KR102677058B1 - 식물 발현 바이러스유사입자를 이용한 바리과 신경괴사증 예방백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물체에서 바리과 어류 바이러스성 질병의 바이러스 유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 신경괴사바이러스 유사입자를 포함하는 백신조성물, 및 이의 제조방법을 제공하여 생산 비용을 줄일 수 있고, 종래 알려진 방법(동물 세포나 미생물에서 단백질을 생산 후 분리정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 차단할 수 있는 효과가 있으며 동물 세포가 필수적으로 포함하는 번역 후 변형 과정이 일어나는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 포함하고 있어 생리활성을 유지하는 단백질 생산이 가능하다.

Description

식물 발현 바이러스유사입자를 이용한 바리과 신경괴사증 예방백신 조성물 {Composition of a vaccine against nervous necrosis disease in grouper using virus-like particles produced by plant expression system}
본 발명은 엽록체로 표적화되는 식물체 발현용 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 식물체에서 분리된 NNV를 백신 조성물로 제조하고 엽록체 표적화 단백질과 NNV 캡시드 단백질이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물체에서 바리과 어류 바이러스성 질병의 바이러스 유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 신경괴사바이러스 유사입자를 포함하는 백신조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
신경괴사바이러스(nervous necrosis virus, NNV)는 Nodaviridae과, Betanodavirus속에 속하는 외피가 없는 형태의 바이러스이다. 노바바이러스과 내의 Betanodavirus 속에 속해 있는 어류 노다바이러스에 의해 유발된다. 이 질병은 유럽농어(Dice??ntrarchus labrax) 뿐만 아니라 줄무늬잭(Pseudocaranx dentex),대서양 넙치(Hippoglossus hippoglossus), 가자미(Scophthalmus maximus) 및 그루퍼 등 경제적으로 중요한 해양어류에 영향을 미친다
바이러스성 신경괴사 (Viral nervous necrosis, VNN)를 야기하는 신경괴사바이러스는 크기가 약 30nm이고, 비외피성 정20면체 RNA바이러스이다. 어류 노다바이러스는 바이러스 외피단백질 유전자 가변부(T4)의 염기서열에 따라 줄무늬잭 NNV (SJNNV), 자주복 NNV (TPNNV), 노랑가자미 NNV (BFNNV) 및 붉바리 NNV (RGNNV) 등 4종류의 유전형으로 구분된다.
신경괴사 바이러스는 현재 해양 환경에 널리 퍼져있으며, 170종 이상의 어종에서 감염 사례가 보고되어 있다. NNV에 감염된 어류는 중추신경계에 괴사로 인한 이상유영, 식욕부진과 같은 임상 징후 후 최종적으로 폐사에 이르게 된다.
상기 바이러스는 치어 단계에 치명적이며 80~100%의 폐사율을 나타내게 된다. 또한, 감염어의 척수, 척수신경절, 뇌(연수)의 신경조직에 현저한 공포변성이 관찰되고 있는데, 그 외의 조직에서는 병변이 보이지 않는다.
한편, 바리과 어류는 농어목 어류로 전 세계적으로 159종이 서식하는 것으로 보고되고 있으며, 기호도가 매우 높은 어종으로 고부가가치의 생산성을 지녔다. 우리나라에서는 제주도와 남해안에 자바리, 능성어, 붉바리, 홍바리 등 11종이 서식하고 있다.
바리과 어류는 뛰어난 식감 및 풍미로 인해 높은 인기를 가지고 있으며, 아시아권 국가에서 고급 식재로서 자리를 잡고 있으며, 이러한 인식을 바탕으로 바리과 양식산업은 빠르게 성장하였으며, 현재 홍콩, 일본, 대만, 싱가포르 등의 아시아권 국가에서 양식을 하고 있다.
