KR19980703611A

KR19980703611A - 엑소폴리사카라이드 분해 효소 및 이의 용도

Info

Publication number: KR19980703611A
Application number: KR1019970707010A
Authority: KR
Inventors: 판슈파이브로엑미헬엠페; 브룩게만게에르트; 판포엘레요제프; 판피크리슈틴라우라이그나티우스; 판담메에릭요오트
Original assignee: 리씨알렉산더디; 베츠디어본인코포레이티드
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 1998-12-05
Also published as: NO974545L; ATE214099T1; DE69619665T2; NO974545D0; EP0820516B1; CA2215996A1; WO1996031610A2; DE69619665D1; ES2174068T3; JPH11503317A; EP0820516A2; AU5500296A; NZ306445A; WO1996031610A3; AU705804B2

Abstract

본 발명은 엑소폴리사카라이드 분해 효소, 엑소폴리사카라이드를 분해할 수 있는 효소 조성물, 및 특히 표면상의 생체막의 감소 또는 제거 및 그러한 표면상의 생체막 형성 방지에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 수성 시스템(함수 시스템, 유체 시스템)의 표면상의 생체막의 감소, 제거 및/또는 방지를 위한 효소의 용도 및/또는 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 하나 이상 포함하는 효소 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 엑소폴리사카라이드를 생산하는 세균 균주, 및 새롭게 단리된 스트렙토마이세스 균주로부터 제조된 엑소폴리사카라이드 분해 효소에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명의 엑소폴리사카라이드 분해 효소는 콜란산 분해 효소이다.

Description

엑소폴리사카라이드 분해 효소 및 이의 용도

본 발명은 엑소폴리사카라이드 분해 효소, 엑소폴리사카라이드를 분해시킬 수 있는 효소 조성물, 특히 표면상의 생체막 감소 또는 제거 방법 및 표면상의 생체막 형성 방지 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 1종 이상 포함하는, 수성 시스템(함수 시스템, 유체 시스템) 표면상의 생체막(biofilm)의 감소, 제거 및/또는 방지용 효소의 용도 및/또는 효소 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 엑소폴리사카라이드 분해 효소 생산 세균 균주, 및 신규하게 단리된 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주로부터 제조되는 엑소폴리사카라이드 분해 효소에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 엑소폴리사카라이드 분해 효소는 콜란산 분해 효소이다.

미생물의 토양 표면상의 부착은 통상적으로 수성 시스템에서 이루어진다. 일반적으로 이런 현상을 생점액화(biofouling)라 하며, 미생물층을 생체막이라 한다. 생체막의 축적은 1) 벌크 유체로부터 물질이 표면으로 운반 및 부착, 2) 생체막내에서의 미생물 대사, 3) 막 표면에서의 유체 전단 응력, 4) 표면 물질 및 조도, 5) 점액화 조절 과정을 포함하는 공정의 결과이다.

여러가지 공업 공정에서 생체막 형성과 관련된 문제점은 에너지 손실, 물질의 열화 및 공정 효율성의 감소이다. 에너지 손실은 냉각탑에서의 열 교환 능력의 감소와 유체 분배 시스템 및 선적 공업에서의 동력 소모의 증가를 의미한다. 고체 표면상의 생체막층으로 인한 물질의 열화는 부식과 부패를 의미한다. 공정 효율성의 감소는 수처리, 펄프 및 제지 공업 및 수질 데이타 콜렉션에서 나타난다.

보건상 문제점이 또한 생점액화와 관련있는데, 예를 들면 치아의 프라그 형성, 질병을 일으키는 진핵 조직으로의 미생물 세포 부착, 음용수의 품질, 생체막으로부터 병원성 유기체의 공업용수 시스템으로의 방출 등이다. 공업 공정- 또는 작동-수 시스템, 예를 들면 제지 공장의 개방식 또는 폐쇄식 순환수 시스템 또는 냉각수 시스템은 미생물 생장에 적합한 환경을 제공하여 그 결과 생체막(또는 점액질)이 함수 시스템의 표면상에 형성된다. 특히 냉각수 시스템의 경우, 이들 생체막 부착물은 열교환성을 감소시키고, 파이프라인의 접합부에 손상과 시스템내에 부식을 일으킬 수 있다. 공정 조절상의 부정적인 효과가 있는 경우, 이는 당해 공업 공정의 효율을 감소시키거나 제품의 질을 손상시킬 수 있다. 이외에, 생체막 또는 점액질 부착물을 일반적으로 에너지 소모율을 더욱 높인다. 펄프, 종이, 보드 및 텍스타일 제조과 같은 공업 공정은 대부분 증가된 생체막 형성에 영향을 받게된다. 예를 들어 제지 기계의 경우, 대량의 물이 백수(white water) 시스템(1차 또는 2차 사이클, 즉 백수 I 또는 II)이라 불리우는 순환 시스템에서 재순환된다. 펄프가 분산되어 있는 백수는 미생물 생장에 이상적인 배양 배지를 형성한다.

공업적 수성 시스템과는 별개로, 생체막 형성이 또한 예를 들면 건강 위생에 있어서 한외여과 및 투석용 막과 같은 다른 환경에 있이서 표면상에 일어날 수 있다. 본 발명의 범주내의 효소 조성물은 생체막 형성이 일어나는 시스템에 있어서 점액질 방지 및 제거용으로 이용될 수 있다.

세균, 특히 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박토(Acinetobacter) 및 에어로박터 플러스 플라보박테리움(Aerobacter plus Flavobacterium), 데술포비브리오(Desulfovibrio), 에셰리키아(Escherichia), 스페로틸러스(Sphaerotilus), 엔테로박터(Enterobacter) 및 사르시나(Sarcina)와 같은 그람-음성균에 의해 생체막 또는 점액질이 형성된다. 그람-음성균의 세포벽 구조가 특히 점액질 형성에 기여하는 인자이다. 그람-음성균의 세포벽은 아세틸 아미노당 및 아미노산으로 이루어진 펩티도글리칸과 단백질, 리포폴리사카라이드 및 리포단백질로 이루어진 외부막을 포함한다. 대조적으로, 그람-양성균, 예를 들어 바실러스(Bacillus)의 세포벽은 대부분 펩티도글리칸 및 테이콘산으로 이루어져 있다.

생체막은 또한 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 알터나리아종(Altenaria sp.), 렌지테스(Lenzytes), 렌티너스(Lentinus), 폴리포러스(Polyporus), 포메스(Fomes), 스페리움(Sperium), 아스퍼길러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 페니실리움(Penicillium), 칸디다(Candida), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 바시도마이세테스(Basidomycetes)와 같은 진균 및 효모에 의해 생산된다.

생체막은 여러가지 종류의 미생물을 포함할 수 있다. 생체막내에서 그람-음성 및 그람-양성균, 진균 및 조류가 발견될 수 있다. 생체막 발달은 유기 분자, 즉 지방, 단백질, 당이 초기 표면상에 농축되면서 개시된다. 이어서 미생물이 이들층으로 유입되고 엑소폴리머를 통하여 부착된다. 이어서 부착된 미생물은 별개의 미생물 콜로니를 형성한다. 얼마후 각각의 콜로니가 성장하였을때, 진짜 생체막이 형성된다. 생체막은 일정한 상태에 도달할 때까지 점점 더 두꺼워진다: 유체로부터 미생물이 기존의 생체막에 부착되면서 생체막으로부터 유동하는 유체로 미생물의 전단에 의해 보충된다.

생체막의 두께는 기질 농도에 따라 증가한다. 두꺼운 생체막내에 특정 영역은 영양소가 고갈되어 약한 구조물이 될 수 있다. 이들 약한 부위는 생물학적 매트릭스에서 구멍을 생성시켜 분리시킬 수 있다. 이어서 이들 구멍상에서의 유동으로 얇은 생체막을 이탈하는 더욱 많은 양의 물질을 분리시킬 수 있다. 생체막이 더욱 두꺼워짐에 따라, 표면에 인접하여 비호기성 영역이 발달하게 된다. 이 영역에서 미생물은 표면을 파괴시킬 수 있다.

일반적으로, 생체막중의 미생물은 글리코칼릭스라 불리우는 막대한 양의 세포외 바이오폴리머로 둘러싸여 있다. 글리코칼릭스는 세포벽에 S-층이라 불리는, 규칙적으로 배열된 당단백질로 이루어질 수 있거나, 부분적으로 용제중으로 탈피될 수 있는 세포 표면에 섬유상 폴리사카라이드 매트릭스, 캡슐로 이루어질 수 있다. 상기 캡슐은 고도로 조직화될 수 있다. 때때로 미생물을 둘라싸고 있는 폴리사카라이드 캡슐이 세포 표면에 공유결합식으로 부착되지 않음을 알 수 있다. 이후 세포를 펠릿화하면 상등액중에 글리코칼릭스만 남게된다.

글리코칼릭스로 둘러싸인 미생물 콜로니는 세포 복제 발생에 의해 형성되어 2개의 딸세포가 동일한 글리코칼릭스내에 가두어지게 된다. 글리코칼릭스 바이오폴리머의 분자간 결합은 2가 양이온에 의해 영향을 받는다. 이들 양이온과 EDTA의 킬레이트화가 생체막 분리에 효과적이다.

