KR19980703534A - 사람 크립틴 성장 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 크립틴 성장 인자 폴리펩티드(CGF) 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 상기 폴리펩티드를 재조합 기술에 의해 제조하는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 상처를 치유하거나 조직을 재생시키고, 이식체 고정을 자극하고 혈관을 형성하기는데 상기 폴리펩티드를 이용하는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드에 대한 길항제, 및 종양과 같은 신형성을 치료하고/하거나 예방하기 위한 치료제로서의 이들의 용도를 기술한다. 또한, 본 발명은 암을 탐지하기 위하여 CGF 핵산 서열 내에서의 돌연변이 여부 및 CGF 폴리펩티드의 변형 수준를 동정하기 위한 진단 분석법을 기술한다.

Description

사람 크립틴 성장 인자

본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 사람 크립틴 성장 인자(종종 CGF로서 후술됨)로서 추정상 동정되었다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 억제 작용에 관한 것이다.

성장 인자, 및 형질전환되는 온코진(oncogene)을 포함하는 기타 유사분열물질이, 특정 세포에 의해 발현될 복합 유전자 세트를 신속하게 유도할 수 있다[참조: Lau, L. F. and Nathans, D.,Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6:165-202(1991)]. 즉시(immediate early) 반응성 또는 초기(early) 반응성 유전자로 불리우는 이들 유전자는 새로이 시작되는 단백질 합성과는 독립적으로, 성장 인자 또는 유사분열물질과 접촉한 후 수분 이내에 전사적으로 활성화된다. 이들 즉시 반응성 유전자 그룹은 분화 및 증식, 재생 및 상처 치유와 같은 복잡한 생물학적 과정의 협력을 필요로 하는 분비된 세포외 단백질을 암호화한다[참조: Ryseck, R.P. et al.,Cell Growth Differ., 2:235-233(1991)].

이들 즉시 반응성 유전자의 발현은 성장 인자의 의해 유발된 사건의 케스케이드(cascade)에서 제3의 메신저로서 작용한다. 또한, 이들 유전자는 세포 증식이 공통적인 사건으로 발생되는 복잡한 생물학적 과정, 예를 들면, 분화 및 상처 치유를 통합하고 이를 협조해야할 필요가 있는 것으로 여겨진다.

크립틴 성장 인자는 특정 유형의 암 세포, 예를 들면, 췌장암 세포에 의해 과발현되어 분비된다.

본 발명의 CGF는 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,256,643호에 기술된 크립토 성장 인자와 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. 이러한 크립토 성장 인자는 유용한 종양 마커로 공지된 것 중의 하나이다. 크립토는 종종 결장암에서 상위조절되어 췌장암에서 발현된다.

본 발명의 한 국면에 따라, 신규의 성숙한 폴리펩티드, 및 생물학적으로 활성이고 진단상 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, mRNA, DNA, cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 사람 본 발명의 폴리펩티드, 및 생물학적으로 활성이고 진단상 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드를 상기 단백질의 발현 및 이에 후속되는 회수를 촉진시키는 조건하에, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양함을 포함하는 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 치료 목적, 예를 들어 근수척 질환인 골다공증을 치료하고, 이식체 고정을 도와주고, 상처 치유와 조직 재생을 자극하며, 혈관 형성을 촉진시키고, 혈관성 평활근의 증식과 내피 세포 생성을 자극하기 위해 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 국면에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다.

본 발명의 또다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하기 위하여, 예를 들면, 상처 치유 동안 또는 폐동맥 섬유증에서 과도한 결합 조직의 생성을 제한하기 위해 사용될 수 있는, 상기 폴리펩티드에 대한 길항제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브(probe)도 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드의 발현과 관련된 질환을 검진하고 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에서의 돌연변이를 검정하기 위한 진단 분석법을 제공한다.

본 발명의 추가의 국면에 따라, 과학적 연구 조사, DNA 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 시험관내 목적을 위하여, 상기 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 모든 국면은 본원의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백해야만 한다.

하기 도면은 본 발명의 양태를 예시하지만 청구의 범위에 포함된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 cDNA 및 상응하는 추론된 아미노산 서열을 예시한다. 아미노산에 대해 표준 단일문자 약어를 사용한다. 서열분석은 373 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystem, Inc.)를 사용하여 수행한다.

도 2는 본 발명의 폴리펩티드(상단)과 크립토 성장 인자(하단) 간의 아미노산 상동성을 도시한 것이다.

본 발명의 한 국면에 따라, 도 1(서열 2)의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드 또는 1995년 5월 11일에 ATCC 기탁번호 제97142호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 사람 췌장 조직으로부터 유도되는 cDNA 라이브러리 중에서 발견된다. 이는 구조적으로 사람 크립토 성장 인자와 관련이 있다. 이는 성숙한 단백질이 207개의 아미노산을 포함하도록 초기 23개의 아미노산 잔기가 추정상의 리더 서열인, 230개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 함유한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 크립토 성장 인자와 공통의 보존된 시스테인 잔기를 갖는다.

더욱이, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 2의 45번 아미노산에서 128번 아미노산까지를 포함하는 추정상의 가용성 부분을 갖기 때문에, 129번 아미노산에서 207번 아미노산 까지는 추정상의 전이막인 부분이다.

초기 노던 불롯 분석은 췌장암 세포에서 매우 고도로 발현된다는 것을 나타낸다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태이거나, 또는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 이러한 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고, 일본쇄일 경우 암호화쇄 또는 비-암호화(안티-센스)쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일하거나, 또는 유전자 암호의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 암호화 서열이 도 1의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1(서열 2)의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 단지 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열 및 리더 또는 분비성 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열(및 임의의 부가적 암호화 서열) 및 인트론과 같은 비-암호화 서열 또는 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'을 포함할 수 있다.

따라서, 용어 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단지 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 부가의 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.

또한 본 발명은 도 1(서열 2)의 추론된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 대립유전자성 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1(서열 2)에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 도 1(서열 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체로는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체가 있다.

앞서 지적한 바와 같이, 당해 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 2)에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 천연 대립유전자성 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자성 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변형시키지 않으면서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 대체 형태이다.

또한 본 발명은 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열이 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 상기 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비성 서열로서 작용하는 리더 서열과 동일한 판독 프레임에서 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질이고 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩티드의 성숙한 형태를 형성시키는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 + 부가의 5' 아미노산 잔기인 프로단백질을 암호화할 수도 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이고 단백질의 불활성 형태이다. 프로서열이 절단되면, 활성을 지닌 성숙한 단백질이 남게 된다.

