KR19980068858A - PCR primers for simultaneous detection of human papillomavirus types 16 and 18 and diagnostic method for virus infection using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명을 인유두종 바이러스(human papillomavirus:HPV) 타잎 16,18의 동시 검출을 위한 특정 염기서열의 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머쌍 및 그를 이용하여 바이스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍은 HPV16과 HPV18 둘다의 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위(consensus region)를 토대로 설계되고 합성된 1차 PCR용 프라이머쌍, 및 HPV16과 HPV18 각각에 특이적인 염기서열의 DNA 단편을 증폭하면서도 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르도록 설계되고 합성된 2차 PCR용 프라이머 2쌍으로 구성된다. HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에 에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검츨이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다. 따라서, 사람의 혈청이나 조직에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18의 동시 감염을 효과적으로 진단할 수 있다.The present invention relates to a polymerase chain reaction (PCR) primer pair of a specific sequence for simultaneous detection of human papillomavirus (HPV) type 16 and 18, and a method for diagnosing the presence of a vise. The primer pairs of the present invention are specific for primary PCR primer pairs designed and synthesized based on consensus regions of HPV16 and HPV18 to amplify DNA fragments of both HPV16 and HPV18, and HPV16 and HPV18, respectively. It consists of two pairs of primers for the secondary PCR designed and synthesized to amplify DNA fragments of the base sequence while the secondary PCR products are different in size. When the primer pair of the present invention is used for the simultaneous detection of HPV16 and HPV18, four PCRs using four pairs of primers required for conventional nested PCR are not performed, and two PCRs using three pairs of primers are also used. Simultaneous detection is possible, which greatly reduces the procedure and time. Therefore, the first PCR using DNA and primer pair HP1 / HP2 obtained from human serum or tissue, and then the second PCR by adding two pairs of primers HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 simultaneously to the first PCR reaction solution. By performing the following procedure, simultaneous infection of HPV16 and HPV18 can be effectively diagnosed.
Description
본 발명은 인유두종 바이러스(human papillomavirus) 타잎 16, 18의 동시 검출을 위한 PCR 프라이머(polymerase chain reaction primer) 및 그를 이용한 바이러스 감염여부의 진단방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인유두종 바이러서 타잎 16 및 타잎 18의 각 바이러스 검출을 위해 지금까지 필요하였던 4쌍의 프라이머 및 4번의 PCR 반응을, 3쌍의 프라이머 및 2번의 PCR 반응으로 간편화시킬 수 있는 특정 염기서열의 프라이머 및 그를 이용하여 전기 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a PCR primer (polymerase chain reaction primer) for simultaneous detection of human papillomavirus types 16 and 18 and a method for diagnosing viral infection using the same. More specifically, the present invention can simplify the four pairs of primers and four PCR reactions required until now for the detection of each virus of human papilloma virus type 16 and type 18 with three pairs of primers and two PCR reactions. It relates to a primer of a specific base sequence and a method for diagnosing the infection of the electric virus using the same.
일반적으로, 자궁경부암은 우리나라 여성암 중 가장 발병빈도가 높은 질병으로서, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, 이하 'HPV'라 함)에 의해 발병하는 것으로 보고되고 있다. 현재까지 약 70여종의 HPV가 발견되었고, 그 중에서 HPV16과 18이 가장 중요한 발병원인으로 알려져 있다(참조:Schiffman, M.H. et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:958(1993)).In general, cervical cancer is the most frequent disease among female cancer in Korea, and is reported to be caused by human papillomavirus (hereinafter referred to as 'HPV'). To date, about 70 HPVs have been found, of which HPV16 and 18 are known to be the most important pathogens (Schiffman, M.H. et al., J. Natl. Cancer Inst., 85: 958 (1993)).