수명의 연구자가 오늘날 알려진 바와 같은 세균성 글리코칼릭스의 기능에 관한 일반적인 결론을 도출시켰다. 1) 고체 표면 또는 기타 전핵 또는 진핵 세포로의 세포의 접착에 있어서 및 2) 배지로부터 유기 영양소의 포획에 있어서 기능한다. 3) 캡슐은 충분히 고도로 조직화되어 입자를 배제시킬 수 있고 따라서 환경으로부터 미생물을 보호할 수 있다. 글리코칼릭스가 항생제, 항체, 박테리오파지에 대한 1차적인 보호벽으로 생각될 수 있다.

생체막이 세균성 물질만으로 이루어지는 경우는 거의 없다. 흔히 무기물이 점액질의 일부인데, 예를 들면 CaCO₃, 알루미나, 실리카, 철, 마그네슘, 구리등이다. 제지 공장에서는 다량의 물질이 막중에 포함될 수 있는데, 이의 예로는 섬유, 충전재, 피치, 송진풀 등이다.

세균성 점액질의 침착은 살균제에 의해 대부분 효과적으로 구제할 수 있는데, 이들 살균제의 효과는 살균제가 공정수중의 미생물을 박멸하여 점액질 생산을 방지한다는 사실을 기본으로 한다. 그러나, 생체막 생산균은 독약에 대해 플랑크톤성 세균보다 훨씬 더 내성이다. 따라서, 생체막을 제거하기 위해서는 매우 고농도의 살균제가 필수적이다. 이는 생체막 세포가 천천히 성장하고 대사 활성이 약하기 때문이며 이들이 이온 교환 수지 고정화 독물로 작용할 뿐만 아니라 살균제가 세포에 도달하는 것을 방지하는 소수성/친수성 방벽으로서 작용하는 이들의 글리코칼릭스에 의해 보호되기 때문이다. 이런 이유로, 별도의 생체막 제거 방법이 과거부터 추구되었으며, 특히 효소가 관심의 대상이 되었다.

생체막 매트릭스는 이종성일 수 있으며; 주로 폴리사카라이드로 구성되어 있다. 따라서 점액질 제거 분야에서의 연구는 특히 폴리사카라이드를 가수분해시키는 효소(이후 폴리사카리다제로 언급함)의 연구에 집중되고 있다. 글리코칼릭스를 분해하여 생체막을 제거하거나 공업용수 시스템중의 점액질 형성을 방지하기 위하여 폴리사카리다제와 같은 효소를 사용하는 것은 당해 분야에 숙지되어 있다.

이미 이에 대해, 산업상 점액질 또는 생체막의 조성에 대한 각각의 상이한 관점을 기본으로 하는 몇가지 방안이 제안된 바 있다.

첫번째 방법은 점액질중에서 배출된 엑소폴리사카라이드에 대해서 활성이 아니고, 세포벽중의 폴리사카라이드에 대해서 활성인 용해 효소를 사용하는 것이다. 따라서 이들 효소는 세포벽을 파괴하여 세균을 박멸시킨다. 예를 들면, 독일 제37 41 583호에는, 세포벽중의 1,3-글루코스에 대한 용해 효소 활성을 갖는 글루카나제와 프로테아제로 이루어진 혼합물을 사용하는 것이 기술되어 있다. 그러나, 세균 세포를 보호하는 점액질층이 효소가 세포벽에 도달하는 것을 방지할 수 있다.

두번째 방법은 세균종에 의해 생산되는 단독형 폴리사카라이드로 이루어진, 산업 점액질에 대한 것이다. 예를 들면, 미국 특허 제3,824,184호 및 제3,773,623호에는, 야생형 세균에 의해 생산된, 레반을 파괴하는 레반 가수분해효소를 사용하는 것이 기술되어 있다. 그러나, 레반은 슈크로스상에서 성장하는 세균에 의해서만 생산된다. 제지 공장 또는 냉각 시스템의 경우, 슈크로스가 현저한 양으로 존재하는 것 같지는 않기에, 레반이 생체막의 중요한 성분은 아니다.

캐나다 특허 제1,274,442호 및 WO 90/02794에는 주로 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)에 의해서 생산되는, 알기네이트를 분해하는 효소인 알기네이트 리아제를 사용하는 것이 기술되어 있다. 그러나, 슈도모나스 종은 대개 평야 조건하에서는 알기네이트를 대량 생산하지 않으며 그러한 점이 알기네이트의 사용을 제한한다.

또한, 산업상 점액질은 항상 산업 장소에 따라 변화될 수 있는, 상이한 미생물로 이루어진 집단에 의해 생산된다. 산업상 점액질(생체막)은 각각의 미생물이 자신만의 특징적인 엑소폴리사카라이드(EPS)를 생산하기 때문에 결코 단일 엑소폴리사카라이드로 이루어지지는 않는다.

US 4,055,467에는 냉각탑에서의 생체막 형성을 방지하기 위하여 펜토사나제-헥소사나제를 사용하는 것이 기술되어 있다.

세번째 방법은 수많은 상이한 헤테로폴리사카라이드가 산업적 점액질중에 존재한다는 사실로부터 시작되었다. 이들 폴리사카라이드가 주로 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 람노스, 리보스, 클루코사민, 갈락토사민, 만누론산, 갈락투론산 및 글루쿠론산으로 매우 복잡한 배열로 이루어져 있다는 것은 당해 분야에 숙지되어 있다[참조: L. Kenne et al.; G. Aspinall(ed.) The Polysaccharides, vol. II(1983), Academic Press; I.W. Sutherland; Surface Carbohydrates of the Procaryotic Cell, Academic Press, London, 1977, 27-96]. 또한, 수많은 기타 당 성분이 소량으로 존재한다.

따라서, 산업적 점액질에 대해 약간의 효과를 갖도록 하기 위해서는 수많은 상이한 효소 활성이 혼합되어야 함을 추정할 수 있다. 그러나, 점액질의 모노사카라이드 조성에 대한 지식이 생체막을 성공적으로 제거할 수 있는 효소 혼합물을 규정하기에 충분치 못하다. 각각의 모노사카라이드는 여러가지 상이한 방법으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 글루코스는 알파-1,2, 알파-1,3, 알파-1,4, 알파-1,6, 베타-1,2, 베타-1,3, 베타-1,4 또는 베타-1,6 연결될 수 있다. 이들 각각의 경우, 별개의 효소 활성이 첨가될 수 있다. 또한, 인접한 모노사카라이드와 사카라이드상의 치환체가 특정 폴리사카리다제의 활성에 대해 매우 중요하다.

또한, 생체막중에서 발견되는 폴리사카라이드의 주요 사카라이드 형성 블럭중 하나에 대해 가능한 수많은 활성 중 하나를 갖는 단일 폴리사카리다제, 또는 심지어 몇가지 종류의 폴리사카리다제의 혼합물이 생체막중의 헤테로폴리사카라이드의 복잡한 조성에 대해 효과가 없거나 매우 제한된 효과만을 갖게됨은 통상적으로 예상된다. 그러나, 일부 복잡한 혼합물이 헤테로폴리사카리다제의 분해에 대해 양성 효과를 갖는다는 것이 당해 분야에서 발견되었다. 미국 특허 제5,071,765 및 유럽 특허원 제0388 115호는 각각 베타- 및 알파-1,4-결합된 글루코스와 세포외 단백질을 공격하는 셀룰라제, 알파-아밀라제 및 프로테아제의 혼합물를 사용하는 것에 관한 것이다. 아밀라제가 점액질 분자의 외부에 흠을 내어, 셀룰라제가 구조중으로 침입하도록하여 점액질을 분해하도록한다고 기술되어 있다. 그러나, 점액질이 외부에 알파-1,4-결합과 내부에 베타-1,4-결합을 갖는다는 것이 결코 입증된 바 없다.

미국 특허 제5,238,572호에는 갈락토시다제, 갈라투로니다제, 람노시다제, 크실로시다제, 푸코시다제, 아라비노시다제 및 알파-글루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소의 혼합물이 기술되어 있다.

생체막 형성을 방지하기 위한 네번째 방법은 점액질 형성의 초기 단계, 즉 세균의 접착을 억제하는 것이다. 유럽 특허원 제0 425 017호에는 미생물이 표면에 부분적으로, 타입 II 엔도글리코시다제와 반응성인 결합에 의해 결합된다고 기술되어 있다. 이들 종류의 효소(엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제, 엔도-알파-N-아세틸갈락토사미니다제 및 엔도-베타-N-아세틸갈락토시다제)는 당단백질중에서 발견되는 특정의 내부 글리코시드 결합을 분해시킬 수 있다. 이들 효소중 일부는 또한 용해성이 것으로 공지되어 있다.

생체막 제거 또는 생체막 방지를 위하여, 수많은 효소의 혼합물을 필요로하거나, 단지 1종 또는 수종의 효소만을 사용하는, 수많은 상이한 효소 방법이 당해 분야에서 제안되었으마, 이들은 제한된 범위의 활성만을 갖는다. 또한, 이들 방법은 점액질을 제거 또는 억제하는 것외에, 수성 시스템의 표면에 세균이 접착하는 것을 방지하고 접착된 세균을 분리시키는 조성물을 제공하지 못하였다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 문제점은 광범위한 활성을 갖는 효소 조성물 또는 효소를 제공하는 것이다. 바람직하게는 상기 조성물이 또한 세균 부착을 방지하고 시스템 표면에 이미 부착된 세균을 분리시킬 수 있어야 한다. 특히, 상기 조성물은 단일종 효소 또는 단지 몇가지 종류의 효소의 단순한 혼합물을 함유하는 것으로 제공되어야 한다. 유리하게는, 상기 조성물이 어떠한 살균제도 함유하지 않아야 한다. 효소 또는 효소들은 당해 분야의 효소 또는 효소 혼합물에 대해 공지된 양보다 적은 양의 효소를 사용할 수 있을 정도의 활성을 가져야 한다.

