KR102677445B1 - 변형된 수막구균 fHbp 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대해 면역화시키기 위한 면역원성 조성물의 성분으로서 유용한 돌연변이화된 fHbp 폴리펩티드 및 상기 돌연변이화된 fHbp 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
Description
본 발명은 유용한 백신 면역원인, 특히 수막구균 인자 H 결합 단백질 (fHbp)에 관한 단백질 공학의 분야이다.
침습성 수막구균 질환 (IMD)은 박테리아 병원체 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)에 의해 유발된다. 전세계적으로 주로 IMD와 연관된 5종의 혈청군 (MenA, B, C, W 및 Y) 중 MenB는 캐나다, 미국, 호주, 뉴질랜드 및 유럽을 비롯한 다수의 지역에서 IMD를 유발하는 우세한 혈청군이다. MenB는 주로 유아 및 청소년이 걸리는, 중증이고, 대개는 치명적인 질환이다. 이는 쉽게 오진되고, 발명 24시간 이내에 사망에 이르게 할 수 있고, 치료를 실시함에도 불구하고 평생 지속되는 중증 장애를 유발할 수 있다.
혈청군 B 수막구균에 대해 면역화시키도록 디자인된 것으로서 허가받은 백신은 현재 2종이 있다: GSK의 벡세로(BEXSERO) 및 화이자(Pfizer)의 트루멘바(TRUMENBA).
벡세로 (일반적으로 4CMenB로도 공지됨)는 5종의 수막구균 항원: 네이세리아 헤파린 결합 단백질 A (NHBA), 인자 H 결합 단백질 (fHbp) 변이체 1.1, 네이세리아 부착 단백질 A (NadA), 및 보조 단백질 GNA1030 및 GNA2091과 함께 그룹 B 수막구균 NZ98/254의 유행병 균주로부터의 외막 소포 (OMV)로 이루어진 제제를 함유한다. 상기 항원들 중 4종은 융합 단백질 (NHBA-GNA1030 융합 단백질 및 GNA2091-fHbp 융합 단백질)로서 존재한다. 4CMenB는 문헌 (예를 들어, 문헌 [Bai et al. (2011) Expert Opin Biol Ther . 11:969-85], [Su & Snape (2011) Expert Rev Vaccines 10:575-88] 참조)에 기재되어 있다. "벡세로" 및 "4CMenB"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
트루멘바는 인산알루미늄 상에 흡착된 2종의 지질화된 MenB fHbp 항원 (v1.55 및 v3.45)을 함유한다.
fHbp (관련 기술분야에서 상호교환적으로 게놈-유래된 네이세리아(Neisseria) 항원 (GNA) 1870, LP2086 및 단백질 '741'로도 공지됨)는, 짧은 연결 서열에 의해 연결된 20개의 보체 제어 단백질 (CCP) 모듈로 이루어진 큰 (180 kDa) 다중-도메인 가용성 당단백질인 인간 인자 H (hfH)에 결합한다. hfH는 인간 혈장 내에서 순환하고, 보체계의 대체 경로를 조절한다. fHbp의 hfH에의 기능적 결합은 주로 hfH의 CCP 모듈 (또는 도메인) 6-7에 의존하고, 보체-매개 사멸에 저항할 수 있는 박테리아의 능력을 증진시킨다. 그러므로, fHbp 발현을 통해 생체외 인간 혈액 및 혈청에서 생존할 수 있게 된다.
상이한 fHbp 분류 체계가 제안됨에 따라, 새로운 서브변이체 지정을 위한 통일한 fHbp 명명법을 포함하는 전용 데이터베이스가 이용가능하다: (http)://neisseria.org/nm/typing/fhbp (또한 (https)://pubmlst.org/neisseria/fHbp/로도 이용가능).
fHbp는 3종 (주요) 변이체 1, 2, 및 3으로 분류되었고, 이는 추가로 서브변이체 fHbp-1.x, fHbp-2.x 및 fHbp-3.x로 분류되었고, 여기서 x는 특정 펩티드 서브변이체를 나타낸다. v2 및 v3과 달리, fHbp v1은 고도로 이종성이고, 여러 서브변이체를 함유한다. 상이한 명명법 체계에서, 서브/변이체는 서열 다양성에 기초하여 서브패밀리 A (변이체 2 및 3에 상응) 및 서브패밀리 B (변이체 1에 상응)로 그룹화된다.
벡세로는 전세계에 퍼져있는 MenB 균주에 대하여 광범위한 적용범위를 제공할 것을 예측된다 ([Medini D et al., Vaccine 2015; 33:2629-2636]; [Vogel U et al. Lancet Infect Dis 2013;13:416-425]; [Krizova et al., Epidemiol Mikrobiol Imunol 2014; 63:103-106]; [Tzanakaki G et al. BMC Microbiol 2014;14:111]; [Wasko I et al. Vaccine 2016;34:510-515]; [6. Simoes MJ et al. PLoS ONE 12(5): e0176177]; 및 [Parikh SR et al. Lancet Infect Dis 2017; 17:754-62]). 추가로, 2015년 9월 영국 국립 유아 면역화 프로그램에 벡세로 도입 후, 10개월째의 데이터는 2회 투약 후에 모든 MenB 균주에 대하여 83%의 백신 효능을 제시하였다 (Parikh SR et al., Lancet 2016; 388:2775-82).
그러나, 살박테리아성 활성은 변이체 특이적이고; 비록 fHbp v2와 v3 사이에 일부 교차-반응성이 기재되기는 하였지만, 한 변이체에 대해 발생된 항체가 반드시 다른 변이체에 대하여 교차-방어성인 것은 아니다 (Masignani V et al., J Exp Med 2003; 197:789-799). 4CMenB 백신에 포함된, 서브변이체 fHbpv1.1에 대해 발생된 항체는 가장 빈번하게 발생하는 fHbp v1 서브변이체와 고도의 교차-반응성을 보이지만, v1.1과 가장 먼 관계를 보이는 v1 서브변이체와는 더 낮은 교차-반응성을 보인다. 추가로, 4CMenB 백신에 포함된, 서브변이체 fHbpv1.1에 대해 발생된 항체는 fHbp v2 및 v3과는 불량한 교차-반응성을 보인다 (Brunelli B et al., Vaccine 2011; 29:1072-1081). 이는 4CMenB 적용범위가 fHbp v2, v3을 보유하는 일부 수막구균 균주, 또는 일부 v1 서브변이체를 보유하는 균주로까지 확장될 수 없다는 것을 의미한다.
따라서, 벡세로와 같이 허가받은 혈청군 B 수막구균 백신의 효능에도 불구하고, 예컨대 4CMenB와 같은 기존 허가받은 백신의 효능은 유지하고, 그보다 열등하지 않지만, 기존 백신에 의해서는 잘 커버되지 않는 fHbp 변이체를 보유하는 수막구균 균주에 대하여 적용범위가 개선된 가치 부가를 보이는 수막구균 백신 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 제1 측면은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드로서, 여기서 상기 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 E211, S216, E232, 또는 그의 조합에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 서열식별번호: 6과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드로서, 여기서 상기 돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6의 E214, S219, E235, 또는 그의 조합에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드 3종 모두를 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 여기서 변이체 fHbp 서열은 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서이고, 여기서 v1 폴리펩티드는 본 발명의 제1 측면에 따른 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 돌연변이체 v1.15 fHbp 폴리펩티드인 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드, 본 발명의 제2 측면에 따른 돌연변이체 v1.15 fHbp 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자, 임의적으로 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제4 측면에 따른 핵산 분자로 형질전환된 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제5 측면에 따른 재조합 숙주 세포로부터 수득되거나 또는 제조된 외막 소포를 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드, 본 발명의 제2 측면에 따른 돌연변이체 v1.15 fHbp 폴리펩티드, 본 발명의 제3 측면에 따른 융합 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제6 측면에 따른 외막 소포를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는데 유용하다.
도 1A는 fHbp v1.x 서브변이체를 발현하는 수막구균 B 균주의 빈도를 제시하는 그래프이며, 이는 이들 v1.x 서브변이체 중 어느 것이 4CMenB 백신에 의해 커버 (흑색) 또는 비커버 (백색)되는지를 나타낸다. 도 1B는 fHbp v2를 보유하는 수막구균 B 균주의 빈도를 제시하는 그래프이며, 이는 이들 균주 중 어느 것이 4CMenB 백신에 의해 커버 (흑색) 또는 비커버 (백색)되는지를 나타낸다. 도 1C는 fHbp v3을 보유하는 수막구균 B 균주의 빈도를 제시하는 그래프이며, 이는 이들 균주 중 어느 것이 4CMenB 백신에 의해 커버 (흑색) 또는 비커버 (백색)되는지를 나타낸다.
도 2는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)과 (도 2A) fHbp v.1.13 E211A; (도 2B) fHbp v1.13 S216R; (도 2C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 2D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에 대한 시차 주사 열량측정법 (DSC) 데이터를 비교하는 4개의 그래프 (써모그램)를 포함한다.
도 3은 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 (도 3A) fHbp v.1.13 E211A; (도 3B) fHbp v1.13 S216R; (도 3C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 3D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 4 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 (도 4A) fHbp v.1.13 E211A; (도 4B) fHbp v1.13 S216R; (도 4C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 4D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 5 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 (도 5A) fHbp v.1.15 E214A; (도 5B) fHbp v1.15 S219R; (도 5C) fHbp v.1.15 E214A/E235A; 및 (도 5D) fHbp v.1.15 E214A/S219R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 6 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 (도 6A) fHbp v.1.15 E214A; (도 6B) fHbp v1.15 S219R; (도 6C) fHbp v.1.15 E214A/E235A; 및 (도 6D) fHbp v.1.15 E214A/S219R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 7 (A-B)는 공지된 fHbp 융합물과 비교된, 본 발명에 따른 2종의 상이한 fHbp 융합 단백질의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 제시하는 2개의 그래프 (센서그램)를 포함한다. 도 7A는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/S216R 융합물의 결합과 비교한 것이다. 도 7B는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/E232A 융합물의 결합과 비교한 것이다.
도 8은 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 본 발명에 따른 fHbp 231.15 E214A/E235A 융합물에의 결합과 비교한 것이다.
도 9 (A-B)는 공지된 fHbp 융합물과 비교된, 본 발명에 따른 2종의 상이한 융합 단백질인 fHbp 융합 단백질의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 보여주는 2개의 그래프를 포함한다. 도 9A는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/S216R 융합물의 결합과 비교한 것이다. 도 9B는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/E232A 융합물의 결합과 비교한 것이다.
도 10은 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 본 발명에 따른 fHbp 231.15 E214A/E235A 융합물에의 결합과 비교한 것이다.
도 11 (A)는 v1.x로 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 rSBA 역가 (토끼 보체)를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 11B는 v1.x로 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대하여 시험된 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 hSBA 역가 (인간 보체)를 제시한다.
도 12 (A)는 v2 또는 v3에서 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 rSBA 역가 (토끼 보체)를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 12B는 v2 또는 v3에서 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대하여 시험된 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 hSBA 역가 (인간 보체)를 제시한다.
도 13은 var2/3 (도 13A) 및 v1.x (도 13B) 균주 타입에 대한 제제에 의한 풀링된 hSBA 데이터를 제시한다. var1 (30개 균주) 및 var2/3 균주 (20개 균주)로 나누어진 총 50개 MenB 균주에 대한 보체 공급원으로서 인간 혈장 (hSBA)의 존재 하에서 백신접종된 마우스로부터 수집된 혈청을 풀로서 시험하였다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 14는 fHbp var2/3 (A) 및 fHbp var1 (B)을 발현하는 균주에 대하여 마우스에서 시험된, 시험 백신 제제에 의해 제공된 적용범위의 백분율을 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 15는 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주에 대한 마우스 혈청으로부터의 hSBA 역가를 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 16은 4개의 벡세로 인디케이터 균주 패널: fHbp var1.1의 경우, M14459 (도 16A); PorA P1.4의 경우, NZ98/254 (도 16B); NHBA의 경우, M4407 (도 16C); 및 NadA의 경우, 96217 (도 16D)에 대한 표준 벡세로 제제 대비로 벡세로 + fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제제 (본 그래프로에서 "벡세로 플러스 플러스"로 지칭)를 비교한 것이다.
도 17은 var2/3 (도 17A) 및 v1.x (도 17B) 균주 타입에 대한 제제에 의한 풀링된 hSBA 데이터를 제시한다. var1 및 var2/3 균주로 나누어진 MenB 균주에 대하여 백신접종된 토끼로부터 수집된 혈청을 풀로서 시험하였다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 18은 fHbp var2/3 (A) 및 fHbp var1 (B)을 발현하는 균주에 대한 토끼에서 시험된 백신 제제에 의해 제공된 적용범위의 백분율을 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1S는 선행 기술의 융합물 231.1_R41S를 지칭하고, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 19는 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주에 대한 토끼 혈청으로부터의 hSBA 역가를 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13 결합은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 비-결합은 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 결합은 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 비-결합은 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 20은 면역화된 마우스 및 비-면역화된 마우스에서의 박테리아 챌린지 (생체발광성 MC58 cc32/var.1)의 다이나믹 영상을 제시한다. 그룹 A의 마우스는 4CMenB + fHbp 23(S)1.13 야생형으로 면역화시킨 반면, 그룹 B의 마우스는 4CMenB + fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R로 면역화시켰다. 비-면역화된 마우스는 대조군으로서 오직 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)만을 받았다.
도 21 (A 및 B)은 면역화된 마우스 및 비-면역화된 마우스에서의 박테리아 챌린지 (생체발광성 MC58 cc32/var.1)의 다이나믹 영상 신호의 정량화 및 비교를 제시한다. 비교는 대략적 총 신호 (각 시점에서 마우스 1마리당 광자/초)를 이용하여 (도 21A), 또는 박테리아 챌린지 30 min 및 6 h 후의 신호 비에 따라 (도 21B) 수행하였다.
도 2는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)과 (도 2A) fHbp v.1.13 E211A; (도 2B) fHbp v1.13 S216R; (도 2C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 2D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에 대한 시차 주사 열량측정법 (DSC) 데이터를 비교하는 4개의 그래프 (써모그램)를 포함한다.
도 3은 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 (도 3A) fHbp v.1.13 E211A; (도 3B) fHbp v1.13 S216R; (도 3C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 3D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 4 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 (도 4A) fHbp v.1.13 E211A; (도 4B) fHbp v1.13 S216R; (도 4C) fHbp v.1.13 E211A/E232A; 및 (도 4D) fHbp v.1.13 E211A/S216R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 5 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 (도 5A) fHbp v.1.15 E214A; (도 5B) fHbp v1.15 S219R; (도 5C) fHbp v.1.15 E214A/E235A; 및 (도 5D) fHbp v.1.15 E214A/S219R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 6 (A-D)는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 (도 6A) fHbp v.1.15 E214A; (도 6B) fHbp v1.15 S219R; (도 6C) fHbp v.1.15 E214A/E235A; 및 (도 6D) fHbp v.1.15 E214A/S219R에의 결합과 비교하는 4개의 그래프 (센서그램)를 포함한다.
도 7 (A-B)는 공지된 fHbp 융합물과 비교된, 본 발명에 따른 2종의 상이한 fHbp 융합 단백질의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 제시하는 2개의 그래프 (센서그램)를 포함한다. 도 7A는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/S216R 융합물의 결합과 비교한 것이다. 도 7B는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/E232A 융합물의 결합과 비교한 것이다.
도 8은 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 본 발명에 따른 fHbp 231.15 E214A/E235A 융합물에의 결합과 비교한 것이다.
도 9 (A-B)는 공지된 fHbp 융합물과 비교된, 본 발명에 따른 2종의 상이한 융합 단백질인 fHbp 융합 단백질의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 보여주는 2개의 그래프를 포함한다. 도 9A는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/S216R 융합물의 결합과 비교한 것이다. 도 9B는 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 결합을 fHbp 231.13 E211A/E232A 융합물의 결합과 비교한 것이다.
도 10은 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 본 발명에 따른 fHbp 231.15 E214A/E235A 융합물에의 결합과 비교한 것이다.
도 11 (A)는 v1.x로 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 rSBA 역가 (토끼 보체)를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 11B는 v1.x로 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대하여 시험된 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 hSBA 역가 (인간 보체)를 제시한다.
도 12 (A)는 v2 또는 v3에서 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 rSBA 역가 (토끼 보체)를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 12B는 v2 또는 v3에서 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대하여 시험된 6종의 fHbp 관련 항원 및 벡세로 유사 제제 각각에 대한 hSBA 역가 (인간 보체)를 제시한다.
도 13은 var2/3 (도 13A) 및 v1.x (도 13B) 균주 타입에 대한 제제에 의한 풀링된 hSBA 데이터를 제시한다. var1 (30개 균주) 및 var2/3 균주 (20개 균주)로 나누어진 총 50개 MenB 균주에 대한 보체 공급원으로서 인간 혈장 (hSBA)의 존재 하에서 백신접종된 마우스로부터 수집된 혈청을 풀로서 시험하였다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 14는 fHbp var2/3 (A) 및 fHbp var1 (B)을 발현하는 균주에 대하여 마우스에서 시험된, 시험 백신 제제에 의해 제공된 적용범위의 백분율을 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 15는 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주에 대한 마우스 혈청으로부터의 hSBA 역가를 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 16은 4개의 벡세로 인디케이터 균주 패널: fHbp var1.1의 경우, M14459 (도 16A); PorA P1.4의 경우, NZ98/254 (도 16B); NHBA의 경우, M4407 (도 16C); 및 NadA의 경우, 96217 (도 16D)에 대한 표준 벡세로 제제 대비로 벡세로 + fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제제 (본 그래프로에서 "벡세로 플러스 플러스"로 지칭)를 비교한 것이다.
