KR102674299B1 - Development of skin aging biomarker or anti-aging molecule using modulation of microRNA-10a, 30c and 451a - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 노화를 효과적으로 예측 및 진단할 수 있는 바이오마커로 사용 가능한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 피부 노화세포에서 특이적으로 과발현되는 엑소좀 유래 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a를 이용한 피부 노화 진단용 조성물 및 피부 노화 예측 또는 진단 방법을 제공하며, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상을 억제하는 억제제를 포함하는 피부 노화 개선용 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.The present invention relates to microRNA-10a, 30c, and 451a that can be used as biomarkers to effectively predict and diagnose skin aging. More specifically, the present invention relates to exosome-derived microRNAs that are specifically overexpressed in skin aging cells. -Provides a composition for diagnosing skin aging and a method for predicting or diagnosing skin aging using microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, and inhibits any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. It is possible to provide a pharmaceutical composition for improving skin aging, a cosmetic composition, or a cosmetic composition for improving wrinkles containing an inhibitor that does.
Description
본 발명은 피부 노화를 효과적으로 예측 및 진단할 수 있는 피부 노화 진단용 바이오마커로서 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a에 관한 것으로, 이를 이용한 피부 노화 진단용 조성물 및 피부 노화 예측 또는 진단 방법, 상기 바이오마커의 억제제를 이용한 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물, 피부 주름 개선용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a as skin aging diagnostic biomarkers that can effectively predict and diagnose skin aging, and a composition for diagnosing skin aging and a method for predicting or diagnosing skin aging using the same. , a composition for preventing or improving skin aging using an inhibitor of the biomarker, a composition for improving skin wrinkles, and a screening method thereof.
노화란 나이 증가에 따른 신체의 기능 및 구조의 생리학적 기능 감소를 의미하며, 노화가 진행될 경우 외부 병원체에 대한 방어기능 감소 및 종양 유전자 활성 등 여러 감염병 및 질병에 대한 감수성이 증가한다. 외부의 자극에 쉽게 노출되는 피부는 노화 진행이 빠르며 노화 진행에 따른 주름 생성 및 탄력 감소가 잘 알려져 있다. 최근 외적인 요소들이 주목받음에 따라 노화의 정도 및 진행 상태가 잘 반영되는 피부의 노화 방지 및 억제를 위한 다양한 화장품 조성물이 요구되고 있다. Aging refers to a decline in the physiological function of the body's functions and structures as age increases. As aging progresses, susceptibility to various infectious diseases and diseases, such as decreased defense function against external pathogens and tumor gene activity, increases. Skin that is easily exposed to external stimuli ages rapidly, and it is well known that wrinkles and elasticity decrease as aging progresses. As external factors have recently received attention, there is a demand for various cosmetic compositions to prevent and suppress skin aging that reflect the degree and progress of aging.
노화에 따른 세포 대사 및 기능 변화는 다양한 세포 모델에서 수행되어 보고되었다. 정상세포에 비해 노화 세포는 세포 주기 억제를 유도하는 p16과 p21, p53의 발현 증가에 따른 세포 분열 속도 및 횟수가 감소되어있다. p16과 p21, p53을 포함한 노화 관련 분비 표현형(senescence associated secretory phenotype, SASP)에 속하는 특정 사이토카인, 성장인자, 단백질분해효소들의 발현 및 분비량은 노화세포에서 증가되어 있다. 또한 정상 세포에 의해 크기가 비대해지는 형태학적 변화가 일어나며 세포내 불필요 물질을 분해하는 리소좀의 크기 증가와 정상 리소좀에 비해 높은 pH로 인한 리소좀의 기능 저하가 보고되었다. 이러한 리소좀의 기능 변화를 측정하는 실험 기법인 senescence associated(SA) β-gal staining이 노화 수준 측정에 이용되며 노화 세포의 경우 정상 세포에 비해 β-gal staining이 증가 되어있다. Changes in cellular metabolism and function due to aging have been conducted and reported in various cell models. Compared to normal cells, senescent cells have a reduced rate and number of cell divisions due to increased expression of p16, p21, and p53, which induce cell cycle inhibition. The expression and secretion of specific cytokines, growth factors, and proteolytic enzymes belonging to the senescence associated secretory phenotype (SASP), including p16, p21, and p53, are increased in senescent cells. In addition, it has been reported that normal cells undergo morphological changes that enlarge their size, increase the size of lysosomes that decompose unnecessary substances in cells, and deteriorate the function of lysosomes due to higher pH compared to normal lysosomes. Senescence associated (SA) β-gal staining, an experimental technique that measures changes in the function of lysosomes, is used to measure the level of aging, and in senescent cells, β-gal staining is increased compared to normal cells.
피부 노화의 경우 크게 외인성 노화와 내인성 노화로 구분된다. 외인성 노화(stress-induced senescence)란 시간에 관계없이 외부의 자극에 의한 노화를 의미하며, 자외선 혹은 활성산소와 같은 외부 스트레스에 의한 DNA 손상 및 염색체의 말단 부분에 존재하는 말단소체의 길이 단축의 경우 유도된다. 내인성 노화(replicative senescence)의 경우 시간에 흐름에 따라 자연스럽게 진행되는 나이 듦 혹은 세포 수준에서의 계대배양을 통해 유도되는 노화를 의미한다. Skin aging is largely divided into extrinsic aging and intrinsic aging. Extrinsic aging (stress-induced senescence) refers to aging caused by external stimuli regardless of time. In the case of DNA damage caused by external stress such as ultraviolet rays or active oxygen and shortening of the length of telomeres present at the ends of chromosomes. It is induced. In the case of intrinsic aging (replicative senescence), it refers to aging that progresses naturally over time or aging induced through subculture at the cellular level.
현재 외인성 피부 노화 방지를 위한 자외선 차단 기능성 화장품의 개발 등이 이루어지고 있으나, 내인성 피부 노화 방지를 위한 해결책은 아직 부족하며, 따라서 내인성 피부 노화를 예방하거나 노화된 피부를 개선시키기 위한 노력이 필요하다.Currently, the development of UV-blocking functional cosmetics to prevent extrinsic skin aging is being conducted, but solutions for preventing intrinsic skin aging are still lacking, and therefore efforts are needed to prevent intrinsic skin aging or improve aged skin.
최근 전 세계의 많은 연구기관들이 주목하고 있는 엑소좀(exosome)은 세포 내에서 분비되는 작은 소포체 extracellular vesicles의 일종으로, 크기가 30~200nm에 해당한다. 특히 세포 간의 신호 교환 수단이자 각종 질병의 바이오마커로서, 최근 엑소좀에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 엑소좀 안에는 세포에서 유래된 다양한 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA) 등이 포함되어 있고 세포 간의 정보 전달 등에 관여하기 때문에 생물학 및 병리학 연구의 새로운 도구로서 각광받고 있다.Exosomes, which have recently been attracting attention from many research institutes around the world, are a type of small extracellular vesicles secreted within cells and range in size from 30 to 200 nm. In particular, as a means of signal exchange between cells and a biomarker for various diseases, research on exosomes has recently been actively conducted. Exosomes contain various proteins and genetic materials (DNA, mRNA, and miRNA) derived from cells and are involved in information transfer between cells, so they are attracting attention as a new tool in biology and pathology research.
엑소좀은 그 안에 마이크로RNA(microRNA)라는 조절성 RNA를 가지고 있는데 이것이 세포간의 상호작용을 조절하는 중요한 역할을 한다. 최근 노화를 조절하는 주요 인자로 마이크로RNA 에 대한 관심이 높은데 마이크로RNA는 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 암호화되지 않은 non-coding RNA 로서 전사 이후의 단계에서 상보적인 messager RNA의 발현을 방해하거나 분해함으로써 30% 이상의 단백질 생산 유전자 발현을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 이러한 노화와 관련된 마이크로RNA는 다양한 기관의 노화에 따른 질환 예방 및 치료를 위한 물질로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.Exosomes contain regulatory RNA called microRNA, which plays an important role in regulating interactions between cells. Recently, there has been a lot of interest in microRNA as a major factor regulating aging. MicroRNA is a short non-coding RNA consisting of about 22 base sequences that interferes with the expression of complementary messager RNA or decomposes it at the post-transcriptional stage. It is well known to regulate the expression of more than 30% of protein-producing genes. Therefore, it is expected that these aging-related microRNAs can be useful as substances for preventing and treating diseases caused by aging in various organs.
이에, 본 발명자들은 사람 피부 섬유아세포로부터 분리된 엑소좀 유래의 특정 마이크로RNA가 피부 노화 특이적으로 발현이 증가됨을 확인하였고, 상기 마이크로RNA의 억제제에 의해 피부 노화가 감소됨을 확인함으로써, 상기 마이크로RNA를 피부 노화의 진단 및 치료를 위한 신규 타겟으로서 이용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors confirmed that the expression of a specific microRNA derived from exosomes isolated from human skin fibroblasts was increased specifically for skin aging, and that skin aging was reduced by an inhibitor of the microRNA, thereby confirming that the microRNA The present invention was completed by discovering that it can be used as a new target for diagnosis and treatment of skin aging.
본 발명의 목적은 피부 노화 진단용 조성물 및 피부 노화 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a composition for diagnosing skin aging and a method for providing information for predicting or diagnosing skin aging.
본 발명의 다른 목적은 피부 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 피부 노화 억제 또는 개선용 화장료 조성물 및 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin aging, a cosmetic composition for inhibiting or improving skin aging, and a composition for improving skin wrinkles.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 노화 억제 또는 개선용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for screening substances for inhibiting or improving skin aging.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above purpose,
본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 피부 노화 진단용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for diagnosing skin aging comprising a substance that measures the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a는 엑소좀 유래인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a may be derived from exosomes.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a는 hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-30c-5p 및 has-miR-451a인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a may be hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-30c-5p, and has-miR-451a. .
