KR102659689B1 - 유근피로부터 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드를 고수율로 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유근피로부터 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드를 고수율로 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출한 화합물의 골 관련 질환 치료, 개선 및 예방 용도에 관한 것이다.
일 양상에 따르면, 본 발명의 E7A 제조방법 및 유근피 추출물 제조방법을 이용하면 파골세포 분화 억제능이 우수한 유효물질을 효과적으로 분리/수득할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 방법을 이용하여 골 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

유근피로부터 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드를 고수율로 추출하는 방법 {A method for extracting (2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-Apiofuranoside (E7A) in high yield from Ulmus}

본 발명은 유근피로부터 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드를 고수율로 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출한 화합물의 골 관련 질환 치료, 개선 및 예방 용도에 관한 것이다.

식품의약품안전처의 조사에 따르면 국내의 고령화 속도는 2010년 10.5%에서 2019년 14.9%로 가파른 증가현상을 보임과 동시에 이러한 고령화의 영향과 맞물려 건강기능 식품 시장 또한 2010년(17,875억원) 대비 2019년(37,257억원)로 증가하는 경향을 보이고 있다. 또한, 통계청 인구 분석에 따르면 현재 65세 이상 노인의 비율이 전체 인구 중 13.5%를 차지하고 있어 고령화 사회에 해당되며, 2040년에는 전체 인구의 32.3%로 예상되어 초고령화 사회(65세 이상 인구 20% 이상)가 될 것으로 예상된다. 이러한 사회 배경과 동향을 바탕으로 앞으로의 뼈/관절 기능성 시장은 지속적으로 확대될 것으로 추정된다.

유근피는 일반적으로 느릅나무속 식물의 뿌리 껍질을 지칭하고 민간에서는 물에 닿게 되면 코처럼 진액이 나온다 하여 코나무로도 불리고 있으며, 축농증, 위염, 위암과 욕창 등에 사용해 오고 있다. 유근피는 원물자체가 같은 느릅나무 속의 식물들을 구분하기 어려워 식품공전 및 대한민국 약전 외 한약(생약)규격집에서 규정한 왕느릅나무가 아닌 일반 느릅나무로 유통 및 연구가 진행되어 연구분야에서 조차 혼란을 야기하고 있다.

이러한 배경 하에, 유근피 추출물로부터 유효한 단일 화합물을 효율적으로 분리하는 공정을 개발하였으며, 상기 공정을 토대로 제조한 유근피 추출물 및 단일 화합물의 우수한 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-2334305호

일 양상은 1) 유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계; 및 2) 상기 열수 추출물 또는 이의 분획물로부터 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 분리하는 단계를 포함하는, E7A 제조 방법으로서, 상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것인, 방법을 제공한다.

다른 양상은 유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계를 포함하는, 유근피 추출물 제조 방법으로서, 상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것인, 방법을 제공한다.

또 다른 양상은 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 유근피 추출물은 상기 방법을 이용하여 수득된 것인, 조성물을 제공한다.

일 양상은 1) 유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계; 및 2) 상기 열수 추출물 또는 이의 분획물로부터 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 분리하는 단계를 포함하는, E7A 제조 방법으로서, 상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것인, 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서의 용어 "유근피"는 느릅나무과(Ulmaceae)에 속하는 느릅나무의 코르크층을 벗긴 수피 또는 근피를 의미한다. 일반적으로 뿌리껍질을 사용하고 있지만 줄기 껍질의 경우에도 동일한 성분을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 플라보노이드, 사포닌, 탄닌 및 점액질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 유근피는 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq), 당느릎나무(Ulmus davidiana Planchon), 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai) 및/또는 왕느릅나무 (Ulmus macrocarpa Hance)의 껍질(수피 또는 근피)을 의미하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 왕느릅나무의 껍질(수피 또는 근피)을 의미하는 것일 수 있다.

상기 유근피는 해당 식물의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 수득된 것일 수 있으며, 식물 조직 배양물로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유근피는 건조된 원물일 수 있다.

상기 추출 용매는 물; 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 뷰탄올(buthanol) 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린 (glycerine), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트(methyl acetate), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 벤젠(bezene), 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 탄화수소계 용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, 상기 추출 용매는 물 및/또는 에탄올을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 추출 용매는 물(증류수, 정제수 등)일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "열수 추출"은 용매와 용질을 혼합하여 용액을 만든 후, 직접 가열방식으로 가열, 교반하여 유효성분을 추출하는 방법을 의미한다. 또한, 열수 추출의 경우 실온 이상의 온도에서 추출하는 조건은 모두 열수 추출로 볼 수 있다.

상기 방법에서 열수 추출을 수행하는 단계는 유근피 및 추출 용매를 혼합하여 용액을 만든 후 실온 이상의 반응 조건에서 유효성분을 추출하는 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.

상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 상기 분획물은 유근피 물 추출물(열수 추출물)을 탄소수 1 내지 4의 알코올로 분획한 것일 수 있으며, 구체적으로 뷰탄올로 분획한 것일 수 있다.

상기 "E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside]"는 하기 화학식 1로 표현되는 것일 수 있다.

[화학식 1]

본 명세서에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다. 특히 바람직한 염으로는, 화합물이 그 내에 산성관능기를 가지는 경우, 알칼리 금속염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (예컨대, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등) 등과 같은 무기염, 및 암모늄염과 같은 유기 염이 있으며, 화합물이 그 내에 염기성 관능기를 가지는 경우, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과 같은 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산과의 염이 있다.