우리나라에서는 2000년대부터 바리과 어류 양식이 도입 및 활성화되어 능성어, 붉바리, 자바리, 3종을 중심으로 양식을 진행하고 있다. 하지만 국내 바리과 양식산업에서 질병으로 산업적, 경제적 피해가 발생하고 있으며, 종묘생산단계인 치어에서 높은 폐사율을 나타내는 NNV의 치료 및 예방법 구축 및 설립이 필요하다.
백신은 바이러스성 질병을 효과적으로 예방할 수 있는 방법이며, 포르말린/열처리 불활화백신, 재조합 단백질 백신, DNA 백신, 생백신 및 바이러스 유사 입자(VLP)백신와 같은 기술을 이용한 백신 연구가 수행되어 있다. 하지만 국내에서 바리과 어류의 NNV 예방이 가능한 백신 개발 및 상용화는 이루어져 있지 않은 실정이다.
바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)는 다양한 질병 원인체에 대한 백신 개발에 활용되고 있으며, 질병 원인체에 대하여 감염성을 나타내지 않으며, 면역원으로서 효과적인 바이러스 단백질이 결합된 입자이다.
최근에는 동물세포나 미생물을 대체할 수 있는 유용생리활성 물질 생산방법으로 식물 발현시스템을 이용한 단백질 생산방법이 주목을 받고 있다. 식물세포는 단백질로의 번역(translation) 후 변형(modification)이 동물세포에서 이루어지는 것과 매우 유사하여 정확하게 복합 단백질(Multimeric protein)을 생성할 수 있고, 당단백질의 경우 당화(Glycosylation)가 되어 있는 형태로 분리할 수 있어 원래의 단백질과 동일한 형태의 변형을 갖는 단백질을 수득할 수 있는 이점이 있다.
식물 기반 단백질 발현 시스템은 의약품 생산에 널리 이용되고 있으며, 단백질 생산시 발생될 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 해당 유용물질의 수요가 급증할 때 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템 대비 절대적으로 유리하여 생산 비용 및 소비가 낮은 점, 대장균 단백질 생산법 대비 더 효과적인 단백질 생산이 가능한 것과 같은 친환경적인 점을 바탕으로 더 효과적으로 항원 단백질을 생산하는데 장점들을 가지고 있다.
이에 본 발명은 식물 발현시스템을 이용하여 생산한 붉바리 신경괴사바이러스 유사 입자(RGNNV-VLP)를 이용하여 바리과 어류를 대상으로 한 식물 발현시스템을 이용한 바리과 어류 바이러스성 질병 예방백신의 조성물과 이를 포함하는 백신을 제공하고자 한다.
국내 공개특허번호 제10-2023-0032679호에는 Potato virus X 유래 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 코딩 서열; TGBs (triple gene blocks)기능상실 돌연변이체 코딩 서열; 목적 단백질 코딩 서열 삽입을 위한 MCS (multiple cloning site) 및 CP (coat protein) 유전자의 C-말단 서열;을 포함하는 발현 카세트 1, 및 RNA 침묵억제 단백질(viral suppressor of RNAsilencing) 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트 2를 포함하는, 식물체에서 목적 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1782692호에는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 능성어 신경괴사증 바이러스의 외피 단백질 DNA의 ORF를 포함하는 재조합 DNA 분자와 서열번호 4의 염기 서열을 갖는, 클로닝된 능성어 신경괴사바이러스 RNA2의 재조합 DNA로부터 발현되는 폴리펩타이드와 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 상기의 재조합 DNA 분자로부터 폴리펩타이드를 발현시켜 제조한 어류 신경괴사증 바이러스에 대한 백신에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1414009호에는 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물, 상기 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제 및 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허번호 제10-2021-0117808호에는 목적 단백질(target gene)의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭 및 유전자 침묵 억제 인자(gene silencing suppressor)인 p38의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭를 제조한 후, 상기 컨스트럭를 함께 가지는 식물 세포에서의 일과성 발현용(transient expression) 바이너리 벡터(binary vector)를 제조한 후, 상기 바이너리 벡터를 단일 아그로박테리움 배양을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 목적 단백질을 식물 잎 세포에서 높은 수준의 단백질을 생산하는 방법에 관하여 개시하고 있다.