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 물질은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the material may be a primer, probe, or antibody specific for any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
또한, 본 발명은 (a) 개체의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a의 발현 수준에 비해 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 피부 노화 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of (a) measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a from a biological sample of an individual; and (b) the expression level of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is increased compared to the expression level of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in the normal control sample. Provides a method of providing information for predicting or diagnosing skin aging, including the step of confirming that the present invention has occurred.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction)으로 수행하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the measurement may be performed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction or real time-polymerase chain reaction.
나아가, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin aging, comprising an inhibitor of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a as an active ingredient.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 억제 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting or improving skin aging, comprising as an active ingredient any one or more inhibitors of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 억제제는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현, 전사 또는 활성을 억제하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may inhibit the expression, transcription, or activity of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 억제제는 MMP-1 효소의 발현, 전사, 분비 또는 활성을 억제함으로써 피부 노화를 억제 또는 개선하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may inhibit or improve skin aging by inhibiting the expression, transcription, secretion or activity of the MMP-1 enzyme.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for improving skin wrinkles, which includes an inhibitor of at least one of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a as an active ingredient.
더 나아가, 본 발명은 (a) 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상이 발현되는 피부 세포에 분석하고자 하는 시료를 처리하는 단계; (b) 상기 피부 세포 내에서 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현양이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우에 상기 시료는 피부 노화 억제 또는 개선용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 피부 노화 억제 또는 개선용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention includes the steps of (a) processing a sample to be analyzed in skin cells expressing any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a; (b) measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in the skin cells; and (c) as a result of the measurement in step (b), if the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is reduced compared to the control group that did not treat the sample, the sample was applied to the skin. Provided is a method for screening a substance for suppressing or improving skin aging, comprising determining the substance for suppressing or improving aging.
사람 정상 피부 섬유아세포의 기능적인 변화로 인해 발생하는 피부 노화를 엑소좀 유래 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 발현 변화 분석을 통해 미리 예측 및 진단할 수 있고 이의 억제제를 이용하여 피부 노화 예방 또는 개선 및 피부 주름 개선에 도움이 될 수 있다.Skin aging caused by functional changes in normal human skin fibroblasts can be predicted and diagnosed in advance by analyzing changes in the expression of exosome-derived microRNA-10a, 30c, and 451a, and their inhibitors can be used to prevent or improve skin aging. It can help improve skin wrinkles.
도 1은 정상 피부 섬유아세포에서 계대배양을 통한 세포노화 유도를 β-gal 염색, 웨스턴 블롯, ELISA 및 실시간 PCR을 통해 확인한 도이다.
도 2는 피부 정상 또는 노화가 유도된 섬유아세포 배양액에서 분리된 엑소좀의 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 차세대 시퀀싱 기술을 통한 사람 피부 섬유아세포 유래 엑소좀 마이크로RNA 분석 기법에 의해 가장 유의미하게 변화된 마이크로RNA 발현양을 비교한 도이다.
도 4는 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 또는 억제제를 정상 피부 섬유아세포에 트랜스펙션 한 후, 이에 따른 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체를 정상 피부 섬유아세포에 트랜스펙션 한 후, 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 타겟 유전자 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 6은 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체를 정상 피부 섬유아세포에 트랜스펙션 한 후, 세포내 노화 유도 효과를 β-gal 염색 및 MMP-1 발현분석(ELISA)을 통해 확인한 도이다.
도 7은 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제를 노화가 유도된 피부 섬유아세포에 트랜스펙션 한 후, 세포 노화 개선 효과를 β-gal 염색 및 MMP-1 발현 분석(ELISA)을 통해 확인한 도이다.Figure 1 is a diagram confirming the induction of cellular senescence through subculture in normal skin fibroblasts through β-gal staining, Western blot, ELISA, and real-time PCR.
Figure 2 is a diagram showing the results of analyzing the characteristics of exosomes isolated from normal skin or aging-induced fibroblast culture medium.
Figure 3 is a diagram comparing the most significantly changed microRNA expression levels by the exosome microRNA analysis technique derived from human skin fibroblasts using next-generation sequencing technology.
Figure 4 is a diagram showing the results of confirming changes in the expression of microRNA-10a, 30c, and 451a after transfection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogs or inhibitors into normal skin fibroblasts.
Figure 5 is a diagram showing the level of target gene expression of microRNA-10a, 30c, and 451a after transfection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogues into normal skin fibroblasts.
Figure 6 is a diagram showing the intracellular aging-inducing effect after transfection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogues into normal skin fibroblasts through β-gal staining and MMP-1 expression analysis (ELISA).
Figure 7 is a diagram confirming the cell aging improvement effect through β-gal staining and MMP-1 expression analysis (ELISA) after transfection of microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors into aging-induced skin fibroblasts. .
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 명세서에서 miRNA 및 miR은 마이크로RNA(microRNA)를 나타내는 것으로, "miRNA", "miR", "microRNA" 및 "마이크로RNA"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.As used herein, the terms "miRNA" and "miR" refer to microRNA, and "miRNA", "miR", "microRNA" and "microRNA" may be used interchangeably.
본 발명에서 용어, "마이크로RNA(microRNA, miRNA, miR)"는 생물의 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 작은 RNA를 의미하며, 타겟 mRNA 3'UTR(untranslated region)과의 상보적인 염기쌍 배열에 의한 타겟 mRNA 번역의 억제를 통해, 유전자 발현 과정에서 중요한 조절 역할을 할 수 있는 20~25개의 뉴클레오티드를 포함하는 작은 RNA이다. 상기 microRNA는 증식, 분화, 세포사멸 등을 포함하는 세포 기능에 있어서 중요한 역할을 하며, 모든 동물에 존재하는 진화적으로 보존된 조절물질로서, 일부 microRNA는 그 프로모터 부위와 관련된 후성유전학적 조절 기작(히스톤 변형, DNA 메틸화 등)을 통해 유전자 발현 조절을 일으킨다고 알려져 있다.In the present invention, the term "microRNA (microRNA, miRNA, miR)" refers to a small RNA that plays a role in controlling gene expression in organisms, and is generated by complementary base pairing with the target mRNA 3'UTR (untranslated region). It is a small RNA containing 20 to 25 nucleotides that can play an important regulatory role in the gene expression process through inhibition of target mRNA translation. The microRNA plays an important role in cellular functions including proliferation, differentiation, and apoptosis, and is an evolutionarily conserved regulator present in all animals. Some microRNAs have epigenetic regulatory mechanisms associated with their promoter regions ( It is known to regulate gene expression through histone modification, DNA methylation, etc.).
본 발명자들은 사람 정상 피부 섬유아세포에서 계대배양을 통해 세포노화를 유도한 후 특이적으로 분비되는 엑소좀 유래 마이크로RNA를 차세대 생명정보 시퀀싱 기술을 통해서 분석한 결과, 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 발현양이 노화 특이적으로 증가함을 확인하였고, 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 투여 시 사람 정상 피부 섬유아세포에서 피부 노화와 관련된 특이적인 특성이 유도됨을 확인하였으며, 반대로 사람 노화 피부 섬유아세포에서 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 투여 시 피부 노화와 관련된 특이적인 특성이 감소하는 것을 확인함으로써, 엑소좀 유래 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 중 어느 하나 이상을 피부 노화 진단 및 예측을 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실을 확인하였고, 이들 억제제를 피부 노화 예방 또는 치료용 약학 조성물, 피부노화 억제 또는 개선용 화장료 조성물 또는 주름 개선용 화장료 조성물 등으로 사용할 수 있음을 확인하였다.The present inventors analyzed exosome-derived microRNAs specifically secreted after inducing cellular senescence in human normal skin fibroblasts through subculture using next-generation bioinformation sequencing technology, and as a result, microRNAs-10a, 30c, and 451a were found. It was confirmed that the expression level increased specifically for aging, and that specific characteristics related to skin aging were induced in human normal skin fibroblasts when microRNA-10a, 30c, and 451a analogs were administered, and conversely, in human aged skin fibroblasts. By confirming that specific characteristics related to skin aging were reduced when microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors were administered, any one or more of exosome-derived microRNA-10a, 30c, and 451a were identified as markers for diagnosing and predicting skin aging. It was confirmed that they can be used, and it was confirmed that these inhibitors can be used in pharmaceutical compositions for preventing or treating skin aging, cosmetic compositions for inhibiting or improving skin aging, or cosmetic compositions for improving wrinkles.
따라서, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 피부 노화 진단용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for diagnosing skin aging comprising a substance for measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명에서 상기 피부 노화는 내인성 노화를 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, the skin aging may mean intrinsic aging, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 피부 노화는 피부 섬유아세포의 노화일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, the skin aging may be aging of skin fibroblasts, but is not limited thereto.
본 발명에서, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a는 엑소좀 유래인 것일 수 있다.In the present invention, the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a may be derived from exosomes.
본 발명에서 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포체를 의미한다. 엑소좀은 직경이 대략 30-200 nm 로 알려져 있고 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀의 대표적인 발현 마커로는 CD9, ALIX, CD63 가 해당된다.In the present invention, “exosome” refers to a small endoplasmic reticulum with a membrane structure secreted from various cells. Exosomes are known to be approximately 30-200 nm in diameter and refer to vesicles that are released into the extracellular environment after fusion of a multivesicular body and the plasma membrane. Representative expression markers of exosomes include CD9, ALIX, and CD63.
