if desired, by activating the virus using one of the superficial transcription factor constructs.

DNA 주입은 모든 경우에 통합을 일으킬 필요가 없다. 일부 상황에서, 도입된 DNA의 순간적인 유지는 충분할 수 있다. 이러한 방식으로, 발명자는 짧은 주기 효과를 얻을 수 있고, 세포는 숙주내로 도입되고 나서, 세포는 사전 결정된 시간 후, 예를 들어 특정 부위에서 귀소될 수 있는 후에 되돌아 올 수 있다.DNA injection does not need to cause integration in all cases. In some situations, instantaneous maintenance of the introduced DNA may be sufficient. In this way, the inventor can obtain a short cycle effect, the cells can be introduced into the host, and then the cells can return after a predetermined time, for example after they can be returned at a particular site.

다중 결합제Multiple binders

본 발명에서 사용하기에 적합한 리간드는 FKBP 키메라 및 FRAP 키메라에 결합되어 트리파티티 복합체를 형성하는 라파미신 및 라파미신 유사체, 유도체 및 의사체(라파로그)를 포함한다. 처리된 세포에 내인성인 FKBP 및/또는 FRAP 단백질에의 결합을 감소시키고, 바람직하게는 상당히 방해하는 치환체(범프)를 하나 이상 함유하는 본 발명의 라파로그가 바람직하다. 본 발명의 변이 FKBP는 PCT/US94/ 01617 및 PCT/US94/08008에 설명된 바와 같이 제공된 라파로그에 결합시키기 위해 수득되고 스크린될 수 있다. 일부 라파로그는 (변이) FKBP 키메라 단백질, (변이) FRAP 키메라에 결합되거나, 복합되지만(도 2 참조), FKBP 복합체와 같이 FRAP에의 결합을 감소시키고, 바람직하게는 상당히 방해하는 임의의 치환체를 갖는다. 상기 펌프를 함유하는 라파로그는 FKBP12 또는 FRAP의 내인성 울혈에 의해 영향받지 않으면서 변이 FKBP 키메라 및/또는 변이 FRAP 키메라에 더욱 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이는 많은 적용, 특히 전체 유기체내에서의 사용에 있어서 바람직하다. 내인성 FRAP에의 감소된 결합의 추가 장점은 다중결합제가 단독으로 또는 내인성 FKBP12 또는 키메라 함유 FKBP 도메인과 함께, 라파미신에 관련하여 대응적으로 감소된 면역억압 활성 또는 메카니즘 기초 유독성을 갖는 것이다. 또한 본 발명에 의해 숙고되는 것은 표면 잔기로 인해 변이화가 내인성 FRAP에의 리간드 부속 결합으로부터 상당히 방해되지만, 보충 변이되는 FRB 도메인을 하나 이상 함유하는 키메라 단백질에 리간드 부속 방식으로 결합시킬 수 있는 변이 FKBP 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다(도 2-E 참조).Ligands suitable for use in the present invention include rapamycin and rapamicin analogs, derivatives and pseudo (rapalogs) that bind to the FKBP chimera and FRAP chimera to form a tripatitic complex. Preference is given to the rapalogues of the invention that contain one or more substituents (bumps) that reduce binding to, and preferably significantly interfere with, endogenous FKBP and / or FRAP proteins in the treated cells. Variant FKBPs of the present invention can be obtained and screened for binding to the provided rapalogs as described in PCT / US94 / 01617 and PCT / US94 / 08008. Some rapalogs bind to or complex with (variant) FKBP chimeric proteins, (variant) FRAP chimeras (see FIG. 2), but have any substituents that reduce binding to the FRAP and preferably significantly interfere with the FKBP complex. . The rapalog containing the pump can more selectively bind to mutant FKBP chimeras and / or mutant FRAP chimeras without being affected by the endogenous congestion of FKBP12 or FRAP. This is desirable for many applications, especially for use in the whole organism. A further advantage of reduced binding to endogenous FRAP is that the multibinding agents, either alone or in combination with endogenous FKBP12 or chimeric containing FKBP domains, have correspondingly reduced immunosuppressive activity or mechanism based toxicity with respect to rapamycin. Also contemplated by the present invention is that a variant of the FKBP domain capable of binding in a ligand-substrate manner to chimeric proteins containing one or more complementary mutations, although mutations due to surface residues significantly interfere with ligand attachment to endogenous FRAP. It is a chimeric protein containing (see Fig. 2-E).

PCT/US94/01617에 설명된 것과 같은, 단량성 1가 리간드, 이외에도 본원에 설명된 유도 화합물은 키메라 단백질 중 하나에 결합될 수 있지만, 이것의 이중 결합 또는 더 높은 다중 결합(리간드의 1가 특성에 따라 일어남)에 영향을 미치지 않는 다중 결합 길항근이다.In addition to monovalent monovalent ligands, such as those described in PCT / US94 / 01617, the inducible compounds described herein can be bound to one of the chimeric proteins, but are either double bonds or higher multiple bonds (monovalent properties of the ligand). It is a multiple binding antagonist that does not affect).

특정 관심의 라파로그는 사람 FKBP12에 결합되고/거나 FK506, FK520 또는 라파미신 중 어느 하나 보다 덜 유력한 크기 이상으로 이것의 로타마제 활성을 억제한다. 상기 검정은 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Holt, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1993, 115, 9925-9938. 억제 활서에서의 감소는 크기에 있어서 약 2 정도 만큼 클 수 있고, 일부 경우에 크기의 약 3 정도를 초과할 것이다. 유용한 라파로그 치환체는 다른 것들 중에서, 알킬, 아릴, -O-알킬, -O-아릴, 치환되거나 비치환된 아민, 아미드, 카르바미드 및 우레아를 포함하고, 이중 알킬 및 아릴은 본원의 다른 부분에 정의된 바와 같다. 예를 들어 PCT/US94/01617 및 PCT/US94/08008을 참조한다.Raphalogs of particular interest bind to human FKBP12 and / or inhibit its rotamase activity beyond a less potent size than any of FK506, FK520 or rapamicin. Such assays are well known in the art. See, eg, Holt, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1993, 115, 9925-9938. The reduction in inhibition type can be as large as about 2 in size and in some cases will exceed about 3 in size. Useful raphalog substituents include, among others, alkyl, aryl, -O-alkyl, -O-aryl, substituted or unsubstituted amines, amides, carbamides, and ureas, wherein double alkyls and aryls are other moieties herein. As defined in. See, eg, PCT / US94 / 01617 and PCT / US94 / 08008.

구체적으로 본 발명의 다중 결합 리간드는 하기 화학식의 라파미신 및 라파로그를 포함한다.Specifically, the multiple binding ligands of the present invention include rapamycin and rapalogue of the following formula.

상기식에서,In the above formula,

U는 -H, -OR1, -SR1, -OC(O)R1또는 -OC(O)NHR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NH-SO2-R1또는 -NHSO2R2(여기에서, R2는 치환된 아릴 또는 알릴 또는 알킬아릴(예를 들어 벤 질 또는 치환된 벤질)임)이고,U is -H, -OR 1 , -SR 1 , -OC (O) R 1 or -OC (O) NHR 1 , -NHR 1 , -NHC (O) R 1 , -NH-SO 2 -R 1 or -NHSO 2 R 2 , wherein R 2 is substituted aryl or allyl or alkylaryl (eg benzyl or substituted benzyl),

V는 -OR3또는 (=O)이고,V is -OR 3 or (= O),

W는 =O, =NR4=NOR4또는 =NNHR4, -NHOR4또는 -NHNHR4, -OR4, -OC(O)R4또는 -OC(O)NR4, 또는 -H이고,W is = O, = NR 4 = NOR 4 or = NNHR 4 , -NHOR 4 or -NHNHR 4 , -OR 4 , -OC (O) R 4 or -OC (O) NR 4 , or -H,

Y는 -OR5, -OC(O)R5또는 -OC(C)NHR5이고,Y is -OR 5 , -OC (O) R 5 or -OC (C) NHR 5 ,

Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, 또는 -OC(O)R6또는 -OC(O)NR6이고,Z is = O, -OR 6 , -NR 6 , -H, -NC (O) R 6 , or -OC (O) R 6 or -OC (O) NR 6 ,

R3는 H, -R7, -C(O)R7또는 -C(O)NHR7또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이고,R 3 is H, -R 7 , -C (O) R 7 or -C (O) NHR 7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate,

R4는 H 또는 알킬이다(여기에서, R1, R4, R5, R6및 R7은 개별적으로 H, 알킬 알킬아릴 또는 아릴로부터 선택된다).R 4 is H or alkyl, wherein R 1 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are individually selected from H, alkyl alkylaryl or aryl.

라파미신에서, U는 -OMe 이고, V는 =O이고, W는 =O이고, Y는 -OH이고, Z는 =O이며, R3및 R4는 페이지 1 상의 화학식(1)에 제시된 입체 이성질체를 갖는 H이다. 본 발명의 라파로그는 가능한 입체 이성질체 배향 중 어느 하나 중에 치환체를 함유할 수 있다.In rapamicin, U is -OMe, V is = O, W is = O, Y is -OH, Z is = O, and R 3 and R 4 are the steric solids shown in formula (1) on page 1 H with isomers. The rapalogs of the present invention may contain substituents in any of the possible stereoisomeric orientations.

본원에서 사용되는 용어로서, 알킬은 포화 및 불포화, 직쇄, 측쇄, 시클로, 및 폴리시클로 지방족 탄화수소(일반적으로 1 내지 8개의 연속 지방족 탄소 원자를 함유, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, 시클로프로필, n-부틸, 이소-부틸, 2차-부틸, t-부틸, 시클로부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, 2차-펜틸, 시클로펜틸등)를 포함하며, 이것은 히드록시, C1-C8알콕시, 아실록시, 카바모일, 아미노, N-아실아미노, 케토, 할로(클로로, 브로모, 플루오로 또는 요도), 트리할로메틸, 시아노, 카르복실, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 작용기(히드록시, 할로 및 시아노기를 제외하고, 그 자체가 상기 작용기중 하나 이상을 보유함)가 하나 이상 임의로 치환된다. 바람직한 탄화수소는 1 내지 6개의 연속 지방족 탄소 원자를 함유하는 알킬, 알콕시 및 아실기이고, 이들은 치환기를 보유할 수 있다.As used herein, alkyl refers to saturated and unsaturated, straight, branched, cyclo, and polycyclo aliphatic hydrocarbons (usually containing 1 to 8 consecutive aliphatic carbon atoms, for example methyl, ethyl, n-propyl, iso -Propyl, cyclopropyl, n-butyl, iso-butyl, secondary-butyl, t-butyl, cyclobutyl, n-pentyl, iso-pentyl, secondary-pentyl, cyclopentyl and the like), which is hydroxy , C 1 -C 8 alkoxy, acyloxy, carbamoyl, amino, N-acylamino, keto, halo (chloro, bromo, fluoro or urethra), trihalomethyl, cyano, carboxyl, alkyl, cyclo One or more functional groups selected from the group consisting of alkyl, aryl and heteroaryl (with the exception of hydroxy, halo and cyano groups themselves possess one or more of these functional groups) are optionally substituted. Preferred hydrocarbons are alkyl, alkoxy and acyl groups containing 1 to 6 consecutive aliphatic carbon atoms, which may bear substituents.

본원에서 사용되는 용어로서, 아릴은 안정한 시클로, 헤테로시클로, 폴리시클로, 및 폴리헤테로시클로 불포화 C3-C14부분(제한되지는 않지만 페닐, 비페닐, 나프틸, 피리딜, 푸릴, 티오페닐, 이미다조일, 피리미디닐 및 옥사조일에 의해 예시됨)을 포함하고, 이것은 히드록시, C1-C8알콕시, C1-C8측쇄 또는 직쇄 아킬, 아실록시, 카바모일, 아미노, N-아실아미노, 니트로, 할로, 트리플루오로메틸, 시아노, 및 카르복실로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 작용기(히드록시, 할로 및 시아노기를 제외하고, 그 자체가 상기 작용기중 하나 이상을 보유함)가 1 내지 5개로 치환될 수 있다.As used herein, aryl is a stable cyclo, heterocyclo, polycyclo, and polyheterocyclo unsaturated C 3 -C 14 moiety, including but not limited to phenyl, biphenyl, naphthyl, pyridyl, furyl, thiophenyl, Imidazoyl, pyrimidinyl and oxazoyl), which include hydroxy, C 1 -C 8 alkoxy, C 1 -C 8 branched or straight chain alkyl, acyloxy, carbamoyl, amino, N- A functional group selected from the group consisting of acylamino, nitro, halo, trifluoromethyl, cyano, and carboxyl (except for hydroxy, halo and cyano groups, itself has one or more of these functional groups) It may be substituted with 1 to 5.

본원에서 사용된 용어로서, 헤테로알킬 및 헤테로아릴은 탄소 원자 하나 이상을 대신하여 산소, 황, 또는 질소를 하나 이상 함유하는 알킬 및 아릴 부분을 각각 언급한다.As used herein, heteroalkyl and heteroaryl refer to alkyl and aryl moieties each containing one or more oxygen, sulfur, or nitrogen in place of one or more carbon atoms.

일부 구체예에서 특정 관심의 리간드는 위치 14에서 히드록실기를 보유하는 라파미신의 감소된 형태 또는 U가 C2-C8직쇄 사슬, 측쇄 또는 시클로 지방족 또는 알콕시 부분; 아릴 또는 헤테로아릴 치환 알킬 또는 알콕시 부분; 또는 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴옥시 부분(아릴 및 헤테로아릴 부분은 치환되거나 비치환될 수 없음)인 라파시민 유도체인, 라파미신 자체와 다른 화합물을 포함한다.In some embodiments the ligand of particular interest is a reduced form of rapamycin having a hydroxyl group at position 14 or a U-C 2 -C 8 straight chain, branched or cycloaliphatic or alkoxy moiety; Aryl or heteroaryl substituted alkyl or alkoxy moieties; Or rapamicin itself, which is a rapamycin derivative that is an aryl, aryloxy, heteroaryl or heteroaryloxy moiety (the aryl and heteroaryl moieties may not be substituted or unsubstituted).

여러 가지 상기 화합물, 또는 상기 치환체를 포함하는 관련 화합물의 실시예가 이들의 합성법과 같이, 종래 기술에 공지되어 있다. 예시를 위해, 하기 합성 도식이 원하는 라파로그를 생성하는데 사용될 수 있는 형질 전환을 대표한다:Examples of various such compounds, or related compounds comprising such substituents, are known in the art, as are their synthesis. For illustrative purposes, the following synthetic schemes represent transformations that can be used to generate the desired raphalogs:

C-7 범프의 제조Preparation of C-7 Bumps

[참조 문헌: Luengo, et al. J.Org. Chem, 59,6512 (1995). Luengo, et al. Chem ＆ Biol 2(7), 471-481 (1995)][Ref. Luengo, et al. J.Org. Chem, 59,6512 (1995). Luengo, et al. Chem & Biol 2 (7), 471-481 (1995)]

C-13 융기의 제조Preparation of C-13 Bumps

[참조 문헌 : Luengo et al. Tet. Lett. 35,6469 (1994)][References: Luengo et al. Tet. Lett. 35,6469 (1994)]

C-14 융기의 제조Preparation of C-14 Bumps

[참조 문헌 : Schubert, et al. Angew Chem Int Ed Engl 23,167 (1984)][Reference Document: Schubert, et al. Angew Chem Int Ed Engl 23,167 (1984)]

C-20 융기의 제조Preparation of C-20 Bumps

[참조 문헌 : Nelson, US Patent 5,387,680][Reference: Nelson, US Patent 5,387,680]

C-24 융기의 제조Preparation of C-24 Bumps

[참조 문헌 : Failli, et al. US Patent 5,373,014. Kao, et al. US Patent 5,378, 386. Lane, et al. Synthesis 1975, p136.][References: Failli, et al. US Patent 5,373,014. Kao, et al. US Patent 5,378, 386. Lane, et al. Synthesis 1975, p 136.]

C-28 융기의 제조Preparation of C-28 Bumps

C-30 융기의 제조Manufacture of C-30 Bumps

[참조 문헌 : Luengo et al. Tet.Lett. 35,6469(1994)][References: Luengo et al. Tet. Lett. 35,6469 (1994)]

C-14에서의 변형Variation at C-14

[참조 문헌 : Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35:6469(1994)][Ref. Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35: 6469 (1994)]

[참조 문헌 : Fisher, et al. J.Org.Chem. 56:2900(1991)][References: Fisher, et al. J. Org. Chem. 56: 2900 (1991)]

[참조 문헌 : Fisher, et al. J.Org.Chem. 56:2900(1991)][References: Fisher, et al. J. Org. Chem. 56: 2900 (1991)]

[참조 문헌 : Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35:6469(1994). Finet Chemical Reviews 89:1487(1989)][Ref. Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35: 6469 (1994). Finet Chemical Reviews 89: 1487 (1989)]

C-13에서의 변형Variation on C-13

[참조 문헌 : Donald, et al. Tetrahedron Letters 1375(1991)][Reference: Donald, et al. Tetrahedron Letters 1375 (1991)]

C-24에서의 변형Variation on C-24

[참조 문헌 : Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35:6469(1994)][Ref. Luengo, et al. Tetrahedron Letters 35: 6469 (1994)]

제형, 용량 및 투여Formulations, Dosages and Administration

단백질-단백질 상호작용을 촉진하기 위한 이들 능력의 효능에 의해, 라파마이신 또는 본 발명의 라파로그는 본 발명의 유전 공학적인 세포를 함유하는 포유 동물에서 약제학적의 조성물 및 본 발명의 키메라 단백질의 트리파티테 복합물의 제형을 촉진하는 방법에 이용될 수 있다.By the efficacy of these abilities to promote protein-protein interactions, rapamycin or a rapalogue of the present invention is a tree of pharmaceutical compositions and chimeric proteins of the present invention in mammals containing the genetically engineered cells of the present invention. It can be used in a method for promoting the formulation of the patite complex.

이러한 처리 또는 예방의 바람직한 방법은 유전학적인 세포중의 이러한 복합물의 측정 가능한 제형을 촉진시키기 위한, 또는 바람직하게는 예를 들어 표적 유전자의 전사, 유전학적인 세포의 아폽토시스, 등과 같은 이러한 복합체에 의해 시작된 원하는 생물학적 사건의 측정 가능한 발동 작용을 촉진하기 위한 조성물의 유효량을 포유동물에 투여하는 것이다.Preferred methods of such treatment or prevention are those desired to facilitate measurable formulation of such complexes in genetic cells, or preferably initiated by such complexes, for example transcription of target genes, apoptosis of genetic cells, and the like. An effective amount of a composition for promoting measurable actuation of a biological event is to be administered to a mammal.

치료상/프로필라틱 투여 및 약제 조성물Therapeutic / Prolactic Administration and Pharmaceutical Compositions

라파마이신 및 다양한 라파로그는 유리 형태에 또는 적당한 염 형태에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염 및 이들이 제조는 당분야의 종래 기술에 잘 알려져 있다. 이러한 조성물의 약제학적으로 허용가능한 염은 통상적인 비독성 염 또는 예를 들어 염기의 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 이러한 조성물의 4차 암모늄 염을 포함한다.Rapamycin and various rapalogs may be present in free form or in suitable salt form. Pharmaceutically acceptable salts and their preparation are well known in the art. Pharmaceutically acceptable salts of such compositions include conventional non-toxic salts or quaternary ammonium salts of such compositions formed from, for example, inorganic or organic acids of bases.

본 발명의 조성물은 수화물 또는 용매 화합물을 형성할 수 있다. 충전된 화합물이 물과 얼림건조됐을 때 수화물 종을 형성하거나, 적당한 유기 용매와 용액에서 농축됐을 때 용매 화합물을 형성하는 것은 당분야의 공지된 기술이다.The composition of the present invention may form a hydrate or a solvent compound. It is known in the art to form hydrate species when the charged compound is freeze-dried with water or to form a solvent compound when concentrated in a solution with a suitable organic solvent.

본 발명은 또한 치료상(또는 예방상)의 유효량의 조성물, 및 약제적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약제 조성물에 관한 것이다. 담체는 예를 들어, 식염, 완충된 식염, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물을 포함하고, 하기에 더 상세하게 논의되어 있다. 조성물은 필요에 따라 습윤 또는 에멀션화 제제, 또는 pH 완충제의 최소량을 또한 함유할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀션, 타블렛, 알약, 캡슐, 유지되는 방출 제형물, 또는 분말 형태로 존재할 수 있다. 조성물을 통상적인 결합제 또는 트리글리세리드와 같은 담체에 의해 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구 제형물은 또한 마니톨, 유당, 녹말, 스테아르산화마그네슘, 사카린화나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘, 등의 약제 정도와 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 제형은 혼합, 과립화, 및 바람직한 제조에 적당한 성분의 압축 또는 용해를 포함할 수 있다.The present invention also relates to pharmaceutical compositions containing a therapeutically (or prophylactically) effective amount of the composition and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Carriers include, for example, saline, buffered saline, glucose, water, glycerol, ethanol and combinations thereof, and are discussed in more detail below. The composition may also contain a minimum amount of a wetting or emulsifying agent, or pH buffer, as desired. The composition may be in the form of a liquid solution, suspension, emulsion, tablet, pill, capsule, sustained release formulation, or powder. The composition may be formulated as a suppository with a conventional binder or carrier such as triglycerides. Oral formulations may also include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharide, cellulose, magnesium carbonate, and the like. The formulation may comprise mixing, granulating, and compressing or dissolving the ingredients suitable for the desired preparation.

사용된 약제 담체는 예를 들어, 고체 또는 액체중의 하나일 수 있다.The pharmaceutical carrier used may, for example, be either solid or liquid.

실례가 되는 고체 담체는 유당, 테라 알바(terra alba), 자당, 활석, 겔라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아르산염, 스테아르산 및 이들의 유사체를 포함한다. 고체 담체는 향미료, 윤활제, 용해제, 현탁액 제제, 충전물, 글리단트, 압축 보조, 결합체 또는 타블렛-붕해제와 같을 역할을 또한 수행할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다; 이것은 또한 캡슐 물질이 될 수 있다. 분말에서, 담체는 정교하게 나눠진 활성 성분과의 혼합물에 존재하는 정교하게 나눠진 고체이다. 타블렛에서, 활성 성분은 적합한 비에서 필요한 압축 특성을 갖는 담체와 혼합되었고, 원하는 모양과 크기로 압축되었다. 분말과 타블렛은 바람직하게도 활성 성분을 99% 이하를 함유한다. 적합한 고체 담체는 예를 들어, 인산칼슘, 스테아르산화마그네슘, 활석, 당, 유당, 덱스트린, 녹말, 겔라틴, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸나트륨 셀룰로오스, 폴리비닐피르롤리딘, 낮은 용융 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다.Illustrative solid carriers include lactose, terra alba, sucrose, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, magnesium stearate, stearic acid and analogs thereof. Solid carriers can include one or more substances that can also serve as flavors, lubricants, solubilizers, suspension formulations, fillers, glycans, compression aids, binders, or tablet-disintegrants; It can also be a capsule material. In powders, the carrier is a finely divided solid present in a mixture with the finely divided active ingredient. In tablets, the active ingredient was mixed with the carrier having the necessary compression properties in suitable ratios and compacted in the shape and size desired. Powders and tablets preferably contain up to 99% of the active ingredient. Suitable solid carriers are, for example, calcium phosphate, magnesium stearate, talc, sugars, lactose, dextrin, starch, gelatin, cellulose, methyl cellulose, carboxymethylsodium cellulose, polyvinylpyrrolidine, low melt wax and ion exchange Resin.

실례가 되는 액체 담체는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 물 등을 포함한다. 액체 담체는 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽, 일릭서(elixirs) 및 가압 조성물의 제조에 이용된다. 활성 성분은 물, 유기 용매, 이 둘의 혼합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 오일 또는 지방과 같은 약제학적으로 허용 가능한 액체 담체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 용액 담체는 용해제, 유화제, 완충제, 예방제, 감미료, 향신료, 현탁 제제, 농조화제, 컬러(color), 점도 조절제, 안정제 또는 오스모-조절제와 같은 다른 적합한 조제적 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 담체의 적합한 예는 물(예를 들어, 상기 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 카르복시메틸나트륨 셀룰로오스 용액으로서의 첨가제를 부분적으로 함유하는), 알콜(1가 알콜 및 다가 알콜, 예를 들어 글리콜을 함유하는) 및 이들의 유도체, 및 오일(예를 들어, 분획된 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다. 부분적인 투여에 있어서, 담체는 또한 에틸 올레산염 및 이소프로필 미피스테이트와 같을 오일리 에스테르일 수 있다. 멸균 액체 카더(carder)는 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압 조성물을 위한 액체 담체는 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 추진제일 수 있다. 무균 용액 또는 현탁액인 액체 조제 조성물은 예를 들어, 근육내의, 복강내의 또는 피하의 주입에 이용될 수 있다. 무균 용액은 또한 정맥내로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 용액 또는 고체 조성물 형태에서 경구적으로 투여될 수 있다.Illustrative liquid carriers include syrup, peanut oil, olive oil, water and the like. Liquid carriers are used in the preparation of solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and pressurized compositions. The active ingredient may be dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable liquid carrier such as water, an organic solvent, a mixture of the two or a pharmaceutically acceptable oil or fat. Solution carriers may contain other suitable pharmaceutical additives such as solubilizers, emulsifiers, buffers, preventives, sweeteners, spices, suspending agents, thickening agents, colors, viscosity regulators, stabilizers or osmo-modulators. Suitable examples of liquid carriers for oral and parenteral administration include water (for example partially containing additives as the cellulose derivative, preferably carboxymethylsodium cellulose solution), alcohols (monohydric and polyhydric alcohols, eg Containing glycols) and derivatives thereof, and oils (eg, fractionated coconut oil and arachis oil). For partial administration, the carrier may also be an oily ester such as ethyl oleate and isopropyl mipistate. Sterile liquid carders are useful in sterile liquid form compositions for parenteral administration. The liquid carrier for the pressurized composition may be a halogenated hydrocarbon or other pharmaceutically acceptable propellant. Liquid preparation compositions, which are sterile solutions or suspensions, can be used, for example, for infusion intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously. Sterile solutions can also be administered intravenously. The composition may also be administered orally in the form of a solution or solid composition.

담체 또는 부형제는 왁스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸메타아크릴레이트 및 이들의 유사체를 수반하거나 갖는 글리세릴 모노스테아르산염 또는 글리세릴 디스테아르산염과 같이 당업자에 공지된 시간 지연 물질을 포함할 수 있다. 경구 투여를 위해 제형화될 때, PHOSAL PG-50(1,2-프로필렌 글리콜로 농축된 인지질, A.Nattermann ＆ Cie.GmbH)중의 0.01% 트윈 80은 라파마이신에 대한 허용 가능한 경구 제형물을 제공함으로서 인지되어 왔고, 다양한 라파로그에 대한 제형물에 적당할 수 있다.Carriers or excipients may include time delay materials known to those skilled in the art such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate with or without wax, ethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, methylmethacrylate and analogs thereof. Can be. When formulated for oral administration, 0.01% Tween 80 in PHOSAL PG-50 (phospholipid enriched with 1,2-propylene glycol, A.Nattermann & Cie.GmbH) provides an acceptable oral formulation for rapamycin. Has been recognized and may be suitable for formulation for various rapalogs.

조제적 형태의 광범위한 종류가 이용될 수 있다. 만약 고체 담체가 이용된다면, 제조물은 타블렛일 수 있고, 분말 또는 이식성 형태, 또는 알약 또는 마름모꼴 정제 중의 견고한 겔라틴 캡슐에 위치할 수 있다. 고체 담체의 양은 광범위하게 변하지만, 바람직하게는 약 25㎎ 내지 1g의 범위일 것이다. 만약 액체 담체가 이용된다면, 제조물은 시럽, 연질 겔라틴 캡슐, 주사약 병 또는 물약병중의 주입가능한 무균 용액 또는 현탁액, 또는 비수성 액체 현탁액의 형태로 존재할 것이다.A wide variety of pharmaceutical forms can be used. If a solid carrier is used, the preparation may be a tablet and may be placed in a solid gelatin capsule in powder or implantable form or in a pill or lozenge tablet. The amount of solid carrier varies widely but will preferably range from about 25 mg to 1 g. If a liquid carrier is used, the preparation will be in the form of injectable sterile solutions or suspensions in syrups, soft gelatin capsules, injection bottles or potions, or non-aqueous liquid suspensions.

안정한 물 가용성 적량 형태를 회수하기 위해, 라파마이신 또는 라파로그의 약학적으로 허용가능한 염이 0.3M 숙신산 또는 시트르산 용액과 같은 유기산 또는 무기산의 수용액에 용해될 수 있다. 대안적으로, 산성 유도체는 적합한 염기 용액에 용해될 수 있다. 만약 가용성 염 형태가 이용될 수 없다면, 조성물은 적합한 보조용매 또는 이들의 조합물에 용해된다. 이러한 적합한 보조용매의 예는 총 부피의 농축 범위 약 0% 내지 60%에서 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸화된 지방산, 지방 알코올 또는 글리세린 히드록시 지방산 에스테르, 및 이들의 유사체를 포함하며, 이 예들에 제한되지는 않는다.To recover a stable water soluble dosage form, a pharmaceutically acceptable salt of rapamycin or rapalogue may be dissolved in an aqueous solution of an organic or inorganic acid, such as a 0.3 M succinic or citric acid solution. Alternatively, the acidic derivatives can be dissolved in a suitable base solution. If a soluble salt form is not available, the composition is dissolved in a suitable cosolvent or combinations thereof. Examples of such suitable cosolvents are alcohols, propylene glycol, polyethylene glycol 300, polysorbate 80, polyoxyethylated fatty acids, fatty alcohols or glycerine hydroxy fatty acid esters in the concentration range from about 0% to 60% of the total volume, and Analogues thereof, but are not limited to these examples.

다양한 운반 시스템은 공지되어 있으며, 라파마이신 또는 라파로그, 또는 타블렛, 캡슐, 주입가능한 용액, 리포솜중의 캡슐형, 마이크로입자, 마이크로캡슐 등을 포함하는 이들의 다양한 제형물 투여에 이용될 수 있다. 주입의 방법은 피부, 피부내, 근내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 폐성, 경막, 눈 및 경구(일반적으로 바람직한)의 경로를 포함하며, 이 예들에 제한되지는 않는다. 화합물은 임의의 편리하거나 또는 적당한 경로 예를 들어, 주입 또는 대형 환제 주입에 의해, 상피 또는 점막피부 내장(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장의 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학상의 활성 제제와 함께 투여될 수 있다.Various delivery systems are known and can be used to administer rapamycin or rapalog or their various formulations, including tablets, capsules, injectable solutions, capsules in liposomes, microparticles, microcapsules and the like. Methods of infusion include, but are not limited to, the dermal, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, pulmonary, dural, eye, and oral (generally preferred) routes. The compound may be administered by any convenient or suitable route, for example, by infusion or large pill infusion, by absorption through the epithelial or mucosal skin gut (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) And other biologically active agents.

어떤 구체예에서, 치료를 필요로 하는 영역에 국부적으로 화합물을 투여하는 것은 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들어 진료 동안, 즉 국부적 적용 동안의 국부적 주입에 의해, 주입에 의해, 도뇨관에 의해, 좌약에 의해, 또는 피부 첩부 또는 이식에 의해 성취되고(제한된 것은 아님), 상기 유공, 비유공의 이식, 또는 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 겔라틴의 물질이다.In some embodiments, it may be desirable to administer the compound locally to the area in need of treatment; This is for example achieved (but not limited to) by local infusion during treatment, ie during local application, by infusion, by catheterization, by suppository, or by skin patching or implantation, It is a substance of gelatin comprising membranes or fibers, such as grafts or sialastic membranes.

특정 구체예에서, 조성물은 인간 정맥내의 투여에 적합한 약학적 조성물로서의 정해진 방법에 따라서 제형화된다. 통상적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균 등장 수용액 완충제 중의 용액이다. 필요한 곳에서, 조성물은 또한 주입 부위에 고통을 완화시키기 위한 용해화 제제 및 국부 마취를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 적량 형태, 예를 들어 동결 건조된 분말에서 분리되어 또는 함께 혼합되어 제공되거나, 활성 제제의 양을 나타내는 앰풀(ampoule) 또는 봉지와 같은 밀봉된 용기에서의 자유 농도에 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여된 곳에서 조제의 등급 물 또는 식염을 함유하는 주입 병은 불필요하다. 조성물이 주입에 의해 투여된 곳에, 주입을 위한 멸균수 또는 식염의 앰풀이 제공되서, 성분이 투여되기 전에 혼합될 수 있다.In certain embodiments, the composition is formulated according to a predetermined method as a pharmaceutical composition suitable for human intravenous administration. Typically, the composition for intravenous administration is a solution in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include solubilizing agents and local anesthesia to relieve pain at the site of injection. Generally, the ingredients are provided in unit dosage form, e.g., separated or mixed together in lyophilized powder, or in free concentration in a sealed container such as an ampoule or bag indicating the amount of active agent. . An infusion bottle containing a formulated grade of salt or salt is unnecessary where the composition is administered by infusion. Where the composition has been administered by infusion, an ampoule of sterile water or saline for infusion is provided so that the components can be mixed before administration.

화합물의 유효량의 개별적인 투여는 개별적인 피부의 침범된 부분에 직접 화합물을 투여함으로서 국부적으로 이루어질 수 있다. 이 목적에 있어서, 화합물은 겔, 연고, 로션, 크림과 같은 약학적으로 허용가능한 국부적 담체를 포함하는 조성물에 투여되거나 사용되며, 상기 조성물은 제한 없이 물, 글리세롤, 알코올, 프로필렌, 지방 알코올, 트리글리세리드, 지방산 에스테르 또는 미네랄 오일과 같은 담체를 포함한다.Individual administration of an effective amount of the compound can be effected locally by administering the compound directly to the affected area of the individual skin. For this purpose, the compound is administered or used in a composition comprising a pharmaceutically acceptable local carrier, such as gels, ointments, lotions, creams, wherein the composition is without limitation water, glycerol, alcohol, propylene, fatty alcohol, triglycerides Carriers such as fatty acid esters or mineral oils.

다른 국부적 담체는 액체 석유, 이소프로필 팔미틴산염, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올(95%), 물중의 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트(5%) 또는 물중의 나트륨 라우릴 황산염(5%)를 포함한다. 항-산화체, 습윤제, 점도 안정제, 및 이와 유사한 제제와 같은 다른 물질을 필요에 의해 첨가할 수 있다. 아존과 같은 피부를 통한 침투 강화는 또한 포함될 수 있다.Other local carriers include liquid petroleum, isopropyl palmitate, polyethylene glycol, ethanol (95%), polyoxyethylene monolaurate in water (5%) or sodium lauryl sulfate in water (5%). Other materials can be added as needed, such as anti-oxidants, wetting agents, viscosity stabilizers, and similar agents. Enhancement of penetration through the skin, such as azone, may also be included.

또한, 특정 예에서, 화합물이 피부 위, 안, 또는 내부에 위치하는 장치에 배치될 수 있다. 이러한 장치는 피동적 또는 능동적 방출 메카니즘에 의해 피부로 조성물을 방출하는 첩제, 이식, 및 주입을 포함한다.Also in certain instances, the compound may be placed in a device located on, in, or inside the skin. Such devices include patches, implants, and infusions that release the composition to the skin by a passive or active release mechanism.

다양한 제형물을 생성하기 위한 물질 및 방법은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 발명을 주제 수행에 적응시킬 수 있다. [참조 문헌 : US Patent Nos. 5,182,293 및 4,837,311(정맥내의 제형물뿐만 아니라 타블렛, 캡슐, 및 다른 경구적 제형물), 및 European Patent Application Publication Nos. 0 649 659(published April 26, 1995; rapamycin formulation for Ⅳ 투여) 및 0 648 494(published April 19, 1995: rapamycin formulation for oral administration)].Materials and methods for producing various formulations are well known in the art and the invention can be adapted to subject performance. [Reference Document: US Patent Nos. 5,182,293 and 4,837,311 (tablets, capsules, and other oral formulations as well as intravenous formulations), and European Patent Application Publication Nos. 0 649 659 (published April 26, 1995; rapamycin formulation for IV administration) and 0 648 494 (published April 19, 1995: rapamycin formulation for oral administration).

단일 또는 다중 적량으로 투여되는 화합물의 유효 적량은 통상적으로 포유동물 몸무게의 약 0.01 내지 50㎎/㎏이고, 바람직하게는 약 0.1 내지 10㎎/㎏이다. 일반적으로, 화합물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 매일 환자당 약 1 내지 2000㎎의 적량으로 투여된다. 화합물이 면역억제 효과를 수반하는 일부 잔여의 라파로그 또는 라파마이신인 구체예에서, 1회 투여량을 심한 면역억제 효과와 관련된 양 미만으로 하는 것이 바람직하다.Effective doses of the compound administered in single or multiple doses are typically about 0.01 to 50 mg / kg of mammal weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg. In general, the compounds are administered to patients in need of such treatment in an amount of about 1 to 2000 mg per patient per day. In embodiments in which the compound is some residual rapalog or rapamycin with an immunosuppressive effect, it is preferred that the single dose be less than the amount associated with the severe immunosuppressive effect.

특정 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 효과적인 화합물의 양은 장애 또는 상태의 성질에 얼마큼은 의존적일 것이고, 표준 임상 기술에 의해 측정될 수 있다. 또한, 생체 외 또는 생체 내 분석은 최적의 적량 범위 확인을 돕기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 유효량은 생체 외 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 1회 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다. 정확한 적량 수준은 주치 내과의사 또는 다른 건강 관리자에 의해 측정되야 하며, 투여 경로를 포함하는 잘 공지된 사항, 나이, 몸무게, 성별 및 개인적인 건강 상태 ; 질병의 성질, 심한 정도 및 임상 단계 ; 수반된(또는 수반되지 않는) 치료의 이용법 ; 환자의 유전 공학적인 세포의 성질 및 범위에 의존적일 것이다.The amount of compound effective for treating or preventing a particular disorder or condition will depend somewhat on the nature of the disorder or condition and can be measured by standard clinical techniques. In addition, ex vivo or in vivo assays can optionally be used to help identify optimal dosage ranges. Effective amounts can be estimated from single dose-response curves derived from ex vivo or animal model test systems. The correct level of dosage should be measured by the attending physician or other health care professional, including well known information including age of administration, age, weight, sex and personal health status; Nature, severity and clinical stage of the disease; The use of concomitant (or non-concomitant) treatment; It will depend on the nature and scope of the patient's genetically engineered cells.

본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적인 팩(pack) 또는 킷(kit)을 제공한다. 이러한 용기와 임의적으로 관련된 것은 약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 이용 또는 판매를 단속하는 정부 기관에 의해 규정된 형태에 통보받을 수 있고, 상기 통보는 인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매 업자의 승인을 반영한다.The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Anything related to such a container may be informed in a form prescribed by a governmental agency that regulates the manufacture, use, or sale of a pharmaceutical or biological product, which notification may be approved by the manufacturer, use, or vendor for human administration. Reflect.

응용Applications

본 발명은 거대한 게놈내에 삽입된 외인성-삽입된 유전자의 발현을 유도하는 임의의 상태에 적용 가능하다. 원하는 발현 수준을 매우 높게 또는 매우 낮게 미리 조절할 수 있다. 대안적으로, 시스템은 조절된 또는 적정 가능한 발현을 성취하가 위해 또한 처리될 수 있다. [참조 문헌 : PCT/US93/01617]. 대부분의 경우에서, 관련되지 않은 세포의 유전자의 우연한 활성은 바람직하지 않다. 하기는 본 발명의 주제의 응용의 예를 제한한 것은 아니다.The present invention is applicable to any condition that directs the expression of exogenous-inserted genes inserted into large genomes. The desired level of expression can be preadjusted very high or very low. Alternatively, the system can also be processed to achieve regulated or titratable expression. [Reference: PCT / US93 / 01617]. In most cases, accidental activity of genes in unrelated cells is undesirable. The following is not intended to limit the examples of application of the subject matter of the present invention.

1. 조절된 유전자 치료. 많은 예에서, 원하는 곳에서의 치료상의 유전자의 스위치 온 및 오프하는 능력 또는 정확하게 발현을 적정하는 능력은 치료상의 효능에 중요하다. 본 발명은 인간 유전자 치료의 환경에서 치료상의 표적 유전자의 조절된 발현을 수행하기에 특히 아주 적합하다. 한 실시예는 키메라(chimeric) 단백질 한 쌍(FRAP-유도된 수용기 도메인을 함유하는 하나, FKBP-유도된 수용기 도메인을 함유하는 또 다른 하나), 키메라를 이합체화 할 수 있는 이합체 제제 및 발현되는 표적 유전자 구성물을 이용한다. 제 1 키메라 단백질은 이형의 활동 도메인으로서의, 포메란츠(Pomerantz) 등에 설명된 혼성의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 제 2 키메라 단백질은 이형의 활동 도메인으로서의 전사 활성 도메인을 포함한다. 라파마이신 또는 라파로그 이합체화 제제는 양 키메라에 결합할 수 있으며, 따라서 키메라를 이합체와 또는 올리고머화 할 수 있다. 이러한 키메라 단백질의 발현을 지휘할 수 있고, 코드화하는 DNA 분자는 공학적으로 세포에 삽입된다. 또한 세포로의 삽입된 DNA 분자는 혼합 DNA-결합 도메인이 결합할 수 있는 DNA 서열과 연결된 표적 유전자이다. 이합체 제제를 갖는 그들의 자손 또는 공학적인 세포와의 접촉(동물 또는 환자에 제제를 투여함으로서)은 전사 인자 복합체의 조합을 유도해서 표적 유전자의 발현을 유도한다. 유사한 구성 성분의 사용과 설계는 PCT/US93/01617에 기재되어 있다. 이들은 대안적인 DNA-결합 도메인에서의 혼합 DNA-결합 도메인의 이용법 및 이것을 코드화하는 DNA 서열; FRAP-유도된 수용체 도메인에서의 키메라중 하나 상의 FRAP-유도된 수용체; 및 참조 특허 문서에 기록된 것과 같은 이합체적 이합체 제제에서의 단량체적 라파마이신 형태 이합체 제제에 의해 본 발명에 적응될 수 있다. 실제에서, 표적 유전자 발현의 수준은 키메라 전사 인자 복합체의 농도 또는 수의 작용일 수 있고, 상기 수준은 차례로 이합체 리간드의 농도의 작용일 수 있다. 하기의 논의된 실험 데이터는 이러한 용량(이합체 리간드의)-반응 유전자 발현의 증거이다.1. Regulated gene therapy. In many instances, the ability to switch on and off therapeutic genes where desired or to properly titrate expression is important for therapeutic efficacy. The present invention is particularly well suited for performing controlled expression of therapeutic target genes in the context of human gene therapy. One embodiment includes a pair of chimeric proteins (one containing a FRAP-derived receptor domain, another containing a FKBP-derived receptor domain), a dimer preparation capable of dimerizing a chimeric and an expressed target Use genetic constructs. The first chimeric protein comprises the hybrid DNA binding domain described in Pomerantz et al. As a heterologous activity domain. The second chimeric protein comprises a transcriptional active domain as a heterologous activity domain. Rapamycin or rapalog dimerization agents can bind both chimeras and thus can chimera or dimerize chimeras. The expression of these chimeric proteins can be directed and the DNA molecules encoding are engineered into cells. Also inserted into the cell is a target gene linked to a DNA sequence to which the mixed DNA-binding domain can bind. Contact with their progeny or engineered cells with a dimeric preparation (by administering the preparation to an animal or patient) induces a combination of transcription factor complexes to induce the expression of the target gene. The use and design of similar components is described in PCT / US93 / 01617. These include the use of mixed DNA-binding domains in alternative DNA-binding domains and DNA sequences encoding them; FRAP-induced receptors on one of the chimeras in the FRAP-induced receptor domain; And monomeric rapamycin form dimer preparations in dimeric dimer preparations, such as those recorded in the reference patent document. In practice, the level of target gene expression may be the action of the concentration or number of chimeric transcription factor complexes, which in turn may be the action of the concentration of dimeric ligands. The experimental data discussed below are evidence of this dose (of dimer ligand) -responsive gene expression.