본 발명은 바리과 어류의 NNV 예방이 가능한 백신 개발이 미흡하고 동물세포 및 미생물에서 단백질 발현 중 나타나는 상기 문제점을 해결하기 위해, 엽록체로 표적화되는 식물체 발현용 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 식물체에서 분리된 NNV를 백신 조성물로 제조하고 엽록체 표적화 단백질과 NNV 캡시드 단백질이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 NNV(nervous necrosis virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리 히스티딘 태그(Polyhistidine-Tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 Linker를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 담배 속(Nicotiana genus) 식물체를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예로서 (S1) 상기 식물체 발현용 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계; (S2) 상기 (S1)단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 NNV 캡시드 단백질을 분리 정제하는 단계; (S3) 상기 (S3)단계에서 수득한 바이러스 유사입자를 포함하는 백신조성물을 제조하는 단계를 포함하는 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)를 포함하는 백신 조성물의 제조방법일 수 있다. 상기 백신 조성물의 제조방법으로 발현된 바리과 어류 바이러스성 질병 백신의 재조합 항원 단백질일 수 있고, 상기 백신조성물에는 면역보조제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바리과 어류 바이러스성 질병의 백신 조성물일 수 있다.
본 발명은 생산 비용을 줄일 수 있고, 종래 알려진 방법(동물 세포나 미생물에서 단백질을 생산 후 분리정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원을 원천 차단할 수 있는 효과가 있으며 동물 세포가 필수적으로 포함하는 번역 후 변형 과정이 일어나는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 포함하고 있어 생리활성을 유지하는 단백질 생산이 가능하다.
도 1은 식물체(Nicotiana benthamiana) RGNNV의 CP를 발현을 위한 재조합 식물 발현 벡터를 나타낸다.
도 2는 실시예에 따른 분리 및 정제한 식물 단백질의 SDS-PAGE 사진을 나타낸다.
도 3은 실시예에 따른 투과전자현미경을 통해 관측한 RGNNV-VLP의 사진을 나타낸다.
도 4는 실험예에 따른 붉바리 백신 접종 후 NNV 인위감염실험 결과를 나타낸다.
도 5는 실험예에 따른 능성어 백신 접종 후 NNV 인위감염실험 결과를 나타낸다.
도 6은 실험예에 따른 붉바리의 ELISA를 이용한 항체가 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예에 따른 능성어의 ELISA를 이용한 항체가 측정 결과를 나타낸다.
본 발명은 어류의 신경괴사바이러스(nervous necrosis virus, NNV)의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 삽입된 식물체 재조합 발현벡터를 제공한다. 또한, 상기 어류는 바리과 어류인 것일 수 있다. 본 발명은 폴리히스티딘 태그와 엽록체로 표적화시키는 루비스코 트랜짓 펩타이드가 NNV 캡시드 단백질에 융합된 재조합 단백질을 발현하는 식물발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 지칭하는 용어 "루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCo transit peptide)"는, 루비스코(Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase) 스몰 서브유닛(small subunit)의 N-말단 트랜짓 펩타이드(N-terminal transit peptide)를 지칭하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에서 지칭하는 용어, "트랜짓 펩타이드(transit peptide)" 또는 "신호 펩타이드(signal peptide)"는, 특정 세포소기관, 세포 구획, 세포외 외수송부로의 단백질의 수송 또는 국지화를 유도할 수 있는 염기 서열을 지칭한다. 이 용어는 트랜짓 펩타이드 및 트랜짓 펩타이드를 암호화하는 염기서열 모두를 포함한다.