본 발명에서, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a는 hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-30c-5p 및 has-miR-451a인 것일 수 있다.In the present invention, the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a may be hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-30c-5p, and has-miR-451a.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하는 것일 수 있다.In the present invention, the expression level of the gene may preferably mean the mRNA level at which the gene is expressed, that is, the amount of mRNA.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 물질은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체인 것일 수 있다. In the present invention, the substance capable of measuring the expression level may be a primer, probe, or antibody specific for any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 전체 또는 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.In the present invention, the primer or probe may be a primer or probe capable of specifically amplifying the entire or specific region of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, and the primer or probe may be Can be designed through methods known in the art.
본 발명에서 상기 "프라이머"란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 예를 들어, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 각각의 프라이머는 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.In the present invention, the term "primer" refers to a single primer that can serve as the starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and polymerization enzymes) at a suitable temperature and in a suitable buffer. -Means strand oligonucleotide. The appropriate length of the primer may vary depending on various factors, such as temperature and the intended use of the primer. In addition, the sequence of the primer does not need to be completely complementary to a partial sequence of the template; it is sufficient to have sufficient complementarity within the range where the primer can hybridize with the template and perform its original function. Therefore, the primer in the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the nucleotide sequence of the template gene, but it is sufficient to have sufficient complementarity within the range to hybridize to the gene sequence and function as a primer. For example, each primer of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a may include base sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, but is not limited thereto. Additionally, it is preferable that the primer according to the present invention can be used in a gene amplification reaction.
상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative real time-polymerase chain reaction; qRT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.The "amplification reaction" refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule, and amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction ( reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative real time-polymerase chain reaction (qRT-PCR), ligase chain reaction (LCR), electron-mediated amplification (TMA), nucleic acid sequencing Substrate amplification (NASBA) may be included.
본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides, can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, and is capable of hybridizing naturally to a target nucleotide sequence. It refers to something that exists or has been artificially synthesized. The probe according to the present invention may be a single chain, preferably an oligodeoxyribonucleotide. Probes of the invention may include native dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), nucleotide analogs, or derivatives. Additionally, the probe of the present invention may also contain ribonucleotides. For example, the probes of the invention may contain backbone modified nucleotides, such as peptide nucleic acids (PNAs) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, phosphoroamidate DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-O-methyl RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexyl. Tall DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines (substituents are fluoro-, bromo-, chloro-, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, ethyl-, 7-deazapurine with a C-7 substituent (including tityl-, propynyl-, alkynyl-, thiazoryl-, imidazoryl-, pyridyl-) (substituents are fluoro-, bromo-, chloro- , iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, thiazoryl-, imidazoryl-, pyridyl-), inosine and diaminopurine. .
또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.In addition, in the present invention, substances that can measure the level of the protein may include antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies that can specifically bind to the protein.
상기 "항체"는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.The “antibody” can be manufactured using techniques known to those skilled in the art. For example, in the case of polyclonal antibodies, the antigen of the protein is injected into an animal and blood is collected from the animal. It can be produced by a method well known in the art to obtain serum containing antibodies, and these polyclonal antibodies can be produced from any animal host species such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs, etc. It is possible to manufacture. In the case of monoclonal antibodies, they can be prepared using a hybridoma method (Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976) well known in the art, or a phage antibody library ( Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991). Additionally, antibodies according to the invention may comprise intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2, and Fv.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 피부 노화 진단용 조성물을 포함하는 피부 노화 진단용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for diagnosing skin aging comprising the composition for diagnosing skin aging according to the present invention.
본 발명의 피부 노화 진단용 키트는 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상 및 이의 표적 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA, 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.The skin aging diagnosis kit of the present invention includes an antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA capable of measuring the mRNA or protein level of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c and microRNA-451a and their target genes, It may include primers, probes, or antibodies, and their definitions are as described above.
상기 표적 유전자는 마이크로RNA-10a의 타겟 유전자인 EPHA4와 마이크로RNA-30c 타깃 유전자인 RUNX2 및 마이크로RNA-451a의 타깃 유전자인 IL6R를 의미하는 것일 수 있다.The target gene may refer to EPHA4, a target gene of microRNA-10a, RUNX2, a target gene of microRNA-30c, and IL6R, a target gene of microRNA-451a.
본 발명의 피부 노화 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 피부 노화 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.If the kit for diagnosing skin aging of the present invention is applied to a PCR amplification process, the kit of the present invention optionally contains reagents necessary for PCR amplification, such as buffer, DNA polymerase (e.g., Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus ( Tth), thermostable DNA polymerase obtained from Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactor, and dNTPs, and the kit for diagnosing skin aging of the present invention can be used in immunoassay. If applicable, the kit of the invention may optionally include a secondary antibody and a labeled substrate.
나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.Furthermore, the kit according to the present invention can be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the above-mentioned reagent components.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 방법을 통해 피부 노화 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은 (a) 개체의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a의 발현 수준에 비해 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.In addition, the present invention provides a method of providing information for predicting or diagnosing skin aging through a method of measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a according to the present invention. Preferably, the method includes (a) measuring the expression level of one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a from a biological sample of an individual; and (b) the expression level of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is increased compared to the expression level of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in the normal control sample. It may include a step to confirm that something has been done.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.The method of measuring the expression level of a gene or the amount of a protein described above may be performed including a known process of isolating mRNA or protein from a biological sample using a known technique.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체"는 피부 노화가 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.In the information provision method of the present invention, the term "individual" refers to humans, primates including chimpanzees, pets such as dogs and cats, and livestock such as cows, horses, sheep, and goats that are likely to develop or have skin aging. It is interpreted to include mammals such as animals, rodents such as mice and rats.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 피부 노화의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 피부 세포일 수 있다.In the present invention, the "biological sample" refers to a sample collected from a living body in which the expression level of the gene or the level of the protein is different from the normal control group depending on the occurrence or progression of skin aging. The sample includes, for example, Although not limited thereto, tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, etc. may be included, and preferably skin cells.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR), RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 수행하는 것일 수 있다.The expression level of the gene is preferably measured by measuring the level of mRNA. Methods for measuring the level of mRNA include reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), These include, but are not limited to, RNase protection assays, Northern blot, and DNA chips. In one embodiment of the present invention, the measurement may be performed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) or real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR).
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.The protein level can be measured using antibodies. In this case, the marker protein in the biological sample and the antibody specific for it form a complex, that is, an antigen-antibody complex, and the amount of the antigen-antibody complex formed is determined by the detection label. It can be measured quantitatively through the size of the signal (detection label). These detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto. Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation, These include complement fixation analysis, FACS, and protein chips.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 양, 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 확인 대상 개체의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 양, 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 피부 노화 여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.Therefore, the present invention, through the above detection methods, determines the expression amount of any one or more of control microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, the mRNA expression amount of the marker gene, or the amount of protein and the microRNA of the subject to be identified. -10a, the expression level of one or more of microRNA-30c and microRNA-451a, the mRNA expression level of the marker gene, or the protein level can be confirmed, and the level of expression can be compared with the control group to determine whether or not the skin is aging, and at what stage it is progressing. Alternatively, prognosis, etc. can be predicted and diagnosed.
보다 구체적으로 상기 피부 노화를 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준이 정상 대조군 시료에 비해 증가하고, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 각각의 표적 유전자인 EPHA4, RUNX2 및 IL6R 중 어느 하나 이상의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준 또는 활성이 정상 대조군 시료에 비해 감소되었을 경우, 피부 노화가 유발된 것으로 판단할 수 있다.More specifically, the method for predicting or diagnosing skin aging includes increasing the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a according to the present invention compared to a normal control sample, and the microRNA- 10a, when the gene expression level or protein expression level or activity of any one or more of the target genes EPHA4, RUNX2, and IL6R among microRNA-30c and microRNA-451a is decreased compared to the normal control sample, skin aging is induced. It can be judged that
나아가, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin aging, comprising an inhibitor of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a as an active ingredient.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 억제 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting or improving skin aging, comprising as an active ingredient any one or more inhibitors of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a.
본 발명에서 상기 억제제는 세포 내에서 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현, 전사 또는 활성을 억제하는(감소시키는) 제제를 의미하는 것일 수 있고, 구체적으로는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 직접적으로 작용하거나 또는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 의미한다.In the present invention, the inhibitor may refer to an agent that inhibits (reduces) the expression, transcription, or activity of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in cells, and specifically, By acting directly on any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c and microRNA-451a or indirectly on any one or more upstream regulators of microRNA-10a, microRNA-30c and microRNA-451a Reduce the expression of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a at the transcription level, or increase the degradation of any one or more of expressed microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. It refers to an agent that reduces the expression level or activity of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a by increasing or interfering with its activity.
마이크로RNA는 대부분 염색체 상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며, 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha) 등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태(pre-miRNA)로 바뀐 후 엑스포틴(exportin)에 의해서 핵을 빠져나와 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 내외 길이의 성숙된 형태로 바뀌게 되고 이는 RISC(RNA interference silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다. 본 발명의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제는 이러한 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상이 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 감소시키거나, 활성을 억제할 수 있다.Most microRNAs are embedded in introns on chromosomes. After transcription, they are processed by Drosha and others to change into a precursor form (pre-miRNA), and then exit the nucleus by exportin (Dicer). Dicer) changes it into a mature form about 22bp in length, which binds to RISC (RNA interference silencing complex) to exhibit its function. The inhibitor of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a of the present invention is involved in a pathway in which any one or more of these microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is activated and functions. Thus, the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a can be reduced or the activity can be inhibited.
본 발명에서 이용할 수 있는 억제제는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제 활성을 가진 물질이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다. 바람직하게는, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머, 리보자임 및 화합물 등을 사용할 수 있다.The inhibitor that can be used in the present invention can be used without particular limitation as long as it is a substance with inhibitory activity of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, and can be applied to cells through standard techniques known in the art. It may be a biological molecule, such as a nucleic acid or polypeptide, a compound, a bacterium, or an extract isolated from a plant or animal that can be processed. Preferably, any one of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is an antisense oligonucleotide that binds complementary to the base sequence of at least one of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. One or more specific siRNAs, RNA aptamers, ribozymes, and compounds can be used.
