KR19980703889A - 임파구 인터페론 조절 인자 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 - Google Patents

임파구 인터페론 조절 인자 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 Download PDF

Info

Publication number
KR19980703889A
KR19980703889A KR1019970707290A KR19970707290A KR19980703889A KR 19980703889 A KR19980703889 A KR 19980703889A KR 1019970707290 A KR1019970707290 A KR 1019970707290A KR 19970707290 A KR19970707290 A KR 19970707290A KR 19980703889 A KR19980703889 A KR 19980703889A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lsirf
nucleic acid
seq
sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1019970707290A
Other languages
English (en)
Inventor
토시후미 마츠야마
알렉스 그로스만
크리스토퍼 디. 리차드슨
Original Assignee
호지 린다 제이
암젠 캐나다 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 호지 린다 제이, 암젠 캐나다 인코포레이티드 filed Critical 호지 린다 제이
Publication of KR19980703889A publication Critical patent/KR19980703889A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

LSIRF로 명명된 신규의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시된다. 또한 이 폴리펩티드의 제조 방법 및 그의 용도도 역시 개시된다.

Description

임파구 인터페론 조절 인자 폴리펩티드를 코딩하는 유전자
유전자 발현의 조절은 몇 가지 다른 수준에서 일어날 수 있으나, 유전자-특이성 전사 인자의 활성화가 이 과정에서 가장 중요한 것으로 고려된다. 전사 인자의 한 종류인 인터페론 조절인자(IRFs)는 4개의 구성원으로 구성된다 : IRF-1, IRF-2, ISGF3γ, 및 ICSBP. 4개의 IRFs 모두는 반복된 트립토판 영역을 포함하는 강하게 보존된 N-말단 DNA-결합 영역을 특징으로 한다 (Veals et al., Mol. Cell. Bio., 12 : 3315-3324 [1992]).
인터페론 조절 인자 -1(IRF-1) 및 -2(IRF-2)는 원래 사람 인터페론-베타(IFN-β) 유전자의 전사 조절 연구에서 확인되었다 (Miyamoto et al., Cell, 54 : 903-913 [1988] 및 Harada et al., Cell, 58 : 729-739 [1989]). cDNA 발현 연구에, IRF-1는 IFN과 IFN-유도 유전자의 전사적 활성화제로서 기능하는 반면, IRF-2는 IRF-1의 효과를 억제한다는 것이 알려졌다 (Fujita et al., Nature, 337 : 270-272 [1989] 및 Harada et al., Cell, 63 : 303-312 [1990]). 최근의 분석에서는 IRF-1이 종양 억제 유전자로서, 그리고 IRF-2가 잠재적 종양원(oncogene)으로서 작용할 수 있음을 보여주었다 (Harada et al., Science, 259 : 971-974 [1993]). IRF-1 발현은 I형(α/β) 및 II형(γ) IFNs에 의하여 유도되고 (Miyamoto et al., Cell, 54 : 903-913 [1998] ; Kanno et al., Mol. Cell. Bio., 13 : 3951-3963 [1993]), 반면에 IRF-2는 I형 IFNs에 의하여 구조적으로 발현 및 유도된다 (Harada et al., Cell, 58 : 729-739 [1989]).
인터페론-자극 유전 인자 -3 감마(ISGF3γ)는 IFN-γ-유도성 단백질로, I형 IFNs에 의하여 잠복성 사이토졸형으로부터 활성화되는 ISGF3α 서브유니트와 결합한다 (Levy et al., EMBO J., 9 : 1105-1111 [1990] ; Levy et al., New Biologist, 2 : 383-392 [1990]). 결합하게 되면, 이 복합체는 핵으로 이주하여, ISRE(IFN-자극 반응 요소)로 알려진 IFN-유도성 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 특정 DNA 서열과 결합하는 것으로 나타났다 (Veals et al., Mol. Cell. Bio., 12 : 3315-3324 [1992]). 최근, ISGF3α 서브유니트 91/84 kDa 및 113 kDa이 클로닝되고 (Schindler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 7836-7839 [1992] ; Fu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 7840-7843 [1992]), 각각 전사-1(Stat-1) 및 -2(Stat-2)의 신호 변환제 및 활성화제로서 고안되었는데, 이들은 I형 IFN/IFN-수용체 결합후 JAK 키나제 인산화의 표적이 된다 (Shuai et al., Science, 261 : 1744-1746 [1993] ; Darnell et al., Science, 261 : 1415-1421 [1994]).
인터페론 교감 서열 결합 단백질(ICSBP) 역시 IFN-γ-유도성 단백질로, 원래 뮤린 MHC 클래스 I, H-2LD유전자 프로모터의 ISRE 모티브(ICS라고 하기도 함)를 인식하는 단백질로서 분리되었다 (Driggers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3743-3747 [1990]). 그러나, IRF-1, IRF-2 및 ISGF3γ와 달리 ISCBP는 마그로파지와 임파구 계열의 세포 내에서 배타적으로 유도되어, 발현의 조직-제한 양상을 나타낸다 (Driggers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3743-3747 [1990]). 최근의 연구에서는 ISCBP가 IFN 및 IFN-유도성 유전자의 유도에서 IRF-1의 효과를 길항하는데 있어서 IRF-2와 유사한 역할을 하는 것으로 제안되었다 (Weisz et al., J. Biol. Chem., 267 : 25589-25596 [1992] ; Nelson et al., Mol. Cell. Biol., 13 : 588-599 [1993]). 인터페론-유도성 유전자의 ISREs는 IRF-1 및 -2에 의하여 인식되는 DNA서열 IRF-E와 중복된다 (Tanaka et al., Mol. Cell. Biol. 13 : 4531-4538 [1993]). 매우 최근, ISFG3γ는 IRF-β 유전자의 IRF-Es에 결합하는 것을 보여주었다 (Kawakami et al., FEBS Letters, 358 : 225-229 [1995]).
인터페론 유전자 및 다른 유전자의 발현 조절에 있어서 IRFs의 중요성에 비추어, 본 분야에서는 다른 IRFs, 특히 조직 특이성 IRFs를 확인할 필요성이 있다.
따라서, IRF 유전자 계열의 신규 구성원을 확인하는 것이 본 발명의 목적이다.
다른 목적은 본 분야에서 통상을 지식을 갖는 자에게 명백할 것이다.
(발명의 요약)
본 발명은 임파구 특이성 인터페론 조절 인자를 코딩하는 신규 핵산 분자를 제공한다. 이 분자는 이전에 IRF-3 분자로 호칭되던 것으로, 현재 LSIRF 분자로 불리우던 것으로, 이 용어는 LSIRF 분자와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하나의 양상으로서 ;
a) 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
b) 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
c) 서열 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 이중 Q 변이체 ;
d) 서열 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
e) 서열 25의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 이중 Q 변이체 ; 및
f) (a), (b), (c), (d), (e)의 핵산 분자, 또는 그의 절편과 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 ;
LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 숙주 세포 내에서 이들 핵산 분자의 발현 산물인 폴리펩티드를 더욱 제공한다.
또한, 본 발명은 LSIRF 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의적으로, 이 항체는 모노클론 항체이다.
본 발명은 다른 양상으로서, LSIRF 폴리펩티드의 특이적 DNA 결합 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 또는 그의 절편을 제공한다.
본 발명은 또 다른 양상으로서, LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또 다른 양상으로서, LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또 다른 양상으로서, 분리된 LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편을 제공하는데 ; 이 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 양상으로서, 외원성 LSIRF 핵산 서열의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 발현 산물인 LSIRF 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 LSIRF 발현을 허용하는 조건하에서 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 LSIRF 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 DNA 결합 활성을 갖는 신규 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 이전에 IRF-3 폴리펩티드로 불리우던 것으로, 현재는 LSIRF 폴리펩티드(임파구 특이성 인터페론 조절인자)로 불리우며, 인터페론 조절 인자로 알려진 폴리펩티드류의 새로운 구성원이다.
도 1은 마우스 LSIRF cDNA 핵산 서열 전제를 나타내고,
도 2는 마우스 LSIRF 폴리펩티드 아미노산 서열 전체를 나타내고,
도 3은 마우스 LSIRF 유전자 5' 측 서열을 나타내고,
도 4는 마우스 LSIRF 게놈 DNA 서열을 나타내고,
도 5는 마우스의 여러 조직 유래 RNA의 노던 블롯을 나타낸다. 이 블롯은 LSIRF 전사를 확인하기 위하여 방사성 표지된 LSIRF 탐사체(prove)를 가지고 탐사된다. 전사체의 크기를 나타내는 RNA 염기쌍 표지는 좌측에 나타난다. 리보솜 RNA를 가지는 아가로스 겔의 사진도 보여진다.
도 6은 자극제 없이 (-) 또는 표시된 자극제로 처리된 마우스 임파구 유래 RNA의 노던 블롯을 나타낸다. 이 블롯은 LSIRF 전사를 유동하는 자극제를 확인하기 위하여 방사성 표지된 LSIRF 탐사체를 가지고 탐사된다. 방사성 표지된 베타액틴 탐사체로 탐사된 동일한 블롯도 보여진다.
도 7은 자극제 없이(-) 또는 표시된 하나 또는 그 이상의 자극제로 처리되고 방사성 표지된 LSIRF 탐사체로 탐사된 마우스 비장세포의 노던 블롯을 나타낸다. 방사성 표지된 베타 액틴 탐사체로 탐사된 동일한 노던 블롯도 보여진다.
도 8은 자극제 없이(-) 또는 표시된 자극제로 처리되고 방사성 표지된 LSIRF 탐사체로 탐사된 마우스 비장세포의 노던 블롯을 나타낸다. 방사성 표지된 베타 액틴 탐사체로 탐사된 동일한 노던 블롯도 보여진다.
도 9는 마우스 MHC ISRE의 LSIRF 결합에서의 겔 쉬프트 결합 분석을 나타낸다. 대조군인 바큘로바이러스로 형질감염된 SF9 인섹트 세포(레인2) 또는 LSIRF 유전자를 함유하는 바큘로바이러스로 형질감염된 SF9 세포(레인 3-12)로부터의 핵 추출물을 방사성 표지된 마우스 MHC ISRE 탐사체와 지시된 경쟁자 DNA 절편(경쟁자 절편의 서열은 표 1에 나타낸다) 양자와 함게 배양하였다. 레인 1 및 13은 방사성 표지된 MHC ISRE 탐사체만을 포함한다.
도 10은 단일 Q 형태인 사람 LSIRF의 코딩 영역의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다(서열 24). 이중 Q 형태는 아미노산 163과 아미노산 164의 코돈 사이에 삽입되는 아미노산 Q(Glu)를 코딩하는 추가 코돈을 갖는다.
도 11은 도 10의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 사람 LSIRF(서열 25)의 아미노산 서열의 추정 단일 Q 형태를 나타낸다. 이중 Q 형태는 아미노산 163과 아미노산 164 사이에 삽입되는 추가 아미노산 Q(Glu)를 갖는다.
용어 IRF-3 및 LSIRF는 여기에서 호환적으로 사용되고 동일한 핵산 서열 및 아미노산 서열을 의미하고 ; LSIRF의 단일 Q 및 이중 Q 형태 양자는 이 정의에 포함된다 (실시예 5 참조).
여기에서 사용되는 용어 생물학적 활성은 뮤린 MHCI ISRE, 사람 ISG54와 같은 ISRE(인터페론 자극 반응 요소)형 DNA 절편 및/또는 ISREm1 또는 ISREm4(이들의 서열은 표 1에 나타내었다)와 같은 ISRE 변이체와 결합하는, 어떠한 원료로부터 유도된 전체 길이 폴리펩티드 또는 그의 절편을 의미한다. 생물학적 활성 폴리펩티드 또는 그의 절편은 도 2 및 25에 나타낸 LSIRF 폴리펩티드와 같은 전체 길이 LSIRF 폴리펩티드에 대하여 형성시킨, 그리고 이들과 반응하는 항체(폴리클론 또는 모노클론)와 면역학적 교차 반응성을 갖는 폴리펩티드 또는 절편도 포함한다.