상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6일 수 있으며, 구체적으로 4.0 내지 6.0, 4.0 내지 5.8, 4.0 내지 5.6, 4.0 내지 5.4, 4.0 내지 5.2, 4.0 내지 5.0, 4.2 내지 6.0, 4.2 내지 5.8, 4.2 내지 5.6, 4.2 내지 5.4, 4.2 내지 5.2, 4.2 내지 5.0, 4.4 내지 6.0, 4.4 내지 5.8, 4.4 내지 5.6, 4.4 내지 5.4, 4.4 내지 5.2, 4.4 내지 5.0, 4.6 내지 6.0, 4.6 내지 5.8, 4.6 내지 5.6, 4.6 내지 5.4, 4.6 내지 5.2, 4.6 내지 5.0, 4.8 내지 6.0, 4.8 내지 5.8, 4.8 내지 5.6, 4.8 내지 5.4, 4.8 내지 5.2, 4.8 내지 5.0, 5.0 내지 6.0, 5.0 내지 5.8, 5.0 내지 5.6, 5.0 내지 5.4 또는 5.0 내지 5.2일 수 있다.

상기 열수 추출은 80 내지 100℃ 조건에서 수행되는 것일 수 있으며, 구체적으로 80 내지 100℃, 80 내지 98℃, 80 내지 96℃, 80 내지 94℃, 80 내지 92℃, 80 내지 90℃, 82 내지 100℃, 82 내지 98℃, 82 내지 96℃, 82 내지 94℃, 82 내지 92℃, 82 내지 90℃, 84 내지 100℃, 84 내지 98℃, 84 내지 96℃, 84 내지 94℃, 84 내지 92℃, 84 내지 90℃, 86 내지 100℃, 86 내지 98℃, 86 내지 96℃, 86 내지 94℃, 86 내지 92℃, 86 내지 90℃, 88 내지 100℃, 88 내지 98℃, 88 내지 96℃, 88 내지 94℃, 88 내지 92℃, 88 내지 90℃, 90 내지 100℃, 90 내지 98℃, 90 내지 96℃, 90 내지 94℃ 또는 90 내지 92℃일 수 있다.

상기 열수 추출은 60분 내지 120분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 구체적으로 60분 내지 120분, 60분 내지 115분, 60분 내지 110분, 60분 내지 105분, 60분 내지 100분, 65분 내지 120분, 65분 내지 115분, 65분 내지 110분, 65분 내지 105분, 65분 내지 100분, 70분 내지 120분, 70분 내지 115분, 70분 내지 110분, 70분 내지 105분, 70분 내지 100분, 75분 내지 120분, 75분 내지 115분, 75분 내지 110분, 75분 내지 105분, 75분 내지 100분, 80분 내지 120분, 80분 내지 115분, 80분 내지 110분, 80분 내지 105분, 80분 내지 100분, 85분 내지 120분, 85분 내지 115분, 85분 내지 110분, 85분 내지 105분, 85분 내지 100분, 90분 내지 120분, 90분 내지 115분, 90분 내지 110분, 90분 내지 105분, 90분 내지 100분, 95분 내지 120분, 95분 내지 115분, 95분 내지 110분, 95분 내지 105분 또는 95분 내지 100분동안 수행되는 것일 수 있다.

상기 방법에서 추출 용매 및 용질(유근피)의 부피/중량비 [추출용매 부피/용질 중량(mL/g)]는 80 내지 120 (mL/g)일 수 있으며, 구체적으로, 80 내지 120 (mL/g), 80 내지 115 (mL/g), 80 내지 110 (mL/g), 80 내지 105 (mL/g), 80 내지 100 (mL/g), 85 내지 120 (mL/g), 85 내지 115 (mL/g), 85 내지 110 (mL/g), 85 내지 105 (mL/g), 85 내지 100 (mL/g), 90 내지 120 (mL/g), 90 내지 115 (mL/g), 90 내지 110 (mL/g), 90 내지 105 (mL/g), 90 내지 100 (mL/g), 95 내지 120 (mL/g), 95 내지 115 (mL/g), 95 내지 110 (mL/g), 95 내지 105 (mL/g), 95 내지 100 (mL/g), 100 내지 120 (mL/g), 100 내지 115 (mL/g), 100 내지 110 (mL/g) 또는 100 내지 105 (mL/g)일 수 있다.

상기 방법은 1) 추출 용매의 pH가 4.5 내지 6.5, 2) 추출 온도가 85 내지 95℃, 3) 추출 시간은 90 내지 105분 및 4) 추출용매/용질의 비율이 95 내지 105 mL/g으로 구성된 조건에서 선택된 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있다.