본 발명에서 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 상기 siRNA는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 특이적으로 작용하여 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the term "siRNA" is a nucleic acid molecule that can mediate RNA interference or gene silencing, and is used as an efficient gene knockdown method or gene therapy method because it can suppress the expression of a target gene. do. The siRNA is a small RNA fragment of 21-25 nucleotides in size that is produced by cutting double-stranded RNA with a dicer. It can specifically bind to mRNA with a complementary sequence and inhibit its expression. For the purpose of the present invention, it specifically acts on any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a to cleave any one or more molecules of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. By inducing an RNA interference (RNAi) phenomenon, any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a can be suppressed. siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for producing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art can be used. For example, a method of directly chemically synthesizing siRNA, a method of synthesizing siRNA using in vitro transcription, and a method of cutting long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using enzymes. , expression methods through intracellular delivery of shRNA expression plasmids or viral vectors, and expression methods through intracellular delivery of PCR (polymerase chain reaction)-induced siRNA expression cassettes, but are not limited thereto.
본 발명에서 용어, "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 결합하여 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.In the present invention, the term “aptamer” refers to a single-stranded oligonucleotide, about 20 to 60 nucleotides in size, and a nucleic acid molecule that has binding activity to a given target molecule. It has a variety of three-dimensional structures depending on its sequence, and can have high affinity for specific substances, like an antigen-antibody reaction. An aptamer can inhibit the activity of a certain target molecule by binding to it. The aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may also be in a linear or circular form. Preferably, the aptamer binds to any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a and serves to inhibit the activity of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. can do. Such an aptamer can be prepared by a person skilled in the art from any one or more sequences of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a by a known method.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열을 의미한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 프로세스 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고 기능을 저해시킬수 있다. 성숙된 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프(stem-loop) 구조)를 가질 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전구체 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 분자의 단일가닥 단편에 상보적이거나, 성숙된 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 분자에 상보적일 수 있다.In the present invention, the term “antisense oligonucleotide” refers to a base sequence that binds complementary to and inhibits expression of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. The antisense oligonucleotide of the present invention binds complementary to a single-stranded fragment of one or more molecules of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in the cell, thereby By reducing the process efficiency of one or more of -451a, their expression can be suppressed and their function can be inhibited. Mature miRNA molecules exist primarily as single strands, but precursor miRNA molecules may have partially self-complementary structures (e.g., stem-loop structures) that may form predominantly double-stranded portions. . The antisense oligonucleotide of the present invention is complementary to a single-stranded fragment of any one or more molecules of precursor microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, or mature microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA. It may be complementary to any one or more molecules of -451a.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 핵산에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 염기서열에 상보적일 수 있고, 이들 자체적으로 루프를 형성하여 루프를 형성하는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상에도 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다 상기 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있다.The antisense oligonucleotide of the present invention binds to any one or more nucleic acids of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a through RNA-RNA, RNA-DNA, and RNA-PNA (protein nucleic acid) interaction, It is a non-enzymatic nucleic acid compound that modifies activity, and one continuous sequence may be complementary to any one or more base sequences of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, and they themselves form a loop. It can bind to any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a that form a loop. In addition, the antisense oligonucleotide of the present invention is double-stranded or single-stranded DNA, double-stranded or single-stranded RNA, DNA/ The oligonucleotides may include RNA hybrids, DNA and RNA analogs and oligonucleotides with base, sugar or backbone modifications. The oligonucleotides may be prepared by methods known in the art to increase stability and resistance to nuclease degradation. It can be transformed.
본 발명의 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.Antisense oligonucleotides that bind complementary to any one or more base sequences of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a of the present invention can be prepared using standard molecular biology techniques, for example, chemical synthesis methods or recombinant methods. It can be separated or manufactured. The antisense oligonucleotide preferably has a length of 15 to 40 nucleotides.
본 발명에서 용어, "리보자임(ribozyme)"은 효소 활성이 있는 RNA 분자를 의미하는 것으로서, 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 생체 내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용 가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 본 발명의 목적상 RNA 기질을 절단할 수 있다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.In the present invention, the term “ribozyme” refers to an RNA molecule with enzymatic activity, and refers to a nucleic acid molecule capable of catalyzing a chemical reaction intramolecularly or between molecules. Ribozymes that can be used in the present invention include nucleases based on ribozymes found in natural systems or different types of ribozymes that catalyze nucleic acid polymerase-type reactions, and can be engineered to catalyze specific reactions in vivo. Ribozymes that are processed can also be used. Ribozymes can cleave RNA or DNA substrates, and for the purposes of the present invention may cleave RNA substrates. Ribozymes typically cleave nucleic acid substrates through recognition and binding of the target substrate and subsequent cleavage. Since this recognition is mostly based on base pair interactions, it may have the feature of enabling target-specific cleavage.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제는, 예를 들어, 서열번호 7 내지 9로 표시되는 염기서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.According to one embodiment of the present invention, the inhibitor of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a of the present invention is, for example, any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 7 to 9. It may include one or more, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제의 세포 내로의 도입은 당업계에 알려진 일반적인 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 및 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있다.In the present invention, any one or more inhibitors of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a can be introduced into cells using general methods known in the art, but are not limited to microinjection, It can be performed using calcium phosphate co-precipitation, electroporation, and liposome methods.
본 발명에서, 상기 억제제는 MMP-1 효소의 발현, 전사, 분비 또는 활성을 억제함으로써 피부 노화를 예방, 억제, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.In the present invention, the inhibitor may prevent, suppress, improve or treat skin aging by inhibiting the expression, transcription, secretion or activity of the MMP-1 enzyme.
본 발명에 따른 상기 피부 노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). The pharmaceutical composition for preventing or treating skin aging according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. In the above, “pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration, such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, etc., and carriers for parenteral administration, such as water, suitable oils, saline solutions, aqueous glucose and glycols, etc. and may additionally contain stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. As for other pharmaceutically acceptable carriers, those described in the following literature may be referred to (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용 되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated in a suitable form according to methods known in the art along with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various forms for parenteral or oral administration according to known methods, and a representative example of the formulation for parenteral administration is an isotonic aqueous solution or suspension as an injectable formulation. Injectable formulations can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be dissolved in saline solution or buffer solution and formulated for injection. Additionally, dosage forms for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills, and capsules.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition formulated in the manner described above can be administered in an effective amount through various routes including orally, transdermally, subcutaneously, intravenously, or intramuscularly. The term “administration” refers to introducing a predetermined substance into a patient by any appropriate method. This means that the substance can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
또한, 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 피부 노화 억제제, 예방 또는 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 억제제, 예방 또는 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.In addition, the "effective amount" above refers to the amount that exhibits a preventive or therapeutic effect when administered to a patient. The dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the type and severity of the patient's disease, age, gender, weight, sensitivity to the drug, type of current treatment, administration method, target cells, etc., and may vary depending on the field of the art. can be easily determined by experts. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in combination with a conventional skin aging inhibitor, prevention or treatment agent, can be administered sequentially or simultaneously with a conventional skin aging inhibitor, prevention or treatment agent, and can be administered singly or multiple times. Preferably, considering all of the above factors, the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects can be administered, more preferably 1 to 10,000 ㎍/kg of body weight/day, and even more preferably 10 to 1,000 mg. The effective dose is /kg body weight/day and can be administered repeatedly several times a day.
본 발명에 따른 상기 피부 노화 억제 또는 개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 화장수, 영양로션, 영양크림, 수분크림, 마사지크림, 에센스, 페이스트, 마스크팩, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형인 것일 수 있다. 상기한 성분 이외의 다른 성분들은 기타 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.The cosmetic composition for suppressing or improving skin aging according to the present invention can be manufactured in any formulation commonly manufactured in the art, for example, lotion, nutritional lotion, nutritional cream, moisture cream, massage cream, essence, It may be one or more formulations selected from the group consisting of paste, mask pack, patch, gel, cream, lotion, powder, soap, cleanser, oil, foundation, makeup base, wax, and spray. Ingredients other than those mentioned above can be appropriately selected and mixed by a person skilled in the art according to other formulations or purposes of use without difficulty.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 오일, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.The cosmetic compositions include, for example, solutions, gels, solid or pasty anhydrous products, emulsions obtained by dispersing the oil phase in the water phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules, or ionic (liposome), non-ionic vesicular dispersants. It may be provided in the form of cream, skin, lotion, oil, powder, ointment, spray or concealer stick. Additionally, it can be prepared in the form of foam or in the form of an aerosol composition further containing compressed propellant.
또한, 상기 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.In addition, the cosmetic composition further contains fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ionic or non-ionic. Ionic emulsifiers, fillers, sequestering and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or any other ingredients conventionally used in cosmetics. It may contain auxiliaries commonly used in the same cosmetic field. These auxiliaries are introduced in amounts commonly used in the field of cosmetology.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can be used alone or in combination, or can be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention. Additionally, the cosmetic composition according to the present invention can be used according to conventional usage methods, and the number of uses can be varied depending on the user's skin condition or preference.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for improving skin wrinkles, which includes an inhibitor of at least one of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a as an active ingredient.
상기 피부 주름 개선용 조성물은 피부 주름 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물일 수 있고, 각 용어의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.The composition for improving skin wrinkles may be a pharmaceutical composition for preventing or treating skin wrinkles or a cosmetic composition for preventing or improving skin wrinkles, and the definitions of each term are as described above.