여기에서 사용되는 용어 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 은 숙주 세포 게놈 DNA의 일부 또는 독립된 분자로서(예를 들어 염색체 외적으로) 숙주 세포로 삽입되어, 숙주 세포 내에 존재하고 숙주 세포 내에서 유지 및 증식되어 숙주 세포의 연속 세대를 통하여 전달되는 핵산 분자를 의미한다.
용어 합성 DNA는 화합 합성 방법에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생산된 핵산 분자를 의미한다.
용어 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA 시스템 형태인 핵산 분자 증식, 복제, 및/또는 발현의 매개체를 의미하는데, 여기에서 플라스미드 또는 바이러스 DNA는 세균, 효모, 무척추 동물, 및/또는 포유 동물 숙주 세포와 기능할 수 있다. 벡터는 숙주 세포 게놈 DNA에 독립적으로 남거나 게놈 DNA에 전체적 또는 부분적으로 통합될 수 있다. 벡터는 화합할 수 있는 어떠한 숙주 세포 내에서도 기능하도록 하기 위해 필요한 모든 요소를 포함할 것이다. 이러한 요소들은 다음에 나타낸다.
본 발명의 하나의 양상에서 LSIRF 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 이 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 얻고, 이 핵산 분자를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 양립가능한 숙주 세포에 삽입하고, 숙주 세포내에서 LSIRF 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 LSIRF 폴리펩티드를 정제하는 것에 의하여 제조될 것이다.
1. LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 제조
LSIRF를 코딩하는 핵산 분자는, 화학적 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝, 및/또는 cDNA의 PCR 증폭을 포함하여 제한되지 않는 여러 가지 방법으로 쉽게 얻을 수 있다. 이러한 DNA를 분리하는데 유용한 이들 및 다른 방법은, 예를 들어 샘브룩 등 (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), 오수벨 등(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]), 그리고 버저 및 킴멜(Berger and Kimmel, Methods in Enzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987])에 의하여 제시되어 있다. LSIRF를 코딩하는 바람직한 핵산 서열은 포유류의 서열이다. LSIRF를 코딩하는 가장 바람직한 핵산 서열은 사람, 래트 및 마우스이다.
LSIRF 핵산 분자의 화학적 합성은 본 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 엥겔스 등 (Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716-734 [1989])에 의하여 제시된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 이들 방법에는, 그 중에서도 포스포트리에스테르, 포스포아미다이트 및 H-포스포네이트 핵사 합성 방법이 포함된다. 전형적으로, LSIRF 폴리펩티드 전체 길이를 코딩하는 핵산 분자는 길이가 수백 염기쌍(bp) 또는 뉴클레오티드가 될 것이다. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 큰 핵산은 각각 길이가 100 뉴클레오티드까지 되는 몇 개의 절편을 합성하고, 다음에 이들 절편을 하기에 기술하는 것과 같이 함께 연결하여 LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 전체 길이 핵산을 형성할 수 있다. 바람직한 방법은 표준 포스포아미다이트 케미스트리를 사용하는 폴리머-지지 합성법이다.
또는, LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 적절한 cDNA 라이브러리(즉, 폴리펩티드를 발현하는 것으로 믿어지는 하나 또는 그 이상의 조직 원료로부터 얻어진 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리(전 게놈 DNA로부터 얻어진 라이브러리)를 스크리닝하는 것에 의하여 얻어질 수 있다. cDNA 라이브러리 원료는 보통 LSIRF를 상당한 양으로 발현하는 것으로 믿어지는 어떠한 종류로부터 얻은 조직(임파구 조직과 같은)이 된다. 게놈 라이브러리 원료는 LSIRF 또는 LSIRF 동족체를 코딩하는 유전자가 정박된 것으로 믿어지는 어떠한 포유류 또는 다른 종으로부터 얻은 어떠한 조직도 될 수 있다. 라이브러리는 라이브러리 내에 존재하는 LSIRF 또는 LSIRF 동족체 cDNA(s) 또는 유전자와 선택적으로 하이브리드되는, 하나 또는 그 이상의 핵산 탐사체(LSIRF 또는 LSIRF 동족체 cDNA와 허용될 수 있는 수준의 동종성을 갖는 올리고뉴클레오티드, cDNA 또는 게놈 DNA절편 또는 클로닝된 유전자)를 사용하여 LSIRF cDNA/유전자의 존재를 스크리닝 할 수 있다. 통상적으로 이러한 라이브러리 스크리닝에 사용되는 탐사체는 그 라이브러리가 얻어지는 종과 동일하거나 유사한 종 유래 LSIRF DNA 서열의 작은 영역을 코딩한다. 또는 탐사체는 하기에 논의되는 바와 같이 축퇴될 수도 있다.
라이브러리 스크리닝은 통상적으로, 탐사체 또는 프라이머와 상당한 수준의 동종성을 갖는 클론의 결합을 허용하면서 비-특이적 결합을 방지하는 수렴 조건하에, 올리고뉴클레오티드 탐사체 또는 cDNA를 라이브러리 내에 있는 클론에 어닐링하는 것에 의하여 달성된다. 통상적인 하이브리드화 및 세척 수렴 조건은 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 탐사체의 크기(즉, 길이로 된 뉴클레오티드의 수), 및 탐사체의 축퇴 여부에 부분적으로 의존한다. 클론을 얻을 확률은 또한 하이브리드화 용액의 고안에서도 고려된다(즉, cDNA 또는 게놈 라이브러리가 스크리닝되는 여부 ; 만약 cDNA 라이브러리라면 문제의 cDNA가 존재할 확률이 높다).
DNA 절편(cDNA와 같은)이 탐사체로 사용되는 경우 전형적인 하이브리드화 조건은, 예를 들어 오수벨 등 (eds., supra)에서 제안된 바와 같다. 하이브리드화 이후, 라이브러리를 포함하는 블롯은 탐사체 크기, 예상되는 탐사체와 클론의 동종성, 스크리닝되는 라이브러리 형태, 스크리닝되는 클론의 수 등 몇가지 인자에 따라 적절한 수렴 조건에서 세척된다. 수렴 세척 용액(보통 이온강도가 낮고 비교적 높은 온도에서 사용된다)의 예는 다음과 같다. 이러한 수렴 세척의 하나는 55-65℃에서 0.015M NaCl, 0.005M 구연산나트륨 및 0.1% SDS인 것이다. 다른 수렴 완충액은 40-50℃에서 1mM Na2EDTA, 40mM NaHPO4, pH 7.2, 및 1% SDS인 것이다. 다른 수렴 세척의 하나는 약 50-65℃에서 0.2X SSC 및 0.1% SDS이다.
올리고뉴클레오티드 탐사체가 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용되는데 있어서, 예를 들어 다음과 같은 수렴 세척 조건의 두 가지 프로토콜이 사용될 수 있다. 첫 번째 프로토콜은 탐사체 길이에 따라 약 35 내지 62℃ 사이의 온도에서 0.05% 피로인산나트륨을 함유하는 6X SSC를 사용하는 것이다. 예를 들어, 14 염기 탐사체는 35-40℃에서, 17 염기 탐사체는 45-50℃에서, 20 염기 탐사체는 52-57℃에서, 그리고 23 염기 탐사체는 57-63℃에서 세척된다. 온도는 배경 비-특이적 결합이 높은 것처럼 보일 때 2-3℃ 높일 수 있다. 두 번째 프로토콜은 세척용으로 테트라메틸암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이다. 이러한 수렴 세척 용액의 하나는 3M TMAC, 50mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 0.2% SDS 인 것이다. 이 용액에 사용되는 세척 온도는 탐사체 길이의 함수이다. 예를 들어, 17 염기 탐사체는 약 45-50℃에서 세척된다.
LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 얻는 다른 적절할 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. 이 방법에서, 폴리(A)+RNA 또는 총 RNA는 LSIRF를 발현하는 조직(임파구 조직과 같은)으로부터 추출된다. 다음에 역전사효소를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 제조한다. 다음에 통상 LSIRF cDNA의 두 개의 분리된 영역과 상보적인 두 개의 프라이머(올리고뉴클레오티드)가 Taq 폴리머라제와 같은 폴리머라제와 함께 cDNA에 첨가되고, 이 폴리머라제는 두 개의 프라이머 사이의 cDNA 영역을 증폭시킨다.
LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제조하기 위해 선택되는 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 탐사체의 사용을 필요로 하는데 있어서(예를 들어 PCR, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝), 탐사체 또는 프라이머로서 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열은 라이브러리 스크리닝 또는 PCR 증폭중 일어날 비-특이적 결합의 양을 최소화하기 위하여 적절한 길이이고 충분히 명백한 것이어야 한다. 탐사체 또는 프라이머의 실제 서열은 보통 다른 유기체와 동일 또는 유사한 유전자로부터 보존되거나 고도로 유사한 서열 또는 영역에 기초한다. 임의적으로, 탐사체 또는 프라이머는 완전히 또는 부분적으로 축퇴될 수 있는데, 즉 전체가 동일한 아미노산 서열을 코딩하지만 다른 코돈을 사용하는 탐사체/프라이머의 혼합물을 포함할 수 있다. 축퇴된 탐사체를 제조하는 대안은 종에 따라 변화되는 이들 코돈 위치의 일부 또는 전부에 이노신을 위치시키는 것이다. 올리고뉴클레오티드 탐사체 또는 프라이머는 위에 기술한 바와 같이 DNA 화학 합성 방법에 의하여 제조될 수 있다.
LSIRF 변이체 또는 변형체의 서열은 본 발명의 범위 내로 사료된다. 여기서에 사용하는 변이체 또는 변형체 서열은 야생형 아미노산 서열에 비하여 아미노산 서열 변형을 야기하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삭제, 및/또는 삽입을 포함하는 서열이다. 어떤 경우, 자연적 대립형질변형의 존재에 기인하여 자연적으로 발생하는 LSIRF 아미노산 변이체 또는 변형체가 존재할 수도 있다. 이렇게 자연적으로 발생하는 변이체도 역시 본 발명의 범위에 들어온다. 합성 변이 체 서열의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 웰즈 등(Wells et al., Gene, 34 : 315 [1985]) 및 샘브룩 등(supra)에 기재되어 있다.
2. LSIRF 폴리펩티드 5' 측 서열의 제조
어떠한 종으로부터 유래된 LSIRF 5' 측 서열(이하 프로모터로도 언급됨)이라도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 여기에서 사용되는 프로모터는 LSIRF 유전자의 5' 측 서열을 의미한다. 5' 측 서열은 여러 가지 전사 인자 결합 부위를 갖고, 또한 약 -30 위치에 TATA 박스, 및 TATA 박스로부터 상향 위치에 CCAAT 박스를 가질 수 있다. 이러한 5' 측 서열은 증진 요소, 억제 요소 및 이와 유사한 다른 인자(매우 원위적으로 위치할 수도 있는 모든 것)와 협조하거나 단독으로, 생체 내에서 LSIRF 유전자의 전사를 자연적으로 조절한다는 특징이 있다. 바람직한 5' 측 서열은 포유류 LSIRF 5' 측 서열이다. 가장 바람직한 것은 사람 LSIRF 5' 측 서열이다.