이합체 리간드는 원하는 표적 유전자의 활성화 전사로서 환자에 투여될 수 있다. 리간드의 결합 친화성, 원하는 반응, 투여의 방식, 반감기, 존재하는 세포의 수에 의존하여, 다양한 프로토콜이 이용될 수 있다. 리간드는 비경구적으로 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 투여의 수는 상기에 설명된 인자에 의존적이다. 리간드는 환약, 분말 또는 산포로서 경구적으로; 구강으로; 설하선으로; 얻을 수 있고, 흡입에 의해 또는 이와 유사하게 혈관내로, 복강내로, 근내로, 피하내로 주입될 수 있다. 리간드(및 단량체적 길항근 화합물)은 투여의 다양한 경로에 대해 당분야에 잘 공지된 통상적인 방법 및 물질을 이용하여 제형화될 수 있다. 투여에 대한 정량의 용량 및 특정 방법은 상기 인자에 의존 적일 것이고, 주치 의사, 또는 인간 또는 동물 건강 관리자에 의해 측정된다. 가장 많은 부분에서, 투여의 방식은 실험상으로 측정될 것이다.Dimeric ligands can be administered to a patient as an activated transcription of a desired target gene. Depending on the binding affinity of the ligand, the desired response, the mode of administration, the half-life, and the number of cells present, various protocols can be used. The ligand can be administered parenterally or orally. The number of administrations depends on the factors described above. Ligands are orally as pills, powders or dispersions; By mouth; By the sublingual gland; And may be injected by inhalation or similarly intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously. Ligands (and monomeric antagonist compounds) can be formulated using conventional methods and materials well known in the art for the various routes of administration. The dose and specific method of quantification for administration will depend on such factors and are measured by the attending physician or human or animal health manager. In most cases, the mode of administration will be determined experimentally.

이 결과에서, 리간드에 의한 전사 활성은 거꾸로 되거나 또는 종료되고, 이합체 리간드와 경쟁할 수 있는 단량체적 화합물이 투여될 수 있다. 따라서, 반대 반응 또는 원하는 치료적 효능의 종료의 경우에서, 이합체 제제를 위한 길항근은 통상적인 경로로 투여될 수 있고, 만약 신속한 전환을 원한다면 특히 혈관내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 리간드 결합 도메인을 갖는 불활성 도메인(또는 전사 사일런서(silencer))의 존재를 제공할 수 있다. 또 다른 접근법에서, 세포는 다른 곳에서 설명된 것으로서의 Fas 또는 TNF 수용체를 통한 시그날링을 경유한 아폽토시스를 통하여 제거될 수 있다. [참조 문헌: International Patent Aplications PCT/US94/01617 및 PCT/US94/08008]In this result, the transcriptional activity by the ligand can be reversed or terminated and a monomeric compound capable of competing with the dimeric ligand can be administered. Thus, in the case of adverse reactions or termination of the desired therapeutic efficacy, the antagonists for dimer preparations can be administered by conventional routes, and especially intravascularly if desired for rapid conversion. Alternatively, the presence of an inactive domain (or transcriptional silencer) with a ligand binding domain can be provided. In another approach, cells can be eliminated through apoptosis via signaling via Fas or TNF receptors as described elsewhere. [Reference: International Patent Aplications PCT / US94 / 01617 and PCT / US94 / 08008]

임의의 응용을 위한 리간드의 특정 적량은 치료상의 적량 모니터링에 이용되는 방법에 따라 측정될 수 있고, 상기 발현의 특정 수준의 유지는 연장된 시간, 예를 들어 약 2 주보다 더 긴 시간이 요구되거나 또는 확장된 간격, 예를 들어 약 2 주 이상을 갖는 짧은 기간의 시간에서 리간드의 개별적이거나 반복적인 적량을 갖는 반복 치료일 수 있다. 미리 계산된 범위내의 리간드의 용량을 제공하고, 반응에 대해 모니터하여, 치료상 반응뿐만 아니라 시간과 발현 수준과의 관계를 수득한다. 시간 및 치료상 반응 동안 관찰된 수준에 의존하여, 다음 시간에 더 많거나 더 적은 용량을 제공하고, 이어서 반응이 일어난다. 이 방법은 치료상 범위내의 적량이 수득될 때까지 되풀이하여 반복한다. 리간드가 장기적으로 투여되는 곳에, 리간드의 유지 적량을 측정하고, 그 후 확장된 간격에서 적당한 반응 및 발현 생성물의 수준을 제공하는 것을 확인하기 위해 세포 시스템을 검증한다.Specific doses of ligands for any application may be measured depending on the method used for therapeutic dose monitoring, and maintenance of a particular level of expression may require an extended time, for example longer than about two weeks or Or repeat treatment with individual or repetitive doses of ligand at extended periods of time, eg, short periods of time with at least about 2 weeks. Doses of ligands within a precalculated range are provided and monitored for response to obtain the relationship between time and expression level as well as therapeutic response. Depending on the time and the level observed during the therapeutic response, the next time more or less dose is given and then the reaction occurs. This method is repeated until the appropriate amount within the therapeutic range is obtained. Where the ligand is administered long term, the maintenance dose of the ligand is measured and then the cellular system is verified to ensure that it provides the appropriate level of response and expression product at extended intervals.

시스템은 발현 효능, 및 적당한 분비 수준에 대한 리간드, 발현 생성물의 활성, 환자에게 특정하게 필요한 것과 같은 많은 변이에 영향을 받기 쉽고, 환자에게 특정하게 필요한 것은 시간 및 환경, 즉 세포의 손실 결과로서의 세포 활성의 손실 비율 또는 개별적인 발현 활성 및 이들의 유사한 것에 의하여 변한다.The system is susceptible to many variations, such as expression efficacy, ligands for appropriate secretion levels, activity of expression products, and the specific needs of the patient, and what is specifically needed by the patient is the cell as a result of time and environment, i.e., loss of cells. Loss ratio of activity or individual expression activity and the like.

2. 재결합 단백질 빛 바이러스의 생성. 상업적이고 연구적 목적에 대한 재결합 치료상 단백질의 생성은 종종 높은 수준에서 단백질을 발현시키기 위해서 공학적인 포유동물 세포 계의 이용을 통하여 이루어질 수 있다. 박테리아나 효모보다 포유동물 세포의 이용은 단백질의 기능이 이종구조 세포에 의해 일반적으로 수행되지 않는 포스트-번역적 변형을 필요로 하는 곳에서 나타난다. 이러한 방법으로 상업적으로 생성된 단백질의 예는 적혈구생성소, 조직 플라스미노젠 활성제, 인자 Ⅷ: c, 항원 등과 같은 응고 인자를 포함한다. 이러한 방법에서 단백질 생성의 비용은 공학적인 세포에서 성취된 발현의 수준과 직접적인 관계가 있다. 이러한 단백질의 생성에서 제 2 한계는 숙주 세포에 대한 독성이다: 단백질 발현은 높은 밀도로의 성장,즉 급격한 생성물 수준의 감소로부터 세포를 예방할 수 있다. 따라서, 조절되는 유전자 치료에 대해 설명된 것으로서의 단백질 발현을 엄격하게 제어 하는 능력은 단백질 생성의 부재하에서 높은 밀도로 자라도록 허용한다. 최적 세포 밀도에 도달한 후에, 활성화된 유전자의 발현이 일어나고, 단백질 생성물이 수득된다.2. Generation of recombination protein light virus. The production of recombination therapeutic proteins for commercial and research purposes is often accomplished through the use of engineered mammalian cell systems to express the protein at high levels. The use of mammalian cells rather than bacteria or yeast appears where the function of proteins requires post-translational modifications that are not normally performed by heterologous cells. Examples of proteins produced commercially in this way include coagulation factors such as erythropoiesis, tissue plasminogen activator, factor VII: c, antigens and the like. In this method the cost of protein production is directly related to the level of expression achieved in the engineered cell. A second limitation in the production of such proteins is toxicity to host cells: protein expression can prevent cells from growing to high densities, ie, a sharp decrease in product levels. Thus, the ability to tightly control protein expression as described for regulated gene therapy allows to grow to high density in the absence of protein production. After reaching the optimal cell density, the expression of the activated gene occurs and the protein product is obtained.

유사한 문제가 구조 및 상업적(예를 들어, 유전자 치료) 및 실험적 이용을 위한 재결합 바이러스의 생성을 위한 포장 라인에서 일어난다. 이러한 세포 계통은 결함있는 재결합 유전자를 잠복시키는 점염성의 바이러스 입자의 조합에 필요한 바이러스 단백질을 생성하기 위해 조작된다. 이러한 포장 라인에 의존적인 바이러스 운반체는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합된 바이러스를 포함한다. 나중의 경우에 있어서, 포장 라인으로부터 수득된 바이러스 축적의 적정 농도는 바이러스 복제 및 핵심 단백질의 생성 수준과 직접적인 관계가 있다. 그러나, 이러한 단백질은 숙주 세포에 독성이 아주 높다. 따라서, 높은-적정 농도 재결합 AAV 바이러스 생성이 어렵다는 것이 증명되어 왔다. 본 발명은 복제 및 핵심 유전자가 본 원에서 설명된 설계의 조절 가능한 전사 인자의 제어하에 위치하는 포장 라인의 구조를 허용하는 이러한 문제에 대한 용액을 제공한다. 포장 세포 라인은 높은 밀도에서 성장할 수 있고, 보조 바이러스로 감염되고, 재결합 바이러스 게놈으로 감염된다. 그 후, 포장 세포에 의해 인코드된 바이러스 단백질의 발현은 높은 적정 농도에서 바이러스의 생성을 허용하는 이합체 제제의 첨가에 의해 유도된다.Similar problems arise in packaging and packaging lines for the production of recombination viruses for commercial (eg gene therapy) and experimental use. This cell line is engineered to produce the viral proteins required for the combination of mucosal viral particles that bury the defective recombination gene. Virus carriers that depend on this packaging line include retroviruses, adenoviruses and adeno-bound viruses. In later cases, the appropriate concentration of virus accumulation obtained from the packaging line is directly related to the level of viral replication and production of key proteins. However, these proteins are very toxic to host cells. Thus, it has been demonstrated that high-titration concentration recombination AAV virus production is difficult. The present invention provides a solution to this problem that allows for the construction of a packaging line where replication and key genes are located under the control of the controllable transcription factors of the designs described herein. Packaged cell lines can grow at high density and are infected with the helper virus and with the recombination virus genome. The expression of viral proteins encoded by the packaging cells is then induced by the addition of dimer preparations that allow the production of virus at high titer concentrations.

3. 생물학적 연구. 본 발명은 표적 유전자에 대한 정확한 제어가 요구되는 생물학적 실험의 넓은 범위에 적절하다. 이들은: (1) 생화학적인 정제를 위한 중요한 RNA 또는 단백질의 발현; (2) 이들의 생물학적 작용을 평가하는 목적에 대한 조직 배양 세포(또는 생체 내에서, 조작된 세포를 통해서)에서 중요한 RNA 또는 단백질 발현의 조절; (3) 이들의 생물학적 작용을 평가하는 목적에 대한 트렌스제닉 동물에서 중요한 RNA 또는 단백질의 조절된 발현; (4) 그 유전자의 생물학적 작용을 평가하는 목적에 대한 내성적인 유전자상에 활동하는 또 다른 조절 단백질, 리보자임 또는 안티센스 분자를 코드화하는 유전자의 발현 조절을 포함한다. 본 발명의 구성 성분에서 트랜스제닉 동물 모델 및 다른 적용은 PCT/US95/10591에 기재된 것을 포함하여 적용될 수 있다.3. Biological Research. The present invention is suitable for a wide range of biological experiments that require precise control of the target gene. These include: (1) expression of RNA or proteins important for biochemical purification; (2) regulation of important RNA or protein expression in tissue culture cells (or in vivo, through engineered cells) for the purpose of evaluating their biological action; (3) regulated expression of RNA or protein of interest in transgenic animals for the purpose of evaluating their biological action; (4) regulation of the expression of a gene encoding another regulatory protein, ribozyme or antisense molecule that acts on a gene that is resistant to the purpose of evaluating the biological action of the gene. Transgenic animal models and other applications in the components of the invention may be applied, including those described in PCT / US95 / 10591.

본 발명은 또한 상기의 적용에 유용한 킷을 제공한다. 이러한 키트는 조절된 유전자 전사, 키메라 단백질의 다중 결합에 의한 활성화된 하나 이상의 전사 제어 요소와 연결된 표적 유전자를 함유하는 표적 유전자 구조를 함유하는 구체예에서, DNA 구성 코드화을 함유하고, 본 발명(및 상기에서 설명된 바로서의 부가적 도메인을 함유할 수 있다)의 키메라 단백질의 발현을 지배할 수 있다. 대안적으로, 표적 유전자 구조는 당업의 종사자에 의해 원하는 표적 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위를 함유할 수 있다. 이러한 킷은 또한 두개의 재결합된 단백질을 이합체화 할수 있고, 표적 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있는 이합체 제제의 샘플을 포함한다.The invention also provides kits useful for the above applications. Such kits contain a DNA construct encoding, in an embodiment containing a target gene construct containing a regulated gene transcription, a target gene linked to one or more transcriptional control elements activated by multiple binding of chimeric proteins, and comprising the present invention (and the May contain an additional domain as described in (C). Alternatively, the target gene construct may contain a cloning site for insertion of a desired target gene by one of skill in the art. This kit also includes a sample of dimeric preparations capable of dimerizing two recombined proteins and activating the transcription of a target gene.

실시예Example

실시예 1: 가공전사인자를 코드화시키는 구성Example 1 Configuration of Coding Processing Transfer Factors

A. 별다른 언급이 없는 한, 본 실시예 및 다른 실시예에 기재된 모든 DNA 조작은 표준 과정을 이용하여 수행하였다[참조, F. M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley Sons, New York, 1994)].A. Unless otherwise noted, all DNA manipulations described in this and other examples were performed using standard procedures. See FM Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley Sons, New York, 1994).

B. 플래즈미드B. Plasmid

효모 GAL4 DNA 결합 도메인, HSV VP16 활성 도메인, 사람 T 셀 CD3 제타 체인 세포내 도메인 또는 사람 FAS의 세포내 도메인을 이용하여 사람 FKBP12(이하, FKBP라 함)의 융합물을 코드화시키는 구성은 PCT/US94/01617에 기재되어 있다.The construct encoding the fusion of human FKBP12 (hereinafter referred to as FKBP) using the yeast GAL4 DNA binding domain, HSV VP16 active domain, human T cell CD3 zeta chain intracellular domain or intracellular domain of human FAS is PCT / US94. / 01617.

본 발명과 관련된 융합 단백질의 발현을 지시하기 위한 추가의 DNA 벡터는 포유동물 발현 벡터 pCGNN으로부터 유래되었다(Attar, R. M. and Gilman, M. Z. 1992, MCB 12: 2432-2443). XbaI-BamHI 단편으로서 pCGNN내에 클로닝된 삽입물은 사람 CMV v촉진제 및 증강제 서열(캡 부위와 관련된 뉴클레오티드 -522에서 +72)의 제어하에 전사되어, 임의의 에피토프 꼬리(모노클론성 항체 12CA5에 의해 인지되는 H. 인플루엔자 헤마글루티닌 유전자의 16 아미노산 위치), 전사인자 도메인인 경우에는 N-말단 핵 정위 서열(NLS; SV40 T 항원으로부터)로 발현된다Additional DNA vectors to direct expression of the fusion proteins associated with the present invention were derived from the mammalian expression vector pCGNN (Attar, R. M. and Gilman, M. Z. 1992, MCB 12: 2432-2443). Inserts cloned into pCGNN as XbaI-BamHI fragments are transcribed under the control of human CMV v promoter and enhancer sequences (nucleotides -522 to +72 associated with the cap site) to be recognized by any epitope tail (monoclonal antibody 12CA5). H. influenza hemagglutinin gene 16 amino acid position), in the case of the transcription factor domain is expressed as the N-terminal nuclear locus sequence (NLS; from the SV40 T antigen)

특별한 언급이 없는한, pCGNN내에 클로닝된 모든 단편은 BamHI 부위 바로 상류의 SpeI 부위를 포함하는 XbaI-.BamHI 단편으로서 삽입되었다. XbaI 및 SpeI가 적합한 단부를 생성시킴에 따라, 추가의 XbaI-BamHI 단편을 초기 삽입물의 하류에 삽입시키고 다중 성분을 포함한 단백질의 단계적 조립을 촉진시킬 수 있다. 정지 코돈은 SpeI와 BamHI사이에 놓았다. 초기 구성을 위해, 벡터 pCGNN-GAL4를 추가로 사용하였으며, 여기서 GAL4 DNA 결합 도메인 유전자의 코돈 1-94을 pCGNN의 XbaI 부위내에 클로닝시킴으로써, XbaI 부위는 단편의 3' 단부에서만 재생된다. 따라서, XbaI-BamHI 단편을 상기 벡터내로 클로닝시켜 GAL4 융합을 일으키고, 이어서 재생시킬 수 있었다.Unless otherwise noted, all fragments cloned into pCGNN were inserted as XbaI-.BamHI fragments containing the SpeI site immediately upstream of the BamHI site. As XbaI and SpeI produce suitable ends, additional XbaI-BamHI fragments can be inserted downstream of the initial insert and promote stepwise assembly of proteins including multiple components. Stop codons were placed between SpeI and BamHI. For initial construction, a vector pCGNN-GAL4 was further used, wherein by cloning codons 1-94 of the GAL4 DNA binding domain gene into the XbaI site of pCGNN, the XbaI site was regenerated only at the 3 ′ end of the fragment. Thus, the XbaI-BamHI fragment could be cloned into the vector to cause GAL4 fusion and then regenerated.

(a) GAL4 DNA 결합 도메인-FRAP 융합물을 코드화시키는 구성(a) a construct that encodes a GAL4 DNA binding domain-FRAP fusion

사람 FRAP 유전자의 일부를 얻기 위해, 사람 흉선 총 RNA(Clontech #64028-1)를 MMLV 전환 전사효소 및 무작위 6량체 프라이머(Clontech 1st strand synthesis kit)를 이용하여 전환전사시켰다. 상기 cDNA는 프라이머 1 및 2 및 Pfu 중합효소(Stratagene)를 함유하는 PCR 반응에 직접 사용하였다. 상기 프라이머들을 사람 FRAP를 포함한 아미노산 2025-2113: 첸(Chen) 등에 의해(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4947-4951) 확인된 포유동물의 'FRB' 도메인에 근본적으로 상응하는 89 아미노산 영역에 대한 코딩 서열을 증폭시키기 위해 FKBP-라파마이신 결합(이하, FRB라 함)에 필요하고 충분한 만큼 디자인하였다. 적당한 크기의 밴드를 정제하고, XbaI 및 SpeI로 소화시켜, XbaI-SpeI 소화된 pCGNN-GAL4로 결찰시켰다. 상기 구성은 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였으며 pCGNN-GAL4-1FRB로 명시하였다.To obtain part of the human FRAP gene, human thymus total RNA (Clontech # 64028-1) was transcribed using MMLV converting transcriptase and random hexamer primer (Clontech 1st strand synthesis kit). The cDNA was used directly for PCR reactions containing primers 1 and 2 and Pfu polymerase (Stratagene). These primers correspond essentially to the 'FRB' domain of mammals identified by amino acids 2025-2113: Chen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4947-4951), including human FRAP. Designed as needed and sufficient for FKBP-rapamycin binding (hereinafter referred to as FRB) to amplify the coding sequence for the 89 amino acid region. Bands of appropriate size were purified, digested with XbaI and SpeI, and ligated with XbaI-SpeI digested pCGNN-GAL4. The construct was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing and designated pCGNN-GAL4-1FRB.

FRB 다중체를 코드화시키는 구성은 FRB XbaI-BamHI 단편을 단리시킨후, SpeI 및 BamHI로 소화시킨 pCGNN-GAL4-1FRB로 다시 결찰시켜 pCGNN-GAL4-2FRB를 생성시킴으로써 이루어지고, 이것은 제한 분석으로 확인하였다. 이 과정을 신규 구성에 대해 유사하게 반복하여 pCGNN-GAL4-3FRB 및 pCGNN-GAL4-4FRB를 산출하였다.The construct encoding the FRB multiplex was made by isolating the FRB XbaI-BamHI fragment and then ligation back to pCGNN-GAL4-1FRB digested with SpeI and BamHI to generate pCGNN-GAL4-2FRB, which was confirmed by restriction analysis. . This process was similarly repeated for the new construct to yield pCGNN-GAL4-3FRB and pCGNN-GAL4-4FRB.

또한, 벡터는 포유동물 FRB 도메인(아미노산 2025-2113)을 에워싸고 있지만 그 아래로 연장되는 FRAP의 더 큰 단편을 코드화시키도록 구성하였다. PCR 프라이머는 다음에 나타낸것과 같이 5'XbaI 및 3'SpeI 부위에 접해있는 FRAP의 여러 영역을 증폭시키도록 디자인하였다.In addition, the vector was constructed to encode a larger fragment of FRAP that encompassed but extended below the mammalian FRB domain (amino acids 2025-2113). PCR primers were designed to amplify the various regions of the FRAP adjacent to the 5'XbaI and 3'SpeI sites as shown below.

명칭designation 아미노산amino acid 5'프라이머5 'primer 3'프라이머3 'primer FRAPaFRAPbFRAPcFRAPdFRAPeFRAPfFRAPgFRAPhFRAPi FRAP a FRAP b FRAP c FRAP d FRAP e FRAP f FRAP g FRAP h FRAP i 2012-21271995-21411945-21131995-21132012-21132025-21272025-21412025-21741945-21742012-21271995-21411945-21131995-21132012-21132025-21272025-21412025-21741945-2174 653561113653561113 782227844782227844

먼저, 단편 FRABi를 상기에 기재한 바와 같이 RT-PCR로 증폭시키키고, XbaI 및 SpeI로 소화시켜, XbaI-SpeI 소화된 pCGNN-GAL4로 결찰시켰다. 이 구성, 즉 pCGNN-GAL4-FRAPi를 PCR로 분석하여 삽입물 배향을 확인하고 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다. 그리고나서 리스트상의 프라이머를 이용한 다른 단편들을 증폭시키기 위해 PCR 기재로 사용하였다. 신규 단편들을 상기 기재된 바와 같이 GAL4 융합물로 클로닝시켜서 pCGNN-GAL4-FRAPa, pCGNN-GAL4-FRAPb등의 구성물을 산출하였으며, 이를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.First, fragment FRAB i was amplified by RT-PCR as described above and digested with XbaI and SpeI and ligated with XbaI-SpeI digested pCGNN-GAL4. This configuration, pCGNN-GAL4-FRAP i , was analyzed by PCR to confirm insert orientation and verified by DNA sequencing. It was then used as a PCR substrate to amplify other fragments using primers on the list. The new fragments were cloned into GAL4 fusions as described above to yield constructs such as pCGNN-GAL4-FRAP a , pCGNN-GAL4-FRAP b and confirmed by DNA sequencing.

FRAPd및 FRAPe의 2개의 더 큰 FRAP 단편의 연결물을 코드화시키는 벡터를 위에서 이용한 방법과 유사한 방법으로 생성시켰다. FRAPd및 FRAPe를 코드화시키는 XbaI-BamHI 단편들을 pCGNN-GAL4-FRAPd및 pCGNN-GAL4-FRAPe로 부터 단리시키고 SpeI 및 BamHI로 소화시킨 상기에서와 같은 벡터로 다시 결찰시켜서 pCGNN-GAL4-2FRAPd및 pCGnn-GAL4-2FRAPe를 생성하였다. 이 과정을 신규 구성물에 대해 유사하게 반복하여 pCGNN-GAL4-3FRAPd, pCGNN-GAL4-3FRAPe, pCGNN-GAL4-4FRAPd및 pCGNN-GAL4-4FRAPe를 산출하였다. 모든 구성물을 제한 분석으로 입증하였다.A vector encoding the linkage of two larger FRAP fragments of FRAP d and FRAP e was generated in a similar manner to the one used above. FRAP d and FRAP e code crystallized XbaI-BamHI fragment of pCGNN-GAL4-FRAP d and pCGNN-GAL4-FRAP e and thereby isolated from the re-ligated into a vector, such as in the above was digested with SpeI and BamHI pCGNN-GAL4-2FRAP d and pCGnn-GAL4-2FRAP e were generated. This process was similarly repeated for the new construct to yield pCGNN-GAL4-3FRAP d , pCGNN-GAL4-3FRAP e , pCGNN-GAL4-4FRAP d and pCGNN-GAL4-4FRAP e . All constructs were verified by restriction analysis.

(b) FRAP-VP16 활성 도메인 융합물을 코드화시키는 구성(b) constructs encoding FRAP-VP16 active domain fusions

헤르페스 심플렉스 비루스 단백질인 VP16의 활성 도메인으로 FRB 도메인(들)의 N-말단 융합물을 생성하기 위해, FRB의 1, 2, 3 및 4 복사체를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 GAL4 융합 벡터로부터 회수하여 XbaI-BamHI 소화된 pCGNN으로 결찰시켜서 pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB 등을 산출하였다. 그리고나서 상기 벡터를 SpeI 및 BamHI로 소화시켰다. VP16의 아미노산 414-490을 코드화시키는 XbaI-BamHI 단편을 플래즈미드 pCG-Gal4-VP16으로부터 단리시키고(Das, G., Hinkley, C. S. and Herr, W. (1995) Nature 374, 657-660) SpeI-BamHI 소화된 벡터로 결찰하여 pCGNN-1FRB-VP16, pCGNN-2FRB-VP16 등을 재생하였다. 그 구성을 제한 분석 및/또는 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.To generate an N-terminal fusion of FRB domain (s) with the active domain of VP16, the herpes simplex virus protein, XbaI-BamHI fragments encoding 1, 2, 3 and 4 copies of FRB were recovered from the GAL4 fusion vector. Ligation with XbaI-BamHI digested pCGNN yielded pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB and the like. The vector was then digested with SpeI and BamHI. XbaI-BamHI fragment encoding amino acids 414-490 of VP16 was isolated from plasmid pCG-Gal4-VP16 (Das, G., Hinkley, CS and Herr, W. (1995) Nature 374, 657-660) SpeI Ligation with -BamHI digested vector regenerated pCGNN-1FRB-VP16, pCGNN-2FRB-VP16 and the like. The configuration was verified by restriction analysis and / or DNA sequencing.

(c) ZFHD1 DNA 결합 도메인-FRAP 융합을 코드화시키는 구성(c) a construct encoding the ZFHD1 DNA binding domain-FRAP fusion

포유동물 세포중의 ZFHDI 코드화 서열의 발현을 지시하기 위한 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다. Zif268 서열을 프라이머 5'Xba/Zif 및 3'Zif+G를 이용한 PCR에 의해 cDNA 클론으로부터 증폭시켰다. Oct1 호메오도메인 서열을 프라이머 5'NotOctHD 및 Spe/Bam3'Oct를 이용한 PCR에 의해 cDNA 클론으로부터 증폭시켰다. Zif268PCR 단편을 XbaI 및 NotI을 이용하여 절단하였다. OctIPCR 단편을 NotI 및 BamHI를 이용하여 절단하였다. 상기 2개의 단편을 pCGNN의 XbaI 및 BamHI 부위사이에서 3-웨이 결찰으로 결찰시켜(Attar and Gilman, 1992), cDNA 삽입이 사람의 CMV 촉진제 및 증강제 서열의 전사적 제어하에 이루어져서 SV40 T 항원으로부터 핵 정위 서열로 연관되는 pCGNNZFHD1을 만들었다. 플래즈미드는 또한 선택적 표지자로서 작용할 수 있는 암피실린 저항을 위한 유전자를 함유한다. (pCGNNZFHD1의 SpeI 및 BamHI 부위사이에서 XbaI-BamHI로서 결찰시킨 사람 FKBP12의 하나 또는 3개의 탄뎀 반복체를 함유하는 유도체, pCGNNZFHD1-FKBP×1 및 pCGNNZFHD1-FKBP×3을 제조하였다. pCGNNZFHD1-FKBP×3의 샘플을 ATCC Accession No. 97399하 American Type Culture Collection으로 침착시켰다.)Expression vectors for directing the expression of ZFHDI encoded sequences in mammalian cells were prepared as follows. Zif268 sequences were amplified from cDNA clones by PCR using primers 5'Xba / Zif and 3'Zif + G. Oct1 homeodomain sequences were amplified from cDNA clones by PCR using primers 5'NotOctHD and Spe / Bam3'Oct. Zif268PCR fragments were digested with XbaI and NotI. OctIPCR fragments were cleaved using NotI and BamHI. The two fragments were ligated with 3-way ligation between the XbaI and BamHI sites of pCGNN (Attar and Gilman, 1992), whereby cDNA insertion was performed under the transcriptional control of human CMV promoter and enhancer sequences, resulting in nuclear positioning sequences from the SV40 T antigen. PCGNNZFHD1 was associated with. Plasmids also contain genes for ampicillin resistance that can act as selective markers. (Derivatives containing one or three tandem repeats of human FKBP12 ligated as XbaI-BamHI between the SpeI and BamHI sites of pCGNNZFHD1, pCGNNZFHD1-FKBP × 1 and pCGNNZFHD1-FKBP × 3, were prepared. Samples were deposited into the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 97399.)

개체변이성 DNA 결합 단백질 ZFHD1을 이용하여 FRB 도메인(들)의 C-말단 융합물을 생성하기 위해, FRB의 1, 2, 3 및 4 복사체를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 GAL4 융합 벡터로부터 회수하고 Spe-BamHI 소화된 pCGNNZFHD1내로 결찰시켜, pCGNN-ZFHD1-1FRB, pCGNN-ZFHD1-2FRB 등을 산츨하였다. 구성을 제한 분석 및/또는 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.To generate C-terminal fusions of FRB domain (s) using the mutagenic DNA binding protein ZFHD1, XbaI-BamHI fragments encoding 1, 2, 3 and 4 copies of FRB were recovered from the GAL4 fusion vector and Spe Ligation into -BamHI digested pCGNNZFHD1 yielded pCGNN-ZFHD1-1FRB, pCGNN-ZFHD1-2FRB and the like. The configuration was verified by restriction analysis and / or DNA sequencing.

ZFHD1과 C-말단 FRB 도메인사이에서 연쇄 폴리펩티드의 추가적 도입 영향을 시험하기 위해, FRB에 대한 N-말단외 서열을 코드화시킨 FRAP 단편을 ZFHD1 융합물로 클로닝시켰다. FRAPa, FRAPb, FRAPc, FRAPd및 FRAPe를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 벡터 pCGNN-GAL4-FRAPa, pCGNN-GAL4-FRAPb등으로부터 절제하고 SpeI-BamHI 소화된 pCGNN-ZFHD1내로 결찰시켜서, 벡터 pCGNN-ZFHD1-FRAPa, pCGNN-ZFHD1-FRAPb등을 산출하였다. 또한, FRAPe의 2, 3 및 4 C-말단 복사체에 대한 ZFHD1의 융합을 코드화시키는 벡터는 pCGNN-GAL4-2FRAPe,pCGNN-GAL4-3FRAPe및 pCGNN-GAL4-4FRAPe로 부터 2FRAPe, 3FRAPe및 4FRAPe를 코드화시키는 XbaI-BamHI 단편을 단리시키고, 이들을 SpeI-BamHI 소화된 pCGNN-ZFHD1내로 결찰시킴으로써 구성하여, 벡터 pCGNN-ZFHD1-2FRAPe, pCGNN-ZFHD1-3FRAPe및 pCGNN-ZFHD1-4FRAPe를 산출하였다. 모든 구성은 제한 분석에 의해 입증하였다.To test the effect of further introduction of the chain polypeptide between ZFHD1 and the C-terminal FRB domain, FRAP fragments encoding the N-terminal sequence for FRB were cloned into ZFHD1 fusions. XbaI-BamHI fragments encoding FRAP a , FRAP b , FRAP c , FRAP d and FRAP e were excised from vector pCGNN-GAL4-FRAP a , pCGNN-GAL4-FRAP b and the like and ligated into SpeI-BamHI digested pCGNN-ZFHD1 Vector pCGNN-ZFHD1-FRAP a , pCGNN-ZFHD1-FRAP b and the like were calculated. Further, the solidifying vector encoding a fusion of ZFHD1 to 2, 3 and 4 copies of FRAP e C- terminus is pCGNN-GAL4-2FRAP e, pCGNN-GAL4-3FRAP e and pCGNN-GAL4-4FRAP e from e 2FRAP, 3FRAP isolated and e and e 4FRAP code crystallized XbaI-BamHI fragment and, to configure them by ligation into the SpeI-BamHI digested pCGNN-ZFHD1, vector pCGNN-ZFHD1-2FRAP e, pCGNN-ZFHD1-3FRAP e and pCGNN-ZFHD1-4FRAP e was calculated. All configurations were verified by restriction analysis.

벡터는 또한 ZFHD1으로 FRB 도메인(들)의 N-말단 융합을 코드화시키도록 구성하였다. FRAPe의 1, 2, 3 및 4 복사체를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 pCGNN-GAL4-2FRAPe, pCGNN-GAL4-2FRAPe등으로부터 단리시키고 XbaI-BamHI 소화된 pCGNN내로 결찰시켜, 플래즈미드 pCGNN-1FRAPe, pCGNN-2FRAPe등을 산츨하였다. 그리고나서, 이들 벡터를 SpeI 및 BamHI로 소화시키고, ZFHD1(pCGNN-ZFHD1으로부터 단리시킴)을 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 결찰시켜, pCGNN-1FRAPe-ZFHD1, pCGNN-2FRAPe-ZFHD1 등을 산출하고, 그 구성을 제한 분석으로 입증하였다.The vector was also configured to encode the N-terminal fusion of FRB domain (s) with ZFHD1. XbaI-BamHI fragments encoding 1, 2, 3, and 4 copies of FRAP e were isolated from pCGNN-GAL4-2FRAP e , pCGNN-GAL4-2FRAP e and the like and ligated into XbaI-BamHI digested pCGNN to form plasmid pCGNN. -1FRAP e , pCGNN-2FRAP e and the like. These vectors were then digested with SpeI and BamHI and ligated XbaI-BamHI fragments encoding ZFHD1 (isolated from pCGNN-ZFHD1) to yield pCGNN-1FRAP e -ZFHD1, pCGNN-2FRAP e -ZFHD1 and the like. The composition was verified by restriction analysis.

(d) FRAP-p65 활성 도메인 융합을 코드화시키는 구성(d) constructs encoding FRAP-p65 active domain fusion

사람 NF-kB p65 서브유닛(이하, 소화된 p65라 함)의 활성 도메인으로 FRB 도메인(들)의 융합을 발생시키기 위해, 플래즈미드 pCG-p65로부터 PCR에 의해 2가지 단편을 증폭시켰다. 프라이머 9(p65/5'Xba) 및 11(p653'Spe/Bam)는 아미노산 450-550에 대한 코드화 서열을 증폭시키고, 프라이머 10(p65/361Xba) 및 11은 아미노산 361-550에 대한 코드화 서열을 증폭시키며, 그 둘은 5'XbaI 및 3'SpeI/BamHI 부위의 측면에 위치된다. PCR 생성물은 XbaI 및 BamHI로 소화되고 XbaI-BamHI 소화된 pCGNN내로 클로닝되어, pCGNN-p65(450-550) 및 pCGNN-p65(361-550)을 산출하였다. 그 구성은 제한 분석 및 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다.Two fragments were amplified by PCR from plasmid pCG-p65 to generate fusion of the FRB domain (s) into the active domain of the human NF-kB p65 subunit (hereinafter referred to as digested p65). Primers 9 (p65 / 5'Xba) and 11 (p653'Spe / Bam) amplify the coding sequence for amino acids 450-550, and primers 10 (p65 / 361Xba) and 11 encode the coding sequence for amino acids 361-550. Amplify, both of which are flanked by the 5'XbaI and 3'SpeI / BamHI sites. PCR products were digested with XbaI and BamHI and cloned into XbaI-BamHI digested pCGNN, yielding pCGNN-p65 (450-550) and pCGNN-p65 (361-550). The configuration was verified by restriction analysis and DNA sequencing.

100 아미노산 P65 전사 활성 서열은 하기 리니어 서열에 의해 코드화된다:The 100 amino acid P65 transcriptional active sequence is encoded by the following linear sequence:

더욱 연장된 p65 전사 활성 도메인(361-550)은 하기 리니어 서열에 의해 코드화된다:Further extended p65 transcriptional active domains 361-550 are encoded by the following linear sequence:

p65 활성 도메인의 일부를 이용하여 FRB 도메인(들)의 N-말단 융합을 발생시키기 위해, 플래즈미드 pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB 등을 SpeI 및 BamHI로 소화시켰다. p65(450-550)를 코드화시킨 XbaI-BamHI를 pCGNN-p65(450-550)으로부터 단리시키고 SpeI-BamHI 소화된 벡터내로 결찰시켜, 플래즈미드 pCGNN-1FRB-p65(450-550), pCGNN-2FRB-p65(450-550) 등을 산출하였다. 구성 pCGNN-1FRB(450-550)을 pCGNN-p65(361-550)으로부터 단리시킨 XbaI-BamHI 단편을 이용하여 유사하게 제조하였다. 그 구성을 제한 분석으로 입증하였다.To generate N-terminal fusion of the FRB domain (s) using a portion of the p65 active domain, plasmids pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB, etc. were digested with SpeI and BamHI. XbaI-BamHI, encoding p65 (450-550), was isolated from pCGNN-p65 (450-550) and ligated into SpeI-BamHI digested vector to plasmid pCGNN-1FRB-p65 (450-550), pCGNN- 2FRB-p65 (450-550) and the like were calculated. Constitutive pCGNN-1FRB (450-550) was similarly prepared using XbaI-BamHI fragment isolated from pCGNN-p65 (361-550). The configuration was verified by restriction analysis.

p65 활성 도메인과 N-말단 FRB 도메인사이에서의 링커 폴리펩티드의 추가적 도입 영향을 시험하기 위해, FRB에 대한 C-말단외 서열을 코드화시킨 FRAP 단편을 p65 융합물로서 클로닝시켰다. FRAPa, FRAPb, FRAPf, FRAPg및 FRAPh를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 벡터 pCGNN-GAL4-FRAPa, pCGNN-GAL4-FRAPb등으로부터 절제하고 XbaI-BamHI 소화된 pCGNN내로 결찰시켜서, 벡터 pCGNN-FRAPa, pCGNN-FRAPb등을 산출하였다. 그리고나서, 상기 플래즈미드를 SpeI 및 BamHI로 소화시키고, p65(아미노산 450-550)를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 결찰시켜, 5개 벡터 pCGNN-FRAPa-p65, pCGNN-FRAPb-p65 등을 산출하였다. 그 구성을 제한 분석으로 입증하였다.To test the effect of further introduction of the linker polypeptide between the p65 active domain and the N-terminal FRB domain, the FRAP fragment encoding the C-terminal sequence for FRB was cloned as a p65 fusion. XbaI-BamHI fragments encoding FRAP a , FRAP b , FRAP f , FRAP g and FRAP h were excised from vector pCGNN-GAL4-FRAP a , pCGNN-GAL4-FRAP b and the like and ligated into XbaI-BamHI digested pCGNN, Vectors pCGNN-FRAP a , pCGNN-FRAP b and the like were calculated. The plasmid was then digested with SpeI and BamHI and ligated with an XbaI-BamHI fragment encoding p65 (amino acids 450-550) to give five vectors pCGNN-FRAP a -p65, pCGNN-FRAP b -p65 and the like. Was calculated. The configuration was verified by restriction analysis.