따라서, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질, 프로서열을 갖는 단백질, 또는 프로서열과 프리서열(리더 서열) 모두를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 정제하도록 하는 마커 서열과 동일한 프레임 내에서 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 이러한 마커 서열은 세균성 숙주의 경우에는 상기 마커와 융합된 성숙한 폴리펩티드를 정제하기 위해 제공된, pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사히스티딘 태그(tag)일 수 있거나, 또는 예를 들어 COS-7 세포와 같은 포유류 숙주가 사용될 경우에는 혈구응집소(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프(epitope)에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)].

용어 유전자는 폴리펩티드 쇄를 생성시키는데 관여된 DNA의 세그먼트를 의미하고; 이는 암호화 영역의 전방 및 후방 영역(리더 및 테일러) 뿐만 아니라 개개의 암호화 세그먼트(엑손) 간의 삽입 서열(인트론)을 포함한다.

완전한 길이의 CGF 유전자의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리도화 프로브로서 사용하여 완전한 길이의 CGF 유전자를 분리하고 CGF 유전자와의 유사성이 높은 서열을 가지거나 유사한 생물학적 활성을 지닌 기타 유전자를 분리할 수 있다. 이러한 유형의 프로브는, 바람직하게는 약 30개 이상의 염기를 가지며, 예를 들면, 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 상기 프로브를 사용하여 완전한 길이의 전사물에 상응하는 cDNA 클론, 및 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 CGF 유전자를 함유하는 게놈성 클론(들)을 동정할 수 있다. 스크린의 한 예는 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 CGF 유전자의 암호화 영역을 분리하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성함을 포함한다. 본 발명에 따르는 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 프로브가 하이브리드화되는 라이브러리의 구성원을 결정한다.

또한 본 발명은 서열간에 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%의 동질성이 존재하는 경우, 상기 언급된 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 엄격한 조건이란 서열간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동질성이 존재하는 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 2)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.

또다르게는, 당해 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화되고 앞서 언급한 바와 같은 동질성을 가지며 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티를 회수하기 위한 서열 1의 폴리뉴클레오티드에 대한 탐침으로서, 또는 진단 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이의 단편(이러한 단편은 30개 이상, 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는다)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 언급된 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 협약하에 주장된다. 이들 기탁은 단지 당해 기술분야의 숙련인에게 편의를 제공하는 것이지 기탁이 35 U.S.C. §112 규정을 충족시켜야 하는 승인 요건은 아니다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오티드의 서열, 및 이에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본 명세서에서 참조로 인용되고 본 명세서내에 기술된 서열과 분쟁이 일어날 경우에 조정한다. 실시권은 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데 필요할 수 있는데, 어떠한 실시권도 본원에 의해 허여되지 않는다.

또한 본 발명은 도 1(서열 2)의 추론된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1(서열 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관해 언급할 경우, 용어 단편, 유도체 및 동족체는 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 동족체는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성을 지닌 성숙한 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 프로단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

도 1(서열 2)의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (ⅰ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않는 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 유전자 암호에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있는 것, (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (ⅲ) 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, (ⅳ) 리더 또는 분비성 서열; 성숙한 폴리펩티드의 정제를 위해 사용되는 서열; 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드와 융합되는 것 또는 (ⅴ) 특정의 아미노산 잔기가 결실되어 있긴 하지만 여전히 생물학적 활성은 보유하는 성숙한 폴리펩티드의 스플리스(splice) 변이체일 수 있다. 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인은 상기 단편, 유도체 및 동족체가 본 발명의 범주 내에 있다고 간주할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되고, 바람직하게는 동종성으로 정제된다.

용어 분리된이란 물질을 이의 본래 환경(예를 들면, 천연 물질인 경우에는 천연 환경)으로부터 제거함을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물 내에 존재하는 천연의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않으나, 천연 시스템 내에 공존하는 몇몇 또는 모든 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으므로, 상기 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아닌 경우에 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 2의 폴리펩티드(특히 성숙한 폴리펩티드) 뿐만 아니라 서열 2의 폴리펩티드와 70% 이상의 상동성(70% 이상의 동종성), 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 90% 이상의 상동성(90% 이상의 동종성), 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 95% 이상의 상동성(95% 이상의 동종성)을 지니는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 상기 부분을 갖는 상기 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

당해 분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 상동성이란 제2 폴리펩티드에 대한 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 비교함으로써 결정한다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데 사용할 수 있으므로, 이러한 단편을 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분을 사용하여 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포를, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)한다. 이러한 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 상기와 같이 조작된 숙주 세포를 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별 또는 CGF 유전자의 증폭에 적합하도록 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이고, 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 당해 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 각종 발현 벡터 중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이스성 DNA를 포함한다. 그러나, 그 외의 어떠한 벡터라도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 경우에는 사용될 수 있다.

적당한 DNA 서열을 각종 방법에 의해 벡터내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 DNA 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법은 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.

발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절(control) 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 DNA 합성을 지시한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli)lac또는trp, 파아지 람다 P_L프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스 내에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결인자를 함유한다. 상기 벡터는 발현을 증폭시키기에 적합한 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 진핵 세포 배양의 경우에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이 내에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별성 마커 유전자를 함유한다.

상기 언급된 바와 같은 적당한 DNA 서열 뿐만 아니라 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킴으로써 상기 숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 한다.

적합한 숙주의 대표적인 예로서는, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)과 같은 세균성 세포; 효모와 같은 진균성 세포; 드로소필라 (Drosophila) S2및 스포도프테라(Spodoptera)Sf9와 같은 곤충류 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적합한 숙주의 선별은 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있다고 간주된다.

보다 특히, 본 발명은 앞서 광범위하게 기술된 바와 같은 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물도 포함한다. 이러한 작제물은 본 발명의 서열을 전진 또는 후진 방향으로 삽입시킨 플라스미드 또는 바이러스성 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 상기 양태의 바람직한 국면에서, 작제물은, 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기 벡터가 예로써 제공된다. 세균성: pQE70, pQE60, pQE-9(공급원: Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(공급원: Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(공급원: Pharmacia). 진핵성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(공급원: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(공급원: Pharmacia). 그러나, 그 외의 어떠한 플라스미드 또는 벡터도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 CAT(Chloramphenicol transferase(클로람페니콜 트랜스퍼라제)) 벡터 또는 기타 벡터를 선별성 마커와 함께 사용하여 바람직한 어떠한 유전자로부터도 선별할 수 있다. 두가지 적합한 벡터는 PKK232-8 및 PCM7이다. 특정하게 명명된 세균성 프로모터로는 lacⅠ, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, P_L및 trp가 있다. 진핵성 프로모터로는 CMS 즉시 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ이 있다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선별은 충분히 당해 분야에서 통상적인 기술의 범주 내이다.