본 발명의 5' 측 서열은 바람직하게 LSIRF 유전자의 5' 부분과 하이브리드되는 cDNA 또는 게놈 LSIRF 절편으로 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 게놈 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 이러한 절편 LSIRF 5' 절편 서열의 일부 또는 전체를 포함하는 라이브러리 내에 있는 클론과 하이브리드 될 수 있는데, 이것은 일반적으로 LSIRF를 위한 코딩 서열의 개시 바로 5'에 위치한다. 확인된 클론은 프로모터의 일부 만을 포함하는데, 클론 자신 또는 그의 절편이 추가의 5' 측 서열을 얻기 위한 게놈 라이브러리 스크리닝의 후속 단계에 사용될 수 있다. 절편으로 스크리닝하는 것은(하이브리드화 및 세척을 포함하여) LSIRF 유전자 및/또는 cDNA를 클로닝하기 위한 상기 기재된 바에 따라 달성될 수 있다.
3. LSIRF 발현을 위한 벡터의 제조
클로닝후, LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 cDNA 또는 유전자를 분리하고, 통상적으로 적절한 숙주 세포 내에서 유전자의 복제수를 증가시키고/증가시키거나 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 이것을 증폭 및/또는 발현 벡터 내로 삽입한다. 비록 맞춤 벡터도 사용될 수 있지만, 종종 시판되는 벡터가 사용된다. 벡터는 채용된 특수한 숙주 세포 내에서 기능적인 것이 선택된다(즉, 벡터는 LSIRF 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 일어날 수 있도록 숙주 세포 장치와 양립할 수 있어야 한다). LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편은 원핵 세포, 효모, 인섹터(바큘로바이러스 시스템) 및/또는 진핵 세포 숙주 내에서 증폭/발현될 수 있다. 숙주 세포의 선택은 적어도 부분적으로는, LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편이 글리코실화된 것인가 여부에 의존한다. 그렇다면, 효모, 인섹트 또는 포유류 숙주 세포가 바람직한데 ; 효모 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 것이고, 인섹트 및 포유류 세포는 LSIRF 폴리펩티드 상에 천연적으로 존재하는 것과 같이 폴리펩티드를 글리코실화 및/또는 포스포릴화할 수 있다(즉, 천연 글리코실화 및/또는 포스포릴화).
통상적으로, 어떠한 숙주 세포에도 사용되는 벡터는 5' 측 서열과, 증진 요소, 복제 요소원, 전사 종료 요소, 공여자 및 수용자 접합 부위를 포함하는 완전인트론 서열, 시그널 펩티드 서열, 리보솜 결합 부위 요소, 폴리아데닐화 서열, 발현되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택 가능한 표지 요소와 같은 다른 조절 요소도 포함할 것이다. 임의적으로, 벡터는 tag 서열, 즉 LSIRF 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는, 폴리 His(헥사 His와 같은)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열, 또는 다른 작은 면역원성 서열을 포함할 수 있다. 이 태그는 단백질을 따라 발현될 것이고, 숙주 세포로부터 LSIRF 폴리펩티드의 정제를 위한 친화성 태그로서 작용할 수 있다. 임의적으로, 이 태그는 예를 들어 선택된 펩티다제를 사용하는 것과 같은 여러 가지 수단에 의해 정제된 LSIRF 폴리펩티드로부터 후속적으로 제거될 수 있다.
A. 5' 측 서열 요소
5' 측 서열은 동종성(즉, 숙주 세포로서 동일한 종(species) 및/또는 스트레인(strain) 유래의), 이종성(즉, 숙주 세포 종 또는 스트레인과 다른 종 유래의), 하이브리드(즉, 한가지 이상 유래의 p5' 측면 서열의 조합), 합성된 것일 수 있고, 천연의 LSIRF 5' 측 서열일 수 있다. 이와 같이 5' 측 서열의 원료는, 5' 측 서열이 숙주 세포 장치 내에서 기능적이고 활성화 될 수 있다면 어떠한 단일세포 원핵 또는 진핵 유기체, 어떠한 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 어떠한 식물일 수도 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 5' 측 서열은 본 분야에서 잘 알려진 몇 가지 방법의 어느 것에 의해서도 얻어질 수 있다. 통상적으로, 여기에서 유용한 LSIRF 5' 측 서열과 다른 5' 측 서열은 맵칭 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 미리 확인될 것이고 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 조직원으로부터 분리될 수 있다. 어떤 경우, 5' 측 서열의 완전한 뉴클레오티드 서열은 알려져 있을 수 있다. 여기에서, 5' 측 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위한 상기에서 기술한 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
5' 측 서열의 전체 또는 일부 만이 알려져 있으면 PCR을 사용하여, 및/또는 동일 또는 다른 종 유래의 적절한 올리고뉴클레오티드 및/또는 5' 측 서열 절편을 가지고 게놈 라이브러리를 스크리닝 하는 것에 의하여 얻어질 수 있다.
5' 측 서열이 알려져 있지 않으면, 동일한 5' 측 서열을 포함하는 DNA의 절편을, 예를 들어 코딩 서열 또는 다른 유전자 또는 유전자들을 포함할 수 있는 보다 큰 DNA 조각으로부터 분리할 수 있다. 적절한 DNA 절편을 분리하기 위하여 주의깊게 선택된 하나 또는 그 이상의 효소를 사용하는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의하여 분리할 수 있다. 분해후, 원하는 절편을 아가로스 겔 정제, QiagenR칼럼 또는 본 분야의 숙련자에게 알려진 다른 방법에 의하여 분리할 수 있다. 이 목적을 달성하기 위한 적절한 효소의 선택은 본 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 명백할 것이다.
B. 복제 요소원
이 성분은 통상적으로 시판되는 원핵 발현 벡터의 일부이고 숙주 세포 내에서 벡터의 증폭을 돕는다. 어떤 복제수까지 벡터를 증폭하는 것은, 어떤 경우 LSIRF 폴리펩티드의 최적 발현을 위하여 중요할 수 있다. 선택된 벡터가 복제 위치원을 포함하지 않는다면, 알려진 서열에 기초하여 이를 화학적으로 합성하고 벡터에 연결할 수 있다.
C. 전사 종결 요소
이 요소는 통상적으로 LSIRF 폴리펩티드 코딩 서열의 말단 3' 에 위치하고 LSIRF 폴리펩티드의 전사를 종결시키도록 작용한다. 보통, 원핵 세포에서 전사 종결 요소는 폴리 T 서열에 이어 G-C가 풍부한 절편이다. 이 요소는 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 벡터의 일부로서 시판되며, 위에서 기술한 바와 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다.
D. 선택 가능한 표지 요소
선택 가능한 표지 유전자는 선택된 배지 내에서 자라는 숙주 세포의 생존 및 성장을 위해 필요한 단백질을 코딩한다. 통상적인 선택 표지 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포를 위해서는, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신과 같은 항생물질 또는 다른 독소에 대한 저항성을 부여하고, (b) 세포의 향정상성 결핍을 보충하고, (c) 복잡한 배지로부터 얻을 수 없는 필수 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선택 가능한 표지는 카나마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 및 테트라사이클린 저항성 유전자이다.
E. 리보솜 결합부위 요소
이 요소는 보통 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵세포) 또는 코자크(Kozak) 서열(진핵세포)로 불리는 것으로 mRNA의 번역 개시에 필수적이다. 이 요소는 통상적으로 프로모터의 3' 및 합성되는 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 에 위치한다. 샤인-달가노 서열은 변화되지만 통상적으로 폴리퓨린(즉, 고 A-G 함량을 갖는)이다. 많은 샤인-달가노 서열이 확인되었고, 이들 각각은 위에서 언급된 방법을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다.
위에서 언급된 이들 요소 전부는 본 발명에 유용한 다른 것과 마찬가지로 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 샘브룩 등 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) 및 버거 등 eds. (Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987])에 기술된 것이다.
F. 시그널 서열 요소
전이유전자(transgene)가 분비되는 본 발명의 태양에서는, 그것이 합성되는 세포 밖에서 전이유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 지시하기 위하여 시그널 서열이 종종 존재한다. 통상적으로, 시그널 서열은 코딩 영역의 5' 말단에 또는 5' 말단을 향하여 전이유전자의 코딩 영역 내에 위치한다. 많은 시그널 서열이 확인되었으며, 이들 중 전이유전 조직 내에서 기능하는 어느 것이라도 전이유전자와 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 시그널 서열은 전이유전자와 동종성 또는 이종성일 수 있으며, 전이유전 포유류에 동종성 또는 이종성일 수 있다. 또는, 시그널 서열이 위에 언급된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 그러나, 여기에서의 목적을 위하여 바람직한 시그널 서열은 전이유전자와 함께 천연적으로 존재하는 것(즉, 전이유전자와 동종성인 것)이다.
G. 인트론 요소
많은 경우, 전이유전자의 전사는 벡터 상에 하나 또는 이보다 많은 인트론의 존재에 의하여 증가된다. 인트론은 전이유전자 서열 내에, 특히 전이유전자가 전체 길이이거나 또는 게놈 DNA 서열의 절편인 곳에 천연적으로 존재할 수 있다. 인트론이 DNA 서열 내에 천연적으로 존재하지 않을 경우(대부분의 cDNA와 같이), 인트론은 다른 원료로부터 얻어질 수 있다. 인트론은 전이유전자 및/또는 전이유전 포유류와 동종성 또는 이종성일 수 있다. 인트론은 유효하게 되기 위해서는 전사되어야 하기 때문에, 프로모터와 전이유전자에 대한 인트론의 위치는 중요하다. 이처럼, 전이유전자가 cDNA 서열인 곳에서 인트론을 위한 바람직한 위치는 전사 개시 위치의 3' 및 폴리 A 전사 종결 서열의 5' 이다. cDNA 전이유전자를 위하여 바람직하게는, 인트론은 전이유전자 서열을 방해하지 않도록 전이유전자의 한 쪽 또는 다른 쪽(즉, 5' 또는 3')에 위치할 것이다. 어떠한 바이러스, 원핵 및 진핵(식물 또는 동물) 유기체라도 포함하는 어떠한 원료 유래의 인트론이라도, 그것이 삽입되는 숙주 세포와 양립할 수 있다면 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 또한 여기에는 합성 인트론도 포함된다. 임의적으로, 하나 이상의 인트론이 벡터 내에 사용될 수 있다.
H. 벡터의 제작
위에 언급된 하나 또는 그 이상의 요소가 사용되는 벡터 내에 이미 존재하지 않을 경우, 이들을 개별적으로 얻어 벡터 내에 연결할 수 있다. 각 요소를 얻기 위하여 사용되는 방법은 본 분야에 숙련자에게 잘 알려져 있고 위에서 언급한 방법(즉, DNA 합성, 라이브러리 스캐닝 등과 같은)과도 비교된다.
본 발명을 실시하기 위하여 사용되는 최종 벡터는 통상적으로 시판되는 벡터와 같은 출발 벡터로부터 제작된다. 이 벡터는 완성된 벡터 내에 삽입되는 요소의 일부를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 만약 요망되는 요소의 아무 것도 출발 벡터 내에 존재하지 않는다면, 연결될 요소의 말단과 벡터의 말단이 연결을 위해 적합하게 되도록 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 벡터를 절단함으로써 각 요소를 개별적으로 벡터에 연결할 수 있다. 어떤 경우, 만족스러운 연결을 얻기 위해서는 함께 연결될 말단을 블런트하게 만들 필요가 있을 수도 있다. 블런팅은 먼저 4개 뉴클레오티드 전부의 존재중에서 클레나우 DNA 폴리머라제 또는 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 점성 말단을 채우는 것에 의하여 달성된다. 이 방법은 본 분야에 잘 알려진 것이고 예를 들어 샘브룩 등(supra)에 기재되어 있다.
또는, 벡터 내로 삽입되는 두 개 또는 그 이상의 요소가 먼저 함께 연결되고 (만약 그들이 서로 인접하여 위치한다면) 다음에 벡터에 연결할 수도 있다.