그러므로, 본 발명의 목적은 통상의 살균제가 갖는 단점을 피하면서 이들의 효과를 달성하거나 능가할 수 있는, 점액질 형성의 방지 및 수성 시스템의 표면상의 생체막 감소 및/또는 제거를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 수성 시스템에서 발견되는 세균, 특히 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 군으로부터의 세균에 의해 생산되는 엑소폴리사카라이드를 분해시킬 수 있는 효소 1종 이상을 포함하는 효소 조성물을 제공함으로써 상기 문제점이 해소된다. 본 발명의 효소 및 효소 조성물은 점액질 형성을 방지하고(하거나) 수성 시스템의 표면상 생체막을 감소하고/하거나 제거하는데 유용하다. 본 발명의 특정 양태로, 본 발명의 효소는 콜란산을 분해시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생체막의 감소, 제거 및/또는 방지는 생체막중의 엑소폴리사카라이드의 감소 및/또는 제거 및/또는 수성 시스템 표면상 엑소폴리사카라이드의 부착 방지를 포함한다.

엔테로박테리아세애는 이들 세균과 함께 캡슐 또는 느슨한 점액질로 대량의 점액질을 구성할 수 있는 어느곳에나 편재하는 미생물이다. 엔테로박테리아세애는 제지 공장에서 뿐만 아니라 냉각수에서[참고 문헌: Drew Chemical Corporation, Principles of Industrial Water Treatment, 1978, 2nd ed., p. 90] 또는 음료수 배급 시스템에서[참고 문헌: LeChevallier et al., Appl. Env. Microb. 53, 1987, 2714-2724] 발견된다. 이 군의 세균은 콜란산으로 공지된 M-항원 폴리사카라이드를 포함하여, 엑소폴리사카라이드를 생산하는 것으로 공지되어 있다[참고 문헌: Aspinall, The Polysaccharides, Academic Press(1983), 314].

본 발명에 따라, 놀랍게도 엑소폴리사카라이드 분해 효소, 특히 콜란산 분해 효소를 포함하는 조성물이 광범위한 활성을 가지며 상이한 종류의 수많은 미생물에 대해 활성임이 밝혀졌다.

본 발명의 범주내에서, 엑소폴리사카라이드 분해 효소(또한 엑소폴리사카리다제 또는 EPS'ase로 언급됨) 또는 콜란산 분해 효소는 각각 미생물, 특히 세균 기원 또는 파아지-방출 효소일 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라서 상기 조성물은 변성 조건하에서 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)에 의해 측정한 바, 분자량이 약 100kDa인, 세균 기원의 세포외 효소인, 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 포함한다. 바람직하게는, 상기 효소는 스트렙토마이세스 균주 GDR-7을 적합한 배지에서 배양시킴으로써 생산된다. 상기 균주는 미국 매릴랜드주 20852 록크빌, 파크론 드라이브 12301 소재, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1994년 7월 27일자로 부다페스트 조약하에 기탁번호 ATCC 55601로 기탁되었다.

본 발명의 효소 및 효소 조성물은 기탁 균주 ATCC 55601 또는 당해 분야에 숙지된 방법으로 파아지 게놈농후제가 수소화된 비버유이고, 소수성 액체 비히클이 카프르산/카프릴산의 트리글리세라이드인 조성물.

스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601을 적합한 배지중에서 배양시켜 수득한, 파아지 게놈[참고 문헌: Sutherland, Surface carbohydrates of the procaryotic cell, 1977, p 232]으로부터 또는 기탁 균주 ATCC 55601로부터 유래된 상기 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 적합한 숙주 세포(미생물, 특히 세균, 식물 또는 동물 세포)를 배양함으로써 제조된다.

상기 언급한 세균으로부터 수득하거나, 파아지를 배양시킴으로써, 또는 유전공학적 방법에 의해 수득한 효소는 점액질 형성의 방지 및/또는 생체막의 감소 및/또는 제거를 위하여, 조효소 배양 상등액의 형태 또는 이의 정제된 형태(즉, 효소가 세포 및 배지로부터 분리된 형태)로 사용될 수 있다. 효소의 적합한 회수 및 정제 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다.

본 발명의 바람직한 양태로, 상기 효소는 세균 숙주 세포, 특히 상기 효소를 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 포함하는, 스트렙토마이세스로부터 유래된 세균 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하여 제조한다. 특히, ATCC 기탁 번호 55601에 대응하는 스트렙토마이세스 균주 GDR-7, 또는 이로부터 유래된 세포 균주가 본 발명의 효소(즉, 엑소폴리사카리다제)의 생산에 가장 적합하다. 본 발명의 가장 바람직한 양태로, 엑소폴리사카리다제의 분자량은 변성 조건하에서 SDS-PAGE로 측정한 바, 약 100 kDa이다. 엑소폴리사카라이드 분해 활성을 갖는 효소를 생산할 수 있는, 스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601의 돌연변이체, 변이체 또는 형질전환체가 또한 본 발명에 따라서 바람직하다.

또한, 스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601로부터의 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 암호화하는 이의 유전자 또는 단편을 적합한 숙주 세포, 특히 세균, 식물 또는 동물 세포에서 클로닝하여 발현시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 효소는 엑소폴리사카라이드를 분해시킬 수 있는, 생물학적 활성 유사체, (천연 및 합성) 변이체, 표소의 단편 및 화학적으로 개질된 유도체를 포함한다. 본 발명에 따라서, 상기 효소의 1차, 2차 및/또는 3차 구조를 이의 생물학적 활성이 유지되는한 변형시킬 수 있다.

본 발명에 따라서, 엑소폴리사카리다제(정제 또는 조형태)는 클렙시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 크산토모나스(Xanthomonas) 등과 같은 다른 세균 균주에 대해서도 활성이다. 따라서 상기 활성은 엔테로박테리아세애 이외의 여러가지 세균종을 함유하는 시스템중의 생체막 제거에 있어서 효소 조성물의 효과에 기여한다.

본 발명의 범주내에서, 효소 조성물은 또한 폴리사카리다제, 프로테아제, 라피제 및 글리코프로테아제로 이루어진 군으로부터의 효소 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 하나의 양태로, 예를 들면, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에 의해 생산된 세린 프로테아제(이 효소는 통상적으로 알칼리성 프로테아제로 언급됨), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로테아제 타입 XXI, 및 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) 타입 IX의 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제를 1종 이상 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 세정 조성물중에서 가장 널리 사용되는 프로테아제는 여러가지 바실러스 균주로부터 유래되는 알칼리성 프로테아제이다. 노보 노르디스크 바이오인더스트리알사(NOVO Nordisk Bioindustrials Inc.)로부터 상표명 에스페라제(Esperase; 등록상표) 및 알칼라제(Alcalase; 등록상표) 및 기스트-브로케이드(Gist-Brocades)로부터 막사타제(Maxatase; 등록상표) 및 막사칼(Maxacal; 등록상표)로 시판되는 프로테아제가 바람직한 알칼리 안정성과 단백분해 활성을 가지며, EPS'ase와 함께 사용하기에 유용하다. 특히, 엑소폴리사카라이드를 아스퍼길러스 사이토이(Aspergillus saitoi)의 아스퍼길러스 산 프로테아제와 함께 사용하는 것이 가장 유리하다.

또한, 본 조성물은 효소 안정화제, 특히 글리세롤, 솔비톨, 글루코스 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택된 안정화제를 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 효소 조성물은 수성 시스템의 표면상에서의 점액질 형성 방지 및/또는 생체막의 감소 및/또는 제거 방법에 성공적으로 사용된다. 상기와 같은 방법에서, 본 조성물은 단독 위치 또는 상이한 부위에 수성 시스템에 가한다. 효소 조성물이 (활성) 성분을 1종 이상 포함하는 경우, 특정 환경에서 상이한 부위에 성분을 가하는 것이 바람직할 수 있다.

효소 조성물은 시스템 용적에 대해, 발효 배양액의 1 내지 10,000ppm, 바람직하게는 5 내지 500ppm의 양으로 가할 수 있다. 콜란산 분해 활성의 경우 본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 0.001 내지 100,000 유니트/㎖, 바람직하게는 0.01 내지 10,000 유니트/㎖ 범위의 농도로 가한다.

본 발명의 효소 조성물은 어떠한 수성 시스템에서든지, 즉 생체막 생산 미생물을 함유하는 개방 또는 폐쇄 공업 공정수 시스템에서 점액질 방지 및 생체막 제거에 적합하다. 제지 공장에서의 개방 또는 폐쇄수 사이클, 특히 백색수 사이클, 또는 냉각 사이클용으로 특히 적합하다. 또한 산업용 냉각탑, 물 저장 탱크, 물 분배 시스템, 펄프 및 제지 공장 용수 뿐만 아니라 한외여과 및 투석막에서의 생체막 제거 및 보건상의 생체막 제거에 사용할 수 있다. 또한, 점도 조절용, 또는 특정 모노 또는 올리고사카라이드의 생산용 발효에 사용할 수 있다.

본 발명에 따라서, 특히 놀랍게도 엔테로박테이라세애에 의해 생산된 엑소폴리사카라이드를 가수분해 (분해)하는 단일 효소가 야생형 세균에 의해 형성된 생체막의 방지 및 이미 존재하는 생체막의 감소 및/또는 제거에 적합하다. 또한, 단일 미생물의 엑소폴리사카라이드에 대해 활성인 단일 효소가 일반적으로 상기와 같이 엑소폴리사카라이드에 대해 높은 활성을 발휘한다는 것은 거의 예측하지 못하는 것이었다.