추가 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 저등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균성 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행할 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Method in Molecular Biology, (1986)].

숙주 세포 내의 작제물은 통상적인 방법으로 사용되어 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또다른 방법으로는, 본 발명의 폴리펩티드를 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.

성숙한 단백질은 적합한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 세균, 또는 기타 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해 무세포 해독 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵성 및 진핵성 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있고, 본 발명의 명세서에 참조로 인용된다.

고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서(enhancer) 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 통상적으로 약 10 내지 300b이고 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 cis-작용성 요소이다. 복제 기원 bp 100 내지 270의 말단측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 말단측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 예로서 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기원; 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별성 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)TRP1 유전자의 앰피실린 내성 유전자; 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 해당촉진성 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질이 세포질 공간 또는 세포외 매질 내로 분비되도록 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 상에서 어셈블리된다. 임의로, 이러한 이종 구조 서열은 목적하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 적합한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께, 작용성 프로모터를 가진 작동성 판독 상 내로 삽입함으로써 작제한다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선별성 마커 및 복제 기원을 포함하여 벡터를 유지할 수 있고, 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주 세포로는 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살포넬라 티피무륨, 및 슈도모나스(Pseudomanas) 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 내의 각종 종들이 있지만, 다른 것들을 선택하여 사용할 수도 있다.

대표적이나 이에 제한되지 않는 예로서, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 선별성 마커 및 세균성 복제 기원을 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터로는, 예를 들어 pKK223-3(제조원: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(제조원: Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 있다. 상기 pBR322 중축(backbone) 절편을 적당한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 결합한다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 다음, 선별된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 유도시키고 세포들을 추가 기간 동안 배양한다.

세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단으로 파쇄한 다음, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 당해 기술 분야의 숙련인에게 익히 공지된 방법들인 냉동-해동 순환, 초음파 분해처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 파쇄시킬 수 있다.

또한, 각종 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 기원, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플리스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랜킹 비-전사 서열을 포함한다. SV40 스플리스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비-전사 유전적 요소를 제공할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그패피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물이거나, 또는 화학적 합성 과정 또는 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양물 중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화 되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 CGF 유전자를 표지시키고 이를 엔도뉴클레이제 절단된 DNA 제제를 함유하는 서던 블롯 분석용 프로브로서 사용하여 종양 조직과 비교해서 정상 조직에서의 크립틴 유전자의 증폭, 재배열, 결실 또는 제한 단편 길이의 다형성이 있는지의 여부를 확인한다.

이와 같이 표지된 크립틴 유전자를 RNA를 함유하는 노던 블롯 분석에 사용하여 각종의 정상 조직 샘플과 병원성 조직 샘플에서의 mRNA의 상대적 발현 정도를 결정한다.

CGF 유전자를 사용하여 CGF mRNA를 발현하는 정상 또는 병원성 세포에서 역학적 국재화에 대한 동일계 RNA:RNA 하이브리드화에 적합한 프로브를 생성시킬 수 있다.

CGF 올리고뉴클레오티드(센스-쇄)를 사용하여 각종 조직에서의 CGF mRNA의 수준을 검정할 수 있다.

CGF 폴리펩티드는 특정 유형의 암 세포, 예를 들면, 췌장암 세포에 의해 과발현되어 분비된다. 따라서, CGF 유전자 전사 또는 과량의 CGF 단백질의 검출로 췌장암을 진단할 수 있다. 따라서, 항-CGF 항체가 종양 형성과 연관된 신생혈관형성을 진단하는데 사용될 수 있는데, 이는 이러한 폴리펩티드의 변형된 수준이 상기 질환의 징후일 수 있기 때문이다.

경쟁적 검정 방법을 사용할 수 있는데, 여기서는 CGF에 특이적인 항체를 고체 지지체에 부착시키고 표지된 CGF 및 숙주로부터 유도된 샘플을 상기 고체 지지체 위로 통과시키고 상기 고체 지지체에 부착되어 검출된 표지의 양을 샘플 내의 CGF의 양과 상관지울 수 있다.

샌드위치 검정은 ELISA 검정과 유사하다. 샌드위치 검정에 있어서, CGF 폴리펩티드를 고체 지지체 위로 통과시켜 이러한 고체 지지체에 부착된 항체와 결합시킨다. 이어서, 제2 항체를 CGF 폴리펩티드에 결합시킨다. 제2 항체에 특이적인 표지시킨 제3 항체를 고체 지지체 위로 통과시켜 제2 항체와 결합되게 한 다음 정량화할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 상처 치유 및 이와 연관된 조직(예: 결합 조직, 피부, 뼈, 연골, 근육, 폐 또는 신장)의 재-성장 관련 치료에 사용할 수 있다.

이러한 폴리펩티드를 사용하여 혈관성 평활근 및 내피 세포의 성장을 증진시켜 혈관 형성을 자극시킬 수도 있다. 이와 같은 혈관 형성의 증가는 허혈성 조직, 및 관상 협착에 따른 심장의 측부 관상 진행에 유익할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 이식체 고정 동안에 사용하여 이식체 주변의 세포 성장을 자극시킴으로써, 상기 이식체가 의도된 부위에 부착되는 것을 촉진시킬 수도 있다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 당해 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 사람 질병을 치료하기 위한 치료제 및 진단제를 개발할 목적으로 DNA 합성 및 DNA 벡터의 제작에 관한 과학적 연구와 관련된 시험관내 목적용 시험 시약으로서의 이용방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 이러한 수용체를 암호화하는 유전자를 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA를 CGF 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조하고, 이러한 RNA로부터 창출된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하고 CGF에 대해 반응성이 없는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는 발현 클로닝을 사용한다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 CGF에 노출시킨다. CGF를 부위 특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 혼입을 포함하는 각종 방법으로 표지시킬 수 있다. 고정 및 배양한 다음, 슬라이드를 대상으로 자동방사성사진술을 이용하여 분석한다. 양성 풀을 동정하고 서브-풀을 제조하고 반복되는 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 사용하여 재형질감염시켜, 최종적으로 추정상의 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.