벡터를 제작하는 다른 하나의 방법은 하나의 반응 혼합물 내에서 동시에 여러 가지 요소들의 연결을 수행하는 것이다. 여기에서, 요소들의 부적절한 연결 또는 삽입으로 인하여 많은 무의미하거나 비기능성 벡터가 발생될 것이나, 제한 엔도뉴클라아제 분해에 의하여 기능성 벡터를 확인 및 선택할 수 있다.
본 발명을 실시하기 위하여 바람직한 벡터는 박테리아, 인섹트, 및 포유류 숙주 세포와 양립할 수 있는 것들이다. 이러한 벡터에는 그 중에서도 pCRII (invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA), 및 pETL (BlueBacII ; Invitrogen)가 포함된다.
벡터가 제작되고 LSIRF 핵산이 벡터의 적절한 부위로 삽입된 후, 완성된 벡터는 증폭 및/또는 LSIRF 폴리펩티드 발현을 위하여 적절한 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 통상적으로 사용되는 숙주 세포에는 다음이 제한없이 포함된다 : 그람 음성 또는 그람 양성 세포와 같은 원핵 세포, 즉 대장균(E. coli), 바실러스, 스트렙토 마이세스, 사카로마이세스, 살모넬라 등의 어떠한 스트레인 ; CHO (Chinese hamster ovary) 세포, 사람 신장 293 세포, COS-7 세포와 같은 진핵 세포 ; Sf4, Sf5, Sf9 및 Sf21과 High 5(모두 Invitrogen Company, San Diego, CA)와 같은 인섹트 세포 ; 및 사카로마이세스 및 피키아와 같은 효모 세포.
선택된 숙주 세포 내로 벡터를 삽입하는 것(형질전환 또는 형질감염이라고도 함)은 염화칼슘, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 리포펙션 또는 DEAE-덱스트란 법과 같은 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용되는 숙주 세포 종류의 함수가 될 것이다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법은 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고 예를 들어 샘브룩 등 (supra)에 언급되어 있다.
벡터를 포함하는(즉, 형질전환 또는 형질감염된) 숙주 세포는 본 분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 배지는 보통 세포의 성장 및 생존에 필요한 모든 영양소를 포함할 것이다. 대장균 세포를 배양하기 위한 적절한 배지는 예를 들어 루리아 브로스(LB) 및/또는 테리픽 브로스(TB)이다. 진핵 세포를 배양하는데 적절한 배지는 RPMI 1640, MEM, DMEM으로, 이들은 모두 배양되는 특정 세포주에 요구되는 혈청 및/또는 성장 인자가 보충될 수 있다. 인섹트 배양을 위한 적절한 배지는 필요에 따라 이스톨레이트, 락트알부민 가수분해물, 및/또는 송아지 태아 혈청이 보충된 그레이스 배지이다.
통상적으로, 형질전환된 세포 만의 선택적 성장을 위하여 유용한 항생물질 또는 다른 화합물이 배지에 추가제로서 첨가된다. 사용되는 화합물은 숙주 세포가 형질전환된 플라스미드 상에 존재하는 선택가능한 표지 요소에 의하여 지시될 것이다. 예를 들어, 선택 가능한 표지 요소가 카나마이신 저항성인 경우 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신일 것이다.
4. 발현의 평가
숙주 세포 내에서 생산된 LSIRF 폴리펩티드의 양은 본 분야에 알려진 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법에는 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비-변성 겔 전기영동, HPLC 분리, 면역침전, 및/또는 DNA 결합 겔 쉬프트 분석과 같은 활성 분석이 제한 없이 포함된다.
5. LSIRF 폴리펩티드의 정제
LSIRF 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되도록 고안되었다면, 대부분의 폴리펩티드는 세포 배양 배지 중에서 발견될 것이다. 그러나, 만약 LSIRF 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되지 않는다면 세포질 내(진핵세포, 그럼 양성 박테리아 및 인섹트 숙주 세포) 또는 페리플라즘 내(그람 음성 박테리아 숙주 세포)에 존재할 것이다.
세포내 LSIRF는, 먼저 숙주 세포를 기계적 또는 삼투적으로 분쇄하여 세포질 내용물을 완충액으로 유리시킨다. 이어서 LSIRF 폴리펩티드를 이 용액으로부터 분리한다.
용액으로부터 LSIRF 폴리펩티드를 정제하는 것은 다양한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 만약 폴리펩티드가 그의 카복실 또는 아미노 말단에 헥사히스티딘(LSIRF/헥사 His) 또는 다른 작은 펩티드와 같은 태그를 포함하도록 합성되었다면, 이 용액을 칼럼 매트릭스가 태그 또는 폴리펩티드와 직접 높은 친화성을 갖는(즉, LSIRF를 특별히 인식하는 모노클론 항체) 친화 칼럼을 통과시키는 것에 의하여 일단계 과정으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈과 높은 친화성 및 특이성을 갖고 결합하므로 ; 니켈의 친화 칼럼(Qiagen 니켈 칼럼 같은 것)이 LSIRF/폴리His 정제에 사용될 수 있을 것이다 (예를 들어, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10. 11. 8, John Wiley $ Sons, New York [1993]).
LSIRF 폴리펩티드가 태그를 갖지 않고 활용 가능한 항체가 없을 경우, 다른 알려진 정제방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법에는 이온 교환 크로마토그래피, 분자 체(sieve) 크로마토 그래피, HPLC, 겔 용출과 조합된 천연 겔 전기영동, 및 예비 등전점 포커싱(preparative isoelectric focusing ; isoprime machine/technique, Hoefer Scientific)이 제한없이 포함된다. 어떤 경우에는, 순도를 증진시키기 위하여 이들 기술의 두가지 또는 그 이상을 조합할 수도 있다. 바람직한 정제 방법은 예비 등전점 포커싱과 조합된 폴리히스티딘 태그화 및 이온 교환 크로마토그래피이다.
만약 LSIRF 폴리펩티드가 박테리아의 페리플라즘 또는 진핵세포의 세포질 (cytoplasm) 내에서 일차적으로 발견된다면, 폴리펩티드가 이러한 복합체를 형성할 경우 봉입체(박테리아)를 포함하는 페리플라즘 또는 세포질의 내용물을 본 분야의 숙련자에게 알려진 어떠한 표준 기술을 사용해서도 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 프렌치 프레스, 균질화, 및/또는 초음파 처리에 의해 용해되어 페리플라즘의 내용물이 유리될 수 있다. 다음에 균질화물은 원심분리될 수 있다.
만약 LSIRF 폴리펩티드가 페리플라즘 내에 봉입체를 형성한다면, 이 봉입체는 종종 내부 및/또는 외부 세포 멤브레인과 결합되어 원심분리후 펠렛 물질 중에서 우세하게 발견될 것이다. 다음에 펠렛 물질을 구아니딘 또는 우레아와 같은 케이오트로픽(chaotropic) 시약으로 처리하여 봉입체를 유리, 분해 및 가용화시킬 수 있다. 그 안에서 이제 가용상태로 된 LSIRF 폴리펩티드를 겔 전기영동, 면역 침전 등을 사용하여 분석할 수 있다. LSIRF 폴리펩티드를 분리할 것이 요망되면, 하기 및 마르스톤 등(Marston et al., Meth. Enz., 182 : 264-275 [1990])에 언급된 표준 방법을 사용하여 분리할 수 있다.
LSIRF 폴리펩티드 봉입체가 숙주 세포의 페리플라즘 내에 상당한 정도로 형성되지 않으면, LSIRF 폴리펩티드는 세포의 원심분리후 상등액 중에서 우세하게 발견될 것이고, LSIRF 폴리펩티드는 하기에 언급되는 방법을 사용하여 상등액으로부터 분리될 수 있다.
LSIRF 폴리펩티드를 부분적으로 또는 완전하게 분리하는 것이 바람직한 상황에서, 본 분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 방법을 사용함으로써 정제할 수 있다. 이러한 방법에는 전기 용출을 수반하는 전기 영동, 여러 가지 크로마토그래피(면역친화성, 분자 체, 및/또는 이온 교환), 및/또는 고압 액체 크로마토그래피에 의한 분리가 제한없이 포함된다. 어떤 경우, 완전한 정제를 위하여 이들 방법의 하나이상을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
여기에서 사용되는 용어 물질(substance)은 LSIRF 유전자의 전사, LSIRF mRNA의 번역 또는 LSIRF 폴리펩티드의 활성을 억제하는데 유용한 화합물을 의미한다.
용어 치료적으로 유효한은 원하는 생리적 반응을 얻기 위하여, 즉 항원 자극 또는 자동면역반응에 반응하는 임파구의 활성을 억제하거나, 또는 항원 자극에 대한 면역 반응을 자극하여 임파구 수를 증가시키기 위하여 요구되는 물질의 양을 의미한다.
용어 항원 자극은 포유류에서 천연적으로 발견되어(내연성) 몇가지 면역 반응의 양상을 나타내거나, 또는 외원성 원료 유래이고 포유류 시스템을 공격하여 몇가지 면역 반응의 양상을 나타내는 화합물을 의미한다.
본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 조성은 본 분야에서 통상의 지식을 갖는 자에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 제조될 수 있다.
(치료적 항-LSIRF 항체)
본 발명을 실시하는데 유용한 폴리클론 또는 모노클론 치료적 항-LSIRF 항체는 다음 방법을 사용하여 실험 동물 중에서 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 표적 아미노산 서열을 포함하는 LSIRF 분자 또는 그의 절편에 대한 폴리클론 항체는, 보통 프로인드 보조제(완전 또는 불완전)와 같은 보조제와 조합하여 LSIRF 분자를 피하(sc) 또는 복강내(ip)에 복수회 주사하는 것에 의하여 동물 중에 형성된다. 면역원성을 높이기 위하여, 먼저 표적 아미노선 서열을 포함하는 LSIRF 분자 또는 절편을 면역화되는 종에서 면역원성이 있는 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 억제제에 이관능성 시약 또는 유도성 시약, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드(리진잔기를 통하여), 글루타르알데히드, 숙신 안하이드라이드, SOCl2, 또는 R1N = C = NR(여기에서 R 및 R1은 다른 알킬기이다)를 사용하여 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 또는, LSIRF-면역원성 접합제는 융합 단백질로서 재조합에 의하여 생산될 수도 있다.
동물들은 접합제 약 1mg 또는 약 1 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대하여)을 프로인드의 완전 보조제 약 3 용적과 결합시키고 용액을 복수개 부위에 피부하 주사하는 것에 의하여, 면역원성 ISIRF 접합제 또는 유도체(표적 아미노산 서열을 포함하는 절편과 같은)에 대해서 면역된다. 약 7 내지 14일 후, 동물로부터 채혈하여 혈청을 항-LSIRF 역가로 정량한다. 역가가 플래토(plateau) 모양으로 될 때까지 항원으로 반복하여 동물들을 부스트(boost)한다. 바람직하게는, 동물이 개시면역화에 사용된 것과 동일한 LSIRF 분자 또는 그의 절편으로 부스트되지만, 다른 단백질로 접합되고/되거나 다른 가교제를 통하여 접합된다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위하여 알럼과 같은 응집제가 주사제 내에 사용되기도 한다.
면역화된 동물로부터 비장 세포를 회수하고 통상적인 방법으로 세포를 불멸화, 예를 들어 골수종 세포와 융합시키는 것에 의하여 모노클론 항체가 제조될 수 있다. 다음에 원하는 항체를 발현하는 것을 스크리닝한다. 모노클론 항체는 바람직하게는 다른 LSIRF 폴리펩티드 또는 LSIRF 폴리펩티드 이형체와 교차-반응하지 않는다.