본 발명에서 지칭하는 용어, 신경괴사바이러스(nervous necrosis virus, NNV)는 Nodaviridae과, Betanodavirus속의 크기가 약30nm이고, 비외피성 정20면체 RNA바이러스이며 어류 노다바이러스는 바이러스 외피단백질 유전자 가변부(T4)의 염기서열에 따라 줄무늬잭 NNV (SJNNV), 자주복 NNV (TPNNV), 노랑가자미 NNV (BFNNV) 및 붉바리 NNV (RGNNV) 등 4종류의 유전형으로 구분된다.
본 발명에서 지칭하는 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 발명에서 지칭하는 용어, "벡터(vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 유전체(genome) 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
본 발명의 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, NNV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오 타이드는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리 히스티딘 태그(Polyhistidine-Tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리히스티딘-태그는 본 발명의 목적 단백질인 PCV2 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 프로모터와 종결자 사이에 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, NNV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오 타이드, 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되는 것일 수 있으나 연결순서에 제한되는 것은 아니다.
상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터,CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있다.
상기 종결자는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 종결자, 파세올린 종결자, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 종결자, 대장균의 rrnB1/B2 종결자 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예로서, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 본 발명에서 지칭하는 용어, "형질전환(transformation)"은 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환 식물체(transgenic plant)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 식물체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 식물체이며, 상기 식물체는 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것이라면 제한이 없다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation), 또는 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명에서 지칭하는 용어, "백신(vaccine)"은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다.
본 발명에서 지칭하는 용어, "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 지칭하는 용어 "식물체"는, 본 발명의 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 니코티아나 벤타미아나 L.(Nicotiana benthamiana L.) 또는 니코티아나타바쿰 cv. 잔티(Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 등의 품종을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 식물 발현시스템을 이용한 바리과 어류 바이러스성 질병 예방백신의 조성물과 관련한 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실시예 1> RGNNV-VLP 발현 플라스미드 제작
도 1은 식물체(Nicotiana benthamiana)에서 RGNNV의 CP(coat protein, capsid protein)의 발현을 위한 재조합 식물 발현 벡터를 나타낸다. 본 실시예에 따른 식물체인 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 RGNNV의 CP(coat protein) 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, NNV CP의 단백질 서열을 확보하고, 식물체에서 발현에 최적화된 서열로 NNV CP 단백질 코딩 유전자를 합성하였다.
엽록체 타겟팅을 위한 RbcS TP(rubisco small subunit transit peptide)인 NR(New RbcS TP)을 코딩하는 유전자, NNV CP를 코딩하는 유전자, 펩타이드 링커를 코딩하는 유전자, 그리고 10X His tag를 코딩하는 유전자를 순서대로 연결하고, pTEX벡터의 MacT 프로모터 와 RD29B 터미네이터 사이에 삽입하여 벡터를 완성하였다. 이후, 삽입된 서열의 확인이 완료된 후, 전기충격법(electroporation)을 통해 아그로박테리아에 형질전환을 실시하였다.
<실시예 2> Nicotiana benthamiana 일과성 발현
형질 전환된 아그로박테리아는 YEP배지(kanamycin 50 ug/ml)에서 28℃조건으로 16시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 아그로박테리아는 2500 × g 에서 원심분리 후, MMA 용액(10 mM MES, pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone)에 600 nm의 파장에서 흡광도(O.D)값이 0.5가 되도록 재부유 시켰다.
이후, 인필트레이션(infiltration)과정을 수행하기 전에 상온에서 1h 동안 반응시켰으며, 이후 재부유된 용액은 6주령의 N. benthamiana에 압력-인필트레이션(pressure-infiltration)을 수행하였다.
<실시예 3> SDS-PAGE 및 Western blot
상기 실시예 2에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펠릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 CP 단백질의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다.
그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, NNV 코트(coat) 단백질과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 NNV 코트(coat) 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 재조합 CP 단백질이 높은 효율로 발현되었음을 확인하였고, 발현된 재조합 CP 단백질의 대부분이 수용성 구획(S)에서 확인되었다.