또한, FRAPe의 1 및 3 N-말단 복사체에 대한 p65의 융합을 코드화시키는 벡터는 SpeI 및 BamHI를 이용하여 pCGNN-1FRAPe및 pCGNN-3FRAPe를 소화시킴으로써 제조하였다. 그리고나서, p65(450-550) 및 p65(361-550)(pCGNN-p65(450-550) 및 pCGNN-p65(361-550))을 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 결찰시켜, 벡터 pCGNN-1FRAPe-p65(450-550), pCGNN-3FRAPe-p65(450-550), pCGNN-1FRAPe-p65(361-550) 및 pCGNN-1FRAPe-p65(361-550)를 산출하였다. 모든 구성은 제한 분석에 의해 입증하였다.In addition, vectors encoding the fusion of p65 to the 1 and 3 N-terminal copies of FRAP e were prepared by digesting pCGNN-1FRAP e and pCGNN-3FRAP e with SpeI and BamHI. The XbaI-BamHI fragment encoding the p65 (450-550) and p65 (361-550) (pCGNN-p65 (450-550) and pCGNN-p65 (361-550)) was then ligated to vector pCGNN-1FRAP e -p65 (450-550), pCGNN-3FRAP e -p65 (450-550), pCGNN-1FRAP e -p65 (361-550) and pCGNN-1FRAP e -p65 (361-550) were calculated. All configurations were verified by restriction analysis.

벡터는 또한 p65 활성 도메인의 일부를 이용하여 FRB 도메인(들)의 C-말단 융합을 코드화시키도록 구성하였다, 플래즈미드 pCGNN-p65(450-550) 및 pCGNN-p65(361-550)를 SpeI 및 BamHI로 소화시키고, FRAPe(pCGNN-GAL4-1FRAPe로부터 단리시킴)의 1 및 3 복사체 및 FRB(pCGNN-GAL4-1FRB로부터 단리시킴)의 1 복사체를 코드화시킨 XbaI-BamHI 단편을 그 내로 결찰시켜, 플래즈미드 pCGNN-p65(450-550)-1FRAPe,pCGNN-p65(450-550)-3FRAPe, pCGNN-p65(361-550)-3FRAPe, pCGNN-p65(450-550)-1FRB 및 pCGNN-p65(361-550)-1FRB를 산츨하였다. 모든 구성을 제한 분석으로 입증하였다.The vector was also configured to encode the C-terminal fusion of the FRB domain (s) using a portion of the p65 active domain. Plasmid pCGNN-p65 (450-550) and pCGNN-p65 (361-550) were SpeI And XbaI-BamHI fragments digested with BamHI and encoding one and three copies of FRAP e (isolated from pCGNN-GAL4-1FRAP e ) and one copy of FRB (isolated from pCGNN-GAL4-1FRB). Plasmid pCGNN-p65 (450-550) -1FRAP e , pCGNN-p65 (450-550) -3FRAP e , pCGNN-p65 (361-550) -3FRAP e , pCGNN-p65 (450-550)- 1FRB and pCGNN-p65 (361-550) -1FRB were extracted. All configurations were verified by restriction analysis.

(e) 추가 구성(e) additional configuration

FRAP 서열의 일부를 교체하고, 상기 과정을 이용함으로써 다른 구성을 제조할 수 있다. 예를 들면, 프라이머 12 및 13은 FRAP의 전체 코드화 영역을 증폭시키는데 이용된다. 프라이머 1과 13, 6과 13 및 5와 13은 FRB 도메인을 둘러싸면서 단백질의 C-말단 단부(리피드 키나제 호모로지 도메인을 포함함) 전체로 연장되는 3가지 단편을 증폭시키는데 이용된다. 이들 단편은 FRB 도메인에 대해 상이한 부분의 단백질 N-말단을 코드화시킨다는 점이 다르다. 각각의 경우에 있어서, RT-PCR은 사람 흉부 RNA로부터 영역을 증폭시키는데 이용되며, PCR 생성물을 정제하고, XbaI 및 SpeI로 소화시키고, XbaI-SpeI 소화된 pCGNN내로 결찰시켜, 그 구성을 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.Other constructs can be made by replacing part of the FRAP sequence and using this procedure. For example, primers 12 and 13 are used to amplify the entire coding region of FRAP. Primers 1 and 13, 6 and 13 and 5 and 13 are used to amplify three fragments that extend throughout the C-terminal end of the protein (including the lipid kinase homology domain) surrounding the FRB domain. These fragments differ in that they encode different portions of the protein N-terminus for the FRB domain. In each case, RT-PCR is used to amplify the region from human thoracic RNA, purify the PCR product, digest with XbaI and SpeI, ligation into XbaI-SpeI digested pCGNN, and analyze its configuration. Proven by DNA sequencing.

(f) 프라이머 서열(f) primer sequences

제한 부위는 밑줄을 그었다(XbaI=TCTAGA, SpeI=ACGAGT, BamHI=GGATCC).Restriction sites are underlined (XbaI = TCTAGA, SpeI = ACGAGT, BamHI = GGATCC).

(g) 대표적 최종 구성물의 DNA 서열 : pCGNN-ZFHD1-1FRB(g) DNA sequence of a representative final construct: pCGNN-ZFHD1-1FRB

비-코드화 뉴클레오티드를 하부에 나타냈다.Non-coded nucleotides are shown below.

(S/X) 및 (X/S)는 XbaI 및 SpeI로 소화시킨 융화성 생성물사이에서 일어난 결찰 결과를 나타내며, 어느쪽의 효소에 의해서도 분열될 수 없는 서열을 산출한다.(S / X) and (X / S) show the result of ligation between compatible products digested with XbaI and SpeI, yielding sequences that cannot be cleaved by either enzyme.

* 정지 코돈을 나타낸다.* Indicates a stop codon.

(h) 비스트로닉(Bicistronic) 구성(h) Bistronic Configuration

뇌심근연 비루스로부터의 내부 리보솜 입구 서열(IRES)을 pWZL-Bleo로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 형성된 단편을 pBS-SK+(STratagene)내로 클로닝시켰으며, 상기 단편은 XbaI 부위 및 IRES 서열의 상류 및 그 하류에 정지 코돈을 함유하고, ATG를 둘러싸는 NcoI 부위 및 그 뒤의 SpeI 및 BamHI 부위를 함유한다. 클로닝을 용이하게 하기 위해, pCGNN-ZFHD1-3FKBP의 시발 ATG 주위의 서열을 NcoI 부위로 변성시키고, XbaI 부위를 각각 5'-GAATTCCTAGAAGCGACCATGGCTTCTAGC-3' 및 5'-GAAGAGAAAGGTGGCTAGCGAACGCCCATAT-3'의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 NheI 부위로 변성시켰다. 그리고나서, ZFHD1-3FKBP를 함유하는 NcoI-BamHI 단편을 pBS-IRES의 하류에서 클로닝시켜 pBS-IRES-ZFHD1-3FKBP를 산출하였다. 이 플래즈미드로부터의 XbaI-BamHI 단편을 SpeI/BamHI-절단시킨 pCGNN-1FRB-p65(361-550)내로 클로닝시켜, pCGNN-1FRB-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBP를 산출하였다.Internal ribosomal inlet sequence (IRES) from cerebral myocardial virus was amplified by PCR from pWZL-Bleo. The formed fragments were cloned into pBS-SK + (STratagene), which contained stop codons upstream and downstream of the XbaI site and the IRES sequence, containing the NcoI site surrounding the ATG followed by the SpeI and BamHI sites. do. To facilitate cloning, the sequence around the starting ATG of pCGNN-ZFHD1-3FKBP was denatured to the NcoI site and the XbaI site was used with oligonucleotides of 5'-GAATTCCTAGAAGCGACCATGGCTTCTAGC-3 'and 5'-GAAGAGAAAGGTGGCTAGCGAACGCCCATAT-3', respectively. Degeneration with NheI site. The NcoI-BamHI fragment containing ZFHD1-3FKBP was then cloned downstream of pBS-IRES to yield pBS-IRES-ZFHD1-3FKBP. The XbaI-BamHI fragment from this plasmid was cloned into SpeI / BamHI-cleaved pCGNN-1FRB-p65 (361-550) to yield pCGNN-1FRB-p65 (361-550) -IRES-ZFHD1-3FKBP. .

C. 개체변이성 단백질을 발현시키기 위한 레트로비랄(retroviral) 벡터C. Retroviral vectors for expressing mutant proteins

레트로비랄 벡터는 전사 인자 융합 단백질을 안정하게 통합적으로 발현시키는데 이용하였으며, 하부 복사 유전자는 pSRαMSVtkNeo(Muller et al., MCB 11: 1785-92, 1991) 및 pSRαMSV(XbaI)(Sawyers et al., J. Exp. Med. 181: 307-313, 1995)로부터 유도하였다. 두가지 벡터중의 유일한 BamHI 부위를, BamHI로 소화시키고, 클레노(Klenow)를 이용하여 그 중에 충진시키고 결찰시켜서 제거하였으며, 각각 pSMTN2 및 pSMTX2를 산출하였다. pSMTN2는 내부 티미딘 키나제 촉진제로부터 네오 유전자를 발현시킨다. 제오신 유전자(Invitrogen)는 NheI 단편으로서 pSMTX2중의 내부 티미딘 키나제 촉진제의 하부에서 유일한 XbaI 부위내로 클로닝되어 pSNTZ를 산출할 것이다. 이 제오신 단편은 케오신 코딩 서열측에 접해있는 NheI 부위를 도입시키기 위해 하기 프라이머를 이용하여 pZeo/SV(Invitrogen)를 변성시킴으로써 생성하였다.Retroviral vectors were used to stably integrate the transcription factor fusion proteins, and the lower copy genes were pSRαMSVtkNeo (Muller et al., MCB 11: 1785-92, 1991) and pSRαMSV (XbaI) (Sawyers et al., J.). Exp. Med. 181: 307-313, 1995). The only BamHI site in the two vectors was digested with BamHI and packed and ligated therein with Klenow, resulting in pSMTN2 and pSMTX2, respectively. pSMTN2 expresses the neo gene from internal thymidine kinase promoters. The eosin gene (Invitrogen) will be cloned into the only XbaI site at the bottom of the internal thymidine kinase promoter in pSMTX2 as a NheI fragment to yield pSNTZ. This zeocin fragment was generated by denaturing pZeo / SV (Invitrogen) using the following primers to introduce the NheI site flanked by the keosin coding sequence.

프라이머1 5'-GCCATGGTGGCTAGCCTATAGTGAGPrimer1 5'-GCCATGGTGGCTAGCCTATAGTGAG

프라이머2 5'-GGCGGTGTTGGCTAGCGTCGGTCAGPrimer2 5'-GGCGGTGTTGGCTAGCGTCGGTCAG

pSMTN2는 LTR의 하류에 유일한 EcoRI 및 HindIII 부위를 함유한다. XbaI-BamHI 단편으로서 합성한 전사 인자 융합 단백질의 클로닝을 용이하게 하기 위해, 하기 서열을 EcoRI 및 HindIII 부위 사이에 삽입시켜서 pSMTN3를 산출하였다:pSMTN2 contains unique EcoRI and HindIII sites downstream of LTR. To facilitate cloning of transcription factor fusion proteins synthesized as XbaI-BamHI fragments, the following sequence was inserted between the EcoRI and HindIII sites to yield pSMTN3:

같은 단편을 pSMTZ의 유일한 EcoRI 부위내에 삽입하여, 3'HindIII 부위가 EcoRI 부위로 대체된 pSMTZ3를 산출하였다.The same fragment was inserted into the only EcoRI site of pSMTZ, yielding pSMTZ3 with the 3'HindIII site replaced by the EcoRI site.

pSMTN3 및 pSMTZ3는 XbaI-BamHI 단편으로서 5' 비루스성 LTR의 하류에 클로닝될 개체변이성 전사 인자를 허용하고, 그들의 능력으로 인해 안정한 통합물을 선택할 수 있음으로써 항생체 G418 또는 제오신 각각에 대한 내성을 부여한다.pSMTN3 and pSMTZ3, as XbaI-BamHI fragments, allow for mutagenic transcription factors to be cloned downstream of the 5 'viral LTR, and because of their ability to select stable integrators, thereby enhancing resistance to either antibiotic G418 or zeocin Grant.

레트로비랄 벡터 SMTN-ZFHD1-3FKBP를 생성하기 위해, 융합 단백질의 제 1 아미노산의 하류에 EcoRI 부위를 첨가하여, pCGNN-ZFHD1-3FKBP를 먼저 변성시켰다. 그리고나서, EcoRI-BamHI(blunted: 뭉툭함)을 EcoRI-HindIII(뭉툭함) pSRαMSVtkNeo(ref. 51)내로 클로닝시킴으로써, ZFHD1-3FKBP를 레트로비랄 LTR로부터 발현시켰다.To generate the retroviral vector SMTN-ZFHD1-3FKBP, pCGNN-ZFHD1-3FKBP was first denatured by adding an EcoRI site downstream of the first amino acid of the fusion protein. ZFHD1-3FKBP was then expressed from retroviral LTR by cloning EcoRI-BamHI (blunted) into EcoRI-HindIII pSRαMSVtkNeo (ref. 51).

실시예 2: 라파마이신-의존성 전사 활성Example 2: Rapamycin-dependent Transcriptional Activity

상기 실험은 1 또는 2 FKBP 도메인만을 함유하는 상응하는 융합 단백질보다 더욱 강하게 일시적으로 전이되거나 안정하게 통합된 보고 유전자를 활성화시킨 Gal4 DNA 결합 도메인 또는 전사 활성 도메인에 융합된 FKBP의 3 복합체를 보여주었다. FRB 유합 단백질로 상기 파라미터를 평가하기 위해, FRB 도메인의 1 이상 복사체에 대해 융합시킨 Gal4 DNA 결합 도메인을 함유한 주요 플래즈미드를 일시적 전사에 의해 3가지 FKBP 도메인 또는 p65 활성 도메인(3×FKBP-p65)을 코드화시킨 플래즈미드를 이용하여 상호-감염시켰다. 도 3A에 나타낸 자료는, 더 작은 FRB 도메인과 다른 상응하는 융합 단백질보다 더 강하게 안정적으로 통합된 보고 유전자를 활성화시킨 Gal4 DNA 결합 도메인에 대해 융합시킨 FRB 도메인의 4 복사체를 나타낸다.The experiment showed three complexes of FKBP fused to a Gal4 DNA binding domain or a transcriptional activation domain that activated a report gene that was transiently transiently or stably integrated stronger than the corresponding fusion protein containing only one or two FKBP domains. To assess this parameter with the FRB fusion protein, the main plasmid containing the Gal4 DNA binding domain fused to one or more copies of the FRB domain was subjected to transient transcription to the three FKBP domains or the p65 active domain (3 × FKBP−). p65) was inter-infected with the plasmid encoded. The data shown in FIG. 3A shows four copies of the FRB domain fused to a Gal4 DNA binding domain that activated a report gene that is more stably integrated with the smaller FRB domain and other corresponding fusion proteins.

방법: HT1080 B 세포를 10% 송아지 혈청이 보충된 MEM중에서 성장시켰다. 6웰 플레이트(Falcon)중의 약 4×105세포/웰을 공급자(GIBCO, BRL)가 추천함에 따라 리포펙션(Lipofection) 과정에 의해 일시적으로 감염시켰다. DNA: 본 실험에서 사용한 리포펙타민의 비율은 1:6이다. 각각의 웰중의 세포는 500ng의 pCGNN F3-p65, 담체로서 19ug의 PUC 118 플래즈미드 및 100ng의 다음 플래즈미드중의 하나를 수용하였다: pCGNN Gal4-1FRB, pCGNN Gal4-2FRB, pCGNN Gal4-3FRB 또는 pCGNN Gal4-4FRB. 전사에 이어, 2㎖의 신선한 배지를 첨가하고, 개시된 농도의 라파마이신을 보충하였다. 24시간후에, 100㎕의 배지에 대해 개시된 바와 같이(Spencer et al., 1993) SEAP 활성을 검정하였다.Methods: HT1080 B cells were grown in MEM supplemented with 10% calf serum. About 4 × 10 5 cells / well in a 6 well plate (Falcon) were temporarily infected by lipofection procedure as recommended by the supplier (GIBCO, BRL). DNA: The ratio of lipofectamine used in this experiment is 1: 6. The cells in each well received 500 ng of pCGNN F3-p65, 19 ug of PUC 118 plasmid and 100 ng of plasmid as carrier: pCGNN Gal4-1FRB, pCGNN Gal4-2FRB, pCGNN Gal4-3FRB Or pCGNN Gal4-4FRB. Following transcription, 2 ml of fresh medium was added and supplemented with rapamycin at the disclosed concentration. After 24 hours, SEAP activity was assayed as described for 100 μl of medium (Spencer et al., 1993).

p65 활성 도메인에 대해 융합된 다중 FRB 도메인이 보고 유전자의 전자 활성을 증가시키는 결과를 초래할 것인가를 시험하기 위해, 본 발명자들은 p65 활성 도메인에 대해 융합시킨 FRB의 1, 2, 3 또는 4 복사체 및 Gal4-3×FKBP를 발현시키는 플래즈미드를 이용하여 HT1080 B 세포를 상호-감염시켰다. 놀랍게도, DNA 결합 도메인-FRB 유합에서와는 달리, p65 활성 도메인에 대해 융합된 FRB의 단일 복사체가 FRB의 2 이상 복사체를 함유하는 상응하는 융합 단백질보다 상당히 강하게 보고 유전자를 활성화시켰다. 도 3B.To test whether multiple FRB domains fused to the p65 active domain will result in increased electronic activity of the report gene, we have identified Gal, 1, 2, 3 or 4 copies of the FRB fused to the p65 active domain. HT1080 B cells were inter-infected using plasmids expressing -3x FKBP. Surprisingly, unlike in the DNA binding domain-FRB fusion, a single copy of the FRB fused to the p65 active domain activated the report gene significantly stronger than the corresponding fusion protein containing two or more copies of the FRB. 3B.

방법: HT1080 B 세포를 10% 송아지 혈청이 보충된 MEM중에서 성장시켰다. 6웰 플레이트중의 약 4×105세포/웰을 GIBCO, BRL이 추천함에 따라 리포펙션 과정에 의해 일시적으로 감염시켰다. DNA: 본 실험에서 사용한 리포펙타민의 비율은 1:6이다. 각각의 웰중의 세포는 담체로서 19ug의 PUC 118 플래즈미드, 100ng의 pCGNN Gal4-F3 및 500ng의 다음 플래즈미드중의 하나를 수용하였다: pCGNN 1, 2, 3 또는 4FRB-p65. 전사에 이어, 2㎖의 신선한 배지를 첨가하고, 개시된 농도의 라파마이신을 보충하였다. 24시간후에, 100㎕의 배지에 대해 개시된 바와 같이(Spencer et al., 1993) SEAP 활성을 검정하였다.Methods: HT1080 B cells were grown in MEM supplemented with 10% calf serum. About 4 × 10 5 cells / well in 6-well plates were temporarily infected by the lipofection process as recommended by GIBCO, BRL. DNA: The ratio of lipofectamine used in this experiment is 1: 6. Cells in each well received 19 ug of PUC 118 plasmid, 100 ng of pCGNN Gal4-F3 and 500 ng of the following plasmid as carrier: pCGNN 1, 2, 3 or 4FRB-p65. Following transcription, 2 ml of fresh medium was added and supplemented with rapamycin at the disclosed concentration. After 24 hours, SEAP activity was assayed as described for 100 μl of medium (Spencer et al., 1993).

또한, 5×Gal4-IL2-SEAP 보고 유전자 및 Gal4 DNA 결합 도메인 및 안정하게 통합된 FKBP의 3 복사체를 함유하는 융합 단백질을 코드화시킨 DNA 서열을 함유하는 또다른 안정한 세포 라인(HT1080 B14)를 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이들 세포를 FRB 도메인의 1 이상 복사체에 대해 융합시킨 p65 활성 도메인을 발현시킨 주요 플래즈미드로 일시적 감염시켰다. HT1080 B 세포에서 관찰한 바와 유사하게, FRB-p65 활성 도메인 융합 단백질의 단일 복사체를 발현시킨 주요 플래즈미드는 FRB의 2 이상 복사체를 갖는 다른 것들보다 더욱 강하게 보고 유전자를 활성화시켰다.In addition, using another stable cell line (HT1080 B14) containing a DNA sequence encoding a 5 × Gal4-IL2-SEAP report gene and a Gal4 DNA binding domain and a fusion protein containing three copies of the stably integrated FKBP Similar experiments were performed. These cells were transiently infected with major plasmids expressing the p65 active domain fused to one or more copies of the FRB domain. Similar to that observed in HT1080 B cells, the major plasmids expressing a single copy of the FRB-p65 active domain fusion protein activated the genes reported more strongly than others with two or more copies of FRB.

실시예 3Example 3

A. 일시적으로 감염시킨 세포에 있어서의 라파마이신-의존성 전사 활성 : ZFHD1 및 p65 융합A. Rapamycin-dependent transcriptional activity in transiently infected cells: ZFHD1 and p65 fusions

SEAP 표적 유전자 및 대표적 ZFHD-FKBP- 및 FRB-p65-함유 융합 단백질을 코드화시킨 플래즈미드로 일시적 감염시킨 사람 섬유육종 세포가 세포 배양 배지내에서 SEAP의 투여량-반응성 분비 및 라파마이신-의존성을 나타냈다. 도 4A를 보면, 하나 또는 2개의 전사 인자 융합 플래즈미드가 생략된 세포중에서는 SEAP 생성이 검출되지 않았고, 라파마이신이 부가되지 않은 세포중에서도 검출되지 않았다(도 4B). 그러나, 모든 성분이 존재할 때, 0.5nM 정도로 낮은 라파마이신 농도에서도 SEAP 분비가 검출될 수 있었다(도 4A). 최대 SEAP 분비는 5nM에서 관찰되었다. 레트로비랄 벡터로 감염시킴으로써 이루어진 SEAP 보고 유전자의 안정하게 통합된 버전 또는 hGH 보고 유전자의 라파마이신-의존 활성을 유도하기 위해 똑 같은 전사 인자를 이용했을 때, 유사한 결과를 얻었다. 약물 존재중의 SEAP 분비 수준을 검출할 수 없기 때문에, 라파마이신에 대한 추벽 활성을 결정하기 어렵지만, 본 시스템에 있어서 라파마이신의 존재하에서 배경 수준보다 최소한 1000배 강화된 것이 분명하다. 따라서, 본 시스템은 검출불가능한 배경 활성 및 높은 동적 범위를 보여준다.Human fibrosarcoma cells transiently infected with plasmids encoding SEAP target genes and representative ZFHD-FKBP- and FRB-p65-containing fusion proteins were subjected to dose-responsive secretion and rapamycin-dependency of SEAP in cell culture medium. Indicated. 4A, SEAP production was not detected in cells omitting one or two transcription factor fusion plasmids, and not in cells without rapamycin added (FIG. 4B). However, when all components were present, SEAP secretion could be detected even at rapamycin concentrations as low as 0.5 nM (FIG. 4A). Maximum SEAP secretion was observed at 5 nM. Similar results were obtained when using the same transcription factor to induce a stable integrated version of the SEAP report gene or rapamycin-dependent activity of the hGH report gene by infection with a retroviral vector. Since the SEAP secretion level in the presence of the drug cannot be detected, it is difficult to determine the wall activity for rapamycin, but it is evident in this system that it is at least 1000 times stronger than the background level in the presence of rapamycin. Thus, the system shows undetectable background activity and high dynamic range.

전사 인자 융합 단백질에 대한 몇몇의 상이한 구조를 찾아냈다(도 5). FKBP 도메인이 ZFHD1에 대해 융합하고, FRBs가 p65에 대해 융합했을 때, 라파마이신-유발 활성의 최적 수준은 다중 FKBPs가 ZFHD1에 대해 융합하고 더 작은 FRBs가 p65에 대해 융합했을 때 일어난다. DNA-결합 단백질 상의 더 바람직한 다중 약물-결합 도메인은 다중 활성 도메인을 보급하고,따라서 더 높은 수준의 촉진제 활성을 끌어내기 위한 상기 단백질의 용량에 영향을 미칠 수 있다. 활성 도메인상에 오직 하나의 약물-결합 도메인이 존재하면, 하나의 p65를 보급하기 위해 ZFHD상에 각각의 FKBP가 허용되어야만된다. p65상의 FRBs의 모든 숫적 증가는 더 작은 활성 도메인이 ZFHD에 대해 보급될 수 있는 기회를 증가시킨다.Several different structures for the transcription factor fusion proteins were found (FIG. 5). When the FKBP domain fused to ZFHD1 and FRBs fused to p65, the optimal level of rapamycin-induced activity occurs when multiple FKBPs fused to ZFHD1 and smaller FRBs fused to p65. More preferred multiple drug-binding domains on the DNA-binding protein can propagate multiple active domains and thus affect the dose of the protein to elicit higher levels of promoter activity. If there is only one drug-binding domain on the active domain, each FKBP must be allowed on ZFHD to replenish one p65. All numerical increases in FRBs on p65 increase the chance that smaller active domains can spread to ZFHD.

방법:Way:

사람 섬유육종으로부터 유래된 HT1080 세포(ATCC CCL-121)을 필수적인 것은 아닌 아미노산 및 10% 송아지 혈청이 공급된 MEM 중에 성장시켰다. 24-웰 디쉬중에 펼쳐진 세포(Falcon, 6×104세포/웰)를 제조자(GIBCO/BRL)가 추천한 조건하에서 리포펙타민인 사용하여 감염시켰다. 총 300ng의 하기 DNA를 각각의 웰내로 감염시켰다: 100ng ZFHD×12-CMV-SEAP 보고 유전자, 2.5ng pCGNN-ZFHD1-3FKBP 또는 DNA 결합 도메인 융합물, 5ng pCGNN-1FRB-p65(361-550) 또는 다른 활성 도메인 융합물 및 192.5ng pUC118. DNA 결합 도메인 또는 활성 도메인이 생략된 경우에, pCGNN 발현 벡터가 결여된 당량을 대체하였다. 제시된 양의 라파마이신을 함유한 리포펙션(5시간동안) 500㎕ 배지를 각 웰에 첨가하였다. 24시간후에, 배지를 제거하고 350nm 여기(excitaion) 및 450nm 방사에서 발광 스펙트로미터(Perkin Elmer)를 사용하여 개시(Spencer et al., Science 262:1019-24, 1993)된 바와 같이 SEAP 활성에 대해 검정하였다. 거짓-감염시킨 세포로부터 측정한 배경 SEAP 활성을 각 수치로부터 감하였다.HT1080 cells (ATCC CCL-121) derived from human fibrosarcoma were grown in MEM supplied with non-essential amino acids and 10% calf serum. Cells spread out in 24-well dishes (Falcon, 6 × 10 4 cells / well) were infected using lipofectamine under conditions recommended by the manufacturer (GIBCO / BRL). A total of 300 ng of the following DNA was infected into each well: 100 ng ZFHD × 12-CMV-SEAP report gene, 2.5 ng pCGNN-ZFHD1-3FKBP or DNA binding domain fusion, 5 ng pCGNN-1FRB-p65 (361-550) or Other active domain fusions and 192.5 ng pUC118. When the DNA binding domain or active domain was omitted, the equivalents lacking the pCGNN expression vector were replaced. 500 μl media of lipofection (for 5 hours) containing the indicated amount of rapamycin was added to each well. After 24 hours, the medium was removed and assayed for SEAP activity as disclosed using a luminescence spectrometer (Perkin Elmer) at 350 nm excitation and 450 nm emission (Spencer et al., Science 262: 1019-24, 1993). Assay. Background SEAP activity measured from false-infected cells was subtracted from each value.

마우스내 주사를 위해 일시적으로 감염시킨 HT1080 세포를 준비하기 위해(아래 참조), 100mm 디쉬중의 세포(2×106세포/디쉬)를 하기 DNA를 이용하여 인산 칼슘 침전에 의해 16시간동안 감염시켰다(Gatz, C., Kaiser. A Wendenburg, R. 1991, Mol. Gen. Genet. 227, 229-237): 100㎍의 ZHWT×12-CMV-hGH, 1㎍의 pCGNN-ZFHD1-3FKBP, 2㎍의 pCGNN-1FRB-p65(361-550) 및 7㎍의 pUC118. 감염시킨 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 헹구고 5시간동안 신선한 배지를 제공하였다. 주사물을 회수하기 위해, 10mM EDTA를 함유하는 헤페스 완충 식염수 용액중의 디쉬로부터 세포를 제거하여, PBS/0/1% BSA/0.1% 글루코스로 세척하고, 2×107세포/㎖의 농도로 상기 용액중에 재현탁시켰다.To prepare transiently infected HT1080 cells for intra-mouse injection (see below), cells in 100 mm dishes (2 × 10 6 cells / dish) were infected for 16 hours by calcium phosphate precipitation using the following DNA: (Gatz, C., Kaiser.A Wendenburg, R. 1991, Mol. Gen. Genet. 227, 229-237): 100 μg ZHWT × 12-CMV-hGH, 1 μg pCGNN-ZFHD1-3FKBP, 2 μg PCGNN-1FRB-p65 (361-550) and 7 μg pUC118. Infected cells were rinsed twice with phosphate buffered saline (PBS) and fresh media was provided for 5 hours. To recover the injections, cells were removed from dishes in a Hepes buffered saline solution containing 10 mM EDTA, washed with PBS / 0/1% BSA / 0.1% glucose and concentrated at 2 × 10 7 cells / ml. Resuspend in solution.

플래즈미드:Plasmid:

전사 인자 융합 플래즈미드의 구성은 상기에 기재하였다.The construction of the transcription factor fusion plasmid has been described above.

pZHWT×12-CMV-SEAPpZHWT × 12-CMV-SEAP

이 보고 유전자는, ZFHD! 결합 부위의 12 탄뎀 복사체(Pemerantz et al., 1995) 및 분비된 알칼리 인산염을 코드화시키는 유전자를 발현시키는 사람 시토메가로비루스(Boshart et al, 1985)에 바로 직접 접해 있는 유전자로부터의 기저 촉진제를 함유하며, pSEAP 프로모터(Clontech)의 NheI-HindIII 단편을 12 ZFHD 결합 부위를 함유하는 하기 NheI-XbaI 단편:This report gene is ZFHD! Contains 12 tandem copies of binding sites (Pemerantz et al., 1995) and basal promoters from genes directly adjacent to human cytomegalovirus (Boshart et al, 1985) that express genes encoding secreted alkali phosphates. And, the NheI-HindIII fragment of pSEAP promoter (Clontech) contains the following NheI-XbaI fragments containing 12 ZFHD binding sites:

및 최소 CMV 촉진제(-54 내지 +45)를 함유하는 하기 XbaI-HindIII 단편으로 대체함으로써 제조하였다:And the following XbaI-HindIII fragments containing minimal CMV promoter (-54 to +45):

pZHWT×12-CMV-hGHpZHWT × 12-CMV-hGH

이 보고 유전자의 활성은 hGH의 생성으로부터 유래된다. 이 보고 유전자는 ZHWT×12-CMV-SEAP(SEAP 코딩 서열을 함유하는)의 HindIII-BamHI(뭉툭함)를 p0GH(hGH 게놈 클론을 함유하는; Selden et al., MCB 6:3171-3179, 1986; BamHI 및 EcoRI 부위를 함께 뭉툭하게 함)로부터의 HindIII(뭉툭함)-EcoRI 단편으로 대체시킴으로써 구성하였다.The activity of this report gene is derived from the production of hGH. This report gene is derived from HindIII-BamHI (bulky) of ZHWT × 12-CMV-SEAP (containing the SEAP coding sequence) p0GH (containing the hGH genomic clone; Selden et al., MCB 6: 3171-3179, 1986). Construct by replacement with HindIII (Blug) -EcoRI fragment from BumHI and EcoRI site blunt together).

pZHWT×12-IL2-SEAPpZHWT × 12-IL2-SEAP

이 보고 유전자는, 최소 CMV 촉진제를 함유하는 XbaI-HindIII 단편을 최소 IL2 유전자 촉진제(출발 부위와 관련하여 -72 내지 +45; Siebenlist et al., MCB 6:3042-3049, 1986))를 함유하는 하기 XbaI-HindIII 단편으로 대체시킨 것을 제외하고 pZHWT×12CMV-SEAP와 같다:This report gene contains the XbaI-HindIII fragment containing the minimum CMV promoter and the minimum IL2 gene promoter (-72 to +45 in relation to the starting site; Siebenlist et al., MCB 6: 3042-3049, 1986). Same as pZHWT × 12CMV-SEAP except for replacing with the following XbaI-HindIII fragment:

pLHpLH

보고 유전자의 단일, 또는 약간의 복사체의 안정한 통합을 촉진시키기 위해, 하기 레트로비랄 벡터를 구성하였다. 몰로니 쥐의 백혈병 비루스 LTR 및 유일한 내부 ClaI 부위에 의해 구동된 히그로마이신 B 내성 유전자를 함유하는 pLH(LTR-hph)을 하기와 같이 구성하였다: hph 유전자를 pBabe Hygro(Morganstern and Land, NAR 18:3587-96, 1990)로부터의 HindIII-ClaI 단편으로서 BamHI-ClaI 절단시킨 pBabe Bleo(블레오 유전자의 손실로 결과됨; BamHI 및 HindIII 부위를 함께 뭉툭하게 함)내에 클로닝시켰다.The following retroviral vectors were constructed to facilitate stable integration of single or slight copies of the report genes. The pLH (LTR-hph) containing the hygromycin B resistance gene driven by leukemia virus LTR and the only internal ClaI site in Moroni rats was constructed as follows: The hph gene was constructed as pBabe Hygro (Morganstern and Land, NAR 18). : 3587-96, 1990) and cloned into BamHI-ClaI digested pBabe Bleo (resulting in loss of Bleo gene; blunting BamHI and HindIII sites together) from HindIII-ClaI fragments.

pLH-ZHWT×12-IL2-SEAPpLH-ZHWT × 12-IL2-SEAP

ZFHD1 결합 부위의 12 탄뎀 복사체를 함유하는 보고 유전자의 복사체 및 SEAP 유전자를 발현시키는 IL2 유전자로부터의 기저 촉진제를 pLH 레트로비랄 벡터내로 클로닝시키기 위해, pZHWT×12-IL2-SEAP(ClaI 링커가 부가됨)로부터의 MluI-ClaI 단편을 pLH의 ClaI 부위내로 클로닝시켰다. 비루스 LTR 및 내부의 ZFHD-IL2 촉진제로부터의 전사 방향이 같도록 배향시켰다.PZHWT × 12-IL2-SEAP (with a ClaI linker) to clone a copy of the report gene containing 12 tandem copies of the ZFHD1 binding site and a basal promoter from the IL2 gene expressing the SEAP gene into the pLH retroviral vector. MluI-ClaI fragments from were cloned into the ClaI site of pLH. Orientation was performed such that the direction of transcription from the virus LTR and the internal ZFHD-IL2 promoter was the same.

pLH-G5-IL2-SEAPpLH-G5-IL2-SEAP

SEAP 유전자를 발현시키는 최저 IL2 촉진제중에 파묻힌 5 Gal4 부위를 함유하는 레트로비랄 벡터를 구성하기 위해, 비루스 LTR 및 내부의 Gal4-IL2 촉진제로부터의 전사 방향이 같도록 하기:To construct a retroviral vector containing a 5 Gal4 site embedded in the lowest IL2 promoter expressing the SEAP gene, the same direction of transcription from the viral LTR and the internal Gal4-IL2 promoter is:

로 이루어진 ClaI-BstBI 단편을 pLH의 ClaI 부위내로 삽입시켰다: 5 Gal4 부위(밑줄 그음) 및 영역 IL2 유전자(이탤릭체)의 -324 내지 -294(진하게 나타냄) 및 -72 내지 +45를 함유하는 ClaI-HindIII 단편 및 SEAP 유전자 코딩 서열(Berger et al., Gene 66:1-10, 1988)을 함유하는 HindIII-BstBI 단편을 정지 코돈직후에 5'-CCCGTGGTCCCGCGTTGCTTCGAT 서열(BstBI 부위를 함유함)을 부가하기 위해 개체변이시켰다.The ClaI-BstBI fragment consisting of was inserted into the ClaI site of pLH: ClaI- containing 5 Gal4 site (underlined) and -324 to -294 (in bold) and -72 to +45 of region IL2 gene (italic). HindIII-BstBI fragments containing HindIII fragments and SEAP gene coding sequences (Berger et al., Gene 66: 1-10, 1988) were added to the 5'-CCCGTGGTCCCGCGTTGCTTCGAT sequence (containing the BstBI site) immediately after the stop codon. Individual mutation.

B. 안정하게 감염시킨 세포중의 라파마이신-의존성 전사 활성B. Rapamycin-dependent Transcriptional Activity in Stably Infected Cells

본 발명자들은 본 시스템이 안정하게 감염시킨 세포중에서 유사한 특성을 나타냄을 확신하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 SEAP 표적 유전자 및 ZFHD1-3FKBP 및 1FRB-p65 각각에 대한 발현 벡터의 잇따른 감염에 의해 안정한 세포 라인을 생성하였다. 최종 전사로부터 결과된 수십개의 안정한 클론이 괴어 있는 곳이 라파마이신-의존성 SEAP 생성을 나타냈다. 이 웅덩이로부터, 본 발명자들은 몇몇의 개별적 클론이 라파마이신에 대한 응답에 있어서 높은 수준의 SEAP를 생성함을 발견하였다. 이 결과로 인한 하나의 상기 클론을 도 4C에 나타낸다. 상기 클론은 상기 웅덩이보다 약 40배 높고 일시적으로 감염시킨 세포보다 상당히 높은 수준의 SEAP를 생성하였다. 상기 클론에 있어서의 배경 SEAP 생성 및 도입율을 정확히 정량하기 위해 시도하는 바, 본 발명자들은 처리하지 않은 세포중의 모든 SEAP 활성까지도 검출되도록 SEAP 검정의 길이를 약 50 인자로 증가시켜서 2회에 걸쳐 검정을 수행하였다. 이러한 조건하에서, 거짓 감염시킨 세포는 47개의 임의의 형광 유닛을 생성한 반면, 감염시킨 클론은 라파마이신 존재중에서 54 유닛 및 100nM 라파마이신에서 90,000 유닛 이상을 생성하였다. 따라서, 이러한 안정한 세포 라인에 있어, 배경 유전자 발현은 무시할 수 있었고, 도입율(90,000 유닛에 대해 7 유닛)은 4승 이상으로 컸다.We conducted the following experiments to ensure that our system exhibited similar characteristics in stably infected cells. We generated stable cell lines by subsequent infection of the expression vector against the SEAP target gene and ZFHD1-3FKBP and 1FRB-p65, respectively. The dozens of stable clones resulting from the final transcription showed rapamycin-dependent SEAP production. From this pool, we found that several individual clones produced high levels of SEAP in response to rapamycin. One such clone resulting from this result is shown in FIG. 4C. The clone produced about 40 times higher than the pool and significantly higher levels of SEAP than transiently infected cells. In an attempt to accurately quantify the background SEAP production and introduction rate in these clones, the inventors increased the length of the SEAP assay to about 50 factors twice in order to detect all SEAP activity in untreated cells. The assay was performed. Under these conditions, the false infected cells produced 47 random fluorescent units, whereas the infected clones produced 54 units and more than 90,000 units in 100 nM rapamycin in the presence of rapamycin. Thus, for this stable cell line, background gene expression was negligible and the rate of introduction (7 units for 90,000 units) was greater than 4 powers.

안정하게 감염시키는 일을 간략화시키기 위해, 본 발명자들은 내부 리보솜 입구 서열(IRES)을 이용하여 ZFHD1-3FKBP와 1FRB-p65 둘다의 생성을 지시하는 비시스트로닉 발현 벡터를 이용하였다. 상기 발현 플래즈미드를 제오신-내성 표식 플래즈미드와 함께, 역으로-변환시킨 SEAP 보고 유전자를 운반하는 세포 라인내로 상호감염시켰으며, 약 40개의 약물-내성 클론이 괴어 있는 곳을 선택하여 확장시켰다. 도 4D는 상기 클론이 괴어 있는 곳 또한 배경물의 검출되지 않으면서 라파마이신-의존성 SEAP 생성을 나타내었고 일시적으로 감염시킨 세포에서 관찰되었던 것과 유사한 투여량-응답 곡선을 보여준다. 상기 클론이 괴어 있는 곳은 도 4C에서 연구했던 클론과 유사한 성능을 갖는 개별적 클론을 함유할 것으로 기대된다. 따라서, 라파마이신-응답성 유전자 발현은 일시적으로 감염시킨 세포 및 안정하게 감염시킨 세포 둘다에서 쉽게 얻어질 수 있다. 이 두가지 경우에 있어서, 매우 낮은 배경 및 높은 도입율을 나타냈다.To simplify the task of stable infection, we used bistronic expression vectors that direct the production of both ZFHD1-3FKBP and 1FRB-p65 using the internal ribosomal entry sequence (IRES). The expression plasmid was transfected with the zeocin-resistant marker plasmid into a cell line carrying the reverse-transformed SEAP report gene, and selected where about 40 drug-resistant clones were plagued. Expanded. FIG. 4D shows the rapamycin-dependent SEAP production where the clone was clogged and without detection of background and shows a dose-response curve similar to that observed in transiently infected cells. It is expected that the clones will contain individual clones with similar performance as the clones studied in FIG. 4C. Thus, rapamycin-responsive gene expression can be readily obtained in both transiently and stably infected cells. In both cases, very low background and high introduction rates were shown.

