KR102656678B1 - 식물 생장 촉진능 및 식물병 방제 효능이 있는 바실러스 벨레젠시스 jc-9 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)는 식물병 유발 균주에 대하여 항균능이 있어 농약 조성물로 활용하기 좋고, 식물 성장을 촉진시키는 옥신(IAA)를 생산하기 때문에 비료 조성물로 활용 가능하다.
Description
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 식물병 방제 효능 및 식물의 성장 촉진능이 우수하다.
화학적 기술에 기초한 농약 및 비료는 자연생태계의 파괴, 병해충의 농약 저항성 증대, 토양과 수질 오염 야기 등 사회적 문제를 일으켜 왔다. 이에 최근 전 세계적으로 화학농약과 비료 사용을 줄이는 정책 시행으로 생물 농약, 생물 비료 시장규묘가 점점 커지고 있는 추세이고, 미생물을 이용한 친환경자재 시장이 점차적으로 증가하고 있다.
그럼에도 국내 스마트 온실 농가 대상으로 실시한 조사(박영균, 2020)에 따르면 97.1%가 화학적 방법을 이용해 병해충을 방제하고 있다고 답변하였으며, 가장 큰 문제가 되는 식물병으로 탄저병과 같은 곰팡이성 병해로 응답하였다고 한다.
이처럼 친환경 기술에 대한 주목도가 증가하는 상황에도 실제 현장에서는 대부분 화학적 제제를 사용하는데, 아직 미생물을 활용한 친환경 제제가 효과가 느리고, 효과가 우수하지 못해서이다.
따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 우량 균주 선별, 엄격한 품질 관리, 효능과 효과 검증, 미생물 활력 유지 및 실증 검증 등을 통한 맞춤형 사용 매뉴얼 구축 등의 기술력 연구가 필요한 상황이다.
본 발명의 목적은 식물병 유발 균주인 산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis)에 대한 항균능이 있으면서도, 식물 성장을 촉진시킬 수 있는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP) 및 이를 활용한 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 식물병에 대해 방제효과 및 작물 생장 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)를 제공한다.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP), 이의 배양액 또는 이 배양액의 건조분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 비료 조성물을 제공한다.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP), 이의 배양액 또는 이 배양액의 건조분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 농약 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)는 식물병 유발 균주에 대하여 항균능이 있어 농약 조성물로 활용하기 좋고, 식물 성장을 촉진능이 좋아 비료 조성물로도 활용 가능하다.
도 1은 본 발명 균주와 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966를 배양하여 항균성을 확인한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명 균주의 배양액에 식물 성장 조절 호르몬인 옥신(IAA)이 있는지 확인하기 위해 LC-MSMS 분석을 실시한 결과이다.
도 3 및 도 4는 본 발명 균주의 배양액에 항균 물질(바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin))이 있는지 확인하기 위해 LC-MSMS 분석을 실시한 결과이다.
도 5는 본 발명 균주의 사이드로포어(Siderophore) 생산량을 보여준다.
도 6은 본 발명 균주 배양액을 실제 작물에 미생물 비료로 사용하여 얻은 결과이다.
도 2는 본 발명 균주의 배양액에 식물 성장 조절 호르몬인 옥신(IAA)이 있는지 확인하기 위해 LC-MSMS 분석을 실시한 결과이다.
도 3 및 도 4는 본 발명 균주의 배양액에 항균 물질(바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin))이 있는지 확인하기 위해 LC-MSMS 분석을 실시한 결과이다.
도 5는 본 발명 균주의 사이드로포어(Siderophore) 생산량을 보여준다.
도 6은 본 발명 균주 배양액을 실제 작물에 미생물 비료로 사용하여 얻은 결과이다.
본 발명은 식물병에 대해 방제효과 및 작물 생장 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)를 제공한다.
하기 실시예에 따르면, 본 발명 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)는 식물병(검은점 무늬병) 유발 균주에 대해 방제효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP)는 식물의 성장을 조절하는 호르몬인 옥신(IAA)를 생산하는데, 이에 본 발명 균주 배양액을 실제 작물에 처리한 결과 식물 성장 촉진능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP), 이의 배양액 또는 이 배양액의 건조분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 비료 조성물 또는 농약 조성물을 제공한다.