<실시예 4> RGNNV-VLP의 추출
상기 실시예 2에 따라 준비된 N. benthamiana의 잎에 추출 용액(50 mM Tris-Cl pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mM Sodium sulfite, 1.5% PVPP, 1 mM PMSF(DMSO))을 넣고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 30분간 교반하고, 5,000 x g로 4℃에서 90분간 원심 분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 단백질 추출액으로부터 재조합 CP 단백질의 분획을 위해 황산 암모늄 침전법을 실시하였다.
상기 추출액을 교반시키면서 40% 황산 암모늄 용액을 동일 부피로 분당 40 mL 첨가한 다음 15분간 교반하였다. 교반이 완료되면 5,000 x g로 4℃에서 30분간 원심 분리하여 펠릿(침전된 CP 단백질)을 확보하였다.
펠릿은 1x PBS 용액으로 용해시켜주고, 용해되지 않은 식물 불순물은 5,000 x g로 4℃에서 15분간 원심 분리하여 제거하고 상층액만 회수하였다. 회수한 상층액은 0.45 μm와 0.2 μm 필터를 하여 최종 재조합 CP 단백질을 분획하였다.
<실시예 5> 투과전자현미경을 통한 VLP의 구조 확인
상기 실시예 4에 따라 준비된 CP 단백질 분획은 plastic and carbon-coated copper 그리드에 흡착시킨 후, 세척을 하였다. 이후 2% (w/v) uranyl acetate를 15-30초 동안 반응시켜 염색하였다. VLP가 흡착된 그리드는 FEI Tecnai G2 20 Twin TEM w/bottom-mounted digital camera를 이용하여 촬영하였다.
도 3은 투과전자현미경을 통해 관측한 RGNNV-VLP의 사진을 나타낸다. 투과 전자현미경을 통해 관측한 결과, 200 nm 크기 범위로 확인하였을 때, 아그로박테리아의 표면에 부착되어있는 VLP 형태를 관찰할 수 있었다.
<실험예 1> 붉바리 및 능성어의 백신 접종
백신 접종을 위한 실험어는 각 다음의 지역에서 구입하였다. 제주도에 위치한 양식장으로부터 평균 무게 35 g(14 cm)의 붉바리를 구입하였다. 전라남도에 위치한 양식장으로부터 평균 무게 8 g(6 cm)의 능성어를 구입하였다. 백신 접종에 앞서, 구입한 붉바리 및 능성어의 NNV 감염 여부를 NNV-항혈청을 이용하여 확인하였다.
구입한 붉바리와 능성어는 1주일간의 순치과정을 거쳤으며, 300 L의 수조에 평균 수온은 25 ± 1 ℃의 여과된 해수를 이용하여 유수식 환경으로 사육하였다. 사육기간동안 하루에 두번 사료를 급이하였다. 순치 후, 붉바리와 능성어는 3개의 그룹으로 나누었으며, 2개의 그룹은 서로 다른 농도의 VLP 백신을 접종하였으며, 1개의 그룹은 대조구로서 PBS를 접종하였다. 백신 및 PBS는 주사법을 이용하여 접종하였다. 표 1은 백신의 조성을 나타낸다. 백신 1차 접종 3주 후, 붉바리는 부스터 접종을 실시하였다.
붉바리 및 능성어 백신의 조성물
어종 100μL 내 VLP 농도 면역보조제
붉바리 2μg 2.5% squalene
0.25% Tween80
0.25% Span85
5μg
능성어 1μg
2μg
<실험예 2> NNV 인위감염실험
인위감염실험에 사용할 바이러스 균주는 2008년 여수에서 분리한 균주를 이용하였으며, SSN-1 세포주에 10%의 fetal bovine serum(FBS), 100 units of penicillin/ml, and 100 μg of streptomycin/ml가 포함된 Leibovitz's L15배지를 이용하여 25℃에서 배양하였다. 바이러스가 포함된 세포의 상등액을 수집하여, tissue culture infectious dose를 기반으로한 감염 역가를 측정하였다. 인위감염을 위해 1E+7 TCID50/fish의 농도를 이용하였다.