파아지미드 전개 방법(phagemid display method)과 같은 재조합 DNA 방법을 사용한 항체의 제조는, 예를 들어 파마시아(Pharmacia, Uppsala, Sweden)로부터 구할 수 있는 재조합 파아지미드 항체 시스템(Recombinant Phagemeid Antibody System) 또는 서프잽 파이지 전개 시스템(SurfZAP™ phage display system, Stratagene Inc., La Jolla, CA)과 같은 시판되는 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
바람직하게는, 사람에 투여하기 위한 항체는 비록 마우스와 같은 실험 동물에서 제조되기는 하지만, 사람 환자가 항체에 대한 면역 반응을 일으키지 않도록 인간화' 또는 키메라화시켜 사람 면역 시스템과 양립할 수 있도록 만들어 진다. 더욱 바람직하게는, 예를 들어 론버그 등(Lonberg et al., nature Genetics. 7 : 13-21 [1994])에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 사람 항체를 환자에 치료적 투여하는 것이 바람직하다.
상기 기술된 방법의 어느 것을 사용하여 생산된 항체는, 예를 들어 LSIRF의 인산화 형태에서 발견되는 것과 같은 핵 표적 시그널을 사용하여 세포막 및 핵막을 통과할 수 있는 화합물과 접합시켜 항체를 핵으로 수송할 수 있다.
(치료적 조성물 및 투여)
LSIRF 항체와 같은 본 발명을 실시하기에 유용한 조성물의 치료적 제형은 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 생리적으로 허용되는 최적의 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로서 동결건조된 케익 또는 수용액의 형태로 저장을 위하여 제조될 수 있다 (Remingtons' Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 수용자에게 비독성이고 적용되는 용량 및 농도에서 바람직하게는 불활성으로, 인산염, 구연산염 또는 다른 유기산과 같은 완충액 ; 아르코르빈산과 같은 항산화제 ; 저분자량 폴리펩티드 ; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질 ; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자 ; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산 ; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린과 같은 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물 ; EDTA와 같은 킬레이트화제 ; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알콜 ; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온 ; 및/또는 트윈, 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생체내 투여를 위하여 사용되는 조성물은 멸균되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 멤브레인을 통하여 여과함으로써 쉽게 달성될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 통상적으로 동결건조 형태 또는 용액 중에 저장될 것이다.
치료적 조성물은 일반적으로, 예를 들어 피하주사침에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 주사액 백 또는 바이알과 같은 멸균 입구를 갖는 용기로 비치된다.
본 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로로, 또는 지속적 방출 시스템 또는 이식 장치로 주사 또는 주입하는 것에 따른다. 바람직하게는, 조성물이 주입, 볼루스 주사 또는 이식(implantation) 장치에 의하여 연속적으로 투여될 수 있다.
지속적-방출 제제의 적절한 예에는 성형 재료, 즉 필름, 또는 마이크로캡슐 형태의 반투성 폴리머 매트릭스가 포함된다. 지속적 방출 매트릭스에는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드(U.S. 3,773, 919, EP 58, 481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., Biopolymers, 22 : 547-556 [1983]), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167-227 [1981] 및 Langer, Chem. Tech., 12 : 98-105 [1982]), 에틸렌 비닐 아세테이트( Langer et al., supra) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)이 포함된다. 지속적-방출 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있는데, 이것은 본 분야에 공지된 몇가지 방법의 어느 것에 의해서도 제조될 수 있다 (예를 들어, DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688-3692 [1985] ; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4030-4034 [1980] ; EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949).
치료적으로 적용되는 조성물의 유효한 양은, 예를 들어 치료 목적, 투여 경로, 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 따라서, 치료사가 최적 치료 효과를 얻기 위하여 요구되는 용량을 측정하고 투여경로를 변경할 필요가 있다. 통상적인 1 일 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg으로부터 100 mg/kg까지 변화될 수 있다. 통상적으로, 원하는 효과를 얻는 용량에 도달할 때까지 임상학자가 본 조성물을 투여할 것이다. 이러한 치료의 진행은 통상적인 분석 방법에 의하여 쉽게 모니터링된다.
본 발명의 LSIRF 핵산 분자, 5' 측 서열, 폴리펩티드, 및 항체 분자는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 다양한 용도를 가질 것이다.
LSIRF 폴리펩티드는 임파구 활성화를 조절하기 위하여 사용되는 치료적 화합물을 위한 표적으로서의 유용성을 가질 것이다. LSIRF 유전자의 발현을 차단하거나(LSIRF 전사 또는 번역을 감소시키는 것에 의해) LSIRF 폴리펩티드의 활성을 억제하는 것에 의해, 어떤 환경 자극에 반응하여 임파구 활성화를 억제하는 것이 가능하다. LSIRF 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것에 의해(LSIRF 5' 측 서열의 상향-조절을 통하여) 임파구 활성화 및 증식을 자극하고, 따라서 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 것이 가능하다.
본 발명의 항체는 폴리클론 또는 모노클론일 수 있으며, 어떠한 포유류 유래의 LSIRF에 대해서도 얻을 수 있다. 이들 항체는 주어진 조직 또는 생물학적 샘플에 있어서 LSIRF 폴리펩티드의 존재 및/또는 양을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 이들은 이 폴리펩티드의 활성 부위에 결합하는 것에 의하여 LSIRF의 활성을 차단하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 이들 항체 자체에서 LSIRF 폴리펩티드의 수준을 감소시키기 위한 치료적 화합물로서의 용도를 발견할 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예를 참고하여 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이다. 이들 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하도록 해석되어서는 안될 것이다.
[실시예 1 : 마우스 LSIRF cDNA의 클로닝]
C57B1/6 마우스의 비장 조직에서 얻은 총 RNA로부터 제조한 cDNA의 PCR 증폭을 위하여 두 개의 PCR(중합요소 연쇄 반응) 프라이머가 사용되었다. 프라이머는 다음과 같다 :
ATCCTGGAACACGC (서열 5)
GCACACGAACTGCCTTCCA (서열 6)
프라이머 5는 뉴클레오티드 2와 3(T와 C), 뉴클레오티드 4와 5(C와 T), 그리고 뉴클레오티드 9와 10(A와 C) 사이에 위치하는 세 개의 이노신 염기를 포함한다. 프라이머 6은 뉴클레오티드 5와 6(A와 C), 뉴클레오티드 7와 8(G와 A), 뉴클레오티드 9와 10(A와 C), 그리고 뉴클레오티드 11와 12(T와 G) 사이에 위치하는 네 개의 이노신 염기를 서열중에 포함한다.
PCR은 dNTPs 200μM, Taq 폴리머라제 2 U 및 각 프라이머 100pM을 포함하는 PCR 완충액 (10mM 트리스-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 및 50mM KCl) 50㎕ 중, 프로그램화 될 수 있는 열 순환기(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) 상에서 수행될 수 있다. 30 사이클의 PCR이 다음 온도 계획 하에서 수행되었다 : 94℃에서 60초 ; 37℃에서 60초 ; 그리고 72℃에서 60초. 이어서 TA-클로닝 시스템(Invitrogen Corp., San Diego, CA)을 사용하여 PCR 산물을 pCRII 플라스미드로 직접 삽입하였다. 이 PCR 산물 삽입물을 포함하는 플라스미드를 증폭시키기 위하여 적임의 대장균주 INV-알파 F'(Invitrogen Corp.)로 형질전환시켰다. 이들 숙주 세포 유래의 플라스미드 DNA를 표준 알카리 용해법(샘브룩 등, supra) 을 사용하여 제조하고, 이어서 이 플라스미드 DNA를 약 1.5% 아가로스 겔을 통하여 전기영동하였다. DNA 일부를 하이본드-N-멤브레인 종이(Amersham, Oakwille, Ontario, Canada) 상에 블롯팅하고 제조자(Amersham)의 프로토콜을 사용하여 뮤린 IRF-1 및 IRF-2의 무작위-프라임된32P 표지된 DNA 절편에 하이브리드시켰다. IRF-1 또는 IRF-2 절편의 어느 것과도 하이브리드하지 못하는 클론 유래의 플라스미드 DNA는 US 바이오사이언스 시쿼나제 키트(US Bioscience, Cleveland, Ohio)를 사용하여 서열을 결정하였다. 한 클론 Spl 5는 유전자 은행에서의 검색에 의해 결정된 신규 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. 이 클론을 무작위 프라이밍(Amersham 방법)에 의해32P로 표지한 다음, 마우스 IL-4 유도된 비장 cDNA 라이브러리(Clonetech, Palo Alto, CA)를 스크리닝하기 위하여 사용하였다. 하이브리드화 후, cDNA 라이브러리 클론을 함유하는 여지를 먼저 1 X SSC와 0.1% SDS로 약 65℃에서 약 30분 동안, 그 다음에 0.2 X SSC와 0.1% SDS로 약 65℃에서 약 30분 동안 세척하였다. ATG 개시 코돈이 없는 두 개의 LSIRF cDNA 클론을 얻었다. 이들 클론의 하나인 C13를 동일한 라이브러리 재스크리닝에 사용하여 대략 5 kb 클론으로 역시 5' 서열이 없는 C16을 얻었다. 다음에 클론 C16을 사용하여 λZAPII 마우스 비장 cDNA 라이브러리(Stratagene, La Jolla, CA)을 스크리닝하여, ATG 개시 코돈으로 추정되는 코돈을 갖는 몇 개의 부분 클론을 얻었다. 전체 코딩 LSIRF 영역을 포함하는 완전한 cDNA 서열은 PCR을 사용하여 5' 연장 프라이머를 가지고 합성 클론을 생성시키는 것에 의하여 얻어졌다. 이 클론을 벡터 pBSII에 삽입하여 플라스미드 PV-1을 생성하고 LSIRF 서열을 확인하였다.
각각의 부분 cDNA 클론에서 예상된 아마노산 서열을 얻었으며, 클론의 일부는 아미노산 위치 164에서 여분의 글루타민을 가졌다. 약 1.4kb인 PV-1의 전체길이 cDNA 서열을 도 1에 나타낸다. PV-1 cDNA는 아미노산 위치 164에서 여분의 글루타민을 포함한다. LSIRF cDNA 서열에 기초한 LSIRF의 예상되는 전체 길이 아미노산 서열을 도 2에 나타낸다.
[실시예 2 : 마우스 LSIRF의 게놈 클로닝]
LSIRF cDNA의 C16 클론의 약 630 bp 부분을 다음 프라이머를 사용하여 증폭하였다 :
CAGCCCGGGGTACTTGCCGCTGTC (서열 7)
AGACCTTATGCTTGGCTCAATGGG (서열 8)
PCR 조건은 94℃에서 1분 및 72℃에서 30초이다.
얻어진 PCR 절편을 1% 아가로스 겔 전기영동, 이어서 스핀-X 칼럼(CoStar Corp., Cambridge, MA)를 통과시키는 것에 의하여 정제하였다. 다음에 무작위 프라이머 기술(Amersham)을 사용하여 이 절편을32P로 표지하고, 계속해서 129/J 마우스 신장 조직으로부터 제조된 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하였다. 0.1 x SSC 및 0.1% SDS 중 65℃에서 세척하여 몇 개의 클론을 얻었다. 서열 결정을 위해 이들 클론 중 2개 (크기 12 및 15 kb)를 벡터 pBSII(Stratagene, La Jolla, CA)으로 서브클로닝하였다. 이 클론들은 약 2kb의 5' 측 서열을 확인할 수 있도록 겹치는 서열을 포함하였다. 이 5' 측 서열을 도 3에 나타낸다. 뮤린 LSIRF 유전자의 엑손과 인트론을 포함하는 게놈 서열은 도 4에 나타내고, 서열 불확실성에 의한 서열상의 불일치는 A 또는 G에 대해서는 R, G 또는 C에 대해서는 S, A 또는 C에 대해서는 M, 그리고 T 또는 G에 대해서는 K로 나타낸다. 모호성은 다음과 같다 :
뉴클레오티드 748, 4159, 7413, 및 10357에서 M ;
뉴클레오티드 5277, 5310, 10564, 및 11713에서 R ;
뉴클레오티드 4513, 5885, 및 9812에서 K ;
뉴클레오티드 6425에서 S.