상기 방법은 E7A 제조 방법으로서, 하기 수학식을 통해 E7A 수득량(농도)를 조절할 수 있으며, 구체적으로 유근피 추출물 내 E7A 함량(농도)를 계산함으로서 조절할 수 있다:

[수학식 2]

E7A = 8.64+1.23X₁+5.86X₂-4.48X₃+0.43X₄+1.78X₁X₂-0.058X₁X₃ +0.45X₁X₄-7.13X₂X₃-0.40X₂X₄+0.39X₃X₄-0.71X₁ ²+1.45X₂ ²-3.85X₃ ²-1.15X₄ ²

[E7A = E7A 수율(mg/g), X₁ = 원물과 추출 용매의 비율(용매/원물, mL/g), X₂ = 추출 온도 (℃), X₃ = 추출 용매 pH (pH), X₄ = 추출 시간 (min)]

다른 양상은 유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계를 포함하는, 유근피 추출물 제조 방법으로서, 상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것인, 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

구체적으로, 상기 유근피 추출물은 열수 추출물일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 구체적인 추출 조건은 상기의 E7A 제조 방법과 동일할 수 있으며, 구체적으로 1) 추출 용매의 pH가 4.5 내지 6.5, 2) 추출 온도가 85 내지 95℃, 3) 추출 시간은 90 내지 105분 및 4) 추출용매/용질의 비율이 95 내지 105 mL/g으로 구성된 조건에서 선택된 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있다.

상기 방법은 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물의 함량이 증대된 유근피 추출물을 제조하기 위한 것일 수 있다.

상기 방법으로 제조된 유근피 추출물은 추출물 전체 중량 대비 E7A 중량이 20 내지 30 mg/g의 농도로 포함되는 것일 수 있으며, 구체적으로 20 내지 30 mg/g, 20 내지 28 mg/g, 20 내지 26 mg/g, 22 내지 30 mg/g, 22 내지 28 mg/g, 22 내지 26 mg/g, 24 내지 30 mg/g, 24 내지 28 mg/g, 24 내지 26 mg/g, 26 내지 30 mg/g 또는 26 내지 28 mg/g의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

상기 방법은 E7A 함량이 증가된 유근피 추출물 제조 방법으로서, 하기 수학식을 통해 E7A 수득량(농도)를 조절할 수 있으며, 구체적으로 유근피 추출물 내 E7A 함량(농도)를 계산함으로서 조절할 수 있다:

[수학식 2]

E7A = 8.64+1.23X₁+5.86X₂-4.48X₃+0.43X₄+1.78X₁X₂-0.058X₁X₃ +0.45X₁X₄-7.13X₂X₃-0.40X₂X₄+0.39X₃X₄-0.71X₁ ²+1.45X₂ ²-3.85X₃ ²-1.15X₄ ²

[E7A = E7A 수율(mg/g), X₁ = 원물과 추출 용매의 비율(용매/원물, mL/g), X₂ = 추출 온도 (℃), X₃ = 추출 용매 pH (pH), X₄ = 추출 시간 (min)]

또 다른 양상은 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

상기 E7A는 하기의 화학식 1로 표현되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

상기 E7A는 본 발명의 E7A 제조방법을 이용하여 수득한 것일 수 있다.

본 명세에서의 용어 "골 관련 질환"이란, 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되어 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환을 의미하는데, 상기 골 관련 질환은 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 골 관련 질환은 파골세포 발현/활성 또는 파골세포 분화와 관련된 골 질환일 수 있으며, 구체적으로 파골세포 과발현 또는 과분화로 인해 발병하는 것일 수 있다.

상기 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이를 포함하는 조성물은 파골세포 분화 억제 또는 파골세포 발현/활성 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "파골세포(osteoclast)"란, 파골세포 전구체(osteoclast precursor)로부터 분화되는 세포로서 파골세포 전구세포들은 M-CSF 및 RANKL 존재 하에서 파골세포로 분화되며, 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apotosis)를 일으킨다.

상기 조성물, 추출물 또는 이의 분획물은 파골세포 분화 또는 발현 관련 마커의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 NFATc1, OSCAR, DC-STAMP 및 CTSK으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 골 관련 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 양상은 상기 골 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 관련 질환 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 골 관련 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 양상은 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본 명세서에서의 용어 "개선"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 골 관련 질환의 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ~ 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다면 본 발명의 추출물을 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 화합물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양상은 E7A [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본 명세서에서의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 사료 조성물은 제제에 따라 골 관련 질환 개선 또는 예방을 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 고농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물 사료에 침지, 분무, 또는 혼합으로 첨가하여 사용될 수 있다.

상기 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다.

상기 사료 조성물은 사료에 첨가되는 물질 (즉, 사료 첨가제), 사료 원료 또는 개체에 급여되는 사료 자체를 모두 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것일 수 있다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

상기 유근피 추출물은 본 발명의 유근피 추출물 제조방법을 이용하여 수득된 것일 수 있다.

또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

일 양상에 따르면, 본 발명의 E7A 제조방법 및 유근피 추출물 제조방법을 이용하면 파골세포 분화 억제능이 우수한 유효물질을 효과적으로 분리/수득할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 방법을 이용하여 골 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.