수용체 동정에 대한 또 다른 접근법으로서, 표지된 CGF를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제와 광친화적으로 연결시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE에 의해 분할하고 X-레이 필름에 노출시킨다. CGF-수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고, 펩티드 단편으로 분할하고, 단백질 미소서열분석시킨다. 미소서열분석으로부터 수득된 아미노산 서열을 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인하는데 사용하여 추정상의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.

또한, 본 발명은 CGF 수용체와 결합하여 이를 활성화하는 것들을 동정하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 예들은 보조 유사분열물질(comitogen) Con A의 존재하에 내피 세포의 증식을 자극하는 것이다. 사람 제대 정맥 내피 세포를 수득하고 이를 96-웰 평저 배양 플레이트(제조원: Costar, Cambridge, MA)에서 배양하고 세포 증식을 촉진시키기에 적당한 반응 혼합물로 보충하는데, 이때 상기 혼합물은 Con A(제조원: Calbiochem, La Jolla, CA)를 함유한다. Con-A 및 스크리닝될 화합물을 가하고 37℃에서 배양한 후에, 배양물을 [³H]티미딘으로 펄스하고 유리 섬유 필터(제조원: PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA) 상에서 수거한다. 3중 배양물의 평균 [³H]티미딘 혼입(cpm)을 액체 신틸레이션 계수기(제조원: Beckman Instruments, Irvine, CA)를 사용하여 측정한다. 상당한 [³H]티미딘 혼입은 내피 세포 증식의 자극을 나타낸다.

길항제 화합물에 대해 분석하기 위해, 상기 언급된 분석을 수행하지만, 본 분석에서는, CGF를 스크리닝하고자 하는 화합물과 함께 가하고, CGF의 존재하에 [³H]티미딘 혼입을 억제하는 상기 화합물의 능력은 상기 화합물이 CGF의 길항제라는 것을 지시해준다.

또다른 방법으로는, CGF 길항제는, 표지된 CGF 및 효능있는 길항제 화합물을 경쟁적 억제 분석에 적합한 조건하에 막-결합된 CGF 수용체 또는 재조합 수용체와 조합함으로써 탐지할 수 있다. CGF를 예를 들면, 방사성 표지시켜, 수용체에 결합된 CGF 분자의 수가 효능있는 길항제의 유효성을 결정할 수 있도록 한다.

또 다른 방법으로는, 공지된 제2 메신저 시스템의 반응에 이어서 효능있는 길항제와 수용체와의 상호작용을 측정할 수 있다. 이러한 제2 메신저 시스템으로는 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시타이드 가수분해가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 화합물을 표지시켜 결합을 탐지할 수 있다. 결합되긴 하지만 제2 메신저 반응을 유발시키지는 않는 화합물이 효과적인 길항제 화합물이다.

효능있는 CGF 길항제의 예로는 상기 폴리펩티드 자체 또는 이러한 폴리펩티드에 대한 수용체와 결합하는 항체, 또는 몇몇 경우에서는 올리고뉴클레오티드가 있다. 또한, 효능있는 길항제는 CGF 수용체를 인식하지만 이에 어떠한 영향도 미치지 않음으로써 CGF의 작용을 경쟁적으로 억제시키는, 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들면, CGF의 돌연변이 형태일 수 있다.

또 다른 효능있는 CGF 길항제는 안티센스(antisense) 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 구조 형성을 통하여 유전자 발현을 조절하거나 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 조절하는데, 이들 방법 모두는 폴리뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인한다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관계된 유전자 영역에 상보적이도록 디자인함으로써[삼중 나선 - 참조: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)], 전사 및 CGF의 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 CGF 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단한다[안티센스-참조: Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 CGF의 생성을 억제할 수 있도록 한다.

효능있는 CGF 길항제는 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 기타 성장 인자 결합 부위와 결합됨으로써 CGF의 정상의 생물학적 활성을 차단시키는 작은 분자를 포함한다. 이러한 작은 분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자가 있지만 이에 제한되지는 않는다.

상기 길항제를 사용하여, 예를 들면, CGF 활성을 길항시키고/시키거나 아테롬성동맥경화증 및 재협착과 이에 따른 발룬(balloon) 혈관형성술에서 확산되는 평활근 세포의 신생물 혈관형성 및 신생동맥내막 증식을 길항시킴으로써 종양 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 억제할 수 있다.

상기 길항제를 다음에 언급된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명의 CGF 폴리펩티드 및 길항제 화합물을 적합한 약제학적 담체와 배합하여 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 당해 폴리펩티드 또는 길항제 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 배합물이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 제형물은 투여 형태에 적합해야 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 컨테이너와 관련된 사항은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이러한 통지는 상기 정부 기관에 의한, 사람 투여용 제품에 대한 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 다른 치료학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.

당해 약제학적 조성물은 통상적인 방법, 예를 들어 경구, 국부, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로로 투여할 수 있다. 약제학적 조성물은 특이적인 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 일반적으로, 이를 1일 약 10μg/체중 kg 이상의 양으로 투여하고 대부분의 경우에는 1일 약 8mg/체중 kg을 초과하지 않는 양으로 투여해야 한다. 대부분의 경우에, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 1일 약 10μg/체중 kg 내지 약 1mg/체중 kg이다.

CGF를 PDGF, IGF, FGF, EGF 또는 TGF-β를 포함하는 기타 성장 인자와 함께 사용하여, 상처 치료에서 보여준 바와 같은 생리학적 반응을 가속화시킬 수 있다.

CGF 폴리펩티드, 및 폴리펩티드인 효능제 및 길항제는 본 발명에 따라서, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현시킴으로써 사용할 수도 있는데, 이를 종종 유전자 치료(gene therapy)라고 부른다.

따라서, 예를 들어 환자의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 유전적으로 조작한 다음, 이와 같이 유전적으로 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 사용함으로써 당해 분야에 공지된 방법으로 조작할 수 있다.

유사하게, 예를 들어 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 폴리펩티드를 생체 내에서 발현시키기 위해 생체 내에서 조작할 수 있다. 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 생체 내에서 세포를 조작하고 생체 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기 과정에 의해 투여하는 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클(vehicle)은 레트로바이러스 이외의 것일 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스를 적합한 전달 비히클과 결합시킨 후에 생체 내에서 세포를 조작하는데 사용할 수 있다.

상기 언급된 레트로바이러스성 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 멍키 쥐과 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 로우스 육종 바이러스와 같은 레트로바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 기본 아페 백혈병 바이러스, 사람 면역결핍증 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 포유류 종양 바이러스가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 한 양태에 있어서, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터는 멍키 쥐과 백혈병 바이러스로부터 유도된다.