안정한 세포 라인. 보고 유전자 또는 DNA 결합 도메인 융합물을 함유하는 헬퍼-프리 레트로비루스는 Psi(-) 암포트로픽 패킹 벡터 및 레트로비랄 벡터 pLH-ZHWT×12-IL2-SEAP 또는 SMTN-ZFHD1-3FKBP 각각을 이용한 293T 세포(Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L. Baltimore D., 1993)의 일시적 상호-감염에 의해 생성하였다. 안정하게 통합된 보고 유전자를 함유한 클론성 세포 라인을 생성하기 위해, 레트로비랄 스톡으로 감염시킨 HT1080 세포를 희석시키고 300㎍/㎖ 히그로마이신 B의 존재중에서 선택하였다. 이로부터의 각각의 클론 및 이하에 개시된 다른 세포 라인을 결손 성분의 일시적 감염으로 선별한 후, 상기 기재된 바와 같이 라파마이신을 부가하였다. 분석한 모든 12 클론을 유도할 수 있었으며, 기저 활성을 조금 가지거나 전혀 가지지 않았다. 가장 대표적인 클론인 HT1080L을 선택하여 추가로 연구하였다.Stable cell lines. The helper-free retrovirus containing the report gene or DNA binding domain fusions can be expressed in 293T cells using Psi (-) Amphoropic packing vector and retroviral vector pLH-ZHWT × 12-IL2-SEAP or SMTN-ZFHD1-3FKBP, respectively. Pear, WS, Nolan, GP, Scott, ML Baltimore D., 1993). To generate clonal cell lines containing stably integrated report genes, HT1080 cells infected with retroviral stocks were diluted and selected from the presence of 300 μg / ml hygromycin B. Each clone from this and other cell lines disclosed below were selected for transient infection of the missing components followed by the addition of rapamycin as described above. All 12 clones analyzed could be derived and had little or no basal activity. The most representative clone, HT1080L, was selected for further study.

pLH-ZHW×12-IL2-SEAP 보고 유전자, ZFHD1-3FKBP DNA 결합 도메인 및 안정하게 통합된 1FRB-p65(361-550) 활성 도메인을 함유하는 HT20-6 세포는, 먼저 HT1080L 세포를 SMTN-ZFHD1-3FKBP-패킹된 레트로비루스로 감염시키고 500㎍/㎖ G418을 함유하는 배지중에서 선택함으로써 생성하였다. 그리고나서, 강한 응답성 클론인 HT1080L3를 선형화시킨 pCGNN-1FRB-p65(361-550) 및 pZeoSV(Invitrogen)으로 감염시키고 250㎍/㎖ 제오신을 함유하는 배지중에서 선택하였다. 먼저, 각각의 클론을 1FRB-p65(361-550)의 존재에 대해 시험하였다. 8개의 양성적 클론에 라파마이신을 부가하여 분석하였다. 8개 모두 낮은 기저 활성을 가졌으며, 이들중 6개에 있어서 최소한 2승으로 유전자 발현이 유발되었다. 강한 응답을 나타낸 클론인 HT20-6을 선택하여 추가 분석하였다.HT20-6 cells containing a pLH-ZHW × 12-IL2-SEAP report gene, a ZFHD1-3FKBP DNA binding domain and a stably integrated 1FRB-p65 (361-550) active domain were first identified as SMTN-ZFHD1- It was generated by infection with 3FKBP-packed retrovirus and selecting from media containing 500 μg / ml G418. The strong responsive clone, HT1080L3, was then infected with linearized pCGNN-1FRB-p65 (361-550) and pZeoSV (Invitrogen) and selected from media containing 250 μg / ml zeosin. First, each clone was tested for the presence of 1FRB-p65 (361-550). Rapamycin was added to 8 positive clones for analysis. All eight had low basal activity and in six of them gene expression was induced by at least power. HT20-6, a clone that showed strong response, was selected for further analysis.

HT1080L 세포를 선형화시킨 pCGNN-1FRB-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBP 및 pZeoSV를 이용하여 상호-감염시키고 250㎍/㎖ 제오신을 함유하는 배지중에서 선택하였다.HT1080L cells were inter-infected with pCGNN-1FRB-p65 (361-550) -IRES-ZFHD1-3FKBP and pZeoSV linearized and selected from media containing 250 μg / ml zeosin.

분석을 위해, 세포를 96-웰 디쉬(1.5×104세포/웰)에 플레이팅하고, 각각의 웰에 대해 제시량의 라파마이신(또는 기초제)을 함유하는 배지 200㎕를 첨가하였다. 18시간후에, 배지를 제거하고 SEAP 활성에 대해 검정하였다. 몇몇 경우에 있어, 분석에 앞서 배지를 희석하고, 얻은 대응하는 SEAP 유닛을 배로 희석시켜서 배가시켰다. 감염시키지 않은 HT1080 세포로부터 측정한 배경 SEAP 활성을 각각의 수치로부터 감하였다.For analysis, cells were plated in 96-well dishes (1.5 × 10 4 cells / well) and 200 μl of medium containing the indicated amount of rapamycin (or basal) was added to each well. After 18 hours, the medium was removed and assayed for SEAP activity. In some cases, media was diluted prior to analysis and the corresponding SEAP units obtained were doubled by doubling. Background SEAP activity measured from uninfected HT1080 cells was subtracted from each value.

실시예 4: 마우스에 있어서 hGH의 라파마이신-의존성 생성물Example 4: Rapamycin-dependent product of hGH in mice

생체내 방법: 동물, 경작 및 일반 과정. 숫컷 nu/nu 마우스를 챨스 리버 실험실(Charles River Laboratories; Wilmington, MA)에서 구하여 실험에 앞서 5일동안 길들였다. 마우스를 무균성 환경에서 자라게 하고, 실험동안에 무균 식품 및 살균수를 자유롭게 먹게 하였으며, 철저한 살균 기술로 처리하였다. 하우징, 경작 기술 또는 실험 기술의 결과로서의 외면적 감염 또는 외관상 질병을 나타내는 면역-해결된 동물은 전혀 없었다.In vivo methods: animals, farming and general processes. Male nu / nu mice were obtained from Charles River Laboratories (Wilington, Mass.) And tamed for 5 days prior to the experiment. Mice were allowed to grow in an sterile environment, freely eaten sterile food and sterile water during the experiment, and treated with thorough sterilization techniques. There were no immuno-resolved animals exhibiting external infections or apparent diseases as a result of housing, tillage techniques or experimental techniques.

일시적으로 감염시킨 세포를 마우스내에 이식시키기 위해, 2×106감염시킨 HT1080 세포를 100㎕ PBS/0.1% 글루코스 완충액중에 현탁시키고, 동물의 둔부 및 옆구리상의 4곳의 근육내 부위에 투여하였다(부위당 약 125㎕). 대조 마우스에 대해서는 당량 부피의 완충액만을 주사하였다.To transplant transiently infected cells into mice, 2 × 10 6 infected HT1080 cells were suspended in 100 μl PBS / 0.1% glucose buffer and administered to four intramuscular sites on the hip and flank of the animal (site). About 125 μl per). Control mice were injected with only equivalent volume of buffer.

등부의 N, N-디메틸아세트아미드 및 9:1(부피비) 혼합물의 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 400)과 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트를 용해시켜서, 생체내 투여를 위한 라파마이신을 제형하였다. 완결된 제형에 있어서, 라파마이신의 농도는 2.0㎖/㎏ 주사량으로 적절한 1회 복용량의 생체내 투여를 허용할 만큼 충분하였다. 1회 복용할 용액의 정밀도는 꼬리 정맥내로의 정맥내 투여에 앞서 HPLC 분석함으로써 확신하였다. 감염시킨 HT1080 세포를 전혀 가지고 있지 않는 몇몇 대조 마우스는 10.0㎎/㎏ 라파마이신을 수용하였다. 추가로, 감염시킨 세포를 갖는 다른 대조 마우스는 라파마이신 기초제만을 수용하였다.Rapamycin was formulated for in vivo administration by dissolving polyglycol glycol (average molecular weight 400) and polyoxyethylene sorbitan monooleate in a back N, N-dimethylacetamide and 9: 1 (volume ratio) mixture. In the finished formulation, the concentration of rapamycin was sufficient to allow an appropriate single dose in vivo administration at 2.0 ml / kg injection. The precision of the solution to be taken once was assured by HPLC analysis prior to intravenous administration into the tail vein. Some control mice that had no infected HT1080 cells received 10.0 mg / kg rapamycin. In addition, other control mice with infected cells received only rapamycin basal.

CO2 흡입을 통해 마취 또는 희생시킨 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 마취된 마우스는 심장천자에 의한 혈액 100㎕를 수집하는데 이용하였다. 마우스를 소생시켜서 이후의 혈액 수집을 위해 회복시켰다. 희생시킨 마우스는 즉시 피를 뽑아냈다. 혈액 샘플을 24시간동안 4℃에서 응결시키고, 혈청을 수집하여 1000×g에서 15분간 원심분리시켰다. 혈청 hGH를 뵈링거 만하임 비-이소트로픽 샌드위치 ELISA(Cat No. 1 585 878)로 측정하였다. 검정 결과, 0.0125ng/㎖의 검출 하한치 및 0.4ng/㎖로 연장된 동적 범위를 가졌다. 추천된 검정 지시는 다음과 같다. 흡수도는 몰레큘러 디바이스 미크로티터 플레이트 리이더상에서 490nm 표준 파장을 이용하여 405nm에서 읽었다. ELISA중의 항체 시약은 희석시킨 혈청 또는 천연 샘플에 있어서 내인성 쥐의 hGH에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않았다.CO2 Blood was collected from anesthetized or sacrificed mice via inhalation. Anesthetized mice were used to collect 100 μl of blood from cardiac puncture. Mice were resuscitated and restored for subsequent blood collection. The mice sacrificed immediately drained blood. Blood samples were condensed at 4 ° C. for 24 hours and serum collected and centrifuged at 1000 × g for 15 minutes. Serum hGH was measured by the Charinger Mannheim non-isotropic sandwich ELISA (Cat No. 1 585 878). The assay had a lower detection limit of 0.0125 ng / ml and a dynamic range extended to 0.4 ng / ml. Recommended test instructions are as follows: Absorbance was read at 405 nm using a 490 nm standard wavelength on a molecular device microtiter plate reader. Antibody reagents in ELISA showed no reactivity to endogenous rat hGH in diluted serum or natural samples.

생체내 hGH 발현. hGH 발현의 1회 복용량-의존성 라파마이신-유발된 자극의 검정을 위해, HT1080 세포 주사후 약 1시간에 마우스에게 라파마이신을 투여하였다. 라파마이신의 1회 복용량은 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 또는 10.0㎎/㎏으로 하였다. 라파마이신 투여후 수 시간후에, 마우스를 희생시키고 혈액을 수집하였다.HGH expression in vivo. For the assay of single dose-dependent rapamycin-induced stimulation of hGH expression, mice were administered rapamycin about 1 hour after HT1080 cell injection. The single dose of rapamycin was 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 or 10.0 mg / kg. Several hours after rapamycin administration, mice were sacrificed and blood was collected.

생체내 hGH 발현의 시간 경로를 알아보기 위해, 마우스에게 세포 주사후 1시간에 10.0㎎/㎏의 라파마이신을 투여하였다. 라파마이신 투여후 4, 8, 17, 24 및 42시간에 마우스를 희생시켰다.To determine the time course of hGH expression in vivo, mice received 10.0 mg / kg of rapamycin 1 hour after cell injection. Mice were sacrificed 4, 8, 17, 24 and 42 hours after rapamycin administration.

라파마이신을 반복적으로 투여하면서, 이식시킨 HT1080 세포로부터 hGH의 지속된 발현을 유도할 수 있는 라파마이신의 능력을 시험하였다. 상기 기재한 바와 같이 감염시킨 HT1080 세포를 마우스에게 투여하였다. 세포 주사후 약 1시간째, 라파마이신의 정맥내 1회 복용량 10.0㎎/㎏의 1/5을 나타냈다. 1회 복용량의 나머지 4분은 마취하에, 즉시 16, 32, 48 및 64시간째에 혈액 수집으로 주어졌다. 추가의 혈액 수집을 첫 번째 라파마이신 복용에 이어 72, 80, 88 및 96시간째에 수행하였다. 대조 마우스에 대해 세포를 투여하였지만, 라파마이신의 수회 투여에 대해서도 기초제만이 수용되었다. 실험 동물 및 그 대조 상대물을 2 그룹의 하나에 대해 각각 할당하였다. 2 실험군 및 2 대조군의 각각은 동일 약물 또는 기초제 처리물을 별도로 수용하였다. 2 그룹 사이에서 번갈아 가면서 혈액을 수집하여 각각의 동물에 대한 혈액 수집 빈도를 감소시켰다는 점에서 2 그룹이 다르다.With repeated administration of rapamycin, the ability of rapamycin to induce sustained expression of hGH from transplanted HT1080 cells was tested. Infected HT1080 cells were administered to mice as described above. About 1 hour after cell injection, 1/5 of 10.0 mg / kg intravenous dose of rapamycin was shown. The remaining 4 minutes of one dose were given as blood collection under anesthesia and immediately at 16, 32, 48 and 64 hours. Additional blood collection was performed at 72, 80, 88 and 96 hours following the first rapamycin dose. Cells were administered to control mice, but only basal agent was also accepted for multiple administrations of rapamycin. Experimental animals and their counterparts were each assigned to one of two groups. Each of the 2 experimental and 2 control groups received the same drug or base agent treatment separately. The two groups differ in that blood is collected alternately between the two groups, reducing the frequency of blood collection for each animal.

결과result

라파마이신은 상기 동물에 있어서 hGH의 1회 복용량-응답성 생성을 끌어냈다(도 6). 라파마이신으로 처리한 동물중의 hGH 농도는 사람에 있어서의 정상적인 혈행 수준(0.2-0.3ng/㎖)에 필적하였다. 본 실험에 있어, hGH 생성에 있어서 고평부는 전혀 관찰되지 않았으며, hGH 생성을 위한 감염된 세포의 최대 용량에 이르지 못했음을 의미한다. 대조 동물-감염 세포는 수용시켰지만 라파마이신은 수용시키지 않았고, 라파마이신은 수용시켰지만 세포는 수용시키지 않음-은 검출될 만한 혈청 hGH는 전혀 나타내지 않았다. 따라서, 이들 동물에 있어서 hGH의 생성은 처리 세포와 라파마이신 둘다의 존재에 절대적으로 의존하였다.Rapamycin elicited single dose-responsive production of hGH in these animals (FIG. 6). HGH concentrations in animals treated with rapamycin were comparable to normal blood circulation levels (0.2-0.3 ng / ml) in humans. In this experiment, no high plateau was observed in hGH production, meaning that the maximum dose of infected cells for hGH production was not reached. Control animals-infected cells but not rapamycin, rapamycin but not cells-showed no detectable serum hGH. Thus, the production of hGH in these animals was absolutely dependent on the presence of both treated cells and rapamycin.

라파마이신 투여후 17시간째에 혈청중의 hGH의 수준은 주목할 정도로 현저하였는데, hGH가 상기 동물에 있어서 4분 이하의 반감기로 순환된 것이 분명하기 때문이다. 이러한 관찰은 처리 세포가 라파마이신 처리후 수시간동안 hGH를 계속해서 분비했음을 의미하였다. hGH 생성의 라파마이신 대조군의 키네틱을 시험하기 위해, 본 발명자들은 동물을 라파마이신 단일 복용으로 처리한후, 수차례 hGH 수준을 측정하였다. 혈청 hGH를 라파마이신 처리후 4시간이내에 관찰하였고, 8시간째에 최고치에 달했으며, 처리후 42시간동안 검출되었다(도 7). hGH 농도는 약 11시간의 반감기를 가지고 그 최고치로부터 붕괴되었다. 이 반감기는 상기 동물에 있어서 hGH 자체의 반감기보다 몇백배 그리고 라파마이신의 반감기(4.6시간)보다 약 2배 더 길다. 라파마이신에 비해 더 늦은 혈청 hGH의 붕괴는 이식 세포의 부근에서의 라파마이신의 더 높은 조직 농도에 영향을 미칠 수 있다. 다시 말하면, 처리 세포로부터의 hGH 생성의 지속은 hGH mRNA의 안정성에 의해 강화될 수 있다.At 17 hours after rapamycin administration, the level of hGH in the serum was remarkable, as it is evident that the hGH circulated with a half-life of up to 4 minutes in the animal. This observation indicated that treated cells continued to secrete hGH for several hours after rapamycin treatment. To test the kinetic of the rapamycin control of hGH production, we treated the animals with a single dose of rapamycin and then measured hGH levels several times. Serum hGH was observed within 4 hours after rapamycin treatment, peaked at 8 hours, and detected for 42 hours after treatment (FIG. 7). The hGH concentration collapsed from its peak with a half-life of about 11 hours. This half-life is several hundred times greater than the half-life of hGH itself in the animal and about two times longer than the half-life of rapamycin (4.6 hours). Late breakdown of serum hGH compared to rapamycin may affect higher tissue concentrations of rapamycin in the vicinity of transplanted cells. In other words, the duration of hGH production from treated cells can be enhanced by the stability of hGH mRNA.

흥미롭게도, 42시간째에 상기 동물에 대한 라파마이신의 2번째 1회 복용량의 투여는 혈청 hGH의 2번째 피크로 결과되며, 이것은 유사한 키네틱으로 붕괴되는데, 처리 세포가 최소 2일동안 라파마이신에 대해 응답하도록 능력이 지속됨을 나타낸다. 따라서, 순환되는 hGH 농도를 평가 및 유지하기 위한 상기 시스템의 능력을 규명하기 위해, 본 발명자들은 16시간 간격으로 동물에게 라파마이신을 다중 1회 복용시키는 시험을 수행하였다. 상기 간격은 hGH 수준이 최고에 이른후에 약 절반으로 쇠퇴하는데 필요한 시간에 상응한다. 이러한 양생법에 따라, 2회의 복용후에 1.7㎍/㎖의 정상-상태 구조 농도에 접근하도록 라파마이신 농도가 예상된다(도 8에서 점선으로 나타냄). hGH 수준은 또한 2차 복용에 이은 정상-상태 구조 농도에 접근하도록 해준다. 도 8은 처리 동물은 라파마이신의 반복 복용에 응답하여 상대적으로 안정한 수준의 순환하는 hGH가 유지됨을 보여준다. 최종 복용후에, hGH 수준은 16시간동안 일정하게 유지되고, 그리고나서, 라파마이신(hGH에 대해 6.8시간 대 라파마이신에 대해 4.6시간)에서와 유사한 반감기로 쇠퇴된다. 이 자료는, 다중 복용시, 순환하는 라파마이신이 생체내 감염 세포로부터의 hGH 분비 이상으로 타이트한 대조군을 제공함을 의미한다. 실제로, 단백질 생성이 약물 투약 중지시에 빠르게 종결됨은 명백하다.Interestingly, administration of the second single dose of rapamycin to the animal at 42 hours results in a second peak of serum hGH, which collapses into a similar kinetic, in which treated cells are treated for rapamycin for at least two days. Indicates that the ability to respond continues. Thus, to characterize the system's ability to assess and maintain circulating hGH concentrations, we conducted a test in which animals received multiple doses of rapamycin at 16 hour intervals. The interval corresponds to the time required to decay by about half after the hGH level reaches its highest. According to this curing method, rapamycin concentration is expected to approach a steady-state structural concentration of 1.7 μg / ml after two doses (indicated by the dashed line in FIG. 8). hGH levels also allow access to steady-state structural concentrations following the second dose. 8 shows that treated animals maintain relatively stable levels of circulating hGH in response to repeated doses of rapamycin. After the last dose, hGH levels remain constant for 16 hours and then decline with a half-life similar to that for rapamycin (6.8 hours for hGH versus 4.6 hours for rapamycin). This data means that, at multiple doses, circulating rapamycin provides a tight control over hGH secretion from infected cells in vivo. In fact, it is evident that protein production terminates quickly upon discontinuation of drug dosing.

검토Review

본 실험은 분자량이 작은 약물을 이용하여 유전적으로 처리한 세포로부터 분비된 치료학적 단백질의 생성을 조정할 수 있는 가능성을 나타낸다. 이 시스템은 사람 유전자 및 세포 치료에 있어서의 사용에 요구되는 많은 양상을 갖는다. 상기 시스템은 매우 낮은 배경 활성 및 높은 도입율을 특징으로 한다. 또한, 숙주 생리학 또는 모든 세포-타입-특이 인자에 대해 영향을 받지 않는다. 아울러, 완전히 사람의 단백질로 구성된다. 대조 약물은 생체내에서 양호하게 작용하고 경구적으로 생체작용될 수 있다.This experiment demonstrates the possibility of modulating the production of therapeutic proteins secreted from genetically treated cells with low molecular weight drugs. This system has many aspects that are required for use in human gene and cell therapy. The system is characterized by very low background activity and high introduction rate. In addition, it is not affected for host physiology or for all cell-type-specific factors. In addition, it consists entirely of human proteins. The control drug works well in vivo and can be orally bioactive.

상기 일반적 디자인의 시스템에 있어, 처리 세포로부터 분비된 치료학적 단백질의 안정하고 정확하게 적정된 복용량을 생체내에 제공할 수 있다. 일시적 중단 및 불규칙적인 복용 또한 일어날 수 있다. 낮은 분자량의 대조군하에서 처리 세포로부터의 단백질 송달의 상당한 이점은 주어진 모든 시간에서 단백질 생성 속도가 낮은 분자량 약물의 순환 농도에 영향을 준다는 것이다. 따라서, hGH와 같은 치료학적 단백질의 명확한 약리학적키네틱이 극적으로 변할 수 있다. 예를 들면, 본 실험에 있어서, 라파마이신의 단일 투여에 이어 처리 세포로부터 송달된 순환 hGH의 키네틱이 재조합된 단백질의 단일 투여에 이어 관찰된 상기 키네틱과 현저하게 다르다. 마우스에 대해 정맥내 투여된 hGH가 수 분의 반감기로 제거되는 반면, 처리 세포로부터의 hGH 수준은 약 7시간의 반감기로 붕괴된 라파마이신으로 유발된다. hGH 제거를 위한 반감기가 약 20분인 사람의 경우에도, 매일 주사하여만 되고, 혈청 hGH 수준은 극적으로 변화된다. 정확한 약물학적 제어하에서 처리 세포로부터의 단백질, 그중에서도 특히 빈약한 약리학적키네틱 또는 낮은 치료학적 인덱스를 갖는 단백질 송달이 더욱 효과적인 치료를 이끌어 낼 것이다.In the above system of general design, it is possible to provide in vivo a stable and correctly titrated dose of therapeutic protein secreted from treated cells. Temporary interruptions and irregular doses can also occur. A significant advantage of protein delivery from treated cells under low molecular weight controls is that the rate of protein production affects the circulating concentration of low molecular weight drugs at any given time. Thus, the clear pharmacological kinetic of therapeutic proteins such as hGH can change dramatically. For example, in this experiment, the kinetic of circulating hGH delivered from treated cells following a single administration of rapamycin is significantly different from the kinetic observed following a single administration of the recombinant protein. Intravenously administered hGH for mice is eliminated with a half-life of several minutes, while hGH levels from treated cells are induced with rapamycin that has collapsed with a half-life of about 7 hours. Even in humans with a half-life of about 20 minutes for hGH removal, injection only is required daily, and serum hGH levels change dramatically. Under precise pharmacological control, protein delivery from treated cells, particularly poor pharmacological kinetics or protein with low therapeutic index, will lead to more effective treatment.

DNA-결합 도메인 및 활성 도메인을 연결하기 위한 낮은-분자량의 약물을 사용하는 것이 생체내 유전자 발현을 규직적으로 하기 위한 효과적 전술이다. 한가지 특히 중요한 특징은, 본 시스템이 전체적으로 조정될 수 있는데, 각각의 성분을 별도로 최적화 및 처리할 수 있다. DNA-결합 활성을 제어하기 위해 비교적 희박한 알로스테릭 분자간 상호작용에 의존하는 박테리아 리프레서에 비해, 실질적으로 모든 DNA-결합 및 활성 도메인에 대해 2분화 전략이 수용될 수 있다. 본 발명자들은 본 실험에서 DNA-결합 친화성 및 새로운 인지 특이성의 합리적 처리를 용이하게 지지하는 제한된 구조의 DNA-결합 도메인을 이용하였다. 유사하게는, 활성 도메인은 최대 잠재력 및 다른 적당한 특성을 처리할 수 있다. 실제로, 본 실험에서 사용한 처리된 전사 인자는 종래의 촉진제/강화제 시스템에 비해 매우 상당한 수준의 유전자 발현을 이끌어냈고, 추가로 상기 두 도메인이 용이하게 혼합될 수 있도록 강화시켰다. 단일 표적 유전자의 전사를 위한 처리 전사 인자를 도입시키기 위한 능력은 종래의 발현 벡터보다 실질적으로 더 높은 수준의 생체내 유전자 발현 및 낮은 배경이 성취되도록 기회를 제공한다.The use of low-molecular weight drugs for linking DNA-binding domains and active domains is an effective tactic for ordering gene expression in vivo. One particularly important feature is that the system can be adjusted as a whole, with each component separately optimized and processed. Compared to bacterial repressors, which rely on relatively sparse allosteric intermolecular interactions to control DNA-binding activity, a bidivision strategy can be accommodated for virtually all DNA-binding and active domains. We used a limited structure of DNA-binding domains in this experiment to facilitate the rational processing of DNA-binding affinity and new cognitive specificity. Similarly, active domains can handle maximum potential and other suitable properties. Indeed, the treated transcription factors used in this experiment elicited very significant levels of gene expression compared to conventional promoter / enhancer systems and further enhanced the two domains for easy mixing. The ability to introduce treatment transcription factors for the transcription of a single target gene offers the opportunity to achieve substantially higher levels of gene expression and lower background in vivo than conventional expression vectors.

본 발명자들은 또한 면역 시스템에 의해 일어날 수 있는 가능성을 최소화하기 위해 사람 단백질로부터 조절된 전사 인자를 구성하도록 선택하였다. 박테리아성 히그로마이신 인산염 변환효소 및 헤르페스 비루스성 티미딘 키나제로 이루어진 융합 단백질을 발현시키는 자기분해성 T 세포를 효과적으로 인지시키고, 면역 시스템이 약화된 AIDS 환자의 경우에도, 숙주 세포독성 T 세포에 의해 제거한 것으로 보고되었다(Riddell, S. R., et al., T-cell mediated rejection of genemodified HTV-specific cytotoxic T lymphocytes in HTV-infected patients, Nature Med. 2, 216-223(1996)). 상기 관찰은 처리 세포중의 이형 단백질의 면역 인지 위험이 실제로 있을 수 있으며, 따라서, 사람 세포중의 조졸 기능을 수행하기 위해 사람의 단백질을 신중하게 사용해야함을 의미한다. 본 전사 인자 융합 단백질의 각각의 개별적 성분이 사람으로부터 기인한 것일지라도, 각각의 단백질은 이종으로 인지될 수도 있는 연결 단백질을 함유한다. 그러나, 상기 연결물은 상기에서 개시된 바와 같이 면역 시스템에 대해 그들의 정위를 최소화시키도록 디자인 또는 선택될 수 있다.We also chose to construct regulated transcription factors from human proteins in order to minimize the possibility of being caused by the immune system. Effective recognition of autolytic T cells expressing a fusion protein consisting of bacterial hygromycin phosphate convertase and herpes viral thymidine kinase and eliminated by host cytotoxic T cells, even in AIDS patients with weakened immune systems (Riddell, SR, et al., T-cell mediated rejection of genemodified HTV-specific cytotoxic T lymphocytes in HTV-infected patients, Nature Med. 2, 216-223 (1996)). This observation implies that there may actually be an immune cognitive risk of the heterologous protein in the treated cells and, therefore, that human proteins must be used with caution in order to perform the chorus function in human cells. Although each individual component of the present transcription factor fusion protein is from a human, each protein contains a linking protein that may be recognized as heterologous. However, the linkages can be designed or selected to minimize their positioning with respect to the immune system as disclosed above.

실시예 5 : 대표적인 C-24 변성 라파로그(Rapalogs)의 합성Example 5 Synthesis of Representative C-24 Modified Rapalogs

라파마이신 정제. 라파마이신을 발효작용에 의해 얻었다. 유기체 Streptomyces hygroscopicus(ATCC#29253)를 제조하는 라파마이신을 15L 또는 30L 페드-배치식 발효물중의 복합 배지상에서 경작하였다. 원심분리에 의해 9-14일후에 생물량을 수확하였다. 상층물을 비이온성 중합체 흡착 수지인 XAD-16(Rohm and Haas)로 1-2시간동안 접촉시켰다. 원심분리로 흡착제를 회수하고, 생물량과 조합하여, 메틸렌클로라이드로 반복 추출하였다. 감압하에 용매를 제거하고, 형성된 잔류물을 아세토니트릴로 추출한 후, 유사한 방식으로 응축하였다. 미정제 라파마이신을 실리카겔(40% 아세톤/헥산)상에서 플래쉬 크로마토그래피로 크로마토그래픽 정제한 후, C-18 전환된-상 HPLC(70% CH3CN/H2O)하였다. 얻은 라파마이신은 원래의 라파마이신 샘플과 같은 HPLC, 스펙트로스코픽 및 생물학적 특성을 나타냈다.Rapamycin tablets. Rapamycin was obtained by fermentation. Rapamycin, which prepares the organism Streptomyces hygroscopicus (ATCC # 29253), was cultivated on complex media in 15L or 30L fed-batch fermentations. Biomass was harvested after 9-14 days by centrifugation. The supernatant was contacted with XAD-16 (Rohm and Haas), a nonionic polymer adsorption resin, for 1-2 hours. The adsorbent was recovered by centrifugation, combined with biomass and extracted repeatedly with methylene chloride. The solvent was removed under reduced pressure and the resulting residue was extracted with acetonitrile and then condensed in a similar manner. Crude rapamycin was chromatographed purified by flash chromatography on silica gel (40% acetone / hexane) followed by C-18 converted-phase HPLC (70% CH 3 CN / H 2 O). The obtained rapamycin showed the same HPLC, spectroscopic and biological properties as the original rapamycin sample.

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심) (AP1731 및 1732) 일반 과정Rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime) (AP1731 and 1732) General Course

MeOH(2㎖)중의 라파마이신(60㎎, 65.6mmol) 용액을 NaOAc(22㎎, 262mmol, 4.0eq)로 처리한 후, 메틸옥시아민 히드로클로라이드(22㎎, 262mmol, 4.0eq)로 처리하고 실온에서 48시간 교반시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 H2O(10㎖)로 켄칭하고 EtOAc(3×10㎖)로 추출하였다. 섞인 유기 추출물을 포화 NaCl 용액(2×10㎖)으로 세정하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하여 용액을 진공하에 농축시켰다. 형성된 잔류물을 실리카겔(10% MeOH/디클로로메탄)상에서 프래쉬 크로마토그래피하여, 이성체 혼합물을 얻었다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 35% AE 25% H2O/MeCN)로 분리하여, 13㎎(21%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 7.6㎎(12%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 965.5749[(M+Na)+ ,계산치 C52H82N2O13Na 965.5710]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 965.5701[(M+Na)+ ,계산치 C52H82N2O13Na 965.5710].A solution of rapamycin (60 mg, 65.6 mmol) in MeOH (2 mL) was treated with NaOAc (22 mg, 262 mmol, 4.0 eq) followed by methyloxyamine hydrochloride (22 mg, 262 mmol, 4.0 eq) and room temperature It was stirred for 48 hours. The reaction mixture was then quenched with H 2 O (10 mL) and extracted with EtOAc (3 × 10 mL). The combined organic extracts were washed with saturated NaCl solution (2 × 10 mL), dried over Na 2 SO 4 , filtered and the solution was concentrated in vacuo. The residue formed was flash chromatographed on silica gel (10% MeOH / dichloromethane) to give an isomer mixture. The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250x20 mm column passed 12 ml per minute, 35% AE 25% H 2 O / MeCN) to give 13 mg (21%) of the faster eluted Z isomer and 7.6 mg (12%) of the E isomer was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 965.5749 [(M + Na) + , calc. C 52 H 82 N 2 O 13 Na 965.5710]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 965.5701 [(M + Na) + , calc. C 52 H 82 N 2 O 13 Na 965.5710].

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-에틸옥심) (AP1688 및 1689)Rapamycin (E and Z) -24- (O-ethyloxime) (AP1688 and 1689)

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심)에서와 같은 방식으로 제조하였다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 30% H2O/MeCN)로 분리하여, 7.7㎎(25%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 0.5㎎(2%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 979.5902[(M+Na)+ ,계산치 C53H84N2O13Na 979.5871]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 965.5701[(M+Na)+ ,계산치 C52H82N2O13Na 965.5710].Prepared in the same manner as in rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime). The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250x20 mm column passed 12 mL per minute, 30% H 2 O / MeCN), yielding 7.7 mg (25%) of the eluted Z isomer and 0.5 mg (2%) ) Isomer of E was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 979.5902 [(M + Na) + , calc. C 53 H 84 N 2 O 13 Na 979.5871]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 965.5701 [(M + Na) + , calc. C 52 H 82 N 2 O 13 Na 965.5710].

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-이소부틸옥심) (AP1684 및 1685)Rapamycin (E and Z) -24- (O-isobutyloxime) (AP1684 and 1685)

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심)에서와 같은 방식으로 제조하였다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 15% H2O/MeCN)로 분리하여, 25㎎(65%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 3.0㎎(7%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1007.6146[(M+Na)+ ,계산치 C55H88N2O13Na 1007.6184]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1007.6157 [(M+Na)+ ,계산치 C55H88N2O13Na 1007.6184].Prepared in the same manner as in rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime). The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250x20 mm column passed 12 mL per minute, 15% H 2 O / MeCN), yielding 25 mg (65%) of the faster eluted Z isomer and 3.0 mg (7%). ) Isomer of E was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1007.6146 [(M + Na) + , calc. C 55 H 88 N 2 O 13 Na 1007.6184]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1007.6157 [(M + Na) + , calc. C 55 H 88 N 2 O 13 Na 1007.6184].

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-벤질옥심) (AP1682 및 1683)Rapamycin (E and Z) -24- (O-benzyloxime) (AP1682 and 1683)

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심)에서와 같은 방식으로 제조하였다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 15% H2O/MeCN)로 분리하여, 19.6㎎(44%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 6.1㎎(14%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1041.6033 [(M+Na)+ ,계산치 C58H86N2O13Na 1041.6028]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1041.5988 [(M+Na)+ ,계산치 C58H86N2O13Na 1041.6028].Prepared in the same manner as in rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime). The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250 × 20 mm column passed 12 ml / min, 15% H 2 O / MeCN), yielding 19.6 mg (44%) of the faster eluted Z isomer and 6.1 mg (14%). ) Isomer of E was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1041.6033 [(M + Na) + , calc. C 58 H 86 N 2 O 13 Na 1041.6028]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1041.5988 [(M + Na) + , calcd C 58 H 86 N 2 O 13 Na 1041.6028].

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-카르복시메틸옥심) (AP1686 및 1687)Rapamycin (E and Z) -24- (O-carboxymethyloxime) (AP1686 and 1687)

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심)에서와 같은 방식으로 제조하였다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 45% H2O/MeCN)로 분리하여, 4.6㎎(11%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 1.0㎎(2%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1009.5664 [(M+Na)+ ,계산치 C53H82N2O15Na 1009.5613]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1009.5604 [(M+Na)+ ,계산치 C53H82N2O15Na 1009.5613].Prepared in the same manner as in rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime). The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250x20 mm column passed 12 mL per minute, 45% H 2 O / MeCN), yielding 4.6 mg (11%) of the eluted Z isomer faster and 1.0 mg (2%). ) Isomer of E was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1009.5664 [(M + Na) + , calc. C 53 H 82 N 2 O 15 Na 1009.5613]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1009.5604 [(M + Na) + , calc. C 53 H 82 N 2 O 15 Na 1009.5613].

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-카르복시아미도메틸옥심) (AP1729 및 1730)Rapamycin (E and Z) -24- (O-carboxamidomethyloxime) (AP1729 and 1730)

라파마이신(E 및 Z)-24-(O-메틸옥심)에서와 같은 방식으로 제조하였다. 이성체 혼합물을 HPLC(Kromasil C-18 250x20mm 칼럼을 분당 12㎖로 통과시킴, 35% H2O/MeCN)로 분리하여, 6.2㎎(10%)의 보다 빠르게 용출된 Z 이성체 및 1.4㎎(2%)의 E 이성체를 얻었다. Z 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1008.5709 [(M+Na)+ ,계산치 C53H83N3O14Na 1008.5768]. E 이성체: 고-분해능 매스 스펙트럼 (FAB) m/z 1008.5753 [(M+Na)+ ,계산치 C53H83N3O14Na 1008.5768]Prepared in the same manner as in rapamycin (E and Z) -24- (O-methyloxime). The isomeric mixture was separated by HPLC (Kromasil C-18 250x20 mm column passed 12 mL per minute, 35% H 2 O / MeCN), yielding 6.2 mg (10%) of the eluted Z isomer and 1.4 mg (2%) ) Isomer of E was obtained. Z isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1008.5709 [(M + Na) + , calc. C 53 H 83 N 3 O 14 Na 1008.5768]. E isomer: high-resolution mass spectrum (FAB) m / z 1008.5753 [(M + Na) + , calcd C 53 H 83 N 3 O 14 Na 1008.5768]

실시예 6Example 6

A. FKBP에 대한 라파마이신 C24 '범프' 유사체의 결합 검정A. Binding Assay of Rapamycin C24 'Bump' Analogs to FKBP

FKBP에 대한 라파마이신 C24 유사체의 친화성을 형광 극성(FP)을 기초로 한 경쟁 검정을 이용하여 결정하였다. 형광-표지한 FK506 프로브(AP1491)를 합성하고, 그 형광 극성에 있어서의 증가를 비포화된 FKBP 및 변동량의 라파마이신 유사체를 경쟁물로서 함유하는 평형 결합 실험에 있어서의 % 경계 프로브의 직접적 정보판독으로서 이용하였다.The affinity of rapamycin C24 analogues to FKBP was determined using a competition assay based on fluorescence polarity (FP). Direct readout of the% border probe in an equilibrium binding experiment in which a fluorescence-labeled FK506 probe (AP1491) was synthesized and contained an increase in its fluorescence polarity as an unsaturated FKBP and varying amounts of rapamycin analog. It was used as.

(i) 형광된 FK506 프로브(AP1491)의 합성(i) Synthesis of Fluorescent FK506 Probe (AP1491)

FK506의 24, 32-비스(tert-부틸디메틸실릴)에테르24, 32-bis (tert-butyldimethylsilyl) ether of FK506

tert-부틸디메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트(108㎕, 470μmol)를, FK50-6(103㎎, 128μmol) 및 디클로로메탄(3㎖)중의 2, 6-루티딘(89.5㎕, 768μmol) 용액을 교반시키면서 0℃에서 한방울씩 떨어뜨려가면서 첨가하였다. 형성 용액을 0℃에서 2시간 교반시킨후, MeOH(0.5㎖) 및 에테르(15㎖)로 처리하였다. 혼합물을 10% 수성 NaHCO3(3㎖) 및 식염수(3㎖)로 세정하였다. 유기층을 데칸테이션하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하여 농축시켜서 황색 오일상을 얻었다. 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, 헥산-EtOAc=3:1)하여 무색 오일상의 표제 화합물(104mg)을 얻었다.tert-Butyldimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (108 μl, 470 μmol) was added to a solution of 2, 6-Lutidine (89.5 μl, 768 μmol) in FK50-6 (103 mg, 128 μmol) and dichloromethane (3 mL). It was added dropwise at 0 ° C. with stirring. The forming solution was stirred at 0 ° C. for 2 hours and then treated with MeOH (0.5 mL) and ether (15 mL). The mixture was washed with 10% aqueous NaHCO 3 (3 mL) and brine (3 mL). The organic layer was decanted, dried over anhydrous Na 2 SO 4 , filtered and concentrated to give a yellow oily phase. Column chromatography (silica gel, hexane-EtOAc = 3: 1) gave the title compound (104 mg) as a colorless oil.

중간체 1Intermediate 1

THF(2.5㎖)중의 FK506(100mg, 97μmol)의 24, 32-비스(tert-부틸디메틸실릴)에테르 용액에, 모르폴린(68mg, 580μmol)을 첨가한 후, 물(60㎕) 그리고 4% 4산화오스뮴 수용액(123㎕, 20μmol)을 첨가하였다. 형성 혼합물을 실온에서 4.5시간 교반시켰다. 그리고나서, 50% 수성 MeOH(1.5㎖) 및 과요오드산나트륨(207mg, 970μmol)으로 처리하고, 현탁액을 추가로 1시간 교반시켰다. 혼합물을 에테르(10㎖)로 희석시키고 포화 수성 NaHCO3(2x4㎖)로 세정하였다. 유기층을 데칸테이션하고, 소량의 아황산나트륨을 함유한 무수 황산나트륨으로 건조하여, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 무수 THF(2.8㎖)중에 용해시키고, 질소하에서 -78℃로 냉각시켜서, THF(282㎕)중의 0.5M의 트리스[(3-에틸-3-페틸)옥시]암모늄 수소화 리튬 용액으로 처리하였다. 형성 용액을 -78℃에서 1.75시간 교반시킨후, 에테르(6㎖) 및 포화 염화암모늄 용액(250㎕)을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물의 온도를 실온으로 올리고 무수 황산나트륨으로 처리하였다. 감압하에 여과 및 농축하여 담황색 오일상(97㎎)을 얻었으며, 이것을 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, 헥산-EtOAc=3:1)하여 무색 오일상으로서의 중간체 1을 얻었다.To 24, 32-bis (tert-butyldimethylsilyl) ether solution of FK506 (100 mg, 97 μmol) in THF (2.5 mL) was added morpholine (68 mg, 580 μmol), followed by water (60 μL) and 4% 4 An aqueous osmium oxide solution (123 µl, 20 µmol) was added. The formation mixture was stirred at rt for 4.5 h. It was then treated with 50% aqueous MeOH (1.5 mL) and sodium periodate (207 mg, 970 μmol) and the suspension was stirred for an additional hour. The mixture was diluted with ether (10 mL) and washed with saturated aqueous NaHCO 3 (2 × 4 mL). The organic layer was decanted, dried over anhydrous sodium sulfate containing a small amount of sodium sulfite, filtered and concentrated. The residue was dissolved in anhydrous THF (2.8 mL), cooled to −78 ° C. under nitrogen and treated with 0.5 M tris [(3-ethyl-3-petyl) oxy] ammonium hydride solution in THF (282 μl). It was. The forming solution was stirred at -78 ° C for 1.75 hours and then quenched by addition of ether (6 mL) and saturated ammonium chloride solution (250 μL). The temperature of the mixture was raised to room temperature and treated with anhydrous sodium sulfate. Filtration and concentration under reduced pressure gave a pale yellow oily phase (97 mg), which was subjected to column chromatography (silica gel, hexane-EtOAc = 3: 1) to give intermediate 1 as a colorless oil.