도 1은 추출 용매에 따른 유근피 추출물의 파골세포 분화 억제 효능을 나타낸 도면이다.
도 2는 추출 용매에 따른 유근피 추출물의 세포 독성 여부를 나타낸 도면이다.
도 3은 추출 용매에 따른 유근피 추출물의 LC/MS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 유근피 추출물의 1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 느릅나무속 식물 추출물의 LC/MS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 느릅나무속 식물 추출물의 MS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7의 A 및 B는 E7A 처리에 따른 TRAP 염색 결과를 나타낸 도면이고, C는 세포 독성 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 E7A 처리에 따른 PIT 어세이 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 E7A 처리에 따른 NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK 및 OSCAR의 발현 수준을 qPCR을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 E7A 처리에 따른 TRAP 염색 결과를 Ulmoside A 및 Catechin와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 11은 추출 조건에 따른 E7A 수율을 반응표면 다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도 12의 A 및 B는 본 발명의 방법으로 추출한 유근피 추출물의 처리에 따른 TRAP 염색 결과를 나타낸 도면이고, C는 세포 독성 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 방법으로 추출한 유근피 추출물의 처리에 따른 PIT 어세이 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 방법으로 추출한 유근피 추출물의 처리에 따른 NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK 및 OSCAR의 발현 수준을 qPCR을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물 재료 및 샘플 준비

건조된 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance)는 현지 회사(진성 F.M)에서 구입했다. 느릅나무속에 속하는 다른 식물인 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq), 당느릎나무(Ulmus davidiana Planchon) 및 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai)는 서울대학교 산림과학부(SNUF)에서 제공받았다. 상기 식물들은 최종 제품의 품질을 보장하기 위해 온도, 상대 습도 및 풍속이 제어된 건조실에서 탈수되었다. 말린 나무 껍질은 믹서기를 사용하고 손으로 따서 작은 조각으로 자르고 고운 가루로 만든 다음 체로 걸러 ~20 mesh의 고운 가루를 수득하였다. 그런 다음 분말 샘플을 폴리프로필렌 지퍼 백으로 옮기고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 2: 실험 기기의 사용 조건

UV 스펙트럼은 Hitachi JP/U-3010 UV spectrophotometer(Tokyo, Japan)를 사용하여 얻었다.

모든 NMR 스펙트럼은 MeOH-d4(Gif-sur-Yvette, France)를 용매로 하여, Bruker Ascend 700 분광계(Billerica Middlesex County, MA, USA)를 사용하여 얻었으며, 각 용매 피크(메탄올-d4의 경우 HH 3.31 및 CC 49.0)를 참조하여 화학적 이동을 얻었다.

저해상도 LC-MS 데이터는 Agilent Technologies 6130 사중극자 질량 분석기에 연결된 Agilent Technologies 1200 시리즈 HPLC에서 수집되었다. 고해상도 질량 데이터는 Quadrupole/TOF 질량 분석기가 있는 Triple TOF 5600 고해상도 질량 분석기로 기록되었다.

모든 질량 데이터는 전자 분무 이온화 방법을 사용하여 얻었다.

고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)는 Waters 2998 광다이오드 어레이 검출기 및 Waters 1525 바이너리 펌프가 장착된 Waters HPLC 시스템(Milford Worces County, MA)을 사용하여 수행되었다.

HPLC 분석에는 HPLC급 용매(대전, 한국)를 사용하였으며, NMR 용매는 Cambridge Isotope Laboratory(Andover, MA, USA)에서 구입했다.

실시예 3: 파골세포 분화 및 TRAP(artrate-resistant acid phosphatase) 염색 어세이

파골세포 분화 및 TRAP 염색은 기존에 공개된 문헌을 토대로 수행되었다. 한편, 골수 세포(BMC) 분리는 순천대학교 동물 연구 표준 프로토콜(SCNU)에 따라 수행되었으며, 동물 사용 프로토콜은 SCNU 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다(허가번호: SCNU IACUC 2021-05). 구체적으로, 5주령 ICR 마우스의 대퇴골과 경골을 세척하여 골수 세포(bone marrow cells, BMC)를 분리하였다. 분리된 BMC는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 10ng/mL M-CSF이 보충된 α-MEM에서 하루 동안 배양했다. 부유 세포를 제거하고, 부착된 세포를 파골세포 전구체(osteoclast precursor: Bone Marrow-Derived Macrophage: BMM)로 이용하여 파골세포 분화에 사용하였다. 파골세포 분화를 위해 상기 BMM을 6-웰 플레이트에 1x10⁶ cells/well)로 시딩하고, M-CSF(30ng/mL) 및 RANKL(10ng/mL, R&D Systems)을 첨가하고 3일간 배양하여 전파골세포(preosteoclast)를 생성했다. 상기 전파골세포를 M-CSF(30ng/mL)의 존재 하에 30분 동안 비히클 또는 실험 샘플로 처리한 다음 RANKL(10ng/mL)로 하루 더 배양하여 성숙한 TRAP⁺-MNC (tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells)로 분화시켰다. 하루 후, 세포를 3.7% 포름알데히드로 5분간 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 5분간 투과화한 후, leukocyte acid phosphatase kit 387-A를 사용하여 염색하였다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 다핵세포(TRAPpositive multinucleate cells: TRAP+ MNCs)를 파골세포로 계수하였다.

실시예 4: 세포 생존력 분석 어세이

세포 생존을 평가하기 위해, 비히클 또는 실험 샘플을 처리하고 72시간 후 WST [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]에서 포르마잔 (formazan)으로의 전환을 평가하였다. 구체적으로, 분리된 BMM(1 x 10⁴ cells/well)을 M-CSF(30ng/mL)의 존재 하에 96-웰 플레이트에서 12시간 동안 인큐베이션한 다음, 각 웰에 표시된 농도에서 DMSO 또는 실험 샘플로 처리했다. 3일 후, 10μL WST-8 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후 광학 밀도는 표준 마이크로플레이트 판독기(Thermo, Varioskan Flash, UK)를 사용하여 450 nm에서 측정되었다.