그 중에서도 본 발명의 잇점은 상기 효소가 이의 활성을 이미 점액화 과정의 매우 초기에 개시한다는 사실에 있는 것으로, 이때 엑소폴리사카리다제가 생체막 형성전에 세균의 접착을 방지한다는 것이다. 또한, 상기 효소는 이미 접착한 세균을 떼어낼 수 있으며 수성 시스템의 표면으로부터 생체막을 효과적으로 제거한다.

본 발명에 따라서, 점액질 감소, 생체막 형성의 제거 및 방지에 관한 상승 또는 적어도 추가의 효과가 엑소폴리사카리다를, 폴리사카리다제, 프로테아제, 리파제 및 글리코프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 효소 1종 이상과 혼합함으로써 성취된다(여기서 프로테아제가 추가 효소로서 가장 바람직하다).

상기 효과는 특히 바실러스 리케니포미스의 세린 엔도프로테아제, 스트렙토마이세스 그리세우스의 프로테아제 타입 XXI, 또는 바실러스 폴리믹사 타입 IX의 메탈로프로테아제, 및 특히 아스퍼길러스 사이토이로부터의 아스퍼길러스 산 프로테아제에 의해 증강된다.

본 발명에 따라서, 상기 효소 및 이들 효소 조성물은 (a) 세균 접착 방지, (b) 접착된 세균의 제거 및/또는 (c) 생체막의 분해에 적합하다.

항생제 대신 본 발명의 효소 조성물 또는 엑소폴리사카라이드를 사용하는 것이 바람직하지만, 항생제와 함께 사용할 수 있으며 어떤 경우에는 바람직할 수 있다.

본 발명의 효소 및/또는 효소 조성물은 또한 당해 분야의 숙련가에게 명백한 계면활성제 및 세제와 같은 적합한 표면-활성제와 혼합할 수 있다. 적합한 계면활성제는 양이온, 비이온, 음이온, 양쪽성 및 츠비터이온 계면활성제로부터 선택할 수 있다. 상기와 같은 적합한 계면활성제의 예를 들면, 비제한적으로 다음과 같다: 적합한 음이온계 계면활성제로는 벤젠 설포네이트, 알킬 설페이트, 알킬 폴리에톡시 에테르 설포네이트, 지방산 모노글리세리드 설페이트 및 설포네이트, 알킬페놀 폴리에톡시 에테르 설페이트, 파라핀 설포네이트, 알파-올레핀 설포네이트, 알파-설포카르복실레이트 및 이들의 에스테르, 알킬 글리세릴 에테르 설포네이트, 지방산 모노글리세라이드 설페이트 및 설포네이트, 알킬페놀 폴리에톡시에테르 설페이트, 2-아실옥시-알칸-1-설포네이트, 및 베타-알킬옥시 알칼 설포네이트의 수용성 염이 있으며; 적합한 비이온성 계면활성제로는 지방 알콜 에톡실레이트를 포함하는 지방 알콜 알콕실레이트와 같은 수용성 에톡실레이트 물질, 1급 및 2급 에톡실레이트, 알킬페놀 에톡실레이트를 포함하는 알킬페놀 알콕실레이트, 및 EOPO(에톡실레이트-프로폭실레이트) 차단 중합체가 있다.

본 발명은 이후 실시예를 참고로 설명된다.

실시예에서, 엑소폴리사카라이드를 분해할 수 있는 효소(엑소폴리사카리다제 또는 EPS's 아제로 언급됨)는 영양 배지중에서 스트렙토마이세스종 ATCC 55601을 발효시킨 다음, 배양액으로부터 상기 효소를 회수함으로써 생산한다. 하부의 상세한 기술은 각각의 스트렙토마이세스종 균주, 효소의 생산 및 회수, 효소 제제의 활성을 측정하기위한 검정법 및 생체막의 방지 및 제거에 있어서 보조제로서 효소의 적용을 제시하는 것이다.

실시예 1

엑소폴리사카라이드를 분해할 수 있는 효소를 생산하는 스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601, 상기 효소의 단리 및 동정

1. 균주의 설명

상기 효소를 생산하는 균주 ATCC 55601은 16S rRNA 분석 및 화학주성 마커에 의해 스트렙토마이세스속에 속하는 것으로 동정되었다. 종의 동정은 데이타에 의해 획득할 수 없다.

형태학적 마커

주변 균사체 경사/회색

포자 체인 나선형

멜라닌 생산 포지티브

기질 균사체 갈색

확산성 안료 적색

화학주성 마커

LL-디아미노피멜산 존재

다이콜산 부재

메나퀴논 MK-9(H₄), MK-9(H₆), MK-9(H₈)

지방산 프로필:

이소- 및 이소전-분지된 지방산.

본 명세서에서 미생물은 스트렙토마이세스종을 언급한다. 본 미생물은 부다페스트 조약하에 1994년 7월 27일자로 미국 매릴랜드주 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에 ATCC 수탁번호 55601로 기탁되어 있다.

스트렙토마이세스종(ATCC 55601)이 바람직한 엑소폴리사카리다제 공급원인 반면, 기술된 바와 같이 엑소폴리사카리다제를 생산하는 다른 종의 유용한 스트렙토마이세스 세균이 동정될 수 있다.

2. 균주의 성장 및 효소의 생산

균주(ATCC 55601)는 여러가지 통상적인 배지, 예를 들면, 트립신 대두 아가상에서 용이하게 성장한다. 주변 균사체 형성은 전문 무기염 아가와 유사한 특이적 배지로 제한된다. 상기 효소는 미생물 스트렙토마이세스종을 글루코스, 글리세롤, 락토스, 프럭토스, 슈크로스, 전분 등과 같은 적합한 탄소-공급원을 함유하는 적합한 배양 배지중에서 배양시킴으로써 생산할 수 있다. 질소-공급원으로서 암모늄염, 질산염 등 및/또는 펩톤, 효소 추출액, 육즙, 대두 추출액, 대두분, 옥수수 침지액, 주정 건조물, 카제인, 면실 단백질 등과 같은 복합 유기 질소 공급원과 같은 여러가지 물질이 사용될 수 있다. 무기염으로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화망간, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산수소이나트륨, 인산수소이칼륨, 황산마그네슘, 황산제이철, 황산아연, 염화칼슘 등이 포함될 수 있다. 추가로, 소포제를 가할 수 있다. 본 발명의 범주내에서 바람직한 배양 배지가 문헌[참조: M. Sarra et al., Biotechnology Letters 15(1993) 559-564]에 기술되어 있다.

발효 초기 pH는 바람직하게는 5.5 내지 8이다. pH는 또한 발효중에 조정될 수 있으며, 바람직하게는 pH 5 내지 9, 더욱 바람직하게는 pH 5.5 내지 8이다. 발효는 20 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃에서 수행한다.

전형적으로 발효는 접종균의 크기 및 발효 인자에 따라 0.5 내지 3일간 수행한다. 발효는 통상의 침수식 발효 또는 표면 배양으로 수행할 수 있다.

스트렙토마이세스종(ATCC 55601)을 사용한 발효를 통한 효소의 직접적인 생산이외에, 상기 효소를 암호화하는 유전자 또는 이의 단편을 클로닝하여 적합한 발현 벡터중에서 발현시킬 수 있다. 가수분해 효소의 클로닝에 대한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있어 본 발명의 엑소폴리사카리다제의 제조에 적합한 클로닝 방법을 사용할 수 있다. 이에 대해 다음 문헌을 참고할 수 있다: J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, 1989.

3. 효소의 회수 및 다운스트림 프로세싱

발효후, 원심분리 또는 여과법에 의해 세포를 회수할 수 제거할 수 있다. 필요한 경우, 여과, 동결건조, 2상 수성계를 사용한 추출 또는 아세톤 등과 같은 유기 용매 또는 황산암모늄과 같은 무기염을 사용한 침전법과 같은 당해 분야에 공지된 기술로 효소를 추가로 농축 및/또는 정제할 수 있다. 경우에 따라, 겔 투과, 이온 교환 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피와 같은 크로마토그라피 또는 기타 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 상등액 배양액을 정제하여 농축시킬 수 있다. 농축할 필요가 없을 경우, 조 상등액, 바람직하게는 세포 제거후 상등액을 효소의 조공급원으로 사용할 수 있다.

4. 효소 검정법의 설명

A. 엑소폴리사카리다제가 활성인지 아닌지는 이후 기술되는 방법(이후 확산 플레이트(또는 부위 시험) 방법으로 언급)을 통하여 정성적으로 검정할 수 있다.

세균 균주를 액체 배지, 예를 들면, 트립티카제 대두 배양액, 영양 배양액중에서 로그상에 도달할 때 까지 성장시킨다. 이어서 상기 배양물 100 ㎕를 고체 배지, 바람직하게는 높은 C/N 비율을 갖는 고체 배지상에 스포팅한다. 적합한 배지는 예를 들면, 문헌[참조: M. Sarra et al., Biotechnology Letters 15(1993) 559-564]에 기술되어 있다. 수득한 배양물을 배지에 균일한 점액성 커버가 생길때 까지 30℃에서 2 또는 3일간 배양시킨다.

이후, 엑소폴리사카리다제 10㎕를 점액층의 상부에 가한다. 투명한 구멍(즉, 할로)가 출현할 경우, 상기 효소는 평가시 균주에 대해 활성인 것으로 간주한다.