중간체 2Intermediate 2

아세토니트릴(10㎖)중의 상기 알코올(300mg, 290μmol) 용액을 2, 6-루티딘(338㎕, 2.9mmol) 및 N, N'-디숙신이미딜카르보네이트(371㎎, 1.45mmol)로 처리하였다. 형성된 현탁액을 실온에서 14.5시간 교반시킨후, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 크로마토그래피(실리카겔, 헥산-EtOAc=2:1 내지 100% EtOAc 구배)하여 담황색 오일상(127㎎)으로서의 혼합된 카보네이트 2를 얻었다.The solution of alcohol (300 mg, 290 μmol) in acetonitrile (10 mL) was diluted with 2, 6-lutidine (338 μl, 2.9 mmol) and N, N′-disuccinimidylcarbonate (371 mg, 1.45 mmol). Treated. The resulting suspension was stirred for 14.5 hours at room temperature and then concentrated under reduced pressure. The residue was chromatographed (silica gel, hexane-EtOAc = 2: 1 to 100% EtOAc gradient) to give mixed carbonate 2 as a pale yellow oily phase (127 mg).

중간체 3Intermediate 3

아세토니트릴(1㎖)중의 상기 카보네이트(30mg, 26μmol) 및 트리에틸아민(36㎕, 260μmol) 용액을 4'-(아미노메틸)플루오레스세인(13.5㎎, 34μmol)로 처리하였다. 형성된 밝은 오렌지색 현탁액을 실온에서 1시간 교반시킨후, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 크로마토그래피(실리카겔, 헥산-EtOAc=1:1 내지 100% EtOAc 내지 EtOAc-MeOH=1:1 구배)하여 담황색 고체상(20.5㎎)으로서의 3을 얻었다.The solution of carbonate (30 mg, 26 μmol) and triethylamine (36 μl, 260 μmol) in acetonitrile (1 mL) was treated with 4 ′-(aminomethyl) fluorescein (13.5 mg, 34 μmol). The light orange suspension formed was stirred at room temperature for 1 hour and then concentrated under reduced pressure. The residue was chromatographed (silica gel, hexane-EtOAc = 1: 1 to 100% EtOAc to EtOAc-MeOH = 1: 1 gradient) to give 3 as a pale yellow solid (20.5 mg).

화합물 4Compound 4

아세토니트릴(2㎖)중의 비스-실릴 에테르 3(35㎎, 25μmol) 용액을 물(250㎕)중의 48%(w/w) HF로 처리하였다. 형성된 혼합물을 실온에서 5.5시간 교반시켰다. 그리고나서, 디클로로메탄(10㎖)으로 희석시키고, 물(2x2㎖)로 세정하였다. 유기층을 데칸테이션하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에 농축하였다. 잔류물을 크로마토그래피(실리카겔, 100% EtOAc)하여 담황색 고체상(13㎎)으로서의 4를 얻었다.A solution of bis-silyl ether 3 (35 mg, 25 μmol) in acetonitrile (2 mL) was treated with 48% (w / w) HF in water (250 μL). The resulting mixture was stirred at rt for 5.5 h. It was then diluted with dichloromethane (10 mL) and washed with water (2 × 2 mL). The organic layer was decanted and dried over anhydrous sodium sulfate. Concentrated under reduced pressure. The residue was chromatographed (silica gel, 100% EtOAc) to give 4 as a pale yellow solid (13 mg).

(ii) FP를 이용한 라파마이신 유사체의 결합 친화력(IC50s)의 결정(ii) Determination of Binding Affinity (IC50s) of Rapamycin Analogues Using FP

작은 유리병중에서 100% 에탄올을 이용하여 각 유사체를 10배 희석시켜서 얼음상에 보관하였다. 모든 다른 조작은 실온에서 행하였다. 재조합시킨 순수한 FKBP(표준 방법으로 정제함, 참조 Wiederrecht, G. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760)의 원액을 50mM 인산칼륨 pH7.8/150mM NaCl/100㎍/㎖ 송아지 감마 글로빈(FP 완충액: Panvera로부터 낮은-형광 시약만을 사용하여 제조함)중의 11.25nM 및 다이나테치 미크로-플루오르 블랙 96-웰 형광 플레이트의 웰로 옮긴 98㎕ 정제수로 희석하였다. 라파마이신 유사체의 2.0㎕ 샘플을 혼합하면서 웰로 옮겼다. 끝으로, 0.1% 에탄올/FP 완충액중의 10nM AP1491을 함유하는 프로브 용액을 제조하여, 혼합시키면서 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 복제 대조 웰은 라파마이신 유사체 대신에 에탄올(100% 프로브 결합을 위해)을 함유하고, FKBP 대신에 FP 완충액(0% 결합)을 함유하였다.Each analog was diluted 10-fold with 100% ethanol in a vial and stored on ice. All other operations were performed at room temperature. A stock solution of recombined pure FKBP (purified by standard methods, see Wiederrecht, G. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760) was added to 50 mM potassium phosphate pH7.8 / 150 mM NaCl / 100 µg / Diluted with 11.25 nM in ml calf gamma globin (FP buffer: prepared using only low-fluorescence reagents from Panvera) and 98 μl purified water transferred to the wells of a Dynethech micro-fluoro black 96-well fluorescent plate. 2.0 μl samples of rapamycin analogs were transferred to the wells with mixing. Finally, a probe solution containing 10 nM AP1491 in 0.1% ethanol / FP buffer was prepared and 100 μl was added to each well with mixing. Replication control wells contained ethanol (for 100% probe binding) instead of rapamycin analogs and FP buffer (0% binding) instead of FKBP.

플레이트를 어둠속에서 약 30분간 덮어 보관하여 평형화시킨후, 각 웰에 있어서의 샘플의 형광 극성을 제작자가 추천한 졸리(Jolley) FPM-2 FP 플레이트 판독기(Jolley Consulting and Research, Inc., Grayslake, IL)로 판독하였다. 각 경쟁 농도에 대한 평균 극성(mP 단위)을 대조 수치에 대한 참조로 총 결합%로 전환시켜서, 경쟁자의 로그 몰 최종 농도(x)에 대해 플롯(y)하였다. 비-선형 최소 스퀘어 분석을 이용하여 곡선을 좋게 만들고, 하기 식을 사용하여 IC50을 이끌어냈다:After equilibration by keeping the plate covered in the dark for about 30 minutes, the fluorescence polarity of the sample in each well was determined by the manufacturer's recommended Jolley FPM-2 FP plate reader (Jolley Consulting and Research, Inc., Grayslake, IL). The mean polarity (in mP units) for each competition concentration was converted to percent total binding as a reference to the control value, plotted against the competitor's log molar final concentration (x) (y). The curves were made good using non-linear least squares analysis and the IC50 was derived using the following equation:

y=M1+(M4-M1)/(1+exp(M2*(M3-x)))y = M1 + (M4-M1) / (1 + exp (M2 * (M3-x)))

상기식에서, M3는 IC50이다. 불완전한 곡선을 위해 IC50을 내삽으로 결정하였다. 라파마이신 및 C14-데속소-라파마이신을 각각의 경우에 있어서 대조군으로서 포함시켰다(C14-데속소-라파마이신은 Luengo, J. I. et al., 1994 Tetrahedron Lett. 35, 6469-6472에 기재된 바와 같이 제조하였다).Wherein M3 is IC50. IC50 was determined by interpolation for incomplete curves. Rapamycin and C14-desoxo-rapamycin were included as controls in each case (C14-desoxo-rapamycin was prepared as described in Luengo, JI et al., 1994 Tetrahedron Lett. 35, 6469-6472 ).

(c) 라파마이신 C24 옥심의 결합 분석 결과(c) Results of binding analysis of rapamycin C24 oxime

친화력을 IC50 및 친화력의 배 손실(=IC50/라파마이신의 IC50)로 보고한다.Affinity is reported as IC50 and fold loss of affinity (= IC50 / IC50 of rapamycin).

B. FRAP에 대한 C7 라파로그-FKBP 복합체의 결합 검정B. Binding Assay of C7 Raphalog-FKBP Complex to FRAP

C7에서 벌크한 치환체를 갖는 라파로그('C7 라파로그') 시리즈를 참고 문헌에 기재된 바와 같이 합성하였다(Luengo et al., 1995, Chemistry and Biology 2, 471-481). 본 명세서에서의 자료는 다음에 나타낸 3가지 라파로그에 대한 것이다:A series of Rapalog ('C7 Rapalog') with bulky substituents at C7 was synthesized as described in the references (Luengo et al., 1995, Chemistry and Biology 2, 471-481). The data herein is for the following three rapalogs:

(a) 합성(a) synthesis

AP1700, 7S-이소프로폭시라파마이신:AP1700, 7S-isopropoxyrapamycin:

이소프로판올 30㎖중의 라파마이신(60㎎, 0.066mmol) 용액을 고체 p-톨루엔술폰산(75㎎, 0.39mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 교반시킨 후, 30㎖의 에틸아세테이트로 희석하고 포화 수성 중탄산나트륨(3x20㎖) 및 식염수(2x20㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨후, 여과 및 농축하였다. 리버스 상을 HPLC(Rainin C-18 ODS1 칼럼, 35% 아세토니트릴/물, 55℃)하여 원하는 생성물(25㎎, 40%)을 얻었다.A solution of rapamycin (60 mg, 0.066 mmol) in 30 ml of isopropanol was treated with solid p-toluenesulfonic acid (75 mg, 0.39 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours, then diluted with 30 ml of ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate (3x20ml) and brine (2x20ml). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated. The reverse phase was HPLC (Rainin C-18 ODS1 column, 35% acetonitrile / water, 55 ° C.) to afford the desired product (25 mg, 40%).

AP1701, 7R-(3-인돌릴)라파마이신 및 AP1702, 7S-(3-인돌릴)라파마이신:AP1701, 7R- (3-indolyl) rapamycin and AP1702, 7S- (3-indolyl) rapamycin:

디클로로메탄 2㎖중의 라파마이신(50㎎, 0.055mmol) 및 인돌(64㎎, 0.55 mmol) 용액을 교반시키면서 -40℃에서 트리플루오로아세트산(0.084㎖, 1.1mmol)을 한방울씩 떨어뜨려가면서 첨가하였다. 온도를 -40℃에서 -45℃내로 3시간동안 유지시킨후, 반응 혼합물을 에틸아세테이트(10㎖) 및 식염수(20㎖)로 분배하였다. 유기층을 식염수(4x20㎖)로 추가 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 리버스 상을 HPLC(Rainin C-18 ODS1 칼럼, 65% 아세토니트릴/물, 55℃)하여, 11.8㎎의 7S-인돌 및 7.6㎎의 7R-인돌(35%)을 얻었다.A solution of rapamycin (50 mg, 0.055 mmol) and indole (64 mg, 0.55 mmol) in 2 mL of dichloromethane was added dropwise with trifluoroacetic acid (0.084 mL, 1.1 mmol) at −40 ° C. with stirring. . After maintaining the temperature at -40 ° C to -45 ° C for 3 hours, the reaction mixture was partitioned between ethyl acetate (10 mL) and brine (20 mL). The organic layer was further washed with brine (4x20 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate. The reverse phase was HPLC (Rainin C-18 ODS1 column, 65% acetonitrile / water, 55 ° C.) to give 11.8 mg of 7S-indole and 7.6 mg of 7R-indole (35%).

화합물을 매스 스펙트럼 및 NMR로 분석하였다.Compounds were analyzed by mass spectra and NMR.

(b) C7 라파로그의 FKBP 결합 친화력의 FP 검정(b) FP assay of FKBP binding affinity of C7 rapalog

상기의 섹션 A중의 C24 라파로그에 대해 기재한 바와 같이, 길항적 FP를 이용하여 FKBP에 대한 라파로그의 친화력을 검정하였다. 라파마이신 및 C14-데속소-라파마이신(Luengo et al., 1994, Tetrahedron Lett. 35, 6469-6427에 기재된 바와 같이 제조함)을 대조군으로서 포함시켰다.As described for the C24 rapalog in section A above, antagonistic FP was used to assay the affinity of the rapalog for FKBP. Rapamycin and C14-desoxo-rapamycin (prepared as described in Luengo et al., 1994, Tetrahedron Lett. 35, 6469-6427) were included as controls.

친화력을 IC50s 및 친화력의 배 손실(=IC50/라파마이신의 IC50)로서 나타냈다.Affinity is expressed as IC50s and fold loss of affinity (IC50 / IC50 of rapamycin).

IC50 (nM)IC50 (nM) 친화력의 배 손실Pear loss of affinity 라파마이신Rapamycin 7.77.7 (1)(One) 데속소-라파마이신Desokso-rapamycin 162162 20.820.8 AP1700AP1700 17.817.8 2.52.5 AP1701AP1701 33.133.1 4.64.6 AP1702AP1702 24.524.5 3.03.0

상기 자료는, 라파마이신-FRAP 접촉면에서 C7 위치의 선정에 따라서 상기 거대 C7 치환체가 FKBP에 대한 라파로그의 친화력를 크게 감소시키지 않음을 나타낸다.The data indicate that upon selection of the C7 position at the rapamycin-FRAP contact surface, the large C7 substituent does not significantly reduce the affinity of the rapalog to FKBP.

(c) C7 라파로그의 FKBP 결합 친화력의 FP 검정(c) FP assay of FKBP binding affinity of C7 rapalog

배양 세포중에서 FRAP에 대한 라파로그-FKBP 복합체의 결합을 분석하기 위해, 본 발명자들은 HT20-6 세포(ZFHD1-응답성 SEAP 보고자를 함유하며 ZFHD1- (3xFKBP) 및 FRB-p65를 안정하게 발현시킨다: 참조 실시예 3(B))를 사용하였다. HT20-6 세포를 96-웰 디쉬(1x104세포/웰)에 플레이팅하고, 각각의 웰에 대해 라파로그의 연속적 희석물을 함유하는 200㎕의 배지를 첨가하였다. 22시간후, 배지를 제거하고 실시예 2에 제시한 바와 같이 SEAP 활성에 대해 검정하였다.To analyze the binding of the Rapalog-FKBP complex to FRAP in cultured cells, we present HT20-6 cells (containing ZFHD1-responsive SEAP reporters and stably express ZFHD1- (3xFKBP) and FRB-p65: Reference Example 3 (B)) was used. HT20-6 cells were plated in 96-well dishes (1 × 10 4 cells / well), and 200 μl of medium containing serial dilutions of Rapalog was added for each well. After 22 hours, the medium was removed and assayed for SEAP activity as shown in Example 2.

결과는 도 15에 나타냈으며, AP1700의 이소프로폭시 C7 치환체가 FRAP 친화력을 적절하게 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, AP1701 및 AP1702의 더 큰 인돌릴 치환체는 SEAP 발현을 거의 완전히 제거하며, 이는 변형시킴으로써 FRAP에 대한 라파로그-FKBP 복합체의 결합을 막기 위한 장애물로서 작용한 것으로 보인다.The results are shown in FIG. 15, wherein the isopropoxy C7 substituent of AP1700 was found to adequately reduce FRAP affinity. However, the larger indolyl substituents of AP1701 and AP1702 almost completely eliminate SEAP expression, which appears to act as an obstacle to prevent binding of the Raphalog-FKBP complex to FRAP by modification.

또한, FRAP를 결합시키는 능력이 감소됨에 따른 활성화시킨 사람의 T 세포 또는 쥐의 비세포의 증식을 감소시키는 능력에 대해 C7 라파로그를 검정하였다. 적절한 검정은 당해 기술분야-예를 들면,3H-티미딘 흡수 억제(Luengo et al., 1995, Chemistry and Biology 2, 471-481)에서 널리 알려져 있다.In addition, C7 rapalogues were assayed for their ability to reduce proliferation of activated human T cells or rat splenocytes as their ability to bind FRAP was reduced. Suitable assays are well known in the art—eg, inhibition of 3 H-thymidine uptake (Luengo et al., 1995, Chemistry and Biology 2, 471-481).

실시예 7: 여러 가지 라파로그에 대해 상보적인 변형 리간드-결합 도메인을 생성하기 위한 변이유발소 및 파지 디스플레이Example 7: Mutagenesis and phage display to generate modified ligand-binding domains complementary to various raphalogs

A. 처리시킨 FKBP 및 FRB 도메인A. FKBP and FRB Domains Treated

본 발명자들은 변성 리간드-결합 도메인을 갖는 하기에 목록화한 융합 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 구성물을 디자인 및 제조하였다. 특별한 언급이 없다면, 표준 방법(Kunkel, T. A., Bebenek, K. and McClary, J. 1991, Meth Enzymol, 204, 234-139)에 따라 올리고뉴클레오티드-첨가 부위-지시된 변이유발소를 이용하여 돌연변이체를 생성하였으며, 디데옥시 시퀀싱으로 입증하였다.We designed and prepared recombinant DNA constructs encoding the fusion proteins listed below having denatured ligand-binding domains. Unless otherwise noted, mutants using oligonucleotide-added site-directed mutagenesis according to standard methods (Kunkel, TA, Bebenek, K. and McClary, J. 1991, Meth Enzymol, 204, 234-139) Was generated and verified by dideoxy sequencing.

본 발명자들은 또한 하기의 FKB 융합 단백질을 코드화시키는 구성을 제조하였다:We also made a construct that encodes the following FKB fusion protein:

또한, 2개의 보존 Phe 잔기 및 보존 Asp와 Asn 잔기 대신에 상이한 아미노산에 대한 코돈을 각각의 FRB 도메인내에서 치환시킴으로써 변성 hFRAP FRB 도메인에 대한 유추로 변성시킨 이스트 및 칸디다 FRB를 제조하였다. 변성 FRB 도메인은, 하기를 포함하는 TOR1 및 TOR2로부터 유래된다:In addition, yeast and Candida FRB modified by analogy to the denatured hFRAP FRB domain were prepared by substituting codons for different amino acids in each FRB domain instead of two conserved Phe residues and conserved Asp and Asn residues. The denatured FRB domain is derived from TOR1 and TOR2, including:

B. 라파로그에 대한 결합을 위해 합리적으로 디자인된 FKBP 돌연변이체의 시험B. Testing of Rationally Designed FKBP Mutants for Binding to Raphalogs

헥사히스티딘 꼬리부 및 모노클론성 항체 12CA5에 대한 항원요소인 H. 인풀루엔자 헤마글루티닌 단백질의 일부가 선행되는 FKBP를 발현시키는 표준 과정을 이용하여, pET20b(Novagen)에 기초를 둔 발현 벡터를 구성하였다. 상기 벡터에 의해 코드화시킨 단백질 서열은 다음과 같다:Expression vector based on pET20b (Novagen), using standard procedures for expressing FKBP followed by a portion of H. influenza hemagglutinin protein, an antigenic element for hexahistidine tail and monoclonal antibody 12CA5 Was constructed. The protein sequence encoded by the vector is as follows:

라파마이신 접촉 잔기에서 돌연변이된 FKBP에 대한 발현 벡터를 생성하기 위해, 올리고뉴클레오티드-첨가 부위-지시된 변이유발을, 문헌(Kunkel, T. A., Bebenek, K. and McClary, J. 1991, Meth Enzymol, 204, 235-139)에 기재된 바와 같이 E. Coli CJ236으로부터 제조한 벡터의 단일-가닥 포움상에서 수행하였다. 돌연변이체를 디데옥시 시퀀싱으로 확인하였다. 돌연변이체 단백질을 문헌(Wiederrecht, G. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760)에 기재된 바와 같이 E. coli BL21(DE3)(Novagen)으로 발현시키고, 문헌(Cardenas, M. E. et al., 1994, EMBO J. 13, 5944-5957)에서와 같이 균질화로 정제하였다.To generate expression vectors for mutated FKBPs at rapamycin contact residues, oligonucleotide-added site-directed mutagenesis is described in Kunkel, TA, Bebenek, K. and McClary, J. 1991, Meth Enzymol, 204. , 235-139), on single-stranded foams of vectors prepared from E. Coli CJ236. Mutants were identified by dideoxy sequencing. Mutant proteins are expressed in E. coli BL21 (DE3) (Novagen) as described in Weiderrecht, G. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760, and in Cardenas, Purified by homogenization as in ME et al., 1994, EMBO J. 13, 5944-5957).

상기 프로토콜을 사용하여, 하기 돌연변이체 사람 FKBP12 단백질을 생성하였다:Using this protocol, the following mutant human FKBP12 protein was generated:

C24 라파로그에 대한 결합을 위해 디자이된 돌연변이체:Designed Mutants for Binding to C24 Rapalog:

C13/C14 라파로그에 대한 결합을 위해 디자인된 돌연변이체:Mutants designed for binding to C13 / C14 rapalogs:

C28/C30 라파로그에 대한 결합을 위해 디자인된 돌연변이체:Mutants designed for binding to C28 / C30 rapalogs:

FKBP 돌연변이체에 대한 라파마이신 및 라파로그의 상대적 결합 친화력을 검정하기 위해, 돌연변이체에 의한 FK506(및 프로브) 결합 친화력의 유지력에 의존하는 경쟁적 형광 극성(FP) 검정을 이용하였다. 그 과정은, 서브-포화를 얻기 위해서 경쟁 반응중의 사용을 위해 돌연변이체 FKBP의 희석도(농도)를 결정하는 직접 결합 검정을 먼저 수행한 것을 제외하고, 실시예 6에서와 같다. 돌연변이체 FKBP의 일련의 희석물은 다이나테크 미크로-플루오르 플레이트에 100㎕ 부피 FP 완충액(실시예 6)을 넣은후, 각각의 웰에 [FP 완충액 +2% 에탄올]중의 10nM AP1491(프로브) 100㎕를 첨가함으로써 제조된다. 평형 및 플레이트 판독은 실시예 6에서와 같다. FKBP 돌연변이체의 농도에 대한 mP 유닛의 플롯은 하기 식에 들어 맞고:To assay the relative binding affinity of rapamycin and rapalog to the FKBP mutant, a competitive fluorescence polarity (FP) assay was used that depends on the retention of FK506 (and probe) binding affinity by the mutant. The procedure is the same as in Example 6, except that a direct binding assay was first performed to determine the dilution (concentration) of the mutant FKBP for use in competition reactions to obtain sub-saturation. Serial dilutions of mutant FKBP were placed in 100 μl volume FP buffer (Example 6) in Dynatech micro-fluorine plates, and then 100 μl of 10 nM AP1491 (probe) in [FP buffer + 2% ethanol] in each well. It is prepared by adding. Equilibrium and plate readings are as in Example 6. Plots of mP units against concentrations of FKBP mutants fit the formula:

y=M3+(((x+M1+M2)-SQRT(((x+M1+M2)＾)-(4*x*M1)))/(2*(M1)))*(M4-M3)y = M3 + (((x + M1 + M2) -SQRT (((x + M1 + M2)))-(4 * x * M1)) / (2 * (M1)) * (M4-M3)

90%의 프로브가 특이적으로 결합된 곳에서의 최종 돌연변이체 농도/희석물은 내삽으로 결정된다. 상기 최종 농도는, 프로토콜중의 11.25nM FKBP 대신 2 x 돌연변이체의 최종 농도로, 실시예 6에서 수행된 경쟁 FP 검정을 위해 이용된다. 90% 포화대신에, 경쟁 검정에 더 민감한 75%가 선택될 수 있다. 라파마이신 유사체의 일련의 희석물은 경쟁자로서 이용하였고, 그 결과는 각각의 돌연변이체에 대한 각각의 라파로그 결합을 위한 IC50으로서 표현하였다.The final mutant concentration / dilution at which 90% of the probes are specifically bound is determined by interpolation. This final concentration is used for the competition FP assay performed in Example 6, with a final concentration of 2 × mutants instead of 11.25 nM FKBP in the protocol. Instead of 90% saturation, 75% may be chosen which is more sensitive to competition assays. A series of dilutions of rapamycin analogs were used as competitors and the results were expressed as IC 50 for each rapalogue binding to each mutant.

C. FKBP-라파로그 복합체에 대한 결합을 위해 합리적으로 디자인된 FRB 돌연변이체 시험C. FRB Mutant Test Rationally Designed for Binding to FKBP-Raphalog Complex

사람 FRAP의 잔기 2021-2113을 코드화시키는 NcoI-BamHI 단편을 프라이머 28 및 29(아래)를 이용하여 PCR에 의해 생성하고, NdeI 부위가 NcoI로 돌연변이된 pET20b(+)(Novagen)의 유도체내로 클로닝시켜서, pET-FRAP(2021-2113)을 산출하였다. 상기 벡터의 단일-가닥 DNA를 부위-지시된 돌연변이 과정에서 형판으로 이용하여, 라파마이신 접촉 잔기에서 돌연변이된 FRAP를 코드화시키는 벡터를 생성하였다. 디데옥시 시퀀싱으로 돌연변이체를 확인하였다. 그리고나서, 돌연변이체를 XabI 및 SpeI 부위를 붙치는 프라이머(30 및 31)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고, XbaI-SpeI 소화된 pCGNN-FRB-p65(361-550)(실시예 1)내로 클로닝시켜서, 형태 E-N-돌연변이체(여기서, E는 HA 항원요소 꼬리부를 나타내고, N은 핵 정위 서열을 나타낸다) FRAP(2021-2113)-p65(361-550)의 가공 단백질의 포유동물 발현을 지시하는 일련의 구성물을 생성하였다. 구성은 제한 분석 및 디데옥시 시퀀싱으로 입증하였다.NcoI-BamHI fragments encoding residues 2021-2113 of human FRAP were generated by PCR using primers 28 and 29 (below) and cloned into derivatives of pET20b (+) (Novagen) where the NdeI site was mutated to NcoI. , pET-FRAP (2021-2113) was calculated. The single-stranded DNA of the vector was used as a template in the site-directed mutation process to generate a vector encoding the mutated FRAP at the rapamycin contact residue. Dideoxy sequencing identified the mutants. The mutants were then amplified by PCR using primers 30 and 31 attaching XabI and SpeI sites and cloned into XbaI-SpeI digested pCGNN-FRB-p65 (361-550) (Example 1) To direct mammalian expression of the processed protein of FRAP (2021-2113) -p65 (361-550), wherein E represents the HA antigenic element tail and N represents the nuclear locus sequence. A series of constructs was generated. The composition was verified by restriction analysis and dideoxy sequencing.

상기 과정을 이용하여, 제시한 올리고뉴클레오티드 프라이머(대문자는 돌연변이 베이스; 5'-3')로 C7 라파로그에 대해 결합하는 돌연변이체 FRAP를 코드화시키는 하기 구성을 생성하였다, 각각은 p65(361-550) 활성 도메인으로 융합시켰다:Using this procedure, the following construct was generated which encodes a mutant FRAP that binds to C7 rapalog with the oligonucleotide primers shown (uppercase mutant base; 5'-3 '), each of p65 (361-550). ) Fused to the active domain:

라파마이신 및 여러 가지 라파로그를 이용하여 FKBP의 복합체에 대한 상기 돌연변이체의 상대적 결합 친화력을 검정하기 위해, 실시예 2에서와 같이 각각의 구성을 사람 HT1080B14 세포내로 일시적으로 상호-감염시켰다. 감염에 이어, 라파마이신 또는 라파로그의 일련의 희석물을 배양 배지에 첨가하였다. 24시간후, SEAP 활성을 실시예 2에서와 같이 측정하였다; 다양한 라파로그 농도에서의 SEAP 활성 효능은 FKBP와 라파로그사이의 복합체에 대한 FRAP 돌연변이체의 친화력에 비례한다.In order to assay the relative binding affinity of the mutant to the complex of FKBP using rapamycin and various raplogs, each construct was temporarily inter-infected with human HT1080B14 cells. Following infection, serial dilutions of rapamycin or rapalogue were added to the culture medium. After 24 hours, SEAP activity was measured as in Example 2; The efficacy of SEAP activity at various raphalog concentrations is proportional to the affinity of the FRAP mutant for the complex between FKBP and raphalog.

PCR 프라이머(대문자는 제한 부위; 5'-3'):PCR primers (uppercase restriction sites; 5'-3 '):

D. 섬유 박테리오파지상의 FRAP의 FRB 도메인의 기능적 디스플레이: 변성 도메인의 합리적 디자인을 위한 대안으로서 선택하기 위한 접근D. Functional Display of FRB Domains of FRAP on Fibrous Bacteriophage: An Approach to Select as an Alternative to Rational Design of Denatured Domains

(a) 벡터 구성(a) vector composition

fd geneIII의 Cys202가 Tyr로 대체된 프라이머 1을 이용한 부위-지시된 돌연변이에 의해 pCANTAB-5E의 유도체인 카르베니실린-내성 파자미드 디스플레이 벡터(Pharmacia)을 구성하였다. Cys는 혼합된 디술피드의 형성으로 인해 Asp198에서 융합된 단백질의 디스플레이를 붕괴시킬 수 있고, 문제점은 Tyr 치환체에 의해 완화된다(Cumningham. B. C. et al., 1994, EMBO J. 13, 2508). 그 구성을 DNA 시퀀싱으로 입증한 후, NcoI 및 BamHI로 소화시켰다. 한쌍의 올리고뉴클레오티드(2 및 3)을 결찰시켜서, geneIII 시그날 서열중의 NcoI 부위와 geneIII중의 코돈 198에서의 BamHI 부위사이에 NcoI-SpeI-BamHI 폴리링커를 함유하는 플래즈미드 pCANTAB-AP-poly를 산축하였다. 상기 벡터를 프레임 NcoI-BamHI 단편중에 수용시켜서 pIII 잔기 198-406상의 코드화 단백질인 N-말단 디스플레이를 지시하는 구성을 제공한다, 융합 배향은 Cunningham et al.(1994, EMBO J. 13, 2508)에 기재되어 있다.Carbenicillin-resistant pazamide display vector (Pharmacia), a derivative of pCANTAB-5E, was constructed by site-directed mutation with primer 1 in which Cys202 of fd geneIII was replaced with Tyr. Cys can disrupt the display of fused proteins in Asp198 due to the formation of mixed disulfides and the problem is alleviated by Tyr substituents (Cumningham. B. C. et al., 1994, EMBO J. 13, 2508). The construct was verified by DNA sequencing and then digested with NcoI and BamHI. The pair of oligonucleotides (2 and 3) were ligated to contain the plasmid pCANTAB-AP-poly containing the NcoI-SpeI-BamHI polylinker between the NcoI site in the geneIII signal sequence and the BamHI site at codon 198 in geneIII. Livestock. The vector is housed in a frame NcoI-BamHI fragment to provide a construct that directs the N-terminal display, which is the coding protein on pIII residues 198-406, fusion orientation is described in Cunningham et al. (1994, EMBO J. 13, 2508). It is described.

잔기 2015-2114를 코드화시키는 FRAP의 단편을 Pfu 중합제(Stratagene) 및 프라이머 4와 5를 이용하여 PCR에 의해 pCGNN-FRAPi로부터 증폭시켰다. 단편을 정제하여, NcoI 및 BamHI로 소화시키고 NcoI-BamHI 소화된 pCANTAB-AP-poly 내로 결찰시켜서, 벡터 pCANTAB-FRAP(2015-2114)를 산출하였다. 그 구성을 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.Fragments of FRAP encoding residues 2015-2114 were amplified from pCGNN-FRAP i by PCR using Pfu polymerase (Stratagene) and primers 4 and 5. The fragment was purified, digested with NcoI and BamHI and ligated into NcoI-BamHI digested pCANTAB-AP-poly to yield the vector pCANTAB-FRAP (2015-2114). The configuration was verified by DNA sequencing.

(b) His6-flag-FKBP의 제조(b) Preparation of His6-flag-FKBP

FRAP를 디스플레이닝하는 파지미드의 친화력 풍부화를 위한 추적용 FKBP 단백질으 제공하기 위해, 헥사히스티딘 꼬리부(친화 정제를 위함) 및 플레그 서열(Kodak IBI)(면역학적 검출을 위함)에 의해 처리되는 FKBP를 발현시키는 표준 과정을 이용하여 pET20b(Novagene)상에 기저된 발현 벡터를 구성하였다. 단백질을 문헌(Wiederrecht, G. et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760)에 따라 E. coli BL21(Novagen)으로 발현시키고, 문헌(Cardenas, M. E. et al. 1994, EMBO J. 13, 5944-5957)에 기재된 바와 같이 Ni-NTA 아가로스(Qiagen)를 사용하여 동질하게 정제하였다.FKBP processed by hexahistidine tail (for affinity purification) and flag sequence (Kodak IBI) (for immunological detection) to provide a tracing FKBP protein for affinity enrichment of phagemids displaying FRAP An expression vector based on pET20b (Novagene) was constructed using a standard procedure to express. Proteins are expressed in E. coli BL21 (Novagen) according to Weiderrecht, G. et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 21753-21760, and Cardenas, ME et al. 1994, EMBO J 13, 5944-5957), and purified homogeneously using Ni-NTA agarose (Qiagen).

발현 단백질의 서열은 다음과 같다:The sequence of the expressed protein is as follows:

(c) 결합 풍부화(c) binding enrichment

p-CANTAB-AP-FRAP(2015-2114)를, 파지미드 성장을 위한 오버나잇 경작을 2% 글루코스를 함유하는 배지중에서 성장시키고, 파지를 37℃에서 초기 1시간 인큐베이션시킨후에 25℃에서 성장시킴으로써 K07을 감염시킨 것을 제외하고는 문헌(Lowman, H. B, and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216)에 기재된 내용을 기초로 헬퍼 파지 K07에 의해 제조한 디스플레이 파지 및 E. coli XL-1(Stratagene)로 변환시켰다. 기준 시약을 제공하기 위해, 파지미드 입자를 클로람페니콜-내성 벡터 pBC(Stratagene)로 변환시킨 세포로부터 제조하였다. 각 경우에 있어 파지미드 적정 농도(콜로니-형성 유닛, cfu)를 문헌(Lowman, H. B. and Wells, J. A. Metheds: Comp. Methods Enzymol. 1991, 3, 205-216)에 따라 결정하였다.p-CANTAB-AP-FRAP (2015-2114) was grown by growing overnight cultivation for phagemid growth in a medium containing 2% glucose and incubating the phage at 37 ° C. initially for 1 hour and then at 25 ° C. Display phage prepared by helper phage K07 based on the content described in Lowman, H. B, and Wells, JA Methods: Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216, except that K07 was infected. And E. coli XL-1 (Stratagene). To provide a reference reagent, phagemid particles were prepared from cells converted to chloramphenicol-resistant vector pBC (Stratagene). In each case the phagemid titration concentration (colony-forming unit, cfu) was determined according to Lowman, H. B. and Wells, J. A. Metheds: Comp. Methods Enzymol. 1991, 3, 205-216.

FKBP 라파마이신상의 FRAP 디스플레이 파지의 특정 결합 풍부화를 나타내기 위해, 약 108cfu 를 PBS/3% BSA/0.05% tween-20('PBSBT') 250㎕중의 약 1010cfu의 pBC 파지와 혼합하였다. 1μM(최종) His6-flag-FKBP 단백질을 첨가한후, 100% 에탄올중의 2.5㎕의 10μM 라파마이신 또는 FK506 또는 에탄올만을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간동안 인큐베이션시킨후, PBSBT중에서 평형화시킨 100㎕의 1:1 슬러리의 Ni-NTA 아가로스 비이드를 첨가하였다(His6-tagged FKBP 및 모든 관련 파지미드를 포획하기 위함). 혼합물을 엔드-오버-엔드 혼합기상에서 15분동안 약하게 분쇄시킨 후, 미크로퓨지중에서 30분간 8000rpm으로 스피닝시켜서 비이드를 펠렛으로 만들었다. 비이드를 1㎖ PBS/0.05% tween-20으로 5회 세정하고, 1㎖ PBS/0.05% tween-20/1M NaCl로 5회 세정하였다. pH2.0의 0.2M 글리신 200㎕를 첨가하고 10분간 인큐베이션시켜 경계면의 파지미드를 비이드로부터 용출시켰다. 비이드를 펠렛화하고, (용출된 파지미드를 함유하는)상층액을 수집하여 26㎕ 1M 트리스 염기로 중화시켰다. 카르베니실린(carb) 및 클로르암페니콜(chlor)-내성 cfu 적정 농도를 상기에서와 같이 결정하고, carb/chlor 비를 (카르베니실린-내성)FRAP 파지미드의 특이적 풍부화의 측정치로서 이용하였다.To demonstrate specific binding enrichment of FRAP display phage on FKBP rapamycin, about 10 8 cfu was mixed with about 10 10 cfu of pBC phage in 250 μl of PBS / 3% BSA / 0.05% tween-20 ('PBSBT') It was. After addition of 1 μM (final) His6-flag-FKBP protein, only 2.5 μl of 10 μM rapamycin or FK506 or ethanol in 100% ethanol was added. After the mixture was incubated for 1 hour at room temperature, 100 μl of 1: 1 slurry of Ni-NTA agarose beads equilibrated in PBSBT was added (to capture His6-tagged FKBP and all related phagemids). The mixture was lightly ground for 15 minutes on an end-over-end mixer and then spun into pellets by spinning at 8000 rpm for 30 minutes in microfuge. The beads were washed five times with 1 ml PBS / 0.05% tween-20 and five times with 1 ml PBS / 0.05% tween-20 / 1M NaCl. 200 μl of 0.2 M glycine pH2.0 was added and incubated for 10 minutes to elute the interface phagemid from the beads. The beads were pelleted and the supernatant (containing eluted phagemid) was collected and neutralized with 26 μl 1M Tris base. Carbenicillin (carb) and chlor-amphenicol (chlor) -resistant cfu titration concentrations were determined as above and the carb / chlor ratio was used as a measure of the specific enrichment of (carbenicillin-resistant) FRAP phagemids. It was.

그 결과, 라파마이신-FKBP 매트릭스상의 친화력 풍부화후의 출발 혼합물에 비해 FRAP 파지가 271배로 상당히 풍부하게 나타났지만, FK506-FKBP 매트릭스에 비해서는 2.4배이거나 FKBP 단독에 대해서는 1.5배 정도였다. 이 실험은 분자의 FRAP 결합 사이드(예를 들면, C7위치)상에 장애물을 갖는 라파마이신 유사체를 결합시키는 라이브러리 돌연변이체 FRAP로부터 정제시키는 과정을 나타낸다.As a result, FRAP phage was significantly richer at 271 times compared to the starting mixture after the affinity enrichment on the rapamycin-FKBP matrix, but was 2.4 times higher than the FK506-FKBP matrix or 1.5 times higher than the FKBP alone. This experiment represents a process for purification from the library mutant FRAP that binds rapamycin analogs with obstructions on the FRAP binding side (eg C7 position) of the molecule.

(d) 프라이머(d) primer

제한 부위는 밑줄을 그었다(NcoI=CCATGG; BamHI=GGATCC).Restriction sites are underlined (NcoI = CCATGG; BamHI = GGATCC).

(e) pCANTAB-AP-FRAP(2015-2114)의 서열(e) the sequence of pCANTAB-AP-FRAP (2015-2114)

E. 섬유 박테리오파지상의 FKBP의 기능적 디스플레이E. Functional Display of FKBP on Fiber Bacteriophage

(a) 벡터 구성(a) vector composition

FKBP(아미노산 1-107)의 코딩 서열을, 템플레이트로서 5ng의 플래즈미드 pCGNN-F1(미합중국 특허 출원류 No. 08/581, 713(1995년 12월 29일자 출원))를 사용하여 프라이머 1과 2를 이용한 PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물을 정제하고, NcoI 및 BamHI로 소화시키고 NcoI-BamHI 소화된 pCANTAB-AP-poly 내로 결찰시켜서, 벡터 pCANTAB-FRAP를 산출하였다. 그 구성을 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 입증하였다. 이 구성은, Cys202가 Tyr에 대해 돌연변이된 pIII 잔기 198-406상의 FKBP의 N-말단 디스플레이를 지시한다: 배향은 Cunningham et al.(1994, EMBO J. 13, 2508)에 의해 기재되어 있다.The coding sequence of FKBP (amino acids 1-107) was prepared using primers 1 using 5 ng of plasmid pCGNN-F1 (US Patent Application No. 08/581, 713, filed Dec. 29, 1995) as a template. Amplification by PCR using 2. The PCR product was purified, digested with NcoI and BamHI and ligated into NcoI-BamHI digested pCANTAB-AP-poly to yield a vector pCANTAB-FRAP. The configuration was verified by restriction analysis and DNA sequencing. This configuration directs the N-terminal display of FKBP on pIII residues 198-406 where Cys202 was mutated to Tyr: The orientation is described by Cunningham et al. (1994, EMBO J. 13, 2508).

(b) 친화력 풍부화 연구를 위해 비오틴화시킨 FK506의 합성(b) Synthesis of biotinylated FK506 for affinity enrichment studies

파지상의 FKBP의 기능적 디스플레이를 나타내기 위한 고정상 리간드를 제공하기 위해, 주효체 도메인의 알릴기에 대한 링커를 통해 부착된 비오틴부를 갖는 여러 가지 FK506을 합성하였다(하기의 스켐참조). 2㎖의 CH2Cl2중의 N-(6-아미노헥실)FK506(35㎎, 36.8mmol) 용액에 비오틴-Su(25.1㎎, 73.5mmol)을 첨가한 후, NEt3(51.4㎖, 368mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물이 맑아질때까지 현탁액에 DMF를 첨가하였다. 10분후에 반응을 완결시켰다. 혼합물을 CH2Cl2(25㎖)로 희석시키고, 물(15㎖), 식염수(15㎖)로 세정한후, Na2SO4로 건조시켰다. 용출액으로서 10% MeOH/CH2Cl2를 이용하여 플래쉬 크로마토그래피하여, 백색 고체상의 원하는 생성물 13㎎(30%)을 얻었다. 그 구조를 NMR 및 MS로 확인하였다.To provide a stationary phase ligand for showing the functional display of FKBP on phage, several FK506s were synthesized with biotin moieties attached through a linker to the allyl group of the main effector domain (see below). Biotin-Su (25.1 mg, 73.5 mmol) was added to a solution of N- (6-aminohexyl) FK506 (35 mg, 36.8 mmol) in 2 mL CH 2 Cl 2 , followed by the addition of NEt 3 (51.4 mL, 368 mmol). Added. DMF was added to the suspension until the reaction mixture became clear. After 10 minutes the reaction was complete. The mixture was diluted with CH 2 Cl 2 (25 mL), washed with water (15 mL), brine (15 mL) and dried over Na 2 SO 4 . Flash chromatography using 10% MeOH / CH 2 Cl 2 as the eluent gave 13 mg (30%) of the desired product as a white solid. The structure was confirmed by NMR and MS.