붉바리 백신 부스터 접종 3주후, 0.1 ml의 바이러스를 복강 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 붉바리는 3주간 임상증상 및 폐사 동향을 확인하였다. 능성어 백신 1차 접종 3주후, 0.1 ml의 바이러스를 복강 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 능성어는 3주간 임상증상 및 폐사 동향을 확인하였다.
인위감염후 3주간 체색 흑화, 이상유영, 무리에서 벗어난 독단유영 및 폐사체는 수거하였다. 수거된 개체의 뇌조직을 적출하여 NNV의 감염을 RNA를 분리 및 RT-PCR을 통해 NNV 감염을 확인하였다.
도 4는 붉바리 백신 접종 후 NNV 인위감염실험 결과를 나타내고 하기의 표 2는 붉바리의 인위감염실험의 최종 폐사율 및 상대생존율 결과를 나타낸다. 붉바리 및 능성어의 인위감염실험결과는 다음과 같다. 붉바리 백신 부스터 접종군의 대조군의 최종폐사율은 66.7%, RGNNV-VLP 2 μg 접종 그룹은 13.3%, RGNNV-VLP 5 μg 접종 그룹은 13.3%으로 나타났으며, 상대생존율은 RGNNV-VLP 2 μg 접종 그룹 80%, RGNNV-VLP 5 μg 접종 그룹 80%로 나타났다.
붉바리의 인위감염실험의 최종 폐사율 및 상대생존율 결과
인위감염농도 실험구 최종폐사율 최종상대생존율
부스터
접종		 1E+7 TCID50/fish Control 66.7% -
RGNNV-VLP 2 μg 13.3% 80.0%
RGNNV-VLP 5 μg 13.3% 80.0%
도 5는 능성어 백신 접종 후NNV 인위감염실험 결과를 나타내고, 하기의 표 3은 능성어의 인위감염실험의 최종 폐사율 및 상대생존율 결과를 나타낸다. 능성어 백신 1회 접종군의 대조군의 최종폐사율은 95.0%, RGNNV-VLP 1 μg 접종 그룹은 50%, RGNNV-VLP 2 μg 접종 그룹은 13.3%로 나타났으며, 상대생존율은 RGNNV-VLP 1 μg접종 그룹 71.4%, RGNNV-VLP 2 μg 접종 그룹 85.7%로 나타났다.
능성어의 인위감염실험의 최종 폐사율 및 상대생존율
인위감염농도 실험구 최종폐사율 최종
상대생존율
1회
접종		 1E+7 TCID50/fish Control 93.3% -
RGNNV-VLP 1 μg 26.7% 71.4%
RGNNV-VLP 2 μg 13.3% 85.7%
<실험예 3> 백신 접종 후 항체가 측정
붉바리 백신 1차 접종 3주 후 및 부스터 접종 3주후, 혈액 샘플링을 실시하였으며, 샘플링된 혈액은 냉장(4℃) 보관을 통해 혈액이 응집된 후, 4℃, 3,500×g에서 15분간 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 수집된 혈청을 이용하여 ELISA 기법을 통해 항체가를 측정하였다.
능성어 백신 1차 접종 3주 후, 혈액 샘플링을 실시하였으며, 샘플링된 혈액은 냉장(4℃) 보관을 통해 혈액이 응집된 후, 4℃, 3,500×g에서 15분간 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 수집된 혈청을 이용하여 ELISA 기법을 통해 항체가를 측정하였다.