도 17은 var2/3 (도 17A) 및 v1.x (도 17B) 균주 타입에 대한 제제에 의한 풀링된 hSBA 데이터를 제시한다. var1 및 var2/3 균주로 나누어진 MenB 균주에 대하여 백신접종된 토끼로부터 수집된 혈청을 풀로서 시험하였다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 18은 fHbp var2/3 (A) 및 fHbp var1 (B)을 발현하는 균주에 대한 토끼에서 시험된 백신 제제에 의해 제공된 적용범위의 백분율을 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1S는 선행 기술의 융합물 231.1_R41S를 지칭하고, fHbp 2-3-1.13은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB ES는 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 NB EE는 231.13_E211A/E232A 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15는 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 NB EE는 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 19는 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주에 대한 토끼 혈청으로부터의 hSBA 역가를 제시한다. 본 도면에서, fHbp 2-3-1.13 결합은 wt v1.13을 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.13 비-결합은 231.13_E211A/S216R 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 결합은 wt v1.15를 포함하는 융합물을 지칭하고, fHbp 2-3-1.15 비-결합은 231.15_ E214A/E235A 융합물을 지칭한다.
도 20은 면역화된 마우스 및 비-면역화된 마우스에서의 박테리아 챌린지 (생체발광성 MC58 cc32/var.1)의 다이나믹 영상을 제시한다. 그룹 A의 마우스는 4CMenB + fHbp 23(S)1.13 야생형으로 면역화시킨 반면, 그룹 B의 마우스는 4CMenB + fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R로 면역화시켰다. 비-면역화된 마우스는 대조군으로서 오직 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)만을 받았다.
도 21 (A 및 B)은 면역화된 마우스 및 비-면역화된 마우스에서의 박테리아 챌린지 (생체발광성 MC58 cc32/var.1)의 다이나믹 영상 신호의 정량화 및 비교를 제시한다. 비교는 대략적 총 신호 (각 시점에서 마우스 1마리당 광자/초)를 이용하여 (도 21A), 또는 박테리아 챌린지 30 min 및 6 h 후의 신호 비에 따라 (도 21B) 수행하였다.
지질단백질 인자 H 결합 단백질 (fHbp)은 모든 MenB 균주의 표면에서 발현된다. fHbp는 인간 보체 조절 단백질 인자 H (hfH)에 결합하여, 박테리아를 보체 매개 사멸로부터 방어하는 복합체를 형성하고, 인간 혈류에서 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)에 생존 메카니즘을 제공한다. fHbp에 대한 항체는 이중 역할을 하는데: 이는 그 자체가 살박테리아성이고, hfH에의 결합을 방지함으로써 균주가 박테리아 사멸에 대하여 더욱 큰 감수성을 띠도록 만든다. fHbp가 hfH에 결합할 수 있는 능력을 감소시키거나, 또는 그를 폐기하는 것은, fHbp 에피토프를 차폐시키고, 항체 결합을 방지하는 잠재능을 갖고 있는, fHbp와 hfH 사이의 방어성 복합체 형성을 방지함으로써 fHbp 항원의 면역원성을 증가시킨다.
fHbp는 다수의 서브변이체와 함께, 3종의 상이한 유전적 및 면역원성 변이체 (v1, v2 및 v3)로 존재한다. 4CMenB에 의해 커버되지 않는 대부분의 MenB 균주는 v2 또는 v3 fHbp, 또는 var1.1과 먼 관계를 보이는 v1 서브변이체를 발현한다.
도 1A에 제시된 바와 같이, (예를 들어, 문헌 [Medini et al. Vaccine 2015; 33(23); 2629-36]에 기재된 바와 같은) MATS 접근법을 이용한 기존 전염병학에서는 v1.1 및 v1.4를 갖는 균주가 가장 빈번하게 발생하고, 그 다음으로는 v1.15, v1.14 및 v1.13이라고 제시되어 있다. 4CMenB 백신에 포함된, 서브변이체 fHbpv1.1에 대한 항체는 상기 가장 빈번하게 발생하는 fHbp v1 서브변이체 (v1.1 및 v1.4)와 고도의 교차-반응성을 보이지만, v1.1과 가장 먼 관계를 보이는 v1 서브변이체 (예를 들어, v1.15 및 v1.13)와는 더 적은 교차-반응성을 보인다. 이는 fHbp v1.15 및 v1.13을 발현하는 수막구균 B 균주가 4CMenB 백신에 의해 커버되지 않는, 가장 빈번하게 발생하는 균주라는 것과 같이, 도 1에 도시되어 있다.
추가로, 4CMenB 백신에 포함된, 서브변이체 fHbpv1.1에 대한 항체는 fHbp v2 및 v3과 불량한 교차-반응성을 보인다 (Brunelli B et al., Vaccine 2011; 29:1072-1081). 도 1B 및 1C는 fHbp v2 또는 v3을 발현하는 가장 빈번하게 발생하는 균주 중 일부 균주에 대한 4CMenB의 적용범위에서의 차이를 제시한다.
이는 4CMenB 적용범위가 fHbp v2, v3을 보유하는 일부 수막구균 균주, 또는 일부 v1 서브변이체를 보유하는 균주로까지 확장될 수 없다는 것을 의미한다.
본 발명은 면역원성이고, 개선된 엔. 메닌기티디스 균주 적용범위를 제공하기 위해 기존 수막구균 백신과 조합될 수 있는, 돌연변이화된 fHbp 변이체 1.13 또는 변이체 1.15 (v1.13 또는 v1.15) 폴리펩티드를 제공한다.
특히, 본 발명의 v1 폴리펩티드는 4CMenB 중에 포함된 fHbp v1.1 항원과 비교하여 유전적으로 다양한 fHbp 변이체 1의 서브변이체이다.
추가로, 본 발명의의 v1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 v1 폴리펩티드와 비교하여 hfH에의 결합을 감소시키기 위해 돌연변이화된 것이다. 그에 반해, 벡세로에 포함된 fHbp v1.1 항원, 및 트루멘바에 포함된 fHp v1.55 및 v3.45 항원은 hfH에 결합하지 않는다.
안정성을 개선시키기 위해 및 또한 fHbp 결합을 감소시키기 위해 변형된, 본 발명의 V1 폴리펩티드는 단독으로, 또는 fHbp 변이체 2 및 3의 돌연변이체 형태와 함께 융합 단백질의 성분으로서 제공될 수 있다. 본 발명의 v1 항원과 함께 상기 v2 및 v3 항원을 포함하는 단일 융합 단백질을 제공함으로써, 본 발명자들은 기존 허가받은 수막구균 B 백신 대비 개선된 균주 적용범위를 갖는다. 명확성을 위해, v2 및 v3 항원 중 어느 것도 예를 들어, 4CMenB에는 존재하지 않는다. 본 발명의 융합 단백질 내의 v2 및 v3 항원 존재는, 예를 들어, 4CMenB와 비교하여 균주 적용범위를 개선시킨다.
본 발명의 v1 폴리펩티드 및 융합 단백질은 단독으로, 또는 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원, 및 수막구균 외막 소포와 함께 조합하여 (예를 들어, 벡세로 조성물과 함께 조합하여) 사용될 수 있고, 이로써, 벡세로 단독인 것과 비교하여 (비-결합 형태의 fHbp 변이체 첨가/포함에 기인하여) 면역원성이 증가되고, (새로운 fHbp 변이체/서브변이체의 첨가에 기인하여) 엔. 메닌기티디스 균주 적용범위가 증가된 조합된 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
돌연변이체 v1.13
수막구균
fHbp
폴리펩티드
본 발명자들은 변형됨으로써 hfH에의 결합을 감소시킬 수 있는 fHbp v1.13 서열 내의 잔기를 확인하였다. 본원에서 상기 돌연변이체를 비-결합 (NB) 돌연변이체로 지칭한다. 본 발명자들은 또한 hfH에의 결합을 감소시키는데 특히 유용한 v1.13 서열 중의 돌연변이 조합도 확인하였다. fHbp v1.13이 또한 관련 기술분야에 fHbp 변이체 B09로 공지되어 있다.
균주 M982 (진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AAR84475.1)로부터의 성숙 야생형 fHbp v1.13 지질단백질은 하기 아미노산 서열을 갖고, 여기서 N-말단 폴리-글리신 신호 서열은 밑줄로 표시되어 있다:
성숙 v1.13 지질단백질은, 전장 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로부터 제거되는 것인 추가 19개의 잔기 N-말단 리더 서열을 갖는다는 점에서 전장 야생형 서열과 차이가 난다. 따라서, 전장 야생형 fHbp v1.13은 하기 아미노산 서열을 갖는다 (여기서 N-말단 리더 서열은 볼드체로 제시되어 있음):
ΔG 형태의 성숙 v1.13 지질단백질에는 성숙 폴리펩티드의 N-말단 폴리-글리신 서열이 결여되어 있고, 즉, 서열식별번호: 1의 처음 7개의 아미노산이 결여되어 있고, 서열식별번호: 31의 처음 26개의 아미노산이 결여되어 있다:
그러므로, 본 발명의 제1 측면은 서열식별번호: 2와 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드로서, 단, 상기 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 잔기 E211, S216 또는 E232 중 하나 이상에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.
k 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 80이고 (즉, 돌연변이체 fHbp v1.13 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 80% 동일성을 가짐), 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다. 가장 바람직하게는, 돌연변이체 fHbp v1.13 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
바람직하게는, 아미노산 서열은 치환 E211A, S216R 또는 E232A 중 적어도 하나 이상에 의해 서열식별번호: 2와 상이하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 하기 (i) E211A 및 E232A, 또는 (ii) E211A 및 S216R로부터 선택되는 다중 잔기에 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 비교하여 잔기 E211A 및 S216R에 치환을 포함한다.
이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 서열식별번호: 2의 잔기 211에서 알라닌 (A)의 글루탐산 (E)으로의 치환은 hfH 동원에 수반되는 음으로 하전된 잔기를 제거하여 fH 결합 폐기에 기여한다. 서열식별번호: 2의 잔기 216에서 세린 (S)의 아르기닌 (R)으로의 치환은 야생형 아미노산을 엔. 고노레아에(N. gonorrhoeae)로부터의 상응하는 잔기롤 대체하고, 이는 hfH에 결합하지 못한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 서열식별번호: 3 (v1.13 ΔG E211A/E232A) 또는 서열식별번호: 4 (v1.13 ΔG (E211A/S216R)의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게로의 투여 후, 서열식별번호: 1의 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 상기 항체는 이상적으로 살박테리아성이다 (하기 참조).
돌연변이체 v1.15
수막구균
fHbp
폴리펩티드
본 발명자들은 변형됨으로써 hfH에의 결합을 감소시킬 수 있는 fHbp v1.15 서열 내의 잔기를 또한 확인하였다. 본원에서 상기 돌연변이체를 비-결합 (NB) 돌연변이체로 지칭한다. 본 발명자들은 또한 hfH에의 결합을 방지하는데 특히 유용한 v1.15 서열 중의 돌연변이 조합도 확인하였다. fHbp v1.15가 또한 관련 기술분야에 fHbp 변이체 B44로 공지되어 있다.
균주 NM452 (진뱅크 수탁 번호 ABL14232.1)로부터의 성숙 야생형 fHbp v1.15 지질단백질은 하기 아미노산 서열을 갖고, 여기서 N-말단 폴리-글리신 신호 서열은 밑줄로 표시되어 있다:
성숙 v1.15 지질단백질은, 전장 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로부터 제거되는 것인 추가 19개의 잔기 N-말단 리더 서열을 갖는다는 점에서 전장 야생형 서열과 차이가 난다. 따라서, 전장 야생형 fHbp v1.15는 하기 아미노산 서열을 갖는다 (여기서 N-말단 리더 서열은 볼드체로 제시되어 있음):
ΔG 형태의 성숙 v1.15 지질단백질에는 N-말단 폴리-글리신 서열이 결여되어 있고, 즉, 서열식별번호: 5의 처음 12개의 아미노산이 결여되어 있고, 서열식별번호: 32의 처음 31개의 아미노산이 결여되어 있다:
그러므로, 본 발명의 제2 측면은 서열식별번호: 6과 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드로서, 단, 상기 돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6의 잔기 E214, S219 또는 E235 중 하나 이상에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.
k 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 80이고 (즉, 돌연변이체 fHbp v1.15 아미노산 서열은 서열식별번호: 6과 적어도 80% 동일성을 가짐), 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다. 가장 바람직하게는, 돌연변이체 fHbp v1.15 아미노산 서열은 서열식별번호: 6과 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
바람직하게는, 아미노산 서열은 치환 E214A, S219R 또는 E235A 중 적어도 하나 이상에 의해 서열식별번호: 6과 상이하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 하기 (i) S219R, (ii) E214A 및 S219R, 및 (iii) E214A 및 E235A로부터 선택되는 잔기에 치환을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이체 v1.15 폴리펩티드는 서열식별번호: 7 (v.1.15_S219R), 서열식별번호: 8 (v1.15_E214A/S219R) 또는 서열식별번호: 9 (v1.15_E214A/E235A)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 돌연변이체 v1.15 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게로의 투여 후, 서열식별번호: 5의 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 상기 항체는 이상적으로 살박테리아성이다 (하기 참조).
융합 폴리펩티드
본 발명은 또한 v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드 3종 모두를 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 여기서 변이체 fHbp 서열은 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서인 융합 폴리펩티드를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L ]3-B-COOH의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, L은 임의적 링커 아미노산 서열이고, A는 임의적 N 말단 아미노산 서열이고, B는 임의적 C 말단 아미노산 서열이다.
본 발명의 융합물의 v1 fHbp 폴리펩티드 성분은 상기 기재된 바와 같은 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드 또는 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드이다.
본 발명의 융합물의 v2 및 v3 fHbp 폴리펩티드 성분은 바람직하게는 야생형 v2 및 v3 폴리펩티드와 비교하여 안정성이 증진되고, hfH에의 결합능이 감소된 돌연변이체 v2 및 v3 폴리펩티드이다. 상기 설명된 바와 같이, fHbp의 hfH에의 결합을 감소시키는 것이 유리한데, 그 이유는 fHbp 에피토프를 차폐시킬 수 있는, fHbp와 hfH 사이의 방어성 복합체 형성을 방지함으로써 폴리펩티드 항원의 면역원성을 증가시키기 때문이다.
본 발명자들은 앞서, 변형됨으로써 폴리펩티드의 안정성을 증가시키고, 또는 hfH에의 결합을 감소시킬 수 있는, v2 및 v3 서열 내의 잔기를 확인하였다. 이들 돌연변이화된 v2 및 v3 서열은 WO2015/128480에 상세하게 기재되어 있다.
균주 2996으로부터의 전장 야생형 fHbp v2는 하기 아미노산 서열을 갖는다 (리더 서열은 볼드체로 제시되어 있고, 폴리-글리신 서열은 밑줄로 표시되어 있음):
성숙 지질단백질에는 서열식별번호: 10의 처음 19개의 아미노산이 결여되어 있다:
ΔG 형태의 서열식별번호: 10에는 처음 26개의 아미노산이 결여되어 있다:
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 12와 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v2 fHbp 폴리펩티드로서, 단, v2 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 12의 잔기 S32 및 L123에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 치환은 S32V 및 L123R이다.
k 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 80이고 (즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 서열식별번호: 12와 적어도 80% 동일성을 가짐), 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 fHbp v2 폴리펩티드는 서열식별번호: 12와 비교하여 말단절단된 것이다. 야생형 성숙 서열과 비교하여, 서열식별번호: 12는 이미 최대 폴리-글리신 서열까지, 및 이를 포함하여 N-말단에서 말단절단된 것이지만 (서열식별번호: 11 및 12를 비교함), 서열식별번호: 12는 C-말단에서 말단절단되고/거나, N-말단에서 추가로 말단절단된 것일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 v2 fHbp 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 v2 fHbp 폴리펩티드는 동일한 실험 조건 하에서 동일하지만, 잔기 S32 및 L123에서 서열 차이가 없는 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖고, 예를 들어, 서열식별번호: 10으로 이루어진 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. S32V 돌연변이는 바람직한 소수성 상호작용을 도입하여 구조를 안정화시킨다. L123R 돌연변이는 fH 및 비바람직한 전하와의 충돌을 도입하여 fH 결합을 폐기한다.
안정성 증강은 예를 들어, 문헌 [Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9] 및 [Bruylants et al. Current Medicinal Chemistry 2005; 12:2011-20]에서 논의된 바와 같이, 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 사용하여 평가될 수 있다. DSC는 앞서 v2 fHbp의 안정성을 평가하는데 사용되어 왔다 (Johnson et al. PLoS Pathogen 2012; 8: e1002981). 안정성을 평가하는데 적합한 DSC 조건은 100-200 mM NaCl (예를 들어, 150 mM)을 포함하는, pH 6 내지 8 (예를 들어, 7-7.5)의 완충처리된 용액 (예를 들어, 25 mM 트리스) 중 20 μM의 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
안정성에서의 증가는 DSC에 의해 평가되었을 때, 야생형과 비교하여, 적어도 한 피크의 열 전이 중간점 (Tm)이 적어도 5℃, 예를 들어, 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 그 초과만큼 증가된 것으로 입증된다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크를 제시하며 (하나는 N-말단 도메인, 및 하나는 C-말단 도메인), 여기서 본 발명의 융합 단백질에 포함된 v2 폴리펩티드는 상기 도메인 둘 다를 포함하며, "안정성에서의 증가"는 N-말단 도메인의 Tm의 적어도 5℃ 증가를 지칭한다. N-말단 도메인의 Tm은 야생형 v2 서열은 40℃에서 또는 심지어는 40℃ 미만에서 존재할 수 있는 반면 (Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8: e1002981), C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 N-말단 도메인을 갖고, 여기서 Tm은 적어도 45℃, 예를 들어, ≥50℃, ≥55℃, ≥60℃, ≥65℃, ≥70℃, ≥75℃, 또는 심지어 ≥80℃이다.