실시예 5: 통계적 분석

결과는 3 반복 결과의 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 통계적 차이는 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. 0.05보다 낮은 P-값은 유의한 것으로 간주되었다(P-값 * <0.05, ** <0.01, *** <0.001).

실험예 1: 왕느릅나무 추출물의 추출 용매별 파골세포 억제능 평가

식품 제조공정에서 사용되는 용매로 왕느릎나무(Ulmus macrocarpa Hance)를 추출하였을 때, 파골세포 분화 억제 능력이 가장 우수한 조건을 찾기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 추출 용매로서 물(0% 에탄올), 70% 에탄올 및 100% 에탄올을 사용한 경우, 추출물의 파골세포 분화 억제 효능을 TRAP 염색법으로 평가하였다. 그 결과, 100% 물 추출물의 경우 TRAP 양성 NMCs/well 값은 1ug/ml의 낮은 농도에서도 비히클에 비해 82.7% 감소한 반면, 100% 에탄올 추출물은 1ug/ml에서 12.2% 감소를 보였고, 에탄올 70% 추출물은 1ug/ml에서 9.7% 감소를 보였다. 따라서, 열수 추출물은 에탄올 추출물보다 현저히 우수한 파골세포 분화 억제 효능을 갖는 것을 알 수 있다(도 1).

또한, CCK-8(Cell Counting Kit-8) 분석을 통해 상기 추출물들의 세포 독성을 확인한 결과, 상기 실험에서 사용한 최대 농도(20 μM)의 추출물 모두 BMM에 대한 유의한 세포독성 효과를 나타내지 않았다 (도 2).

실험예 2: 왕느릅나무 추출물의 유효 활성성분 발굴

상기 실험예 1의 결과를 토대로 에탄올 추출물보다 열수 추출물에서 파골세포 분화 억제에 더 효과적인 유효 활성물질이 있을 것이라고 가정하였으며, 3가지 추출물(열수, 100% 에탄올, 70% 에탄올)을 LC/MS를 이용하여 비교하였다. 그 결과, 70% 에탄올 추출물 및 100% 에탄올 추출물에서는 거의 볼 수 없는 피크(15.53)가 열수 추출물에서는 쉽게 검출되는 것을 확인하였다 (도 3).

다음으로, 상기 유효 활성물질을 확인하기 위해 1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC 스펙트럼으로 분리정제하였으며, 하기와 같은 화합물이 발굴되었다 (도 4).

(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside : white and brown amorphous powder; [α]20D -19.6 (c 0.52, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203, 278; 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.98 (d,J = 1.7 Hz, H-2′), 6.80 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, H-6′), 6.76 (d,J = 8.1 Hz, H-5′), 6.14 (d, J = 3.8 Hz, 1H, H6), 6.14 (d, J = 3.8 Hz, 1H, H8),4.82 (br s, H-2), 4.19 (m, H-3), 2.88 (dd, J = 16.8, 4.4 Hz, H-4a), 2.74 (dd, J = 16.8,2.6 Hz, H-4b), 2.88 (H-4a), 2.74 (H-4b), 2.86 (H-4a), 2.54 (H-4b), 5.49 (d, J = 2.9 Hz, H-1″), 4.14 (d, J = 2.9 Hz, H-2″), 4.09 (m, H-4″a), 3.85 (d, J = 9.7 Hz, H4″b), 3.62 (m, H-5″), 5.49 (d, J = 2.9 Hz, H-1″) ; 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 108.72 (C-1″),79.94 (C-3″), 78.27 (C-2″), 75.40 (C-4″), 64.96 (C-5″), 158.01 (C-7), 157.95 (C-9), 157.31 (C-5), 145.95 (C-4′), 145.83 (C3′),132.15 (C-1′), 119.36 (C-6′), 115.90 (C-5′), 115.28 (C-2′), 102.51 (C-10), 97.40 (C-6), 97.17 (C-8), 80.29 (C-2), 67.29 (C-3), 29.27 (C4) ; ESIMS m/z 423 [M + H]+, 421 [M - H]-

구체적으로 왕느릅나무 열수 추출물에서 분리된 화합물은 flavan-3-ol aglycone과 당 모이어티로 구성되어 있으며, 203 nm (최대) 및 280nm(최대)에서 UV 흡수를 나타냈다. 분자식 C₂₀H₂₂O₁₀ 은 각각 m/z 423 [M + H]⁺ 및 421 [M - H]^- 에서 양이온성 및 음이온성 ESI(electrospray ionization) MS 분자 이온 피크에 의해 환원되었다. 1H NMR 스펙트럼은 1,2,3,5-테트라치환된 벤젠 고리에서 H-6 및 H-8에 대해 δ 6.13에서 2개의 중첩된 방향족 단일항(singlets)을 나타냈고, ABX 스핀 시스템에서 δ 6.98, 6.80 및 6.76에서 3개의 방향족 신호를 나타냈다. H-2의 양성자 신호는 메탄올-d4에서 δ 4.82에서 넓은 단일선 신호로, DMSO-d6에서 3.5Hz의 작은 결합 상수와 함께 δ 4.72에서 이중선으로 관찰되었으며, 이는 2,3-시스 상대 구성을 나타낸다. 2R, 3R 절대 구성은 -19.6([α]²² _D)의 광학 회전에 의해 제안되었다. 나머지 5개의 지방족 proton 신호는 δ 5.49, 4.14, 4.09, 3.85 및 3.62에서 관찰되었으며, 이는 D-apiofuranose의 존재를 시사한다. β 당 결합은 apiofuranose 모이어티의 아노머 양성자의 커플링 상수(J = 2.9Hz)를 기반으로 결정되었다. C-7에서 당 모이어티의 7-O-연결은 H-1''에서 인접 탄소 원자 C-6, C-7 및 C-8까지의 HMBC 상관 관계에 의해 확인되었다.