도 6은 붉바리의 ELISA를 이용한 항체가 측정 결과를 나타낸다. 접종 후의 혈청을 이용한 ELISA의 결과, 붉바리의 RGNNV-VLP 백신 내에 포함된 VLP량이 높아질수록 더 높은 항체가가 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 대조구 대비 더 높은 항체가를 나타내었다.
도 7은 능성어의 ELISA를 이용한 항체가 측정 결과를 나타낸다. 능성어의 항체가 확인 결과, 접종 시, 항체가는 백신에 포함된 VLP량에 따라 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 대조구 대비 더 높은 항체가를 나타내었다.
본 발명은 식물체에서 바이러스 유사 입자를 발현하는 재조합 벡터와 백신조성물을 제공하여 상품화 단계에서 동물세포 및 박테리아와 달리 종자로서 관리와 대량생산이 용이한 바 효율적이고 경제적이기 때문에 관련 산업이에 이윤 창출을 도모함으로 산업상 이용가능성이 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 NNV(nervous necrosis virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리 히스티딘 태그(Polyhistidine-Tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 Linker를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체 발현용 재조합 벡터
  2. 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 NNV(nervous necrosis virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물체 발현용 재조합 벡터
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1 또는 청구항 2의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체
  6. 청구항 5에 있어서 형질전환체는 형질전환 식물체로서, 담배 속(Nicotiana genus) 식물인 것을 특징으로 하는, 형질전환체
  7. 하기의 단계를 포함하는, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)를 포함하는 바리과 어류 바이러스성 질병의 백신 조성물 제조방법;
    (S1) 청구항 1 또는 청구항 2의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
    (S2) 상기 (S1)단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 NNV 캡시드 단백질을 분리 정제하는 단계;
    (S3) 상기 (S2)단계에서 수득한 바이러스 유사입자를 포함하는 백신조성물을 제조하는 단계
  8. 청구항 7의 방법으로 제조된 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)를 포함하는 바리과 어류 바이러스성 질병의 백신 조성물
  9. 청구항 8에 있어서 상기 백신조성물에는 면역보조제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바리과 어류 바이러스성 질병의 백신 조성물
  10. 제7항의 방법으로 발현된 바리과 어류 바이러스성 질병 백신의 재조합 항원 단백질
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KR20210117808A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 포항공과대학교 산학협력단 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법

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국내 공개특허번호 제10-2021-0117808호에는 목적 단백질(target gene)의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭 및 유전자 침묵 억제 인자(gene silencing suppressor)인 p38의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭를 제조한 후, 상기 컨스트럭를 함께 가지는 식물 세포에서의 일과성 발현용(transient expression) 바이너리 벡터(binary vector)를 제조한 후, 상기 바이너리 벡터를 단일 아그로박테리움 배양을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 목적 단백질을 식물 잎 세포에서 높은 수준의 단백질을 생산하는 방법에 관하여 개시하고 있다.
국내 공개특허번호 제10-2023-0032679호에는 Potato virus X 유래 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 코딩 서열; TGBs (triple gene blocks)기능상실 돌연변이체 코딩 서열; 목적 단백질 코딩 서열 삽입을 위한 MCS (multiple cloning site) 및 CP (coat protein) 유전자의 C-말단 서열;을 포함하는 발현 카세트 1, 및 RNA 침묵억제 단백질(viral suppressor of RNAsilencing) 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트 2를 포함하는, 식물체에서 목적 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1782692호에는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 능성어 신경괴사증 바이러스의 외피 단백질 DNA의 ORF를 포함하는 재조합 DNA 분자와 서열번호 4의 염기 서열을 갖는, 클로닝된 능성어 신경괴사바이러스 RNA2의 재조합 DNA로부터 발현되는 폴리펩타이드와 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 상기의 재조합 DNA 분자로부터 폴리펩타이드를 발현시켜 제조한 어류 신경괴사증 바이러스에 대한 백신에 관하여 개시하고 있다.

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