또한, 본 발명의 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현을 억제시킴으로서, 피부 노화 또는 피부 주름을 예방, 억제, 개선 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.In addition, by suppressing the expression of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a of the present invention, a method for preventing, suppressing, improving, or treating skin aging or skin wrinkles can be provided.
더 나아가, 본 발명은 (a) 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상이 발현되는 피부 세포에 분석하고자 하는 시료를 처리하는 단계; (b) 상기 피부 세포 내에서 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현양이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우에 상기 시료는 피부 노화 억제 또는 개선용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 피부 노화 억제 또는 개선용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention includes the steps of (a) processing a sample to be analyzed in skin cells expressing any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a; (b) measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a in the skin cells; and (c) as a result of the measurement in step (b), if the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a is reduced compared to the control group that did not treat the sample, the sample was applied to the skin. Provided is a method for screening a substance for suppressing or improving skin aging, comprising determining the substance for suppressing or improving aging.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상, 유전자 또는 단백질을 포함하는 피부 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기 "시료"는 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현양, 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현양, 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 피부 노화를 억제 또는 개선시킬 수 있는 물질로 판단할 수 있다.According to the screening method of the present invention, the sample to be analyzed can first be contacted with skin cells containing any one or more genes or proteins among the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. Here, the "sample" is screened to determine whether it affects the expression level, gene expression level, protein amount, or protein activity of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a. refers to an unknown substance used in The sample may include, but is not limited to, chemicals, oligonucleotides, antisense-RNA, siRNA (small interference RNA), shRNA, or natural product extract. Thereafter, the expression level of the gene, the amount of protein, or the activity of the protein can be measured in the sample-treated cells, and as a result of the measurement, the expression of any one or more of the microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a If an increase or decrease in the amount, gene expression level, protein amount, or protein activity is measured, the sample can be judged to be a substance that can inhibit or improve skin aging.
상기에서 마이크로RNA-10a, 마이크로RNA-30c 및 마이크로RNA-451a 중 어느 하나 이상의 발현양, 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.In the above, the method of measuring the expression level of any one or more of microRNA-10a, microRNA-30c, and microRNA-451a, gene expression level, protein amount, or protein activity is performed through various methods known in the art. It may be, for example, but not limited to, reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real time-polymerase chain reaction, Western blot, Northern blot, ELISA ( It can be performed using enzyme linked immunosorbent assay, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and immunoprecipitation assay.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
실시예 1. 사람 정상 피부 섬유아세포에서 계대배양을 통한 세포 노화 유도Example 1. Induction of cell aging through subculture in human normal skin fibroblasts
1-1. 사람 피부 섬유아세포의 계대배양1-1. Subculture of human skin fibroblasts
사람 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 세포 노화를 유도하기 위해, 계대배양을 실시하였다.To induce cellular senescence in human dermal fibroblasts (HDF), subculture was performed.
구체적으로, 사람피부 유래 섬유아세포는 ATCC(USA)에서 구입하여, RPMI-1640 Medium (Corning, NY, USA)에 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)과 1% Penicillin/Streptomycin solution이 첨가된 배양액 조건에서 배양하였다. 세포가 배양용 플라스크에 약 80% 찼을 때 0.25% Trypsin-EDTA (Invitrogen, USA)를 이용하여 세포를 떼어낸 후 1200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 새 배지를 이용하여 세포를 재현탁한 후, 1:3의 비율로 새 배지에 배양하였다.Specifically, human skin-derived fibroblasts were purchased from ATCC (USA) and cultured in RPMI-1640 Medium (Corning, NY, USA) with 10% fetal bovine serum and 1% Penicillin/Streptomycin solution. Cultured under conditions. When the culture flask was about 80% filled with cells, the cells were removed using 0.25% Trypsin-EDTA (Invitrogen, USA) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. The cells were resuspended using new medium and then cultured in new medium at a ratio of 1:3.
1-2. 사람 피부 섬유아세포의 노화 유도 여부 분석1-2. Analysis of whether aging is induced in human skin fibroblasts
사람 피부 섬유아 세포 (HDF)모델에서 계대배양을 통한 세포 노화 유도 후, 정상 세포(NS)와 노화 세포(S)에서 다양한 세포 노화 지표를 통해 노화유도여부를 검증하였다.After inducing cell aging through subculture in the human skin fibroblast (HDF) model, the induction of aging was verified through various cell aging indicators in normal cells (NS) and senescent cells (S).
먼저, 노화 수준 측정 실험 기법 중 하나인 senescence associated β-gal staining(β-gal 염색)을 수행하였다. 정상(NS) 및 노화(S) HDFs를 PBS 500 μL로 2회 세척한 다음 4% paraformaldehyde 고정액을 이용하여 15분간 상온에서 고정화하였다. 고정화한 HDFs는 PBS 500 μL로 2회 세척하고 Senescence β-Galactosidase Staining Kit (Cell signaling, USA)를 이용하여 SA-β-gal staining buffer [40 mM citric acid/phosphate(pH 6.0), 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 160mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/mL 5-bromo-4-chloro3-indolyl-β-d-galactopyranoside in dimethylformamide] 300 μL를 첨가하여 CO2가 없는 37℃에서 HDFs를 16시간 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.First, senescence associated β-gal staining, one of the experimental techniques for measuring the level of aging, was performed. Normal (NS) and aged (S) HDFs were washed twice with 500 μL of PBS and then fixed at room temperature for 15 minutes using 4% paraformaldehyde fixative. The immobilized HDFs were washed twice with 500 μL of PBS and stained with SA-β-gal staining buffer [40 mM citric acid/phosphate (pH 6.0), 5 mM K 3 using the Senescence β-Galactosidase Staining Kit (Cell signaling, USA). CO 2 by adding 300 μL of Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 160mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/mL 5-bromo-4-chloro3-indolyl-β-d-galactopyranoside in dimethylformamide]. HDFs were stained for 16 hours at 37°C in the absence of heat and then observed under an optical microscope.
분석 결과, 정상세포에 비해 노화세포에서 β-gal staining이 증가함을 확인하였고, 정상 세포에 비해 노화 세포의 크기가 증가하였다(도 1A).As a result of the analysis, it was confirmed that β-gal staining increased in senescent cells compared to normal cells, and the size of senescent cells increased compared to normal cells (Figure 1A).
1-3. 웨스턴 블랏 분석1-3. Western blot analysis
정상(NS) 및 노화(S) HDFs를 프로티아제 및 포스팟타이제 저해제를 첨가한 RIPA buffer(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 μL로 용해한 세포 용해액을 4℃, 12,000Хg, 15분간 원심분리하여 상층액을 취하였으며, BCA의 방법으로 동량의 단백질 20μg 을 포함한 시료를 10% SDS-PAGE에 전기영동하였다. Gel에 분자량 별로 분리된 단백질을 PVDF membrane에 이동시킨 후 5% skim milk가 함유된 TBS-T (tris-buffered saline, 0.1% Tween 20)로 상온에서 1시간 blocking 하고 TBS-T를 이용하여 10분씩 3회 세척하였다. 일차 항체 β-actin(Santa Cruz, Dallas, TX, USA), p21(Santa Cruz), p53(Santa Cruz)과 이차 항체(Santa Cruz)는 5% Bovine serum albumin (BSA)가 함유된 TBS-T로 녹인 후 각각 4℃ 에서 16 시간, 상온에서 1시간 반응하였고 TBS-T를 이용하여 10분씩 3회 세척하였다. Membrane은 Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisher, Waltham, MA, USA)을 이용하여 각 단백질을 검출한 다음 화상분석시스템(Fusion Solo S, Vilber, Collegien, France)으로 현상하고 분석하였다.Normal (NS) and aged (S) HDFs were dissolved in 100 μL of RIPA buffer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) containing protease and phosphatase inhibitors, and the cell lysate was incubated at 4°C. The supernatant was collected by centrifugation at 12,000Хg for 15 minutes, and a sample containing an equal amount of 20 μg of protein was electrophoresed in 10% SDS-PAGE using the BCA method. Proteins separated by molecular weight on the gel were transferred to a PVDF membrane, blocked for 1 hour at room temperature with TBS-T (tris-buffered saline, 0.1% Tween 20) containing 5% skim milk, and then blocked for 10 minutes each using TBS-T. Washed 3 times. Primary antibodies β-actin (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), p21 (Santa Cruz), and p53 (Santa Cruz) and secondary antibodies (Santa Cruz) were grown in TBS-T containing 5% bovine serum albumin (BSA). After dissolving, the reaction was carried out at 4°C for 16 hours and at room temperature for 1 hour, respectively, and washed three times for 10 minutes each using TBS-T. Each protein was detected on the membrane using Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisher, Waltham, MA, USA), and then developed and analyzed using an image analysis system (Fusion Solo S, Vilber, Collegien, France).
정상 세포와 노화 세포에서 단백질 추출 후 웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현률을 측정한 결과, 세포노화에 따라 증가한다고 알려진 p21과 p53 단백질이 노화세포에서 증가하였다(도 2B).As a result of measuring protein expression rates through Western blotting after extracting proteins from normal and senescent cells, p21 and p53 proteins, which are known to increase with cellular aging, increased in senescent cells (Figure 2B).
1-4. 효소결합면역흡착검사1-4. Enzyme-linked immunosorbent test
정상 세포와 노화 세포에서 분비되는 사이토카인 및 케모카인 분비 수준을 효소결합면역흡착분석(Enzyme-linked Immunosorbent assay, ELISA)을 통해 측정한 결과, SASP에 속하는 염증유발성 인자(IL-6과 IL-8) 및 단백질분해효소인 MMP-1, MCP-1과 같은 케모카인 분비가 노화세포에서 증가함을 확인하였다(도 1C).As a result of measuring the secretion levels of cytokines and chemokines secreted from normal and senescent cells using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), proinflammatory factors belonging to SASP (IL-6 and IL-8) were detected. ) and the secretion of chemokines such as proteolytic enzymes MMP-1 and MCP-1 were confirmed to increase in senescent cells (Figure 1C).