균주 M1239로부터의 전장 야생형 fHbp v3은 하기 아미노산 서열을 갖는다 (리더 서열은 볼드체로 제시되어 있고, 폴리-글리신 서열은 밑줄로 표시되어 있음):
성숙 지질단백질에는 서열식별번호: 13의 처음 19개의 아미노산이 결여되어 있다:
ΔG 형태의 서열식별번호: 13에는 처음 31개의 아미노산이 결여되어 있다 (즉, 신호 서열 및 폴리-글리신 서열이 결여되어 있다):
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15와 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v3 fHbp 폴리펩티드로서, 단, v3 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 15의 잔기 S32 및 L126에 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 치환은 S32V 및 L126R이다.
k 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 80이고 (즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 서열식별번호: 15와 적어도 80% 동일성을 가짐), 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 fHbp v3 폴리펩티드는 서열식별번호: 15와 비교하여 말단절단된 것이다. 야생형 성숙 서열과 비교하여, 서열식별번호: 15는 이미 최대 폴리-글리신 서열까지, 및 이를 포함하여 N-말단에서 말단절단된 것이지만 (서열식별번호: 14 및 15를 비교함), 서열식별번호: 15는 C-말단에서 말단절단되고/거나, N-말단에서 추가로 말단절단된 것일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 v3 fHbp 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 융합 단백질 중에 포함된 v3 fHbp 폴리펩티드는 동일한 실험 조건하에서 동일하지만, S32 및 L126에서 서열 차이가 없는 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖고, 예를 들어, 서열식별번호: 13으로 이루어진 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. S32V 돌연변이는 바람직한 소수성 상호작용을 도입하여 구조를 안정화시킨다. L126R 돌연변이는 fH 및 비바람직한 전하와의 충돌을 도입하여 fH 결합을 폐기한다.
안정성 증강은 예를 들어, 문헌 [Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9] 및 [Bruylants et al. (2005) Current Medicinal Chemistry 12:2011-20]에서 논의된 바와 같이, 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 사용하여 평가될 수 있다. DSC는 앞서 v3 fHbp의 안정성을 평가하는데 사용되어 왔다 (van der Veen et al. (2014) Infect Immun PMID 24379280). 안정성을 평가하는데 적합한 DSC 조건은 100-200 mM NaCl (예를 들어, 150 mM)을 포함하는, pH 6 내지 8 (예를 들어, 7-7.5)의 완충처리된 용액 (예를 들어, 25 mM 트리스) 중 20 μM의 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
안정성에서의 증가는 DSC에 의해 평가되었을 때, 야생형과 비교하여, 적어도 한 피크의 열 전이 중간점 (Tm)이 적어도 5℃, 예를 들어, 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 그 초과만큼 증가된 것으로 입증된다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크를 제시하며 (하나는 N-말단 도메인, 및 하나는 C-말단 도메인), 여기서 본 발명의 융합 단백질에 포함된 v3 폴리펩티드는 상기 도메인 둘 다를 포함하며, "안정성에서의 증가"는 N-말단 도메인의 Tm의 적어도 5℃ 증가를 지칭한다. N-말단 도메인의 Tm은 야생형 v3 서열은 대략 60℃ 이하에 존재할 수 있는 반면 (Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981), C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열은 N-말단 도메인을 갖고, 여기서 Tm은 적어도 65℃, 예를 들어, ≥70℃, ≥75℃, 또는 심지어 ≥80℃이다.
상기 기재된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L ]3-B-COOH의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, L은 임의적 링커 아미노산 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 링커 아미노산 서열 "L"은 글리신 중합체 또는 글리신-세린 중합체 링커이다. 예시적인 링커는 "GGSG", "GGSGG", "GSGSG", "GSGGG", "GGGSG", "GSSSG" 및 "GSGGGG"를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 글리신 또는 글리신-세린 중합체 링커는 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명에 따라 바람직한 융합 폴리펩티드에서, v2 및 v3 서열 및 v3 및 v1 서열은 글리신-세린 중합체 링커 "GSGGGG"에 의해 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나, 그로 이루어진다 (글리신-세린 링커 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 돌연변이화된 잔기는 볼드체로 제시되어 있음):
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 대안적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게로의 투여 후, 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드, 특히, 서열식별번호: 31, 32, 10 및/또는 13의 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 상기 항체는 이상적으로 살박테리아성이다 (하기 참조).
상기 기재된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L ]3-B-COOH의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, A는 임의적 N 말단 아미노산 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 융합 단백질이 잘 발현될 수 있도록 하는데 유리한, 하기 N-말단 아미노산 서열을 추가로 포함한다:
본원에 개시된 융합 단백질 중 임의의 것(예를 들어, 서열식별번호: 18-22, 29 및 30)은 융합 폴리펩티드의 N-말단에 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하도록 변형될 수 있고, 즉, 서열식별번호: 34의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 fHbp v2 성분의 N-말단에 부가된다.
살박테리아성 반응
본 발명의 바람직한 v1.13, v1.15 및/또는 융합 폴리펩티드는 수막구균에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 유도할 수 있다. 살박테리아성 항체 반응은 편의상 마우스에서 측정되고, 백신 효능의 표준 인디케이터이다 (예를 들어, 문헌 [end-note 14 of Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820]; 또한 WO2007/028408 참조)
본 발명의 제1 실시양태의 폴리펩티드는 바람직하게는 v1.13 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 제1 실시양태의 바람직한 폴리펩티드는 마우스에서 혈청 살박테리아성 검정법에서 v1.13 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체를 유도할 수 있다.
본 발명의 제2 실시양태의 폴리펩티드는 바람직하게는 v1.15 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 제2 실시양태의 바람직한 폴리펩티드는 마우스에서 혈청 살박테리아성 검정법에서 v1.15 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체를 유도할 수 있다.
예를 들어, 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은 골드슈나이더(Goldschneider) 검정법을 이용하여 인간 보체 이용 시 ≥1:4의 혈청 살박테리아성 역가를 제공할 수 있고/거나 [Goldschneider et al. (1969) J. Exp . Med . 129:1307-26, Santos et al. (2001) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:616-23], 및 [Frasch et al. (2009) Vaccine 27S:B112-6], 새끼 토끼 보체를 이용하여 ≥1:128의 혈청 살박테리아성 역가를 제공할 수 있다.
폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 (적어도 부분적으로) 프로테아제를 이용한 더 긴 폴리펩티드의 분해에 의해, RNA로부터의 번역에 의해, 세포 배양물로부터 (예를 들어, 재조합 발현 또는 엔. 메닌기티디스 배양물로부터) 정제 등에 의해 제조될 수 있다. 이. 콜라이(E. coli) 숙주에서의 이종 발현이 바람직한 발현 경로이다.
본 발명의 폴리펩티드는 이상적으로는 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어, 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, 또는 더 긴 길이이다. 이들은 돌연변이체 fHbp v1, v2 및/또는 v3 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열은 유사하게 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어, 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, 또는 더 긴 길이여야 한다.
fHbp는 자연적으로 엔. 메닌기티디스의 지질단백질이다. 이는 천연 리더 서열 또는 이종 리더 서열에 의해 이. 콜라이에서 발현되는 경우 지질화되는 것으로도 또한 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어, 일반적으로 트리팔미토일-S-글리세릴-시스테인을 형성하는 팔미토일 기를 포함하는, 지질화될 수 있는 N-말단 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 지질화되지 않는다.
폴리펩티드는 바람직하게는 실질적으로 순수하거나, 실질적으로 단리된 형태로 제조된다 (즉, 실질적으로 다른 네이세리아 또는 숙주 세포 폴리펩티드가 없는 형태). 일반적으로, 폴리펩티드는 비-자연적으로 발생된 환경에서 제공되며, 예를 들어, 이들은 이들의 자연적으로 발생된 환경으로부터 분리된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 출발 물질과 비교하여 폴리펩티드가 강화된 조성물로 존재한다. 따라서, 정제된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 정제된이란, 폴리펩티드가 다른 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재한다는 것을 의미하고, 여기서 실질적으로 없다는 것은 조성물의 총 폴리펩티드 중 50% 초과 (예를 들어, ≥75%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, 또는 ≥99%)가 본 발명의 폴리펩티드임을 의미한다.
폴리펩티드는 다양한 형태를 취할 수 있다 (예를 들어, 천연, 융합, 글리코실화, 비-글리코실화, 지질화, 이황화 브릿지 등)
본 발명의 폴리펩티드가 생물학적 숙주에서 번역에 의해 생산된다면, 이때는 대부분의 숙주에서 N-말단 메티오닌을 제공할 출발 코돈을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는, 적어도 신생 단계에서, 상기 서열식별번호 서열 상류에 메티오닌 잔기를 포함할 것이다.
신생 서열의 절단이란, 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열 자체가 폴리펩티드의 N-말단을 제공할 수 있음을 의미한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열의 상류에 N-말단 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단의 단일 메티오닌 바로 다음에 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열을 갖고; 다른 실시양태에서, 더 긴 상류 서열이 이용될 수 있다. 상기 상류 서열은 짧을 수 있다 (예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 예는 단백질 수송을 유도하는 리더 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어, 히스티딘 태그, 즉, His n (여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상) 포함)을 포함한다. 다른 적합한 N-말단 아미노산 서열이 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열의 최종 아미노산의 하류에 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 C-말단 연장부는 짧을 수 있다 (예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). 예는 단백질 수송을 유도하는 서열, 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어, 히스티딘 태그, 즉, His n (여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상) 포함), 또는 폴리펩티드 안정성을 증진시키는 서열을 포함한다. 다른 적합한 C-말단 아미노산 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 C-말단에 히스티딘 태그 (문헌 [Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981], 및 [Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77] 참조), 및 특히, 헥사히스티딘 태그를 포함하는 폴리펩티드는 배제한다.
"폴리펩티드"라는 용어는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라, 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 본 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로 발생할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착 또는 고정화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 또는 비오틴 표지를 포함할 수 있다. 이는 면역검정법 기술에 특히 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 인공 아미노산 서열, 즉, 임의의 자연적으로 발생된 수막구균에는 존재하지 않는 서열로 이루어진다.
인자 H에 대한 친화도는 (예를 들어, 문헌 [Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5]에 개시된 바와 같이) 고정화된 인간 fH를 이용하여 표면 플라즈몬 공명을 이용함으로써 정량적으로 평가될 수 있다. (동일한 실험 조건 하에 측정되었을 때, 동일하지만, 돌연변이는 없는 폴리펩티드 대비) 적어도 10배, 및 이상적으로, 적어도 100배의 친화도 감소 (즉, 해리 상수, KD 증가)를 제공하는 돌연변이가 바람직하다.
핵산
본 발명의 제4 측면은 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드, 돌연변이체 v1.15 fHbp 폴리펩티드, 또는 상기 정의된 바와 같은 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 핵산을 제공한다.
본 발명의 핵산은 다수의 방법으로, 예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로 화학적 합성 (예를 들어, DNA의 포스포르아미다이트 합성)에 의해, 뉴클레아제 (예를 들어, 제한 효소)를 이용한 더 긴 핵산의 분해에 의해, 예를 들어, 리가제 또는 폴리머라제를 이용하여) 더 짧은 핵산 또는 뉴클레오티드를 연결시킴으로써, 게놈 또는 cDNA 라이브러리 등으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산은 예를 들어 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터, 프라이머, 프로브, 표지형, 비표지형 등과 같은 다양한 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 핵산은 바람직하게는 단리된 또는 실질적으로 단리된 형태이다.
"핵산"이라는 용어는 DNA 및 RNA, 및 또한 그의 유사체, 예컨대, 변형된 백본을 함유하는 것, 및 또한 펩티드 핵산 (PNA) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어, 방사성 또는 형광성 표지로 표지될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 (예컨대 플라스미드) (예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터, 예컨대, 핵산 면역화에 적합한 것들) 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
숙주 세포
본 발명의 제5 측면은 상기 정의된 바와 같은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 박테리아이다. 박테리아는 예를 들어, 수막구균 또는 이. 콜라이일 수 있다. 박테리아는 구성적으로 폴리펩티드를 발현할 수 있으나, 또는 일부 실시양태에서, 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 박테리아는 폴리펩티드를 과다발현할 수 있다 (WO2006/081259 참조). 폴리펩티드의 발현은 이상적으로는 상 가변성이 아니다.
세포는 수막구균 박테리아, 예컨대, mltA가 하향조절되거나, 또는 넉아웃되고, 또한 임의적으로 (i) LPS의 지질 A 부분이 독성을 띠도록 하는데 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히, lpxl1 ; 및/또는 (ii) 피막 폴리사카라이드 합성 또는 외수송에 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히, synX 및/또는 ctrA가 하향조절되거나, 또는 넉아웃된 수막구균 박테리아일 수 있다.
소포
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 숙주 세포로부터, 특히, 수막구균 숙주 세포로부터 제조된 외막 소포를 제공한다.
본 발명의 숙주 세포로부터 제조된 소포는 바람직하게는, 소포에서 면역-접근가능한 형태이어야 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하고, 즉, 본 발명의 정제된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체는 또한 소포에 존재하는 폴리펩티드에도 결합할 수 있어야 한다.
이러한 막 소포는 수막구균 외막의 파괴에 의해 또는 수막구균 외막으로부터의 수포 형성에 의해서 수막구균 외막으로부터 외막의 단백질 성분을 포함하는 소포를 형성함으로써 수득된 임의의 프로테오리포솜 소포를 포함한다. 따라서, 본 용어는 외막 소포 (OMV; 종종 '수포'로 지칭), 미세소포 (MV [WO02/09643]) 및 '천연 OMV' ('NOMV' [Katial et al. (2002) Infect Immun 70:702-707])를 포함한다.
MV 및 NOMV는 박테리아 성장 동안 자발적으로 형성되고, 배양 배지로 방출되는 자연적으로 발생된 막 소포이다. MV는 브로쓰 배양 배지에서 네이세리아를 배양하고, 브로쓰 배양 배지에서 더 작은 MV로부터 전체 세포를 분리하고 (예를 들어, 세포만 펠릿화시키고, 더 작은 소포는 펠릿화시키지 않기 위해 여과에 의해 또는 저속 원심분리에 의해 수행), 이어서, 세포 고갈 배지로부터 MV를 수집함으로써 (예를 들어, 여과에 의해, MV의 차별적 침전 또는 응집에 의해, MV를 펠릿화시키기 위한 고속 원심분리에 의해 수행) 수득될 수 있다. MV의 생산에서 사용하기 위한 균주는 일반적으로 배양 중에 생산된 MV의 양을 기초로 하여 선택될 수 있으며, 예를 들어, US 6,180,111 및 WO01/34642에 MV를 고도로 생산하는 네이세리아가 기재되어 있다.
OMV는 박테리아로부터 인공적으로 제조되며, 계면활성제 처리 (예를 들어, 데옥시콜레이트 이용)를 이용하거나, 또는 비-계면활성제 수단에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, WO2004/019977 참조). OMV를 형성하기 위한 기술은 계면활성제를 침전시키지 않는 충분히 높은 pH에서 박테리아를 담즙산 염 계면활성제 (예를 들어, 리토콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 데옥시콜산, 콜산, 우르소콜산 등의 염, 여기서 소듐 데옥시콜레이트 [EP0011243 및 문헌 [Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80] 참조]가 네이세리아를 처리하는데 바람직함)로 처리하는 것을 포함한다 [WO01/91788]. 다른 기술은 초음파처리, 균질화, 미세유동화, 공동화, 삼투압 충격, 분쇄, 프렌치 가압, 블렌딩 등과 같은 기술을 이용하여 실질적으로 계면활성제의 부재 하에서 수행될 수 있다 [WO2004/019977]. 계면활성제를 이용하지 않거나, 계면활성제를 소량 이용하는 방법은 유용한 항원, 예컨대, NspA 및 fHbp를 유지시킬 수 있다. 따라서, 본 방법은 약 0.5% 이하, 예를 들어, 약 0.2%, 약 0.1%, <0.05%로 데옥시콜레이트를 포함하거나, 또는 그를 포함하지 않는 OMV 추출 완충액을 이용할 수 있다.
OMV 정제를 위한 유용한 프로세스는 WO2005/004908에 기재되어 있고, 고속 원심분리 대신 미정제 OMV에 대한 한외여과를 수반한다. 상기 프로세스는 한외여과 수행 이후에 초원심분리 단계를 수반할 수 있다. OMV는 또한 WO2011/036562에 기재된 2 단계 크기 여과 프로세스를 이용하여 정제될 수 있다.