현재까지 HPV 감염 여부의 진단을 위하여, HPV16의 외피단백질 E6 및 E7에 대한 항체를 이용하여 혈청내 항원을 검사하는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)법이 보고되었지만(참조:Sun Y. et al., J. Clin, Microbiol., 32:2216(1994)), 항체의 제작을 위해 동물사육이 필요하고, 항체 제작 기간도 장기간이 소요되며, 항체의 다량 확보가 곤란하여 필요할 때마다 새로 항체를 만들어야 하는 번거러움이 있다는 등의 여러가지 문제점을 인하여, ELISA법은 통상 사용할 수 있는 혈청학적 검사법으로 활용되지는 못하고 있는 설정이다.To date, for diagnosis of HPV infection, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) has been reported to test antigens in serum using antibodies to envelope proteins E6 and E7 of HPV16 (Sun Y. et al., J. Clin, Microbiol., 32: 2216 (1994)), animal breeding is required for the production of antibodies, antibody production takes a long time, and it is difficult to secure a large amount of antibodies, so new antibodies should be made whenever needed. Due to various problems such as hassle, the ELISA method is a setting that has not been utilized as a serological test method that can be used normally.
이에, 최근 특정의 DNA 서열을 신속하고 간단하게 증폭시킬 수 있는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 함)법이 개발되어 분자생물학 분야에 널리 이용되고 있는 바, 상술한 ELISA법이 지니는 문제점을 해소하기 위해 HPV의 검출에도 PCR을 적용하게 되었다(참조:Monk B.J. et al., Diagn. Mol. Pathol., 3:283(1994); Zheng P.S. et al., Gynecol. Oncol., 53:179(1995)).In recent years, polymerase chain reaction (PCR) method, which can rapidly and simply amplify a specific DNA sequence, has been developed and widely used in the field of molecular biology. This genie has also been subjected to PCR in the detection of HPV to solve the problem (Monk BJ et al., Diagn. Mol. Pathol., 3: 283 (1994); Zheng PS et al., Gynecol. Oncol., 53: 179 (1995).
일반적으로, 임상시료로부터 병원성 미생물을 검출하기 위해서는 높은 검출 민감도 및 신뢰도를 제공하는 검출방법이 요구되는데, PCR을 이용한 검출시에도 이를 만족시키기 위해, 첫번째 프라이머쌍에 의해 증폭된 PCR 산물을 다시 새로운 두번째 프라이머쌍에 의해 증폭시키는 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행한다. 따라서, HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스 검출에는 상술한 네스티드 PCR을 적용하면, 1종의 바이러스당 2쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR이 요구되는 바, HPV16 및 HPV18의 동시 검출에는 총 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR이 수행되어야 한다.In general, detection of pathogenic microorganisms from clinical samples requires a detection method that provides a high detection sensitivity and reliability, and in order to satisfy the detection using PCR, a second PCR product amplified by the first primer pair is again used. Nested PCR is performed to amplify by primer pairs. Therefore, if the above-described nested PCR is applied to the detection of two viruses of HPV16 and HPV18, two PCRs using two pairs of primers per one virus are required. Therefore, a total of four pairs are used for simultaneous detection of HPV16 and HPV18. Four PCRs using primers should be performed.
이러한 기술배경하에서, 본 발명자들은 자궁경부암을 유발시키는 HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스를 동시에 간단한 검출하고자 예의 연구노력한 결과, 네스티드 PCR에 통상적으로 요구도는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 그 절차와 시간을 단축시켜, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 상기 HPV16 및 HPV18의 2종 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 특정 염기서열의 프라이머를 설계 및 합성하였고, 그 PCR 프라이머쌍을 HPV16 및 HPV18 표준 균주에 적용한 PCR한 결과, HPV16 및 HPV18을 효과적으로 구분하여 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Under these technical backgrounds, the present inventors intensively tried to simultaneously detect two viruses, HPV16 and HPV18, which cause cervical cancer. As a result, four procedures using four pairs of primers, which are commonly required for nested PCR, were performed. In order to shorten the time and time, two primers using three pairs of primers were designed and synthesized, which were capable of simultaneously detecting the two viruses of HPV16 and HPV18, and the PCR primer pairs were used as HPV16 and HPV18 standards. As a result of PCR applied to the strain, it was confirmed that HPV16 and HPV18 can be effectively classified and detected, and thus, the present invention was completed.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 HPV16 및 HPV18 2종의 바이러스를 동시에 간편하게 검출할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide a pair of PCR primers that can easily detect two viruses of HPV16 and HPV18 at the same time.
본 발명의 두번째 목적은 전기 프라이머쌍을 이용하여 HPV16 및 HPV18의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide a method for diagnosing infection of HPV16 and HPV18 using an electric primer pair.