1-5. 역전사 중합효소 연쇄반응 및 실시간 중합효소 연쇄반응 분석1-5. Reverse transcription polymerase chain reaction and real-time polymerase chain reaction analysis
정상 세포와 노화 세포에서 RNA 추출 후 RNA 분리 키트(Qiagen, USA)를 사용해 RNA를 분리하고, cDNA 합성(Promega, USA)을 사용하여 분리된 RNA 1ug에 대해 cDNA를 합성하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Promega, USA) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)(Invitrogen, USA)을 통해 세포 노화 지표의 유전자(p16, SDHA 및 SDHB)의 발현정도를 측정하였다.After RNA extraction from normal and senescent cells, RNA was isolated using an RNA isolation kit (Qiagen, USA), and cDNA was synthesized for 1 ug of the isolated RNA using cDNA synthesis (Promega, USA). Measurement of expression levels of cellular aging indicator genes (p16, SDHA, and SDHB) through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Promega, USA) and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) (Invitrogen, USA). did.
세포 노화에 따라 증가한다고 알려진 p16과 노화에 따라 감소한다고 알려진 미토콘드리아 콤플렉스 II catalytic subunit인 SDHA와 SDHB의 유전자 발현 수준을 확인한 결과, 노화 세포에서 p16의 발현이 증가하고 SDHA와 SDHB의 발현이 감소함을 확인하였다(도 1D).As a result of checking the gene expression levels of p16, which is known to increase with cellular aging, and SDHA and SDHB, the mitochondrial complex II catalytic subunits, which are known to decrease with aging, the expression of p16 increases and the expression of SDHA and SDHB decreases in aging cells. This was confirmed (Figure 1D).
상기 결과로부터, 사람 피부 섬유아 세포 모델에서 계대배양을 통해 노화가 유도됨을 확인하였다. From the above results, it was confirmed that aging was induced through subculture in the human skin fibroblast model.
실시예 2. 사람 피부 섬유아세포 유래 엑소좀 분리 및 특성 분석Example 2. Isolation and characterization of exosomes derived from human skin fibroblasts
2-1. 사람 피부 정상 또는 노화 섬유아세포로부터 엑소좀의 분리2-1. Isolation of exosomes from normal or aging human skin fibroblasts
초고속 원심 분리와 검증된 엑소좀 분리키트를 통하여 높은 순도와 함량의 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로 초고속 원심분리를 통해 농축한 정상 세포 및 노화 피부 섬유아세포 배양액을 ExoSpin 키트 (Cell Guidance Systems, Cambridge, UK)를 이용하여 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 정상 세포와 노화 세포를 RPMI-1640 Medium (Corning, NY, USA)에 5% Gibco exosome-depleted FBS (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)이 첨가된 배양액 조건에서 배양하였다. 48시간 후 배양액을 Pierce Protein Concentrator PES, 10K MWCO (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)를 사용해 6,000x g, 1시간 원심분리하여 농축하였다. 농축된 배양액을 16,000×g, 30분 원심분리하여 remaining cellular debris를 제거하였다. ExoSpin buffer를 1:2로 첨가해서 4℃에서 24시간 반응 시킨 후 16,00×g, 1시간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 침전물(엑소좀)을 100 μL PBS를 첨가해 재현탁하였다. 재현탁 시킨 엑소좀을 ExoSpin 컬럼에 로딩(loading)하여 100×g, 30초 원심분리하여 정제된 엑소좀을 용출하였다.Exosomes of high purity and content were isolated through ultra-high-speed centrifugation and a proven exosome isolation kit. Specifically, exosomes were isolated and purified from normal cell and aged skin fibroblast culture media concentrated through ultra-high-speed centrifugation using the ExoSpin kit (Cell Guidance Systems, Cambridge, UK). Normal and senescent cells were cultured in RPMI-1640 Medium (Corning, NY, USA) supplemented with 5% Gibco exosome-depleted FBS (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). After 48 hours, the culture was concentrated using Pierce Protein Concentrator PES, 10K MWCO (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) by centrifugation at 6,000x g for 1 hour. The concentrated culture was centrifuged at 16,000×g for 30 minutes to remove remaining cellular debris. ExoSpin buffer was added in a ratio of 1:2 and reacted at 4°C for 24 hours, then centrifuged at 16,00×g for 1 hour to remove the supernatant, and the precipitate (exosomes) was resuspended by adding 100 μL of PBS. The resuspended exosomes were loaded onto an ExoSpin column and centrifuged at 100×g for 30 seconds to elute the purified exosomes.
2-2. 엑소좀의 농도, 크기 및 형태 측정2-2. Measurement of concentration, size and shape of exosomes
상기 2-1의 방법으로 정상 세포 및 노화 피부 섬유아세포 유래 배양액에서 분리된 엑소좀에 대하여, Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)를 통해 정제된 엑소좀의 농도 및 크기를 측정한 결과, 분리된 엑소좀 직경은 대부분 200 nm 이하의 크기이며 정상세포에 비해 노화세포에서 엑소좀의 농도가 증가함을 확인하였다(도 2A). 투과전자현미경(TEM)을 통해 엑소좀 입자의 크기 별 분포를 확인한 결과 정제된 엑소좀의 입자 크기 및 형태를 확인하였다(도 2B).As a result of measuring the concentration and size of exosomes purified through Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for exosomes isolated from culture media derived from normal cells and aged skin fibroblasts using the method of 2-1 above, the diameter of the separated exosomes It was confirmed that the size of most exosomes was less than 200 nm and that the concentration of exosomes increased in senescent cells compared to normal cells (Figure 2A). As a result of confirming the distribution of exosome particles by size through transmission electron microscopy (TEM), the particle size and shape of the purified exosomes were confirmed (Figure 2B).
또한, 정제된 엑소좀에서 단백질 추출 후 웨스턴 블랏을 통해 대표적인 엑소좀 표면 마커인 CD9, ALIX, CD63 및 Syntenin 단백질의 발현정도 여부를 확인한 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, CD9, ALIX, CD63 및 Syntenin이 발현함을 확인하였다. 한편, Endoplasmic reticulum 에서만 발현되는 Calnexin을 음성마커로 사용한 결과 엑소좀 단백질 내에 발현양이 없는 것을 확인하였다.In addition, after protein extraction from purified exosomes, the expression level of representative exosome surface markers CD9, ALIX, CD63, and Syntenin proteins was confirmed through Western blot. As shown in Figure 2C, CD9, ALIX, CD63, and Syntenin were detected. This occurrence was confirmed. Meanwhile, when Calnexin, which is expressed only in endoplasmic reticulum, was used as a negative marker, it was confirmed that there was no expression level in the exosomal protein.
이를 통해 상기 정상 세포 및 노화 피부 섬유아세포 유래 배양액에서 분리된 엑소좀은 전형적인 엑소좀의 특성을 갖는 것을 확인하였다.Through this, it was confirmed that the exosomes isolated from the normal cell and aged skin fibroblast-derived culture medium had typical exosome characteristics.
실시예 3. 사람 피부 섬유아세포 유래 엑소좀 마이크로RNA 및 발현양 분석Example 3. Analysis of exosomal microRNA and expression level derived from human skin fibroblasts
사람 피부 섬유아세포의 정상 세포 및 노화 세포 유래 엑소좀에서 RNA 추출 후 피부 노화의 분자적 기전을 도출하기 위하여 차세대 시퀀싱 기술을 통한 소형 리보핵산(small RNA) 서열 분석 시퀸싱을 진행하였다. 전체 유전체 마이크로RNA 프로파일링을 분석하고 비교하였다.After extracting RNA from exosomes derived from normal and senescent cells of human skin fibroblasts, small ribonucleic acid (small RNA) sequencing was performed using next-generation sequencing technology to derive the molecular mechanism of skin aging. Genome-wide microRNA profiling was analyzed and compared.
구체적으로 제조업자의 프로토콜에 따라 mirVANA miRNA isolation kit(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 사람 피부 섬유아세포의 정상 세포 및 노화 세포 유래 엑소좀에서 소형 리보핵산이 풍부한 토털 RNA를 추출하였고 miRNA 라이브러리는 illumina library preparation protocol 에 따라 준비하였다. 각각의 라이브러리는 Illumina 어댑터 bar barcode로 색인화 하였다. small RNA 라이브러리는 6% TBE 유레아 폴리아크릴아마이드 겔에서 크기별로 나누고 140 내지 160 염기 쌍(base pair) 부분(fraction)은 겔로부터 절개하여 얻고 정제하였다. 모든 색인화된 샘플은 Illumina GAⅡx(36 bp 단편(reads))의 하나의 레인(lane)에서 풀링(pooling)하고 서열분석(sequencing)하였다.Specifically, total RNA enriched in small ribonucleic acids was extracted from exosomes derived from normal and senescent cells of human skin fibroblasts using the mirVANA miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX) according to the manufacturer's protocol, and the miRNA library was extracted from the illumina library. It was prepared according to the preparation protocol. Each library was indexed with an Illumina adapter bar barcode. The small RNA library was divided by size on a 6% TBE urea polyacrylamide gel, and a fraction of 140 to 160 base pairs was excised from the gel and purified. All indexed samples were pooled and sequenced in one lane of Illumina GAIIx (36 bp reads).