B. 효소의 활성을 또한 점성도 검정법으로 정량적으로 검정할 수 있다. 효소가 세균 시험 샘플, 이들에 의해 생산된 점액질 및/또는 폴리사카라이드에 대해 활성인 경우, 상기와 같은 시험 샘플에 효소를 가하면 폴리사카라이드의 효소 가수분해로 인하여 점도가 감소된다.

엑소폴리사카라이드(이후 EPS로 언급)의 용액을(하기와 같은, 실시예 2의 방법으로) 제조하고 특정양의 효소와 함께 배양시킨다. 이후 혼합물을 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨다. 이어서 불활성화된 혼합물을 증류수로 전체 용적이 16㎖가 되도록 희석한다.

이어서 위벨로드 점도계를 사용하여 점도를 측정한다. 제공된 조건, 즉, pH 7, 30℃에서 30분내에 점도를 50% 감소시키는 효소의 양을 활성 1 단위로 간주한다.

점도 감소는 수학식 1에 따라서 측정한다:

상기식에서,

점도 블랭크 1: EPS-용액을 가하기전에 효소를 불활성화시킨것.

점도 블랭크 2: EPS-용액 대신 완충액 3㎖를 함유하는 용액에 효소를 가함.

5. ATCC 55601에 의해 생산된 엑소폴리사카리다제의 특성

엑소폴리사카리다제는 변성 조건하에서 SDS-PAGE로 측정한 바, 분자량이 약 100kDa인 세포외 효소이다. 온도의 함수로서 활성을 도 1에 제시한다. 최대 활성은 45℃ 근처에서 나타난다.

도 2는 pH의 함수로서 활성을 나타낸다. 최적 pH는 pH 4.5 내지 pH 5.5 사이이다.

천연 효소에 대한 열안정성 연구는 35℃에서 3.5시간의 반감기, 및 50℃에서 45분의 반감기를 나타낸다. 열안정성은 글리세롤, 솔비톨, 글루코스, EDTA 등의 첨가와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 향상될 수 있다.

본 효소는 바실러스 리케니포미스의 세린 엔도프로테아제(예, Alcalase: 등록상표 - Novo, Esperase: 등록상표 - Novo), 스트렙토마이세스 그리세우스의 프로테아제 타입 XXI, 바실러스 타입 IX의 메탈로프로테아제와 같은 프로테아제에 의해 불활성화되지 않는다. 아스퍼길러스 산 프로테아제와 혼합시 더욱 활성인 제제가 수득된다. EPS'ase를 아스퍼길러스 산 프로테아제와 혼합하면(세균 접착, 접착된 세균의 제거 및/또는 생체막의 제거에 관한) 활성에 1/99 내지 99/1 EPS'ase/프로테아제 스케일로 영향을 준다.

점액질 조절용의 경우 이들 프로테아제 등을 엑소폴리사카리다제와 혼합하는 것이 유리하다. 점액질 제거에 적합한 기타 프로테아제가 선행 기술, 예를 들면, EP 0 590 746로부터 공지되어 있다.

6. ATCC 55601의 배양으로부터 상등액 배양액의 활성

특이적 엑소폴리사카리다제 활성외에, 상응하는 당의 p-니트로페닐 유도체를 사용하여 다음 활성을 검출한다:

*N-아세틸-β-D-글로코사미니다제

*알파-L-푸코시다제

술파닐아미드-아조카세인(R.M. Tomarelli et al., J. Lab. Clin. Med. 34, 1949, 428)을 사용하여 프로테아제 활성을 또한 관찰한다.

관찰한 활성은 생체막 방지 및/또는 제거에 유리하게 기여할 수 있다.

하기 컬쳐 콜렉션 균주로 이루어진 세포층상에 효소를 스포팅할 때, 정화 효과(clear effect)를 볼수 있다:

엔테로박터 클로아새(Enterobacter cloacae) NCTC 9395

클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) LMG 3055

클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena) LMG 3207

클렙시엘라 플랜티콜라(Klebsiella planticola) LMG 3065

클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) LMG 2095

슈도모나스 피케티(Pseudomonas picketii) LMG 5942

크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) NRRL 1453

수성 시스템의 여러가지 세균에 대한 EPS'ase의 활성은 점액질 샘플로부터 단리된 세균을 사용한 정성적 효소 검정법(4.A.의 부위 시험, 상기 설명)을 이용하여 확인한다. 세균을 감자 덱스트로스 아가상에서 성장시키고, 48시간 동안 30℃에서 배양시켜 점액질층을 형성시킨다. EPS'ase의 3% 스톡 용액을 제조한다. 이후, EPS'ase의 3% 스톡 용액 10 ㎕를 상기 층에 스포팅한다. 결과는 하기와 같다:

샘플 번호	세균	결과
73	엔테로박터종	포지티브-정화
74	클렙시엘라종	포지티브-정화
84	동정 안됨	포지티브-정화
86	동정 안됨	포지티브-정화
87	오크로박테리움 안트로피	네가티브
88	아크로박테리움 라디오박터 B	포지티브-정화
91	슈도모나스 포라기	포지티브-정화

본 실험은 본 발명의 EPS'ase가 엔테로박테리아세애 뿐만 아니라 다른 세균종(즉, 아크로박테리움 및 슈도모나스)에 대해서도 활성임을 증명한다. 그러나, 엔테로박터 균주에 대한 활성이 다른 균주에 대한 활성 보다 훨씬 크다.

본 발명의 EPS'ase는 또한 상업적으로 입수가능한 기타 효소와 함께 사용할 수 있다. Novo Nordist로부터 입수한 3종의 시판 효소, Esperase: 등록상표, Cereflo: 등록상표, 및 Gamanase: 등록상표에 대해 EPS'ase(3% 스톡 용액으로, 이후 EPS'ase 3%로 기술함)를 사용하여 상기 점 시험을 반복한다.

Esperase: 등록상표는 바실러스의 친알칼리 종의 침지식 발효에 의해 생산된 세린-타입 프로테아제이다.

Cerefle: 등록상표는 바실러스 서브틸리스의 침지식 발효에 의해 생산된 정제된 세균성 β-글로카나제 제제이며; 상기 효소는 맥아 및 보리 β-글루칸(1,4-β-, -1,3-β-글루칸)을 3 내지 5개의 글루코스 단위를 갖는 올리고사카라이드로 분해하는 엔도-글루카나제이다.

Gamanase: 등록상표는 아스퍼길러스 나이거로부터 제조된 갈락토-만나제(1,4-β-D-만나 만나노히드롤라제)이며; 상기 효소는 만난, 갈락토만난, 및 글루코만난에서 β(1-4) 밴드를 무작위적으로 가수분해한다.

이 시험에서, 세균 단리물에 대해 다음 조합물을 사용한다. 효소는 50:50 비율로 함께 혼합한다. 각 혼합물 10㎕를 세균층상에 스포팅한다.

(a) EPS'ase 3% + Esperase: 등록상표 8.0ℓ(50/50)

(b) EPS'ase 3% + Cereflo: 등록상표 200ℓ(50/50)

(c) EPS'ase 3% + Gamanase: 등록상표 1.5ℓ(50/50)

결과는 다음과 같다:

샘플 번호	세균	포지티브 결과
73	엔테로박터종	a, b, c
74	클레시엘라종	a, c
84	동정 안됨	b, c
86	동정 안됨	a, b, c
87	오크로박테리움 안트로피	a, c
91	슈도모나스 프라기	a, b, c

상기 결과는 본 발명의 EPS'ase가 다른 상업적으로 입수가능한 효소와 함께 적합하게 사용될 수 있음을 나타내는 실질적인 증거를 제공한다.

7. 생체막 방지 및 제거 능력

생체막 형성은 공업용 냉각탑, 물 저장 탱크, 물 분배 시스템, 펄프 및 제지 공장용수, 의료용 한외여과 및 투석막과 같은 여러가지 환경에서 일어난다.

제지 공장의 가공용수를 모형화한 실험에서(하기 참조), 본 발명의 엑소폴리사카리다제를 적용하면 생체막과 함께 있는 점액질을 가수분해시켜, 대조군과 비교시 생체막의 두께를 감소시킨다. 상기 효소를 적용하면 2가지 메카니즘, 세균의 부착 방지 및 접착된 세균의 제거 촉진을 통하여 생체막의 형성을 감소시킨다.

생체막을 방지하거나 제거하는데 필요한 엑소폴리사카리다제의 양은 시스템의 오염에 따른다. 지침으로서, 1 내지 10,000 ppm, 바람직하게는 5 내지 500 ppm의 투여량이 적합하다. 콜란산 분해 활성의 경우, 0.001 내지 100,000 단위/㎖, 바람직하게는 0.01 내지 10,000 단위/㎖의 투여량이 적합하다. 상기 효소는 단번에 투여하거나 나누어 투여할 수 있으며, 또는, 경우에 따라, 연속적으로 가할 수 있다. 액체 제형을 투여하는 것이 더욱 용이하기 때문에, 상기 효소를 포함하는 액체 조성물이 바람직하다. 경우에 따라, 정제형과 같은 무수 제품을 가할 수 있다. 액체 제형으로 가하는 경우, 상기 효소는 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들면, 글루코스, 솔비톨, 글리세롤, EDTA 등의 첨가에 의해 안정화시키는 것이 바람직하다.