이러한 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 레트로바이러스성 LTR; SV40 프로모터; 및 문헌[참조: Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990(1989)]에 기재된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 기타 프로모터(예를 들면, 히스톤, pol Ⅲ 및 β-악틴 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 진핵성 세포내 프로모터와 같은 세포내 프로모터)가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이용될 수 있는 기타 바이러스성 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선택은 본 명세서의 교시로부터 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 이용될 수 있는 적합한 프로모터로는 아데노바이러스성 주 후기 프로모터와 같은 아데노바이러스성 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV)와 같은 이종 프로모터; 호흡기 합포체성 바이러스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 열 쇽 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터와 같은 바이러스성 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스성 LTR(상기 언급된 바와 같은 변형된 레트로바이러스성 LTR을 포함함); β-액틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 또한 당해 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 본래의 프로모터일 수도 있다.

레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 사용하여 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성할 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세의 예로는 본원에 참조로 삽입된 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, p. 5-14(1990)]에 기술된 바와 같은 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DNA 세포주가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 벡터는 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해서 패키징 유전자를 형질도입할 수 있다. 이러한 수단으로는 전기 영동, 리포좀의 사용 및 CaPO₄침전이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나의 또다른 양태에서는, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 리포좀 내로 봉입하거나 지질에 커플링시킨 다음 숙주에 투여할 수 있다.

생산자 세포주는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스성 벡터 입자를 생성시킨다. 이러한 레트로바이러스성 입자를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 진핵성 세포를 형질도입할 수 있다. 이와 같이 형질도입된 진핵 세포는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 배아 간세포, 배아 암종 세포, 및 조혈성 간 세포, 헤마토사이트, 섬유아세포, 근원세포, 각질세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 서열은 또한, 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정한 위치에 대해 특이적으로 표적되고 이와 하이브리화할 수 있다. 더욱이, 현재 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 필요가 있다. 염색체 위치를 표식하기 위한, 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 표식화 시약을 현재 거의 입수할 수 없다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA의 유전자 위치를 나타내는 것(지도화)은 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호연관시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.

간략히 언급하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 대해 지도화할 수 있다. 3' 비-해독된 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 내에 하나 이상의 엑손을 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선별하여, 증폭 과정을 복잡하게 만든다. 다음, 상기 프라이머를 개개의 사람 염색체를 함유하는 체강 세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생성시킬 수 있다.

체강 세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 DNA를 특정 염색체로 분배하기 위한 신속한 방법이다. 본 발명에 있어서 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 서브-국재(sublocalization)를 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 유사한 방법으로 성취할 수 있다. 이의 염색체로 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 지도화 방법으로는 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한, 동일계 내의 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선별 방법이 있다.

cDNA 클론을 중기 염색체 확산 배양물과 동일계 내에서 형광성 하이브리드화(FISH)시켜 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 또는 60개 염기정도로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 상기 기술의 재고를 위해, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.

서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호연관시킬 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man](Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로 구입할 수 있다)에서 발견된다. 다음, 동일한 염색체 영역에 지도화시킨 유전자와 질환간의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 공동유전형질)을 통해 동정한다.

다음, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 결정하는 것이 필요하다. 돌연변이가 몇몇 감염자 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상인에서는 관찰되지 않을 경우, 이러한 돌연변이가 아마도 상기 질환의 유발 원인제일 것이다.

통상적인 물리적 지도화의 분해 및 유전학적 지도화 기술을 이용하면, 상기 질환과 연관된 염색체 영역으로 정확하게 국재된 cDNA가 50 내지 500가지의 효능있는 유발 원인성 유전자 중의 하나일 수 있다(이는 1 메가염기 지도화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 취한다).

당해 폴리펩티드, 이의 단편 또는 기타 유도체, 이의 동족체, 또는 이들을 발현시키는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 이들 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날항체일 수 있다. 또한 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 사람적응화 항체 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 기술 분야에 공지된 각종 방법을 상기 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는, 상기 폴리펩티드를 동물 내로 직접 주사하거나 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 다음, 상기와 같이 수득된 항체는 상기 폴리펩티드 자체에 결합될 것이다. 이러한 방법으로, 당해 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열이라도 완전한 천연 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 이의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 및 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]이 있다.

일본쇄 항체의 제조를 위해 기술된 기술[미국 특허 제4,946,778호]을 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 일본쇄 항체를 제조하는데 적용할 수 있다. 또한, 유전자전환된 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 사람적응화 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이나; 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는 다는 것을 인지해야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 중량 기준이다.

하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해, 종종 나타나는 특정 방법 및/또는 용어에 관해 기술한다.

플라스미드는 처음에는 소문자 p로 표기하고/거나 그 다음에는 대문자 및/또는 숫자로 표기한다. 본 발명에서 출발 플라스미드는 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있도록 시판중이거나, 또는 시판용 플라스미드로부터 공개된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있고 통상의 숙련인에게 명백할 것이다.

DNA의 분해(digestion)란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 절단하는 것을 지칭한다. 본 발명에 사용된 각종 제한 효소는 시판용이고 이의 반응조건, 보조인자 및 기타 필요조건은 통상의 숙련인에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해서는, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 1μg을 약 20μl의 완충액에서 효소 약 2 유니트와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리하고자 하는 경우에는, 전형적으로 DNA 5 내지 50μg을 효소 20 내지 250 유니트를 사용하여 보다 큰 용적으로 분해한다. 특정 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변화될 수 있다. 분해 후에, 반응물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.

절단된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

올리고뉴클레오티드란 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우 또 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

연결(ligation)이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 지칭한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 다른 방법으로 제공하지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 이용하여, 거의 등몰량의 연결시키고자 하는 DNA 단편 0.5μg당 T4 DNA 리가제(리가제) 10 유니트를 사용하여 연결을 수행한다.

달리 언급되지 않는 한, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.

실시예 1

CGF의 세균성 발현 및 정제

CGF를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97142)을, 프로세싱된 CGF 단백질의 5' 서열(-시그날 펩티드 서열) 및 CGF 유전자에 대한 3' 벡터 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. CGF에 상응하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 BamHⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시됨)에 이어 프로세싱된 단백질 코돈(밑줄침)의 추정된 말단 아미노산으로부터 출발하는 CGF 암호화 서열을 함유하는 서열 3을 갖는다.

5' ACTCTTGGATCCAATTTGGGAAACAGCTATCAAAGA 3'

3' 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 4는 XbaⅠ 제한 부위(진하게 표시됨)에 이어 카복시-말단 5개 아미노산 및 해독 정지 코돈(밑줄침)에 상응하는 뉴클레오티드의 역 보체를 함유한다.