가공되지 않은 소형 리보핵산(raw small RNA) 서열분석 맵핑(mapping)전에 표준 유전체(reference genome)로 해독하고, 염기 서열의 질(quality)적 해독은 FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)로 평가하였으며, 3' 말단에 부착된 어댑터 시퀀스는 내부(in-house)의 펄 스크립트(PERL script)로 제거하였다. 어댑터 시퀀스 트리밍(trimming) 후, 단편 크기(read size) 분배(distribution)는 R(http://www.r-project.org.) 스크립트로 분석하였다. 어댑터 시퀀스를 트리밍한(adapter-trimmed) 소형 리보핵산 단편(read)은 디폴트 옵션(default option)을 가진 BWA(http://bio-bwa. sourceforge.net.) 소프트웨어를 따른 UCSC Genome Browser(http://genome. ucsc.edu)로부터 다운로드된 참조 표준 유전체 mm10에 맵화(mapped)하였다(Li & Durbin 2009). 맵화한 서열 단편을 RNA 계열(class)로 구분하기 위해, 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 운반RNA(transfer RNA; tRNA), 리보솜 RNA(ribosomal RNA; rRNA)및 다른 비번역 RNA(non-coading RNA)를 계열화 하기 위한 UCSC Genome Browser와 fRNAdb(http://www.ncrna.org/frnadb.)로부터의 주석 파일(annotation file)에서 소형 리보핵산과 반복서열(repeats)의 게놈 위치 정보(genomic position information)를 사용하여 수행하였다. 맵핑 위치(mapping position)와 주석 정보(annotation information)를 비교하여, 모든 맵화된 서열 단편과 부합되는 RNA 타입으로 계열화하고, 각각의 RNA 타입의 발현에 대한 상대적 빈도는 지정한 서열 단편 수에 기초하여 평가하였다. 이미 알려진 miRNA(miRBase ver. 20)에 대해서는 파이썬(Python) 스크립트를 사용하여 맵화된 서열 단편으로부터 각각의 전구체(precursor)와 최종 miRNA(mature microRNA)에 대한 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)을 계산하였다. 새로운 miRNA 탐색을 위해, 디폴트 파라미터(default parameter)를 가진 mirDeep2 소프트웨어를 사용하였고, MiRBase는 알려진 miRNA를 배제하기 위해 사용하였다. Before mapping, raw small ribonucleic acid (raw small RNA) is decoded into a reference genome, and the quality of the nucleotide sequence is decoded using FastQC (http://www.bioinformatics.babraham). ac.uk/projects/fastqc), and the adapter sequence attached to the 3' end was removed using an in-house PERL script. After adapter sequence trimming, fragment size (read size) distribution was analyzed using R (http://www.r-project.org.) script. Small ribonucleic acid fragments (reads) with adapter sequences trimmed were retrieved using the UCSC Genome Browser (http: It was mapped to the reference standard genome mm10 downloaded from //genome.ucsc.edu (Li & Durbin 2009). To classify mapped sequence fragments into RNA classes, microRNA (miRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), and other non-coding RNA (RNA) ) Genomic position information of small ribonucleic acids and repeats in the annotation file from UCSC Genome Browser and fRNAdb (http://www.ncrna.org/frnadb.) for sequencing. ) was performed using. By comparing the mapping position and annotation information, all mapped sequence fragments are sequenced into matching RNA types, and the relative frequency of expression of each RNA type is evaluated based on the number of specified sequence fragments. did. For known miRNAs (miRBase ver. 20), FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped) for each precursor and final miRNA (mature microRNA) from sequence fragments mapped using a Python script. ) was calculated. To discover new miRNAs, mirDeep2 software with default parameters was used, and MiRBase was used to exclude known miRNAs.
분석 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 정상 세포 대비 노화 세포 유래 엑소좀에서 유의미하게 증가 또는 감소한 20개의 마이크로RNA을 확인하였으며, 특히, 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a(hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-30c-5p 및 has-miR-451a)의 발현이 노화 세포 유래 엑소좀에서 특이적으로 발현이 증가함을 확인하였다. 이때, 상기 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 각각의 특이적 발현 증가를 확인한 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.As a result of the analysis, as shown in Figure 3, 20 microRNAs were confirmed to be significantly increased or decreased in exosomes derived from senescent cells compared to normal cells, especially microRNA-10a, 30c, and 451a (hsa-miR-10a-5p , hsa-miR-30c-5p and has-miR-451a) were confirmed to be specifically increased in exosomes derived from senescent cells. At this time, the nucleotide sequences of primers that confirmed the specific increase in expression of each of the microRNA-10a, 30c, and 451a are shown in Table 1 below.
실시예 4. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체와 억제제의 세포효과 분석Example 4. Analysis of cellular effects of microRNA-10a, 30c and 451a analogues and inhibitors
상기 실시예 3에서 정상 세포 대비 노화세포 유래 엑소좀에서 특이적으로 발현이 증가하는 것으로 확인된 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 에 대한 기능 분석을 위하여 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 각각의 특이적 유사체(mimic)와 억제제(inhibitor) 및 음성대조군으로 miRNA Negative Control (ctl) 를 바이오니아에서 구입하였다. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 각각의 특이적 유사체와 억제제의 염기서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.For functional analysis of microRNA-10a, 30c, and 451a, which were confirmed to have increased expression specifically in senescent cell-derived exosomes compared to normal cells in Example 3, specific microRNA-10a, 30c, and 451a, respectively. Mimics, inhibitors, and miRNA Negative Control (ctl) were purchased from Bioneer as a negative control. The base sequences of specific analogs and inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a are shown in Table 2 below.
준비된 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 유사체와 억제제를 각각 섬유아세포에 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 마이크로RNA 유사체 또는 억제제 형질 주입 30시간 후, RNA를 추출하여 역전사 중합효소 연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 마이크로RNA 발현 수준을 측정하였다.The prepared analogs and inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a were respectively intracellularly injected into fibroblasts by transfection. 30 hours after transfection with microRNA analogs or inhibitors, RNA was extracted and microRNA expression levels were measured through reverse transcription polymerase chain reaction and real-time polymerase chain reaction.
그 결과, 유사체로 인한 마이크로RNA의 발현 증가와 억제제로 인한 마이크로RNA의 발현 감소를 확인하였다(도 4). 이를 통해 제작한 마이크로RNA 유사체 및 억제제가 해당하는 마이크로RNA의 발현양을 특이적으로 조절하는 것을 확인하였다.As a result, an increase in microRNA expression due to the analog and a decrease in microRNA expression due to the inhibitor were confirmed (Figure 4). Through this, it was confirmed that the produced microRNA analogs and inhibitors specifically regulate the expression level of the corresponding microRNA.
실시예 5. 유사체로 인한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 타겟 유전자 발현조절 효과 분석Example 5. Analysis of the effect of analogs on regulating target gene expression of microRNA-10a, 30c, and 451a
타겟스캔 알고리즘이라는 높은 예측 정확도를 보이는 마이크로RNA 표적 예측 프로그램을 통해 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 타겟 유전자를 분석하였다. 정상 피부 섬유아세포에 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체와 miRNA Negative Control (ctl)를 각각 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 24시간 후 세포에서 RNA를 추출하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 마이크로RNA의 타겟 유전자(EPHA4, RUNX2 및 IL6R)의 발현 수준을 측정하였다.The target genes of microRNA-10a, 30c, and 451a were analyzed using a microRNA target prediction program with high prediction accuracy called the TargetScan algorithm. MicroRNA-10a, 30c, and 451a analogs and miRNA Negative Control (ctl) were each intracellularly injected into normal skin fibroblasts by transfection. RNA was extracted from cells after 24 hours. Expression levels of microRNA target genes (EPHA4, RUNX2, and IL6R) were measured through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR).
그 결과, 마이크로RNA-10a의 타겟 유전자인 EPHA4와 마이크로RNA-30c 타깃 유전자인 RUNX2 및 마이크로RNA-451a의 타깃 유전자인 IL6R 각각의 발현 레벨이 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 주입으로 인해 음성대조군(ctl) 대비 감소하는 것을 확인하였다(도 5).As a result, the expression levels of EPHA4, the target gene of microRNA-10a, RUNX2, the target gene of microRNA-30c, and IL6R, the target gene of microRNA-451a, decreased in the negative control group due to injection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogs. It was confirmed that it decreased compared to (ctl) (Figure 5).
실시예 6. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체에 의한 사람 정상 피부 섬유아세포 노화 유도 효과 분석Example 6. Analysis of the effect of microRNA-10a, 30c and 451a analogs on inducing aging in human normal skin fibroblasts
6-1. β-gal staining을 통한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 주입에 따른 피부 섬유아세포의 노화6-1. Aging of skin fibroblasts following injection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogues through β-gal staining
정상 피부 섬유아세포에 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체와 miRNA Negative Control (ctl)를 각각 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체에 의한 세포노화 유도 효과를 다양한 실험 분석을 통해 검증하였다. 먼저, Senescence associated β-gal staining을 진행한 결과, 정상 세포에서 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 주입에 의하여, 음성대조군(ctl)에 비해 β-gal staining이 유의미하게 증가함에 따라, 노화가 유도되었음을 확인하였다(도 6A).MicroRNA-10a, 30c, and 451a analogs and miRNA Negative Control (ctl) were each intracellularly injected into normal skin fibroblasts by transfection. The cellular senescence-inducing effect of microRNA-10a, 30c, and 451a analogues was verified through various experimental analyses. First, as a result of Senescence associated β-gal staining, injection of microRNA-10a, 30c, and 451a analogues in normal cells significantly increased β-gal staining compared to the negative control group (ctl), thereby inducing aging. It was confirmed that this was done (Figure 6A).