(c) FKBP 디스플레이 파지의 성장(c) Growth of FKBP Display Phage

p-CANTAB-AP-FRAP(2015-2114)를, 파지미드 성장을 위한 오버나잇 경작을 2% 글루코스를 함유하는 배지중에서 성장시킨 것을 제외하고는 문헌(Lowman, H. B, and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216)에 기재된 내용을 기초로 헬퍼 파지 K07에 의해 제조한 디스플레이 파지 및 E. coli XL-1(Stratagene)로 변환시켰다. 파지미드 적정 농도(콜로니-형성 유닛, cfu)를 문헌(Lowman, H. B. and Wells, J. A. Metheds: Comp. Methods Enzymol. 1991, 3, 205-216)에 따라 결정하였다.p-CANTAB-AP-FRAP (2015-2114) was grown in Lowman, H. B, and Wells, JA Methods, except that overnight cultivation for phagemid growth was grown in a medium containing 2% glucose. : Display phage prepared by helper phage K07 and E. coli XL-1 (Stratagene) based on the content described in Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216). Phagemid titration concentrations (colony-forming units, cfu) were determined according to Lowman, H. B. and Wells, J. A. Metheds: Comp. Methods Enzymol. 1991, 3, 205-216.

(d) 비오틴화시킨 FK506을 이용한 경쟁적 ELISA에 의한 기능적 FKBP 디스플레이의 증명(d) Demonstration of functional FKBP display by competitive ELISA with biotinylated FK506

96-웰 맥시소르프 플레이트(Nunc)의 웰을 웰당 PBS중의 100㎕의 1㎍/㎖의 스트레프파비딘(Pierce)으로 코팅하여 덮은후, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 실온에서 1% tween-20/PBS로 차폐시킨후에, 차폐용액을 제거하고, PBS/1% 에탄올중의 10nM 비오틴화시킨 FK506을 첨가하고, 추가로 10분간 인큐베이션시켰다. 동시에, 별도의 튜브에 FKBP 파지(약 5x105cfu) 및 PBS/0.02% BSA/1% 에탄올중의 FK506의 일련의 희석물을 함유하는 100㎕의 인큐베이션액을 준비하였다. 상기 인큐베이션액을 상온에서 1시간 방치하여 평형화시킨후, 웰을 코팅하고, PBS/0.05% tween-20으로 5회 세정한고, 웰에 대해 파지-FK506 혼합물을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션시킨후, PBS/0.05% tween-20으로 15회 세정하였다. 결합된 파지를 검출하기 위해, 안티-M13 항체-HRP 콘쥬게이트(Pharmacia)의 1/5000 희석물 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션시킨후, 플레이트를 앞에서와 같이 10회 세정한후, TMB 기질(Boehringer)을 이용하여 제조자의 지시에 따라서 HRP 활성 정량화하였다. 비오틴화시킨 FK506를 전혀 코팅시키지 않거나(0% 결합0 FK506 경쟁자를 전혀 갖지 않는(100% 결합) 대조군을 기준으로 총 파지 결합%로서 수치를 계산하였다.Wells of 96-well maxithorp plates (Nunc) were covered with 100 μl of 1 μg / ml strepvidavidine (Pierce) in PBS per well and then incubated at 4 ° C. overnight. After shielding with 1% tween-20 / PBS at room temperature, the shielding solution was removed and 10 nM biotinylated FK506 in PBS / 1% ethanol was added and incubated for a further 10 minutes. At the same time, 100 μl of incubation liquid containing FKBP phage (approximately 5 × 10 5 cfu) and serial dilutions of FK506 in PBS / 0.02% BSA / 1% ethanol were prepared. The incubation solution was left to stand at room temperature for 1 hour to equilibrate, then the wells were coated, washed 5 times with PBS / 0.05% tween-20 and the phage-FK506 mixture was added to the wells. Plates were incubated at room temperature for 1 hour and then washed 15 times with PBS / 0.05% tween-20. To detect bound phage, 100 μl of a 1/5000 dilution of anti-M13 antibody-HRP conjugate (Pharmacia) was added to each well, incubated for 1 hour at room temperature, and the plates washed 10 times as before. Afterwards, HRP activity was quantified according to the manufacturer's instructions using a TMB substrate (Boehringer). Values were calculated as% total phage binding, based on controls that either did not coat biotinylated FK506 (0% binding 0 FK506 competitors at all (100% binding)).

도면에 도시된 바와 같이, 본 실험은 FK506에 대해 나타나는 FKBP의 특이적인 높은-친화성 결합을 나타낸다. 검정에 있어서의 상호작용을 위한 IC50은 0.65nM였으며, 0.4-1nM의 FK506에 대한 FKBP의 알려진 Kd에 정확히 일치하였다.As shown in the figure, this experiment shows the specific high-affinity binding of FKBP to FK506. The IC 50 for interaction in the assay was 0.65 nM and was exactly in line with the known Kd of FKBP for FK506 of 0.4-1 nM.

(e) 라파마이신의 C13 및 C14 위치에 표적시킨 파지상의 돌연변이체 FKBP의 생성(e) Production of phage mutant FKBPs targeted to the C13 and C14 positions of rapamycin

C13 또는 C14위치에서 장애된 라파마이신 유사체를 결합시키는 이형체를 얻기 위한 돌연변이체 FKBP를 생성하기 위해, 변질 프라이머 3과 4를 사용하여 FKBP 유전자의 일부를 증폭시키고 Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42 및 Phe99에 대한 코돈의 위치에 변질 코돈 NNS(여기서, N은 모든 염기이고 S는 G 또는 C이다)를 도입시켰다. 상기 잔기의 측사슬을 컴퓨터 그패픽을 이용하여 C14 카르보닐 및/또는 C13 히드록시기와 접촉하는지, 또는 접촉시에 잔기와 접하는지를 관찰하였다. 무질서한 영역에 접해있는 종랭의 ApaLI 및 BamHI 부위를 이용하였다.To generate mutant FKBP to obtain a variant that binds a rapamycin analogue impaired at the C13 or C14 position, altered primers 3 and 4 are used to amplify a portion of the FKBP gene and to Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42 and Phe99 A modified codon NNS was introduced at the codon's position for where N is all bases and S is G or C. The side chains of the residues were contacted using computer graphics to contact C14 carbonyl and / or C13 hydroxyl groups, or contact upon residue. Longitudinal ApaLI and BamHI sites adjacent to the disordered region were used.

FKBP의 일부를 프라이머 3과 4 및 Pfu 중합효소를 사용하여 pCGNN-F1으로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 QIAEX II kit(Qiagen)을 사용하여 정제하고, ApaLI 및 BamHI로 소화시키고, ApaLI-BamHI 소화된 pCANTAB-AP-FKBP내로 결찰시켰다. 결찰 생성물을 페놀 추출로 정제하고, 에탄올 침전에 의해 농축시킨후, 표준 기술(Dower, W. J. et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16, 6127)로 E. coli XL-1 세포내로 일렉트로포레이션시켰다. 파지를 취해서 상기와 같이 역가하였다(Lowman, H. B. and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216).Portions of FKBP were amplified from pCGNN-F1 using primers 3 and 4 and Pfu polymerase. PCR products were purified using the QIAEX II kit (Qiagen), digested with ApaLI and BamHI and ligated into ApaLI-BamHI digested pCANTAB-AP-FKBP. The ligation product was purified by phenol extraction, concentrated by ethanol precipitation and electroporated into E. coli XL-1 cells by standard techniques (Dower, WJ et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16, 6127). . Phage were taken and titered as described above (Lowman, H. B. and Wells, J. A. Methods: Comp. Methods Enzymol, 1991, 3, 205-216).

(f) 라이브러리 분류(f) library classification

약 1010-1011cfu 파지미드 입자를 250㎕의 PBS/3% BSA/0.05% tween-20(PBSBT)중에서 제조하였다. 재조합 GST-FRAP 융합 단백질(E. coli중에서 발현시키고 문헌(Chen et al,m 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4947-4951)에 기재된 바와 같이 정제함)을 첨가하여 최종 농도를 1μM로 한후, 2.5㎕의 10μM 범핑시킨 라파마이신 100% 에탄올 원액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 인큐베이션시킨후, PBSBT중에서 평형화시킨 1:1 슬러리의 글루타티온-아가로스 비이드(Pharmacia) 100㎕를 첨가하였다(GST-tagged FKBP 및 모든 관련 파지미드를 포획하기 위함). 혼합물을 엔드-오버-엔드 혼합기상에서 15분동안 약하게 분쇄시킨 후, 미크로퓨지중에서 30분간 8000rpm으로 스피닝시켜서 비이드를 펠렛으로 만들었다. 비이드를 1㎖ PBS/0.05% tween-20으로 5회 세정하고, 1㎖ PBS/0.05% tween-20/1M NaCl로 5회 세정하였다. pH2.0의 0.2M 글리신 200㎕를 첨가하고 10분간 인큐베이션시켜 경계면의 파지미드를 비이드로부터 용출시켰다. 비이드를 펠렛화하고, (용출된 파지미드를 함유하는)상층액을 수집하여 26㎕ 1M 트리스 염기로 중화시켰다. 카르베니실린(carb) 및 클로르암페니콜(chlor)-내성 cfu 적정 농도를 상기에서와 같이 결정하고, carb/chlor 비를 (카르베니실린-내성)FRAP 파지미드의 특이적 풍부화의 측정치로서 이용하였다.About 10 10 -10 11 cfu phagemid particles were prepared in 250 μl of PBS / 3% BSA / 0.05% tween-20 (PBSBT). Final concentration by addition of recombinant GST-FRAP fusion protein (expressed in E. coli and purified as described in Chen et al, m 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4947-4951) After 1 μM, 2.5 μl of 10 μM bumped rapamycin 100% ethanol stock solution was added. After the mixture was incubated for 1 hour at room temperature, 100 μl of a 1: 1 slurry of glutathione-agarose beads (Pharmacia) equilibrated in PBSBT was added (to capture GST-tagged FKBP and all related phagemids). The mixture was lightly ground for 15 minutes on an end-over-end mixer and then spun into pellets by spinning at 8000 rpm for 30 minutes in a microfuge. The beads were washed five times with 1 ml PBS / 0.05% tween-20 and five times with 1 ml PBS / 0.05% tween-20 / 1M NaCl. 200 μl of 0.2 M glycine pH2.0 was added and incubated for 10 minutes to elute the interface phagemid from the beads. The beads were pelleted and the supernatant (containing eluted phagemid) was collected and neutralized with 26 μl 1M Tris base. Carbenicillin (carb) and chlor-amphenicol (chlor) -resistant cfu titration concentrations were determined as above and the carb / chlor ratio was used as a measure of the specific enrichment of (carbenicillin-resistant) FRAP phagemids. It was.

배경 전체에서 특이적 풍부화가 검출될 때, 개별적 FKBP 파지 클론을 단리시키고, 표준기술로 시퀀싱하였다. 경쟁적 ELISA 또는 형광 극성 검정으로 범핑시킨 라파마이신에 대한 클론의 결합을 측정하였다.When specific enrichment was detected throughout the background, individual FKBP phage clones were isolated and sequenced by standard techniques. The binding of clones to rapamycin bumped by competitive ELISA or fluorescence polarity assay was measured.

(g) 프라이머 서열(g) primer sequences

제한 부위는 밑줄 그었다(NcoI=CCATGG; BamHI=GGATCC; ApaLI=GTGCAC).Restriction sites are underlined (NcoI = CCATGG; BamHI = GGATCC; ApaLI = GTGCAC).

(h) pCANTAB-AP-FKB의 서열(h) the sequence of pCANTAB-AP-FKB

실시예 8: 시그날 변환의 라파마이신-의존성 활성Example 8: Rapamycin-dependent Activity of Signal Transformation

생물학적 리간드 또는 항-보고자 항체를 응집시킴으로써, 많은 세포형 보고자를 활성화시킬 수 있다. 추가로, 2가지 상이한 단백질의 응집은 종종 세포내 시그날을 유발시키는 작용을 할 수 있다. 라파마이신 및 그 유사체는, 하나는 하나이상의 FKBP 및 주효체 도메인을 함유하고 다른 하나는 하나이상의 FRAP 도메인 및 주효체 도메인을 함유하는 개체변이성 단백질을 올리고머화시킴으로써 보고자 주효체 도메인의 활성 작용을 유발시키는데 이용될 수 있다. 이 스켐은 도 T1(a)에 예시되어 있다. 2가지 단백질이 막에 걸려있는 것으로 보이지만, 하나는 막에 걸려있고, 추가의 라파마이신 또는 유사체는 제 2 단백질이 이량화를 통해 막으로 보급되도록 되어 있다. 막 걸림은 막 저편의 단백질 앵커 또는 단백질의 지질 변성, 예를 들면 미리스토일레이션을 통해 영향을 받을 수 있다. 상기 주효체 도메인은 2가지 단백질상에 존재되거나, 상이한 단백질 도메인상에 존재될 수 있다. 이들은 단백질 키나제 및 단백질 키나제 기질과 같이 기능적으로 이용될 수 있다. 대안으로서, 제 1 주효체의 활성을 억제하기 위해 제 2 주효체가 제공될 수 있다.By aggregating a biological ligand or anti-reporter antibody, many cell type reporters can be activated. In addition, aggregation of two different proteins can often act to induce intracellular signals. Rapamycin and its analogs induce the active action of a reporter main body domain by oligomerizing an individual mutagenic protein, one containing at least one FKBP and a main effector domain and the other containing at least one FRAP domain and a main effector domain. Can be used. This schema is illustrated in Figure T1 (a). Although two proteins appear to be hung on the membrane, one is hung on the membrane and an additional rapamycin or analog is intended to allow the second protein to diffuse into the membrane through dimerization. Membrane jamming can be effected through protein anchors on the other side of the membrane or through lipid denaturation of the protein, such as myristolation. The main effector domain may be on two proteins or on different protein domains. They can be used functionally like protein kinases and protein kinase substrates. As an alternative, a second main active may be provided to inhibit the activity of the first main active.

본 발명자들은, 몇몇 구현에 있어서, 개체변이성 단백질이 키나아제가 혼합되어 있고, 이질의 주효체 도메인과 함께 FKBP 및 FRAP 도메인을 함유함을 주목하였다. 단일 혼합된 개체변이체의 올리고머화 또한 도 T1(b)에 도시한 바와 같이, 시그날 변환을 활성화시키기 위해 이용될 수 있다. 여기서 라파마이신은 단백질의 2가지 동일한 복사체를 2량화하는 것으로 보여진다. FKBP 및 FRAP 도메인의 반복은 게놈체에 대해 더 많은 다중체를 허용한다.The inventors noted that, in some embodiments, the mutant protein contains a mixed kinase and contains FKBP and FRAP domains with heterologous main effector domains. Oligomerization of a single mixed individual variant may also be used to activate signal transduction, as shown in FIG. T1 (b). Rapamycin is shown to dimerize two identical copies of the protein. Repetition of the FKBP and FRAP domains allows for more multiplexes to the genomic body.

시그날 변환에 있어서의 라파마이신의 2가지 사용례는 보고자 티로신 키나제 활성 작용을 부여하는 예와 Fas 활성을 거쳐 아포프토시스 작용을 부여하는 예를 들 수 있다. 특별한 언급이 없는한, 모든 DNA 조작은 문헌(F. M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons. New York, 1994)의 표준 과정에 따라 수행하였고, 모든 단백질 프로토콜은 문헌(Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)에 따라 수행하였다. 모든 PCR 생성물은 구성물을 만드는데 이용하였으며, 그 구성은 시퀀싱으로 확인하였다.Two examples of the use of rapamycin in signal transduction are examples of imparting tyrosine kinase activity to reporters and examples of imparting apoptosis through Fas activity. Unless otherwise noted, all DNA manipulations were performed according to the standard procedures of FM Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons. New York, 1994, and all protein protocols are described in Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies, a Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). All PCR products were used to make up the constructs, the constructs confirmed by sequencing.

A. 라파마이신-유발성 보고자 티로신 키나제 활성.A. Rapamycin-Induced Reporter Tyrosine Kinase Activity.

1. pCM의 구성, 미리스틸레이션 시그날을 함유하는 발현 벡터1. Construction of pCM, Expression Vectors Containing Prestillation Signals

올리고뉴클레오티드 1과 2를 어닐링시켜서 얻은 XbaI-Myr-BamHI 카세트를 XbaI/BamHI로 소화시키고 pCG 발현 벡터(Tanaka, M. and Herr, W, 1990, Cell 60; 375-386)의 XbaI/BamHI 부위내로 클로닝시켜서 pCGM을 산출하였다(참조, 하기의 (7)). 상기 올리고뉴클레오티드 카세트는 인프레임 XbaI 부위로 이루어지고, 이어서 플라스마 멤브레인(Cross et al., 1984, MCB. 4:1834-1842)에 대한 미리스토일레이션 및 표적 단백질을 허용하는 것으로 보여지는 c-Src 티로신 키나제의 제 1의 15 아미노산 잔기를 코드화시키는 서열로 이루어진다. 미리스토일레이션 도메인은 인프레임 SpeI 부위 및 정지 코돈에 후속된다. pCG 벡터에 있어서의 XbaI 부위는 2개의 아미노산이 개시 Met 및 클로닝된 서열사이에 첨가되도록 위치된다. 개시 Met와 미리스틸화된 Gly사이의 공간이 c-Src(Pellman et al,m 1985, PNAS. 82: 1623-1627)의 막 정위를 결정하는데 중요하기 때문에, XbaI 부위에 이은 pCGM 중의 ATG를 제거하였다. 클로닝 단계를 용이하게 하기 위해, 미리스틸레이션 카세트중의 SpeI 부위를 XbaI 부위로 돌연변이시켰다. pCGM의 단일 가닥된 우라실-DNA를 제조하고, 올리고뉴클레오티드 3(XbaI 부위에 이은 ATG를 제거하고 ATG에 대해 EcoRI 부위 5'를 첨가하기 위해) 및 올리고뉴클레오티드 4(SpeI 부위에 이은 미리스틸레이션 도메인을 XbaI 부위로 바꾸기 위해)의 둘다를 이용하여 돌연변이를 수행하였다. pCM 벡터의 ATG를 둘러싸는 형성 서열을 올리고뉴클레오티드 5를 이용한 시퀀싱으로 확인하였다(참조, 서열 1, (8)).The XbaI-Myr-BamHI cassette obtained by annealing oligonucleotides 1 and 2 was digested with XbaI / BamHI and incorporated into the XbaI / BamHI site of the pCG expression vector (Tanaka, M. and Herr, W, 1990, Cell 60; 375-386). Cloning yielded pCGM (cf. (7) below). The oligonucleotide cassette consists of an in-frame XbaI site, followed by c-Src, which seems to allow myristolation and target protein for the plasma membrane (Cross et al., 1984, MCB. 4: 1834-1842). Consisting of a sequence encoding the first 15 amino acid residues of a tyrosine kinase. The myristolation domain follows the in-frame SpeI site and stop codon. The XbaI site in the pCG vector is positioned so that two amino acids are added between the starting Met and the cloned sequence. Because the space between the starting Met and the pre-stilled Gly is important for determining the membrane position of c-Src (Pellman et al, m 1985, PNAS. 82: 1623-1627), the Aba in the XbaI site followed by pCGM is removed. It was. To facilitate the cloning step, the SpeI site in the mystilation cassette was mutated to the XbaI site. Single-stranded uracil-DNA of pCGM was prepared and oligonucleotide 3 (to remove ATG followed by XbaI site and EcoRI site 5 'to ATG) and oligonucleotide 4 (mypelation site followed by SpI site) Mutations were performed using both) to switch to the XbaI site. The forming sequence surrounding the ATG of the pCM vector was confirmed by sequencing with oligonucleotide 5 (see SEQ ID NO: 1, (8)).

2. pCM에 대한 항원요소 택 및 FKBP의 첨가로 인한 pCMF1/2/3.HA의 생성2. Production of pCMF1 / 2 / 3.HA by Tagging Antigens to pCM and Addition of FKBP

상보성 올리고뉴클레오티드(6 및 7)를 어닐링하여 SpeI-HA-BamHI 카세트를 제조하였다. 상기 카세트는 모노클론성 항체 12CA5, 정지 코돈 및 BamHI 부위에 의해 인지되는 H. 인풀루엔자 헤마글루티닌 유전자의 9 아미노산에 후속되는 인프레임 SpeI 부위를 갖는다. SpeI-HA-BamHI 카세트를 pCGNNF1, pCGNNF2 및 pCGNNF3의 SpeI/BamHI 부위내로 서브 클로닝시켰다. 계속해서, HA 항원요소로 융합시킨 FKBP의 1/2/3 복사체를 pCM내에 XbaI/BamH1으로서 서브 클로닝시켰다. 형성된 플래즈미드(pCMF1/2/3.HA)는 다음의 양상을 갖는다: 미리스틸레이션 도메인; 인프레임 XbaI 부위; FKBP의 1/2/3 복사체; 인프레임 SpeI 부위; HA 항원요소 택; 및 정지 코돈.Complementary oligonucleotides (6 and 7) were annealed to make the SpeI-HA-BamHI cassette. The cassette has an in-frame SpeI site following the 9 amino acids of the H. influenza hemagglutinin gene recognized by the monoclonal antibody 12CA5, stop codon and BamHI site. The SpeI-HA-BamHI cassette was subcloned into the SpeI / BamHI site of pCGNNF1, pCGNNF2 and pCGNNF3. Subsequently, 1/2/3 copies of FKBP fused to HA antigen elements were subcloned as XbaI / BamH1 in pCM. The formed plasmid (pCMF1 / 2 / 3.HA) has the following aspects: myristylation domain; Inframe XbaI site; 1/2/3 copy of FKBP; Inframe SpeI site; HA antigen element tag; And stop codons.

3. pCM에 대한 항원요소 택 및 FRB의 첨가로 인한 pCMF1/2/3.Flag의 생성3. Generation of pCMF1 / 2 / 3.Flag by Tagging Antigens to pCM and Addition of FRB

상보성 올리고뉴클레오티드(8 및 9)를 어닐링하여 SpeI-HA-BamHI 카세트를 제조하였다. 상기 카세트는, 인프레임 SpeI 부위가 모노클론성 항체 안티-FLAG.M2(Kodak Scientific Imaging Systems)에 의해 인지되는 8 아미노산(DYKDDDDY)(Hopp et., 1988, Biotech. 6:1205-1210)에 대한 코드인 서열에 후속되는 것을 제외하고는 상기의 SpeI-HA-BamH1에서와 같은 양상을 갖는다. SpeI-Flag-BamHI 카세트를 pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB 및 pCGNN-3FRB의 SpeI/BamHI 부위내로 서브 클로닝시켰다. 계속해서, FRB 도메인-Flag 항원요소 융합물의 FRB의 1/2/3 복사체를 pCM내에 XbaI/BamH1으로서 서브 클로닝시켰다. 형성된 플래즈미드(pCMFR1/2/3.Flag)는 다음의 양상을 갖는다: 미리스틸레이션 도메인; 인프레임 XbaI 부위; FRB의 1/2/3 복사체; 인프레임 SpeI 부위; Flag 항원요소 택; 및 정지 코돈.Complementary oligonucleotides (8 and 9) were annealed to make the SpeI-HA-BamHI cassette. The cassette is designed for the 8 amino acid (DYKDDDDY) (Hopp et., 1988, Biotech. 6: 1205-1210) in which the in-frame SpeI site is recognized by the monoclonal antibody anti-FLAG.M2 (Kodak Scientific Imaging Systems). It has the same aspect as in SpeI-HA-BamH1 except following the sequence which is the code. The SpeI-Flag-BamHI cassette was subcloned into the SpeI / BamHI sites of pCGNN-1FRB, pCGNN-2FRB and pCGNN-3FRB. Subsequently, 1/2/3 copies of the FRB of the FRB domain-Flag antigenic fusion were subcloned as XbaI / BamH1 in pCM. The formed plasmid (pCMFR1 / 2 / 3.Flag) has the following aspects: myristylation domain; Inframe XbaI site; 1/2/3 copy of FRB; Inframe SpeI site; Flag antigen element tag; And stop codons.

4. FKBP 및 FRB 융합의 보고자 티로신 키나제 시토플래스믹 도메인에 대한 구성4. Configuration for Reporter Tyrosine Kinase Cytoplasmic Domains of FKBP and FRB Fusions

보고자 티로신 키나제의 시토플래스믹 도메인 선택(예를 들면, EGFR, erbB-2, PDGFR, KDR/Flk-1, Flt-1)은 인프레임 5'XbaI 및 3'SpeI 부위로 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 SpeI 부위가 pCMFR 시리즈 또는 pCMF 시리즈 벡터중에 보관되도록 프레임 SpeI 부위내로 서브 클로닝시키거나, XbaI 부위가 보관되도록 인프레임 XbaI 부위내로 서브 클로닝시킬 수 있다. 결과로서, FKBP/FRB 도메인(들)은 보고자 티로신 키나제의 시토플래스믹 도메인에 대해 C-말단 또는 NH2-말단을 위치시킬 수 있다. (i) 주어진 보고자의 시토플래스믹 도메인이 FKBP 및 FRB 둘다에 대해 융합되거나(예를 들면, FRB에 대해 융합된 erbB-2 시토플래스믹 도메인 및 FKBP에대해 융합된 EGFR 시토플래스믹 도메인) (ii) 2개의 상이한 보고자의 시토플래스믹 도메인이 FKBP 및 FRB에 대해 융합될 수 있도록(예를 들면, FKBP에 대해 융합된 EGFR 시토플래스믹 도메인 및 FRB에 대해 융합된 erbB-2 시토플래스믹 도메인) 벡터를 구성하였다. 전자(i)에 있어서, 약물, 라파마이신의 첨가가 동종 2량체(예를 들면, EGFR/EGFR)의 형성을 유발시키는 것에 반해, 후자(ii)에 있어서, 약물 첨가는 이종 2량체(예를 들면, EGFR/erbB-2)를 유발시켜서 시그날 변환 캐스캐이드의 활성화를 야기시킨다.Cytoplasmic domain selection (eg EGFR, erbB-2, PDGFR, KDR / Flk-1, Flt-1) of reporter tyrosine kinase was PCR amplified with in-frame 5′XbaI and 3′SpeI sites. PCR products can be subcloned into the frame SpeI site so that the SpeI site is stored in the pCMFR series or pCMF series vector, or subcloned into the in-frame XbaI site so that the XbaI site is stored. As a result, the FKBP / FRB domain (s) can position the C-terminus or NH 2 -terminus to the cytoplasmic domain of the reporter tyrosine kinase. (i) the cytoplasmic domain of a given reporter is fused for both FKBP and FRB (eg, the erbB-2 cytoplasmic domain fused to FRB and the EGFR cytoplasmic domain fused to FKBP) (ii ) Vectors such that the cytoplasmic domains of two different reporters can be fused to FKBP and FRB (eg, the EGFR cytoplasmic domain fused to FKBP and the erbB-2 cytoplasmic domain fused to FRB) Was constructed. In the former (i), the addition of the drug, rapamycin, causes the formation of homodimers (eg EGFR / EGFR), whereas in the latter (ii), the addition of the drug is heterodimer (eg For example, EGFR / erbB-2) is induced to cause activation of the signal transduction cascade.

5. 구성물 시험5. Component test

FKBP- 및 FRB- 보고자 시토플래스믹 도메인 융합의 2량화를 유발시킬 수 있는 라파마이신 또는 유사체의 능력을 시험하기 위해, 선택한 구성물(예를 들면, pCMEGFR-FR1 및 pCMEGFR-F1)을 리포펙션(Gibco BRL)에 의해 Cos-1내로 상호감염시켰다. 감염시킨후 3일째, 세포를 라파마이신으로 유도하고 리시스 완충액(1% Triton X-100; 500mM Tris. cl pH8.0; 150mM NaCl; 5mM NaF; 1mM 오르토 바나듐산나트륨; 10㎍/㎖ 아프로티닌; 10㎍/㎖ 루펩틴)에 용해시켰다. 라파마이신-처리 및 비처리 세포 분해물로부터의 융합 단백질을 안티-Flag 및 12CA5 항체로 면역학적침전시키고 안티-포스포티로신 항체로 면역학적소멸시켰다. 최적의 결과를 달성하기 위해서, 세포 타입; DNA 감염량; 라파마이신의 사용 농도 및 약물 처리의 지속성을 다양하게 선택하였다.To test the ability of rapamycin or an analog to induce dimerization of FKBP- and FRB-reporter cytoplasmic domain fusions, selected constructs (eg, pCMEGFR-FR1 and pCMEGFR-F1) were lipofected (Gibco). BRL) was transfected into Cos-1. Three days after infection, cells were induced with rapamycin and Lysis buffer (1% Triton X-100; 500 mM Tris. Cl pH8.0; 150 mM NaCl; 5 mM NaF; 1 mM sodium ortho vanadate; 10 μg / ml aprotinin 10 µg / ml lupeptin). Fusion proteins from rapamycin-treated and untreated cell lysates were immunoprecipitated with anti-Flag and 12CA5 antibodies and immunodepleted with anti-phosphotyrosine antibodies. To achieve optimal results, cell type; DNA infection amount; The concentration of rapamycin used and the persistence of drug treatment were varied.

6. 라파마이신-유발성 세포 성장6. Rapamycin-Induced Cell Growth

선택한 포유동물 세포 라인(예를 들면, NIH3T3)을 FRB 및 FKBP 융합 단백질(예를 들면, pCMEGFR-FR1 및 pCMEGFR-F1)을 코드화시키는 구성물로 상호감염시키고, 융합 단백질을 발현시키는 안정한 세포 라인을 확립하였다. 보고자 시토플래스믹 도메인의 라파마이신-유발성 활성이 세포 증식을 유발시키는지를 결정하기 위해, 융합 단백질을 발현시키는 안정한 세포 라인을 라파마이신 존재 또는 부재중에 성장시키고, 일정 과정(예를 들면, 세포수를 세고;3H 티미딘 혼입률 등을 측정)으로 세포 성장률을 측정하였다. 최적의 결과를 얻을 수 있도록 보고자 티로신 키나제; 보고자 활성(이종 2량체 대 동종 2량체)을 선택하였다.The selected mammalian cell line (eg NIH3T3) is transfected with a construct encoding the FRB and FKBP fusion proteins (eg pCMEGFR-FR1 and pCMEGFR-F1) and establishes a stable cell line that expresses the fusion protein. It was. To determine if the rapamycin-induced activity of the cytoplasmic domain we report causes cell proliferation, a stable cell line expressing a fusion protein is grown in the presence or absence of rapamycin and subjected to a process (eg, cell number). Cell growth rate was measured by measuring the 3 H thymidine incorporation rate and the like. Report tyrosine kinases to ensure optimal results; Reporter activity (heterodimer vs. homodimer) was selected.

7. 올리고뉴클레오티드 서열7. Oligonucleotide Sequence

8. 서열 1:8. SEQ ID NO: 1

변성 서열을 하부의 굵은 활체로 나타내고, 개시 ATG는 밑줄 그었다. 상부의 서열은 어버이로부터의 pCG 백본이다.Denatured sequences are shown in the lower boldface, and the starting ATG is underlined. The top sequence is the pCG backbone from the parent.

B. Fas의 도메인(들)을 포함하는 개체변이성 단백질을 코드화시키는 구성B. Construct Encoding Mutagenic Proteins Containing Domain (s) of Fas

Fas 활성을 제어하고 작은 분자를 거친 아포프토시스 작용을 유발시킬 수 있는 능력을 처리 세포를 선택적으로 제거하는데 이용될 수 있는 유전자 치료 및 실험실적 시스템에 적용시켰다. 여기서의 단백질은 낮은 친화력의 NGF 보고자를 거쳐 막에 앵커링되며, p75라 불리운다. 그러나, 또다른 단백질 앵커는 휩게 치환될 수 있을 것으로 예상된다. p75는 세포외 도메인에 대한 항체의 응용성 및 모든 확인된 리간드(Bothwell, M. 1995. Annu. Rev. Neurosci. 18:223-253)와의 높은 친화력 상호작용의 결여 때문에 실험실적으로 유용하다.The ability to control Fas activity and induce apoptotic action via small molecules has been applied to gene therapy and laboratory systems that can be used to selectively remove treated cells. The protein here is anchored to the membrane via a low affinity NGF reporter, called p75. However, it is expected that another protein anchor may be substituted. p75 is laboratory useful because of the applicability of the antibody to the extracellular domain and the lack of high affinity interactions with all identified ligands (Bothwell, M. 1995. Annu. Rev. Neurosci. 18: 223-253).

1. 2-단백질 라파마이신-조정된 Fas 활성1. 2-protein Rapamycin-Modulated Fas Activity

(a) p75 벡터의 구성(a) Composition of p75 vector

낮은 친화력의 NGF 보고자(p75로도 알려져 있음)의 트란스멤브레인 도메인 및 세포외 도메인을 함유하는 FRAP-Fas 융합 단백질의 발현을 지시하기 위한 벡터를 포유동물 발현 벡터 pJ7W(Morgenstern, J. P. and Land, H. 1990, Nucleic Acids Res. 18:1068)로부터 유도하여, 표준방법을 이용하여 원래의 pBR 백본에 대해 pUC 백본을 치환시켜 변형시켰다. 이를 벡터 pA7W라 부른다. 상기 플래즈미드의 폴리링커 부위내로 클로닝시킨 삽입물을 유인원의 CMV 촉진제 및 강화제 서열의 제어하에 전사시켰다. 폴리링커는 HindIII-SalI-XbaI-BamH1-SmaI-SstI-EcoRI-ClaI -KpnI-BgIII을 갖는 CMV 서열에 후속된다. 적당한 클로닝 부위 및 촉진제를 갖는 모든 포유동물 발현 벡터는 치환될 수 있다.A vector for directing the expression of the FRAP-Fas fusion protein containing the transmembrane domain and the extracellular domain of the low-affinity NGF reporter (also known as p75) was selected from the mammalian expression vector pJ7W (Morgenstern, JP and Land, H. 1990). , Nucleic Acids Res. 18: 1068), was modified by replacing the pUC backbone with the original pBR backbone using standard methods. This is called vector pA7W. Inserts cloned into the polylinker site of the plasmid were transcribed under the control of the apes CMV promoter and enhancer sequences. The polylinker is followed by the CMV sequence with HindIII-SalI-XbaI-BamH1-SmaI-SstI-EcoRI-ClaI-KpnI-BgIII. All mammalian expression vectors with the appropriate cloning site and promoter can be substituted.

HindIII 및 XbaI 부위에 의해 접해있는 p75의 단편을 코드화시키는 제한 단편을 p75의 서열(Johnson, D., Lanahan, A., Buck. C. R., Shegal, A., Morgan, C., Mercer, E., Bothwell. M., Chao. M. 1986. Cell 47: 545-554)에 기초를 둔 프라이머 J1(5') 및 J2(3')을 이용하여 PCR로 생성하였다. PCR 템플레이트의 원래 공급원은 J1 및 J2와 유사하지만 제한 부위가 다른 프라이머를 사용하여 사람의 뇌 라이브러리로부터 유도한 클론이었다. 형성된 단편의 5' 단부는 HindIII 부위에 이어 EcoRI 부위, Kozak 서열 및 p75 코팅 서열의 시발(아미노산 1)을 함유한다. 생성된 3' 단부는 XbaI 부위에 후속하여 예상된 막 스패닝 서열을 지나 아미노산 274, 2 아미노산을 포함하여 보고자 서열까지 코드화시킨다. PCR 생성물은 HindIII-XbaI 단편으로서 HindIII-XbaI 절단된 pA7W내로 서브클로닝시켜, pA7Wp75를 생성시켰다. 그 구성은 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.Restriction fragments encoding fragments of p75 bound by the HindIII and XbaI sites include sequences of p75 (Johnson, D., Lanahan, A., Buck. CR, Shegal, A., Morgan, C., Mercer, E., PCR was generated using primers J1 (5 ') and J2 (3') based on Bothwell.M., Chao.M. 1986. Cell 47: 545-554. The original source of PCR templates was clones derived from human brain libraries using primers similar to J1 and J2 but with different restriction sites. The 5 'end of the formed fragment contains the HindIII site followed by the EcoRI site, Kozak sequence and p75 coated sequence start (amino acid 1). The resulting 3 ′ end is encoded following the XbaI site beyond the expected membrane spanning sequence, including amino acids 274, 2 amino acids, to the reporter sequence. PCR products were subcloned into HindIII-XbaI digested pA7W as HindIII-XbaI fragments, resulting in pA7Wp75. The construction was verified by restriction analysis and DNA sequencing.

(b) pA7Wp75에 대한 Fas의 첨가(b) addition of Fas to pA7Wp75

Fas 아미노산 206-304(FasS) 및 Fas 아미노산 206-319(FasL)을 코드화시키는 XbaI-SpeI 단편을 PCR에 의해 제조하여, 상기 효소로 절단시킨 pA7Wp75내로 서브클로닝시켰다. 사용한 프라이머는 J3(5') 및 J4 또는 J5(3')이었다. J5는 그 말단 코돈아래서 종결되는 Fas의 단편을 생성한다: SpeI로 절단했을 때, Fas의 말단 15aa를 코드화시키는 뉴클레오티드를 제거하여 절단된 형태의 세포내 Fas(이를 FasS라 부른다)를 얻었다. 상기 15aa의 제거는 일부 세포 타입에 있어서 Fas의 활성을 증가시킨다(Itoh, N., and Nagata, S. 1993, J. Bilo. Chem 268: 10932). 프라이머 J4는 Fas의 천연의 말단 코돈을 SpeI 부위로 대체시키고, Fas중에 함유된 원래의 SpeI 부위를 돌연변이시켜서 FasL을 생성시킨다. 상기 단편을 서브클로닝시킴으로써 생성된 플래즈미드는 각각 pA7Wp75-FasS및 pA7Wp75-FasL이다. 이 구성을 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 입증하였다.XbaI-SpeI fragments encoding Fas amino acids 206-304 (Fas S ) and Fas amino acids 206-319 (Fas L ) were prepared by PCR and subcloned into pA7Wp75 digested with the enzyme. Primers used were J3 (5 ') and J4 or J5 (3'). J5 produces a fragment of Fas that terminates under its terminal codon: When cleaved with SpeI, the nucleotides encoding terminal 15aa of Fas were removed to obtain a truncated intracellular Fas (called Fas S ). Removal of 15aa increased the activity of Fas in some cell types (Itoh, N., and Nagata, S. 1993, J. Bilo. Chem 268: 10932). Primer J4 replaces the native terminal codon of Fas with the SpeI site and mutates the original SpeI site contained in Fas to produce Fas L. The plasmids generated by subcloning the fragment are pA7Wp75-Fas S and pA7Wp75-Fas L, respectively. This configuration was verified by restriction analysis and DNA sequencing.

(c) p75-FRAP-Fas-에피토프 융합 단백질: pA7Wp75-FasSE 및 pA7Wp75-FasLE에 대한 FRAP-함유 단편의 첨가로 인한 p-75-FRAPx-FasSirKE 및 p75-FasSORL-FRAPxE의 생성(c) p75-FRAP-Fas-epitope fusion protein: p-75-FRAPx-Fas SirK E and p75-Fas SORL -FRAPxE due to the addition of FRAP-containing fragments to pA7Wp75-Fas S E and pA7Wp75-Fas L E Generation of

FRAP의 일부를 함유하는 XbaI-SpeI 단편을 기재하였다. XbaI-SpeI 단편을 p75 코팅 서열 직후의 XbaI 부위내에 삽입하여 p-75-FRAPx-FasSirKE를 생성하거나 Fas 단편 직후의 SpeI 부위내로 삽입하여 p75-FasSORL-FRAPxE를 생성하였다. 대안으로, 하나이상의 FRAP 단편을 서브클로닝시켰다. 따라서 최종 시리즈의 벡터는 p75 세포외 및 트란스멤브레인 서열, 하나이상의 Fas 세포내 도메인에 대해 N- 또는 C-말단으로 융하된 하나이상의 FRAP-유래된 도메인 및 에피토프 택을 코드화시킨다.XbaI-SpeI fragments containing portions of FRAP have been described. The XbaI-SpeI fragment was inserted into the XbaI site immediately after the p75 coating sequence to generate p-75-FRAPx-Fas SirK E or into the SpeI site immediately after the Fas fragment to generate p75-Fas SORL -FRAPxE. Alternatively, one or more FRAP fragments were subcloned. The vector of the final series thus encodes the p75 extracellular and transmembrane sequences, one or more FRAP-derived domains and epitope fused to the N- or C-terminus for one or more Fas intracellular domains.

(d) p75-FKBP-Fas 융합 단백질: pA7Wp75-FasSE 및 pA7Wp75-FasLE에 대한 FRAP-함유 단편의 첨가로 인한 p75-FKBPn-FasSirK또는 p75-FasSORL-FKBPn의 생성(d) p75-FKBP-Fas fusion protein: production of p75-FKBPn-Fas SirK or p75-Fas SORL -FKBPn due to the addition of FRAP-containing fragments to pA7Wp75-Fas S E and pA7Wp75-Fas L E

FKBP의 일부를 함유하는 XbaI-SpeI 단편을 기재하였다. XbaI-SpeI 단편을 p75 코팅 서열 직후의 XbaI 부위내에 삽입하여 p-75-FKBPn-FasSirK를 생성하거나 Fas 단편 직후의 SpeI 부위내로 삽입하여 p75-FasSORL-FKBPn를 생성하였다. 따라서 최종 시리즈의 벡터는 p75 세포외 및 트란스멤브레인 서열, 하나 이상의 Fas 세포내 도메인에 대해 N- 또는 C-말단으로 융하된 하나이상의 FKBP-유래된 도메인 및 에피토프 택을 코드화시킨다.XbaI-SpeI fragments containing portions of FKBP have been described. The XbaI-SpeI fragment was inserted into the XbaI site immediately after the p75 coating sequence to generate p-75-FKBPn-Fas SirK or inserted into the SpeI site immediately after the Fas fragment to generate p75-Fas SORL -FKBPn. The vector of the final series thus encodes the p75 extracellular and transmembrane sequences, one or more FKBP-derived domains and epitope tags that have been N- or C-terminally fused to one or more Fas intracellular domains.