5' CTCTAGACTATTATTTACAACATAGAAAATTAAAGGC 3'

상기 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-9(공급원: Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 91311) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-9는 항생제 내성(Amp^r), 세균성 복제 기원(ori), IPTG-조절성 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 다음, pQE-9를 Hind Ⅲ 및 XbaⅠ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-9에 연결하고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 이용하여 동일한 프레임 내에 삽입한다. 목적하는 재조합체는 히스티딘 태그 및 리보좀 결합 부위로부터 하부에 삽입된 CGF 암호화 서열을 함유할 수 있다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(공급원: Qiagen, Inc.)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 lacⅠ 억제인자를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사물을 함유한다. LB 판 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)와 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광밀도 600(O.D⁶⁰⁰)으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. lacⅠ 억제인자를 불활성화시킴으로써 IPTG가 유도되는데, 이로써 P/O가 유전자 발현 증가를 유발시킨다는 것이 명백해졌다. 지수적 성장 배양이 되도록 세포를 2.5시간 더 성장시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. CGF/6-히스티딘-함유 M15[pREP4] 세포를 pH 8에서 6M GnHCl, 50mM NaPO₄(pH 8)에서 용융시킨다. 용융물을 닉켈-킬레이트 칼럼 상에 부하하고 병류물을 수집한다. 이 칼럼을 pH 8.0, 6.0 및 5.0에서 6M GnHCl, 50mM NaPO₄으로 세척한다. CGF 융합 단백질(순도 90% 초과)을 pH 2.0에서 용출시킨다. 재생시키기 위해서는, pH 2.0 용출물을 3몰 구아니딘 HCl, 100mM 인산나트륨, 10몰 글루타티온(환원된) 및 2몰 글루타티온(산화된)으로 조정한다. 이러한 용액에서 12시간 동안 배양한 후, 단백질을 10몰 인산나트륨으로 투석시킨다. 겔을 수행하게 위해, 펠렛을 SDS/NaOH 및 2X SDS-PAGE 부하 완충액에 재현탁시키고 열 변성시킨 다음, 4-20% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동시킨다. 이 단백질을 쿠마시 브릴리언트 불루(Coomassie Brilliant Blue) R-250 염색하여 가시화한다.

실시예 2

바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 CGF의 클로닝 및 발현

완전한 길이의 CGF 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97142)을 5' BamHⅠ 및 3' XbaⅠ을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이러한 프라이머 서열은 서열 5 및 6이다.

5' ACTCTTGGATCCGCCATCATGACCTGGAGGCACCAT 3'

5' TACAACTCTAGACTATTATTTACAACATAGAAAATTAAAGGC 3'

BamHⅠ-XbaⅠ 단편은 분비용 시그날 서열을 함유하는 완전한 CGF 암호화 영역을 함유한다. F2로서 명명된 상기 단편을 시판용 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다.

벡터 pA2를 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 CGF 단백질의 발현에 사용한다[참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 이러한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 강력한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스(SV) 40의 폴리아데닐화 부위를 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해, 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제를 폴리헤드린 프로모터에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열을 공동형질감염된 야생형 바이러스성 DNA의 세포-매개된 동종 재조합을 위한 바이러스성 서열에 의해 양측에 플랭킬할 수 있다. 수 많은 기타 바쿨로바이러스 벡터를 pRG1, pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 pA2 대신 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39].

pA2 플라스미드를 제한 효소 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 분해한 다음, 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 탈포스포릴화한다. 그 다음, DNA를 시판용 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이러한 벡터 DNA를 V2로 명명한다.

BamHⅠ-XbaⅠ 절단된 단편 F2와 탈포스포릴화 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 그 다음, 이. 콜라이 균주 XL1 블루(Stratagene Cloning System, 11011 North Torrey Pines Road La Jolla, Ca. 92037)를 형질전환시키고, 효소 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 CGF cDNA를 갖는 플라스미드(pBac CGF)에 함유된 세균을 동정하였다. 이와 같이 클론된 단편의 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인한다.

플라스미드 pBac CGF 5μg을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판용의 선형화된 바쿨로바이러스[상표: 바쿨로골드(BaculoGold^TM)바쿨로바이러스 DNA, 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.] 1.0μg으로 공동형질감염시킨다.

바쿨로골드^TM바이러스 DNA 1μg 및 플라스미드 pBac CGF 5μg을 무혈청 그레이스 배지(공급원: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50μl를 함유하는 미세역가 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다. 리포펙틴 10μl와 그레이스 배지 90μl를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 다음, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 상기 플레이트를 전후로 진탕하여 새로이 추가된 용액을 혼합한다. 그 다음, 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 배양한다. 5시간 후에 형질감염 용액을 상기 플레이트로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 상기 플레이트를 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양한다.

4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 분석을 상기 섬머즈(Summers)와 스미스(Smith)에 의해 기술된 바와 유사하게 수행한다. 한 변형으로서, 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시키도록 하는 블루 갈(Blue Gal)[Life Technologies Inc., Gaithersburg]이 수반된 아가로스 겔을 사용한다. (플라크 분석의 상세한 설명은 공급자(Life Technologies Inc., Gaithersburg)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이러스학에 관한 사용자 지침서 제9면 내지 제10면에서 참조할 수 있다).

일련의 희석을 수행한지 4일 후에, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 팁으로 골라낸다. 그 다음, 재조합 바이러스를 함유하는 한천을 그레이스 배지 200μl를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 상기 한천을 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection(MOI)) 2에서 재조합 바쿨로바이러스 V-CGF로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인 부재의 SF900 Ⅱ 배지[Life Technologies Inc., Gaithersburg]로 대체한다. 42시간 후에³⁵S-메티오닌 5μCi 및³⁵S 시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 추가로 배양하고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자가방사성사진에 의해 가시화시킨다.

실시예 3

CHO 세포 내에서의 재조합 CGF의 발현

벡터 pN346을 CGF 단백질을 발현시키는데 사용한다. 플라스미드 pN346은 플라스미드 pSV2-dhfr[ATCC 기탁번호 37146]의 유도체이다. 양 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 dhfr 유전자를 함유한다. 이들 플라스미드로 형질감염시킨, 디하이드로폴레이트 활성이 결핍되는 중국산 햄스터 난소 세포 또는 기타 세포를, 상기 세포를 화학치료제인 메토트렉세이트가 보충된 선별성 배지(알파 부재 MEM, Lift Technologies) 내에서 성장시킴으로써 선별할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX) 내성 세포내에서의 DHFR 유전자의 증폭은 문헌[참조: Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., -and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68]에 널리 공지되어 있다. MTX의 농도를 증가시키면서 성장시킨 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과로서, 표적 효소 DHFR를 과생성시킴으로써 약제에 대한 내성을 나타낸다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되는 경우에는, 이는 통상적으로 공동증폭되고 과발현된다. 결과적으로, 메토트렉세이트의 투여가 중지되면, 세포주는 염색체내로 통합된 증폭된 유전자를 함유한다.

