KR19980066916A - 간장의 항섬유화 작용을 가지는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간장의 항섬유화 작용을 가지는 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다음 구조식(1)의 피살리엔을 활성성분으로 함유하고 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제와 함께 통상의 약제학적으로 사용되는 제조방법에 따라서 통상의 약제학적인 제제로 제제화한 간장의 항섬유화 제제조성물에 관한 것이다.

Description

간장의 항섬유화 작용을 가지는 약학적 조성물

제I-1도는 CCl₄로 독성을 유발시킨 일차배양 쥐 간세포로부터 유출된 GPT와 SDH의 활성에 미치는 피살리엔의 효과를 나타낸 그래프이며,

제I-2도는 CCl₄로 독성을 유발시킨 배양된 쥐 간세포에서 MDA, Cytochrome P-450에 대한 피살리엔의 효과를 나타낸 그래프이며,

제I-3도는 CCl₄로 독성을 유발시킨 오랜 배양기간을 유지시킨 쥐 간세포에서 하이드록시프롤린 함량에 대한 피살리엔의 효과를 나타낸 그래프이며,

제II-1도는 매슨-트리크롬(Masson-Trichrome)으로 염색한 대조 쥐 A(x40), 담도결찰 쥐(bile duct-ligate rats: BDL) B 및 피살리엔을 투여한 BDL 쥐(25mg/kg/day)의 간단면도이며,

제II-2도는 시리우스-레드(Sirius-red)로 염색한 대조쥐 A(x40), BDL 쥐 B(x100) 및 피살리엔을 투여한 쥐 C(x40)의 간단면도이다.

본 발명은 간장의 항섬유화 작용을 가지는 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

특히 본 발명은 다음 구조식 (I)로 표시되는 피살리엔(Physalien)을 주성분으로 함유하고 약학적 제제의 제조에 통상으로 사용되는 부형제를 함유하는 간장의 항섬유화 작용을 가지는 약학적 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 간장 보호 활성을 갖는 물질을 천연물에서부터 찾고자 갈락토사민이나 사염화탄소로 독성을 유발한 일차배양 간세포를 이용하여 천연물의 간세포 보호 활성을 검색하여 왔다. 일차 검색 결과, 유의성 있는 간세포 보호 활성을 나타낸 구기자를 연구대상으로 설정하였다. 구기자(Lycium chinense Miller, Solanaceae)는 가지과에 속하는 구기자 나무의 성숙한 열매로 예로부터 민간이나 한방에서 자양강장제로 널리 사용되어 왔으며 최근에는 여러 제약회사에서 생산 판매하고 있는 자양강장 드링크 제제의 중요한 구성생약의 하나로 포함되고 있다. 생리활성 지향적 분리과정(bioactivity-oriented fractionation)을 거쳐 구기자에서 간세포 보호 활성을 갖는 물질을 분리하고, 이화학적 및 분광학적 분석을 통하여 그 구조를 피살리엔(physalien)으로 결정하였다. 나아가 이 물질의 간보호 활성 기전을 생화학적 방법을 이용하여 규명하였다.

피살리엔은 사염화탄소로 독성을 유발한 간세포에서 유리되는 글루타믹 파이루빅 트랜스아미나아제(glutamic pyruvic transaminase (GPT), 솔비톨 데하이드로지나제(sorbitol dehydrogenase (SDH))의 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 피살리엔은 글루타치온-S-트랜스페라제(glutathione-S-transferase (GST)) 활성에는 별다른 영향을 미치지 못하였으며 총 사이토크롬 P450s(total cytochrome P450s)의 활성을 정상상태의 수준으로 유지시켰다. 더구나 특기할만하게도 피살리엔은 간섬유화의 시험관내(in vitro) 지표인 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline)양을 감소시켜 항섬유화 작용이 있을 수 있음을 시사하였다. 이러한 실험관내실험 결과를 토대로 본 연구실에서는 피살리엔의 간보호 활성을 실험동물에서 (in vivo) 확인하기 위하여 인위적으로 간 담도를 결찰한 이차 담도성 간섬유화 모델을 이용하여 연구를 계속하였다. 피살리엔이 함유된 분획을 간담도 결찰을 시행한 첫째 주부터 간 섬유화가 유도되는 6주째까지 12.5mg/kg/day, 25mg/kg/day 농도로 경구투여한 결과 간 조직 내의 4-하이드록시프롤린양을 유의성있게 감소시켰다. 또한 간조직 단백질 중의 콜라겐 양을 측정한 결과 4-hydroxyproline양의 경우와 동일한 결과를 나타내었다. 이 결과에 의해 실험관내 실험에서 입증된 피살리엔의 간섬유화 억제 작용을 실험동물에서도 검증하였다.

한편 피살리엔이 함유된 분획은 간독성의 일반적 지표인 혈장 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스페라제(glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)) 및 GPT의 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 피살리엔 분획은 담즙 정체때 활성화되는 효소중의 하나인 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)에 대해서도 유의성있는 감소효과를 나타내었다. 피살리엔의 항산화작용에 대한 효과를 알아본 바에 의하면 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase (SOD)), 글루타치온 디설파이드 리닥타제(glutathione disulfide reductase (GSSG reductase))의 활성에는 영향을 미치지 못하였으나 조직 내의 글루타치온(glutathione) 양은 피살리엔 분획을 25mg/kg b.w./day를 투여하였을 때 간 담도 결찰군에 비해 유의성 있게 증가하였으며 간 담도결찰에 의해 증가된 혈장 MDA의 양도 유의성있게 감소되었다. 이상의 결과로 피살리엔은 간독성 화학물질이나 담도 결찰에 의한 산화적 자극에 대한 길항 효과 뿐 아니라 콜라젠(collagen)의 합성을 감소시켜 간섬유화 억제작용을 나타냄을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 구조식 (I)의 화합물을 활성성분으로 함유하고 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 구조식 (I)의 화합물을 활성성분으로 함유하고 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

피살리엔은 현죽도과(Apocynaceae)에 속하는 스템마데니아 글라브라(Stemmadenia glabra)에서 처음으로 분리된 화합물이다. [C;ecio, J. F. and Castro, V. H., Fisalieno, Colarante de los fructus madvros de plants, Rev. Latinoam. Quim. 15, 24(1984)]. 그후 피살리엔은 Physalis, Lycium 속에서도 분리되었다고 보고되어 있다. 그러나 이 분리된 피살리엔이 어떠한 약리학적 활성을 가지고 있는 가에 대하여서는 지금까지 연구된 바도 없었고, 발표된 논문도 없었다.

본 발명의 구기자 추출물 및 그 분획물은 다음의 스킴에 의하여 얻어졌다.

다음의 실시예 및 실험예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예 1]

구기자 엑스의 제조 :

건조시킨 구기자 40kg을 환류냉각장치를 부각시킨 추출기에서 클로로포름 : 메탄올을 3:1 로 섞은 혼합용매로 추출한 후 감압농축하여 엑스 2.8kg을 얻었다.

[실시예 2]

구기자 엑스의 분획 :

이 구기자 엑스를 물에 현착시킨 다음 극성에 따라 n-헥산과 초산에틸로 순차적으로 분획하여 n-헥산분획물 252.6g과 초산에틸분획물 199.7g을 얻었다.

[실시예 3]

화합물 I의 분리:

n-헥산 분획물중 30g을 실리카겔을 이용하여 칼럼크로마토그래피를 하였다. 유출용매로는 석유에테르와 초산에틸(100:1)의 혼합용매를 시작으로 극성을 증가시키면서 용매를 유출시켜 7개의 분획물로 나누었다. 그 결과 석유에테르:초산에틸(30:1)의 혼합용매에서 붉은색 계열의 혼합물을 얻었다(석유에테르:초산에틸=30:1(v/v), Rf=0.37). 이렇게 얻은 혼합물을 세파덱스 LH20을 이용하여 칼럼크로마토그래피(용매:석유에테르)를 시행하여 정제하였다. 정제한 혼합물을 다시 벤젠에 용해하고 메탄올로 재결정하여 오렌지색 결정으로 화합물 I(40mg)을 얻었다.

이 화합물은 UV스펙트럼 상의 452nm, 480nm에서 최대흡수피크를 (석유에테르중) 나타내었다. IR스펙트럼에서는 1735^-1의 에스테르결합, 1460cm^-1의 이중결합 및 1350, 1180cm^-1의 지방산 측쇄를 확인하였다. 따라서, 화합물 I은 카로테노이드골격에 지방산이 에스테르결합을 하고 있는 것으로 추정하였고, 이를 MS상의 전형적 피크(peak)인 1044, 788, 532, 256m/z로서 확인하였다. 카로테노이드골격에 에스테르 결합한 지방산은 C18인 팔미테이트로 추정되었으므로 화합물 I을 검화하고 표준물질과 비교하여 확인하고 이를 피살리엔으로 결정하였다. 또한 NMR데이타들도 문헌치와 비교하였으며, 이 결과 화합물 I은 피살리엔으로 확인되었다.

이 NMR데이타는 다음의 표 1에 나타내었다.

표 I. 화합물 I의 확인(Identification)

Compound I exhibited the following data: needle orange coloured crystal compound(27mg), Rf=0.37(solvent system of Pet. ether : EtOAc=30:1(v/v) was used as the developer), m.p. 98.5~99.5℃ [α]_D ²⁵-44°(c, 0.1, CHCl₃)

physalien(C₇₂H₁₁₆O₄) U.V.(pet. ether) λ_max(nm) : 452(ε 140) 480(ε124.4) IR(KBr) ν(cm^-1) ; 1460, 1438, 1418 (C=C), 1735(ester bond), 1350~1180cm^-1MS(EI 30eV) (m/z) ; 1044 (M⁺), 788 (M⁺-C₁₆H₃₂O₂), 696 (M⁺-C₁₆H₃₂O₂-C₇H₈)¹H-NMR(CDCl₃, 400MHz) ; δ1.6(m, H-2, ax), δ1.794(m, H-2, eq), δ1.0775(s, H-16, eq), δ1.11(s, H-17, ax), δ2.118(dd, H-4, ax), δ2.436(dd, H-4, eq), δ1.723(s, H-18), δ1.970(s, H-19, 20), δ5.10(m, H-3, ax), 6.0~6.7(m) vinyl proton, δ0.87(t, J=6 Hz, terminal CH₃), δ1.26(s), δ2.28(t, J=7.2Hz), ppm

¹³C-NMR(CDCl₃, 100MHz)

[실험방법]

실험예 1 :

In vitro 실험

간세포 배양(In vitro model)

간세포는 베리(Berry)와 프렌드(Friend)의 방법(Berry, 1969a, 1991b; Kleiman, 1979)을 약간 수정한 2단계 콜라제나제(collagenase) 관류법으로 분리하였다. 흰쥐를 우레탄(urethane)(1g/kg body weight)으로 마취시키고 70% 에탄올로 복부를 소독한 후 개복하였다. 간 문맥에 21 게이제 카테타(gauge catheter)를 삽관하여 약 50ml의 HBSS 용액을 30ml/min의 속도로 관류시켰으며, 동시에 하대정맥을 신정맥 아래에서 잘라 혈액을 제거하였다. 다음 흉강을 열고 상대정맥에 18카테타(gauge catheter)를 삽관한 다음 하대정맥을 묶어서 간조직을 통과한 소화액(digestion solution)이 상대정맥을 통하여 원래의 용기 내로 되돌아오는 재순환이 되도록 하였다. 재순환은 37℃에서 95% O₂/5% CO₂의 혼합기체를 공급해 주면서 HBSS 95ml과 콜라제나제(collagenase) 5ml(10mg/ml HBSS, 최종 농도 0.05%)로 구성된 소화액으로 10-15분간 수행하였다. 그 후 간을 적출하여 용기에 옮긴 후, 적당량의 HBSS를 가하고 간막을 가위로 찢어 간세포를 유리시킨 다음, 거즈(gauze) 및 렌즈페이퍼(lens paper)를 사용하여 여과하였다. 여과액은 50×g에서 2분간 원심분리한 다음 상징액을 버리고 침전된 간세포를 다시 배양액으로 현택시켜 원심분리하였다. 침전된 간세포를 새로운 배양액에 현탁시켜 세포 현탁액을 얻은 다음, 세포 생존율이 85%이상 되면 5×10⁵cells/ml 농도로 배양용기(collagen으로 미리 도포된 용기, 35×10mm)에 이식하여 배양하였다.

배양액은 웨이머스 MB 752/1 미디엄(Waymouth's MB 752/1 medium), 5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 2.0mg/ml 송아지 혈청암부민(bovine serum albumin)(fraction V), 10^-6M 덱사메타손(dexamethasone), 10^-7M 인슐린(insulin), 5.32×10^-2M L-세린(serine), 4.09×10^-2M L-알라닌(alanine), 2.67×10^-2M NaHCO₃, 100IU/ml 페니실린(penicillin), 100IU/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 5㎍/ml 암포테리신암포테리신(amphotericin) B 또는 50㎍/ml 겐타마이신 설페이트(gentamycin sulfate)로 구성된 것을 사용하였다.

배양환경

일정한 습도와 온도가 유지되는 37℃ 배양기에서 공기(95%)와 CO₂(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다.

사염화탄소에 의한 간세포의 독성유도

흰쥐의 간세포를 24시간 배양한 다음 10mM 사염화탄소를 배양액에 첨가하고 1.5시간 노출시켜 독성을 유발시켰다.

시료의 처리

구기자 추출물과 이의 분획물을 각각 HBSS 완충용액에 용해시켜 최종농도가 10mg/ml이 되도록 한 후밀리포아막(Millipore membrane)(0.22㎛, Millex-GV, USA)을 통과시켜 무균상태로 제조하였다.

화합물이 HBSS에 용해되지 않을 경우에는 인트랄리포스(Intralipos) 용제로 하여 무균적으로 제조하였다.

생리활성 측정

글루타믹 파이루빅 트랜스아미나제(Glutamic pyruvic transaminase) 활성 측정 :

배양액중의 GPT 활성은 Kit를 사용하여 라이트만-프랭켈(Reitman-Frankel)의 방법에 의하여 측정하였다 (S. Reitman and S. Frankel, Am. J.Cli. Pathol. 28, 56 (1957)).

솔비톨 데하이드로제나제(Sorbitol dehydrogenase) 활성 측정:

간세포 배양액중의 SDH활성은 Gerlach의 방법을 약간 수정하여 (U. Gerlach, in: Methods of Enzymatic Analysis Ed. by H. U. Bergmeyer, 1965, pp. 761-765) 측정하였다. 즉 배양액 650㎕에 200㎕의 0.2M 트리에탄올아민(triethanolamine) HCl buffer (pH 7.4), 50㎕의 NADH(23.3mg/4ml deionized water)를 가하여 상온에서 30분간 방치하였다. 곧이어 300㎕의 4.0M 후락토오스(fructose)를 첨가하여 잘 섞은 다음 365nm에서 UV흡광도 변화를 측정하였다. 1분동안 변하는 흡광도의 변화를 측정하여 SDH units로 환산하였다.

접종 하루후에 분리된 쥐 간세포를 10mM CCl₄/에탄올(0.03ml) 또는 10mM CCl₄/에탄올+인트라리포스(Intralipos:상품명)중의 피살리엔시료(최종 용매농도, 1%)를 함유하는 배지에 노출시켰다. 몇 개의 시료는 처리하지 않고 대조군으로 사용하였다. CCl₄처리 90분후에 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가하고 5시간 더 배양을 계속하였다. 다음에 배지중의 GPT와 SDH의 활성을 측정하였다(n=3).

그 결과는 제I-1도에 나타내었다.

제I-1도에서

^a대조는 CCl₄로 독성을 유발시키지 않은 간세포 배양액의 값이다.

GPT에 대한 대조값은 평균 10.8 0.5IU/L이다.

^b표준은 CCl₄로 독성을 유발시킨 비처리된 간세포 값이며, GPT 에 대한 표준값은 평균 50.8 9.2IU/L이다.

^c보호퍼센트는 100 X (표준 GPT값 - 시료의 GPT값)/(표준 GPT값 - 대조의 GPT 값)으로 계산한다.

^dSDH의 대조값은 평균 2.8 0.2Unit/ml이다.

^eSDH의 표준값은 평균 48.8 0.2Unit/ml이다.

^f보호퍼센트는 100 X (표준 SDH값 - 시료의 SDH값)/(표준 SDH값 - 대조의 SDH값)으로 계산한다.

대조와는 큰 차이가 있다 : p0.05^*, p0.01^**, p0.001^***

MDA(TBA reactants) 함량 측정 :

지질의 과산화 정도를 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(tetraethoxypropane)을 표준물질로 하여 Rechnagel법에 의하여 측정하였다 (R. O. Rechnagel, E. A. Glende jr, R. L. Waller and K. Lowrey, Lipid peroxidation: biochemistry, measurement and significance in liver cell injury, in G.L. Plaa, W. R. Hewitt(eds): Toxicology of the liver, N. Y., Ravan Press (1982)). 간세포 현탁액 0.5ml에 1ml의 10% TCA를 가해 10분 동안 방치한 다음 10000×g에서 2분 동안 원심분리하였다. 상징액 1ml을 취하여 0.5ml TBA (pH 7.0, 0.5%)를 넣고 가열하였다 (100℃, 10min). 상온에 10분동안 방치한 후 535nm에서 흡광도를 측정하였다.

수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase) 활성 측정:

간세포 내의 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)의 활성은 맥코드(McCord)와 프리도비치(Fridovich) 등의 방법(J. M. McCord, J. D. Crapo and I. Fridovich, Superoxide dismutase assay: a review of methodology, in M. A. Mehlman, J. M. MaCord and I. Fridovich(eds): Superoxide and superoxide dismutase, N. Y. Academic Press, pp 11-17(1977))을 수정하여 측정하였다. 배양용기의 배양액을 제거한 후 3ml의 66mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)를 가하여 세포현탁액을 준비하였다. 이와 같이 준비한 세포 현탁액을 15초동안 균질화시킨 후 12500×g에서 15분동안 원심분리하였다. 100㎕의 상징액에 0.2ml의 reagent A, 500㎕의 이차증류수, 200㎕의 reagent B를 가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어 200㎕의 reagent C를 가하여 상온에서 20분간 방치한 후 55nm에서 흡광도를 측정하여 SOD unit으로 환산하였다.

글루타치온-S-트랜스페라제(Glutathione-S-transferase)활성 측정:

간세포 내의 GST(glutathione-S-transferase)의 활성은 하비그(Habig) 등의 방법(W. H. Habig, M. J. Pabst and W. B. Jakoby, J. Biol. Chem. 249, 7130 (1974))을 이용하여 측정하였다. 상징액을 GST 활성 측정을 위한 검액으로 사용하였다. 50㎕글루타치온(glutathione) (30mM), 50㎕ 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)(30mM) 및 500㎕ 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer)(pH 7.4)가 담긴 시험관에 600㎕ post-mitochondrial 상징액을 가하여 잘 혼합한 후 즉시 340nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 즉, 흡광도가 직선상으로 증가하는 부분을 5분간 측정하였는데 이때 mg 단백질이 매분당 생성하는 생성물의 양이 활성을 나타내는 것으로 환산하였다.

사이토크롬 P-450(Cytochrome P-450) 함량 측정:

간세포 내의 사이토크롬 P-450(cytochrome P-450) 함량은 오무라(Omura) 등의 방법(T. Omura, and R. Sato, J. Biol. Chem. 239, 2370(1964))을 이용하여 측정하였다. 상징액을 둘로 나눠 각각을 시험관에 옮겨 각 시험관에 2-3mg의 소디움 디티오네이트(sodium dithionite)(Na₂S₂O₄)를 첨가하여 혼합한 후 검액에만 일산화탄소 개스(carbon monoxide gas)를 30초간 주입하고 대조군을 대조로 하여 450nm와 490nm에서 검액의 흡광도를 측정했다. 두 파장에서의 흡광도 차이를 사이트크롬 P-450(cytochrome P-450) 함량으로 환산하였으며 cytochrome P-450 함량은 mg 단백질 당 함유되어 있는 양으로 나타내었다.

이들 결과는 제I-2에 나타내었다.

세포중의 MDA, 와 사이토크롬 P-450의 함량 및 GST활성을 측정하였다(n=3).

^a대조군의 MDA, 사이토크롬 P-450의 함량 및 GST 활성은 각각 평균 80.6 5.5nmol/mg protein, 1967.4 40.4nmol/mg protein 및 13.9 3.9umol/mg protein이었다.

^b표준군의 MDAl, 사이토크롬 P-450의 함량 및 GST활성은 각각 평균 114.5 6.6nmol/mg protein, 344.2 28.4nmol/mg protein 및 5.3 0.2umol/min/mg protein이었다.

4-하이드록시프롤린(4-Hydroxyproline) 함량 측정 :

21일 동안 배양한 간세포 내에서의 4-하이드록시플로린(4-hydroxyproline) 함량은 스윗쳐(Switzer) 등의 방법(B.R. Switzer, J. Nutr. Biochem., 2, 229(1991))을 이용하여 측정하였다. 21일 동안 배양한 세포를 수집한 다음 같은 부피의 50% TCA(4℃)를 가해 단백질을 침전시킨 후 2000×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층을 제거하고 침전된 단백질의 부피와 동량의 6N HCl로 가수분해 시켰다(18hr). 가수분해물 100㎕을 각기 용기에 넣고 진공 건조한 후 1.2ml, 50% 이소프로파놀(isopropanol)과 0.2ml 클로라민-T(chloramine-T)용액을 가하였다. 그리고 10분 후에 1ml 에를리히(Erhlich)용액을 가하고 배양한(50℃, 90min)후 증류수를 대조로 하여 558nm에서 흡광도를 측정했다.

단백질 정량:

단백질 양은 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준품으로 하여 롤리(Lowry)방법 (O. H. Lowry, N. J. rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randall, J. Biol, Chem. 193, 265(1961)으로 505nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

[실험예 2]

In vivo 이차담도성 간섬유화 모델

실험동물:

실험 동물은 200g 내외의 자성 위스터 랫트(Wistar rats)를 서울대학교 동물사육장으로부터 공급받아 사용하였다. 간 담도 결찰 시술 후 6주를 경과하여 간 섬유화를 유도하였다. 대조군은 콘토라스의 방법으로 샴-오퍼레이티드(sham-operated)하였다 (J. Kontouras, H. Barbara, J. S. Biling and P. Billing, Prolonged bileduct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat, Br. J. Exp. Path., 65, 305-311(1984)). 실험 전 기간 동안 대조군 및 담도 결찰한 rats에게 tween 20% 및 tween 20%+약물(12.5mg/kg b.w. 25mg/kg b.w.)를 각각 투여하였다. 6주후 실험동물을 치사시키고 심장에서 채혈하여 ALT, AST 활성 및 MDA의 양을 측정하였다. 수술 즉시 간을 채취하고 이를 포르말린 고정하였다. 간 조직의 일부는 호모지네이션(homogenation)하여 ALP, GGT, 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline) 양 및 산화환원 관련 효소의 활성을 측정하였다.

간 조직 내 콜라젠(collagen)양의 측정:

간 조직 내의 콜라젠(collagen)양은 로페즈 데 레온(Lopez de Leon)과 로즈킨드(Rojkind)의 방법을 따랐다(A. L. Leon and M. Rojkind, A simple microethod for collagen and total protein determination in formalin-fixed paraffin-embedded sections, J. Histochem. Cytochem., 33. 737-743(1985)). 이 방법은 시리우스 레드(Sirius Red)와 파스트 그린(Fast Green)이 각각 콜라젠(collagen) 단백질과 비코라젠(collagen) 단백질에 선택적으로 염색되는 성질을 이용한 것이다. 파라핀(Paraffin)으로 포매한 조직 절편(10㎛)을 염색한 후 이를 0.1% NaOH; methanol (1:1, v/v)으로 용출시켜 그 흡광도를 630nm(for Fast Green), 540nm(for Sirius Red)에서 측정하였다.

결과는 ㎍ collagen/mg total protein으로 나타내었다(Leon and Rojkind, 1985; 및 W. Jimenez, A. Pares, J. Caballeria, D. Heredia, M. Bruguera, M. Torres, M. Rojkind and J. Rodes, Measurement of fibrosis needle liver biopsies: Evaluation of a colorimetric method, Hepatology, 5, 815-818(1985))

4-하이드록시플린(4-hydroxyproline) 양의 측정:

간 조직 내의 콜라젠(collagen)양은 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline)양을 측정하여 간접적으로 확인하였다. 얼린 간조직을(median lobe, 30-50mg) 동결 건조하고 이를 가수분해하였다. 가수분해물을 여과하고 이 중의 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline)양을 스윗쳐(Switzer) 등의 방법에 의하여 측정하였다(B. R. Switzer, J. Nutr. Biochem., 2, 229(1991)).

그 결과를 제I-3도에 나타내었다. 제I-3도는 CCl₄에 의하여 독성이 유발된 쥐 간세포를 장시간 배양하였을 때 하이드록시프롤린 량에 대한 피살리엔의 효과를 나타낸 것이다.

배지를 매일 갈아주고 21일간 전배양한 후, 일차 쥐 간세포를 제1도의 설명에서 기술된 바와 같이 피살리엔을 첨가한 것과 첨가하지 않은 CCl₄에 노출시킨다. CCl₄에 노출시킨 90분후에 배지를 갈아주고 배양액을 5시간 더 배양한다. 세포중의 하이드록시프롤린량을 다음에 계산한다(n=3).

^a하이드록시프롤린량의 대조값은 0.23 0.01ug/mg protein이다.

^b하이드록시프롤린량의 표준값은 0.87 0.02ug/mg protein이다.

간 조직 내 및 혈액의 생화학적 지표 분석:

간 조직 내의 SOD, GST 활성 및 혈중의 MDA의 양은 in vitro 방법을 따랐다. 간 조직 내의 GSH 양은 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitro-benzene)을 이용하여 정량하였고 GSSG 리덕타제(reductase)의 활성은 칼버그(Carlberg) 마네비크(Mannervik) 등의 방법을 따랐다(I. Carberg and B. Mannervvik, Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver, J. Biol. Chem., 250, 5475(1975)). ALP의 활성은 4-니트로페닐 포스페이트(4-nitrophenyl phosphate)를 기질로 하여 티츠(Tietz) 등의 방법에 따라 측정하였고(N. W. Tietz, C. A. Burtis, P. Duncan, K. Ervin, C. J. Petitclerc, A. D. Rinker, D. Shirey and E. R. Zygowicz, A reference method for measurement of alkaline phosphatase activity in human serum, Study group on alkaline phosphatase, Clin. Chem., 29, 751(1983)), GGT의 활성은 감마글루타밀-p-니트로아닐린(gamma glutamyl-p-nitroaniline)을 기질로 차츠(Szasz) 등의 방법에 의하여 측정하였다(G. Szasz, A kinetic photometric method for serum gamma-glutamyltraspeptidase, Clin. Chem., 15, 124 (1969)).

통계 처리 :

통계적 유의성을 검토하기 위해 대조치로부터의 변동을 ANOVA test에 의해 판정하였다. P값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

결과:

피살리엔이 사염화탄소에 의하여 독성을 입은 간세포에 대한 보호작용을 나타내는지를 알아보기 위하여 피살리엔(0.1-10μM)을 일차배양 간세포에 투여하였다. 피살레인은 사염화탄소에 의한 독성으로 증가되는 배양액 내의 GPT 및 SDH 양을 감소시켜 10μM 농도에서 각각 정상상태 때의 63%, 76% 수준까지 독성을 차단시키는 효과를 나타내었다. 그 결과는 제1-1도에 나타내었다.

00 사염화탄소에 의하여 독성을 입은 간세포의 지질과산화에 미치는 피살리엔의 효과를 알아보기 위하여 지질과산화에 의하여 생성되는 마론디알데하이드(MDA)의 양을 측정하였다. 정상 간세포에서의 MDA 생성양은 80.6±5.5pmol/mg protein이었으나 사염화탄소로 독성을 입은 간세포의 경우 114.5±6.6pmol/mg protein까지 증대하였다. 그러나 피살리엔은 10μM 농도에서 사염화탄소에 의해 증가된 MDA 양을 90.5±3.4nmol/mg protein으로 감소시켰다. 그 겨로가는 제1-2도에 나타내었다. 지질의 과산화를 억제시키는 작용이 있음을 확인할 수 있었다.

피살리엔이 약물대사 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 간세포 내의 사이토크롬P-450양을 알아보았다. 간세포가 사염화탄소에 의하여 독성을 입으면 세포 내의 사이토크롬 P-450양은 344.2±28.4pmol/mg protein으로 정상상태 때의 1/6 정도로 감소하였다. 피살리엔을 사염화탄소로 독성을 유발시킨 간세포에 작용시키면 사이토크롬 P-450의 양을 농도의존적으로 증가시켜 10μM의 농도에서 정상상태 때의 80%인 1650.5±72.0pmol/mg protein 수준까지 유지시켰다. 그러나 생체 내 해독작용에 관여하는 효소인 글루타치온-S-트랜스페라제(glutathione-S-transferase (GST))의 활성에 대하여서는 피살리엔은 유의성 있는 활성을 나타내지 않았다.

한편 피살리엔이 컬라젠합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하이드록시프롤린의 양을 측정하였다. 흰 쥐의 간세포를 3주 동안 배양한 경우 정상상태에서는 하이드록시프롤린의 양이 230±10ng/mg protein이었으나 사염화탄소로 독성을 유발시킨 하이드록시프롤린의 양이 870±20ng/mg protein로 정상상태에 비하여 4배 증대되었다. 그러나 피살리엔을 사염화탄소로 독성을 입힌 간세포에 작용시키면 1μM 농도에서 390±30ng/mg protein까지 감소시켜 정상상태 때의 90% 수준까지 회복시켰다. 그 결과는 제1-3도에 나타내었다.

사염화탄소로 독성을 유발시킨 간세포 대하여 피살리엔은 지질의 과산화를 억제하고 약물대사효소인 사이토크롬 P-450의 활성을 증가시켜 간세포 보호 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 간접적이기는 하지만 피살리엔은 간세포내 4-하이드록시프롤린의 양을 감소시켜 항섬유화 활성을 나타내었고 생체 내에서 간섬유화를 억제시킬 수 있음을 시사하였다. 이에 연구자 등은 흰 쥐의 간담도를 결찰하고 6주를 경과하는 동안 유도된 간 섬유화에 대한 피살리엔의 작용을 알아 보았다.

6주 동안의 간 담도 결찰에 의한 간 손상은 외견상 간 및 비장이 비대해짐은 물론 중심정맥 주위에 콜라겐 양이 증가하고 문맥역 주위에 담도관상(ductular structure) 구조가 증대되는 현상을 수반하였다(P. Muriel, O. R. Suarez, P. Gonzalez and L. Zuniga, Protective effect of S-adenosyl-1-methionine on liver damage induced by biliary obstruction in rats: a historical, ultrastructural and biochemical approach, J. Hepatol. 121. 95-102 (1994)). 그 결과는 제II-1도에 나타내었다. 피살리엔을 함유한 분획(physalien +triacylglycerol 4.5:5.3, w/w)을 실험 전 기간 동안 경구투여한 경우(12.5mg/kg body weight/day, 25mg/kg body weight/day) 간담도 결찰에 의해 증가된 collagen의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었다(제II-2도). 6주 후 간 및 비장의 무게, 체중 변화량은 대조군이나 약물 투여군에서 유의성있는 차이를 보이지 않았다(표II-1). 혈액 중의 GPT 및 GOT의 활성은 정상 대조군의 경우 18.7±5.8과 57.1±11.0 U/1였으며 6주 담도 결찰 후에는 71.6±16.5 및 162.0±19.9 U/1로 유의성있게 증가되었다. 그러나 피살리엔을 함유한 분획을 25mg/kg body weight/day 농도로 투여한 경우 GOT 활성이 유의성 있게 감소되었다(표 II-2). 담즙 정체성 효소인 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(gamma glutamyl transpeptidase (GGT)) 및 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase (ALP))의 활성도 담도 결찰 시술 6주 후에는 유의성있게 증가되었다. 피살리엔을 25mg/kg b.w./day 농도로 투여한 경우 ALP의 활성이 유의성있게 감소되었다(표 II-2). 간 담도 결찰 후 즉시 채취한 간 조직을 포르말린으로 고정하고 파라핀 포매한 간 절편을 콜라겐막을 선택적으로 염색하는 시리우스 레드(Sirius red) 시약을 사용하여 염색하고 이를 메탄올로 용출시켜 정량한 결과 피살리엔을 25mg/kg b.w./day 농도로 투여하였을 때 간 조직 내의 컬라젠양이 현저히 감소되었다. 또 간 조직을 가수분해하여 유리된 4-하이드록시프롤린을 정량한 결과 역시 유의성있는 감소를 나타내어 피살리엔이 간 섬유화를 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(표 II-3).

피살리엔 분획의 간 담도 결찰에 의한 산화적 자극에 대한 효과를 알아보기 위하여 산화, 환원에 관여하는 몇 종류의 효소 활성에 미치는 영향을 알아보았다. GST는 용해도가 낮은 소수성 물질과 GSH를 결합시켜 용해도를 증가시킴으로써 생체내 저장과 세포내 이동 그리고 체외배설을 용이하게 한다. 따라서 체내의 GSH pool 및 GST 활성은 독성물질의 무독화 단계에서 중요한 역할을 한다고 할 수 있다(S. Ahmad, Oxidative stress and antioxidant defenses in biology, pp238-272, Chapman and Hall, N. Y.,(1995)). 또 생리적으로, 병리적으로 발생하는 자유기의 해소(scavenger)에 관여하는 효소인 SOD, catalase의 활성도 생체방어기전의 중요한 효소들이다. 자유기를 발생하는 물질의 제거, 자유기에 의한 지질과산화 방지, 대사효소의 활성 유지 및 체외배설은 그러므로 병변의 진행을 차단하는 중요한 요소가 된다. 피살리엔은 간 조직 내의 SOD, GSSG reductase의 활성에도 간 담도결찰 대조군과 유의성있는 차이를 나타내지 않았으나 GSH 양은 정상 대조군(56.9±10.5nmol/mg protein)의 74%를 유지하였고 GST 효소 활성은 농도의존적으로 유의성있게 증가시켰다. 또 지질과산화정도를 나타내는 MDA양도 피살리엔을 25mg/kg b.w.를 투여하였을 경우 3.8±1.5nmol/l로서 간 담도 결찰군(6.4±0.8nmol/l)에 비해 유의성있게 감소하였다(표 II-4).

이상의 결과는 피살리엔 및 피살리엔을 함유하는 구기자 분획이 흰 쥐의 간담도를 결찰시켜 인위적으로 유도한 간 섬유화를 유의성있게 차단시키므로 이를 간경변의 예방이나 치료제로의 개발 가능성을 시사한다고 하겠다.

표 II-1. 간 및 비장중량 및 체중의 변화

표 II-2. 혈청중 생화학적 활성 및 간조직에서의 콜레스타틱 엔자임 활성

GGT : nmol of released γ-glutamyl-p-nitroaniline/min/mg protein

ALP : nmol of released 4-nitrophenol/min/mg protein Significantly differ from BDL control a) p0.05, c) p0.001

표 II-3. 간조직에서의 4-하이드록시프롤린과 콜라젠량

4-Hydroxyproline : total liver 4-hydroxyproline(mg)

Collagen : ㎍ collagen/mg protein

Significantly differ from BDL control b) p0.01, c) p0.001

표 II-4. 간조직에서의 항산화 효소 프로파일 및 혈청중 MDA 량

GSH : nmol/min/mg protein

GST : nmol/mg protein

GSSG reductase, SOD : U/mg protein

MDA : nmol/l

Significantly different from BDL control a) p0.05, b) p0.01 c) p0.001

[실험예 3]

급성독성실험

1. 경구투여

ICR계 마우스(25 5g)를 10마리씩 5군으로 나누어 본 발명의 피살리엔을 각각 1, 5, 25, 125, 625mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과, 5군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

2. 복강투여

ICR계 마우스(25 5g)를 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 피살리엔을 각각 0.2, 2, 20, 200mg/kg의 용량으로 복강투여한 후 24시간동안 독성여부를 관찰한 결과, 4군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

이상의 결과에서, 본 발명의 피살리엔은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 피살리엔은 간장의 항섬유화 작용을 가지고 있는 놀라운 사실이 입증되었을 뿐만 아니라 독성도 거의 없음이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 피살리엔은 간장의 섬유화를 예방하거나 또는 치료할 수 있는 능력이 있으며, 본 발명의 피살리엔은 간경변의 예방과 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명의 피살리엔은 일일 1.0 내지 2000mg을 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제나 또는 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적인 방법으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있는 약학적 제제로 제제화하여 의약품 또는 식품으로 사용될 수 있다. 이 량은 환자의 나이, 성별 또는 질병의 정도에 따라서 증감될 수 있다.

다음에 제제실시예로서 본 발명의 제제의 제조예를 예시한다.

제제실시예 1 : 정제의 제조

피살리엔50mg

유당20mg

전분20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 2 : 캅셀제의 제조

피살리엔50mg

유당20mg

전분19mg

탈크1mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

제제실시예 3 : 주사제의 제조

피살리엔10mg

용해보조제적량

주사용 멸균증류수 적량

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법에 따라서 전체용량을 2ml로 한 후 2ml의 앰플에 충진하고 밀봉한 다음 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 4 : 시럽제의 제조

피살리엔1000mg

설탕5g

이성화당5g

소디움 벤조에이트10mg

용해보조제적량

정제수적량

전체50ml

상기의 성분을 정제수에 넣고 잘 교반한 다음 50ml의 갈색 유리병에 충진하여 시럽제를 제조한다.

Claims (1)

1. 다음 구조식(1)의 피살리엔을 활성성분으로 함유하고 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제와 함께 통상의 약제학적으로 사용되는 제조방법에 따라서 통상의 약제학적인 제제로 제제화한 간장의 항섬유화 제제조성물.