본 발명과 함께 이용하기 위한 소포는 임의의 수막구균 균주로부터 제조될 수 있다. 소포는 일반적으로 혈청군 B 균주로부터의 소포이겠지만, 이들을 B 이외의 다른 혈청군 (예를 들어, WO01/91788에는 혈청군 A에 대한 프로세스가 개시되어 있음), 예컨대, A, C, W135 또는 Y로부터 제조하는 것도 가능하다. 균주는 임의의 혈청형 (예를 들어, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16 등), 임의의 혈청아형, 및 임의의 면역형 (예를 들어, L1; L2; L3; L3,3,7; L10 등)의 균주일 수 있다. 수막구균은 임의의 적합한 계통, 예를 들어, 과침습성 및 과병독성 계통, 예를 들어, 서브그룹 I; 서브그룹 III; 서브그룹 IV-1; ET-5 복합체; ET-37 복합체; A4 클러스터; 계통 3의 7종의 과병독성 계통 중 임의의 것으로부터의 수막구균일 수 있다.
본 발명의 박테리아는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 것 이외에도, 하나 이상의 추가 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 이들은 변형된 fur 유전자를 가질 수 있다 [WO98/56901]. nspA 발현의 발현은 동시 진행되는 porA 및 cps 넉아웃으로 상향조절될 수 있다. OMV 생산을 위한 엔. 메닌기티디스의 추가 넉아웃 돌연변이체는, 예를 들어, WO2004/014417에 개시되어 있다. 문헌 [Claassen et al. (1996) 14(10):1001-8]에는 6종의 상이한 PorA 아형을 발현하도록 변형된 균주로부터의 소포의 구축이 개시되어 있다. LPS 생합성에 수반하는 효소의 넉아웃에 의해 달성된, 낮은 내독소 수준을 가진 돌연변이체 네이세리아가 또한 이용될 수 있다. LPS의 지질 A 부분이 독성을 띠도록 하는데 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히, lpxl1 유전자의 발현을 감소시키거나, 스위치 오프하도록 조작된 돌연변이체 네이세리아가 본 발명에 이용될 수 있다 [Fisseha et al. (2005) Infect Immun 73:4070-80]. 유사하게, 피막 폴리사카라이드 합성 또는 외수송에 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히, synX 및/또는 ctrA 유전자의 발현을 감소시키거나, 스위치 오프하도록 조작된 돌연변이체 네이세리아가 본 발명에 이용될 수 있다. 상기 또는 다른 돌연변이체 모두 본 발명에 이용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명과 함께 사용되는 균주는 1 초과의 PorA 아형을 발현할 수 있다. 6가 및 9가 PorA 균주는 앞서 구축되었다. 균주는 PorA 아형: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 및/또는 P1.18-1,3,6 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종을 발현할 수 있다. 다른 실시양태에서, 균주는 PorA 발현에 대해 하향조절되었을 수 있고, 여기서 예를 들어, PorA의 양은 야생형 수준 대비 (예를 들어, 균주 H44/76 대비) 적어도 20% (예를 들어, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95% 등)만큼 감소되었거나, 또는 심지어 넉아웃되었다.
일부 실시양태에서, 균주는 특정 단백질을 (상응하는 야생형 균주 대비) 과다발현할 수 있다. 예를 들어, 균주는 NspA, 단백질 287 [WO01/52885], fHbp [WO2006/081259] (본 발명의 fHbp 포함), TbpA 및/또는 TbpB [WO00/25811], Cu,Zn-슈퍼옥시드 디스뮤타제, HmbR 등을 과다발현할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 박테리아 염색체에 통합될 수 있거나, 예를 들어, 플라스미드 내에 에피솜 형태로 존재할 수 있다.
유리하게는 소포 생산을 위해, 수막구균은 폴리펩티드의 발현이 확실하게 상 변동되지 않도록 유전적으로 조작될 수 있다. 수막구균에서 유전자 발현의 상 가변성을 감소시키거나 제거하기 위한 방법은 WO2004/015099에 개시되어 있다. 예를 들어, 유전자는 구성적 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 배치될 수 있거나, 그의 상 가변성의 원인인 DNA 모티프를 제거하거나 대체함으로써 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 균주는 참고문헌 WO02/09746, WO01/09350, WO02/062378, 및 WO2004/014417에 개시된 넉아웃 및/또는 과다발현 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 4개 문서의 가이던스 및 명명법에 따라, 하향조절 및/또는 넉아웃에 유용한 유전자는 (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; 또는 (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX 및/또는 SynC를 포함한다.
돌연변이체 균주가 이용되는 경우, 일부 실시양태에서, 이는 하기 특징들 중 하나 이상, 또는 그들 모두를 가질 수 있다: (i) 수막구균 LOS를 말단절단하기 위해 하향조절되거나, 넉아웃된 LgtB 및/또는 GalE; (ii) 상향조절된 TbpA; (iii) 상향조절된 NhhA; (iv) 상향조절된 Omp85; (v) 상향조절된 LbpA; (vi) 상향조절된 NspA; (vii) 넉아웃된 PorA; (viii) 하향조절되거나, 넉아웃된 FrpB; (ix) 하향조절되거나, 넉아웃된 Opa; (x) 하향조절되거나, 넉아웃된 Opc; (xii) 결실된 cps 유전자 복합체. 말단절단된 LOS는 시알릴-락토-N-네오테트라오스 에피토프를 포함하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어, 이는 갈락토스-결핍 LOS일 수 있다. LOS는 α 쇄를 갖지 않을 수 있다.
소포를 제조하는데 이용되는 수막구균 균주에 따라, 소포는 균주의 천연 fHbp 항원을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다 (WO2004/046177).
한 바람직한 실시양태에서, 수막구균은 기능성 MltA 단백질을 발현하지 않는다. WO2006/046143 및 문헌 [Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 72:1914-19]에서 논의된 바와 같이, 수막구균에서 MltA (막-결합된 용해 트랜스글리코실라제, GNA33으로도 공지됨)의 넉아웃은 다량의 막 소포를 배양 배지로 자발적으로 방출하는 박테리아를 제공하고, 이들은 상기 배양 배지로부터 쉽게 정제될 수 있다. 예를 들어, 소포는 (i) 소포를 그의 상이한 크기에 기초하여 박테리아로부터 분리하는 제1 여과 단계로서, 여기서 소포는 여액으로 통과하는 것인 단계; 및 (ii) 소포를 잔류물에 유지시키는 제2 여과 단계를 포함하는, WO2011/036562의 2단계 크기 여과 프로세스를 이용하여 정제될 수 있다. MltA 돌연변이 (하향조절 또는 넉아웃)는 'GMMA' 백신에 이용되어 왔고 [Koeberling et al. (2014) Vaccine 32:2688-95], 특히 LPS의 지질 A 부분이 독성을 띠도록 하는데 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히 lpxl1 및/또는 피막 폴리사카라이드 합성 또는 외수송에 수반되는 적어도 하나의 유전자, 특히 synX 및/또는 ctrA 유전자의 추가 하향조절 또는 넉아웃과 편리하게 조합될 수 있다. GMMA (Generalized Modules for Membrane Antigens: 막 항원에 대한 일반화 모듈)은 반응원성이 감소되고, 면역원성이 증가된 GMMA를 방출하도록 조작된 수막구균 균주로부터 생산되는 유전적으로 해독화된 OMV이다. GMMA는 단핵구 활성화 시험 (MAT)에서 시험되었을 때, OMV보다 낮은 염증유발성을 보이는 시토카인을 유도한다.
'GMMA' 백신에 대한 바람직한 수막구균 균주는 이러한 접근법을 이용하여 본 발명의 돌연변이체 v2 fHbp 및/또는 돌연변이체 v3 fHbp를 발현하고, 발현은 강력한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 상기 균주에 의해 방출된 소포는 면역원성 형태의 돌연변이체 v2 및/또는 v3 fHbp 단백질을 포함하고, 소포의 투여는 문헌 [Koeberling et al. (2014) Vaccine 32:2688-95]에서 논의된 바와 같이, 살박테리아성 항체 반응을 제공할 수 있다. 균주는 또한 v1 fHbp를 발현할 수 있거나, 또는 v1 fHbp는 가용성 형태의 분리된 재조합 단백질로서 대신 제공될 수 있다 (그리고 v1 fHbp는 야생형이거나, 또는 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, fH에 결합할 수 있는 그의 능력을 파괴시키도록 돌연변이화된 돌연변이체 서열일 수 있다). 본 발명은 상기 균주를 제공하고, 예를 들어, 균주의 성장 후에 배양 배지로부터 정제된 형태로서, 이러한 균주가 방출하는 소포를 또한 제공한다. 이들 균주에서 발현에 바람직한 v2 돌연변이체는 본원에서 논의된 바와 같이 S32 및/또는 L123에 돌연변이를 갖고, 상기 균주에서 발현에 바람직한 v3 돌연변이체는 본원에서 논의된 바와 같이 S32 및/또는 L126에 돌연변이를 갖는다. 따라서, 이들 v2 및 v3 돌연변이체 fHbp 서열을 발현하는 수막구균으로부터 제조된 소포는 본 발명의 백신에 사용하기에 특히 바람직한 면역원이다.
상기 균주에 사용하기에 유용한 프로모터는 WO2013/033398 및 WO2013/113917에 개시된 것들을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 (a) 포린 유전자, 바람직하게는 특히 엔. 메닌기티디스로부터의 porA 또는 porB로부터의 프로모터; 또는 (b) 특히 엔. 메닌기티디스로부터의 rRNA 유전자 프로모터 (예컨대 16S rRNA 유전자)일 수 있다. 수막구균 포린 프로모터가 이용되는 경우, 이는 바람직하게는 porA, 심지어 더 특히 수막구균 porA 유전자 프로모터로부터의 -10 영역, 및/또는 수막구균 porA 유전자 프로모터로부터의 -35 영역 (바람직하게는 -10 영역 및 -35 영역이 12-20개 뉴클레오티드의 개입 서열에 의해 분리되고, 개입 서열은 폴리-G 서열을 함유하지 않거나, 8개 이하의 연속 G 뉴클레오티드를 갖는 폴리-G 서열을 포함함)으로부터 비롯된다. rRNA 유전자 프로모터가 이용되는 경우, 이는 더욱 특히 (i) 수막구균 rRNA 유전자 프로모터로부터의 -10 영역 및/또는 (ii) 수막구균 rRNA 유전자 프로모터로부터의 -35 영역을 포함할 수 있다. (a) 및 (b)의 하이브리드를 이용하고, 예를 들어, porA 프로모터로부터의 -10 영역 및 rRNA 프로모터로부터의 -35 영역 (컨센서스 -35 영역일 수 있음)을 갖는 것이 또한 가능하다. 따라서, 유용한 프로모터는 (i) (특히 수막구균) rRNA 유전자로부터의 -10 영역 및 (특히 수막구균) porA 유전자로부터의 -35 영역, 또는 (ii) (특히 수막구균) porA 유전자로부터의 -10 영역 및 (특히 수막구균) rRNA 유전자로부터의 -35 영역을 포함하는 프로모터일 수 있다.
LOS가 소포에 존재한다면, 그의 LOS 및 단백질 성분을 연결 ("수포내" 접합 [WO2004/014417])하기 위해 소포를 처리할 수 있다.
면역원성 조성물
본 발명의 폴리펩티드는 면역원성 조성물에서 활성 성분(들)으로서 사용될 수 있고, 따라서, 본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드, 제2 측면에 따른 돌연변이체 v1.15 fHbp 폴리펩티드, 제3 측면에 따른 융합 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따른 제6 측면에 따른 소포를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는데 유용하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면의 폴리펩티드 항원 이외에도, 본 발명의 면역원성 조성물은 4CMenB의 항원 성분들 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 4CMenB 제품 (벡세로)은 유행성 그룹 B 수막구균 NZ98/254 균주, B:4:P1.7b,4로부터의 OMV 제제를 함유한다. 동일한 OMV가 MeNZB 백신에서도 발견되며, 본원에서는 OMVnz로 지칭된다. 추가로, 4CMenB는 5종의 수막구균 항원: NHBA (287; 서브변이체 1.2), fHbp (741; 서브변이체 1.1), NadA (961; 서브변이체 3.1), GNA1030 (953) 및 GNA2091 (936)포함한다. 이들 항원 중 4종은 융합 단백질 (NHBA-GNA1030 융합 단백질 (287-953) 및 GNA2091-fHbp (936-741) 융합 단백질)로서 존재한다.
엔. 메닌기티디스 균주 NZ98/254로부터의 25 μg OMV와 함께, 1.5 mg 수산화알루미늄 아주반트 상에 흡착된, 각 50 μg씩 NHBA-GNA1030, NadA 및 GNA2091-fHbp를 함유하는 0.5 ml 용량의 4CMenB 완제품을 제제화한다. 추가로, 각 0.5 ml 용량의 제제는 3.125 mg 염화나트륨, 0.776 mg 히스티딘 및 10 mg 수크로스를 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 상표명 벡세로 하에 시판되는 백신 완제품 4CMenB를 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 서열식별번호: 19의 fHbp 융합 폴리펩티드 (fHbp 23S_1.13_E211A/S216R) 및 완전한 4CMenB 조성물을 포함한다.
수막구균
혈청군
A, C, W135 및 Y
본 발명의 조성물은 또한 수막구균 혈청군 Y, W135, C 및 A 중 하나 이상으로부터의 피막 사카라이드 항원을 포함할 수 있고, 여기서 항원은 담체 단백질(들)에 접합되고/거나, 올리고사카라이드이다. 피막 사카라이드는 올리고사카라이드의 형태로 이용될 수 있다. 이들은 (예를 들어, 가수분해에 의해) 정제된 피막 폴리사카라이드의 단편화에 의해 편리하게 형성되고, 이어서, 일반적으로는 원하는 크기의 단편의 정제가 진행될 것이다.
기존 혈청군 C 백신 (멘쥬케이트(MENJUGATE) [Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698, Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49], 메닌기테크(MENINGITEC) 및 네이스백-C(NEISVAC-C))은 접합된 사카라이드를 포함한다. 멘쥬케이트 및 메닌기테크는 CRM197 담체에 접합된 올리고사카라이드 항원을 갖는 반면, 네이스백-C는 파상풍 톡소이드 담체에 접합된 완전한 폴리사카라이드 (데-O-아세틸화된 것)를 이용한다.
상표명 멘베오(MENVEO), 메낙트라(MENACTRA), 및 니멘릭스(NIMENRIX) 하에 시판되는 백신 제품들은 모두 혈청군 Y, W135, C 및 A 각각으로부터의 접합된 피막 사카라이드 항원을 함유한다.
멘베오 (이는 또한 일반적으로 수막구균 (그룹 A, C, Y, 및 W-135) 올리고사카라이드 디프테리아 CRM197 접합체 백신으로도 공지됨)에서, A, C, W135 및 Y 항원 각각은 CRM197 담체에 접합되어 있다.
메낙트라 (이는 또한 일반적으로 수막구균 (그룹 A, C, Y 및 W-135) 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 접합체 백신으로도 공지됨)에서, A, C, W135 및 Y 항원 각각은 디프테리아 톡소이드 담체에 접합되어 있다.
니멘릭스 (이는 또한 일반적으로 수막구균 폴리사카라이드 그룹 A, C, W-135 및 Y 접합체 백신으로도 공지됨)에서, A, C, W135 및 Y 항원 각각은 파상풍 톡소이드 담체에 접합되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 측면의 폴리펩티드 항원 이외에도, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y로부터의 하나 이상의 접합된 피막 사카라이드 항원을 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 측면의 폴리펩티드 항원 이외에도, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y로부터의 하나 이상의 접합된 피막 사카라이드 항원과 함께 4CMenB 완제품을 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 측면의 폴리펩티드 항원 이외에도, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y 각각로부터의 접합된 피막 사카라이드 항원과 함께 4CMenB 완제품을 포함하여 각 수막구균 혈청형 A, B, C, W135 및 Y에 대한 항원을 포함하는 5가 면역원성 조성물을 형성한다.
바람직한 실시양태에서, 본 조성물은 멘베오에 존재하는 A, C, W135 및 Y 항원 접합체, 메낙트라에 존재하는 A, C, W135 및 Y 항원 접합체, 또는 니멘릭스에 존재하는 A, C, W135 및 Y 항원 접합체를 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 서열식별번호: 19의 fHbp 융합 폴리펩티드 (fHbp 23S_1.13_E211A/S216R), 4CMenB 완제품 및 멘베오에 존재하는 A, C, W135 및 Y 항원 접합체를 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 측면의 폴리펩티드 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 벡세로 및 멘베오, 메낙트라 또는 니멘릭스 중 하나 이상과 함께 공동-투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 벡세로 및 멘베오와 함께 공동-투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동-투여된"이라는 것은 상이한 면역원성 조성물/백신이 별개로 또는 조합물로서 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
백신이 별개로 투여되는 경우, 이는 전형적으로 상이한 부위에, 예를 들어, 한 백신은 좌측 상완으로, 및 2번째 백신은 우측 상완으로 투여될 것이다. 따라서, 두 백신은 대측으로 (예를 들어, 양쪽 팔, 또는 양쪽 다리, 또는 대측 팔 및 다리), 또는 동측으로 (예를 들어, 신체 같은 쪽 팔과 다리) 투여될 수 있다. 비록 백신이 별개로 투여되기는 하지만, 이는 실질적으로는 동시에 (예를 들어, 같은 의료 상담 또는 의료 전문가 또는 백신접종 센터 방문 동안), 예컨대, 서로간 1시간 이내에 투여된다.