플라스미드 pN346은 라우스 육종 바이러스[참조: Cullen, et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985, 438-447]의 긴 말단 반복체(LTR)의 관심있는 강력한 프로모터의 유전자와, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)[참조: Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985]의 즉시 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편을 발현하기 위해 함유된다. 상기 프로모터의 하부는 유전자의 통합을 허용하는 다음 단일 제한 효소 절단 부위이다: BamHⅠ, PvuⅡ 및 NruⅠ. 이들 클로닝 부위 이외에도, 상기 플라스미드는 3개의 판독 프레임 모두에서 해독 중지 코돈에 이어 3' 인트론 및 랫트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 효능이 높은 기타 프로모터, 예를 들면, 사람 β-액틴 프로모터, SV40 초기 또느 후기 프로모터 또는 기타 레트로바이러스(예: HIV 및 HTLVI)로부터의 긴 말단 반복체를 상기 발현에 사용할 수도 있다. mRNA를 폴리아데닐화하기 위하여, 기타 시그날, 예를 들면, 사람 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 시그날을 또한 사용할 수 있다.

염색체 내로 통합된 유전자를 수반하는 안정한 세포주를 gpt, G418 또는 하이그로마이신과 같은 선별성 마커를 이용한 공동형질감염시 선별할 수 있다. 개시시 하나 이상의 선별성 마커, 예를 들면, G418과 메토트렉세이트를 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pN346을 제한 효소 BamHⅠ로 분해한 다음, 당해 기술 분양에 공지된 방법으로 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 탈포스포릴화한다. 상기 벡터를 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다.

완전한 길이의 CGF 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97142)을 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 서열 7을 가지고 BamHⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시됨)에 이어 진핵 세포에서 해독 개시에 대한 효율적인 시그날을 모방한 6개의 뉴클레오티드를 함유한다[참조: Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950, 1987].

5' ACTCTTGGATCCGCCATCATGACCTGGAGGCACCAT 3'

나머지 뉴클레오티드는 해독 개시 코돈(밑줄침)을 포함하는 6개의 아미노 말단 아미노산에 상응한다. 3' 프라이머는 서열 8을 가지고 PvuⅡ 제한 효소 부위에 이어 해독 정지 코돈로부터 출발하는 3' CGF DNA의 역 보체인 18개 뉴클레오티드를 함유한다.

5' TACAACCAGCTGCTATTATTTACAACATAG 3'

PCR 생성물을 BamHⅠ-PuvⅡ로 분해시키고 시판용 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 정제시킨다. 이어서, 상기 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여, BamHⅠ-PuvⅡ 분해시키고 포스파타제로 처리된 플라스미드 pN346에 연결시킨다. Xl1Blue(Stratagene) 이. 콜라이를 형질전환시키고 LB, 50μg/ml 앰피실린 플레이트상에 도말한다. 목적하는 재조합체를 적당한 배향으로 보유하는 콜로니를, 라우스 육종 바이러스 프로모터에 상응하는 5' 프라이머 및 CGF 코돈 73-79의 역 보체에 상응하는 3' 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 스크리닝한다. 클론된 단편의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다. CHO-dhfr-세포를 형질감염시킨다.

활성의 DH FR 효소가 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 발현 플라스미드 pN346CGF 5μg을 리포펙틴 방법[참조: Felgner et al., supra]을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5μg과 함께 공동형질감염시킨다. 플라스미드 pSVneo는 우점적 선별성 마커, G418을 포함하는 항생제 그룹에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 유전자 neo를 함유한다. 상기 세포를 G418 1mg/ml가 보충된 알파 부재 MEM에 접종한다. 2일 후, 상기 세포를 트립신으로 처리하고 하이브리도마 클로닝 플레이트(Greiner, Germany)에 접종한 다음 10 내지 14일간 배양한다. 이후, 단일 클론을 트립신으로 처리한 다음 상이한 농도의 메토트렉세이트(25, 50, 100, 200, 400nm)를 사용하여 6-웰 페트리 디쉬에 접종한다. 그 다음, 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을 보다 고농도의 메토트렉세이트(500nM, 1μM, 2μM, 5μM)를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트에 옮긴다. 클론이 100μM의 농도에서 성장할 때까지 동일한 과정을 반복한다.

목적하는 유전자 생성물의 발현을 웨스턴 블롯 분석 및 SDS-PAGE로 분석한다.

실시예 4

유전자 치료를 통한 발현

피부 생검에 의해 특정 대상체로부터 섬유아세포를 수득한다. 생성된 조직을 조직 배양 배지에 놓아 두고 작은 조각으로 분리시킨다. 이러한 작은 조각을 조직 배양 플라스크의 젖은 표면 위에 놓아두는데, 약 10조각을 각 플라스크에 놓아둔다. 이 플라스크를 거꾸로 하고, 단단하게 밀봉시킨 다음 실온에 밤새 방치시켜 둔다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 전위시키고 조직 조각을 플라스크의 바닥에 고정시킨 채로 두며 신선한 배지(예: 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 햄의 F12 배지)를 가한다. 이어서, 이를 37℃에서 약 1주 동안 배양한다. 이때, 신선한 배지를 가하고 매 수일마다 계속해서 교체한다. 2주간 더 배양한 후, 섬유아세포의 단층이 나타난다. 이러한 단층을 트립신으로 처리하고 보다 큰 플라스크로 늘린다.

몰로니 쥐의 육종 바이러스의 긴 말단 반복에 의해 플랭킹된 pMV-7[참조: Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)]을 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 분해하고 연속적으로 송아지 장내 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔 상에서 분획화하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 5' 및 3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 5' 프라이머는 EcoRⅠ 부위를 함유하고 3' 프라이머는 HindⅢ 부위를 또한 함유한다. 몰로니 쥐의 육종 바이러스 선형 중축과 증폭된 EcoRⅠ 및 HindⅢ 단편의 등량을 T4 DNA 리가제의 존재하에서 함께 가한다. 생성된 혼합물을 두 단편을 연결시키기에 적당한 조건하에서 유지시킨다. 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질전환시키고, 이를 벡터가 적절하게 삽입된 문제의 유전자를 함유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 한천을 함유하는 카나마이신 위로 도말한다.