(e) 라파마이신-개재된 Fas 활성의 검정(e) Assay of Rapamycin-Interposed Fas Activity

Fas 및 FRAP 도메인을 함유하는 단백질 및 Fas 및 FKBP 도메인을 함유하는 단백질의 라파마이신 첨가시 Fas를 활성화시키고 세포 사지를 유발시킬 수 있는 발현 능력을 일시적이거나 안정하게 감염시킨 세포중에서 시험하였다.The addition of rapamycin to proteins containing Fas and FRAP domains and proteins containing Fas and FKBP domains was tested in cells that transiently or stably infected the ability to express Fas by activating Fas and causing cell limbs.

세포를 안정하게 감염시키기 위해, 네오마이신 내성과 같은 선택적 표지자를 코드화시키는 벡터를 플래즈미드로 상홋감염시켰다. 감염후 2 내지 3일째, 세포를 G418내로 플레이팅시키고, 표준수단으로 내성 개체군 또는 클론을 단리시켰다. 상기 개체군을 2량체에 이어 세포로 처리하고 아포프토시스를 직접적으로 유발시키는 가를 감시하였다.To stably infect cells, vectors encoding selective markers, such as neomycin resistance, were transfected with plasmids. Two to three days after infection, cells were plated into G418 and resistant populations or clones were isolated by standard means. The population was treated with dimers followed by cells and monitored to induce apoptosis directly.

중요 구성물을 발현시키는 안정한 세포 라인을 형성시키기 위한 대안으로 레트로비랄 벡터내로 삽입물을 서브클론시킨다. 상기 삽입물은 서브클로닝을 용이하게 하기 위해서 Eco RI로 절제시킬 수 있다. 종래 방법을 이용하여 패킹 세포에 의해 상층액을 변환시키는데 상기 벡터를 이용하였다.Subclones the insert into a retroviral vector as an alternative to forming stable cell lines that express important constructs. The insert can be excised with Eco RI to facilitate subcloning. The vector was used to transform the supernatant by packing cells using conventional methods.

2. 단일 단백질 라파마이신-조종된 Fas 활성2. Single Protein Rapamycin-Controlled Fas Activity

(a) Fas 세포내 도메인의 라파마이신-의존성 동종 2량화를 위한 FKBP-FRAP 개체변이성 단편 FKBP-FRAP 융합 구성물의 구성(a) Construction of FKBP-FRAP mutant fragment FKBP-FRAP fusion constructs for rapamycin-dependent homodimerization of Fas intracellular domain

i. 구조-조장된 디자인i. Structure-designed design

라파마이신-의존성 동종 2량화할 수 있는 FRAP 및 FKBP 도메인 둘다를 함유하는 분자를 디자인하기 위해, 사람 FKBP12, 라파마이신과 최소 FRB 도메인을 둘러싸는 사람 FRAP 의 일부사이의 4 복합체의 3차원적 구조를 고려할 수 있다. FRAP, FKBP 및 Fas 부분을 함유하는 2 분자의 융합 단백질을 동종 2량화시키기 위해 (i) 시그날을 변환시키기 위해 응집된 Fas의 능력을 유지시키면서, 막에 매어있는 분자들 사이에서 일어나는 FRAP-FKBP 상호작용을 위해 필요한 변형을 수용할 만한 폴리펩티드의 충분한 길이 및 가요성; 및 (ii) 라파마이신에 의한 분자내 2량화의 보존 또는 최소화가 요구된다.To design molecules containing both rapamycin-dependent homodimerizable FRAP and FKBP domains, the three-dimensional structure of the four complexes between human FKBP12, rapamycin and a portion of the human FRAP surrounding the minimum FRB domain was Can be considered FR10-FKBP interactions occurring between molecules bound to the membrane, while maintaining the ability of the aggregated Fas to convert signals to (i) convert the signal to homodimerize two-molecule fusion proteins containing the FRAP, FKBP and Fas moieties. Sufficient length and flexibility of the polypeptide to accommodate the modifications needed for functioning; And (ii) preservation or minimization of intramolecular dimerization by rapamycin.

융합 단백질을 디자인하는데 있어서 하기의 사항을 고려하는 것이 바람직하다:In designing a fusion protein, it is desirable to consider the following:

(i) FRB와 FKBP는 분자내 2량화가 입체적으로 유지될 정도로 충분하게 짧은 폴리펩티드를 갖는 링커와 연결되어야만 한다. 바람직한 배향은 FRAP의 C-말단으로서 FRAP-FKBP이고 FKBP의 N-말단은 거리를 두어서, 가요성을 부여하는 분자내 2량화가 여전히 유지되도록 긴(10 아미노산) 링커를 허용해야만 된다.(i) FRB and FKBP must be linked with a linker having a polypeptide that is sufficiently short that intramolecular dimerization is maintained stericly. The preferred orientation is FRAP-FKBP as the C-terminus of FRAP and the N-terminus of the FKBP should be distanced to allow long (10 amino acid) linkers so that intramolecular dimerization still confers flexibility.

(ii) 상기 FRAP-FKBP 카세트는 막-근방(즉, C-말단에 부가된 Fas 도메인을 갖는다) 또는 막-말단에 존재될 수 있다.(ii) The FRAP-FKBP cassette may be present in the membrane-near (ie with a Fas domain added at the C-terminus) or at the membrane-terminus.

(iii) 막에서의 2량화에 의해 암시된 구조적 변형을 허용하도록 긴 링커가 FRAP-FKBP 도메인에 대해 N-말단에 존재해야만 된다. FRAP의 N-말단 위치는 상기 긴 링커가 FRB 도메인에 대한 영역 N-말단으로부터 천연의 FRAP 서열을 포함할 수 있도록 됨에 따라서 개체변이성 단백질의 면역성이 감소하게 되는 것이 바람직하다.(iii) Long linkers must be present at the N-terminus to the FRAP-FKBP domain to allow for structural modifications implied by the dimerization in the membrane. The N-terminal position of the FRAP is preferably such that the long linker can include native FRAP sequences from the region N-terminus to the FRB domain, thereby reducing the immunity of the mutant protein.

(iv) 최적 링커 길이 및 주어진 단백질에 대한 융합 위치는 경헙적으로 확신되어야만 한다.(iv) The optimal linker length and fusion position for a given protein should be conservatively convincing.

T1-T12를 나타내는 FKBP 및 FRAP의 일련의 12 융합물을 디자인하였다. 9는 Arg2018(N-말단 링커)에 대해 13, 23 또는 33 아미노산 N-말단과 2가지 단백질을 분리하는 4, 7 또는 10잔기사이에 포함된 N-FRAP-FKBP-C 융합물이었다. 나머지 3은 FKBP Glu107과 FRAP Arg2018사이에 FRAP 서열의 3, 0 또는 -4 잔기를 놓은 N-FKBP-FRAP-C 융합물이었다.A series of 12 fusions of FKBP and FRAP representing T1-T12 were designed. 9 was the N-FRAP-FKBP-C fusion contained between 13, 23 or 33 amino acid N-terminus and 4, 7 or 10 residues separating the two proteins for Arg2018 (N-terminal linker). The remaining 3 were N-FKBP-FRAP-C fusions with 3, 0 or -4 residues of the FRAP sequence between FKBP Glu107 and FRAP Arg2018.

(ii) 구성(ii) composition

12 융합물을 3-프라이머 PCR 슬라이싱 방법(Yon, J. and Fried, M. 1989, Nudcleic Acids Res. 17, 4895)을 이용하여, 단일 단편으로서 직접 클로닝시킬 수 있는 XbaI-BamH1 카세트로서 제조하였다. 이러한 방식의 클로닝은 이종 서열을 코드화시키고 링커의 길이를 바꾸는 유전자들사이의 제한 부위의 도입을 회피시킨다. 1ng의 각각의 pCGNN-1FRAPi및 pCANTAB-AP-FKBP 혼합물을 1μM의 각각의 2개의 외부 프라이머(A 및 C)를 갖는 Pfu 중합효소를 사용하여, 원하는 융합을 지시하는 두 유전자에 대해 상보적인 단일 '슬라이스' 올리고(B) 0.01μM의 존재중에서 증폭시켰다. 이용한 프라이머를 아래에 목록화하였다:12 fusions were prepared as XbaI-BamH1 cassettes that can be cloned directly as single fragments using a 3-primer PCR slicing method (Yon, J. and Fried, M. 1989, Nudcleic Acids Res. 17, 4895). Cloning in this manner avoids the introduction of restriction sites between genes that encode heterologous sequences and change the length of the linker. Using 1 ng of each pCGNN-1FRAP i and pCANTAB-AP-FKBP mixtures with Pfu polymerase with 2 outer primers (A and C) of 1 μM each, a single complementary to two genes indicating the desired fusion 'Slice' oligos (B) were amplified in the presence of 0.01 μM. The primers used are listed below:

PCR 생성물을 정제하고, XbaI 및 BamHI로 소화시키고, XbaI-BamHI 소화된 pCM내로 결찰시켰다. 그 구성을 제한 분석 및 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다.PCR products were purified, digested with XbaI and BamHI and ligated into XbaI-BamHI digested pCM. The configuration was verified by restriction analysis and DNA sequencing.

프라이머 서열Primer sequence

제한 부위는 밑줄을 그었다(XbaI=TCTAGA, SpeI=ACGAGT, BamHI=GGATCC).Restriction sites are underlined (XbaI = TCTAGA, SpeI = ACGAGT, BamHI = GGATCC).

대표적 구성물의 서열 : 융합물 T6Sequence of representative construct: fusion T6

(b) pA7Wp75-FasSE 및 pA7Wp75-FasLE에 대한 FRAP-FKBP 개체변이성 삽입물의 첨가(b) Addition of FRAP-FKBP mutant insert to pA7Wp75-Fas S E and pA7Wp75-Fas L E

T1 내지 T2를 XbaI-SpeI 단편으로서 XbaI로 선형화시킨 pA7Wp75-FasSE 및 pA7Wp75-FasLE내로 서브클로닝시킴으로써 p75TFasSorLE를 생성하였다. SpeI로 선형화시킨 pA7Wp75-FasLE내로 서브클로닝시킴으로써 p75TFasSorLT-E를 생성하였다. 그 구성을 표 1((d))에 나타낸다.P75TFas SorL E was generated by subcloning T1 to T2 into pA7Wp75-Fas S E and pA7Wp75-Fas L E linearized with XbaI as XbaI-SpeI fragments. P75TFas SorL TE was generated by subcloning into pA7Wp75-Fas L E linearized with SpeI. The configuration is shown in Table 1 ((d)).

(c) FRAP-Fas-FKBP 구성(c) FRAP-Fas-FKBP Configuration

개체변이성 단편 T1-T12의 형성대신에, 단일 사슬을 최적 활성을 위해 도메인을 상이하게 배향하도록 요구할 수 있다. FKBP 및 FRB가 Fas 단편에 의해 분리된 다른 일련의 구성을 이루었다. 이러한 구성의 출발점은 pCMF1HA, pCMF2HA 및 pCMF3HA이다. 개체변이성 전사 인자의 구성에서와 같은 전략과 유사하게, FKBP 및 FRB 단편을 BamHI 부위의 바로 상류에 SpeI 부위를 갖는 XbaI-BamHI 단편으로서 pCM내에 클로닝시켰다. XbaI 및 SpeI가 상보성 단부를 생성함에 따라, 초기 삽입물의 하류에 추가의 XbaI-BamHI 단편이 삽입될 수 있다. 부수적으로, XbaI-SpeI 단편의 클로닝은 구성물의 5' 단부에 단편을 추가시킨다. 최종 p75-앵커된 구성물을 표 1의 (d)에 나타낸 XbaI-SpeI 단편을 pA7Wp75-FasSE내로 서브클로닝시킴으로써 제조하였다. 유사한 계류를 pA7Wp75-FasLE내로 서브클로닝시킴으로써 제조하였다. 상기 벡터내로의 삽입은 Fas 단편에 대해 삽입물 3'의 첨가로 인한 XbaI를 절단시킨다. 상기 벡터내로의 삽입은 Fas 단편에 대해 삽입물 3'의 첨가로 인한 SpeI를 절단시킨다. 상기 벡터내로의 삽입은 p75 단편에 대해 삽입물 3'의 첨가 및 벡터중의 원래의 Fas 단편의 제거로 인한 XbaI 및 SpeI를 절단시킨다. 이러한 3가지 서브클로닝 전략을 이용하여, 하기 시리즈의 구성물을 생성하였다. 아래첨자의 숫자는 도메인이 반복되는 회수를 의미한다.Instead of forming the mutagenic fragments T1-T12, a single chain may be required to orient the domains differently for optimal activity. FKBP and FRB made up another series of constructs separated by Fas fragments. The starting point for this configuration is pCMF1HA, pCMF2HA and pCMF3HA. Similar to the same strategy as in the construction of mutant transcription factors, FKBP and FRB fragments were cloned into pCM as XbaI-BamHI fragments with SpeI sites immediately upstream of the BamHI site. As XbaI and SpeI produce complementary ends, additional XbaI-BamHI fragments may be inserted downstream of the initial insert. Incidentally, cloning of the XbaI-SpeI fragment adds the fragment at the 5 'end of the construct. The final p75-anchored construct was prepared by subcloning the XbaI-SpeI fragment shown in Table 1 (d) into pA7Wp75-Fas S E. Similar moorings were made by subcloning into pA7Wp75-Fas L E. Insertion into the vector cleaves XbaI due to the addition of Insert 3 'to the Fas fragment. Insertion into the vector cleaves SpeI due to the addition of insert 3 'to the Fas fragment. Insertion into the vector cleaves XbaI and SpeI due to addition of Insert 3 'to the p75 fragment and removal of the original Fas fragment in the vector. Using these three subcloning strategies, the following series of constructs were created. Subscript numbers indicate the number of times a domain is repeated.

(d) 표 1(d) Table 1

(e) 이용한 단편의 말단(FKBP 및 FRB 단편은 본 명세서에 두루 나타냄)(e) the ends of the fragments used (FKBP and FRB fragments are shown throughout this specification)

i. p75 세포외 및 트란스멤브레인 단편i. p75 extracellular and transmembrane fragments

ii. Fas의 세포내 도메인:ii. Intracellular domain of Fas:

(f) 사용된 올리고(f) oligos used

단백질을 막에 고정시키기 위해 미리스토일화 서열을 사용하는 구성물에 대해, pCM(본원에서 설명됨)을 사용하고, 삽입물을 XbaI-BamHI 또는 XbaI-SpeI 단편으로서 미리스토일화 신호 서열에 3'에서 클로닝시켰다.For constructs that use myristoylation sequences to immobilize proteins to the membrane, use pCM (described herein) and clone the insert at 3 ′ to the myristoylation signal sequence as an XbaI-BamHI or XbaI-SpeI fragment. I was.

(g) 배양액 중의 안정한 형질감염된 사람 HT1080 세포의 라파마이신-조절된 아폽토시스(g) Rapamycin-regulated apoptosis of stable transfected human HT1080 cells in culture

구성물 A30 및 A31(d, 표 1)로부터의 XbaI-BamHI를 pCM 내로 클로닝시켜서 MT5FasSE 및 MT6FasSE(여기에서, M은 미리스토일화 도메인(상기 실시예 섹션 A.1 및 A.8. 참조)을 나타내고, 나머지 약어들은 d, 표 1에 기재되어 있음)의 발현에 관한 M30 및 M31 구성물을 생성시켰다. 이들 발현 카세트를 함유하는 EcoRI-BamHI 단편을 레트로바이러스 인자 pSMTN3 내로 클로닝시켰다 (실시예 1). 상기 DNA를 함유하는 헬퍼 비함유 레트로바이러스를 구성물 및 Psi(-) 암포트로픽 패키징 인자에 의한 293T 세포(Pear, W.S. et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8392-8396)의 일시적 공동 형질감염에 의해 생성시켰다. HT1080 세포를 바이러스 스톡으로 감염시키고, G418로 선택하였다.Cloning XbaI-BamHI from constructs A30 and A31 (d, Table 1) into pCM to represent MT5FasSE and MT6FasSE (where M represents the myristoylation domain (see Examples section A.1 and A.8. Above). The remaining abbreviations, d, described in Table 1) resulted in M30 and M31 constructs for expression. EcoRI-BamHI fragments containing these expression cassettes were cloned into retroviral factor pSMTN3 (Example 1). The helper-free retrovirus containing the DNA was constructed using 293T cells (Pear, WS et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8392-8396) by construct and by Psi (-) amphoteric packaging factor. ) By transient co-transfection. HT1080 cells were infected with viral stock and selected with G418.

라파마이신에 반응하여 세포의 안정하게 형질감염된 푸울의 아폽토시스를 검정하기 위해, 세포를 10000개 세포/웰로 96-웰 배양판에 플레이팅시켰다. 밤샌 인큐베이션 후, 라파마이신의 일련의 희석물을 50ng/㎖(최종) 안티노마이신 D와 함께 첨가하고, 약 20시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 계속 인큐베이션시켰다. 매질을 제거하고, 10% 알라마르 블루 염료를 함유하는 매질 100㎕로 교체하였다. 판을 상기와 같이 인큐베이션시키고, 세포 생존 정도를 미세 적정판 리더 상에서 570nm 및 600nm에서 OD의 분광 측정에 의해 주기적으로 평가하였다. 대표적으로, 리딩을 대조군(비처리) 웰이 블랭크의 삭제 후 OD 0.2-0.4에서 있을 때 까지 계속하였다.To assay apoptosis of stably transfected pools of cells in response to rapamycin, cells were plated in 96-well culture plates at 10000 cells / well. After balsamin incubation, a series of dilutions of rapamycin were added with 50 ng / ml (final) antinomycin D and continued incubation at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 20 hours. The medium was removed and replaced with 100 μl of medium containing 10% Alamar Blue Dye. Plates were incubated as above and cell viability was assessed periodically by spectroscopic measurement of OD at 570 nm and 600 nm on a microtiter plate reader. Typically, reading was continued until control (untreated) wells were at OD 0.2-0.4 after deletion of blank.

도 13은 (a) M30 및 (b) M31 발현 구성물로 안정하게 형질감염된 세포의 생존이 용량 의존 방식으로 라파마이신의 존재하에 감소될 수 있음을 보여준다. 도 13(c)으로부터 입증된 바와 같이, 세포 사멸의 정도는 합성 FKBP 단독이합체화제 AP1428로 처리한 미리스토일화된 (FKBP x 2)-Fas 구성물(PCT/US94/08008에 기술되어 있음)를 발현시키는 세포의 사멸 정도에 필적한다 :FIG. 13 shows that the survival of cells stably transfected with (a) M30 and (b) M31 expression constructs can be reduced in the presence of rapamycin in a dose dependent manner. As demonstrated from FIG. 13 (c), the degree of cell death expressed myristoylated (FKBP × 2) -Fas construct (described in PCT / US94 / 08008) treated with synthetic FKBP homodimerizer AP1428. Comparable to the degree of cell death that causes

AP1428은 PCT/US95/10559에 기술되어 있는 화합물 49이다. 라파마이신이 혼합된 키메라 단백질을 발현시키지 않는 세포의 생존에 대해 최소 효과를 가짐을 유의해야 한다.AP1428 is compound 49 described in PCT / US95 / 10559. It should be noted that rapamycin has a minimal effect on the survival of cells that do not express mixed chimeric proteins.

실시예 9: 라파마이신 의존성 DNA 결합Example 9: Rapamycin Dependent DNA Binding

DNA 결합의 수준에서 전사 인자 기능을 조절하는 능력이 치료적 유전자 발현의 소분자 조절에 대한 또다른 접근법이다. DNA 결합을 위해 라파마이신에 의존성인 전사 인자를 생성시키기 위한 하나의 접근법은 많은 전사 인자가 이합체로서 이들의 동족 서열에 결합한다는 점을 이용한다. 이러한 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 종종 DNA를 직접 접촉시키는 데에 수반되는 영역, 및 이합체 생성을 중개하는 데에 수반되는 영역으로 세분될 수 있다. 이와 같이, 천연 전사 인자 이합체와 도메인을 FKBP 또는 FRAP로 치환시킴으로써, 키메라 전사 인자는 라파마신 의존성 DNA 결합을 나타낸다.The ability to modulate transcription factor function at the level of DNA binding is another approach to small molecule regulation of therapeutic gene expression. One approach for generating transcription factors that are dependent on rapamycin for DNA binding utilizes that many transcription factors bind their cognate sequences as dimers. The DNA binding domains of such transcription factors can often be subdivided into regions involved in direct contact of DNA, and regions involved in mediating dimer production. As such, by replacing the native transcription factor dimer and domain with FKBP or FRAP, the chimeric transcription factor exhibits rapamycin dependent DNA binding.

임의의 사람 이합체 전사 인자는 이러한 접근법에 따를 수 있다. 예로는 HNF-1, SRF 또는 다른 MADS 박스 함유 단백질, 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자 패밀리의 임의의 멤버, 예를 들어 MyoD(미오게닌), bZIP 전사 인자 패밀리의 임의의 멤버, 예를 들어 FOS, JUN, ATF, CREB 등이 있다.Any human dimer transcription factor can follow this approach. Examples include HNF-1, SRF or other MADS box containing proteins, any member of the helix-loop-helix transcription factor family, eg MyoD (myogenin), any member of the bZIP transcription factor family, eg FOS , JUN, ATF, CREB, etc.

치료 유전자의 원하지 않는 활성화를 방지하기 위해, 키메라 전자 인자의 DNA 결합 특이성을 어미 단백질의 특이성과 상이하게 처리할 수 있다. 이것은 팔린드롬성 표적 DNA 서열의 자리 공간의 반응 변형시켜서, 라파마이신 중개 키메라 단백질이 결합하지만, 천연적으로 생성되는 어미 이합체는 결합할 수 없게 함으로써 달성될 수 있다.In order to prevent unwanted activation of the therapeutic gene, the DNA binding specificity of the chimeric electronic factor can be treated differently from the specificity of the mother protein. This can be accomplished by the reaction modification of the site space of the palindromic target DNA sequence so that the rapamycin mediated chimeric protein binds but the naturally occurring parent dimer cannot bind.

생체외 라파마이신 의존성 DNA 결합은 발테리아 리프레서 단백질 LexA의 유도체에 의해 입증되었다.In vitro rapamycin dependent DNA binding was demonstrated by derivatives of the Valteria Refresher Protein LexA.

LexA는 이합체로서 이것의 표적 오퍼레이터에 결합하고, DNA와 직접 상호작용하는 아미노 말단 도메인 및 이합체화를 중개하는 카르복시 말단 도메인을 포함한다. LexA 이합체화 도메인이 FKBP 또는 FRAP로 치환시킨 키메라 단백질이 구성된다. 도 14는 Lex 결합 자리를 함유하는 DNA로 인큐베이팅시킨 Lex-FKBP 및 Lex-FRAP을 거의 같은 양으로 함유하는 결합 반응의 겔 이동성 시프트 검정을 보여준다. 라파마이신의 부재하에서는, 어떠한 특이적 결합도 검출할 수 없다(도 14, 레인 1). 결합 반응에서 증가량의 라파마이신의 포함은 이동성 시프트 겔에서 특이적 복합체의 오염된 외관을 유발시킨다(도 14, 레인 2-4). 이러한 결과는 라파마이신이 LexA 표적 서열을 함유하는 DNA에 결합할 수 있는 Lex-FKBP/Lex-FRAP 이종이합체의 생성을 촉진시킨다는 결과에 의해 지지된다.LexA binds to its target operator as a dimer and includes an amino terminal domain that interacts directly with DNA and a carboxy terminal domain that mediates dimerization. A chimeric protein is constructed wherein the LexA dimerization domain has been replaced with FKBP or FRAP. FIG. 14 shows gel shift shift assays of binding reactions containing approximately equal amounts of Lex-FKBP and Lex-FRAP incubated with DNA containing Lex binding sites. In the absence of rapamycin, no specific binding can be detected (FIG. 14, lane 1). Inclusion of increasing amounts of rapamycin in the binding reaction results in a contaminated appearance of specific complexes in the mobile shift gel (FIG. 14, lanes 2-4). This result is supported by the finding that rapamycin promotes the production of Lex-FKBP / Lex-FRAP heterodimers that can bind to DNA containing LexA target sequences.

도 14.Figure 14.

Lex-FKBP/Lex-FRAP 이종이합체 Lex-FKBP 및 Lex-FRAP 단백질에 의한 라파마이신 의존성 DNA 결합을 생체외에서 번역하고, 방사성 표지화 LexCon 올리고누클레오티드와의 결합 반응에서 함께 혼합시켰다. 라파마이신은 도시된 농도로 결합 반응에 포함된다(레인 1-4).Rapamycin dependent DNA binding by Lex-FKBP / Lex-FRAP heterodimer Lex-FKBP and Lex-FRAP proteins was translated in vitro and mixed together in a binding reaction with radiolabeled LexCon oligonucleotides. Rapamycin is involved in binding reactions at the concentrations shown (lanes 1-4).

화살표는 라파마이신 의존성 DNA 복합체의 위치를 가리킨다. LexCon 프로브의 서열이 하기에 기재되어 있으며, LexA 결합 자리는 밑줄을 그었다.The arrow points to the location of the rapamycin dependent DNA complex. The sequences of LexCon probes are described below and the LexA binding sites are underlined.

플라스미드 구성물Plasmid construct

플라스미드 p19BL87, p19BL87G6FKBP 및 p19BL87FRB를 변형된 pET19BHA, pET-19B RLWO 인자 중에서 구성하여, 모든 발현된 단백질이 아미노-말단 His를 함유하게 된다. Tag 다음에는 헤마토글루틴 에피토프 Tag가 뒤따른다.Plasmids p19BL87, p19BL87G6FKBP and p19BL87FRB were constructed among the modified pET19BHA, pET-19B RLWO factors so that all expressed proteins contained amino-terminal His. The tag is followed by the hematoglutin epitope tag.

p19BL87은 Lex DNA 결합 도메인(aa 1-87)을 코드화한다. Lex 코드화 서열은 프라이머 LexA Xba 및 LexA87Spe/Bam에 의해 pCGNNLex202로부터의 PCR에 의해 증폭된다. PCR 생성물은 XbaI 및 BamHI에 의해 절단되고, p19BHA의 XbaI와 BamHI 자리 사이에 결찰된다.p19BL87 encodes the Lex DNA binding domain (aa 1-87). Lex encoding sequences are amplified by PCR from pCGNNLex202 with primers LexA Xba and LexA87Spe / Bam. The PCR product is cleaved by XbaI and BamHI and ligated between the XbaI and BamHI sites of p19BHA.

p19BL87G6FKBP는 6개의 글리신 연성 링커를 통해 골격 중에서 FKBP(aa 2-108)에 융합된 LexA(aa 1-87)을 코드화시킨다. FKBP 코드화 서열은 프라이머 5'XG6FKBP 및 FKBP 3' Spe/Bam에 의해 pCGNNF1으로부터 PCR에 의해 증폭된다. pCGNNZFHD1-FKBPx3(ATCC 수탁 번호 97399)이 또한 FKBP 코드화 DNA에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다(참조 : 1995년 12월 29일자로 출원된 USSN 08/581,713). PCR 생성물은 XbaI 및 BamHI에 의해 절단되고, p19BL87의 SpeI와 BamHI 자리 사이에 결찰된다.p19BL87G6FKBP encodes LexA (aa 1-87) fused to FKBP (aa 2-108) in the backbone via six glycine soft linkers. The FKBP coding sequence is amplified by PCR from pCGNNF1 by primers 5'XG6FKBP and FKBP 3 'Spe / Bam. pCGNNZFHD1-FKBPx3 (ATCC Accession No. 97399) can also be used as a source for FKBP encoded DNA (USSN 08 / 581,713, filed Dec. 29, 1995). The PCR product is cleaved by XbaI and BamHI and ligated between the SpeI and BamHI sites of p19BL87.

p19BL87FRB는 골격 중에서 FRAP(aa 2025-2113)에 융합된 LexA(aa 1-87)을 코드화시킨다. FRAP 코드화 서열은 pCGNN-GAL4-1FRB로부터 XbaI-BamHI 단편으로서 단리되고, p19BL87의 SpeI와 BamHI 자리 사이에 결찰된다.p19BL87FRB encodes LexA (aa 1-87) fused to FRAP (aa 2025-2113) in the backbone. The FRAP coding sequence is isolated as an XbaI-BamHI fragment from pCGNN-GAL4-1FRB and ligated between the SpeI and BamHI sites of p19BL87.

PCR 프라이머PCR primers

결합 반응Binding reaction

p19BL87G6FKBP 및 p19BL87FRB 플라스미드를 제조업자의 지시에 따라 TNT 커플링된 레티쿨로사이트 시스템(Promega)를 사용하여 생체외에서 번역하였다.p19BL87G6FKBP and p19BL87FRB plasmids were translated ex vivo using a TNT coupled reticulosite system (Promega) according to the manufacturer's instructions.

결합 반응은 15㎖의 결합 완충제 (10mM Tris pH 7.5 mM DDT, 0.1mM EDTA, 10%v/v 글리세롤, 5mM MgCl2, 60mM NaCl), 50㎎/㎖ 소혈청 알부민(NED); 200ng 폴리(dIdC) (Pharmacia); 1㎖의 각각의 L87G6FKBP 및 L87FRB 프로그램화 레티쿨로사이트 용해물 및 0.2ng g-32P-dATP 표지화 LexCon 프로브 (전체 부피 : 20㎖)를 함유한다. 라파마이신을 적합한 농도로 첨가하고,반응물을 30분 동안 실온에서 인큐베이팅시킨다.The binding reaction was 15 ml of binding buffer (10 mM Tris pH 7.5 mM DDT, 0.1 mM EDTA, 10% v / v glycerol, 5 mM MgCl 2, 60 mM NaCl), 50 mg / ml bovine serum albumin (NED); 200 ng poly (dIdC) from Pharmacia; 1 ml of each L87G6FKBP and L87FRB programmed reticulocyte lysate and 0.2 ng g-32P-dATP labeled LexCon probe (total volume: 20 ml). Rapamycin is added at a suitable concentration and the reaction is incubated for 30 minutes at room temperature.

겔 이동성 시프트 검정Gel mobility shift assay

복합체를 2시간 동안 10-15V/cm에서 처리한, 0.5X TBE 완충제 중의 4% 40:1 가교 폴리아크릴아미드 겔에서 용해시킨다.The complex is dissolved in a 4% 40: 1 crosslinked polyacrylamide gel in 0.5X TBE buffer, treated at 10-15 V / cm for 2 hours.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 생물학적 스위치에 대한 형태에 관한 것이고, 특히 동물세포에서의 생물학적 사건을 조절하는 신규한 방법 및 물질에 관한 것이다. 이러한 생물학적 사건에는 예를 들어, 유전자 전사, 유전자 발현 또는 아폽토틱(apoptotic ) 세포치사를 유도하는 세포내 시그날 형질도입 경로의 활성화, 유전자 녹아웃, 유전자 발현 봉쇄, 및 유전자 생성의 기능억제가 포함된다. 본 발명은 두가지 형태의 키메라 단백질에 관한 것이며, 이러한 키메라 단백질은 일반적인 리간드에 상호결합을 통해 복합화되는 경우에 바람직한 사건으로서 직접 또는 간접적으로 활성화될 수 있다.The present invention relates to forms for biological switches, and in particular to novel methods and materials for controlling biological events in animal cells. Such biological events include, for example, activation of intracellular signal transduction pathways leading to gene transcription, gene expression or apoptotic cell death, gene knockout, gene expression blockade, and inhibition of gene production. The present invention relates to two types of chimeric proteins, which can be activated either directly or indirectly as a preferred event when complexed via mutual binding to a common ligand.

본 발명은 키메라 단백질을 코드화하는 재조합 DNA 구성물; 하나 이상의 재조합 DNA 구성물을 함유하는 DNA 벡터; 상기 구성물에 의해 코드화된 융합 단백질; 하나 이상의 상기 DNA 구성물에 의해 형질변환된(즉, 함유하고 발현할 수 있는) 세포, 특히 동물 세포; 키메라 단백질 분자를 다중화할 수 있고 이에 결합되는 스몰 분자 (이가 또는 다가의 다중화제); 및 상기된 것들을 제조하고 사용하는 방법을 포함한다.The present invention provides a recombinant DNA construct encoding a chimeric protein; A DNA vector containing one or more recombinant DNA constructs; Fusion proteins encoded by the construct; Cells, particularly animal cells, transformed (ie, containing and capable of expressing) by one or more of said DNA constructs; Small molecules (bivalent or multivalent multiplexing agents) capable of multiplexing and binding to chimeric protein molecules; And methods of making and using those described above.

더욱 특히, 본 발명은 본 발명의 라파마이신의 존재 또는 상기 라파마이신의 유사체, 의사체 또는 유도체(라팔로그: rapalog)의 존재에 반응하는 유전자 조작된 세포를 제조하고 사용하는 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명은 라파마이신 또는 라팔로그의 존재하에 서로 복합될 수 있는 융합 단백질 세트를 코드하는 재조합 DNA의 세포내로의 도입을 포함한다. 이러한 유전자 조작된 세포를 라파마이신 또는 적합한 라팔로그와 접촉시키면 융합 단백질이 복합되고, 생물학적 반응이 개시된다. 이러한 융합 단백질중 한 융합 단백질은 FKBP의 하나 이상의 복제물: 라파마이신 결합(FRB) 도메인 및 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 함유한다. 제 2 융합 단백질은 라파마이신 또는 라팔로그에 결합하고 FRB 함유 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 FKBP 단백질로부터 유도된 도메인의 하나 이상의 복제물을 함유한다. 이러한 제 2 융합 단백질은 또한 하나 이상의 이종성 도메인을 함유하는데 이러한 이종성 도메인은 제 1 융합 단백질의 이종성 도메인과 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 FRB 및 FKBP 도메인은 천연 단백질로부터 선택될 수 있고, 이하 기술되는 바와 같이 다양하게 변형될 수 있다. 다양한 종으로부터 유도된 FRB, FKBP 및 이종성 도메인이 사용될 수 있지만, 사람 펩티드 서열 또는 이의 변이체가 사람 유전자 치료에 바람직하다. 작동적으로는, FRB및 FRBP 도메인이 수용체(리간드 결합)도메인으로 작용하며, 라파마이신 또는 라팔로그 분자의 중재하에 융합 단백질의 복합화를 유도한다. 라파마이신 또는 라팔로그 중재된 복합화의 생물학적 반응 특성은 융합 단백질의 이종성 도메인에 의해 측정된다. 따라서 이종성 도메인은 작용 도메인이라 일컬어진다.More particularly, the present invention provides methods and materials for preparing and using genetically engineered cells that respond to the presence of rapamycin of the present invention or to the presence of analogs, pseudo or derivatives of the rapamycin (rapalog). . The present invention encompasses the introduction of recombinant DNA into cells which encode sets of fusion proteins that can be complexed with one another in the presence of rapamycin or rapalog. Contacting these genetically engineered cells with rapamycin or a suitable rapalog complexes the fusion protein and initiates a biological response. One of these fusion proteins contains one or more replicas of FKBP: rapamycin binding (FRB) domains and one or more heterologous protein domains. The second fusion protein contains one or more copies of a domain derived from FKBP protein capable of binding to rapamycin or rapalog and complexing with the FRB containing protein. Such a second fusion protein also contains one or more heterologous domains which may be the same or different from the heterologous domain of the first fusion protein. The FRB and FKBP domains used in the fusion proteins of the invention can be selected from natural proteins and can be variously modified as described below. FRB, FKBP and heterologous domains derived from various species can be used, but human peptide sequences or variants thereof are preferred for human gene therapy. In operation, the FRB and FRBP domains act as receptor (ligand binding) domains and induce the complexation of fusion proteins under the mediation of rapamycin or raphalog molecules. The biological response properties of rapamycin or rapalog mediated complexation are measured by the heterologous domain of the fusion protein. The heterologous domain is thus called the functional domain.

다양한 이종성 단백질 도메인이 이러한 융합 단백질에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 가지 관점에 있어서, 두 융합 단백질(이들중의 한 융합 단백질은 하나 이상의 FRB 도메인을 함유하고, 다른 하나는 하나 이상의 FKBP 도메인을 함유한다)은 각각 하나 이상의 상이한 이종성 도메인, 즉, 그밖의 융합 단백질을 함유하지 않는 이종성 도메인을 함유한다. 예를들어, 특정의 구체예에 있어서, 하나의 융합 단백질은 하나 이상의 DNA 결합 도메인을 함유하고 다른 융합 단백질은 전사 활성화 도메인을 함유한다. 융합 단백질의 리간드 중재된 관련성은 전사 인자 복합체의 형성을 나타내며 하나의 융합 단백질상에서 DNA-결합 도메인에 의해 인식(즉, 결합할 수 있는)된 DNA 서열에 결합된 표적 유전자의 전사를 개시시킨다. 한 가지 구체예에 있어서, 융합 단백질중의 하나는 융합 단백질을 세포막 또는 핵등과 같은 특정의 세포 영역으로 유도할 수 있는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 세포막을 표적하는 위치화 도메인은 미리스토일화(myristoylation) 부위 또는 수용체 단백질 또는 막 스패닝 단백질의 트랜스막 영역과 같은 도메인을 포함한다. 그밖의 융합 단백질은 막 위치화 및/또는 클러스터화시에 세포 시그날 형질도입 경로를 활성화할 수 있는 시그날화 도메인을 함유한다. 시그날화 도메인의 예에는 성장 인자 또는 시토킨 수용체의 세포내 도메인, FAS 또는 TNFR1의 세포내 도메인과 같은 아폽토시스 개시 도메인, 및 SOS, Raf, lck, ZAP-70 등과 같은 그밖의 시그날화 단백질로부터 유도된 도메인이 포함된다. 많은 시그날화 단백질은 PCT/US94/01617(참조예 23 내지 26쪽)호에 개시되어 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 각각의 융합 단백질은 하나 이상의 FRB 도메인 및 하나 이상의 FRKB 도메인 뿐만 아니라 하나 이상의 이종성 도메인을 함유한다. 이러한 융합 단백질은 라파마이신 또는 라팔로그의 존재하에 단일 이합체화될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포 내생성의 펩티드 서열을 함유하는 도메인이 바람직하다. 따라서, 사람 유전자 치료를 위해서는 사람의 도메인이 특히 바람직하다.Various heterologous protein domains can be used for such fusion proteins. In one aspect of the invention, two fusion proteins, one of which contains one or more FRB domains and the other containing one or more FKBP domains, each of one or more different heterologous domains, i.e. It contains a heterologous domain that does not contain an outer fusion protein. For example, in certain embodiments, one fusion protein contains one or more DNA binding domains and the other fusion protein contains a transcriptional activation domain. Ligand mediated relevance of the fusion protein indicates the formation of a transcription factor complex and initiates the transcription of a target gene bound to a DNA sequence recognized (ie capable of binding) by a DNA-binding domain on one fusion protein. In one embodiment, one of the fusion proteins contains one or more domains capable of directing the fusion protein to a particular cellular region, such as a cell membrane or a nucleus. Localization domains that target cell membranes include domains such as myristoylation sites or transmembrane regions of receptor proteins or membrane spanning proteins. Other fusion proteins contain a signaling domain capable of activating cell signaling transduction pathways in membrane localization and / or clustering. Examples of signaling domains include apoptotic initiation domains, such as the intracellular domains of growth factors or cytokine receptors, the intracellular domains of FAS or TNFR1, and other signaling proteins derived from SOS, Raf, lck, ZAP-70, and the like. Domain is included. Many signaling proteins are disclosed in PCT / US94 / 01617 (Reference Examples 23-26). In another embodiment of the invention, each fusion protein contains one or more FRB domains and one or more FRKB domains as well as one or more heterologous domains. Such fusion proteins may be single dimerized in the presence of rapamycin or rapalog. Generally, domains containing peptide sequences of host cell endogenous are preferred. Thus, human domains are particularly preferred for human gene therapy.

융합 단백질을 코드화하는 재조합 DNA 분자가 또한 제공되는데, 이러한 분자는 특히 진핵세포에서 발현을 유도할 수 있는 벡터이다. 이러한 세포중 효모 및 동물 세포가 특히 바람직하다. 융합 단백질의 구성 성분을 보면, 융합 단백질을 코드하는 재조합 DNA 분자는 소정의 융합 단백질의 리간드 결합 도메인(FRB 도메인 또는 FKBP 도메인) 또는 그러한 도메인을 함유하는 단백질을 코드화하는 DNA 분자 및 이종성 도메인 또는 이종성 단백질 도메인이 유도되는 단백질을 코드화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성될 수 있다. 유전자 코드를 변성시키지 않으면서 혼성시킬 수 있는 DNA가 또한 본 발명에 포함된다.Also provided are recombinant DNA molecules encoding fusion proteins, which are vectors that can induce expression, particularly in eukaryotic cells. Of these cells, yeast and animal cells are particularly preferred. In view of the components of a fusion protein, a recombinant DNA molecule encoding a fusion protein is a DNA molecule and a heterologous or heterologous protein encoding a ligand binding domain (FRB domain or FKBP domain) of a given fusion protein or a protein containing such domain. The domain may be selectively hybridized to a DNA molecule encoding a protein from which it is derived. Also included in the present invention are DNAs that can hybridize without denaturing the genetic code.

본 발명의 키메라 단백질을 코드하는 DNA 서열 및 진핵세포내에서 이들의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 사용하면, 다양하게 사용될 수 있는 유전자 조작된 세포를 얻을 수 있다. 그렇게 하기 위해서는 바람직한 키메라 단백질의 진핵세포(바람직하게는 동물)에서 발현을 유도하는 발현 벡터 또는 DNA 구성물을 형성시키고, 이어서 재조합 DNA를 DNA가 흡수되는 방법으로 세포내로 도입하여, 적어도 세포의 일부에서 도입된 DNA를 발현시킨다. DNA를 세포내로 도입시켜 이종성 유전자를 발현시키는 다양한 방법 및 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 방법 및 물질은 공지되어 있고 시판중인 물질이다.Using DNA sequences encoding chimeric proteins of the invention and vectors capable of inducing their expression in eukaryotic cells, genetically engineered cells can be obtained that can be used in a variety of ways. To do so, it forms an expression vector or DNA construct that induces expression in the eukaryotic cell (preferably an animal) of the desired chimeric protein, and then introduces the recombinant DNA into the cell in such a way that the DNA is taken up and at least in part of the cell. Express the DNA. Various methods and materials for introducing DNA into cells to express heterologous genes can be used, and such methods and materials are known and commercially available materials.