그러나, 별개로 공동-면역화시키는 것보다는 조합물로서 투여를 수행할 수 있다. 따라서, 공동-면역화하는 조합 백신, 즉, 상이한 면역원이 혼합되어 있는 단일 조성물을 이용할 수 있다. 조합 백신은 주사를 맞는 횟수가 감소된다는 이점을 대상체에게 제공하며, 이는 컴플리언스 증가라는 임상적 이점으로 이어질 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물의 용도
본 발명의 면역원성 조성물은 의약에서 사용하기에 적합하고, 특히, 네이세리아 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환에 대해 포유동물을 면역화시키는데 사용될 수 있으며, 이로써, 면역원성 조성물의 수용자는 네이세리아 메닌기티디스 박테리아에 의한 감염 및/또는 그에 기인하는 질환에 대한 방어를 제공하는 면역 반응을 일으킨다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 수막구균 B 감염 또는 질환에 대해 포유동물을 면역화시키는데 유용하다. 그러나, 수막구균 혈청군 B 항원이 다른 수막구균 혈청군 항원 (예를 들어, A. C, W 및/또는 Y 항원)과 조합된 본 발명의 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막구균 A, B, C, W 및/또는 Y 감염 또는 질환에 대해 포유동물을 면역화시키는데 유용하다.
그러므로, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스에 의해 유발되는 감염 및/또는 질환에 대해 대상체를 면역화시키는 예방 방법에서 사용된다. 면역원성 조성물은 또한 치료 방법 (즉, 네이세리아 메닌기티디스 감염을 치료하는 방법)에서도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대해 생체내 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다.
면역 반응은 바람직하게는 방어성이고, 바람직하게는 항체 및/또는 세포-매개 면역을 수반한다. 바람직하게는, 면역 반응은 살박테리아성 항체 반응이다. 본 방법은 부스터 반응을 발생시킬 수 있다. 생체내 면역 반응을 발생시킴으로써, 포유동물은 네이세리아 질환 (특히 수막구균 감염)으로부터 방어될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 네이세리아 (예를 들어, 수막구균) 감염으로부터 포유동물을 방어하는 방법을 제공한다.
본 발명은 약제로서 (예를 들어, 면역원성 조성물로서 또는 백신으로서) 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 이는 또한 포유동물에서의 네이세리아 (예를 들어, 수막구균) 감염 예방용 약제의 제조에서 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 치료용 (즉, 감염을 치료하기 위한 용도) 또는 예방용 (즉, 감염을 예방하기 위한 용도)으로 적합한, 백신 생성물로서 제제화된다. 백신은 전형적으로 예방용이다.
포유동물은 바람직하게는 인간이다. 인간은 성인, 청소년 또는 소아 (예를 들어, 영아 또는 유아)일 수 있다. 소아용 백신은 또한 예를 들어, 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게도 투여될 수 있다.
용도 및 방법은 수막염 (특히, 박테리아, 예컨대, 수막구균, 수막염) 및 균혈증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 질환을 예방/치료하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 이들은 엔. 메닌기티디스 (예를 들어, 혈청군 B)에 의해 유발되는 침습성 수막구균 질환에 대한 개체의 능동 면역화에 적합하다.
엔. 메닌기티디스에 대한 방어는 역학적으로, 예를 들어, 임상 시험에서 측정될 수 있지만, 면역원성 조성물이 수혜자에서 혈청 살박테리아성 항체 (SBA) 반응을 유도하는지를 확증하는 간접 측정 방식을 이용하는 것이 편리하다. SBA 검정법에서, 조성물을 받은 수혜자로부터의 혈청을 보체 (비록 새끼 토끼 보체가 자주 대신 사용되기는 하지만, 바람직하게는 인간 보체)의 존재 하에서 표적 박테리아 (본 발명에서, 엔. 메닌기티디스)와 함께 인큐베이션하고, 다양한 혈청 희석액에서 박테리아의 사멸을 평가하여 SBA 활성을 결정한다. SBA 검정법에서 관찰된 결과는 경쟁적 SBA 검정법을 수행하여 관심 항원(들)의 면역원성 활성의 추가적인 간접적 증거를 제공함으로써 보강될 수 있다. 경쟁적 SBA 검정법에서, 항원(들)을 함유하는 면역원성 조성물을 받은 수혜자로부터의 혈청을 상기 항원(들)과 함께 미리 인큐베이션한 후, 이어서, 인간 보체의 존재 하에서 표적 박테리아와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 박테리아의 사멸을 평가하고, 수혜자의 혈청 중 살박테리아성 항체가 미리 인큐베이션하는 사전 단계 동안 관심 항원에 결합하고, 이에 박테리아 상의 표면 항원에 결합에는 이용불가능하다면, 박테리아 사멸은 감소되거나, 또는 폐기될 것이다.
조성물이 각각의 모든 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 방어하여야 하거나, 또는 조성물을 받은 각각의 모든 수혜자가 방어되어야 하는 것은 아니다. 이러한 보편적인 방어는 이러한 분야에서 정상 표준이 아니다. 오히려, 보편적인 방어는 대개 국가별로 그에 기초하여 선택되고, 아마도 시간에 따라 변하는 참조 실험실 균주 패널에 대해 평가되고, 이는 수혜자 집단에서 측정된다.
본 발명의 바람직한 조성물은 허용되는 백분율의 인간 대상체에 대하여 각 항원 성분에 대한 혈청방어를 위한 기준보다 우수한 항체 역가를 인간 환자에서 제공할 수 있다. 숙주가 항원에 대해 혈청전환된 것으로 간주되는 것 초과의 연관된 항체 역가를 갖는 항원은 널리 알려져 있고, 이러한 역가는 WHO와 같은 기구에 의해 공개되어 있다. 바람직하게는 80% 초과의 통계학상 유의적인 대상체 샘플, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 보다 더욱 바람직하게는 93% 초과 및 가장 바람직하게는 96-100%가 혈청전환된다.
면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 면역원 뿐만 아니라, 필요에 따라, 임의의 다른 다른 명시된 성분들을 포함한다.
'면역학적 유효량'은 단일 용량으로 또는 시리즈의 일부로서 개체로의 상기 양의 투여가 치료 또는 예방에 효과적인 것을 의미한다.
"예방"이라는 용어는 질환의 진행을 감소 및/또는 제거하거나, 또는 질환의 발병을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체의 면역계는 (예를 들어, 백신접종에 의해) 프라이밍되어 면역 반응을 일으키고, 질환의 발병이 제거되도록 감염을 퇴치할 수 있다. 따라서, 백신접종을 받은 대상체는 감염될 수는 있지만, 대조군 대상체보다 더욱 잘 감염을 퇴치할 수 있다. 이러한 양은 치료할 개체의 건강 및 신체 상태, 치료할 개체 (예를 들어, 비-인간 영장류, 영장류 등)의 분류군, 항체를 합성할 수 있는 개체의 면역계 능력, 원하는 방어 정도, 백신 제제, 의학적 상황에 대한 주치의의 평가, 및 다른 관련 인자에 따라 달라진다. 상기 양은 통상의 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 포함되어 있을 것으로 예상된다. 본 조성물은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
백신 효능
본 발명에서 사용하기 위한 면역원성 조성물은 바람직하게는 적어도 10%, 예를 들어, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, 또는 그 초과의 엔. 메닌기티디스의 적어도 한 균주에 대해 백신 효능을 갖는다.
백신 효능은 상기 조성물을 받지 않은 대상체 (예를 들어, 비-면역화되거나, 또는 위약 또는 음성 대조군을 받은 대상체)와 비교하여, 본 발명에 따른 조성물을 받은 대상체에서 수막구균 질환이 발생할 수 있는 상대적 위험 감소로 결정된다. 따라서, 본 발명에 따라 면역화된 집단에서의 수막구균 질환의 발병률을 본 발명에 따라 면역화되지 않은 대조군 집단에서의 발병률과 비교하여 상대 위험을 수득하고, 백신 효능은 100%에서 상기 수치를 감산한 값이다.
백신 효능은 개체에 대해서보다는 집단에 대해 결정된다. 따라서, 이는 유용한 역학 도구이지만, 개별 방어를 예측하지는 못한다. 예를 들어, 개별 대상체는 감염체의 매우 큰 접종물에 노출될 수 있거나, 또는 더 쉽게 감염되도록 하는 다른 위험 인자를 가질 수 있지만, 이것이 효능 척도의 타당성 또는 유용성을 무효화하는 것은 아니다. 본 발명에 따라 및 백신 효능 측정을 위해 면역화되는 집단의 크기는 적어도 100명이 이상적이고, 예를 들어, 적어도 500명의 대상체와 같이 더 클 수도 있다. 대조군 그룹의 크기는 또한 적어도 100명, 예를 들어, 적어도 500명이어야 한다.
투여
본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사 (예를 들어, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 또는 조직의 사이질 공간으로), 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 수행될 수 있다. 대퇴부 또는 상완으로의 근육내 투여가 바람직하다. 주사는 바늘을 통해서 이루어질 수 있지만 (예를 들어, 피하용 바늘), 무침 주사가 대안적으로 이용될 수 있다. 전형적인 근육내 용량은 약 0.5 ml이다.
네이세리아 감염은 신체의 다양한 부위에 영향을 주는 바, 이에, 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 액제 또는 현탁제로 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 연고, 크림, 또는 분제와 같이 국소 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 정제 또는 캡슐제로서, 또는 시럽 (임의적으로 향미화된 것)으로서 경구 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 미세 분말 또는 스프레이를 이용하여 흡입기로서 폐 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 페서리로서 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 점적제와 같이 비강, 귀, 또는 안구 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 주사에 적합한 조성물이 가장 바람직하다.
본 발명은 전신 및/또는 점막 면역을 유도하는데 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 '용량'은 단일 면역화로 대상체에게 투여하는데 적합한 조성물의 부피이다. 비록 (예를 들어, 소아에게) 분할 용량으로 투여될 수도 있지만, 인간 백신은 전형적으로 약 0.5 ml의 투여 부피로 투여된다. 용량 부피는 조성물 중 항원의 농도에 의존하여 추가로 달라질 수 있다.
조성물은 추가로 '다회용량' 키트로, 즉, 다회 면역화를 위해 충분한 조성물을 함유하는 단일 용기로 제공될 수 있다. 다회용량은 보존제를 포함할 수 있거나, 또는 다회용량 용기는 조성물의 개별 용량 제거를 위한 무균 어댑터를 가질 수 있다.
투여는 단일 용량 스케줄을 수반할 수 있지만, 일반적으로는 다회 용량 스케줄을 수반할 것이다. 바람직하게는, 적어도 3회 용량 스케줄이 제공된다. 프라이밍 용량 간의 적합한 간격은 통상적으로, 예를 들어, 4-16주, 예컨대 1개월 또는 2개월인 것으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 벡세로는 생후 2, 4 & 6개월째, 또는 2, 3 & 4개월째에 투여되고, 임의적으로 4차 용량은 12개월째에 투여될 수 있다.
면역화되는 대상체는 인간이며, 이는 예를 들어, 생후 0-12개월, 1-5세, 5-18세, 18-55세, 또는 55세 초과인 임의 연령의 인간일 수 있다. 바람직하게는, 면역화되는 대상체는 청소년 (예를 들어, 12-18세) 또는 성인 (18세 이상)이다.
임의적으로, 대상체는 소아기 (예를 들어, 12세 이전)에 엔. 메닌기티디스에 대해 면역화되었고, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 부스터 용량으로 받는 청소년 또는 성인이다.
본 발명이 공동-면역화를 언급하는 경우, 상이한 면역원성 조성물/백신은 별개로 또는 조합물로서 투여될 수 있다.
백신이 별개로 투여되는 경우, 이는 전형적으로 상이한 부위에, 예를 들어, 한 백신은 좌측 상완으로, 및 2번째 백신은 우측 상완으로 투여될 것이다. 따라서, 두 백신은 대측으로 (예를 들어, 양쪽 팔, 또는 양쪽 다리, 또는 대측 팔 및 다리), 또는 동측으로 (예를 들어, 신체 같은 쪽 팔과 다리) 투여될 수 있다. 비록 백신이 별개로 투여되기는 하지만, 이는 실질적으로는 동시에 (예를 들어, 같은 의료 상담 또는 의료 전문가 또는 백신접종 센터 방문 동안), 예컨대, 서로간 1시간 이내에 투여된다.
그러나, 별개로 공동-면역화시키는 것보다는 조합물로서 투여를 수행할 수 있다. 따라서, 공동-면역화하는 조합 백신, 즉, 상이한 면역원이 혼합되어 있는 단일 조성물을 이용할 수 있다. 조합 백신은 주사 횟수가 감소된다는 이점을 대상체에게 제공하며, 이는 컴플리언스 증가라는 임상적 이점으로 이어질 수 있다.
비-항원 성분
본 발명의 면역원성 조성물은 일반적으로 조성물을 받는 환자에 유해한 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 물질일 수 있는, 제약상 허용되는 담체를 포함할 것이다. 제약상 허용되는 담체는 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 에멀젼화제, pH 완충화 물질 등도 또한 상기 비히클에 존재할 수 있다. 적합한 담체에 관한 철저한 논의는 문헌 [Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472]에서 이용가능하다.
조성물은 바람직하게는 멸균 조성물이다. 이는 바람직하게는 발열원 무함유이다. 이는 바람직하게는, 예를 들어, pH 6 내지 pH 8, 일반적으로 약 pH 7로 완충화된다. 조성물이 수산화알루미늄 염을 포함하는 경우, 히스티딘 완충제를 이용하는 것이 바람직하다 [WO03/009869]. 본 발명의 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
본 발명의 조성물에 이용될 수 있는 아주반트는 불용성 금속염, 수중유 에멀젼 (예를 들어, MF59 또는 AS03, 둘 다는 스쿠알렌을 함유함), 사포닌, LPS의 비-독성 유도체 (예컨대 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-데아실화된 MPL), 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 해독화된 박테리아 ADP-리보실화 독소, 미세입자, 리포솜, 이미다조퀴놀론, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 문헌 [chapter 7 of Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.]에 개시되어 있다.
수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄 아주반트의 이용이 특히 바람직하고, 폴리펩티드는 일반적으로 상기 염에 흡착된다. 상기 염은 옥시히드록시드 및 히드록시포스페이트를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [chapters 8 & 9 of Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum] 참조). 염은 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다 (예를 들어, 겔, 결정형, 무정형 등).
추가 항원 성분
본 발명의 면역원성 조성물은 다른 질환 또는 감염에 대한 면역화를 위한 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하기 추가 항원 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
- 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로부터의 사카라이드 항원 [예를 들어, 문헌 [Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332], [Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285], 및 [Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207]].
- A형 간염 바이러스, 예컨대, 불활성화된 바이러스로부터의 항원 [예를 들어, 문헌 [Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188], [Iwarson (1995) APMIS 103:321-326]].
- B형 간염 바이러스로부터의 항원, 예컨대, 표면 및/또는 코어 항원 [예를 들어, 문헌 [Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl: S63-68 & 79-80]]).
- 디프테리아 항원, 예컨대, 디프테리아 톡소이드 [예를 들어, 문헌 [chapter 3 of Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0]], 예를 들어, CRM197 돌연변이체 [예를 들어, 문헌 [Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70]].
- 파상풍 항원, 예컨대, 파상풍 톡소이드 (예를 들어, 문헌 [chapter 4 of Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0]).
- 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)로부터의 항원, 예컨대, 임의적으로 또한 퍼탁틴 및/또는 아글루티노겐 2 및 3과 함께 조합된, 비. 퍼투시스(B. pertussis)로부터의 백일해 홀로톡신 (PT) 및 사상형 헤마글루티닌 (FHA) (예를 들어, 문헌 [Gustafsson et al. (1996) N. Engl . J. Med . 334:349-355], 및 [Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238]).
- 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B로부터의 사카라이드 항원 [예를 들어, 문헌 [Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263]].
- 소아마비 항원(들) [예를 들어, 문헌 [Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308], 및 [Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126]], 예컨대 IPV.
- 홍역, 볼거리 및/또는 풍진 항원 (예를 들어, 문헌 [chapters 9, 10 & 11 of Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0]).
- 인플루엔자 항원(들) (예를 들어, 문헌 [chapter 19 of Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0]), 예컨대 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 표면 단백질.
- 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)로부터의 항원 [예를 들어, 문헌 [McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1: S101-107]].
- 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코쿠스)로부터의 단백질 항원 [예를 들어, 문헌 [Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6], WO02/34771].
- 스트렙토코쿠스 아갈락티아 (그룹 B 스트렙토코쿠스)로부터의 사카라이드 항원.
- 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코쿠스)로부터의 항원 [예를 들어, WO02/34771, 문헌 [Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43], [Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663]].
- 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 항원 [예를 들어, 문헌 [Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240]; 또한 1218-1219 페이지 참조].
독성 단백질 항원은 필요한 경우 해독화될 수 있다 (예를 들어, 화학적 및/또는 유전적 수단에 의한 백일해 독소의 해독화 [Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238]).
디프테리아 항원이 조성물에 포함되는 경우, 파상풍 항원 및 백일해 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 유사하게, 파상풍 항원이 포함되는 경우, 디프테리아 및 백일해 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 유사하게, 백일해 항원이 포함되는 경우, 디프테리아 및 파상풍 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, DTP 조합물이 바람직하다.
사카라이드 항원은 바람직하게는 접합체 형태이다. 일반적으로, 접합은 이것이 T-비의존성 항원으로부터 T-의존성 항원으로 사카라이드를 전환시켜, 면역학적 기억에 대한 프라이밍을 허용함에 따라, 사카라이드의 면역원성을 증진시킨다. 접합은 소아과 백신에 특히 유용하고, 널리 알려진 기술이다.