6-2. ELISA를 통한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 주입에 따른 피부 섬유아세포 노화 분석6-2. Analysis of skin fibroblast aging following injection of microRNA-10a, 30c and 451a analogs using ELISA
MMP-1은 콜라겐분해효소로서 피부의 주요 형태인 제1형 콜라겐과 3형 콜라겐을 분해한다고 알려져 있고 자연적으로 노화된 피부와 광노화된 피부에서 콜라겐 합성이 감소되는 바가 알려져 있다. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체로 인한 노화가 유도되어 MMP-1 효소의 분비가 증가하는지를 확인하기 위하여 정상 피부 섬유아세포에 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 유사체 및 miRNA Negative Control (ctl)를 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 48시간 후, 세포배양액을 분리하여 MMP-1 특이적 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 실시하였다.MMP-1 is a collagenase that is known to decompose type 1 collagen and type 3 collagen, the main types of skin, and it is known that collagen synthesis is reduced in naturally aged skin and photoaged skin. To determine whether microRNA-10a, 30c, and 451a analogues induce aging and increase MMP-1 enzyme secretion, normal skin fibroblasts were transfected with microRNA-10a, 30c, and 451a analogues and miRNA Negative Control (ctl). It was injected intracellularly by transfection. After 48 hours, the cell culture was separated and subjected to MMP-1 specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA 결과, 마이크로RNA 유사체를 주입한 정상세포에서 음성대조군(ctl) 대비 MMP-1 분비양이 증가함을 확인하였다(도 6B). As a result of ELISA, it was confirmed that the amount of MMP-1 secretion increased in normal cells injected with microRNA analogs compared to the negative control group (ctl) (Figure 6B).
이를 통해 노화 세포 유래 엑소좀에서 특이적으로 발현이 증가한 것으로 확인된 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 유사체 주입으로 인하여, 섬유아세포의 노화 유도가 나타남을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 상기 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 피부세포노화 바이오마커로서의 활용 가능성을 확인하였다.Through this, it was confirmed that the induction of senescence in fibroblasts occurred due to the injection of analogues of microRNA-10a, 30c, and 451a, which were confirmed to have a specific increase in expression in exosomes derived from senescent cells. From these results, the microRNA-10a , the possibility of using 30c and 451a as skin cell aging biomarkers was confirmed.
실시예 7. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제에 의한 사람 노화 피부 섬유아세포 노화 개선 효과Example 7. Effect of improving aging of human aging skin fibroblasts by inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a
7-1. β-gal staining을 통한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 주입에 따른 피부 섬유아세포의 노화 개선 효과 분석7-1. Analysis of the effect of improving aging of skin fibroblasts following injection of microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors through β-gal staining
노화 피부 섬유아세포에 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 또는 음성대조군으로 miRNA Negative Control (ctl)를 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제에 의한 세포노화 감소 효과를 다양한 실험 분석을 통해 검증하였다.Aging skin fibroblasts were intracellularly injected with microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors or with miRNA Negative Control (ctl) as a negative control by transfection. The effect of reducing cellular aging by microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors was verified through various experimental analyses.
먼저, Senescence associated β-gal staining 진행한 결과, 노화세포에서 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 주입에 의하여, 음성대조군(ctl) 대비 β-gal staining 이 유의미하게 감소함을 확인하였다(도 7A). First, as a result of Senescence associated β-gal staining, it was confirmed that the injection of microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors in senescent cells significantly reduced β-gal staining compared to the negative control group (ctl) (Figure 7A) .
7-2. ELISA를 통한 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 주입에 따른 피부 섬유아세포의 노화 개선 효과 분석7-2. Analysis of the effect of improving aging of skin fibroblasts by injection of microRNA-10a, 30c and 451a inhibitors using ELISA
MMP-1은 콜라겐분해효소로서 피부의 주요 형태인 제1형 콜라겐과 3형 콜라겐을 분해한다고 알려져 있고 자연적으로 노화된 피부와 광노화된 피부에서 콜라겐 합성이 감소되는 바가 알려져 있다. 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제가 세포노화 제어효과를 통해 MMP-1 효소의 분비를 감소시키는지 여부를 확인하기 위하여 노화 피부 섬유아세포에 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제 또는 음성대조군으로 miRNA Negative Control (ctl)를 형질 주입(transfection) 방식으로 세포내 주입하였다. 48시간 후, 세포배양액을 분리하여 MMP-1 특이적 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 실시하였다. MMP-1 is a collagenase that is known to decompose type 1 collagen and type 3 collagen, the main types of skin, and it is known that collagen synthesis is reduced in naturally aged skin and photoaged skin. To determine whether microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors reduce the secretion of MMP-1 enzyme through a cellular aging control effect, aging skin fibroblasts were treated with microRNA-10a, 30c, and 451a inhibitors or miRNA as a negative control. Negative Control (ctl) was injected intracellularly by transfection. After 48 hours, the cell culture was separated and subjected to MMP-1 specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA 결과, 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a 억제제를 주입한 노화세포에서 MMP-1 분비양이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 억제제 주입이 노화 관련 표현형을 감소시킴을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 상기 마이크로RNA-10a, 30c 및 451a의 억제제를 피부 세포 노화 예방, 개선 또는 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다.As a result of ELISA, it was confirmed that the amount of MMP-1 secretion decreased in senescent cells injected with inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a. Through this, it was confirmed that injection of inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a reduced aging-related phenotypes. These results show that the inhibitors of microRNA-10a, 30c, and 451a can be used to prevent, improve, or treat skin cell aging. It was confirmed that it exists.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been examined focusing on its preferred embodiments. A person skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a restrictive perspective. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope should be construed as being included in the present invention.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Development of skin aging biomarker or anti-aging molecule using modulation of microRNA-10a, 30c and 451a <130> PN2105-275 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a primer <400> 1 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c primer <400> 2 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a primer <400> 3 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a mimic <400> 4 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c mimic <400> 5 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a mimic <400> 6 aaaccgccau uacugaguu 19 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a inhibitor <400> 7 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c inhibitor <400> 8 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a inhibitor <400> 9 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Development of skin aging biomarker or anti-aging molecule using modulation of microRNA-10a, 30c and 451a <130> PN2105-275 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a primer <400> 1 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c primer <400> 2 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a primer <400> 3 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a mimic <400> 4 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c mimic <400> 5 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a mimic <400> 6 aaaccgccau uacugaguu 19 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10a inhibitor <400> 7 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-30c inhibitor <400> 8 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-451a inhibitor <400> 9 aaaccguuac cauuacugag uu 22
Claims (12)
상기 피부 노화 진단용 조성물은 마이크로RNA-10a 및 hsa-miR-30c-5p로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 마이크로RNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 진단용 조성물.According to paragraph 1,
The composition for diagnosing skin aging is characterized in that it further comprises one or more microRNAs selected from the group consisting of microRNA-10a and hsa-miR-30c-5p.
상기 마이크로RNA-451a, 마이크로RNA-10a 또는 hsa-miR-30c-5p는 엑소좀 유래인 것인 피부 노화 진단용 조성물.According to any one of paragraphs 1 and 2,
A composition for diagnosing skin aging, wherein the microRNA-451a, microRNA-10a or hsa-miR-30c-5p is derived from exosomes.
상기 물질은 마이크로RNA-451a에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체인 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단용 조성물.According to paragraph 1,
A composition for diagnosing skin aging, wherein the substance is a primer, probe, or antibody specific for microRNA-451a.
(b) 상기 마이크로RNA-451a의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-451a의 발현 수준에 비해 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 피부 노화 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the expression level of microRNA-451a from a biological sample of an individual; and
(b) A method of providing information for predicting or diagnosing skin aging, comprising the step of confirming that the expression level of microRNA-451a is increased compared to the expression level of microRNA-451a in a normal control sample.
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative real time-polymerase chain reaction)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.According to clause 5,
A method of providing information for predicting or diagnosing skin aging, characterized in that the measurement is performed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction or quantitative real time-polymerase chain reaction. .
상기 억제제는 마이크로RNA-451a의 발현, 전사 또는 활성을 억제하는 것인 조성물.According to any one of paragraphs 7 and 8,
A composition wherein the inhibitor inhibits the expression, transcription or activity of microRNA-451a.
상기 억제제는 MMP-1 효소의 발현, 전사, 분비 또는 활성을 억제함으로써 피부 주름을 억제 또는 개선하는 것을 특징으로 하는, 조성물.According to any one of paragraphs 7 and 8,
The composition is characterized in that the inhibitor suppresses or improves skin wrinkles by inhibiting the expression, transcription, secretion or activity of the MMP-1 enzyme.
(b) 상기 피부 세포 내에서 마이크로RNA-451a의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-451a의 발현양이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우에 상기 시료는 피부 주름 억제 또는 개선용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 피부 주름 억제 또는 개선용 물질을 스크리닝 하는 방법.(a) processing a sample to be analyzed on skin cells expressing microRNA-451a;
(b) measuring the expression level of microRNA-451a in the skin cells; and
(c) If, as a result of the measurement in step (b), the expression level of microRNA-451a is reduced compared to the control group that did not treat the sample, determining that the sample is a material for suppressing or improving skin wrinkles, Method for screening substances for suppressing or improving skin wrinkles.
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| KR1020210104042A KR102674299B1 (en) | 2021-08-06 | Development of skin aging biomarker or anti-aging molecule using modulation of microRNA-10a, 30c and 451a |
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| JP2009091283A (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-30 | Pola Chem Ind Inc | Matrix metalloprotease and composition containing the same |
| US20110301091A1 (en) | 2008-11-03 | 2011-12-08 | Giammaria Giuliani | Compositions and methods for reducing the signs of aging of the skin |
| EP3763822A1 (en) * | 2018-02-28 | 2021-01-13 | Jala Group Co. | Method for screening skin endogenous aging targets, active material for improving skin endogenous aging and screening method therefor |
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