실시예 2

정량 분석용으로 대표적인 엑소폴리사카라이드 구조, 또는 EPS 구조를 문헌: Garegg et al., Acta Chem. Scand. 1971, 25(4), 1185-1194의 방법에 따라서 제조할 수 있다. 세균 균주, 우선적으로는 엔테로박터 클로아새 NCTC 9395를 하기와 같이 나타낸 조성의 고체 배지(pH 7)상에서 성장시킨다:

성분	농도(g/ℓ)
D-글루코스	4.0
NH₄Cl	0.4
Na₂HPO₄.2H₂O	7.5
KH₂PO₄	3.0
NaCl	0.5
MgSO₄.7H₂O	0.2
아가	15

세균을 30℃에서 48시간 동안 성장시킨다. 이어서 이들을 긁어내고 인산염 완충액, pH 7중에 현탁시킨다. 이후, 상기 용액을 30000 G에서 30분간 원심분리시킨다. 상등액을 증류수에 대해 투석시키고 0.1 N NaOH를 가하여 pH 10 내지 11로 만든다. 본 제제중에 존재하는 EPS는 2배 용적의 냉 아세톤(-18℃)을 가하여 침전시킨다. 이후 수득한 EPS를 동결 건조시킨다.

실시예 3

스트렙토마이세스종 균주 ATCC 55601를 하기에 나타낸 조성의 배지(pH 7)가 들어있는 삼각 플라스크에서 성장시킨다:

성분	농도(g/ℓ)
효모 추출액	10
전분	10
트립톤	5
MgSO₄.7H₂O	0.5
MnCl₂.4H₂O	0.1
EPS	2

상기 배양물 250rpm에 30℃에서 회전 증발기상에서 36시간 동안 성장시킨다. 엔테로박터 클로아세 NCTC 9395에 대해 점-시험을 통하여 활성을 검정한다. 높은 엑소폴리사카리다제 활성을 나타내는 정화 구멍(clearing holes)이 1시간내에 출현한다. 이후 상기 배양액을 원심분리시키고 황산암모늄으로 상등액을 65%로 포화시킨다. 침전물을 동결 건조시키고 엑소폴리사카리다제(EPS'ase)의 공급원으로 사용한다.

실시예 4

실시예 3에 기술된 바와 같은 동결건조시킨 EPS'ase 분말 2g을 트리스 완충액 0.1M, pH 7 100㎖에 용해시킨다. 엔테로박테리아세 EPS(0.5g)를 트리스 완충액(0.1M, pH 7) 100㎖에 용해시킨다. 상기 EPS'ase 1㎖를 EPS 용액과 합하여 30℃에서 30분간 배양시킨다. 30분후, 혼합물을 5분간 100℃에서 가열하여 반응을 중단시킨다. 제1 블랭크는 미리 불활성화시킨 효소 1㎖를 EPS 3㎖와 함께 포함한다. 제2 블랭크는 불활성화시킨 효소 1㎖는 포함하지만 EPS 용액이 트리스-완충액 3㎖로 대체되었다. 3가지 샘플의 점도를 30℃에서 자동으로 등록되는 위벨로드 점도계로 측정한다. 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다:

샘플의 점도(pH=7, 온도=30℃)

샘플	점도(mm²/S)
점도 제1 블랭크 (EPS + 불활성화시킨 EPS'ase)	3.079
점도 제2 블랭크 (완충액 + 불활성화시킨 EPS'ase)	0.827
점도 샘플 (EPS + EPS'ase)	1.010

엑소폴리사카리다제는 EPS-용액의 점도를 확실히 감소시키는데, 이는 엑소폴리사카리다제의 분해를 증명하는 것이다. 실시예 1, 4. B의 수학식에 의해 계산된 점도의 감소율은 91.9%이다.

실시예 5

생체막 제거를 시험하기 위하여, 제지 공장의 습식-종결부를 모형화한 생체 오물 반응기(biofouling reactor)를 사용한다. 상기 발효기에서 성장시킨 세균은 제지 공장의 귀찮은 단리물로, 엔테로박테리아세에 속하며 다량의 EPS를 생산하는 것으로 알려져 있다. 혼합 용기에서, 세균을 희석수 및 영양소와 혼합한다. 하기에 나타낸 농도의 영양소를 본 시험 단위에 적용시킨다:

화합물	농도 (ppm)
NaCl	10
K₂HPO₄	3
글루코스	200
크실로스	100
갈락토스	20
아라비노스	1
만노스	0.5
프럭토스	20
양이온성 전분	30
박토 소이톤	20

상기 혼합 용기를 순환 금속 시험부가 장치되어 있는 PVC 닥트에 연결한다. 이들 시험부는 효소 첨가 전 및 후에 중량을 잰다. 또한 현탁된 고체의 총량을 효소 첨가중 모니터한다.

상기 시험 단위는 30 내지 35℃, pH 7에서 작동시키며 평균 체류 시간은 1시간이다.

생체막은 7 일간 발달시킨다. 이 기간후 2 내지 5 ㎜ 두께의 생체막이 발달하게 된다. 효소로서, 스트렙토마이세스종의 삼각 플라스크 배양물의 조 상등액을 사용한다. 효소는 4개의 등량부로 나누어 가한다. 각각의 투여량은 전체 투여량 4500 ppm에 상응한다. 무게 법정량이 도 3에 제시되어 있다.

효소 첨가를 시작한지 24시간후 생체막이 제거된다. 첨가와 동시에, 생체막의 제거를 육안으로 알수 있게 된다. 혼합 용기중에 형성된 더 많은 부분의 생체막은 효소 첨가시 벗겨진다. 이런 생체막의 제거는 연속적으로 일어나진 않지만 단계적으로 일어나는데, 이는 리그(rig)중에 이미 형성된 점액질이 다량인 데 원인이 있는 것 같다.

실시예 6

EPS'ase의 방지 능력을 IR 검출기가 장착된 제2 리그 시스템으로 평가한다. IR 흡광도는 생체막 두께와 선형으로 상관된다. 리그는 다음 조건하에서 작동시킨다:

온도	35℃
pH	7
평균 체류 시간	20분
유동 속도	0.66m/s

제지 공장으로부터의 단리물을 접종원으로 다시 사용한다(실시예 5 참조). 리그 시스템중 세균 농도는 초기에 5.0.10⁶CFU/㎖로 정한다.

EPS'ase는 매일 30분간 4회 투여한다. 시스템중 최대 농도는 30분후 200ppm이다.

효소 처리된 리그중 생체막 형성은 비처리 리그중에서의 발달 상황 보다 훨씬 떨어진다(도 4). 상기 리그 둘다 동시에 작동시킨다. 이는 엑소폴리사카리다제가 생점액질의 제거 뿐만 아니라 이의 방지에도 유용함을 증명하는 것이다.

실시예 7

생체막 제거 및 방지에 관해 관찰된 효과가 오로지 EPS의 효소 가수분해에 기인한 것인지를 증명하기 위하여 다음 실험을 수행한다. 제지 공장으로부터의 세균 단리물을 다음 조성을 갖는 액체 배지(pH 7) 중에서 성장시킨다:

성분	농도 (g/ℓ)
글루코스	15
세균학적 펩톤	7
NaCl	5

500㎖짜리 삼각 플라스크 2개에 상기 배지 100㎖를 채우고 세균으로 접종한다. 삼각 플라스크 하나에 EPS'ase 용액 1㎖를 가한다. 삼각 플라스크 2개에서 성장시킨 다음 600nm에서 광학 밀도를 측정한다. 발효 말기에, 30시간후, 삼각 플라스크의 내용물을 원심분리시키고 상등액의 점도를 측정한다(표 2).

발효 30시간 후 처리 및 비처리 삼각 플라스크의 점도

삼각 플라스크	점도(mm²/s)
비처리	3.977
+ 효소	1.212
모두 멸균	0.834

EPS 형성은 EPS'ase를 투여함으로써 방지된다. 두개의 삼각 플라스크에서의 광학 밀도가 필적할만한 결과를 제시하므로 성장은 영향을 받지 않는 것으로 판단된다(도 5).

본 실험은 스트렙토마이세스종의 상등액이 EPS에 대해서만 영향을 발휘하며 효소 제제는 세균을 사멸하거나 세균 성장을 제한하지 않음을 입증한다.

상기 실험은 또한 본 효소를 사용하여 EPS-형성 미생물의 발효중 레올로지 및 점도 변수를 조절할 수 있음을 입증한다. 본 발명의 효소는 엑소폴리사카라이드가 점도를 조절하기위한 보조제를 사용하여 생산되는 경우의 발효에 적용할 수 있다. 이는 발효기중의 산소 전달을 증강시켜 교반용 에너지 소모를 감소시킬 수 있도록 한다.

또한, 엑소폴리사카리다제는 단리된(즉, 정제된) 형태로 사용할 수 있다. 단리는 당해 분야에 숙지된 효소의 적합한 회수 및 정제 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 본 효소를 사용하여 산 가수분해 대신 생산후 폴리사카라이드를 가수분해시킬 수 있다. 이에 대한 적용예는 폴리사카라이드로부터 당의 집중적인 분리이다. 예를 들면, 폴리사카라이드는 콜란산일 수 있다.

실시예 8

EPS-형성 미생물(실시예 7 참조)이 EPS를 생산하도록 한다. 이후 배양물을 원심분리시키고 합성 제분 완충액중에 재현탁시킨다.