전형적인 담체 단백질은 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 또는 파상풍 독소, 또는 그의 톡소이드 또는 돌연변이체이다. CRM197 디프테리아 독소 돌연변이체 [Research Disclosure, 453077 (Jan 2002)]가 유용하며, 상표명 PREVNAR 하에 시판되는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 백신 중의 담체이다. 다른 적합한 담체 단백질은 엔. 메닌기티디스 외막 단백질 복합체 [EP-A-0372501], 합성 펩티드 [EP-A-0378881, EP-A-0427347], 열 충격 단백질 [WO93/17712, WO94/03208], 백일해 단백질 [WO98/58668, EP-A-0471177], 시토카인 [WO91/01146], 림포카인 [WO91/01146], 호르몬 [WO91/01146], 성장 인자 [WO91/01146], 다양한 병원체-유래 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 [Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824], 예컨대 N19 [Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7], 에이치. 인플루엔자(H. influenzae)로부터의 단백질 D [EP-A-0594610, Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384], 뉴몰리신 [Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13] 또는 그의 비-독성 유도체 [Michon et al. (1998) Vaccine. 16:1732-41], 폐렴구균 표면 단백질 PspA [WO02/091998], 철-흡수 단백질 [WO01/72337], 씨. 디피실레(C. difficile)로부터의 독소 A 또는 B [WO00/61761], 재조합 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 엑소단백질 A (rEPA) [WO00/33882] 등을 포함한다.
필요에 따라 임의의 적합한 링커를 이용하여, 임의의 적합한 접합 반응이 이용될 수 있다.
사카라이드는 전형적으로 접합 이전에 활성화되거나, 관능화될 것이다. 활성화는, 예를 들어, 시아닐화 시약, 예컨대 CDAP (예를 들어, 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 [Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198, WO95/08348])를 수반할 수 있다. 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU 등을 이용한다.
링커 기를 통한 연결은 임의의 공지된 방법, 예를 들어, US 4,882,317 및 US 4,695,624에 기재된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 한 유형의 연결은 폴리사카라이드의 환원적 아민화, 생성된 아미노 기와 아디프산 링커 기의 한 말단과의 커플링, 및 이어서, 아디프산 링커 기의 다른 말단에의 단백질 커플링을 수반한다 [Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919, EP0208375]. 다른 링커는 B-프로피온아미도 [WO00/10599], 니트로페닐-에틸아민 [Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165: 171-288 (1979)], 할로아실 할라이드 [US 4,057,685], 글리코시드 결합 [US 4,673,574; US 4,761,283; US 4,808,700], 6-아미노카프로산 [US 4,459,286], ADH [US 4,965,338], C4 내지 C12 모이어티 [US 4,663,160] 등을 포함한다. 링커를 이용하는 것에 대한 대안으로서, 직접 연결이 이용될 수 있다. 단백질에의 직접 연결은 예를 들어, US 4,761,283 및 US 4,356,170에 기재된 바와 같이, 폴리사카라이드의 산화 이후에 단백질에 의한 환원적 아민화를 포함할 수 있다.
(예를 들어, 말단 =O 기를 -NH2로 대체하여) 아미노 기를 사카라이드에 도입시킨 후, 아디프산 디에스테르 (예를 들어, 아디프산 N-히드록시숙신이미도 디에스테르)에 의한 유도체화 및 담체 단백질과의 반응을 수반하는 프로세스가 바람직하다. 또 다른 바람직한 반응은, 예를 들어, MenA 또는 MenC의 경우, 단백질 D 담체에 의한 CDAP 활성화를 이용한다.
조성물 중 항원은 전형적으로 각각 적어도 1 μg/ml의 농도로 존재할 것이다. 일반적으로, 임의의 주어진 항원의 농도는 그 항원에 대한 면역 반응을 유도하기에 충분할 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 치료적으로 (즉, 기존 감염을 치료하기 위해) 또는 예방적으로 (즉, 추후 감염을 예방하기 위해) 이용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 단백질 항원을 이용하는 것의 대안으로서, 항원을 코딩하는 핵산 (RNA, 예컨대 자기-복제 RNA, 또는 DNA, 예컨대 플라스미드일 수 있음)이 이용될 수 있다.
일반사항
"포함하는"이라는 용어는 "수반하는" 뿐만 아니라, "이루어진"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 이루어질 수 있거나, 또는, 예를 들어, X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다. "포함하는" (또는 "포함한다" 등)에 대한 언급은 임의적으로 "로 이루어진" (또는 "로 이루어진다" 등)의 언급으로 대체될 수 있다. "로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 "및 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것"으로 제한한다.
수치값 x와 관련된 "약"이라는 용어는 임의적인 것이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y를 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물은 Y를 완전히 함유하지 않을 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"라는 단어는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
본 개시내용이 "에피토프"에 관한 것인 경우, 상기 에피토프는 B-세포 에피토프 및/또는 T-세포 에피토프일 수 있지만, 일반적으로는 B-세포 에피토프가 될 것이다. 상기 에피토프는 경험적으로 (예를 들어, PEPSCAN (예를 들어, 문헌 [Geysen et al. (1984) PNAS USA 81:3998-4002] 및 [Carter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23] 참조) 또는 유사한 방법을 이용하여) 확인될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 제임슨-울프(Jameson-Wolf) 항원 지수 (Jameson, BA et al. 1988, CABIOS 4(1):181-186), 매트릭스 기반 접근법 (Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89), MAPITOPE (Bublil et al. (2007) Proteins 68(1):294-304), TEPITOPE (De Lalla et al. (1999) J. Immunol . 163:1725-29, 및 Kwok et al. (2001) Trends Immunol 22:583-88), 신경망 (Brusic et al. (1998) Bioinformatics 14(2):121-30), OptiMer & EpiMer ([Meister et al. (1995) Vaccine 13(6):581-91] 및 [Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610]), ADEPT (Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7), Tsites (Feller & de la Cruz (1991) Nature 349(6311):720-1), 친수성 (Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190), 또는 항원 지수 (Welling et al. (1985) FEBS Lett . 188:215-218))를 이용하여 예측될 수 있다. 에피토프는 항체 또는 T-세포 수용체의 항원 결합 부위에 의해 인식되고, 그에 결합하는 항원의 부분이고, 이는 또한 "항원 결정기"로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 "백분율 서열 동일성"이라고 언급하는 것은 관련 기술분야에 공지된 적합한 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 이용하여 쌍별 서열 정렬을 수행함으로써 계산되는 동일성 값을 지칭하는 것으로 이해된다.
질의 아미노산 서열은 본원에서 하나 이상의 청구범위에서 확인된 아미노산 서열에 의해 기재될 수 있다. 질의 서열은 대상 서열과 100% 동일할 수 있거나, 또는 대상 서열과 비교하여 특정 개수의 아미노산 변경 (예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등)까지 포함할 수 있으며, 이로써, % 동일성은 100% 미만이다. 예를 들어, 질의 서열은 대상 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일하다.
정렬을 수행하고, 백분율 서열 동일성 (%)을 계산하는데 사용되는 바람직한 정렬 도구는 국소 정렬 도구, 예컨대 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST: Basic Local Alignment Search Tool) 알고리즘이다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터 (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 정렬은 갭 개방 패널티 12 및 갭 연장 패널티 2를 포함하는 아핀 갭 검색, BLOSUM 매트릭스 62를 이용하여 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘은 문헌 [Smith & Waterman (1981) Adv . Appl . Math. 2: 482-489]에 개시되어 있다. 다른 바람직한 정렬 도구는 워터(Water) (EMBOSS) 및 마르셰(Marcher) (EMBOSS)이다. 대안적으로, 정렬을 수행하고, 백분율 (%) 서열 동일성을 계산하는데 사용되는 바람직한 정렬 도구는 최적합 정렬 도구, 예컨대, KERR 알고리즘으로도 공지된 GENEPAST이다.
퍼센트 동일성을 계산하기 위해, 질의 서열 및 대상 서열을 비교하고, 지정된 영역 (예를 들어, 길이가 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65개 또는 그 초과의 아미노산 길이인 영역, 그리고, 최대로는 대상 아미노산 서열의 전체 길이까지 될 수 있음)에 걸쳐 최대로 일치하도록 정렬할 수 있다. 상기 지정된 영역은 아미노산 서열 중 임의의 언급된 점 돌연변이를 포함하는 질의 서열 영역을 포함하여야 한다. 대안적으로, 백분율 서열 동일성은 대상 서열의 "전체 길이"에 걸쳐 계산될 수 있다. 질의 서열에 존재할 수 있는 임의의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 스트레치, 예컨대 신호 펩티드 또는 리더 펩티드 또는 C-말단 또는 N-말단 태그는 정렬로부터 배제되어야 한다.
폴리펩티드 서열과 관련하여 "단편"이라는 용어는 폴리펩티드가 전장 단백질의 분획이라는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 돌연변이체 폴리펩티드의 단편은 또한 돌연변이(들)를 포함한다. 단편은 전단 단백질과 공통되는 정성적 생물학적 활성을 가질 수 있고, 예를 들어, "면역원성 단편"은 전장 서열에 대해 발생되는 것과 같이 단편에 대해서 동일하거나 또는 유사한 면역 반응이 발생될 수 있도록 허용하는 하나 이상의 에피토프, 예컨대 면역우세 에피토프를 함유하거나, 또는 코딩한다. 폴리펩티드 단편은 일반적으로 천연 단백질과 비교하여 아미노 (N) 말단부 및/또는 카르복시 (C) 말단부가 결실되지만, 단편의 남은 아미노산 서열은 천연 단백질의 아미노산 서열과 동일하다. 폴리펩티드 단편은 천연 폴리펩티드 서열의 예를 들어: 약 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262개의 연속된 아미노산 (상기 수치 사이의 모든 정수, 예를 들어, 참조 폴리펩티드 서열의 50 내지 260, 50 내지 255, 50 내지 250, 50 내지 200, 50 내지 150개의 연속된 아미노산 포함)을 함유할 수 있다. 단편이라는 용어는 명백하게 전장 fHbp 폴리펩티드 및 그의 성숙 지질단백질을 배제한다.
혈청군 다음에, 수막구균 분류는 혈청형, 혈청아형 및 이어서 면역형을 포함하고, 표준 명명법은 각각이 예를 들어, B:4: P1.15:L3,7,9와 같이 콜론에 의해 분리된, 혈청군, 혈청형, 혈청아형, 및 면역형을 열거한다. 혈청군 B 내에서, 일부 계통은 종종 질환을 유발하고 (과침습성), 일부 계통은 다른 것보다 더욱 중증인 형태의 질환을 유발하며 (과병독성), 다른 것들은 질환을 거의 유발하지 않는다. 7종의 과병독성 계통이 인지되며, 즉 서브그룹 I, III 및 IV-1, ET-5 복합체, ET-37 복합체, A4 클러스터 및 계통 3이다. 이들은 멀티로커스 효소 전기 영동 (MLEE)에 의해 정의되었으나, 멀티로커스 서열 형결정(MLST)이 또한 수막구균을 분류하는데 이용되어 왔다. 4종의 주요 과병독성 클러스터는 ST32, ST44, ST8 및 ST11 복합체이다.
본원에서 "증강된 안정성" 또는 "더 높은 안정성" 또는 "안정성에서의 증가"이라고 언급하는 것은 동일한 실험 조건 하에서 비-돌연변이체 (야생형) 폴리펩티드와 비교하였을 때, 본원에 개시된 돌연변이체 폴리펩티드가 더 높은 상대 열안정성 kcal/mol)을 갖는다는 것을 의미한다. 안정성 증강은 예를 들어, 문헌 [Bruylants et al. (Differential Scanning Calorimetry in Life Sciences: Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design, 2005 Curr. Med. Chem. 12: 2011-2020)] 및 [Calorimetry Sciences Corporation's "Characterizing Protein stability by DSC" (Life Sciences Application Note, Doc. No. 20211021306 February 2006)]에서 논의된 바와 같은 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여, 또는 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 평가될 수 있다. 안정성에서의 증가는 DSC 또는 DSF에 의해 평가 시, 열 전이 중간점 (Tm)이 적어도 약 5℃ 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Thomas et al., Effect of single-point mutations on the stability and immunogenicity of a recombinant ricin A chain subunit vaccine antigen, 2013 Hum. Vaccin. Immunother. 9(4): 744-752]를 참조한다.
본 발명은 상기에서 단지 예로서 기재되고, 본 발명의 범주 및 정신 내에서 유지되면서, 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명을 수행하기 위한
모드
이제, 본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 정의될 것이다.
실시예
실시예
1:
변이체
1.13 돌연변이체를 포함하는 안정화된
fHbp
231
융합물의
안정성 분석
상기 기재된 바와 같이, 시차 주사 열량측정법 (DSC)은 단백질의 열 안정성 및 도메인 폴딩에 관한 정보를 제공하며, 이는 문헌, 예를 들어, [Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9] 및 [Bruylants et al. Current Medicinal Chemistry 2005; 12:2011-20]에 기재되어 있다. DSC는 앞서 v2 fHbp의 안정성을 평가하는데 사용되어 왔다 (Johnson et al. PLoS Pathogen 2012; 8:e1002981). 안정성을 평가하는데 적합한 DSC 조건은 100-200 mM NaCl (예를 들어, 150 mM)을 포함하는, pH 6 내지 8 (예를 들어, 7-7.5)의 완충처리된 용액 (예를 들어, 25 mM 트리스) 중 20 μM의 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
본 발명자들은 상기 기술을 이용하여 fHbp 변이체 1 서브변이체를 돌연변이화시키는 것이 231S 융합 단백질 안정성에 미치는 효과를 조사하였다.
본 실시예에서 사용된 안정화된 fHbp 231 융합물 ("231S"로 명명)은 안정화 돌연변이를 포함하는 변이체 2 및 변이체 3 서열을 포함한다. 구체적으로, 231S 융합물의 v2 성분은 S32V 및 L123R 돌연변이 둘 다를 포함하는 서열식별번호: 16의 서열을 갖는다. 231S 융합물의 v3 성분은 S32V 및 L126R 돌연변이 둘 다를 포함하는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 본 발명자들은 안정성에 미치는 효과를 조사하기 위해 231S 융합물의 v1 성분을 달리하였다.
각 fHbp 변이체 폴리펩티드는, DSC 써모그램에서 뚜렷이 상이한 두 전이 (피크)로서 명확하게 구별될 수 있는 N-말단 및 C-말단 도메인을 포함한다. 대부분의 fHbp 변이체의 C-말단 전이에 상응하는 Tm 값은 대략 90℃인 반면, N-말단 도메인의 Tm 값은 상이한 fHbp 변이체 사이에서 광범위하게 달라지며, 여기서 최저값은 변이체 2.1 야생형에서 관찰되고 (42℃), 최고값은 var 1.1에서 관찰된다 (70℃).
도 2는 DSC 데이터를 비교하는 4개의 상이한 써모그램을 제시하며, 여기서 fHbp 231S 융합물의 변이체 1 성분은 하기이다:
fHbp v1.1 또는 fHbp v1.13 또는 (A) fHbp v.1.13 E211A (도 2A);
fHbp v1.1 또는 fHbp v1.13 또는 (B) fHbp v1.13 S216R (도 2B);
fHbp v1.1 또는 fHbp v1.13 또는 fHbp v.1.13 E211A/E232A (도 2C); 및
fHbp v1.1 또는 fHbp v1.13 또는 fHbp v.1.13 E211A/S216R (도 2D).
야생형 v1 서열을 포함하는 융합물과 비교하였을 때, C-말단 전이 온도를 증가시킴으로써, (i) 융합 구축물 중의 fHbp 단위는 올바르게 폴딩되고, ii) v1 돌연변이는 융합 구축물을 안정화시키는데 효과적이라는 상기 4개의 각 써모그램으로부터 결론을 얻을 수 있다.
실시예
2:
fHbp
단일
변이체
돌연변이체의
hfH에의
결합
인간 인자 H (hfH)에의 결합을 감소시킬 수 있는 fHbp 변이체 1 서브변이체 1.13 및 1.15의 능력에 대해 치환 돌연변이가 미치는 효과를 조사하기 위해 (아직까지는 참조 서열의 부분으로서 명시되지 않았던 C-말단 His6 태그가 부가된) 표 1에 제시된 하기 폴리펩티드를 생성하였다:
표 1
본 발명자들 (예를 들어, 문헌 [Karlsson et al. (1994) Methods 6:99-110]에 기재된 바와 같이) 단백질-단백질 상호작용에 관한 상세한 정량적 연구 및 그의 평형 및 동력학적 파라미터의 결정을 가능하게 하는 기술인 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용하여 fHbp 단일 변이체 돌연변이체의 hfH에의 결합을 조사하였다.
SPR-기반 결합 방법은 센서 칩의 표면 상에의 리간드 고정화를 수반한다. 상이한 농도의 분석물을 포함하는 용액이 그 위로 유동할 수 있도록 하고, 고정화된 리간드에 대한 그의 상호작용을 특징화할 수 있도록 하는 잘 정의된 화학법을 이용하여 센서 칩의 표면 상에 관심 리간드를 고정화시킨다. SPR 신호는 금 센서 칩 표면에서의 굴절률 변화로부터 시작된다.