따라서 본 발명의 한 가지 목적은 상기된 두 융합 단밸질을 코드화하는 재조합 DNA를 함유하는 동물 세포를 제공하는데 있다. 이러한 융합 단백질중 하나는 라파마이신 또는 라팔로그에 결합할 수 있고, 하나 이상의 FKBP 도메인 및 이에 이종인 하나 이상의 도메인을 함유한다. 제 2의 융합 단백질은 하나 이상의 FRB 도메인 및 이에 이종인 하나 이상의 도메인을 함유하며 제 1의 융합 단백질 및 하나 또는 둘의 라파마이신 또는 라팔로그와 함께 3 부분 복합체를 형성한다. 어떠한 구체예에 있어서, 하나의 융합 단백질에 존재하는 하나 이상의 이종성 도메인은 또한 다른 융합 단백질상에 존재한다. 즉, 두 융합 단백질은 하나 이상의 공통의 이종 도메인을 지닌다. 그밖의 구체예에 있어서, 각각의 융합 단백질은 하나 이상의 상이한 이종성 도메인을 함유한다.It is therefore an object of the present invention to provide animal cells containing recombinant DNA encoding the two fusion proteins described above. One such fusion protein is capable of binding rapamycin or rapalog and contains one or more FKBP domains and one or more domains heterologous thereto. The second fusion protein contains one or more FRB domains and one or more domains heterologous thereto and form a three part complex with the first fusion protein and one or two rapamycins or raphalogs. In some embodiments, one or more heterologous domains present in one fusion protein are also present on another fusion protein. That is, the two fusion proteins have one or more common heterologous domains. In other embodiments, each fusion protein contains one or more different heterologous domains.

본 발명의 특정의 목적은 세포를 라파마이신 또는 라팔로그와 접촉시키면 표적 유전자를 전사시키도록 조작된 동물 세포를 제공하는데 있다. 그러한 세포는 두 융합 단백질을 코드하는 재조합 DNA에 추가하여 DNA 서열에 작동적으로 결합된 표적 유전자를 포함하는 표적 유전자 구성물을 함유한다. 상기 DNA 서열은 융합 단백질과 라파마이신 또는 라팔로그와의 복합체의 존재에 반응적이다. 특정의 구체예에 있어서, 세포는 숙주 세포의 내생성 FKBP 또는 FRB 함유 단백질에 대한 결합에 대하여 검출할 수 있는 FKBP 융합 단백질과 FRB 융합 단백질에 결합하는 라팔로그와의 접촉에 반응적이다.It is a particular object of the present invention to provide animal cells engineered to transcribe target genes when the cells are contacted with rapamycin or raphalog. Such cells contain a target gene construct comprising a target gene operably linked to a DNA sequence in addition to the recombinant DNA encoding the two fusion proteins. The DNA sequence is reactive to the presence of a complex of a fusion protein with rapamycin or raphalog. In certain embodiments, the cell is responsive to contact of the FKBP fusion protein with a rapalog that binds to the FRB fusion protein that is detectable for binding to the endogenous FKBP or FRB containing protein of the host cell.

본 발명의 또다른 목적은 세포를 라파마이신 또는 라팔로그와 접촉시키면 세포의 치사를 개시하도록 조작된 동물 세포를 제공하는데 있다. 그러한 세포에서, 하나 이상의 융합 단백질상의 하나 이상의 이종성 도메인은 클러스터화되는 경우에 세포의 아폽토시스를 개시시키는 FAS 또는 TNF-R1의 세포내 도메인과 같은 도메인이다.Another object of the present invention is to provide an animal cell that has been engineered to initiate cell death when the cell is contacted with rapamycin or raphalog. In such cells, one or more heterologous domains on one or more fusion proteins are domains such as the intracellular domain of FAS or TNF-R1 that, when clustered, initiate apoptosis of the cell.

본 발명의 또다른 목적은 세포를 라파마이신 또는 라팔로그와 접촉시키면 세포의 성장, 분화, 또는 증식을 자극하도록 조작된 동물 세포를 제공하는데 있다. 그러한 세포에서, 하나 이상의 융합 단백질상의 하나 이상의 이종성 도메인은 세포 성장, 분화 또는 증식을 중재하는 호르몬에 대한 수용체의 세포내 도메인과 같은 도메인이다. 세포 성장, 분화 및/또는 증식은 수용체 세포내 시그날화 도메인을 클러스터화시키다. 그러한 클러스터화는 호르몬 결합에 의해 자연적으로 발생되며 라파마이신 또는 라팔로그와의 접촉에 따른 본 발명의 조작된 세포에서 발생된다.Another object of the present invention is to provide animal cells engineered to stimulate the growth, differentiation, or proliferation of cells when the cells are contacted with rapamycin or raphalog. In such cells, one or more heterologous domains on one or more fusion proteins are domains such as the intracellular domain of a receptor for hormones that mediate cell growth, differentiation or proliferation. Cell growth, differentiation and / or proliferation clusters the receptor intracellular signaling domains. Such clustering occurs naturally by hormonal binding and occurs in engineered cells of the invention following contact with rapamycin or rapalog.

다양한 세포류(사람 또는 그밖의 중)가 사용될 수 있고, 요구되는 경우 사람에게 사용될 수 있도록 생적합성 물질내에 캡슐화될 수 있지만, 사람의 세포가 사람의 유전자 치료에 바람직하다.Various cell types (human or otherwise) can be used and encapsulated in biocompatible materials for use in humans, if desired, but human cells are preferred for human gene therapy.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 조작된 세포를 생성시키는 물질 및 방법을 제공하는데 있다. 이러한 목적은 표적 유전자 구성물과 같은 어떠한 보조 재조합 DNA와 함께 융합 단백질을 코드화하는 재조합 DNA를 제공하고, 재조합 DNA를 세포에 의해 DNA가 흡수되는 조건하에 숙주 세포내로 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 그러한 형질감염은 배양물에 유지된 숙주세포를 사용한 세포외 방법으로 수행될 수 있다. 배양물에서 조작된 세포는 예를들어 생체내 유전자치료에서 숙주내로 도입될 수 있다. 그렇게 함으로써 라파마이신 또는 라팔로그의 존재에 반응(상기된 바와 같이)하는 숙주, 바람직하게는 사람 또는 비사람 포유동물을 제공하는 방법이 구성되는 것이다. 또한, 형질감염은 사람 또는 비사람 숙주에 존재하는 숙주 세포를 사용하여 생체내에서 수행될 수 있다. 그러한 경우에, DNA 분자는 하나 이상의 숙주 세포에 의해 DNA가 흡수되는 조건하에 숙주내로 직접 도입된다. 이러한 방법은 라파마이신 또는 라팔로그의 존재에 반응(상기된 바와 같이)하는 숙주, 바람직하게는 사람 또는 비사람 포유동물을 제공하는 또 다른 방법이다. 배양물에 또는 전체 유기체중의 세포에 DNA를 도입하는 다양한 물질 및 방법이 기술 분야에 공지되어 있으며 본 발명을 수행하는데 사용되도록 조작될 수 있다.It is still another object of the present invention to provide a material and a method for producing a cell which is engineered as described above. This object can be achieved by providing recombinant DNA encoding the fusion protein with any auxiliary recombinant DNA, such as a target gene construct, and introducing the recombinant DNA into a host cell under conditions where the DNA is taken up by the cell. Such transfection can be performed by extracellular methods using host cells maintained in culture. Cells engineered in culture can be introduced into the host, for example in gene therapy in vivo. Doing so constitutes a method of providing a host, preferably a human or non-human mammal, which responds (as described above) to the presence of rapamycin or rapalog. In addition, transfection can be performed in vivo using host cells present in human or non-human hosts. In such cases, the DNA molecule is introduced directly into the host under conditions where the DNA is taken up by one or more host cells. This method is another method of providing a host, preferably a human or non-human mammal, which responds (as described above) to the presence of rapamycin or rapalog. Various materials and methods for introducing DNA into cultures or into cells in whole organisms are known in the art and can be engineered to be used to carry out the present invention.

그밖의 목적은 상기와 같이 조작된 세포를 사용하여 달성된다. 예를들어, 한가지 방법으로는 상기된 바와 같이 조작된 세포를 라파마이신 또는 라팔로그가 융합 단백질과 복합체를 형성하도록 유효량의 라파마이신 또는 라팔로그와 접촉시킴으로써 본 발명의 융합 단백질을 다중화시키는 방법이 있다. 융합 단백질의 다중화가 표적 유전자의 전사를 개시시키는 구체예에서, 표적 유전자를 활성화시키는 방법이 구성된다. 융합 단백질이 하나 이상의 시그날화 도메인을 함유하는 구체예에서, 세포 시그날 형질도입 경로를 활성화하는 방법이 구성된다. 융합 단백질이 아폽토틱 세포 치사를 개시시키는 클러스터화시킬 수 있는 하나 이상의 도메인을 함유하는 구체예에서, 세포치사를 촉진하는 방법이 구성된다. 이러한 방법들은 세포 배양물 또는 사람환자를 포함한 전체 유기체에서 수행될 수 있다. 세포 배양물에서 수행하는 경우에, 라파마이신 또는 라팔로그는 배양 배지에 첨가된다. 전체 유기체에서 수행하는 경우에는, 라파마이신 또는 라팔로그(약제학적 또는 수의학적 조성물일 수 있다)는 전체 유기체에 투여되는데, 예를들어, 경구 또는 비경구등으로 투여된다. 바람직하게는, 동물에게 투여되는 라파마이신 또는 라팔로그의 용량은 투약자에서 바람직하지 않은 면역억제가 유발될 수 있는 용량 수준 이하이다.Another object is achieved using the cells engineered as above. For example, one method is to multiplex the fusion protein of the invention by contacting the engineered cells as described above with an effective amount of rapamycin or raphalog such that the rapamycin or rapalogue complexes with the fusion protein. . In embodiments in which multiplexing of the fusion protein initiates transcription of the target gene, a method of activating a target gene is constructed. In embodiments in which the fusion protein contains one or more signaling domains, a method of activating a cellular signal transduction pathway is constructed. In embodiments in which the fusion protein contains one or more clusterable domains that initiate apoptotic cell death, a method of promoting cell death is constructed. Such methods can be performed in whole organisms, including cell cultures or human patients. When performed in cell culture, rapamycin or raphalog is added to the culture medium. When performed in whole organisms, rapamycin or rapalog (which may be a pharmaceutical or veterinary composition) is administered to the whole organism, for example orally or parenterally. Preferably, the dose of rapamycin or rapalog administered to the animal is below the dose level at which unwanted immunosuppression can be induced in the doser.

본 발명의 또 다른 목적은 상기된 바와 같이 세포 또는 사람 또는 비사람 동물의 유전자를 조작하는데 사용되는 킷을 제공하는데 있다. 그러한 킷은 본 발명의 한 쌍의 융합 단백질을 코드화하는 재조합 DNA 구성물을 함유한다. 재조합 DNA 구성물은 동물 세포내로 도입되기에 적합하고 세포내에서 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 진핵 발현 백터의 형태일 수 있다. 그러한 킷은 또한 코드화된 융합 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 라파마이신 또는 라팔로그의 샘플을 함유할 수 있다. 이러한 키슨 또한 융합 단백질중의 하나에는 결합할 수 있지만 둘 모두와는 복합체를 형성할 수 없는 FK506 또는 어떠한 그밖의 화합물과 같은 다중화 길항제를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 융합 단백질을 코드화하는 재조합 DNA 구성물은 하나 이상의 이종성 도메인을 코드화하는 DNA 대신 클로닝 부위를 함유하여, 사용자가 이종성 도메인을 코드화하는 DNA를 도입시킬 수 있게 한다. 어떠한 구체예에서, 킷은 또한 이하 상세히 기술되는 바와 같이 복합화된 융합 단백질의 존재에 반응적인 DNA 서열에 결합된 표적 유전자 또는 클로닝 부위를 함유하는 표적 유전자 구성물을 함유할 수 있다.It is still another object of the present invention to provide a kit for use in manipulating genes of cells or human or non-human animals as described above. Such kits contain a recombinant DNA construct that encodes a pair of fusion proteins of the invention. Recombinant DNA constructs may be in the form of eukaryotic expression vectors suitable for introduction into animal cells and capable of inducing expression of fusion proteins in cells. Such kits may also contain a sample of rapamycin or rapalog that can form a complex with the encoded fusion protein. Such a kison may also contain multiplexing antagonists such as FK506 or any other compound that can bind to one of the fusion proteins but cannot form a complex with both. In certain embodiments, the recombinant DNA construct encoding the fusion protein contains a cloning site instead of the DNA encoding one or more heterologous domains, allowing the user to introduce DNA encoding the heterologous domain. In some embodiments, the kit may also contain a target gene construct containing a target gene or cloning site bound to a DNA sequence responsive to the presence of a complexed fusion protein as described in detail below.

Claims (45)

2종 이상의 재조합 DNA를 함유하는 동물 세포로서,An animal cell containing two or more recombinant DNAs, 제 1 재조합 DNA는 라파마이신 또는 이것의 유사체에 결합할 수 있고, 1종 이상의 라파마이신 결합 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 단백질 도메인을 포함하는 제 1 키메라 단백질을 코드화시키며, 여기에서 라파마이신 결합 도메인은 (i) 천연적으로 생성되는 FKBP 또는 이것의 일부, (ii) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FKBP의 변이체 및 (iii) 물질(i) 또는 (ii)의 FKBP를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FKBP로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하고;The first recombinant DNA is capable of binding rapamycin or an analog thereof, and encodes a first chimeric protein comprising at least one rapamycin binding domain and at least one protein domain heterologous thereto, wherein the rapamycin binding The domain comprises (i) a naturally occurring FKBP or portion thereof, (ii) a variant of naturally occurring FKBP which is deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents of up to 10 amino acid residues, and (iii) a substance. a peptide sequence selected from the group consisting of FKBPs encoded by DNA sequences that can optionally hybridize to the DNA sequences encoding FKBPs of (i) or (ii); 제 2 재조합 DNA는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 제 1 키메라 단백질과의 복합체를 형성할 수 있고, 1종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 포함하는 제 2 키메라 단백질을 코드화하며, 여기에서 FRB 도메인은 (iV) 천연적으로 생성되는 FRB 도메인, (V) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FRB의 변이체 및 (Vi) 물질(iV) 또는 (V)의 FRB를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FRB 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 동물 세포.The second recombinant DNA may form a complex with a rapamycin or rapamycin analogue and a first chimeric protein and encode a second chimeric protein comprising at least one FRB domain and at least one domain heterologous thereto, Wherein the FRB domain is (iV) a naturally occurring FRB domain, (V) a variant of the naturally occurring FRB in which up to 10 amino acid residues are deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and (Vi) substances An animal cell comprising a peptide sequence selected from the group consisting of a FRB domain encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding (iV) or (V) the FRB. 제 1항에 있어서, 제 1 키메라 단백질이 사람 FKBP12의 펩티드 서열; 5개 이하의 아미노산 치환기를 함유하는 상기 서열의 변이체; 또는 사람 FKBP12를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 동물 세포.The method of claim 1, wherein the first chimeric protein comprises: a peptide sequence of human FKBP12; Variants of the sequence containing up to 5 amino acid substituents; Or an animal cell comprising a peptide sequence selected from peptide sequences encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding human FKBP12. 제 2항에 있어서, 제 1 키메라 단백질이 사람 FKBP12의 Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42, Phe46, Phe48, Glu54, Val55 및 Phe99에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나, 아미노산 치환기로 치환된 FKBP 도메인을 포함하는 동물 세포.3. The FKBP domain of claim 2, wherein the first chimeric protein comprises one or more amino acid residues corresponding to Tyr26, Phe36, Asp37, Arg42, Phe46, Phe48, Glu54, Val55, and Phe99 of human FKBP12, or substituted with an amino acid substituent. Containing animal cells. 제 1항에 있어서, 제 2 키메라 세포가 사람 또는 쥐과 동물 FRAP의 Glu-2025 내지 Lys-2113; Tor1(에스. 세레비시아에)의 Glu-1962 내지 Arg-2050; Tor1(에스. 세레비시아에)의 펩티드 서열 Glu-1962 내지 Arg-2050; Tor2(에스. 세레비시아에)의 Glu-1965 내지 Lys-2053; 10개 이하의 아미노산 치환기, 결실 또는 삽입을 함유하는 상기 서열 중 어느 하나의 변이체; 또는 상기 펩티드 서열 중 어느 하나를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA에 의해 코드화된 펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 동물 세포.The method of claim 1, wherein the second chimeric cells comprise Glu-2025 to Lys-2113 of human or murine FRAP; Glu-1962 to Arg-2050 of Tor1 (S. cerevisiae); Peptide sequences Glu-1962 to Arg-2050 of Tor1 (S. cerevisiae); Glu-1965 to Lys-2053 from Tor2 (S. cerevisiae); A variant of any one of the above sequences containing up to 10 amino acid substituents, deletions or insertions; Or an animal cell comprising a peptide sequence selected from the group consisting of peptide sequences encoded by DNA that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding any of the peptide sequences. 제 4항에 있어서, 제 2 키메라 세포가 사람 FRAP의 Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, TrP2101 및 Asp2102에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나, 아미노산 치환기로 치환된 FRB 도메인을 포함하는 동물 세포.The animal cell of claim 4, wherein the second chimeric cell comprises a FRB domain wherein one or more amino acid residues corresponding to Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, TrP2101 and Asp2102 of a human FRAP are deleted or substituted with amino acid substituents. 제 1항에 있어서, 키메라 단백질 중 하나 이상이 막 편재화 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein at least one of the chimeric proteins contains a membrane localization domain. 제 1항에 있어서, 키메라 단백질 중 하나 이상이 사람의 펩티드 서열을 포함하는 이종성 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein at least one of the chimeric proteins contains a heterologous domain comprising a human peptide sequence. 제 1항에 있어서, 제 1 키메라 단백질이 2종 이상의 FKBP 도메이늘 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein the first chimeric protein contains two or more FKBP domains. 제 1항에 있어서, 제 2 키메라 단백질이 2종 이상의 FRB 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein the second chimeric protein contains two or more FRB domains. 제 1항에 있어서, 키메라 단백질 중 하나가 1종 이상의 DNA 결합 도메인을 함유하고, 나머지 키메라 단백질이 1종 이상의 전사 활성와 도메인을 함유하며, 세포가 DNA-결합 도메인을 결합시킬 수 있는 DNA 서열에 작용적으로 결합된 표적 유전자를 추가로 함유하는 동물 세포.The method of claim 1, wherein one of the chimeric proteins contains at least one DNA binding domain, the remaining chimeric protein contains at least one transcriptional activity and domain, and the cell acts on a DNA sequence capable of binding a DNA-binding domain. An animal cell further containing a target gene that is coupled to its target. 제 1항에 있어서, 키메라 단백질 중 하나 이상이 다중 결합시에 세포내 신호 자극 세포 성장, 분화, 증식, 아폽토시스 또는 유전자 발현을 개시할 수 있는 이종성 도메인을 포함하는 이종성 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein at least one of the chimeric proteins comprises a heterologous domain comprising a heterologous domain capable of initiating intracellular signal stimulating cell growth, differentiation, proliferation, apoptosis or gene expression upon multiple binding. 제 11항에 있어서, 이종성 도메인이 FAS 또는 TNF-R1의 세포내 도메인 또는 이것의 단편으로부터 유도된 펩티드 서열을 포함하는 동물 세포.The animal cell of claim 11, wherein the heterologous domain comprises a peptide sequence derived from an intracellular domain of FAS or TNF-R1 or a fragment thereof. 제 1항에 있어서, 2종의 키메라 단백질이 각각 1종 이상의 공통적인 이종성 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 1, wherein the two chimeric proteins each contain one or more common heterologous domains. 제 13항에 있어서, 2종의 키메라 단백질이 각각, 다중 결합시에 세포내 신호 자극 세포 성장, 분화, 증식, 아폽토시스 또는 유전자 발현을 개시할 수 있는 도메인을 함유하는 동물 세포.The animal cell of claim 13, wherein the two chimeric proteins each contain a domain capable of initiating intracellular signal stimulating cell growth, differentiation, proliferation, apoptosis or gene expression upon multiple binding. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 2종의 키메라 단백질이 동일하고, 다중 결합시에 세포내 신호를 자극하는 동물 세포.The animal cell according to any one of claims 11 to 14, wherein the two chimeric proteins are identical and stimulate intracellular signals upon multiple binding. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람으로부터 유래되는 동물 세포.The animal cell according to any one of claims 1 to 15, which is derived from a human. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 적합성 물질 내에 캡슐화되는 동물 세포.The animal cell of claim 1, encapsulated in a biocompatible material. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따르는 동물 세포를 함유하는 비-사람 세포.Non-human cell containing an animal cell according to any one of claims 1 to 17. 세포에 의한 DNA 흡수를 제공하는 조건하에서 키메라 단백질을 코드화시키는 1종 이상의 DNA 분자를 숙주 동물 세포에 도입시키는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따르는 동물 세포를 생성시키는 방법.19. A method of producing an animal cell according to any one of claims 1 to 18, comprising introducing into a host animal cell at least one DNA molecule encoding a chimeric protein under conditions providing DNA uptake by the cell. 제 19항에 있어서, DNA 결합에 결합된 표적 유전자를 코드화시키는 DNA 유전자를 세포내에 도입시켜서, 키메라 단백질의 결합에 반응하여 표적 유전자를 전사시키는 것을 추가로 포함하는 방법.20. The method of claim 19, further comprising introducing a DNA gene encoding a target gene bound to DNA binding into the cell, thereby transcribing the target gene in response to binding of the chimeric protein. 1종 이상의 동물 세포에 의한 DNA의 흡수를 제공하는 조건하에서 키메라 단백질을 코드화시키는 1종 이상의 DNA 분자를 동물 체내에 도입시키는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따르는 동물 세포를 생성시키는 방법.An animal cell according to any one of claims 1 to 16 comprising introducing into the animal body at least one DNA molecule encoding a chimeric protein under conditions providing uptake of the DNA by at least one animal cell. How to generate. 동물 체내에 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따르는 세포를 도입시키는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따르는 세포를 함유하는 동물을 생성시키는 방법..18. A method of producing an animal containing a cell according to any one of claims 1 to 17, comprising introducing a cell according to any one of claims 1 to 17 into an animal body. 키메라 단백질과의 복합체를 생성시킬 수 있는 조건하에서, 세포를 유효량의 마파마이신 또는 적합한 라파마이신 유사체를 접촉시키는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따르는 세포에서 키메라 단백질을 다중 결합시키는 방법.18. A method of multiplexing a chimeric protein in a cell according to any one of claims 1 to 17, which comprises contacting the cell with an effective amount of mapamycin or a suitable rapamycin analog, under conditions capable of producing a complex with the chimeric protein. How to combine. 제 23항에 있어서, 세포를 하기 화학식의 라파마이신과는 상이한 화합물과 접촉시키는 방법 :The method of claim 23, wherein the cell is contacted with a compound different from rapamycin of the formula: 상기 식에서,Where U는 -H, -OR1, -SR1, -OC(O)R1, -OC(O)NHR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NH-SO2-R1 또는 -NH-SO2-R2(여기에서, R2는 치환된 아릴, 알릴 또는 알킬아릴임)이고,U is -H, -OR1, -SR1, -OC (O) R1, -OC (O) NHR1, -NHR1, -NHC (O) R1, -NH-SO2-R1 or -NH-SO2-R2 (here R 2 is substituted aryl, allyl or alkylaryl, V는 -OR3 또는 (=O)이고,V is -OR3 or (= O), W는 =O, =NR4, =NOR4, =NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC(O)R4, -OC(O)NR4 또는 -H이고,W is = O, = NR4, = NOR4, = NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC (O) R4, -OC (O) NR4 or -H, Y는 -OR5, -O(O)R5 또는 -OC(O)NHR5이고,Y is -OR5, -O (O) R5 or -OC (O) NHR5, Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, -OC(O)R6 또는 -OC(O)NR6이고,Z is = O, -OR6, -NR6, -H, -NC (O) R6, -OC (O) R6 or -OC (O) NR6, R3는 H, -R7, -C(O)NHR7 또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이고,R3 is H, -R7, -C (O) NHR7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate, R4는 H 또는 알킬이고,R 4 is H or alkyl, 여기에서, R1, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 H, 알킬, 알킬아릴 또는 아릴로 구성된 군으로부터 선택된다.Wherein R 1, R 4, R 5, R 6 and R 7 are independently selected from the group consisting of H, alkyl, alkylaryl or aryl. 키메라 단백질의 이합체화에 반응성인 표적 유전자 구성물을 세포를 함유하는 제 10항, 11항 또는 제 14항 중 어느 한 항에 따르는 세포에서 표적 유전자의 전사를 활성화시키는 방법으로서, 세포를 유전자 발현을 제공하기에 유효한 양으로 키메라 단백질과의 복합체를 형성시킬 수 있는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.A method of activating the transcription of a target gene in a cell according to any one of claims 10, 11 or 14 containing the target gene construct responsive to dimerization of chimeric proteins, the cell providing gene expression. A method comprising contacting rapamycin or a rapamycin analog capable of forming a complex with a chimeric protein in an amount effective below. 제 25항에 있어서, 세포를 하기 화학식의 라파마이신과는 상이한 화합물과 접촉시키는 방법 :The method of claim 25, wherein the cell is contacted with a compound different from rapamycin of the formula: 상기 식에서,Where U는 -H, -OR1, -SR1, -OC(O)R1, -OC(O)NHR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NH-SO2-R1 또는 -NH-SO2-R2(여기에서, R2는 치환된 아릴, 알릴 또는 알킬아릴임)이고,U is -H, -OR1, -SR1, -OC (O) R1, -OC (O) NHR1, -NHR1, -NHC (O) R1, -NH-SO2-R1 or -NH-SO2-R2 (here R 2 is substituted aryl, allyl or alkylaryl, V는 -OR3 또는 (=O)이고,V is -OR3 or (= O), W는 =O, =NR4, =NOR4, =NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC(O)R4, -OC(O)NR4 또는 -H이고,W is = O, = NR4, = NOR4, = NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC (O) R4, -OC (O) NR4 or -H, Y는 -OR5, -O(O)R5 또는 -OC(O)NHR5이고,Y is -OR5, -O (O) R5 or -OC (O) NHR5, Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, -OC(O)R6 또는 -OC(O)NR6이고,Z is = O, -OR6, -NR6, -H, -NC (O) R6, -OC (O) R6 or -OC (O) NR6, R3는 H, -R7, -C(O)NHR7 또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이고,R3 is H, -R7, -C (O) NHR7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate, R4는 H 또는 알킬이고,R 4 is H or alkyl, 여기에서, R1, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 H, 알킬, 알킬아릴 또는 아릴로 구성된 군으로부터 선택된다.Wherein R 1, R 4, R 5, R 6 and R 7 are independently selected from the group consisting of H, alkyl, alkylaryl or aryl. 세포를 복합체를 형성시키기에 유효한 양으로 키메라 단백질과의 복합체를 형성시킬 수 있는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따르는 세포에서 신호 변환 경로를 작용시키기 위한 방법.A signal transduction in a cell according to any one of claims 11 to 14, comprising contacting the cell with a rapamycin or rapamycin analog capable of complexing with the chimeric protein in an amount effective to form the complex. Method for acting on the pathway. 제 27항에 있어서, 세포를 하기 화학식의 라파마이신과는 상이한 화합물과 접촉시키는 방법 :The method of claim 27, wherein the cell is contacted with a compound different from rapamycin of the formula: 상기 식에서,Where U는 -H, -OR1, -SR1, -OC(O)R1, -OC(O)NHR1, -NHR1, -NHC(O)R1, -NH-SO2-R1 또는 -NH-SO2-R2(여기에서, R2는 치환된 아릴, 알릴 또는 알킬아릴임)이고,U is -H, -OR1, -SR1, -OC (O) R1, -OC (O) NHR1, -NHR1, -NHC (O) R1, -NH-SO2-R1 or -NH-SO2-R2 (here R 2 is substituted aryl, allyl or alkylaryl, V는 -OR3 또는 (=O)이고,V is -OR3 or (= O), W는 =O, =NR4, =NOR4, =NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC(O)R4, -OC(O)NR4 또는 -H이고,W is = O, = NR4, = NOR4, = NNHR4, -NHOR4, -NHNR4, -OR4, -OC (O) R4, -OC (O) NR4 or -H, Y는 -OR5, -O(O)R5 또는 -OC(O)NHR5이고,Y is -OR5, -O (O) R5 or -OC (O) NHR5, Z는 =O, -OR6, -NR6, -H, -NC(O)R6, -OC(O)R6 또는 -OC(O)NR6이고,Z is = O, -OR6, -NR6, -H, -NC (O) R6, -OC (O) R6 or -OC (O) NR6, R3는 H, -R7, -C(O)NHR7 또는 C-28/C-30 고리형 탄산염이고,R3 is H, -R7, -C (O) NHR7 or C-28 / C-30 cyclic carbonate, R4는 H 또는 알킬이고,R 4 is H or alkyl, 여기에서, R1, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 H, 알킬, 알킬아릴 또는 아릴로 구성된 군으로부터 선택된다.Wherein R 1, R 4, R 5, R 6 and R 7 are independently selected from the group consisting of H, alkyl, alkylaryl or aryl. 다중 결합시에 아폽토시스를 자극할 수 있는 이종성 도메인을 함유하는 1종 이상의 키메라 단백질을 함유하는 제 11항, 제 12항, 제 14항 및 제 15항 중 어느 한 항에 따르는 세포에서 세포 사멸을 수행하는 방법으로서, 세포를 키메라 단백질과의 복합체를 형성시키기에 유효한 양으로 키메라 단백질과의 복합체를 형성시킬 수 있는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.Performing cell death in cells according to any one of claims 11, 12, 14 and 15 containing one or more chimeric proteins containing heterologous domains that can stimulate apoptosis upon multiple binding A method comprising: contacting a cell with rapamycin or a rapamycin analog capable of forming a complex with a chimeric protein in an amount effective to form a complex with the chimeric protein. 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배양기에서 성장시키고, 접촉을 배양기에 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 첨가하여 수행하는 방법.30. The method of any one of claims 23-29, wherein the cells are grown in the incubator and the contacting is performed by adding rapamycin or rapamycin analog to the incubator. 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 숙주 유기체 중에 존재하고, 접촉이 숙주 유기체에 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 투여하여 수행되는 방법.The method of any one of claims 23-29, wherein the cells are in the host organism and the contacting is performed by administering rapamycin or rapamycin analog to the host organism. 제 31항에 있어서, 숙주 유기체가 포유동물이고, 라파마이신형 화합물이 이에 대한 적절한 약제 또는 수의학적 부형제 중에서 경구, 구강, 설하선, 경피, 피하, 근내, 정맥내, 관절내 또는 흡입 투여에 의해 투여되는 방법.32. The method of claim 31 wherein the host organism is a mammal and the rapamycin type compound is administered by oral, buccal, sublingual, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarticular or inhaled administration in a suitable pharmaceutical or veterinary excipient thereto. How to be. 숙주 동물 세포에 2종 이상의 재조합 DNA를 도입시키는 것을 포함하여 라파마이신 또는 라파마이신 유사체에 반응성인 동물 세포를 제공하는 방법으로서,A method of providing an animal cell that is reactive to rapamycin or a rapamycin analog, including introducing two or more recombinant DNAs into a host animal cell, 제 1 재조합 DNA는 라파마이신 또는 이것의 유사체에 결합할 수 있고, 1종 이상의 라파마이신 결합 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 단백질 도메인을 포함하는 제 1 키메라 단백질을 코드화시키며, 여기에서 라파마이신 결합 도메인은 (i) 천연적으로 생성되는 FKBP 또는 이것의 일부, (ii) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FKBP의 변이체 및 (iii) 물질(i) 또는 (ii)의 FKBP를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FKBP로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하고;The first recombinant DNA is capable of binding rapamycin or an analog thereof, and encodes a first chimeric protein comprising at least one rapamycin binding domain and at least one protein domain heterologous thereto, wherein the rapamycin binding The domain comprises (i) a naturally occurring FKBP or portion thereof, (ii) a variant of naturally occurring FKBP which is deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents of up to 10 amino acid residues, and (iii) a substance. a peptide sequence selected from the group consisting of FKBPs encoded by DNA sequences that can optionally hybridize to the DNA sequences encoding FKBPs of (i) or (ii); 제 2 재조합 DNA는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 제 1 키메라 단백질과의 복합체를 형성할 수 있고, 1종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 포함하는 제 2 키메라 단백질을 코드화하며, 여기에서 FRB 도메인은 (iV) 천연적으로 생성되는 FRB 도메인, (V) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FRB의 변이체 및 (iii) 물질(iV) 또는 (V)의 FRB를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FRB 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 방법.The second recombinant DNA may form a complex with a rapamycin or rapamycin analogue and a first chimeric protein and encode a second chimeric protein comprising at least one FRB domain and at least one domain heterologous thereto, Wherein the FRB domain is (iV) a naturally occurring FRB domain, (V) a variant of a naturally occurring FRB in which up to 10 amino acid residues are deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and (iii) substances A peptide comprising a peptide sequence selected from the group consisting of FRB domains encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding (iV) or (V) the FRB. 숙주 동물의 1종 이상의 세포의 형질감염을 제공하는 조건하에, 숙주 포유 동물에 2종 이상의 재조합 DNA를 도입시키는 것을 포함하여, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체에 반응성인 포유동물을 제공하는 방법으로서,A method of providing a mammal that is responsive to rapamycin or a rapamycin analog, comprising introducing two or more recombinant DNAs into a host mammal under conditions that provide for transfection of one or more cells of the host animal. 제 1 재조합 DNA는 라파마이신 또는 이것의 유사체에 결합할 수 있고, 1종 이상의 라파마이신 결합 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 단백질 도메인을 포함하는 제 1 키메라 단백질을 코드화시키며, 여기에서 라파마이신 결합 도메인은 (i) 천연적으로 생성되는 FKBP 또는 이것의 일부, (ii) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FKBP의 변이체 및 (iii) 물질(i) 또는 (ii)의 FKBP를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FKBP로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하고;The first recombinant DNA is capable of binding rapamycin or an analog thereof, and encodes a first chimeric protein comprising at least one rapamycin binding domain and at least one protein domain heterologous thereto, wherein the rapamycin binding The domain comprises (i) a naturally occurring FKBP or portion thereof, (ii) a variant of naturally occurring FKBP which is deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents of up to 10 amino acid residues, and (iii) a substance. a peptide sequence selected from the group consisting of FKBPs encoded by DNA sequences that can optionally hybridize to the DNA sequences encoding FKBPs of (i) or (ii); 제 2 재조합 DNA는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 제 1 키메라 단백질과의 복합체를 형성할 수 있고, 1종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 포함하는 제 2 키메라 단백질을 코드화하며, 여기에서 FRB 도메인은 (iv) 천연적으로 생성되는 FRB 도메인, (v) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FRB의 변이체 및 (vi) 물질(iv) 또는 (v)의 FRB를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FRB 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 방법.The second recombinant DNA may form a complex with a rapamycin or rapamycin analogue and a first chimeric protein and encode a second chimeric protein comprising at least one FRB domain and at least one domain heterologous thereto, Wherein the FRB domain is (iv) a naturally occurring FRB domain, (v) a variant of a naturally occurring FRB in which up to 10 amino acid residues are deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and (vi) substances or (v) a peptide sequence selected from the group consisting of FRB domains encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding a FRB of (v). 숙주 포유동물에 2종 이상의 재조합 DNA를 함유하는 세포를 도입시키는 것을 포함하는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체에 반응성인 포유동물을 제공하는 방법으로서,A method of providing a mammal responsive to rapamycin or a rapamycin analog comprising introducing a cell containing two or more recombinant DNAs into a host mammal, 제 1 재조합 DNA는 라파마이신 또는 이것의 유사체에 결합할 수 있고, 1종 이상의 라파마이신 결합 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 단백질 도메인을 포함하는 제 1 키메라 단백질을 코드화시키며, 여기에서 라파마이신 결합 도메인은 (i) 천연적으로 생성되는 FKBP 또는 이것의 일부, (ii) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FKBP의 변이체 및 (iii) 물질(i) 또는 (ii)의 FKBP를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FKBP로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하고;The first recombinant DNA is capable of binding rapamycin or an analog thereof, and encodes a first chimeric protein comprising at least one rapamycin binding domain and at least one protein domain heterologous thereto, wherein the rapamycin binding The domain comprises (i) a naturally occurring FKBP or portion thereof, (ii) a variant of naturally occurring FKBP which is deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents of up to 10 amino acid residues, and (iii) a substance. a peptide sequence selected from the group consisting of FKBPs encoded by DNA sequences that can optionally hybridize to the DNA sequences encoding FKBPs of (i) or (ii); 제 2 재조합 DNA는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 제 1 키메라 단백질과의 복합체를 형성할 수 있고, 1종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 포함하는 제 2 키메라 단백질을 코드화하며, 여기에서 FRB 도메인은 (iv) 천연적으로 생성되는 FRB 도메인, (v) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FRB의 변이체 및 (vi) 물질(iv) 또는 (v)의 FRB를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FRB 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 방법.The second recombinant DNA may form a complex with a rapamycin or rapamycin analogue and a first chimeric protein and encode a second chimeric protein comprising at least one FRB domain and at least one domain heterologous thereto, Wherein the FRB domain is (iv) a naturally occurring FRB domain, (v) a variant of a naturally occurring FRB in which up to 10 amino acid residues are deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and (vi) substances or (v) a peptide sequence selected from the group consisting of FRB domains encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding a FRB of (v). 라파마이신 또는 이것의 유사체에 결합할 수 있고, 1종 이상의 라파마인신 결합 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 단백질 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 킷으로서,A kit comprising a protein capable of binding rapamycin or an analog thereof and comprising at least one rapamycin binding domain and at least one protein domain heterologous thereto, 라파마이신 결합 도메인은 (i) 천연적으로 생성되는 FKBP 또는 이것의 일부, (ii) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FKBP의 변이체 및 (iii) 물질(i) 또는 (ii)의 FKBP를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FKBP로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하고;Rapamycin binding domains include (i) naturally occurring FKBPs or portions thereof, (ii) variants of naturally occurring FKBPs having up to 10 amino acid residues deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and ( iii) a peptide sequence selected from the group consisting of FKBP encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding a FKBP of substance (i) or (ii); 제 2 재조합 DNA는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 제 1 키메라 단백질과의 복합체를 형성할 수 있고, 1종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 포함하는 제 2 키메라 단백질을 코드화하며, 여기에서 FRB 도메인은 (iv) 천연적으로 생성되는 FRB 도메인, (v) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 아미노산 치환기로 치환된 천연적으로 생성되는 FRB의 변이체 및 (iv) 물질(v) 또는 (vi)의 FRB를 코드화시키는 DNA 서열에 선택적으로 혼성될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드화된 FRB 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 킷.The second recombinant DNA may form a complex with a rapamycin or rapamycin analogue and a first chimeric protein and encode a second chimeric protein comprising at least one FRB domain and at least one domain heterologous thereto, Wherein the FRB domain is (iv) a naturally occurring FRB domain, (v) a variant of naturally occurring FRB in which up to 10 amino acid residues are deleted, inserted, or substituted with amino acid substituents, and (iv) substances A kit comprising a peptide sequence selected from the group consisting of FRB domains encoded by a DNA sequence that can optionally hybridize to a DNA sequence encoding a FRB of (v) or (vi). 제 36항에 있어서, 키메라 단백질과의 복합체를 형성시킬 수 있는 라파마이신 도는 라파마이신 유사체를 추가로 포함하는 킷.The kit of claim 36, further comprising a rapamycin or rapamycin analog capable of forming a complex with the chimeric protein. 제 36항에 있어서, 다중 결합 길항 물질을 추가로 포함하는 킷.The kit of claim 36, further comprising multiple binding antagonists. 제 36항에 있어서, 키메라 단백질 및 라파마이신 또는 라파마이신 유사체에 의해 형성된 복합체에 반응성인 전사 조절 요소에 결합된 표적 유전자를 함유하는 1종 이상의 표적 유전자 구성물을 추가로 포함하는 킷.37. The kit of claim 36, further comprising at least one target gene construct containing a target gene bound to a chimeric protein and a transcriptional regulatory element responsive to the complex formed by the rapamycin or rapamycin analog. 제 35항에 있어서, 1종 이상의 DNA 구성물이 이종성 도메인 대신에 클로닝 자를 함유하는 킷.36. The kit of claim 35, wherein the one or more DNA constructs contain cloning elements instead of heterologous domains. 제 36항에 있어서, 표적 유전자 구성물이 표적 유전자 대신에 클로닝 부위를 함유하는 킷.The kit of claim 36, wherein the target gene construct contains a cloning site in place of the target gene. 1종 이상의 FRB 도메인, 및 FAS의 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 서열을 함유하는 1종 이상의 도메인을 함유하는 융합 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 구성물.A recombinant DNA construct encoding a fusion protein containing at least one FRB domain and at least one domain containing a peptide sequence selected from the peptide sequences of the FAS. 2종 이상의 FRB 도메인 및 이에 대해 이종성인 1종 이상의 도메인을 함유하는 융합 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 구성물.A recombinant DNA construct that encodes a fusion protein containing two or more FRB domains and one or more domains heterologous thereto. 1종 이상의 FRB 도메인 및 세포 편재화 도메인을 함유하는 융합 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 구성물.A recombinant DNA construct encoding a fusion protein containing at least one FRB domain and a cell localization domain. FKBP 도메인 함유 단백질과 함께 라파마이신 보다 우선적으로 라파마이신 유사체와의 3성분 복합체를 형성시키는 1종 이상의 FRB 도메인을 함유하는 융합 단백질을 코드화시키는 재조합 DNA 구성물.A recombinant DNA construct encoding a fusion protein containing at least one FRB domain that, together with a FKBP domain containing protein, preferentially forms a tricomponent complex with rapamycin analogs.
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