제1도는 본 발명의 PCR 프라이머를 이용한 HPV16 및 HPV18의 동시 검출과정을 나타내는 모식도이다.1 is a schematic diagram showing the simultaneous detection of HPV16 and HPV18 using the PCR primer of the present invention.
제2도는 HPV 타잎별 염기서열 및 HPV16과 HPV18에 특징적인 각 DNA 단편의 증폭을 위한 1차 및 2차 프라이머의 위치를 나타내는 그림이다.FIG. 2 is a diagram showing the positions of primary and secondary primers for amplifying each DNA fragment characteristic of HPV type and HPV16 and HPV18.
제3도는 1차 및 2차 PCR에 의해 증폭된 HPV16 및 HPV18 특이 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.3 is a photograph showing the results of agarose gel electrophoresis of HPV16 and HPV18 specific DNA fragments amplified by primary and secondary PCR.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명자들은 임상시료로부터 HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위하여, HPV16 및 HPV18에 특징적인 각 PCR 단편을 동시에 간단히 네스티드 PCR에 의해 증폭시킬 수 있는 프라이머를 다음과 같이 설계하고, 합성한다 HPV16 및 HPV18 둘다의 DNA 단편을 증폭할 수 있도록, HPV의 타잎별 염기서열을 분석한 다음, HPV16 및 HPV18의 공통 염시서열 부위(consensus region)를 토대로 하기와 같은 1차 PCR용 프라이머쌍 HP1/HP2를 설계 및 합성한다. 이어, HPV16 및 HPV18 각각에 특이적인 염기서열의 DNA 단편을 증폭하면서도 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르도록, 하기와 같은 2차 PCR용 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182를 설계 및 합성한다.For the simultaneous detection of HPV16 and HPV18 from clinical samples, we design and synthesize primers that can amplify each of the PCR fragments characteristic of HPV16 and HPV18 by simple nested PCR simultaneously, as follows: Both HPV16 and HPV18 In order to amplify DNA fragments of HPV, the sequence of each type of HPV was analyzed, and then the primer pair HP1 / HP2 for primary PCR was designed and synthesized based on the common consensus region of HPV16 and HPV18. do. Subsequently, the following two pairs of primers for secondary PCR, HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182, are designed and synthesized so as to amplify DNA fragments of nucleotide sequences specific for HPV16 and HPV18, respectively, and have different sizes of secondary PCR products. .
HP1:5'-CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3'HP1: 5'-CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3 '
HP2:5'-CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3'HP2: 5'-CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3 '
상기에서, R은 A 또는 G;Wherein R is A or G;
Y는 C 또는 T; 및,Y is C or T; And,
S는 G 또는 C이다.S is G or C.
HPV161:5'-TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3'HPV161: 5'-TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3 '
HPV162:5'-GGTTACAATATTGTAATGGGC-3'HPV162: 5'-GGTTACAATATTGTAATGGGC-3 '
HPV181:5'-CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3'HPV181: 5'-CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3 '
HPV182:5'-ACATACACAACATTGTGTGACG-3'HPV182: 5'-ACATACACAACATTGTGTGACG-3 '
상술한 프라이머쌍을 이용한 네스티드 PCR에 의해 HPV16 및 HPV18의 특이 DNA 단편이 동시에 증폭되는지 알아보기 위하여, HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 분리한 DNA에 프라이머쌍 HP1/HP2를 첨가하고 1차 PCR한 다음, 이 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182를 동시에 첨가하여 2차 PCR하고, 아가로스 겔 전기영동하다. 그 결과, HPV16의 특히 PCR 산물인 225bp DNA 단편과 HPV18의 특히 PCR 산물인 295bp DNA 단편이 동시에 증폭됨을 알 수 있다.In order to determine whether the specific DNA fragments of HPV16 and HPV18 are simultaneously amplified by nested PCR using the above-described primer pairs, primer pairs HP1 / HP2 are added to DNA isolated from HPV16 and HPV18 standard strains, and then subjected to the first PCR. The reaction solution was subjected to secondary PCR by adding two pairs of primers HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 simultaneously, followed by agarose gel electrophoresis. As a result, it can be seen that the 225 bp DNA fragment, which is the PCR product of HPV16, and the 295 bp DNA fragment, which is the PCR product of HPV18, are simultaneously amplified.