시간 경과에 따른 SPR 신호 변화를 모니터링하여, 상이한 단계의 결합 이벤트가 시각화되고, 평가될 수 있도록 하는 결합 반응 (RU) 대 시간의 플롯인 센서그램을 생성한다
분석물 주사 동안, 결합 반응 증가는 표면에서 분석물-리간드 복합체의 형성에 기인하고, 센서그램은 회합 단계가 지배적이다. 주사 후, 정상 상태에 도달하고, 여기서 결합 및 회합 분자는 평형을 이룬다. 분석물 주사 종결 후의 반응 감소는 복합체의 해리에 기인하며, 이는 해리 단계를 정의한다. 센서그램 데이터를 적절한 동력학적 결합 모델에 피팅함으로써 동력학적 파라미터 예컨대 회합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수, 및 시험되는 상호작용의 결합 친화도를 계산할 수 있다.
본 발명자들 하기 실험 세트-업을 이용하였다:
칩: 아민 화학법에 의해 고정화되고, 아세테이트 완충제 (pH 4.0) 중 10 μg/ml인 ~ 400 RU의 인자 H 6-7 도메인, 및 아민 화학법에 의해 고정화되고, 아세테이트 완충제 (pH 4.0) 중 20 μg/ml인 ~ 2500 RU의 인자 H, 휴먼(Human) (머크 밀리포어(Merck Millipore))를 포함하는 CM-5
도 3 (A-D)에 제시된 데이터는 fHbp v1.1 (벡세로®에 존재하는 fHbp 항원) 및 fHbp v1.13 (야생형)의 인자 H (hfH) 도메인 6-7에의 결합을 fHbp v.1.13 E211A (도 3A), fHbp v1.13 S216R (도 3B), fHbp v.1.13 E211A/E232A (도 3C) 및 fHbp v.1.13 E211A/S216R (도 3D)과 비교한다.
단지 도메인 6-7만을 함유하는 hfH의 단편도 fHbp - hfH 상호작용을 모방하는데 충분한 것으로 밝혀졌는 바 (Schneider et al. (2009) Nature 458:890-893), 이로써, fHbp 돌연변이체 및 구축물의 hfH에의 친화도를 평가할 수 있는 간소화된 모델 시스템을 제공하였다.
v.1.1 및 야생형 v1.13과 비교하여 fHbp v1.13 단일 돌연변이체는 감소된 fH 결합을 보인 반면 (도 3A 및 3B 참조), 이중 돌연변이체 v1.13 E211A/E232A 및 v1.13 E211A/S216R은 크게 감소된 결합 활성을 보인다 (도 3C 및 3D 참조).
도 4 (A-D)에 제시된 데이터는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.13 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 fHbp v.1.13 E211A (도 4A), fHbp v1.13 S216R (도 4B), fHbp v.1.13 E211A/E232A (도 4C) 및 fHbp v.1.13 E211A/S216R (도 4D)과 비교한다.
v.1.1 및 야생형 v1.13과 비교하여 fHbp v1.13 단일 돌연변이체는 감소된 fH 결합을 보인 반면 (도 4A 및 4B 참조), 이중 돌연변이체 v1.13 E211A/E232A 및 v1.13 E211A/S216R은 크게 감소된 결합 활성을 보인다 (도 4C 및 4D 참조).
도 5 (A-D)에 제시된 데이터는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 인자 H 도메인 6-7에의 결합을 fHbp v.1.15 E214A (도 5A), fHbp v1.15 S219R (도 5B), fHbp v.1.15 E214A/E235A (도 5C) 및 fHbp v.1.15 E214A/S219R (도 5D)과 비교한다.
v.1.1 및 야생형 v1.15와 비교하여 fHbp v1.15 단일 돌연변이체는 감소된 fH 결합을 보인 반면 (도 5A 및 5B 참조), 이중 돌연변이체 v1.15 E214A/E235A 및 v1.15 E214A/S219R은 인자 H 서브도메인 fH6-7에 대해 어떤 유의적인 결합도 보이지 않는다 (도 5C 및 5D 참조).
도 6 (A-D)에 제시된 데이터는 fHbp v1.1 및 fHbp v1.15 (야생형)의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 fHbp v.1.15 E214A (도 6A), fHbp v1.15 S219R (도 6B), fHbp v.1.15 E214A/E235A (도 6C) 및 fHbp v.1.15 E214A/S219R (도 6D)과 비교한다.
v.1.1 및 야생형 v1.15와 비교하여 fHbp v1.15 단일 돌연변이체 E214A는 감소된 fH 결합을 보인 반면 (도 6A 참조), 단일 돌연변이체 v1.15 S219R 및 이중 돌연변이체 v1.15 E214A/E235A는 전장 fH 단백질에 유의적으로 결합하지 않는다 (도 6B 및 6C 참조).
이중 돌연변이체 v1.15 E214A/S219R은 전장 fH 단백질에 대하여 일부 잔류 결합 활성을 보이는 것으로 나타났다 (도 6D 참조).
그러므로, 요약하면, hfH 결합을 감소 또는 폐기하는데 가장 유망한 후보물질은 fHbp 돌연변이체 v1.13 E211A/E232A, v1.13 E211A/S216R, v1.15 S219R 및 v1.15 E214A/E235A이다.
실시예
3:
fHbp
23(S)1.13 및 23(S)1.15
융합물
돌연변이체의
hfH에의
결합
fHbp 231 융합 단백질의 var1 성분을 돌연변이화시키는 것이 인간 인자 H (hfH)에 결합할 수 있는 융합물의 능력에 미치는 효과를 조사하기 위해 (아직까지는 참조 서열의 부분으로서 명시되지 않았던 C-말단 His6 태그가 부가된) 하기 융합 폴리펩티드 (표 2)를 생성하였다:
표 2
본 발명자들 실시예 2와 관련하여 상기에 기재된 바와 같이 SPR을 이용하여 fHbp 23(S)1.13 및 23(S)1.15 융합물 돌연변이체의 hfH에의 결합을 조사하였다.
본 실시예에서 사용된 fHbp 231S 융합물 (서열식별번호: 30)은 상기에 상세하게 기재된 바와 같이, 각각 S32V/L123R 및 S32V/L126R 안정화 돌연변이를 포함하는 변이체 2 및 변이체 3 서열을 포함한다. 구체적으로, 213S 융합물의 v2 성분은 서열식별번호: 16의 서열을 갖고, 213S 융합물의 v3 성분은 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. fHbp 231S 융합물의 v1.1 성분은 상기 서열식별번호: 30에서 볼드체로 제시된 바와 같이, fH 비-결합 점 돌연변이 (R→S)를 포함하고, 이는 WO2011/126863에 기재된 R41S 돌연변이에 상응한다.
본 실시예에서 사용된 fHbp 231 wt 융합물 (서열식별번호: 29)은 서열식별번호: 30의 융합물과 일치하며, 단, v2 및 v3에 안정화 돌연변이의 도입은 없고, v1.1 중 비-결합 돌연변이는 없다.
fHbp 23S_1.13E211A/S216R 융합물 (서열식별번호: 19)은 서열식별번호: 30의 융합물과 일치하며, 단, 융합물의 v1 성분은 본 발명의 v1.13 비-결합 E211A/S216R 돌연변이체이다.
fHbp 23S_1.15 E214A/E235A 융합물 (서열식별번호: 22)은 서열식별번호: 30의 융합물과 일치하며, 단, 융합물의 v1 성분은 본 발명의 v1.15 비-결합 E214A/E235A 돌연변이체이다.
fHbp-23S_1.13E211A/E232A 융합물 (서열식별번호: 18)은 서열식별번호: 30의 융합물과 일치하며, 단, 융합물의 v1 성분은 본 발명의 v1.13 비-결합 E211A/S216R 돌연변이체이다.
fHbp 231 wt (서열식별번호: 29) 및 fHbp 231S (서열식별번호: 30) 융합 단백질은 본 실험에서 대조군으로서 작용한다.
도 7 (A-B)에 제시된 센서그램은 fHbp 231 wt fHbp 231S의 인자 H (hfH) 도메인 6-7에의 결합을 fHbp 23S_1.13E211A/S216R (도 7A), 및 fHbp 23S_1.13E211A/E232A (도 7B)와 비교한다.
도 8에 제시된 센서그램은 fHbp 231 wt fHbp 231S의 인자 H (hfH) 도메인 6-7에의 결합을 fHbp 23S_1.15 E214A/E235A와 비교한다.
단지 도메인 6-7만을 함유하는 hfH의 단편도 fHbp - hfH 상호작용을 모방하는데 충분한 것으로 밝혀졌는 바 (Schneider et al. (2009) Nature 458:890-893), 이로써, fHbp 돌연변이체 및 구축물의 hfH에의 친화도를 평가할 수 있는 간소화된 모델 시스템을 제공하였다.
도 7 및 8에 따르면, v1.13/1.15 돌연변이체 3종 모두가 인자 H 도메인 6-7에 대해 강력하게 감소된 결합 활성을 보인다는 것은 분명하다. 2fHbp 31S 융합물과 관련하여, v1.13 및 v1.15 돌연변이체 융합물에 의해 나타난 결합 활성은 분명하게 감소되어 있다.
도 9 (A-B)에 제시된 센서그램은 fHbp 231 wt fHbp 231S의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 fHbp 23S_1.13E211A/S216R (도 9A), 및 fHbp 23S_1.13E211A/E232A (도 9B)와 비교한다.
도 10에 제시된 센서그램은 fHbp 231 wt 및 fHbp 231S의 전장 인자 H 단백질에의 결합을 fHbp 23S_1.15 E214A/E235A와 비교한다.
이들 데이터는 시험된 v1.13/1.15 돌연변이체 3종 모두가 fHbp 231S 융합물에 필적할 정도로, 전장 인자 H에 대해 강력하게 감소된 결합 활성을 보인다는 것을 제시한다.
실시예
4: 여러 상이한
fHbp
v1
서브변이체
(
v1.x
)를 발현하는
수막구균
균주에 대해, 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질에 의해 유도되는 면역원성 연구
1차 목적:
기존 fHbp 항원/융합 단백질 및 허가받은 4CMenB 백신과 비교하여, hfH 결합을 감소 또는 폐기하는 돌연변이를 포함하는 231.13 융합 단백질에 의해 여러 상이한 fHbp v1 서브변이체로 fHbp를 발현하는 수막구균 균주에 대해 유도되는 면역원성을 연구하고자 한다. 면역원성은 토끼 혈청 살박테리아성 검정법 (rSBA) 및 인간 혈청 살박테리아성 검정법 (hSBA)을 이용하여 하기 fHbp v1 서브변이체 (v1.x) 균주: v1.1, v1.10, v1.13, v1.14 및 v1.15에 대해 결정한다.
본 실험은 기존 항원/융합 조성물 및 허가받은 4CMenB 백신과 비교되여 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질이 fHbp v1.x를 발현하는 균주 패널에 대해 유사한 면역원성 (비-열등성)을 보이는지 여부를 평가하는 것을 목적으로 한다.
면역화 프로토콜:
하기 표 3에 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 마우스 (CD1 암컷, 6-8주령) 10마리로 이루어진 7개 그룹은 7종의 상이한 항원 조성물 중 하나를 3개로 분리된 200 μl 용량으로 받았다.
표 3
*936-741은 4CMenB 백신에 포함된 GNA2091-fHbp 융합물이다.
**벡세로-유사는 벡세로 완제품을 지칭하지만, 반드시 출시 승인을 받은 배치로부터의 제품일 필요는 없다.
종점:
결과:
도 11A는 v1.x로 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 각각의 시험된 7종의 항원 조성물의 rSBA 역가 (토끼 보체)를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 11B는 v1.x로 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대한 각각의 시험된 7종의 항원 조성물의 hSBA 역가 (인간 보체)를 제시한다.
본 결과는 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질 (그룹 1 및 2)은 v1.x 균주 패널에 대하여 허가받은 벡세로 제품 및 벡세로 fHbp 항원 (936-741)과 유사한 (비-열등성) 면역원성을 보인다는 것을 제시한다.
흥미롭게도, 본 결과는 또한 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질 (그룹 1 및 2)이 rSBA 및 hSBA 둘 다에서 결정된 바와 같이, v1.x 균주 패널에 대하여 관련 기술분야에 공지된 기존 융합 단백질 (구체적으로 231.1S 융합물 (본원에서 서열식별번호: 30))보다 면역원성이 더 크다는 것을 시사한다.
실시예
5:
fHbp
v2/v3을 발현하는
수막구균
균주에 대해, 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질에 의해 유도되는 면역원성 연구
1차 목적:
기존 fHbp 항원/융합 단백질, 및 허가받은 4CMenB 백신과 비교하여, hfH 결합을 감소 또는 폐기하는 돌연변이를 포함하는 231.13 융합 단백질에 의해 v2 또는 v3으로 fHbp를 발현하는 수막구균 균주에 대해 유도되는 면역원성을 연구하고자 한다. 본 실험은 기존 항원 조성물과 비교하여 3종의 상이한 돌연변이화된 fHbp 변이체를 포함하는 것이 균주 적용범위 폭을 증가시킬 수 있는 잠재능을 갖는지 여부를 평가하는 것을 목적으로 한다.
면역원성은 토끼 혈청 살박테리아성 검정법 (rSBA) 및 인간 혈청 살박테리아성 검정법 (hSBA)을 이용하여 하기 fHbp v2 및 v3 균주: v2.16, v3.31 및 v3.42에 대해 결정한다.
면역화 프로토콜:
하기 표 4에 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 마우스 (CD1 암컷, 6-8주령) 10마리로 이루어진 7개 그룹은 7종의 상이한 항원 조성물 중 하나를 3개로 분리된 200 μl 용량으로 받았다.
표 4
*936-741은 4CMenB 백신에 포함된 GNA2091-fHbp 융합물이다.
**벡세로-유사는 벡세로 완제품을 지칭하지만, 반드시 출시 승인을 받은 배치로부터의 제품일 필요는 없다.
종점:
결과:
도 12A는 v2 또는 v3으로 fHbp를 발현하는 다양한 수막구균 균주에 대한 각각의 시험된 7종의 항원 조성물의 rSBA 역가를 제시한다. SBA 결과에서, 각각의 도트는 풀링된 혈청에서 분석된 단일 균주의 SBA 역가를 나타낸다. 도 12B는 v2 또는 v3으로 fHbp를 발현하는 동일의 다양한 균주에 대한 각각의 시험된 7종의 항원 조성물의 hSBA 역가를 제시한다.
본 결과는 fHbp 변이체 3종 모두를 포함하는 융합 단백질이 rSBA 및 hSBA에서 fHbp v1.1 단독, 벡세로에 포함된 936-741 융합물 또는 실제로 벡세로 제품 그 자체와 비교하였을 때, 훨씬 더 높은 역가를 생성한다는 것을 제시한다. 이는 기존 백신 또는 백신 성분과 비교하여, v2 또는 v3으로 fHbp를 발현하는 균주에 대한 면역학적 반응이 유의적으로 개선되었다는 것을 입증하는 것이다.
실시예
6: 기존
4CMenB
백신에 본 발명의
fHbp231.x
비-결합 돌연변이체를
포함시
키는 것이 갖는 부가 가치 평가
1차 목적:
a) 선택된 혈청군 B 네이세리아 메닌기티디스의 fHbp var 2 및 3 균주 20개에 대하여 hSBA 역가에 의해 측정 시, 2종의 상이한 동물 모델 (마우스 및 토끼)에서 3차 투약 후 2주째의, 본 발명의 4CMenB + fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질의 균주 적용범위 (hSBA 역가 ≥64로 정의)를 기존 4CMenB 백신과 비교하여 평가하고자 한다.
b) 선택된 혈청군 B 네이세리아 메닌기티디스의 fHbp var 1.x 균주 30개에 대하여 hSBA 역가에 의해 측정 시, 2종의 상이한 동물 모델 (마우스 및 토끼)에서 3차 투약 후 2주째의, 본 발명의 4CMenB + fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질의 균주 적용범위 (hSBA 역가 ≥64로 정의)를 기존 4CMenB 백신과 비교하여 평가하고자 한다.
c) 4CMenB 참조 균주 및 4CMenB에 의해 커버되는 것으로 예측되는 fHbp var 1.1 및 1.4를 보유하는 균주를 포함하는 혈청군 B 네이세리아 메닌기티디스 11종에 대하여 hSBA 역가에 의해 측정 시, 2종의 상이한 동물 모델 (마우스 및 토끼)에서 3차 투약 후 2주째의, 본 발명의 4CMenB + fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질의 (비-열등성을 평가하는) 균주 적용범위를 기존 4CMenB 백신과 비교하여 평가하고자 한다.
종점: 3차 주사 후 2주째에 수집된 풀링된 혈청으로부터의 hSBA 역가 (그룹당 1개의 풀).
마우스에서의 연구 디자인
4-6주령 CD1 암컷 마우스 균주는 1, 22 및 36일째에 200 μl의 4CMenB 흡착된 수산화알루미늄 (벡세로) 또는 4CMenB 흡착된 수산화알루미늄 (벡세로) + 각종의 상이한 fHbp 231 융합 단백질 (하기 표 5에 제시된 바와 같음)을 3회에 걸쳐 복강내로 (IP) 주사를 맞았다. 혈액 샘플을 1차 주사 전 (0일째)에 수집하고, 최종 출혈물은 3차 주사 후 2주째 (49일째)에 수집하였다.
표 5
*fHbp 231S 융합 단백질은 WO2011/126863에 기재된 R41S 돌연변이에 상응하는, 본원 서열식별번호: 30에서 볼드체로 제시된 v1.1 성분 중의 fH 비-결합 점 돌연변이 (R→S) 이외에도 v2 및 v3 성분으로 안정화 돌연변이를 포함한다.