상기에서 발굴한 화합물은 (2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside(E7A)로서, 하기의 화학식을 갖는다.

[화학식 1]

실험예 3: 느릅나무속 식물의 E7A 함량 평가

상기 실험예들을 토대로 확인한 배당체 플라보노이드인 E7A가 현재 다양하게 이용되는 다른 느릅나무속 식물에 어느 정도로 함유되어 있는 지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 느릅나무속 식물로서 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq), 당느릎나무(Ulmus davidiana Planchon) 및 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai)의 전처리된 건조시료를 이용하여 동일한 조건(원물 300mg, 용매 30ml, 90℃, 90분, pH 5, 210nm, 20uL injection)에서 추출하였으며, 추출된 용액 샘플을 LC/MS를 통해 분석하였다. 그 결과, 15.53분에 상기 느릅나무속 추출물에서 UV(210nm) 신호 피크가 검출된 것을 확인하였다 (도 5). 또한, HPLC의 표준 곡선 방법을 사용하여 분석한 결과, E7A는 왕느릅나무 추출물에서 현저히 우수한 함량을 갖고 있으며, 다른 느릅나무속 추출물에서는 2.5 ug/ml 이하 정도로 포함되어 있음을 확인하였다.

다음으로, 정성 실험의 정확도를 높이기 위해 15.53분의 MS 결과에 대해 추가적인 실험을 수행하였다. 상기에서 확인한 바와 같이 표준 활성 화합물로 선택한 E7A는 m/z 423 [M + H]⁺ 및 421 [M - H]^- 값을 가졌다. 그 결과, 질량 데이터는 423.150 m/z가 나타났으며, 동일한 MS 결과는 왕느릅나무 추출물에서만 도출되었다 (도 6).

상기 결과를 토대로, E7A는 느릅나무속 식물 중 왕느릅나무에서 고함량으로 함유하고 있는 것을 알 수 있는 바, E7A를 고순도 및 효율적으로 추출하기 위해서는 왕느릅나무를 이용하는 것이 가장 효과적이라는 것을 알 수 있다.

실험예 4: E7A의 파골세포 억제 효능 평가

상기 느릅나무속 식물(유근피)로부터 추출하여 수득한 E7A의 파골세포 억제 효능을 평가하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, E7A의 파골세포 분화 억제 효능을 평가하기 위해, TRAP 염색 분석을 수행한 결과, 1, 3, 10, 20 μM의 E7A을 처리한 경우 분화된 BMM 세포가 감소하였으며, 특히 다핵세포의 수는 E7A의 농도 의존적으로 감소하였다 (도 7A 및 B). 한편, 상기 농도의 E7A는 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 7C). 또한, 파골세포 분화 수준을 확인할 수 있는 PIT 어세이에서도 E7A의 농도의존적으로 파골세포 분화가 억제됨을 확인하였다 (도 8).

다음으로, 20 μM의 E7A을 처리한 경우 파골세포 특이적 마커 유전자인 NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK 및 OSCAR의 발현 수준을 qPCR을 이용하여 분석한 결과, 대조군에 비해 마커 유전자의 발현이 억제됨을 확인하였다 (도 9A). 상기 결과는 NFATc1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과에서도 동일하게 나타났다(도 9B).

다음으로, E7A의 파골세포 분화 억제효능을 왕느릅나무 추출물로부터 수득할 수 있는 활성성분인 Ulmoside A 및 Catechin과 비교하였다. 그 결과, E7A는 Ulmoside A 및 Catechin와 비교하여 현저히 우수한 파골세포 분화 억제 효능을 나타내는 것을 확인하였다(도 10).

실험예 5: E7A 추출 조건 확립

5.1: 반응 표면 방법론(response surface methodology, RSM)에 의한 추출 최적화 설계

상기 실험예에서 확인한 느릅나무속 식물의 유효 활성물질인 E7A를 고효율로 추출하는 조건을 확립하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 유근피로부터 최대 함량의 E7A를 추출하는 공정의 모델링 및 최적화 조건 수립을 위해 3-level-4-factor 실험계획인 Box-Behnken design과 반응표면분석법을 이용하였다. 추출공정에 중요한 독립변수(X_n)로서 고려되는 인자 즉, 원물과 추출 용매의 비율[(L/S ratio, mL/g), X₁], 추출 온도[(T, ℃), X₂], 추출 용매 pH[pH, X₃], 추출 시간[(t, min), X₄]을 요인변수로 하여, 3단계(-1, 0, 1)로 부호화 하였으며, Box-behnken design에 따라, 하기 표 1과 같이 15구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한, 상기의 독립변수에 영향을 받는 종속변수는 E7A의 함량(Y)으로 측정하여 회귀분석을 실시하였다.