따라서, HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검출이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다.Therefore, when the primer pair of the present invention is used for simultaneous detection of HPV16 and HPV18, two PCRs using three pairs of primers are performed without performing four PCRs using four pairs of primers required for conventional nested PCR. Simultaneous detection is also possible, which greatly shortens the procedure and time.
결국, 사람의 혈청이나 조직에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18의 동시 감염을 효과적으로 진단할 수 있다.Finally, the first PCR using DNA and primer pair HP1 / HP2 obtained from human serum or tissue, and then the second PCR by adding two pairs of primers HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 simultaneously to the first PCR reaction solution. By performing the following procedure, simultaneous infection of HPV16 and HPV18 can be effectively diagnosed.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1:HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위한 프라이머의 설계Example 1 Design of Primers for Simultaneous Detection of HPV16 and HPV18
시료내에 미량 존재하는 HPV16 및 HPV18을 선택적으로 동시에 증폭시킬 수 있는 프라이머를 다음과 같은 과정에 의해 설계하였다:HPV16 및 HPV18 둘다의 DNA 증폭을 1차 PCR 과정에서 수행하는데, 이때 사용되는 1쌍의 프라이머는 실험의 간편성을 위해 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위를 토대로 설계하였다. 이어, HPV16 및 HPV18의 선택적 증폭을 2차 PCR 과정에서 수행하는데, 이때 사용되는 각쌍의 프라이머는 각각의 2차 PCR 산물의 크기가 서로 다르게 되도록 하고, HPV16 및 HPV18을 구분할 수 있는 특정 염기서열을 증폭하도록 설계하였다. 이와 같은 PCR 프라이머를 이용한 HPV16 및 HPV18의 동시 검출과정을 모식적으로 제1도에 나타내었다.Primers capable of selectively amplifying a small amount of HPV16 and HPV18 in the sample at the same time were designed by the following procedure: DNA amplification of both HPV16 and HPV18 was performed in the first PCR procedure, where a pair of primers used Was designed based on the common sequence region of HPV16 and HPV18 for simplicity of experiment. Subsequently, selective amplification of HPV16 and HPV18 is performed in the secondary PCR process, wherein each pair of primers is used so that the size of each secondary PCR product is different from each other and amplifies specific sequences capable of distinguishing HPV16 and HPV18. It is designed to. Simultaneous detection of HPV16 and HPV18 using such PCR primers is shown in FIG.
실시예 2:HPV16 및 HPV18 동시 검출용 프라이머의 합성Example 2 Synthesis of Primer for Simultaneous Detection of HPV16 and HPV18
HPV16 및 HPV18을 동시에 검출할 수 있는 PCR 프라이머를 합성하기 위하여, 우선 현재까지 보고된 임상적 중요성을 갖는 HPV의 타잎별 염기서열을 분석하고, 다른 HPV 타잎과 구분되는 HPV16 및 HPV18의 공통 염기서열 부위를 조사한 다음(참조:제2도), 이를 토대로 하기와 같은 1차 PCR 프라이머쌍 HP1 및 HP2를 설계 및 합성하였다. 제2도에서, 서열 중간에 위치하는 (-)는 결실된 염기를 나타내고, (*)는 보존된 염기(conserved base)를 나타내며, 그외 위치는 (-)는 보존도가 높은 염기를 나타내고, 박스는 HPV16 및 HPV18의 DNA 증폭에 이용되는 PCR 프라이머에 해당하는 부분을 나타낸다.In order to synthesize PCR primers capable of simultaneously detecting HPV16 and HPV18, first, the sequence of each type of HPV having clinical significance reported to date is analyzed, and the common sequence region of HPV16 and HPV18 distinguished from other HPV types. Then, the first PCR primer pair HP1 and HP2 were designed and synthesized as follows. In FIG. 2, (-) in the middle of the sequence represents a deleted base, (*) represents a conserved base, and other positions (-) represent a highly conserved base, box Denotes a portion corresponding to PCR primers used for DNA amplification of HPV16 and HPV18.