모든 모호성은 인트론 내에 존재하고, 따라서 LSIRF의 코딩 영역을 포함하는 엑손의 뉴클레오티드 서열에는 영향을 주지 않는다.
LSIRF의 뉴클레오티드(cDNA 게놈) 서열과 해석된 아미노산 서열을 진뱅크(GeneBank)와 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에 있는 모든 서열과 비교하였으며, 어떠한 동일한 서열도 발견되지 않았다. 그러나, LSIRF의 아미노 말단 서열은 IRF 류의 다른 구성원과 동종성을 가졌다. 가장 높은 동종성은 폴리펩티드 ICSBP(인터페론 교감 서열 결합 단백질)와의 것으로, 이것은 아미노 말단에서 LSIRF와 83%의 동종성(하나의 아미노산 갭을 허용)을 공유한다.
[실시예 3 : 마우스 LSIRF 발현]
플라스미드 PV-1으로부터 EcoRI 제한 분해에 의하여 LSIRF 전체 길이 cDNA 서열을 절단하였다. LSIRF 유전자를 전기영동후 0.7% 아가로스겔로부터 분리하고, 클레나우 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트 말단화하고 플라스미드 pETL(BlueBacII, Invitrogen Company)의 NheI 부위로 연결하여 플라스미드 pETL-LSIRF를 생성하였다. 이 플라스미드를 표준 배양 방법 및 조건을 사용하여 E. coli 세포주 DH5-알파(암피실린의 존재중에 성장하는) 내에서 증폭시켰다. 적절한 배향으로 LSIRF 유전자를 포함하는 정제된 플라스미드를(EcoRI, HindIII PvuII 분해로 제한 엔도뉴클라아제 맵핑에 의해 결정) 선형화된 바큘로바이러스 게놈 DNA(Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA)와 함께 Sf9 인섹트 세포(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwill, MD USA로부터 입수)로 공통-형질감염시키고, 세포를 이스톨레이트, 락트알부민 가수분해물 및 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 그레이스 배지 중 28℃에서 약 48시간 동안 배양하였다.
배양후, 세포를 수확하고 블루오-갈 (Bluo-gal ; Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)의 존재중에서 플라크 분석을 수행하여 (Richardson, ed., Meth. Mol. Biol., vol 39 : Baculovirus Expression Protocols, Humana Press, Totowa, NJ [1995]) 재조합 바이러스를 분리하였다. 5-7일 배양후 청색 재조합 플라크를 선택하고 이 플라크를 Sf9 세포를 함유하는 24 웰 마이크로역가판에서 증폭시켰다. 약 108pfu/ml의 역가가 얻어질 때까지 조직 배양 플라스크내에서 대규모 세포 배양에 의해 재조합 바이러스의 증폭을 수행하였다. LSIRF의 발현은 약 1 pfu/세포의 중복 감염으로 Sf9 세포를 감염시키고 감염후 0, 24, 48, 72 및 96시간 째에 세포를 수확하는 것에 의해 확인되었다. 다음에 SDS-PAGE 샘플 완충액 (100mM DTT, 80mM 트리스-HCl, pH 6.8, 10% 글리세롤, 0.0012% 브로모페놀 블루)중에서 가용화시키는 것에 의하여 세포용해물을 제조하고 웨스턴 블롯 분석에 의하여 분석하였다.
Sf9 세포와 마우스 말초 임파구 양자로부터 얻은 단백질 추출물에서 LSIRF 폴리펩티드의 존재를 분석하였다. 임파구는 임파절 조직을 미세눈(mesh) 스크린을 통하여 통과시키는 것에 의하여 마우스로부터 적출된 임파절로부터 얻었다. 임파구는 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 이스코브 배지(Iscove's medium) 중에서 보존되었다. Sf9와 임파구 세포로부터의 단백질 추출물은 제조업자의 Sf9 세포용 프로토콜(Pharmingen, San Diego, CA) 또는 샘브룩 등(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989] ; 임파구 세포용)의 방법을 사용하여 제조되었다. 표준 방법을 사용하여 단백질을 8% 폴리아크릴아미드/0.1% SDS 겔 상에서 용해시키고 겔을 이모빌론-P(Immobilon-P) 멤브레인(Millipore Company)으로 전사하였다. 블롯을 먼저 차단 완충액(1 X PBS 중 4% 스킴 밀크와 0.05% 트윈-20)으로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다음에 LSIRF 카복시-말단 펩티드에 대하여 얻은 LSIRF 토끼 폴리클론 항 혈청을 블롯에 약 1 : 2000의 희석도로 (PBS 1부에 대하여 차단 완충액 1부의 용액 중에서) 첨가하였다. 항체를 생성시키기 위하여 토끼에 주사되는 LSIRF 펩티드는 다음과 같다 :
GYELPHEVTTPDYHR (서열 9)
LSIRF 항체와 약 1시간 동안 배양후 블롯을 세척하고 LSIRF 항체를 염소 항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합 항체로 약 1 : 5000의 희석도에서 검출하였다.
본 결과는 약 51 kD 밴드(LSIRF의 예상 분자량)가, 항-CD3 항체로 자극된 말초 T 세포와 재조합 Sf9 세포 양자에 대한 항 LSIRF 항체로 인식됨을 보여주었다.
[실시예 4 : 마우스의 LSIRF 발현 분석]
A. 조직 블롯
LSIRF 전사의 조직 특이성을 평가하기 위하여, 왕 등(Wangm, et al., EMBO, J., 10 : 2437-2450 [1991])에 의하여 기술된 방법을 사용하여 마우스 뇌, 폐, 흉선, 골수, 비장. 간. 장. 췌장, 타액선, 정소, 심장 및 연근육 조직으로부터 총 RNA를 제조하였다. RNA를 1% 아가로스/포름알데히드 겔을 통하여 표준 방법을 사용해서 전기영동시키고, 다음에는 샘브룩 등(supra)이 기술한 바와 같이 니트로셀룰로스 종이로 전사하였다. 블롯을 LSIRF 전체 코딩 영역(PV-1로부터 삽입)을 포함하는 무작위-프라임된32P 표지된 1.4 kb cDNA로 하이브리드시키고, 이어서 스튜어트 등(Stewart et al., Meth. Mol. Cell Biol., 1 : 73-76 [1989])에 의해 기술된 바와 같이 0.2 X SSC와 0.1% SDS 중 약 50℃에서 세척하였다.
도 5에서 보여주는 결과는 약 5.5kb의 LSIRF 전사체가 주로 비장 및 골수 조직에, 흉선과 폐 조직에서의 동일 크기의 보다 약한 전사체와 함께 존재한다는 것을 나타낸다. 놀라웁게도, 어떠한 추가 밴드도 관찰되지 않았다. 또한, 도 6은 임파절 조직도 역시 LSIRF 전사체를 포함한다는 것을 보여준다.
CTLL-2, D10.G4.1, HT-2, EL-4 및 BW5147를 포함하는 여러 가지 T 세포주(모든 세포는 American type culture Collection (12301 Parkland Drive, Rockville, MD, USA로부터 얻을 수 있다)를 노던 블롯 분석에 의해 LSIRF 발현을 평가하였다. RNA는 콤진스키 등(Chomczynski et al., Anl. Biochem., 162 : 156-159 [1987])의 방법을 사용하여 이들 세포주로부터 추출하였다. 세포주를 10% 송아지 태아 혈청과 2mM L-글루타민을 보충한 이스코브 배지중 37℃, 5% CO2에서 유지하였다. 최초의 세 개 세포주는 말초 T 세포 계열인 것으로 사료되고, 마지막 두 개는 미성숙 T 세포 계열인 것으로 사료된다. HT-2와 CTLL-2 세포의 배양에서는 IL-2(Genzyme Inc., Cambridge, MA) 50 U/ml 및 2-머캡토에탄올 50μM이 보충되고 ; D10.G4.1의 배양에서는 IL-1(Genzyme Inc., Cambridge, MA) 50 U/ml, IL-2 50 U/ml, 및 2-머캡토에탄올 50mM이 보충되었다.
스튜어트 등(supra)의 방법을 사용하여 노던 블롯을 총 RNA로부터 제작하고 하이본드 N 종이로 전사하여 1.4 kb 무작위 프라임된 cDNA로 탐사하였다.
결과는 LSIRF 전사체가 말초 T 세포주에서만 보이는 것을 나타내는데, 이는 LSIRF가 성숙 T 세포에서 유리하게 발현됨을 제시하는 것이다. 프리-B(pre-B) 세포주 CB17.51, B 세포주 WEHI231(American Type Culture Collection), 및 혈장세포 종 세포주 J558(American Tyep Culture Collection)에서 유사한 mRNA 전사 분석은, J558에서 가장 강한 시그널을 가지면서 모든 세포주에서 전사체의 존재를 보여준다.
비장 또는 임파절로부터 얻은 일차 임파구에서의 LSIRF 유도는 배양된 세포에 여러 가지 자극제를 첨가하고 LSIRF mRNA 농도를 측정하는 것에 의하여 평가되었다. 임파절 세포에 사용된 자극제는 뮤린 인터페론 베타 (IFN-beta ; Lee Biomolecular Research, San Diego, CA) 1000 U/ml, 뮤린 인터페론 감마 (IFN-gamma ; Genzyme Inc., Cambridge, MA) 100 U/ml, 또는 뮤린 종양괴사인자 (TNF ; Genzye Inc) 10 ng/ml이었다. 비장 세포는 항-IgM 항체 20 ㎍/㎖, 리포폴리사카라이드(LPS ; 박테리아 엔도톡신 )10 ㎍/㎖, PMA(포르볼 미리스테이트 아세테이트 ; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 10ng/㎖, 사이클로스포린 A (CsA ; Sandoz Company, Basel, Switzerland) 1 mg/㎖, 콘카나발린 A(ConA ; Sigma) 10 ㎍/㎖, 또는 사이클로헥시미드 (CHX ; Sigma) 1 또는 10 ㎍/㎖으로 처리하였다. 모든 세포는 37℃에서 6시간 동안 처리하였다.
결과는 도 6, 7 및 8에 나타낸다. 모든 도면에서 벡타 액틴이 분석되는 총 RNA 양의 지표로서 보여진다.
도 6은 항-CD3 항체가 LSIRF 전사를 유도하는 것을 보여준다. 그러나 가장 놀라운 것은, 인터페론이 LSIRF 전사를 유도하지 않는다는 것이다. 이것은 다른 알려진 IRFs와 매우 대조적인 것으로, 다른 알려진 IRFs 양자의 전사는 인터페론에 의하여 유도된다.
도 7은 단백질 합성 저해제인 사이클로헥시미드가 LSIRF 전사를 유도하는 것을 보여준다. 이 결과는 예상치 않았던 것인데, 사이클로헥시미드는 IRF-1 또는 IRF-2 유전자의 전사를 유도하지 않기 때문이다.
도 8은 항-IgM 및 PMA가 LSIRF 전사를 유도하는 것을 보여준다. 항-IgM에 의한 이러한 유도는 놀라운 것으로, 이것은 LSIRF가 T 세포 뿐 아니라 B 세포에서도 발현되는 것을 나타낸다.