Standard order	Ratio (mL/g)	Temp (℃)	pH	Time (min)	E7A content (mg/g extract)
					Actual	Predicted
1	60	50	9	90	2.939982	3.583875
2	100	50	9	90	2.923131	3.695148
3	60	90	9	90	2.958002	6.0283
4	100	90	9	90	8.488186	11.68661
5	80	70	5	60	7.16491	9.473598
6	80	70	13	60	0.093011	-0.08326
7	80	70	5	120	5.606503	9.625085
8	80	70	13	120	0	1.533627
9	60	70	9	60	6.519959	7.161999
10	100	70	9	60	9.131182	9.142613
11	60	70	9	120	7.84878	7.142008
12	100	70	9	120	12.26836	10.93097
13	80	50	5	90	2.42369	2.715729
14	80	90	5	90	9.64775	11.69112
15	80	50	13	90	0.387739	-2.35098
16	80	90	13	90	0.096894	-0.89049
17	60	70	5	90	12.19584	7.613251
18	100	70	5	90	16.72217	12.64207
19	60	70	13	90	0	0.933125
20	100	70	13	90	0.238274	1.673885
21	80	50	9	60	1.520334	2.216257
22	80	90	9	60	11.7217	8.239884
23	80	50	9	120	3.571285	3.906127
24	80	90	9	120	12.16128	8.318384
25	80	70	9	90	6.210983	8.644835
26	80	70	9	90	6.399325	8.644835
27	80	70	9	90	9.958712	8.644835
28	80	70	9	90	10.30981	8.644835
29	80	70	9	90	10.34535	8.644835

반응표면분석에서 독립변수의 종속변수에 대한 2차 회귀식은 다음과 같았다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, X_i 및 X_j는 독립 변수를 나타내고, Y는 종속 변수를 나타내고, β₀, β_i, β_ij 및 β_ii는 각각 절편, 선형, 2차 및 상호 작용 항에 대한 회귀 계수를 나타낸다)

추출특성의 모니터링과 최적조건범위 예측은 각 종속변수의 반응표면분석법을 이용하여 분석하였다.

5.2: 추출 공정

상기의 독립변수를 이용하여 유근피 추출물을 수득하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, HAE(heat-assisted extraction)의 최적화는 용매 증발을 피하기 위해 밀봉된 용기를 사용하는 항온 히터에서 수행되었다. 추출 시간(t, 60-120분), 온도(T, 50-90 ℃), 용매의 pH(pH, pH 5-13), 고액/고체 비율(S/L, 60-100%)에 따라 29개의 실험군으로 설정하여 추출하였으며, 추출 후 원심분리(4000rpm, 1000초, 상온)하고, 상등액을 Whatman 여과지 4호로 여과하였다.

추출물 내 E7A의 함량은 0.45μm 필터를 거친 추출물을 HPLC Waters HPLC system (Milford Worces County, MA)를 이용하여 분석하였다. 이때, 분석조건으로 컬럼은 Phenomenex Luna C18, 5 μm, 100 Å, 250Х100 mm, 이동상은 0.1% formicacid, 유속은 1 ml/min, 검출기는 UV(210 nm)를 각각 사용하였다. 정량은 외부표준법으로 검량선을 작성하여 실시하였다. 즉, 표준물질 E7A(상업적으로는 입수할 수 없는 98% 정제)를 정제수에 녹여 250 ppm으로 한 후, 이 액을 희석하여 125, 62.5, 31.125, 15.63 ppm별로 표준용액을 조제하고, HPLC로 분석한 후, 검량선을 작성하여 정량하였다.

한편, 상기 유근피 추출물로부터 E7A를 분리하기 위해, 건조된 물 추출물(312.5mg)을 증류수(250mL)에 다시 채우고, 상기 용액을 디클로로메탄(250mL), 에틸 아세테이트(250mL), n-부탄올(250mL)에 순차적으로 분배하였다. n-부탄올 층을 Sephadex LH-20 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고 메탄올로 용출하여 46개의 분획(UMB1-UMB46)을 얻었다. UMB 13-46 분획에는 유사한 화학 성분이 포함되어 있어, UMB13-46의 조합을 HPLC로 정제했다.

5.3: E7A 추출 최적화 조건 확립

상기 실험예 5.1의 Box-behnken design를 기반으로 구축된 추출 조건별 실험 및 예측 E7A 함량은 표 1에 나타낸 바와 같았고, 결과에 대한 반응표면 회귀식은 2차 다항식 방정식으로서 하기와 같이 도출되었다.

[수학식 2]

E7A = 8.64+1.23X₁+5.86X₂-4.48X₃+0.43X₄+1.78X₁X₂-0.058X₁X₃ +0.45X₁X₄-7.13X₂X₃-0.40X₂X₄+0.39X₃X₄-0.71X₁ ²+1.45X₂ ²-3.85X₃ ²-1.15X₄ ²

[E7A = E7A 수율(mg/g), X₁ = 원물과 추출 용매의 비율(용매/원물, mL/g), X₂ = 추출 온도 (℃), X₃ = 추출 용매 pH (pH), X₄ = 추출 시간 (min)]

상기 E7A 함량에 대한 회귀식은 R²은 0.85로 높은 상관관계를 보였다.