HP1:5'-CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3'HP1: 5'-CCRYTGCTGYATGYSATAAATGT-3 '
HP2:5'-CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3'HP2: 5'-CATTTTCGTYCTCGTCATCTGA-3 '
상기에서, R은 A 또는 G;Wherein R is A or G;
Y는 C 또는 T; 및,Y is C or T; And,
S는 G 또는 C이다.S is G or C.
아울러, 2차 PCR 프라이머는 HPV16 및 HPV18의 DNA 염기서열을 상호 비교하여, HPV16에만 특이적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 HPV161/HPV162, HPV18에만 특이적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 HPV181/HPV182를 설계 및 합성하였다.In addition, the secondary PCR primers compare the DNA sequences of HPV16 and HPV18, and primer pairs capable of amplifying base sequences specific to HPV161 / HPV162 and HPV18, which are primer pairs capable of amplifying only HPV16 specific sequences. HPV181 / HPV182 was designed and synthesized.
HPV161:5'-TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3'HPV161: 5'-TCGATGTATGTCTTGTTGCAG-3 '
HPV162:5'-GGTTACAATATTGTAATGGGC-3'HPV162: 5'-GGTTACAATATTGTAATGGGC-3 '
HPV181:5'-CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3'HPV181: 5'-CAACATAGCTGGGCACTATAGA-3 '
HPV182:5'-ACATACACAACATTGTGTGACG-3'HPV182: 5'-ACATACACAACATTGTGTGACG-3 '
실시예 3:HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 DNA의 분리Example 3: Isolation of DNA from HPV16 and HPV18 Standard Strains
HPV16 및 HPV18 표준균주로부터 DNA를 분리하기 위하여, HPV16이 감염된 CaSki 세포구(ATCC CRL 1550) 및 HPV18이 감염된 HeLa 세포주(ATCC CCL 2) 각각을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 수득한 다음, 100μl의 SE 용액(75mM NaCl 및 25mM EDTA로 구성된 용액)에 현탁시키고, 5μl의 10% SDS 및 1μl의 단백질가수분해효소 K(20mg/ml)를 첨가하여 50℃에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 페놀/클로로포름에 의한 추출 및 알콜에 의한 DNA 침전과정을 거쳐, DNA를 수득하고 100μl의 증류수에 현탁시켰다.To separate DNA from HPV16 and HPV18 standard strains, each of HPV16 infected CaSki cells (ATCC CRL 1550) and HPV18 infected HeLa cell lines (ATCC CCL 2) were centrifuged at 6,000 rpm for 10 minutes to obtain a precipitate. It was suspended in 100 μl of SE solution (solution consisting of 75 mM NaCl and 25 mM EDTA), and 5 μl of 10% SDS and 1 μl of protease K (20 mg / ml) were added and reacted at 50 ° C. for 2 hours. Then, DNA extraction was performed by extraction with phenol / chloroform and DNA precipitation with alcohol, and suspended in 100 µl of distilled water.
실시예 4:PCR에 의한 HPV16 및 HPV18의 특이 DNA 단편 증폭Example 4 Amplification of Specific DNA Fragments of HPV16 and HPV18 by PCR
HPV16 및 HPV18에 특징적인 DNA 단편의 PCR에 의한 증폭을 알아보기 위하여, 실시예 3에서 분리한 HPV16/HPV18 DNA 함유용액 1μl와 실시예 2에서 합성한 HP1/HP2 프라이머쌍을 혼합하고, 94℃에서 5분간 미리 변성(pre-denaturation)시킨 다음, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초) 및 연장(extension, 72℃에서 1분)을 총 30회 진행시키는 1차 PCR을 수행하였다.In order to examine the amplification by PCR of the DNA fragments characteristic of HPV16 and HPV18, 1 μl of the HPV16 / HPV18 DNA-containing solution isolated in Example 3 and the HP1 / HP2 primer pair synthesized in Example 2 were mixed, and at 94 ° C. Pre-denaturation for 5 minutes, followed by 30 times of denaturation (30 seconds at 94 ° C.), annealing (30 seconds at 55 ° C.) and extension (1 minute at 72 ° C.) First PCR was performed.