수많은 효소가 살균제에 의해 불활성화될 수 있다는 것은 공지되어 있으며, 상기와 같은 각각의 실험은 2개의 파트로 나누어져 있다. 효소가 존재하지 않는 살균제 대조군 및 성장 대조군과는 별도로, 효소와 살균제가 동시에 첨가되는 세트(동시 실험)와 살균제 첨가를 효소를 첨가한 후 1시간 경과한 후에 수행하는 다른 세트(연속적 실험)가 있다. 이 경우, 효소는 살균제를 가하기전에 배양물의 성장중 형성되는 EPS를 분해시킬 기회를 갖는다. 표 3에서 Bronopol(2-브로모-2-니트로-1,3-프로판디올)에 대한 결과는 포지티브 효과를 입증한다. 3시간후 99.99%를 사멸시키는데 필요한 농도는 살균제 전에 효소를 가할 경우 반으로 줄게된다(즉, 25 ppm에서 12.5 ppm으로). 또한, Kathon WT(5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 + 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 13.9%) 및 글루타르알데히드를 사용하는 경우의 결과도 제시한다.

살균성에 대한 EPS'ase의 영향

살균제 대조군
시간	대조군	희석	K12,5ppm	K25ppm	B12,5ppm	B25ppm	G200ppm	G400ppm
30'	+31,11	1/100	+2,22	-10	+2,22	-2,22	-27,77	?
		0	?	?	?	?	?	-99,99
180'	+694,44	0	?	-99,98	?	-99,99	-99,92	-99,99
동시적 실험
시간	대조군	희석	K12,5ppmE	K25ppmE	B12,5ppmE	B25ppmE	G200ppmE	G400ppmE
30'	+70,59	1/100	+47,06	+45,59	+52,94	+45,59	-13,24	?
		0	?	?	?	?	?	-99,99
180'	+1032,35	0	?	-98,49	?	-99,99	?	-99,99
연속적 실험
시간	대조군	희석	K12,5ppm	K25ppmS	B12,5ppmS	B25ppmS	G200ppmS	G400ppmS
30'	+19,77	1/100	+24,42	+6,98	-5,81	-31,40	-11,63	-98,35
		0	?	?	?	?	?	-99,99
180'	+795,35	0	?	-99,95	-99,81	-99,99	?	98,49
' = 분단위의 시-% = t = 0'에서 성장 대조군과 비교한 사멸%+% = t = 0'에서 성장 대조군과 비교한 성장%? 는 계수하기에 너무 과하게 성장한 플레이트를 의미함K = Kathon WT, B = Bronopol, G = 글루타르알데히드

실시예 9

여러가지 세균, 및 이들에 의해 생산된 점액질에 대한 EPS'ase의 활성을 추가로 입증하기 위하여, 점도계 검정법(실시예 1, 4.B 참조)을 사용하여 아시네토박터종(Acinetobacter sp.)을 시험한다. 비교용으로 엔테로박터종을 동시에 시험한다.

분석용으로 선택한 특정 샘플은 단일 세포 세균의 거대한 플레이트 계수(현미경으로 측정)를 기본으로 선택하고, 이들은 또한 점액성 매트릭스를 갖는다. 아시네토박터종이 슈도모나스 멘도시나, 슈도모나스 플루오레센스 C, 슈도모나스 푸티다 A 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스/게노스페시에스 2를 포함한 아시네토박터 바우마닐리/게노스페시에스 2를 포함하는 것으로 확인되었다. 상기 엔테로박터종은 클레시엘라 테리게나를 포함한 클렙시엘라 슈도모니애 A를 포함하는 것으로 확인되었다.

실시예 5의 막이 형성되어 더럽게되는 반응기 리그를 사용하여 아시네토박터종 및 엔테로박터종 둘다에 대해 생체막을 생산토록한다. 이후 생체막 점액질을 순환성 금속 시험 부위의 벽으로부터 단리하여, 이들을 각각 동일한 고속으로 원심분리시켜 각각의 엑소폴리사카라이드 용액을 분리시킨다. 각각의 엑소폴리사카라이드 용액의 샘플에, EPS'ase의 3% 스톡 용액(EPS'ase 3%)dmf 1000ppm의 농도로 가한 다음, 2시간 동안 35℃에 50rpm에서 배양시킨다. 열-불활성화 대조군 및 물을 고려하여 점도 감소를 계산한다(실시예 1, 4.B의 방법으로). 결과는 다음과 같다:

시험 샘플	점도 변화 %
아시네토박터종 + EPS'ase 3%	-19
엔테로박터종 + EPS'ase 3%	-32

이들 결과는 본 발명의 EPS'ase가 엔테로박테리아세에 대해서 활성일 뿐만 아니라, 수계에서 통상적으로 발견되는 다른 세균에 대해서도 활성임을 입증한다.

실시예 10

EPS 형성에 유리한, 적합한 배지중에서 미생물을 성장시키고, 아세톤 침전법에 의해 배지로부터 EPS를 수거하여 최종 생성물을 동결 건조시킴으로써 제지 공장으로부터의 세균 단리물(Enterobacter)로부터 엑소폴리사카라이드(EPS)를 정제한다.

작업 용량이 1.2ℓ인 다음 배지(g 또는 ㎖/ℓ로): 박토-펩톤, 7g; NaCl, 5g; K₂HPO₄, 3g; KH₂PO₄, 0.9g; 글루코스, 15g; 및 소포제 8270(Dearborn Chemicals), 0.05㎖를 함유하는 2ℓ-발효기중에서 엔테로박터를 성장시킨다. 750 rpm에서 교반시키면서, 30℃, pH 7.0에서 발효를 수행하는데, 이때 분당 배지 용적당 공기 0.6 용적으로 통기시킨다. 56시간후, 발효 배양액을 13,600 x g에서 1시간 동안 원심분리시켜 세포를 제거한다. 빙냉 아세톤 1 ℓ를 배양물 상등액 분획에 가한다. 이로 인하여 혼합물의 표면상에 부유하는 겔화 물질이 부유한다. 겔화 물질을 표면으로부터 걷어내고, 남게되는 용액의 pH를 1N NaOH를 가하여 pH 11로 조정한다. 추가로 아세톤 500㎖를 가하고, 용액을 4℃에서 24시간 동안 냉각시킨다. 이로 인하여 용액의 표면상에서 부유하는 추가의 겔화 물질이 생성된다. 이 물질을 표면으로부터 수거하고 제1 겔화 분획과 합한다. 상기 합한 분획을 Milli-Q에 4℃에서 밤새 용해시키고 투석액의 전도성이 0.037 마이크로Ohms/cm²가 될 때까지 Milli-Q에 대해서만 투석시킨다. 투석후, 투석액을 동결건조시키고 4℃에서 보관한다.

실시예 11

겔 투과 크로마토그라피는 실시예 10에서 제조한 엔테로박터 EPS의 MW가 2.10⁶이상임을 나타낸다. 10⁴내지 10⁶영역에서 관찰되는 다른 분자량 분획을 없다. EPS'ase를 사용한 접촉 시간이 3시간 경과된 후, 점도가 실질적으로 이미 감소되었음에도 불구하고, 분해 생성물은 볼수 없다. 24시간후, MW 2.10⁶에서 피크가 사라지고 새로운 브로드 피크가 4.10⁵에서 관찰된다. 이는 더 장시간의 배양 시간에서도 거의 일정하게 유지된다. GPC에 의해 나타난 바와 같은 EPS'ase에 의한 정제된 EPS의 분해가 도 6에 나타나 있다.

실시예 12

실시예 10에 따라서 제조된 EPS의 글리코실 조성 분석을 카르복실기 환원 전 및 후에 모두 알디톨 아세테이트의 제조 및 GC 분석으로 수행한다.

방법은 문헌: York, et al; Methods Enzymol. 118(1985) 3-40에 기술되어 있다. 간략하면, 소량의 엔테로박터 EPS를 2M 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 121℃에서 2시간 동안 가술분해시킨다. 생성된 모노사카라이드를 중수소화붕산나트륨을 사용하여, 이들의 알디톨로 환원시킨다. 이후 생성된 알디톨을 피리딘중에서 아세트산 무수물을 사용하여 아세틸화한다. 알디톨 아세테이트를 슈펠코(Supelco)로부터 모세관 SP2330 컬럼을 사용하는 GC로 분석한다. 존재하는 우론산의 종류를 특성화하기 위하여, 소량의 샘플을 메탄올성 1M HCl로 80℃에서 수시간 동안 처리한다. 글루쿠론산 또는 갈락튜론산과 같은 산성 당의 메틸 에스테르를 포함하는, 생성된 메틸글리코시드를 중수소화붕산나트륨을 사용하여 환원시킨다. 이 방법으로 우론산의 메틸 에스테르가 대응하는 헥소스로 환원된다. 예를 들면, 글루쿠론산 메틸 에스테르가 글루코스로 환원된다. 생성된 혼합물을 TFA를 사용하여 가수분해하고 상기한 바와 같이 알디톨 아세테이트로 전환시킨다. GC 분석을 또한 상기한 바와 같이 수행한다.