상기 추출물에서 E7A 함량에 대한 추출 매개변수의 효과를 3차원 반응표면 다이어그램으로 도 11에 나타냈다. 상기 도 11을 살펴보면, 추출 조건 중 추출 용매의 pH가 E7A 함량에 가장 큰 영향을 주었으며, 추출 용매의 pH가 낮을수록 E7A의 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 또한, 원물과 추출용매 비율 역시 E7A 함량에 영향을 주었으며, '원물:추출 용매'의 비율이 높을수록 E7A의 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 추출온도가 높을수록 E7A의 함량 이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 추출시간 역시 E7A 함량에 영향을 주었다.

반응표면분석에 따라 예측된 E7A의 최대값은 26.0487 mg/g extract (E7A양/추출물양)으로 예측되었고(표 2), 이때의 추출 조건은 추출 용매 pH5, 추출 온도 90 ℃, 추출 시간 96.82분 및 원물과 추출 용매의 비율 1:100로 각각 결정되었다. 즉, pH가 낮은 증류수에 원물:추출용매=1:100 비율로 90℃에서 97분 추출할 경우 가장 높은 수율의 E7A를 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.

Ratio (mL/g)	Temp (℃)	pH	Time (min)	E7A content (mg/g extract)
				Predicted	Actual
100	90	5	97	26.0487	26.05±0.96

상기 결과를 토대로, 유근피로부터 최대 E7A 함량을 갖는 추출물을 수득하기 위한 추출 공정은 추출 용매 pH, 추출 온도, 추출용매 비율 및 추출 시간을 포함하는 추출 조건의 영향을 받은 것으로 확인되었고, 모든 변인조건에서 영향을 크게 받는 것으로 확인되었다. 또한, 추출조건에 따른 E7A 함량을 설명하는 유의성을 가진 회귀식이 수립되었고, E7A 추출에 최적인 추출조건을 결정할 수 있다.

실험예 6: 최적화 조건으로 추출된 유근피 추출물의 파골세포 억제효능 평가

상기 실험예 5에서 확립한 최적화 조건을 통하여 수득한 유근피(왕느릅나무) 추출물의 효능을 평가하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 최적화 유근피 추출물(이하, Opti)의 파골세포 분화 억제 효능을 평가하기 위해, TRAP 염색 분석을 수행한 결과, 1, 3, 10, 20 μM의 Opti를 처리한 경우 분화된 BMM 세포가 감소하였으며, 특히 다핵세포의 수는 E7A의 농도 의존적으로 감소하였다 (도 12A 및 B). 한편, 상기 농도의 Opti는 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 12C). 또한, 파골세포 분화 수준을 확인할 수 있는 PIT 어세이에서도 Opti의 농도의존적으로 파골세포 분화가 억제됨을 확인하였다 (도 13).

다음으로, 20 μM의 Opti를 처리한 경우 파골세포 특이적 마커 유전자인 NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK 및 OSCAR의 발현 수준을 qPCR을 이용하여 분석한 결과, 대조군에 비해 마커 유전자의 발현이 억제됨을 확인하였다 (도 14A). 상기 결과는 NFATc1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과에서도 동일하게 나타났다(도 14B).

상기 결과를 토대로, 본 발명에서 확립한 최적화 조건으로 추출한 유근피 추출물은 E7A 함량이 최대치로 포함되어 있는 바, 파골세포 분화 억제능이 우수한 것을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

1) 유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계; 및
2) 상기 열수 추출물 또는 이의 분획물로부터 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드 [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside, E7A], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 분리하는 단계
를 포함하는, E7A 제조 방법으로서,
상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것이고,
상기 열수 추출은 80 내지 100℃ 조건에서 수행되는 것이고,
상기 열수 추출은 60분 내지 120분 동안 수행되는 것이며,
상기 추출 용매 및 유근피의 부피/중량비는 80 (mL/g) 내지 120 (mL/g)인 것인, 방법.

삭제

삭제

삭제

청구항 1에 있어서, 상기 유근피는 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa)로부터 유래된 것인, 방법.

유근피 및 추출 용매를 이용하여 열수 추출을 수행하는 단계를 포함하는, 유근피 추출물 제조 방법으로서,
상기 추출 용매의 pH는 4 내지 6인 것이고,
상기 열수 추출은 80 내지 100℃ 조건에서 수행되는 것이고,
상기 열수 추출은 60분 내지 120분 동안 수행되는 것이며,
상기 추출 용매 및 유근피의 부피/중량비는 80 (mL/g) 내지 120 (mL/g)인 것이며,
상기 유근피 추출물은 (2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드 [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside, E7A], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 것인, 방법.

삭제

청구항 6에 있어서, 상기 유근피 추출물은 20 mg/g 내지 30 mg/g의 E7A를 포함하는 것인, 방법.

(2R,3R)-에피카테킨-7-O-β-D-아피오퓨라노사이드 [(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside, E7A], 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris)에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)에 의한 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 약학 조성물.

청구항 9에 있어서, 상기 E7A, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물은 청구항 1 및 5 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 수득된 것인, 조성물.

유근피 추출물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 유근피 추출물은 청구항 6 및 8 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 수득된 것이고,
상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris)에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)에 의한 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.