이어, 반응이 완결된 1차 PCR 반응액 1μl와 HPV161/HPV162, HPV181/HPV182 4종의 프라이머를 혼합하고, 94℃에서 5분간 미리 변성시킨 다음, 변성(94℃에서 30초), 결합(52℃에서 30초) 및 연장(72℃에서 1분)을 총 30초 진행시키는 2차 PCR을 수행하였다.Subsequently, 1 μl of the completed primary PCR reaction solution and four primers of HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 were mixed, premodified at 94 ° C. for 5 minutes, and then denatured (30 seconds at 94 ° C.) and bound (52). A second PCR was performed with 30 seconds) and extension (1 minute at 72 ° C) for a total of 30 seconds.
이렇게 제조된 2차 PCR 반응산물을 아가로스 겔상에서 분리한 결과, HPV16 및 HPV18 DNA 혼합액을 사용한 경우는 HPV16의 특이 PCR 산물이 225bp DNA 단편과 HPV18의 특히 PCR 산물인 295bp DNA 단편이 동시에 증폭되었으며(참조:제3도의 레인 5,6 및 7); HPV18 DNA만을 사용할 경우는 HPV18의 특이 PCR 산물인 295bp DNA 단편만이 증폭되었고(참조:제3도의 레인 8,9 및 10); HPV16 DNA만을 사용한 경우는 HPV16의 특이 PCR 산물인 226bp DNA 단편만이 증폭되었음을(참조:제3도의 레일 11,12 및 13) 확인하였다. 제3도에서, 레인 1은 DNA 크기(size) 마커이며, 레인 2,3,4는 증류수를 사용하여 PCR을 수행한 음성 대조군(negative control)의 실험 결과이다.As a result of the separation of the secondary PCR reaction product thus prepared on an agarose gel, when the HPV16 and HPV18 DNA mixtures were used, the specific PCR product of HPV16 was amplified simultaneously with the 225 bp DNA fragment and the 295 bp DNA fragment, which is particularly the PCR product of HPV18. See lanes 5, 6 and 7 in FIG. 3; When only HPV18 DNA was used, only 295 bp DNA fragment, the specific PCR product of HPV18, was amplified (see lanes 8,9 and 10 in FIG. 3); When only HPV16 DNA was used, it was confirmed that only 226bp DNA fragment, which is a specific PCR product of HPV16, was amplified (Rail 11, 12 and 13 in FIG. 3). In FIG. 3, lane 1 is a DNA size marker, and lanes 2, 3, and 4 are experimental results of a negative control performed by PCR using distilled water.
따라서, HP1/HP2 프라이머쌍을 이용한 1차 PCR, HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182 프라이머 2쌍을 이용한 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18을 효과적으로 동시에 검출할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, it was found that HPV16 and HPV18 can be detected simultaneously by performing the first PCR using the HP1 / HP2 primer pair and the second PCR using the HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 primer pairs.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, HPV16 및 HPV18의 동시 검출을 위해 본 발명의 프라이머쌍을 이용하면, 종래의 네스티드 PCR에서 요구되는 4쌍의 프라이머를 이용한 4번의 PCR을 수행하지 않고, 3쌍의 프라이머를 이용한 2번의 PCR로서도 동시 검출이 가능하므로, 그 절차와 시간을 대폭 단축시킬 수 있다. 따라서, 사람의 혈청이나 조직에서 수득한 DNA와 프라이머쌍 HP1/HP2을 이용하여 1차 PCR한 다음, 이 1차 PCR 반응액에 프라이머 2쌍 HPV161/HPV162 및 HPV181/HPV182을 동시에 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써, HPV16 및 HPV18의 동시 감염을 효과적으로 진단할 수 있다.As described and demonstrated in detail above, when using the primer pair of the present invention for simultaneous detection of HPV16 and HPV18, three pairs of PCR without performing four PCRs using four pairs of primers required for conventional nested PCR Simultaneous detection with two PCRs using primers can greatly reduce the procedure and time. Therefore, the first PCR using DNA and primer pair HP1 / HP2 obtained from human serum or tissue, and then the second PCR by adding two pairs of primers HPV161 / HPV162 and HPV181 / HPV182 simultaneously to the first PCR reaction solution. By performing the following procedure, simultaneous infection of HPV16 and HPV18 can be effectively diagnosed.
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