토끼에서의
연구 디자인
9주령 뉴질랜드 암컷 토끼는 1, 21 및 35일째에 500 μl의 수산화알루미늄 중 흡착된 4CMenB (벡세로) 또는 4CMenB 흡착된 수산화알루미늄 (벡세로) + 각종의 상이한 fHbp 231 융합 단백질 (하기 표 6에 제시된 바와 같음)을 3회에 걸쳐 근육내로 (IM) 주사를 맞았다. 최종 출혈물은 3차 주사 후 2주째에 수집하였다.
표 6
*fHbp 231S 융합 단백질은 WO2011/126863에 기재된 R41S 돌연변이에 상응하는, 본원 서열식별번호: 30에서 볼드체로 제시된 v1.1 성분 중의 fH 비-결합 점 돌연변이 (R→S) 이외에도 v2 및 v3 성분으로 안정화 돌연변이를 포함한다.
샘플 크기 정당화
재시험 또는 추가 적정이 20%임을 고려할 때, 그룹당 마우스 10마리 및 토끼 3마리가 충분한 풀링된 혈청이 hSBA에서 큰 균주 패널 (약 73개)에 대해 시험될 수 있도록 허용하는 동물의 최소 수이다.
선택된 혈청군 B 네이세리아 메닌기티디스의 총 61개의 fHbp var 1, 2 및 3 보유 균주를 hSBA에 의해 시험하였다.
면역학적 판독
61개의 fHbp var 1.x, var 2, 또는 var 3을 보유하는 엔. 메닌기티디스 균주 및 참조 벡세로 항원 균주 패널에 대해 인간 보체를 이용하는 혈청 살박테리아성 검정법 (hSBA)에 의해 기능성 항체를 측정하였다.
SBA는 인간에서 엔. 메닌기티디스에 대한 방어와 상관관계를 갖는 것으로서 허용된 유일한 것이다.
결과
체액성
반응 -
rSBA에
의해 측정된 기능성 항체
엔. 메닌기티디스 균주의 보체 매개 사멸을 일으킬 수 있는 상이한 벡세로 제제에 의해 유발된 기능성 항체를 측정하기 위해, 3차 백신접종 후 2주째 수집된 혈청을 약 60개의 엔. 메닌기티디스 균주 패널에 대한 보체 공급원으로서 인간 토끼 혈청을 이용하는 혈청 살박테리아성 활성 검정법 (hSBA)에서 풀로서 시험하였다.
총 수의 선택된 네이세리아 균주를 3개의 상이한 균주 패널 fHbp var 2 및 3, fHbp var 1.x 및 벡세로 참조 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주로 나누었다.
● 벡세로 대비 본 발명의 fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질을 포함하는 제제의 부가 가치를 보여주기 위해 50개 균주를 선택하였다:
o fHbp var2 또는 var3을 보유하는 20개 균주
■ 선택은 fHbp 빈도 분포에 기초하였고, fHbp v2.16, v2.19, v2.21, v2.24, v3.116, v3.31 및 v3.42를 보유하는 균주를 포함하였다.
o fHbp var1.x를 보유하는 30개 균주
■ 기존 벡세로 갭을 처리하고, fHbp var1의 전체 유전자 다양성을 샘플링하기 위해 선택을 수행하였고, fHbp v1.1, v1.4, v1.13, v1.15, v1.14, v1.10, v1.260, v1.510, v1.90, v1.275, v1.697, v1.226, v1.110, v1.249, v1.108, v1.227 및 v1.215를 보유하는 균주를 포함하였다.
● 벡세로 참조 균주 + 벡세로에 의해 커버되는 것으로 공지된 추가 균주(fHbp 1.1 및 1.4 포함)를 포함하는 벡세로 대비 본 발명의 fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질을 포함하는 제제의 비-열등성을 보여주기 위해 11개 균주를 선택하였다.
마우스에서의 면역원성 연구
벡세로 대비 본 발명의 fHbp 융합 단백질을 포함하는 제제의 부가 가치를 측정하기 위해, 백신접종받은 마우스로부터 수집된 혈청을, var1 (30개 균주) 및 var2/3 균주 (20개 균주)로 나누어진 총 50개의 MenB 균주에 대해 보체 공급원으로서 인간 혈장 존재 하에 풀로서 시험하였다 (hSBA). 특히, 벡세로에 의해 커버되지 않도록 50개 균주를 선택하였고, 그러므로, 모든 벡세로 항원에 대해 미스매칭된다. 본 결과는 도 13A 및 13B에 기록되어 있다.
도 13A 및 13B로부터 뚜렷이 드러나는 바와 같이, 본 발명의 fHbp 융합 단백질을 포함하는 제제가 var 2/3 균주에 대해 벡세로보다 더 우수한 성능을 보이고, 또한 var 1.x 균주 패널에 대해서도 벡세로보다 우수하다.
커버된 균주와 비-커버된 균주 구별을 돕기 위해, 새로운 임계값 256 (초기 임계치 64의 4배)을 선택하였다. 커버된 균주의 백분율을 계산하였고, 이는 도 14A 및 14B에 제시되어 있다.
이 그래프에 제시된 결과는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제제가 벡세로 단독인 것과 비교하였을 때, var2 및 3 균주 패널 둘 다에 대해 더 높은 적용범위를 제시하고 (도 14A), 벡세로와 비교하여 대다수의 변이체 1.x 균주에 대해 더 높은 적용범위를 유도하였다는 것 (도 14B)을 재차 입증한다.
마지막으로, 마우스에서 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주 패널에 대한 마우스 항혈청을 시험하여 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제제의 비-열등성을 또한 평가하였다 (도 15). hSBA에서 풀링된 마우스 혈청을 11개의 MenB 균주 패널에 대해 시험하여 비-열등성을 평가하였다.
도 15에 제시된 결과는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 모든 제제에 대해 벡세로와 비교하여 비-열등성이라는 것이 확증되었을 뿐만 아니라, 추가 fHbp 성분에 대한 항체의 추가 기여의 결과로서 균주 대부분에 대해 개선된 면역원성이 뚜렷이 나타났다는 것을 시사한다.
벡세로 항원의 특이적 면역원성이 새로운 융합 단백질의 첨가 시에도 보존된다는 것을 확증하기 위해, 4개의 벡세로 인디케이터 균주 패널 (fHbp var1.1의 경우, M14459; PorA P1.4의 경우, NZ98/254; NHBA의 경우, M4407; NadA의 경우, 96217)에 대해 보체 공급원으로서 새끼 토끼 보체를 이용하여 개별 마우스 혈청을 시험함으로써 (rSBA) 벡세로 대비 본 발명의 fHbp231.13_E211A/S216R 융합 단백질을 포함하는 제제의 비-열등성을 또한 평가하였다. 본 결과는 도 16 (A-D)에 기록되어 있다. 이 그래프에서, "벡세로 플러스 플러스"는 제제 벡세로 + fHbp 231.13_ E211A/S216R을 지칭한다.
토끼에서의
면역원성 연구
기존 벡세로 제제 및 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제제에 대한 풀링된 hSBA 데이터는 var2/3 균주 타입에 대해서는 도 17A에, 및 var.1.x 균주 타입에 대해서는 도 17B에 추가로 제시되어 있다. 파선 표시는 토끼 혈청의 경우, hSBA 임계치 16을 나타낸다.
본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질을 포함하는 모든 제제는 벡세로 단독과 비교하였을 때, var 2 및 3 균주에 대하여 개선된 적용범위를 제공하고, 벡세로 단독과 비교하였을 때, 대다수의 변이체 1.x 균주에 대하여 더 높은 hSBA 역가를 유도하였다.
상기 기재된 마우스 연구에서와 같이, 토끼 데이터를 분석하기 위한 새 임계치로서 값 256 (초기 임계치 64의 4배)을 선택하였다.
적용범위 분석을 수행하였고, 이는 도 18A (var2/3 균주의 경우) 및 도 18B (var1.x 균주의 경우)에 요약되어 있다. 본 결과를 통해 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질을 포함하는 제제가 벡세로 단독인 것보다 더 높은 백분율로 var2/3 균주를 커버할 수 있고, 벡세로 단독 및 벡세로 + 선행 기술의 fHbp 융합물 231.1_R41S (도 18에서 2-3-1S로 지칭) 둘 다의 것보다 더 높은 백분율로 v1.x 균주를 커버할 수 있다는 것이 확증된다.
마지막으로, 도 19에 기록된 바와 같이, 토끼에서 벡세로 참조 균주 및 fHbp var 1.1 및 1.4 균주를 포함하는 11개 균주 패널에 대해 토끼 항혈청을 시험하여 벡세로 대비로 본 발명에 따라 fHbp 융합 단백질을 포함하는 제제의 비-열등성을 확증하였다.
본 결과는 본 발명에 따른 fHbp 융합 단백질을 포함하는 모든 제제에 대해 비-열등성이 확증되었다는 것을 제시한다.
실시예
7:
hFH
트랜스제닉
마우스 모델에서
4CMenB
+ 23(S)1.13 NB 돌연변이체 대 4CMenB + 23(S)1.13 wt의 면역원성 평가
면역화 프로토콜
그룹 A = 4CMenB + fHbp 23(S)1.13 야생형
그룹 B = 4CMenB + fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R.
면역화된 마우스에서의 박테리아
챌린지
각 그룹으로부터 9마리의 마우스를 챌린지하였다 (샘플링 후 및 박테리아 챌린지 이후에 마우스 2마리: 그룹 A에서 1마리 및 그룹 B에서 1마리가 사망하였음). 혈청군 B 균주 MC58의 생체발광성 변이체를 이용하여 마우스를 i.p.로 챌린지하였다 (마우스 1마리당 500 μl 염수 중 107 CFU).
결과
감염 후 30 min 및 6h에 다이나믹 영상을 수행하였고, 총 광자/초를 점수화하고, 마우스 1마리당 총 광자/초 뿐만 아니라, 감염 6h 후 마우스 1마리당 총 광자/초/감염 0.5h 후 마우스 1마리당 총 광자/초의 비로서 표현하였다 (도 20).
마우스 1마리당 방출되는 총 광자를 계산하였고, 이는 도 21에 제시되어 있다. 그룹 둘 다에서, 비-감염된 마우스와 비교하였을 때, 신호는 유의적으로 감소되었다. 그룹 B의 마우스는 그룹 A와 비교하였을 때, 총 광자/초는 더 낮은 것으로 나타났지만, 도 21A에서 이러한 차이는 유의 수준 (p=0.2)에 도달하지는 못했다. 그러나, 분석이 신호의 비 6h/0.5h로서 표현된 경우 (도 21B), 차이는 유의적이다 (p=0.007) (만-휘트니 검정).
결론
도 20 및 21로부터 알 수 있는 바와 같이, 0.5시간과 비교하였을 때, 6시간 시점에 그룹 둘 다의 마우스에서 관찰된 감염 후 제거에 의해 입증되는 바와 같이, 제제 A 및 B 둘 다, 그로 면역화된 그룹 둘 다의 마우스는 MC58 챌린지로부터 방어되었다. 그에 반해, 비-면역화된 마우스는 챌린지 후 6시간째까지 감염을 제거하지 못했다. 그러나, 챌린지 후 제거는 4CMenB + fHbp 23(S)1.13 야생형으로 면역화된 그룹 A의 마우스와 비교하였을 때, 4CMenB + fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R로 면역화된 그룹 B의 마우스에서 더욱 크게 일어났다.
그러므로, 이러한 생체내 데이터는 본 발명의 비-결합 이중 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드를 함유하지 않는, 융합 폴리펩티드를 포함하는 등가의 조성물과 비교하였을 때, 본 발명에 따른 돌연변이화된 비-fH 결합 융합 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물의 면역원성이 개선되었다는 것을 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA
<120> Modified Meningococcal fHbp Polypeptides
<130> VB66548wo
<150> EP18188321.6
<151> 2018-08-09
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 1
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
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100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
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Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile
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Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 2
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr
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Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
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Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His
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Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys
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Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala
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Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MUTATED fhbp POLYPEPTIDE
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Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
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Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
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Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
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Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys
180 185 190
Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Asp Ala Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala
210 215 220
Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Ala Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245
<210> 4
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUTATED fhbp POLYPEPTIDE
<400> 4
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys
180 185 190
Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Asp Ala Lys Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala
210 215 220
Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245
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<211> 263
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 5
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85 90 95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100 105 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
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Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130 135 140
Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165 170 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180 185 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195 200 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210 215 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225 230 235 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245 250 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
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<211> 251
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 6
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys
85 90 95
Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp
100 105 110
Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly
115 120 125
Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val
130 135 140
Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly
145 150 155 160
Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys
165 170 175
Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala
180 185 190
Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val
195 200 205
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210 215 220
Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn
225 230 235 240
Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
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<213> Artificial Sequence
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<223> MUTATED fhbp POLYPEPTIDE
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Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys
85 90 95
Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp
100 105 110
Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly
115 120 125
Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val
130 135 140
Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly
145 150 155 160
Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys
165 170 175
Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala
180 185 190
Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val
195 200 205
Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Ile Phe Gly
210 215 220
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Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
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<213> Artificial Sequence
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<223> MUTATED fhbp POLYPEPTIDE
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1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg
35 40 45
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50 55 60
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115 120 125
Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val
130 135 140
Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly
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165 170 175
Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala
180 185 190
Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val
195 200 205
Leu Tyr Asn Gln Ala Ala Lys Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Ile Phe Gly
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Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn
225 230 235 240
Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
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<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUTATED fhbp POLYPEPTIDE
<400> 9
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys
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Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp
100 105 110
Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly
115 120 125
Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val
130 135 140
Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly
145 150 155 160
Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys
165 170 175
Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala
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Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val
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Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 10
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
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Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 11
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
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Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
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100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
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225 230 235 240
Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 12
<211> 247
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 12
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245
<210> 13
<211> 281
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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130 135 140
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys
165 170 175
Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp
180 185 190
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
195 200 205
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
210 215 220
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
225 230 235 240
Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
245 250 255
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
260 265 270
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Ile Pro Gln Asn
275 280 285
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
290 295 300
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
305 310 315 320
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
325 330 335
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
340 345 350
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr
355 360 365
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly
370 375 380
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His
385 390 395 400
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser
405 410 415
Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
420 425 430
Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp
435 440 445
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
450 455 460
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
465 470 475 480
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
485 490 495
Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
500 505 510
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
515 520 525
Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys Asn
530 535 540
Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
565 570 575
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu
580 585 590
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
595 600 605
Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val
610 615 620
Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
625 630 635 640
Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
645 650 655
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
660 665 670
Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His
690 695 700
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser
705 710 715 720
Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala
725 730 735
Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys
740 745 750
Gln
<210> 31
<211> 274
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 31
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Phe Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu
115 120 125
Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala
130 135 140
Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe
145 150 155 160
Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe
165 170 175
Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
180 185 190
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu
195 200 205
Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His
210 215 220
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala
260 265 270
Lys Gln
<210> 32
<211> 282
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 32
Met Asn Arg Thr Thr Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val
20 25 30
Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu
35 40 45
Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr
65 70 75 80
Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys
85 90 95
Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp
100 105 110
Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln
115 120 125
Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser
130 135 140
Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp
145 150 155 160
Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met
165 170 175
Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys
180 185 190
Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile
195 200 205
Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp
210 215 220
Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu
225 230 235 240
Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly
245 250 255
Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly
260 265 270
Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
275 280
<210> 33
<211> 254
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 33
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Gln
65 70 75 80
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100 105 110
Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys
225 230 235 240
Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 34
Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg
1 5 10
Claims (32)
- 서열식별번호: 4의 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드.
- 삭제
- v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 여기서 변이체 fHbp 서열은 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서이고, 여기서 v1 fHbp 폴리펩티드는 제1항에 따른 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드인 융합 폴리펩티드.
- 삭제
- 제3항에 있어서,
(a) v2 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 16의 아미노산 서열로 이루어지고/거나;
(b) v3 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 17의 아미노산 서열로 이루어지는 것인
융합 폴리펩티드. - 제3항에 있어서, v2 및 v3 서열, 및 v3 및 v1 서열이 글리신-세린 링커에 의해 연결된 것인 융합 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 글리신-세린 링커가 "GSGGGG"인 융합 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열로 이루어지는 융합 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 서열식별번호: 34의 N-말단 아미노산 서열을 추가로 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제1항의 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드, 또는 제3항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 플라스미드인 단리된 핵산 분자.
- 제10항의 핵산 분자로 형질전환된 단리된 숙주 세포주.
- 제10항의 핵산 분자로 형질전환된 재조합 숙주 세포이며, 여기서 숙주 세포는 박테리아인 재조합 숙주 세포.
- 제1항의 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드, 또는 제3항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 포함하는, 포유동물을 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) 감염에 대해 면역화시키는데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원, 및 수막구균 외막 소포 (OMV) 중 하나 이상을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 제15항에 있어서, 4CMenB 조성물을 포함하는 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y로부터의 접합된 피막 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 제17항에 있어서, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, C, W135 및 Y 각각으로부터의 접합된 피막 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 의약에서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 포유동물이 인간인 면역원성 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
EP18188321.6 | 2018-08-09 | ||
EP18188321.6A EP3607967A1 (en) | 2018-08-09 | 2018-08-09 | Modified meningococcal fhbp polypeptides |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011126863A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-13 | Children's Hospital & Research Center Oakland | Factor h binding proteins (fhbp) with altered properties and methods of use thereof |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011126863A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-13 | Children's Hospital & Research Center Oakland | Factor h binding proteins (fhbp) with altered properties and methods of use thereof |
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