B. 겔 쉬프트 분석
LSIRF 폴리펩티드가 DNA 결합 단백질 인가 여부를 평가하기 위하여 전기영동 이동성 쉬프트 분석을 시행하였다. 대조군 Sf9 세포(야행성 바큘로바이러스 만으로 형질감염된)와 LSIRF 발현 Sf9 세포(LSIRF cDNA를 포함하는 바큘로바이러스로 형질감염된) 유래의 핵 추출물을 다음과 같이 제조하였다. Sf9 세포를 펠렛화한 다음 PBS로 2회 세척하였다. 최종 세척후 세포를 107세포당 H-완충액(저장성 완충액 ; H-완충액은 Hepes-NaOH 25mM, pH 8.0, KCl 10mM, MgCl25mM, EDTA 0.5mM 및 DTT 0.5mM로 구성됨) 0.5 ml에 재현탁하고, 세포가 저장성 완충액에 의해 팽윤되는 동안 약 30분 동안 얼음 상에서 배양하였다. 다음에 세포를 다운스 균질화기 중에서 B형 유봉 15 스트로크로 파쇄하였다. 미세원심분리기 내에서 10Krpm으로 약 4℃에서 약 10분 동안 펠렛화함으로써 세포 잔류물로부터 핵을 분리하였다. 다음에, 핵의 대부분이 포함되어 있는 펠렛을 107세포당 N-완충액(N-완충액은 Hepes-NaOH 25mM, pH 8.0, KCl 400mM, MgCl25mM, EDTA 0.5mM, 10% 글리세롤 및 DTT 0.5mM로 구성됨) 0.5ml에 재현탁하고, 약 20분 동안 얼음 상에서 배양하였다. 다음에 현탁액을 미세원심분리기 내에서 15K rpm으로 4℃에서 약 15분 동안 원심분리하였다. LSIRF 폴리펩티드의 대부분을 포함하는 상등액을 센트리콘 10 미세농축기(Centricon 10 microconcentrator ; Amicon Corporation)를 사용하여 완충액 교환하여 과잉의 염을 제거하였다. 농축용 희석 완충액은 E-완충액(Hepes-NaOH 25mM, pH 8.0, KCl 50mM, MgCl25mM, EDTA 0.5mM, 15% 글리세롤 및 DTT 0.5mM)이었다. H-완충액, N-완충액 및 E-완충액은 모두 다음 프로테아제 저해제를 포함하였다 : PMSF 0.5mM, 류펩틴 0.5 ㎍/ml 및 아프로티닌 0.5 ㎍/ml.
절편의 LSIRF 결합에 의한 특정 DNA 절편의 전기영동 이동성을 평가하기 위하여, 추출물을 이중 나선32P-표지된 DNA 탐사체와 함께 배양하였다. 이 탐사체의 감지 나선의 서열은 야생형 뮤린 MHC IRSE 결합 서열로서 다음과 같다 :
TGCAGAAGTGAAACTGAGG (서열 10)
결합 반응을 위하여, 약 25 × 103cpm (탐사체 약 1 × 10-11몰에 해당)이 결합 반응 완충액(Hepes-KOH 12mM, pH 7.9, KCl 30mM, EGTA 60 μM, DTT 0.3mM, 2.5% 피콜, 폴리(dI-dC) [Pharmacia로부터 입수] 0.6 ㎍ 및 0.05% NP-40) 중에서 제조되었다. 핵산 추출물은 BSA(소 혈청 알부민) 약 0.1 mg/ml를 포함하는 E-완충액 내에서, LSIRF 함유 반응용으로는 총단백질 약 14 ㎍/ml의 최종 농도까지, 그리고 대조 반응용으로는 약 22 ㎍/ml까지 약 8배 희석함으로써 제조하였다. 결합 반응은 핵산 추출물 약 1 ㎕를 탐사체 용액 약 6.24 ㎕에 첨가함으로써 시작되는데, 어떤 경우, 탐사체 용액에는 비표지된 경쟁자 DNA 절편도 포함된다. 이들 절편 각각의 서열을 하기 표 1에 나타낸다. 경쟁자 절편은 약 750배 몰과량(표지된 절편과 비교하여)으로 첨가된다. 핵 추출물/탐사체 용액을 약 23℃에서 약 20분 동안 배양한 다음, 샘플 적용전 약 250 볼트에서 약 2시간 동안 예비-가동시킨 9% 폴리아크릴아미드 겔(0.25 X TBE로 제조) 상에 부하하였다. 겔을 약 300 볼트에서 약 2시간 동안 작동시켜 비결합 DNA 탐사체로부터 단백질-DNA 복합체를 분리하였다. 다음에 겔을 건조하고 필름에 노출시켜 단백질 결합에 기인한 DNA 탐사체 이동쉬프트를 평가하였다.
표 1에서, m은 마우스 서열을 나타내고, h는 사람 서열을 나타낸다.
결과는 도 9에 보여진다. 여기에서 보듯이, 야생형 MHC ISRE 서열은 LSIRF 단백질과 결합한다. 또한, 두 개의 ISRE DNA 절편 변이체인 m1 및 m4는 두 개의 다른 DNA 절편인 Ig 람다 B 및 ISG54와 마찬가지로 결합에 대하여 잘 경쟁한다.
[표 1]
[실시예 5 : 사람 LSIRF 클로닝]
사람 cDNA 코딩 LSIRF를 확인하기 위하여, 사람 임파구 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA ; catalog number HL 1031a)를 마우스 PV-1 클론을 사용하여 스크리닝하였다. 스크리닝 조건은 처치 완충액(Church 및 Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81 : 1991-1995 [1985])중 65℃에서 하룻밤이었다. 여지를 각각 2 X SSC 및 0.1% SDS에서 약 30분 동안 2회 세척하였다. 스크리닝된 약 100만 플라크 중에서, 두 개의 양성 클론을 확인, 분리하고, 표준 기술을 사용하여 DNA를 정제하였다. 클론을 pBluescript(Stratagene, LaJolla, CA)의 EcoRI로 서브클로닝하였다. 이들 클론중 가장 긴 것으로 H14로 명명한 약 2 kb보다 긴 것이 서열화되었다. 이 서열은 이 클론이 TNF(종양 괴사 인자) 수용체 p55(약 400 염기쌍)와 마우스 LSIRF 서열의 엑손 3-9와 고도의 동종성을 갖는 서열 약 1 kb의 하이브리드인 것을 나타내었다. 또한, 이 클론은 보존된 정지 코돈, 접합(splice) 공여 서열, 및 인트론 9의 약 600 염기쌍을 갖는다. 따라서, 이 1019 염기쌍 서열은 사람 LSIRF 서열의 일부를 나타낸다는 결론에 도달하였다. 이 1019 염기쌍 서열을 다음 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다 ;
CTGGACATCTCAGACCCGTACAAAGTG (서열 19)
CTTGACATTTTTCATTCTTGAATAGAG (서열 20)
증폭 조건은 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 약 90초였다. H14 주형 약 500 ng을 Taq 폴리머라제의 존재중에서 사용하고, PCR 약 15 사이클을 시행하였다. 얻어진 PCR 산물을 TA 클로닝 키트 벡터 PCRII(Invitrogen, San Diego, CA)로 직접 연결하고 서열화시켜 적절한 절편이 증폭되었음을 확인하였다. 이 1019 염기쌍 cDNA 절편을 FISH로 명명하고, 다음에 사람 백혈구 5'-스트레치 cDNA 라이브러리(Clontech ; catalog number HL1169x)를 스크리닝하기 위하여 사용하였다. 스크리닝 조건은 다음과 같다 : 처치 완충액 중 약 65℃에서 하룻밤 보존하고, 2 X SSC 및 0.1% SDS 내에서 약 30분 동안 2회 세척한 다음, 0.2 X SSC 및 0.1% SDS 내에서 약 30분 동안 2회 세척하였다. 약 500,000의 하나의 플라크를 확인하고 DNA를 정제 및 서열화하였다. 이 클론을 HIRF4λDR2로 명명하였는데, 엑손 5, 7, 8 및 인트론 8뿐 아니라, 인트론 2 및 전체 길이의 엑손 3(단지 엑손 3의 한 부분 만이 H14 클론에서 발견되었다)을 포함하였다. 엑손 4 및 6은 중첩되었거나 손실된 것으로 예상된다.
LSIRF 코딩 서열의 나머지를 얻기 위하여 두가지 방법이 채용되었다. 먼저, 벡터 람다 픽스 2(Stratagene, LaJolla, CA) 중의 사람 태반 게놈 라이브러리를 탐사체로서 FISH cDNA를 사용하여 스크리닝하였다. 스크리닝 조건은 처치 완충액내 약 65℃에서 하룻밤 보존한 후, 2 X SSC 및 0.1% SDS 내에서 약 30분 동안 2회 세척하는 것이다. 10개의 파아지 클론을 분리하고 하나의 클론으로부터 DNA를 분리하여 HG-1으로 명명하였다. 이 DNA를 제한 엔노뉴클레아제 BamHI, SacI, 및 XbaI로 분해하고 절편을 클로닝 벡터 pMOB로 서브클론하였다(Strathmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 1247-1250 [1991]). 각 절편의 서열을 얻고 마우스 LSIRF 서열과 비교하였다. 사람 LSIRF의 프로모터, 엑손 I, 및 엑손 II를 마우스 서열과의 동종성에 근거하여 이 클론 내에서 확인하였다.
사용된 두 번째 방법은 클론테크 마라톤(Clontech MarathonR)키트를 사용하고 제조자의 프로토콜에 따르는 RACE 반응이다. 높은 LSIRF 발현을 갖는 것으로 앞서의 노던 블롯 분석에 의해 알려진 OCILY8(Blood, 69 : 1307-1314 [1987]로 불리우는 B-세포 임파구를 사용하였다. 얻어진 RACE 산물을 서열화하고 엑손 1 및 2 (상기 방법에 따라 얻어진)의 게놈 서열에 부합되는 것이 발견되었다.
오픈 리딩 프레임을 생산하기 위하여 벡터 PCRII의 EcoRI 부위로부터 FISH cDNA를 잘라내어 PGEX4T3(Promega, Madison, WI)의 EcoRI 부위로 연결하여 벡터 pGEX4T3-FISH를 제작하였다. FISH 클론으로 융합되도록 허용되는 형태로 오픈 리딩 프레임의 5' 말단을 얻기 위하여, 사람 비장 마라톤R(Clontech, catalog No. 7412-1) cDNA를 다음의 두 증폭용 프라이머와 함께 사용하였다 :
TGCCCTCAGCTCCGAGTCCAG (서열 21)
AACCATTTTCACAAGCTA (서열 22)
증폭은 다음 조건 하에서 PCR에 의하여 달성되었다 : 94℃에서 30초, 64℃에서 30초, 및 68℃에서 1분. 연장된 고순도 폴리머라제(Boehringer Manheim)를 사용하여 30사이클을 수행하였다. 이 방법을 사용하여, LSIRF의 N-말단 서열을 증폭시켜 약 600 염기쌍의 예정된 DNA 절편 크기로 하였다.
약 600 염기쌍 절편을 서열 22(상기 언급됨) 및 서열 23(하기와 같음)을 사용하여 PCR에 의하여 재증폭시켰다 :
GGATCCGGATCCATGAACTGGAGGGCGGCGGCCGAGGC (서열 23)
천연 PFU 폴리머라제(Stratagene, LaJolla, CA)를 사용하여 다음과 같이 PCR 15 사이클을 수행하였다 : 94℃에서 30초, 64℃에서 30초, 및 72℃에서 90초.