부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트를 제조하여 분석함으로써 글리코실 결합 분석을 수행한다. 이는 문헌: Ciucanu and Kerek; Carbohydrate Res., 131(1984) 209-217에 기술된 방법으로 수행한다. 이 방법에서는, 샘플을 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 용해시키고 수산화나트륨 분말을 가하여 DMSO 음이온을 생산한다. 이를 실온에서 수시간 동안 교반시키고 이후 과량의 요오드화메틸을 가하여 과메틸화 폴리사카라이드를 형성시킨다. 이때 과메틸화 샘플을 2개의 파트로 나눈다. 한 파트는 TFA중에서 가수분해시키고 상기한 바와 같이 알디톨 아세테이트로 전환시킨다. 제2 파트의 폴리사카라이드는 1M HCl중에서 메틸화하여 생성된 부분적 메틸화된 메틸 글리코시드를 중수소화붕산나트륨으로 처리하여 부분적으로 메틸화된 우론산 잔기를 이들의 대응하는 헥소스로 전환시킨다. 전환시, 이들 당 잔기는 C-6에 부착된 2개의 중수소 원자를 갖게 되는데, 이들은 질량 스펙트럼 분석시 정상적인 헥소스와 구별할 수 있도록 한다. 생성된 과메틸화 카르복실 환원된 메틸 글리코시드를 가수분해시켜 상기한 바와 같이 부분적 메틸화된 아세세이트로 전환시킨다. 두 파트에 대한 분석은 Supelco로부터의 SP2330 모세관 컬럼을 사용하는 혼합된 GC-MS로 수행한다.

결과:

글리코실 조성 및 메틸화 결과는 하기 표 4에 나타낸다:

실시예 10에서 제조된 엔테로박터 EPS의 글리코실 조성 분석

글리코실 잔기	상대적 %
푸코스	37
갈락토스	34
글루코스	29

표 4에 제시된 조성의 경우, 카르복실기 환원전에 분석을 수행한 것이다. 카르복실기 환원후, 글루코스의 양이 현저히 증가하는데, 이는 상기 EPS에 존재하는 우론산 잔기의 종류가 글루쿠론산임을 나타내는 것이다.

표 5는 세포외 폴리사카라이드의 글리코실 결합 분석 결과를 나타낸다.

글리코실 결합 분석

글리코실 잔기	상대적 GC 피크 면적%
말단 결합된 갈락토스	4.1
4-결합된 푸코스	14.0
3,4-결합된 푸코스	20.0
3-결합된 글루코스	20.0
3-결합된 갈락토스	19.0
4,6-결합된 갈락토스	22.0

카르복실기 환원후 결합 분석으로 4,6-결합 갈락토스 등과 등량으로 존재하는 4-결합 글루쿠론산으로 확인된, 추가의 피크가 있음을 알게된다. 이들 결과는 상기 EPS가 4-결합된 푸코스: 3,4-결합된 푸코스: 3-결합된 글루코스: 3-결합된 갈락토스: 4-결합된 글루쿠론산: 4,6-결합된 갈락토스의 비가 1:1:1:1:1:1임을 나타낸다. 이들 결합은 일반적으로 콜란산에 대해 이미 공개된 구조와 일치한다(참조: G. Aspinall(ed.) The Polysaccharides, vol. II(1983), Academic Press).

실시예 13

추가적인 리그 연구를 수행하여 EPS'ase가 엔테로박테리아세에 의한 오물화(참조: 실시예 6)를 방지함을 확인한다. 이들 리그 연구용으로 사용되는 EPS'ase는 실시예 3에 따라서 수득한다.

생체막 방지 능력은 실시예 5에 기술된 리그를 이용하여 평가한다:

시험 조건
유동 속도	0.74m/s
온도	35℃
pH	7
평균 체류 시간	1시간
리그를 오염시키기위해 사용되는 균주	점액질로부터의 엔테로박터종 단리물(실시예 5 참고)
시험 지속 기간	100 시간

시험 A

EPS'ase에 대한 투여량 섭생: 일당 4회 30분으로 피크 농도가(94ppm) 콜란산 분해 활성 4.4·10⁴단위/ℓ이었다. 이는 35% 억제 결과이다.

시험 B

EPS'ase에 대한 투여량 섭생: 일당 4회 30분으로 피크 농도가 콜란산 분해 활성 44단위/ℓ이었다. 이는 30% 억제 결과이다.

리그 연구에 대한 EPS'ase의 활성 단위는 다음과 같이 측정한다:

1. EPS 발효 배양액으로부터, 50mM MES(pH 5.5)(MES = 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산)의 일련의 희석물을 제조한다.

2. 각각의 희석물로부터 25㎕를 48시간 경과된 엔테로박터 표면상에 스포팅한다. 32℃에서 60분간 배양시킨다.

3. 정화 영역 직경을 측정한다.

4. 각각의 정화 영역 직경에 대응하는 희석 수준을 곱한다.

5. 모든 생성물의 합은 EPS'ase 단위/0.025㎖와 같다.

실시예 14

다음 실험은 EPS'ase가 엑소폴리사카라이드 분해 효소, 즉, EPS'ase 활성이 엔테로박테리아세로 제한되지 않는다는 사실에 대한 추가적인 증거를 제공한다.

실시예 1의 6번 상타에 기술된 실험을 점액질로부터 단리된 하기와 같은 동정균을 사용하여 반복한다. 하기 단리물의 세포층상에서 Halo's를 관찰할 수 있다. 불활성화 효소를 적용할 경우내수와 Halo's는 생성되지 않는다.

엔테로박터종(Enterobacter sp.) 단리물 1

엔테로박터종 단리물 2

슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi)

클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) A

슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)

슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)

엔테로박터 아스부리애(Enterobacter asburiae)

도 1은 온도의 함수로서 실시예 1의 효소의 활성을 나타낸다.

도 2는 pH의 함수로서 실시예의 효소의 활성을 나타낸다. 최적 pH는 pH 4.5 내지 5.5 사이이다.

도 3은 실시예 1의 효소를 사용하는 시간의 함수로서 생체막 제거에 대한 결과를 나타낸다(실시예 5 참조).

도 4는 실시예 1의 효소를 사용하는 시간의 함수로서 점액질 방지에 대한 결과를 나타낸다(실시예 6 참조).

도 5는 실시예 1의 효소를 사용하는 시간의 함수로서 EPS 형성 방지에 대한 결과를 나타낸다(실시예 7 참조).

도 6은 GPC에 의해 측정한 바와 같은 EPS'ase에 의한 정제된 EPS의 분해를 나타낸다(실시예 11 참조).

Claims

스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601을 적합한 배지중에서 배양시켜 수득한, 엑소폴리사카라이드 분해 효소.
제1항에 있어서, 변성 조건하에서 SDS-PAGE로 측정한 바, 효소의 분자량이 약 100kDa임을 특징으로 하는 효소.
제1항 또는 2항에 있어서, 엑소폴리사카라이드 효소가 콜란산을 분해할 수 있음을 특징으로 하는 효소.
스트렙토마이세스 균주 ATCC 55601로부터의 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 암호화하는 유전자 또는 이의 단편을 적합한 숙주 세포중에서 클로닝 및 발현시켜 수득할 수 있는 엑소폴리사카라이드 분해 효소.
제4항에 있어서, 엑소폴리사카라이드 효소가 콜란산을 분해할 수 있음을 특징으로 하는 효소.
제4항 또는 5항에 있어서, 숙주 세포가 세균 세포임을 특징으로 하는 효소.
제6항에 있어서, 세균 세포가 스트렙토마이세스로부터 유래됨을 특징으로 하는 효소.
제1항 내지 7항 중의 어느 한 항에 따르는 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 하나 이상 포함함을 특징으로 하는, 수성 시스템의 표면상의 생체막의 감소, 제거 및/또는 방지용 효소 조성물.
콜란산을 분해할 수 있는 효소를 하나 이상 포함함을 특징으로 하는, 수성 시스템의 표면상의 생체막의 감소, 제거 및/또는 방지용 효소 조성물.
제9항에 있어서, 콜란산 분해 효소가 세균 기원임을 특징으로 하는 조성물.
제8항 내지 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 폴리사카리다제, 프로테아제, 리파제 및 글리코프로테아제로 이루어진 군으로부터의 효소 1종 이상을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 효소가 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에 의해 생산된 세린 엔도프로테아제, 스트렙토마이세스 그리세우스의 프로테아제 타입 XXI, 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) 타입 IX의 메탈로프로테아제 및 아스퍼길러스 사이토이(Aspergillus saitoi)의 아스퍼길러스 산 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제임을 특징으로 하는 조성물.
적합한 배지중에서 스트렙토마이세스 ATCC 55601을 배양시킴을 특징으로 하는, 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 효소의 생산 방법.
스트렙토마이세스 ATCC 55601로부터의 엑소폴리사카라이드 분해 효소를 암호화하는 유전자 또는 이의 단편을 적합한 숙주 세포중에서 클로닝하여 발현시킴을 특징으로 하는, 제1항 내지 3항 중의 어느 한 항에 따르는 효소의 생산 방법.
수성 시스템의 표면상의 생체막의 감소, 제거 및/또는 방지를 위한, 제1항 내지 7항 중의 어느 한 항에 따르는 효소 및/또는 제8항 내지 12항 중의 어느 한 항에 따르는 조성물의 용도.
제15항에 있어서, 수성 시스템이 개방식 또는 폐쇄식 공업용 가공수 또는 냉각수 시스템임을 특징으로 하는 용도.
제16항에 있어서, 공업용 가공수 시스템이 제지 공장에서의 개방식 또는 폐쇄식 물 사이클임을 특징으로 하는 용도.
제15항에 있어서, 표면이 한외여과 또는 투석막임을 특징으로 하는 용도.
엑소폴리사카라이드의 분해를 위한, 제1항 내지 7항 중의 어느 한 항에 따르는 효소 및/또는 제8항 내지 12항 중의 어느 한 항에 따르는 조성물의 용도.
ATCC 55601에 상응하거나 이로부터 유래된 스트렙토마이세스 균주.