앰포트로픽 pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양액에서 성장시켜 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 둘벡코 변형된 이글즈 배지(DMEM)에서 밀도를 합류시킨다. 상기 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 가하고 패키징 세포를 상기 벡터로 형질도입한다. 이때 패키징 세포는 유전자를 함유하는 감염성 바이러스성 입자를 생산한다(패키징 세포는 본원에서 생산자 세포로서 지칭됨).

신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고 연속적으로 합류된 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 배지를 수거한다. 감염성 바이러스성 입자를 함유하는 소모된 배지를 미소기공 여과기를 통하여 여과시켜 분리된 생산자 세포를 제거하고 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 아-합류된 플레이트로부터 제거하고 생산자 세포로부터의 배지로 신속히 교체한다. 이 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 바이러스의 역가가 높으면, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이도 어떠한 선별도 필요치 않는다. 역가가 극히 낮을 경우에는, neo 또는 his와 같은 선별성 마커를 갖는 레트로바이러스성 벡터를 사용하는 것이 필요하다.

이어서, 유전자 처리시킨 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 3 미소담체 비드 상에서 합류까지 성장시킨 후에 숙주에 주입한다. 이때 섬유아세포는 단백질 생성물을 생성시킨다.

본 발명의 수 많은 변형 및 변이가 상기 교시에 비추어 볼 때 가능하므로, 첨부된 청구의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기술된 것 이외의 양태로 실시할 수 있다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(ⅰ) 출원인: 마이스너 등

(ⅱ) 발명의 명칭: 사람 크립틴 성장 인자

(ⅲ) 서열수: 10

(ⅳ) 서신 주소:

(A) 수신인: 카렐라, 바이른, 바인, 길필란, 쎄치, 스튜워트 올스타인 (B) 가: 벡커 팜 로드 6

(C) 시: 로즈랜드

(D) 주: 뉴 져지

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 07068

(ⅴ) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 3.5 인치 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PS/2

(C) 운용 시스템: MS-DOS

(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙트 5.1

(ⅵ) 현 출원 데이터:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일: 본원과 함께 제출

(C) 분류:

(ⅶ) 이전의 출원 데이터

(A) 출원 번호:

(B) 출원 날짜:

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 페라로 그레고리 디

(B) 등록 번호: 36,134

(C) 참조/소송 번호: 325800-

(ⅸ) 전자통신 정보:

(A) 전화: 201-994-1700

(B) 팩시밀리: 201-994-1744

(2) 서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 기재: 서열 1

(2) 서열 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 205개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄:

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(xi) 서열 기재: 서열 2

(2) 서열 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 기재: 서열 3

(2) 서열 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 기재: 서열 4

(2) 서열 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 기재: 서열 5

(2) 서열 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 기재: 서열 6

Claims (20)

1. (a) 도 1에 제시된 -23번 아미노산에서부터 207번 아미노산까지를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (b) 도 1에 제시된 1번 아미노산에서부터 207번 아미노산까지를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (c) 도 1에 제시된 1번 아미노산에서부터 150번 아미노산까지를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (d) 도 1에 제시된 45번 아미노산에서부터 150번 아미노산까지를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (e) (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있고 상기 폴리펩티드와 70% 이상의 동질성을 나타내는 폴리뉴클레오티드; 및

   (f) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 구성원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
3. (a) ATCC 기탁번호 제97142호에 함유된 DNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (b) ATCC 기탁번호 제97142호에 함유된 DNA에 의해 발현된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드와 70% 이상의 동질성을 나타내는 폴리뉴클레오티드; 및

   (d) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 구성원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
4. 제2항에 있어서, 도 1에 제시된 1번 뉴클레오티드로부터 771번 뉴클레오티드까지의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제2항에 있어서, 도 1에 제시된 62번 뉴클레오티드로부터 771번 뉴클레오티드까지의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제2항에 있어서, 도 1에 제시된 151번 뉴클레오티드로부터 771번 뉴클레오티드까지의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제2항에 있어서, 도 1에 제시된 283번 뉴클레오티드로부터 600번 뉴클레오티드까지의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제2항에 따른 DNA를 함유하는 벡터.
9. 제8항에 따른 벡터를 사용하여 유전적으로 조작시킨 숙주 세포.
10. 제9항에 따른 숙주 세포로부터 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현시킴을 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
11. 제8항에 따른 벡터를 사용하여 세포를 유전적으로 조작함을 포함하는, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 세포의 제조 방법.
12. (ⅰ) 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; 및 (ⅱ) ATCC 기탁번호 제97142호의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 구성원을 포함하는 폴리펩티드.
13. 제12항의 폴리펩티드에 대한 수용체를 활성화하는 화합물.
14. 제12항의 폴리펩티드를 억제하는 화합물.
15. 제12항의 폴리펩티드에 대한 항체.
16. 표면 상에 CGF 수용체를 발현시키는 세포를, 상기 수용체에 대한 리간드의 결합에 적합한 조건하에서, 표지된 CGF 및 스크리닝시키고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    상기 수용체에 부착된 표지의 양을 측정함으로써 상기 수용체에 대한 표지된 CGF의 결합 정도를 결정함을 포함하여, 제12항의 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
17. 표면 상에 CGF 수용체를 발현시키는 세포를, 상기 수용체에 대한 리간드의 결합에 적합한 조건하에서 스크리닝시키고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    상기 수용체에 대한 화합물의 결합 정도와 이러한 결합에 의해 발생된 시그날의 결핍 여부를 결정함을 포함하여, 제12항의 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
18. 표면 상에 CGF 수용체를 발현시키는 세포를, 상기 수용체에 대한 리간드의 결합에 적합한 조건하에서 스크리닝시키고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    상기 수용체에 대한 화합물의 결합 정도와 이러한 결합에 의해 발생된 시그날의 존재 여부를 결정함을 포함하여, 제12항의 폴리펩티드에 대한 수용체를 활성화하는 화합물을 동정하는 방법.
19. 제1항의 폴리뉴클레오티드에서의 돌연변이를 결정함을 포함하여, 제1항의 폴리뉴클레오티드에서의 돌연변이와 관련된 질환 또는 이러한 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법.
20. 숙주로부터 유도된 샘플 중에서 제12항에 따른 폴리펩티드의 존재 여부를 분석함을 포함하는 진단 방법.