FISH 삽입체를 포함하는 pGEX4T3 벡터(pGEX4T3-FISH)를 BamHI 및 SacII로 분해하여 FISH 삽입체의 5' 부분을 제거하였다. 상기로부터 얻은 약 600 염기쌍의 PCR 산물을 동일 효소로 분해하고 pGEX4T3-FISH 벡터로 연결하여 완전한 길이의 오픈 리딩 프레임 구조체 pGEX4T3 LSIRF BamHI/EcoRI를 형성하였다. 이의 코딩 영역은 도 10에 나타낸다. 예상되는 아미노산 서열은 도 11에 나타낸다. 이 클론은 제조자의 프로토콜에 따라 GST 융합 단백질(Pharmacia) 생산에 의해 평가되었다. 융합 단백질의 예상 크기는 약 79 kD으로, 이중에서 약 27 kD은 GST 단백질이고 약 52 kD는 LSIRF 단백질이다. 융합 단백질은 8% SDS-PAGE 상에서 약 79 kD의 예상된 크기로 이동한 것이 쿠마시 블루 염색에 의하여 결정되었다.
사람 LSIRF의 노던 블롯 분석은 이 유전자가 사람 비장 조직 및 말초 혈액 조직에서 우선적으로, 대장 및 장관 조직에서 보다 낮은 수준으로 발현된다는 것을 보여주었다. 또한, 클론테크(Clontech, catalog no. 7757-1)로부터 얻은 복수의 종양 세포주 노던 블롯을 사용하여, 사람 B 세포 버킷 임파종 세포주 라지(B cell Burkitt's lymphoma line Raji)에서 이 유전자의 약한 발현이, 그리고 사람 흑색종 세포주 G361 종량 세포주에서 강한 발현이 관찰되었다.
부분적으로 hLSIRF 서열을 포함하는 몇 개의 클론의 DNA 서열화에 근거할 때, hLSIRF 서열의 두가지 형태가 존재하는 것으로 생각된다. 하나의 형태는 단일 Q(Single Q) 형태로, 염기 490-492에서 CAG 코돈을 포함하는데, 이것은 아미노산 위치 164에서 아미노산 Q(Gln)를 코딩한다. LSIRF DNA의 두번째 형태는 이중 Q(Double Q) 형태로, 단일 Q 의 염기 492와 493 사이에 추가의 CAG 코돈을 포함하여, 단일 Q 형태의 아미노산 163과 164 사이에 추가의 아미노산 Q(Gln)를 야기한다. 이러한 하나의 차이를 제외하면, 두 형태의 아미노산 및 핵산 서열은 동일하다.
벡터 pGEX4T3 내 사람 LSIRF(hLSIRF)를 코딩하는 전체 길이 단일 Q DNA 서열은 1996년 3월 27일자로 ATCC에 기탁 번호 98016으로 기탁되었다. 또한, hLSIRF 단백질의 이중 Q 형태를 코딩하는 전체 길이 사람 LSIRF 서열은 1996년 3월 27일자로 ATCC에 기탁 번호 98017로 기탁되었다.
[서열 목록]
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : 암젠 캐나다 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭 : LSIRF 폴리펩티드를 코딩하는 유전자
(iii) 서열수 : 25
(iv) 주소 :
(A) 수령인: 암젠 캐나다 인코포레이티드
(B) 번지 : 6733 미시소가 로드 쉬트 303
(C) 시 : 미시소가
(D) 주 : 온타리오
(E) 국가 : 캐나다
(F) 번호 : L5N 6J5
(v) 컴퓨터 식별 형식 :
(A) 매체 형식 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) 현재 출원 데이터 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류번호 :
(v) 출원인/대리인 정보 :
(A) 성명 : 올레스키, 낸시 에이.
(B) 등록번호 : 34,688
(C) 참조/서류 번호 : A-338A
(2) 서열 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1353 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 1]
(2) 서열 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 450 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
[서열 2]
(2) 서열 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 2139 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
[서열 3]
(2) 서열 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 12537 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
[서열 4]
(2) 서열 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 14 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 5]
ATCCTGGAAC ACGC
(2) 서열 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 6]
GCACACGAAC TGCCTTCCA
(2) 서열 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 7]
CAGCCCGGGG TACTTGCCGC TGTC
(2) 서열 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 8]
AGACCTTATG CTTGGCTCAA TGGG
(2) 서열 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
[서열 9]
Gly Tyr Glu Leu Pro His Glu Val Thr Thr Pro Asp Tyr His Arg
1 5 10 15
(2) 서열 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 19 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 10]
TGCAGAAGTG AAACTGAGG
(2) 서열 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 11]
TGCAGAAGTG AAACTGAG
(2) 서열 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 12]
TGCAGAAGTG AAACCTGG
(2) 서열 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 13]
TGCAGAAGTG AACATGAG
(2) 서열 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 14]
TGCAGAAGTG GTCCTGAG
(2) 서열 15에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 15]
GCTAGAAGTG AAACTGAG
(2) 서열 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 16]
AAAGGAAGTG AAACCAAG
(2) 서열 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 17]
TGAGGAACTG AAAACAGA
(2) 서열 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 16 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 18]
GGGAAAGTGA AACTAG
(2) 서열 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 19]
CTGGACATCT CAGACCCGTA CAAAGTG
(2) 서열 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 20]
CTTGACATTT TTCATTCTTG AATAGAG
(2) 서열 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 21]
TGCCCTCAGC TCCGAGTCCA G
(2) 서열 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 22]
AACCATTTTC ACAAGCTG
(2) 서열 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 38 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 23]
GGATCCGGAT CCATGAACTG GAGGGCGGCG GCCGAGGC
(2) 서열 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1353 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : cDNA
[서열 24]
(2) 서열 25에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 450 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
[서열 25]

Claims (17)

  1. a) 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
    b) 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
    c) 서열 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 이중 Q 변이체 ;
    d) 서열 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 ;
    e) 서열 25의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 이중 Q 변이체 ; 및
    f) (a), (b), (c), (d), (e)의 핵산 분자, 또는 그의 절편과 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자로 구성되는 그룹으로부터 선택된,
    LSIRF 폴리펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 분리된 핵산 분자.
  3. 서열 1의 분리된 핵산 분자.
  4. 서열 4의 분리된 핵산 분자.
  5. 서열 3의 분리된 핵산 분자.
  6. 제 1 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  7. 제 6 항의 벡터로 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주세포.
  8. LSIRF 폴리펩티드의 특정 DNA 결합 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 또는 그의 절편.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  10. 제 8 항에 있어서, 외원성 핵산 분자 서열의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 발현 산물인 폴리펩티드.
  11. 제 1 항의 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  12. LSIRF의 발현을 허용하는 조건하에서 제 7 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 LSIRF 폴리펩티드의 생산 방법.
  13. 제 1 항의 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체.
  14. 제 13 항에 있어서, 모노클론 항체인 항체.
  15. a) LSIRF 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포로 삽입하고 ; 그리고
    b) LSIRF 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    LSIRF 폴리펩티드의 제조 방법.
  16. 서열 24의 분리된 핵산 분자 또는 그의 이중 Q 변이체.
  17. 제 8 항에 있어서, 서열 25의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 이중 Q 변이체.
KR1019970707290A 1995-04-14 1996-04-12 임파구 인터페론 조절 인자 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 KR19980703889A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42273395A 1995-04-14 1995-04-14
US8/422,733 1995-04-14
US08/611,280 US5891666A (en) 1995-04-14 1996-04-03 Genes encoding LSIRF polypeptides
US8/611,280 1996-04-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19980703889A true KR19980703889A (ko) 1998-12-05

Family

ID=27025728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970707290A KR19980703889A (ko) 1995-04-14 1996-04-12 임파구 인터페론 조절 인자 폴리펩티드를 코딩하는 유전자

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5891666A (ko)
EP (1) EP0820509B1 (ko)
JP (1) JPH11505104A (ko)
KR (1) KR19980703889A (ko)
CN (1) CN1181784A (ko)
AT (1) ATE386114T1 (ko)
AU (1) AU5265796A (ko)
BR (1) BR9604947A (ko)
CA (1) CA2217633C (ko)
CZ (1) CZ318997A3 (ko)
DE (1) DE69637429T2 (ko)
ES (1) ES2301167T3 (ko)
HU (1) HUP9802289A2 (ko)
NO (1) NO974713L (ko)
NZ (1) NZ304789A (ko)
WO (1) WO1996032477A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6245562B1 (en) * 1996-05-28 2001-06-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Identification of genes altered in multiple myeloma
US6448072B1 (en) 1999-06-04 2002-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Transcription factors related to TFIIA
US20050220781A1 (en) * 2003-09-04 2005-10-06 Duen-Hwa Yan IFIX, a novel HIN-200 protein, for cancer therapy
CN113943369B (zh) * 2021-10-27 2023-04-18 福州迈新生物技术开发有限公司 抗mum1蛋白单克隆抗体、细胞系及其应用
CN114015696B (zh) * 2021-11-09 2023-06-16 海南大学 卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因、蛋白、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
US6369202B1 (en) 2002-04-09
NO974713D0 (no) 1997-10-10
EP0820509A1 (en) 1998-01-28
CA2217633A1 (en) 1996-10-17
MX9707542A (es) 1998-07-31
US6258935B1 (en) 2001-07-10
CA2217633C (en) 2003-06-03
ES2301167T3 (es) 2008-06-16
BR9604947A (pt) 1999-08-24
NZ304789A (en) 1998-12-23
NO974713L (no) 1997-10-10
AU5265796A (en) 1996-10-30
US5891666A (en) 1999-04-06
JPH11505104A (ja) 1999-05-18
DE69637429D1 (de) 2008-03-27
CN1181784A (zh) 1998-05-13
WO1996032477A1 (en) 1996-10-17
CZ318997A3 (cs) 1998-05-13
ATE386114T1 (de) 2008-03-15
HUP9802289A2 (hu) 1999-01-28
DE69637429T2 (de) 2009-07-09
EP0820509B1 (en) 2008-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100687388B1 (ko) 인터루킨-18 결합 단백질, 이들의 제조방법 및 용도
EP1109908B1 (en) Methods for determining compounds for modulating the body weight
CA2292835A1 (en) Ntn-2 member of tnf ligand family
AU7713098A (en) Ntn-2 member of tnf ligand family
KR100439290B1 (ko) 인터로이칸-18을인식하는신규의폴리펩티드
WO1996040864A1 (en) A novel protein, faf1, which potentiates fas-mediated apoptosis and uses thereof
JPH08509119A (ja) Ｔａｔａ結合蛋白関連因子、ｔａｆをコードする核酸および使用方法
WO1998031701A1 (en) Endothelial pas domain protein
US6172211B1 (en) Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
JP4314386B2 (ja) Ｂｃｌ−２調節因子（ＢＭＦ）配列及びアポトーシスの調節におけるそれらの使用
CA2167303A1 (en) Regulation of transcription factor, nf-il6/lap
EP0820509B1 (en) Genes encoding lymphocyte interferon regulatory factor (lsirf) polypeptides
AU2675197A (en) Novel protein - traf6
US6670450B1 (en) Protein and gene involved in myocyte differentiation
EP0780472A2 (en) Stress proteins
JPH10504714A (ja) ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質
US20010024808A1 (en) Leptin induced genes
JP2006223311A (ja) リンパ球インターフェロン調節因子（ｌｓｉｒｆ）ポリペプチドをコードする遺伝子
CA2393381A1 (en) Genes encoding lymphocyte interferon regulatory factor (lsirf) polypeptides
US6071741A (en) Doc tumor suppressor protein and gene
WO1999015550A1 (en) Ucp3 genes
MXPA97007542A (en) Genes coding for the polypeptides of the regulatory factor of the interferon of lymphocytes (lsi)
WO1997004010A1 (en) SIGNAL TRANSDUCTION AGENTS OF T-CELL RECEPTOR Vα-1 GENE LOCUS

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid