KR19980064214A - 분석물의 면역화학적 측정을 개선하기 위한 면역해리법 - Google Patents

분석물의 면역화학적 측정을 개선하기 위한 면역해리법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분석물과 상호작용성 생물 친화성을 나타내는 고정화된 특이적 수용체 R1, 및 마찬가지로 분석물과 상호작용성 생물 친화성을 나타내고 통상적으로 표지된 특이적 수용체 R2를 사용하여 샘플중의 하나 이상의 분석물을 면역화학적으로 측정하는 방법에 관한 것이다. 신규한 방법에서, 분석물에 대해 하나이상의 특이적 결합 부위를 갖고있는 수용체 R3을 가하고, 이로써 수득한 면역 복합체를 완전히 또는 부분적으로 해리시킨 후, 이들을 재결합시키고 계속해서 검출한다. 추가의 바람직한 양태에 따라서 수용체 R3 이외에 R3에 대한 친화성을 갖고 고체상에서 고정화되는 수용체 R4를 사용하여, 이로써 수득한 면역 복합체를 완전히 또는 부분적으로 해리시킨 후, 이들을 재결합시키고 계속해서 검출한다.

Description

분석물의 면역화학적 측정을 개선하기 위한 면역해리법
본 발명은 분석물과 상호작용성 생물 친화성을 나타내는 고정화된 특이적 수용체 R1, 및 마찬가지로 분석물과 상호작용성 생물 친화성을 나타내고 통상적으로 표지된 특이적 수용체 R2를 사용하여 샘플중의 하나 이상의 분석물을 면역화학적으로 측정하는 방법에 관한 것이다. 신규한 방법에서, 분석물에 대해 하나이상의 특이적 결합 부위를 갖고있는 수용체 R3을 가하고, 이로써 수득한 면역 복합체를 완전히 또는 부분적으로 해리시킨 후, 이들을 재결합시키고 계속해서 검출한다. 추가의 바람직한 양태에 따라서 수용체 R3 이외에 R3에 대한 친화성을 갖고 고체상에서 고정화되는 수용체 R4를 사용하여, 이로써 수득한 면역 복합체를 완전히 또는 부분적으로 해리시킨 후, 이들을 재결합시키고 계속해서 검출한다.
질병 유도물질, 예를 들면 바이러스, 세균, 알레르겐, 자가항원 또는 특히 약제에 대한 특이적 항체 형성으로 수반되는 질병을 진단하기 위한 통상적인 면역학적 방법은 이들 항체가 유도 물질에 속하는 항원성 구조를 갖는 복합체를 형성하는 능력을 기본으로 한다.
특히 일반적으로 이종 면역검정이라고 칭하는 상기 방법의 양태에서, 이의 성분, 예를 들면 특이적 항체(분석물 항체)에 대해 조사될 샘플을 질병 유발물질의 항원성 구조, 공지된 적절한 지지 물질상에 고정화된 이의 항원성 구조와 접촉시킨다. 샘플내에 존재하는 분석물 항체는 면역 복합체로서 지지 물질에 고정화된 질병 유발물질의 항원성 구조에 결합되어 검출된다. 샘플의 분석물 항체와 복합체를 형성할 수 있는 검출 항체 또는 기타 특이적 수용체(예; 단백질 A)는 검출에 사용될 수 있다.
통상적으로, 검출 시약은 방법론적으로 결합된 항체의 양을 검출할 수 있게하는 표지를 수반한다.
통상적으로 사용된 표지는 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 인광 물질 또는 발광성 물질, 안정한 짝지워지지 않은 전자를 갖는 물질, 라텍스 입자, 자기성 입자, 금속 교질용액 및 적혈구이다.
상기 방법은 단일-단계 및 다중 단계 검출 방법 둘 다를 포함한다고 공지되어 있다. 각 절차상 단계는 일반적으로 분리 공정(세척 단계)으로 종결된다.
그러나, 이종 면역 검정에서 매우 간단히 수행되는 단일-단계 방법의 기술은 모든 질병 마커를 검출하기에는 적합하지 않다. 이-단계 또는 다중단계 방법이 기술적 이유로 종종 적용되어 왔다.
그러나, 면역 복합체 전이 효소 면역 검정이라고 칭하는 다중단계 방법은 또한 공지되어 있다[참조 문헌; S. Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Anaysis 8: 86-95 (1994)]. 상기 방법에서, 고체상 항원, 특이적 항체 및 표지된 배합 항원을 포함하는 완전한 면역 복합체는 고체 상으로 부터 분리된다. 그 후 완전한 면역 항체는 항체-결합 고체상으로 피펫으로 전이시켜 고정시키고 검출한다.
상기 방법은 매우 특이적이나, 검출되는 질병 유발물질 또는 이에 대한 지시된 항체가 1차 단계에서 고정화된 특이적 수용체를 갖는 복합체로 도입되면, 당해 기술분야의 숙련인에게 공지된 역 반응으로 후속 반응 단계에서 복합체로 부터 다시 부분적으로 분리될 수 있고, 결과적으로 검출 반응을 제외하게 되어 반응성이 감소된다는 단점이 있다.
상기 다중단계 방법의 진단적 효율은 고정화된 수용체와 검출될 물질 사이에서 역반응 속도가 높을 경우 특히 크게 감소한다. 상기 높은 속도는, 예를 들면 질병 유발물질 또는 약제에 대해 낮은 친화성을 갖는 항체인 경우에 수득된다. 숙련인은 상기 효과가 특히 후속적으로 돌연변이되어 고정화된 특이적 수용체와 단지 약한 상호반응만을 나타내는 변이성 질병 유발물질 또는 질병 마커를 종종 검출하는 방법의 경우에서 수득된다는 것을 알고 있다.
EP 0 572 845에서는 역 반응 속도가 검출되는 물질의 구조적 특징에 대한 추가의 수용체를 가함에 의해 실질적으로 감소된다고 기술하였다. 이 수용체는 검출되는 물질에 대한 하나 이상의 결합 부위를 가져야만 하고, 물질의 면역 화학적 검출을 간섭하지 말아야 한다.
그러나, 역 반응의 현저한 감소에도 불구하고, 상기 방법은 마찬가지로 질병 유발물질 또는 약제에 대한 특별한 저-친화성 항체를 높은 반응성으로 신뢰할만하게 검출하는데 사용할 수 없다.
그러므로, 본 발명의 목적은 이러한 단점을 갖지 않는 시약을 밝히는 것이다.
놀랍게도, 고정화된 특이적 수용체 R1, 수용체 R1과 상호 작용성 생물친화성을 나타내는 분석물 A, 및 상기 분석물에 대해 지시되고 통상적으로 표지된 특이적 수용체 R2로 이루어진, 이미 형성된 면역 복합체가 면역 해리 단계 및 후속적의 재결합 단계를 수행하면, 수용체 R3이 부가적으로 첨가된 경우 시그날에서 증가가 나타날 수 있음을 발견했다. 후자의 수용체는 분석물 A 및 수용체 R1 또는 분석물 A 및 수용체 R2 사이의 면역 반응을 억제하지 않고, 하나 이상의 분석물과 결합할 수 있기 때문에 고체상에 결합되지 않는 분석물의 비율을 감소시킨다.
다른 양태에서 R3외에 추가의 고정화 수용체 R4가 첨가되고, 수용체 R4는 R3과 상호작용성 생물친화성을 나타낼 수 있다. R4는 분석물 A 및 수용체 R3으로 이루어진 면역 복합체를 고체상에 결합시킴에 의해 비고정화 면역 복합체의 비율을 감소시킨다. 그러나, 이러한 경우, 특이적 수용체 R3은 상기 양태에서와 같이 분석물 A에 대해 하나 이상의 특이적 결합 부위를 가져야만 하는 것은 아니다. 분석물 A 및 일반적으로 표지를 수반하는 수용체 R2의 상기 부가의 결합은 결과적으로 시그날 수율을 현저하게 증가시키고, 궁극적으로 분석물 A에 대한 검정의 반응성을 증가시킨다.
다른 양태에서, 수용체 R4는 2차 고체상에서 고정화되고, 해리된 면역 복합체, 예를 들면 R3-A-R2는 1차 고체상에서 2차 고체상으로 전이되고, 이때 재결합 단계 및 R2의 검출이 또한 일어난다.
본 발명의 의미내에서 검출된 분석물 A는, 예를 들면 질병 유발물질에 의해 유도되는 항체 또는 질병유발 물질 그 자체와 같은 항원일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 지지체에 고정화되고, 특이적 수용체 R1에 분석물의 결합 정도가 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 추가의 특이적 수용체 R2로 측정되는 특이적 수용체 R1, 및 검출될 물질 A에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 고정화된 특이적 수용체 R1에 대해 특정 친화성을 갖지 않고, 표지되지 않은 수용체 R3을 가하고, 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 특이적 수용체 R2에 분석물 A의 결합 정도를 하기의 재결합으로 측정하는 방법을 사용하여 하나 이상의 분석물을 면역 화학적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 지지체에 고정화되고, 특이적 수용체 R1에 분석물의 결합 정도가 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 추가의 특이적 수용체 R2로 측정되는 특이적 수용체 R1, 및 해리 단계에서 검출될 물질에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖지 말아야 하는 결합 인자 R3 이외에, 추가의 특이적 고정화 또는 고정성 수용체 R4를 가하고, 상기 수용체 R4는 R3 에 대해 친화성을 나타내고, 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 특이적 수용체 R2에 분석물 A의 결합 정도를 하기의 재결합으로 측정하는 방법을 사용하여 하나 이상의 분석물을 면역 화학적으로 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 지지체에 고정화되고, 특이적 수용체 R1에 분석물의 결합 정도가 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 추가의 특이적 수용체 R2로 측정되는 특이적 수용체 R1, 및 해리 단계를 포함하는 단계에서, 검출될 물질에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖지 말아야 하는 결합 인자 R3 이외의 경우에, 해리된 번역 복합체, 예를 들면 R3-A-R2가 추가로 특이적 고정화 또는 고정 가능한 수용체 R4를 포함하는 2차 고체상으로 전이되고, 상기 수용체 R4는 R3에 대하 친화성을 보이고, 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 수반하는 특이적 수용체 R2에 분석물 A의 결합 정도를 하기의 재결합으로 측정하는 방법을 사용하여 하나 이상의 분석물을 면역 화학적으로 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 의미에 있어서, 표지되지 않은 이란 R3이 특정 표지를 수반하지 않거나 특정 수용체에 분석물의 결합 정도를 측정하기 위해 사용되는 표지를 수반하지 않는 것을 의미한다.
방법에서 특이적 수용체 R4는 이의 모든 양태에서 숙련인 에게 공지되어 사용될 수 있다. 중요한 인자는, 바람직하게는 분석물이 고정화된 특이적 수용체에 면역 화학적으로 또는 유사하게 1차 단계에서 결합하고, 2차 단계에서 직접적 또는 간접적으로 검출되나 꼭 차례로 분리된 단계일 필요는 없는 모든 면역 화학적 방법에서 신규한 방법을 적당한 형태로 적용할 수 있는 것이다.
상기 방법은 바람직하게는 숙련인에게 샌드위치 ELISA로 공지된 방법으로, 바람직하게는 염색성 또는 형광성 기질을 갖는 효소 또는 표지 시스템으로 바람직하게 사용된 발광성 표지로 적용될 수 있다. 그러나 선택된 양태는 신규한 방법의 가능한 용도에 중요한 영향을 주진 않는다.
미세 적정 플레이트, 자기성 입자, 라텍스 입자 또는 화학적 매트릭스를 갖는 시험 원소, 예를 들면 섬유 또는 막을 포함하는 시험 모듈러스는 바람직하게는 고체상으로 사용된다.
당해 숙련인에게는 상기 언급된 바대로 면역학적 방법은 상이한 분석물, 예를 들면 HIV 1(HIV = human immunodeficiency virus) 및 HIV 2, 각각 또는 서로 배합하여, 또는 HIV 1 및/또는 HIV 2를 HCV(hepatitis C virus 또는 hepatitis C virus 항원)과 배합하여 동시에 측정하기 위해 적용될 수 있다고 공지되있다. 상기 언급된 의미에서 분석물은 바이러스성 항원 또는 이에 대해 지시된 항체일 수 있다. 상기 양태는 또한 본원에 포함된다.
본 발명의 의미에서 해리는 생물친화성 상호작용을 역의 방법으로 붕괴시키거나 감소시킬 수 있는 모든 화학적 및 물리학적 방법을 포함한다. 숙련인에게는 단백질 및 항체의 면역 화학적 정제에서 사용되는 화학 물질로, 예를 들면 티오시아네이트, 우레아 또는 구아니딘이 공지되어 있다. 해리는 또한 면역학적으로 적합한 작용 물질과의 경쟁과 같은 면역학적 방법으로 일어날 수 있다. 해리는 추가로 산성 또는 알칼리성 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 숙련인에게는 마찬가지고 해리의 물리적 방법은, 예를 들면 온도차, 전자파 또는 초음파로 공지되 있다.
본 발명의 의미내에 재결합은 비-해리성 조건, 예를 들면 중화 또는 희석으로, 또는 단순히 이전에 수행된 해리 조건의 역(예; 상기 언급된 온도차를 제거하거나 전자파 발생기 또는 초음파 발생기의 정지)으로 수행하는 것을 의미한다.
본 발명의 의미내에 수용체 R3은 분석물 A에 대해 하나 이상의 생물친화성 결합 부위를 갖는 특이적 결합 파트너이다. 또한 상기 수용체 R3은 수용체 R4의 상호 반응으로 도입할 수 있다. 상기 수용체 R3의 결합 파트너 또는 성분은 항체의 결합체 또는 항체 자체일 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편 또는 이의 결합체는 A 또는 이외의 A 및 R4에 대해 직접적일 수 있다. 수용체 R3은 또한 수용체 R4가 지시된 구조적 원소에 대해 커플링되는 항체 또는 항체 단편을 포함 할 수 있다.
본 발명의 의미내에 수용체 R4는 R3에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖는 특이적 결합 파트너이다. 수용체 또는 상기 수용체의 성분은 항체/항체 단편의 결합체 또는 항체/ 항체 단편 그자체일 수 있다. 상기 항체/항체 단편 또는 이의 결합체는 R3에 대해 직접적일 수 있거나 이외에 수용체 R3을 포함하는 결합 부위로 인식되는 항원성 구조를 가질 수 있다. R4는 또한 R3이 지시된 구조적 원소에 대해 커플링되는 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 방법에서 사용하기위한 시약에 관한 것이다.
특이적 항원(분석물)을 검출하기 위한 수용체의 바람직한 배합물은
R1: 분석물에 대해 지시된 항체
R2: 표지를 갖고 분석물에 대해 지시된 항체
R3: 분석물 A에 대해 지시된 항체이다.
특이적 항원(분석물)을 검출하기 위한 수용체의 바람직한 배합물은
R1: 분석물 A에 대해 지시된 항체
R2: 표지를 갖고 분석물 A에 대해 지시된 항체
R3: 분석물 A애 대해 지시된 항체
R4: 항체 R3에 대해 지시된 항체이다.
항원이 검출되는 경우, 항체 또는 항체 단편은 고체상 항체 R1 또는 결합 항체 R2가 바람직하게는 수용체 R3 만큼 사용되는 동일한 에피토프를 인식하지 않는다.
특이적 항체(분석물)을 검출하기 위한 수용체의 바람직한 배합은
R1: 분석물 A가 지시되는 항원
R2: 표지를 갖고 분석물 A가 지시되는 항원
R3: 분석물 A에 대해 지시된 항체
특이적 항체(분석물)을 검출하기 위한 수용체의 바랍직한 배합은
R1: 분석물 A가 지시되는 항원
R2: 표지를 갖고 분석물 A가 지시되는 항원
R3: 분석물 A에 대해 지시된 항체
R4: 항체 3에 대해 지시된 항체이다.
특이적 항체(분석물)을 검출하기 위한 수용체의 특히 바람직한 배합은
R1: 분석물 A가 지시되는 항원
R2: 표지를 갖고 분석물 A가 지시되는 항원
R3: 분석물 A에 대해 지시되고, 항체-고유적이지 않은 추가의 에피토프를 수반하는 항체
R4: 항체 R3의 추가의 에피토프에 대해 지시되고, 상기 에피토프가 항체-본질이 아닌 항체이다.
숙련인에게는 항체-본질이 아닌 항체 및 추가의 항원(예; 바이오틴 또는 디그옥시제닌)을 각각의 경우에 포함하는 결합체를 제조하기 위한 방법으로 공지되있다. 개시 물질의 생물친화성 기능을 보유하는 반면, 상기 결합체은, 예를 들면 화학적 시약의 도움으로 링커 도는 생물친화적 상호반응으로 제조 될 수 있다. 하이브리드 분자는 또한 화학적 합성, 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다.
신규한 시약은 다수의 사람 및 수의학적 진단법으로 사용될 수 있다. 인용되는 예는 바이러스(예; hepatitis A, B 및 C 바이러스 및 또한 상이한 HIV 형), 세균성 및 기생 병인 및 또한 알레르기성 질병의 구조적 특징에 대한 상이한 면역글로블린 종의 항체를 검출이-단계 또는 다중단계 시험이다. 기타 싱시에는 빌병 유도 물질, 예를 들면 바이러스(예; hepatitis B 바이러스), 세균, 기생물질 및 알레르겐,및 또한 다중 단계 검출 방법에서 질병 마커(예; 종양 마커)이다.
본 발명은 하기의 실시예 및 특허청구의 범위로 명료해지나 추가로 더욱 일반적인 교시의 특정 제한을 의도하는 것은 아니다.
실시예 1
1a) 고체상의 제조
B형 미세적정 플레이트(구입처; Nunc, Roskilde, Denmark)를 코팅 용액(50mM탄산나트륨 완충용액, pH 9.5중의 재조합 gp41[Behringwerke AG, Marburg, FRG] 600 ㎍/ℓ 및 바이오틴[Behringwerke AG, Marburg, FRG]에 대한 모노크로날 항체)의 웰당 100㎕와 함께 4℃에서 24시간 동안 배양한다. 그후 미세적정 플레이트의 웰을 세척 용액(50mM Tris, 0.1% Tween 20, pH 7.2) 300㎕로 3회 세척한다. 실리카 겔로 건조된 미세적정 플레이트는 혐기적 조건하에서 약 1년 동안 안정하다.
1b) 결합체의 제조
HIV 1 gp41 펩티드(IAF Biochem, Laval, Canada) 10㎎을 무수 초산/물(50:50, v/v) 1㎖중에 용해시킨다. 5N 수산화나트륨 용액으로 중화시킨후 10배의 초과 몰랄 N-γ-말레이미도부틸릴석신산을 가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 안정화시킨다. 반응하지 않는 이종이작용성 시약은 인산 나트륨 100mM, 니트릴로드리아세트산 5M, pH 6.0을 사용하여 겔 여과(Sephadex G-25)로 분리한다.
홀스 래디쉬 퍼옥사이드(Boeringer Mannheim, Mannheim, FRG) 10㎎을 100배 초과 몰랄 2-이미노티오란과 함께 10mM 인산 나트륨 10㎖, 100mM 염화 나트륨 pH 8.0중에서 실온에서 1시간 동안 배양한다. 그 후 유리 개질성 시약을 100mM 염화인산, 5mM 니트릴로트리아세트산, pH 6.0을 사용하여 겔 여과(Sephadex G-25)하므로 제거한다.
두 용출제(SH-활성화 퍼옥시다제 및 말레이미드-변형된 HIV 1 펩티드)를 결합하여 실온에서 밤새 배양한다. 100mM N-에틸말레이미드 1/10 vol으로 반응을 멈춘후, 결합체을 비반응한 HIV 1 펩티드로 부터 겔 여과(Sephadex G-25)하므로 제거한다. 농축(2mg/ml)시킨 후, 결합체을 -20℃에서 저장한다.
1c) 바이오틴화된 항체의 제조
10mM 인산 나트륨, 100mM 염화 나트륨, pH 8.0중에 용해시킨 사람 면역글로블린 G(Behringwerke AG, Marburg, FRG)에 대한 모노클론성 항체 10㎎을 10mM 인산 나트륨, 100mM 염화 나트륨, pH 8.0, 10㎖중에 용해시킨 10배 몰랄 초과의 N-하이드록시석신이미드-X-바이오틴과 함께 실온에서 1시간 동안 배양한다. 그 후 유리 개질성 시약을 100mM 트리스, 5mM 니트릴로트리아세트산, pH 7.0을 사용하여 겔 여과(Sephadex G-25)하므로 제거한다.
실시예 2 : 신규한 시약의 용도
2a) HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정(참조 시스템 Ⅰ)
항-HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정은 하기와 같이 수행된다.
샘플 완충용액(0.3m 트리스/HCl, 1% 알부민, 2% 트윈 20, pH 7.2) 25㎕를 상기 실시예 1a에서 기술된 바대로 제조된 미세적정 플레이트의 웰중에 사람 혈청 100㎕와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 50mM PBS, 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하고, 실시예 1b에서 기술된 바대로 제조된 결합체(0.1M 트리스/HCl, 1mM 글리신, 0.2% 알부민, 0.4% 플루로닌 F64, 사람 면역글로블린 G에 대한 모노클론성 항체 1㎎/ℓ, pH 8.1에서 1:1000으로 희석) 125㎕를 각각의 웰로 피펫팅한다. 30-분 배양(+37℃)을 추가의 4 세척 단계로 종결한다. 다수의 결합 항-HIV 항체와 직접적으로 상관관계가 있는 결합 퍼옥시다제 활성은 H2O2/테트라메틸벤지딘을 가하므로 측정된다. 실온에서 30분 후, 기질 전환을 0.5M 황산의 첨가로 멈춘다. 흡광은 450nm에서 측정한다.
2b) HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정(신규한 시스템 Ⅰ)
HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정은 하기와 같이 수행한다.
샘플 완충용액(0.3M 트리스/HCl, 1% 알부민, 2% 트윈 20, pH 7.2) 25㎕를 상기 실시예 1a에서 기술된 바대로 제조된 미세적정 플레이트의 웰중에 사람 혈청 100㎕와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 50mM PBS, 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하고, 해리 완충용액(5mM 글리신/HCl, pH 2.5) 100㎕를 RT에서 30분 동안 가한다. 실시예 1b에서 기술된 바대로 제조된 결합체(0.5M 트리스/HCl, 1mM 글리신, 1% 알부민, 2% 플루로닌 F64, 사람 면역글로블린 G에 대한 모노클론성 항체 5㎎/ℓ, pH 8.1에서 1:200 희석) 25㎕를 세척단계 없이 각각의 웰로 피펫팅한다. 30-분 배양(+37℃)을 추가의 4 세척 단계로 종결한다. 다수의 결합 항-HIV 항체와 직접적으로 상관관계가 있는 결합 퍼옥시다제 활성은 H2O2/테트라메틸벤지딘을 가하므로 측정된다. 실온에서 30분 후, 기질 전환을 0.5M 황산의 첨가로 멈춘다. 흡광은 450nm에서 측정한다.
항-HIV 1-양성 샘플 및 또한 특히 낮은 반응성을 갖는 항-HIV 1-양성 샘플, 및 항-HIV-은성 혈청은 참조 시스템 및 신규한 효소 면역검정 모두에서 연구한다.
연구 결과(흡광 단위)를 표 1에 나타낸다.
샘플 지정 항-HIV 상태 희석 설명 참조 시스템 Ⅰ 신규한 시스템 Ⅰ
음성대조구양성대조구9111/399111/399111/469111/469111/19BS 1-5BS 1-17BS 1-33BS 1-59 음성양성양성양성양성양성양성음성음성음성음성 그대로1:40001:1001:2001:501:1001:8000그대로그대로그대로그대로 고친화성저친화성저친화성저친화성저친화성고친화성 0.0981.5751.2110.5200.5280.3100.9060.0760.0770.0900.083 0.1030.4121.6530.8860.9270.4890.8770.0890.0780.0750.091
두 시험 시스템, 특히 저 친화성 샘플(예; 9111/46)의 경우에서 제조된 시그날에서 현저한 차이가 나타난다. 이러한 샘플에 관한 감도는 거의 참조 시스템 Ⅰ에 비해 거의 2배이다. 코팅 항원용 고 친화성을 갖고, 이미 참조 시스템 Ⅰ에서 높은 희석률로 희석된 샘플은 신규한 시스템 Ⅰ에서 증가된 특정 시그날을 나타내진 않는다. 항-HIV-음성 혈청은 두 시험 시스템에서 유사한 방법으로 반응한다.
실시예 3: 신규한 시약의 용도
3a) HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정(참조 시스템 Ⅰ)
HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정(신규한 시스템 Ⅰ)은 하기와 같다.
샘플 완충용액(0.3M 트리스/HCl, 1% 알부민, 2% 트윈 20, pH 7.2) 25㎕를 상기 실시예 1a에서 기술된 바대로 제조된 미세적정 플레이트의 웰중에 사람 혈청 100㎕와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 50mM PBS, 0.1% 트윈 20으로 4회 세척한 후, 실시예 1b에서 기술된 바대로 제조된 결합체(0.1M 트리스/HCl, 1mM 글리신, 0.2% 알부민, 0.4% 플루로닌 F64, 사람 면역글로블린 G에 대한 , 실시예 1c)에서 기술된 바대로 바이오틴화된 모노클론성 항체 1㎎/ℓ, pH 8.1에서 1:1000으로 희석) 125㎕를 각각의 웰로 피펫팅한다. 30-분 배양(+37℃)을 추가의 4 세척 단계로 종결한다. 다수의 결합 항-HIV 항체와 직접적으로 상관관계가 있는 결합 퍼옥시다제 활성은 H2O2/테트라메틸벤지딘을 가하므로 측정된다. 실온에서 30분 후, 기질 전환을 0.5M 황산의 첨가로 멈춘다. 흡광은 450nm에서 측정한다.
3b) HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정(신규한 시스템 Ⅱ)
항-HIV 1 항체를 검출하기 위한 효소 면역검정은 하기와 같이 수행한다.
샘플 완충용액(0.3M 트리스/HCl, 1% 알부민, 2% 트윈 20, pH 7.2) 25㎕를 상기 실시예 1a에서 기술된 바대로 제조된 미세적정 플레이트의 웰중에 사람 혈청 100㎕와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 50mM PBS, 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하고, 해리 완충용액(5mM 글리신/HCl, pH 2.5) 100㎕를 RT에서 30분 동안 가한다. 실시예 1b에서 기술된 바대로 제조된 결합체(0.5M 트리스/HCl, 1mM 글리신, 1% 알부민, 2% 플루로닌 F64, 사람 면역글로블린 G에 대한 모노클론성 항체이고, 이 모노클론성 항체가 실시예 1c)에서 기술된 바대로 바이오틴화된 5㎎/ℓ, pH 8.1에서 1:200 희석) 25㎕를 세척단계 없이 각각의 웰로 피펫팅한다. 30-분 배양(+37℃)을 추가의 4 세척 단계로 종결한다. 다수의 결합 항-HIV 항체와 직접적으로 상관관계가 있는 결합 퍼옥시다제 활성은 H2O2/테트라메틸벤지딘을 가하므로 측정된다. 실온에서 30분 후, 기질 전환을 0.5M 황산의 첨가로 멈춘다. 흡광은 450nm에서 측정한다.
항-HIV 1-양성 샘플 및 또한 특히 낮은 반응성을 갖는 항-HIV 1-양성 샘플, 및 항-HIV-음성 혈청은 참조 시스템 및 신규한 효소 면역검정 모두에서 조사된다.
연구 결과(흡광 단위)를 표 2에 나타낸다.
샘플 지정 항-HIV 상태 희석 설명 참조 시스템 Ⅰ 신규한 시스템 Ⅰ
음성대조구양성대조구9111/399111/399111/469111/469111/19BS 1-5BS 1-17BS 1-33BS 1-59 음성양성양성양성양성양성양성음성음성음성음성 그대로1:8001:1001:2001:501:1001:8000그대로그대로그대로그대로 고친화성저친화성저친화성저친화성저친화성고친화성 0.1490.9971.8130.9880.6940.3410.9970.0980.0860.0890.084 0.1401.8342.5001.7140.8000.5021.8340.0900.0860.0800.079
두 시험 시스템, 특히 저 친화성 샘플(예; 9111/39)의 경우에서 제조된 시그날에서 현저한 차이가 나타난다. 이러한 샘플에 관한 감도는 거의 참조 시스템 Ⅱ에 비해 거의 2배이다. 코팅 항원용 고 친화성을 갖고, 이미 참조 시스템 Ⅱ에서 높은 희석률로 희석된 샘플은 신규한 시스템 Ⅱ에서 증가된 특정 시그날을 나타내진 않는다. 항-HIV-음성 혈청은 두 시험 시스템에서 유사한 방법으로 반응한다.
본 발명은 샘플내의 분석물을 면역화학적 방법으로 측정할 경우, 발생할 수 있는 문제점, 예를 들면 면역 복합체 형성후의 역반응으로 인한 해리 및 반응성 감소등을 극복하기 위하여, 신규한 수용체 R1, R2, R3, R4를 사용하여 면역화학적으로 개선된 방법으로 분석물을 측정하는 것이다.

Claims (11)

  1. (1) 측정될 분석물을 함유할 수 있는 샘플을, 고체상에 고정화시키고 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 수용체 R1과 접촉시켜 면역 복합체 R1-A을 제조하고,
    (2) 하나 이상의 세척 단계를 수행하고,
    (3) 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 표지된 수용체 R2, 및 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 비표지된 수용체 R3을 가하고, 이때 수용체 R2 및 R3는 어떠한 순서로도 가할수 있고, 면역 복합체의 분해가 유도되도록 초기 해리 조건하에서, 및 이어서 면역 복합체의 재결합 및 신형성을 허용하는 비해리 조건하에서 가하여 A, R1, R2 및 R3을 함유하는 고정화된 면역 복합체를 제조하고,
    (4) 고체상에 고정화된 분석물의 양의 척도인, 고체상에 고정화된 표지의 양을 적합한 방법으로 검출함을 포함하여, 분석물을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (1) 수용체 R3에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 수용체 R4를 추가로 고체상에 고정화시키고, (2) 상기 수용체 R3이 분석물 A에 대해 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖고, (3) 한편으로 A, R2 및 R3, 및 다른 한편으론 R1 및/또는 R4를 함유하는 면역 복합체를 제조하는 방법.
  3. (1) 측정될 분석물을 함유할 수 있는 샘플을, 고체상에 고정화시키고 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 수용체 R1과 접촉시켜, 면역 복합체 R1-A를 제조하고,
    (2) 하나 이상의 세척 단계를 수행하고,
    (3) 면역 복합체 R1-A의 분해를 유도하는 해리 단계를 수행하고,
    (4) 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 표지된 수용체 R2, 및 분석물 A에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 비표지된 수용체 R3을 가하며, 이때 수용체 R2 및 R3은 어떠한 순서로도 면역 복합체의 신형성을 허용하는 비해리 조건하에서 가할 수 있고, 분석물 A 및 수용체 R2 및 R3을 수용체 R3에 대해 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 수용체 R4가 고정화되어 있는 2차 고체상과 접촉시켜 A, R2, R3 및 R4를 함유하는 고정화된 면역 복합체를 제조하고,
    (5) 고체상에 고정화된 분석물의 양의 척도인 고체상에 고정화된 표지의 양을, 적당한 방법으로 검출함을 포함하여, 분석물을 측정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, R1 및 R3이 각각의 경우에 분석물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이고, R2가 분석물에 대해 지시된 표지된 항체 또는 분석물에 대해 지시된 표지된 항체 단편인 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, R1 및 R3이 각각의 경우에 분석물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이고, R2가 분석물에 대해 지시된 표지된 항체 또는 분석물에 대해 지시된 표지된 항체 단편이고, R4가 R3에 대해 지시된 항체 또는 R3에 대해 지시된 항체 단편인 방법.
  6. 제5항에 있어서, R3이 R1 또는 R2로 인식되는 에피토프와 상이한 에피토프로 인식되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분석물이 항체이고, R1이 분석물이 지시되는 항원이고, R2가 분석물이 지시되는 표지된 항원이고, R3이 분석물에 대해 지시된 항체 또는 분석물에 대해 지시된 항체 단편인 방법.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 분석물이 항체이고, R1이 분석물이 지시되는 항원이고, R2가 분석물이 지시되는 표지된 항원이고, R3이 분석물에 대해 지시된 항체이거나 분석물에 대해 지시된 항체 단편이고, R4가 R3에 대해 지시된 항체이거나 R3에 대해 지시된 항체 단편인 방법.
  9. 제8항에 있어서, R3이 항체-고유적이지 않은 추가의 에피토프를 수반하고, R4가 항체-고유적이지 않은 R3의 추가의 에피토프에 대해 지시되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HIV에 대한 항체를 측정하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 청구된 방법을 수행하기 위한 진단제.
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