한편, 상기 농약 조성물은 바람직하게 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin), 사이드로포어(Siderophore)로 저해할 수 있는 식물병 방제 농약으로 사용하는 것이 좋다.
하기 실시예에 따르면, 본 발명 균주는 항균 물질인 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin), 사이드로포어(Siderophore)를 생산한다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 후보 균주 확보 및 항균능 확인 실험]
후보 균주들을 확보하기 위해, 국내 과수농장 밭 토양 1g을 채취하여 인산 완충 생리식염수 (Phosphate buffered saline, Ph 7.0)에 희석한 후, TSA(Tryptic Soy Agar)플레이트에 도말하여, 30 ℃에서 3일 이상 배양하였다. 이를 통해 50점의 균주를 분리할 수 있었다.
이후 분리한 후보 균주를 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966과 배양하여 항균능이 있는지 확인하고자 했다.
항균능 확인 실험방법은 PDA배지 가운데에 후보 균주를 접종하고, 주변부에 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966을 접종하였다. 이후 1주일간 30℃에서 정치배양하고, 상태를 관찰하였는데, 후보 균주 중 JC-9 균주가 우수한 항균능을 가지고 있었다 (도 1).
도 1은 본 발명 균주와 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966를 배양하여 항균성을 확인한 실험 결과로, 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966의 형태가 JC-9가 접종된 부분을 중심으로 동그랗게 깍여있는 모습을 볼 수 있는데, 이는 본 발명 균주 JC-9가 검은점 무늬병 세균인 Xanthomonas campestris pv. campestris KACC 17966에 대하여 우수한 항균능이 있음을 의미한다.
이하 실험에서는 본 발명 균주인 JC-9로만 실험하였다.
[실시예 2: 본 발명 균주의 식물성 호르몬 생산 확인 실험]
본 발명 균주(JC-9)를 미생물 비료로 사용하였을 때 식물 생장 촉진 효과가 있을지 확인하기 위해, 본 발명 균주의 배양액에 식물호르몬 옥신(IAA)이 있는지 검출하고자 했다.
식물호르몬 옥신은 트립토판으로부터 합성되는 아미노산 유도체로서 식물의 성장을 조절하는 호르몬 중 하나로, 옥신은 식물 줄기와 잎, 뿌리의 성장을 촉진하고, 낙과를 방지하며, 착과를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
한편, 옥신(IAA) 검출 실험방법은 JC-9 균주 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 QuEChERS 방법을 사용하여 전처리하고, LC-MSMS 분석을 하였다 (도 2). 한편, LC-MSMS 분석은 컬럼으로 X-Bridge (2.1 x 100mm, 3.5㎛, C18)을 사용하고, flow rate를 0.2ml / min 으로 설정하여 실험하였다.
도 2는 LC-MSMS 분석 결과를 보여주는데, 이를 보면 JC-9 균주가 식물 생장 촉진 물질인 옥신(IAA)을 생산할 수 있음을 확인할 수 있다.
[실시예 3: 본 발명 균주의 항균 물질 생산 확인 실험]
본 발명 균주(JC-9)를 미생물 농약으로 사용하였을 때 어떤 항균 물질로 항균 효과를 나타내는지 확인하고자 했다.
실험방법은 JC-9 균주 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 SPE(Solid-Phase Extraction) 방법을 사용하여 전처리하고, LC-MSMS 분석을 하였다 (도 3, 도 4). 한편, LC-MSMS 분석은 컬럼으로 X-Bridge (2.1 x 100mm, 3.5㎛, C18)을 사용하였고, flow rate를 0.2ml / min 으로 설정하였다.
도 3 및 도 4는 LC-MSMS 분석 결과를 보여주는데, 이를 보면 본 발명 균주의 배양액에는 항균 물질인 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin)이 있는 것을 확인할 수 있다.
한편, 해당 Mass peak가 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin), 수르팩틴(Surfactin)을 나타내는게 맞는지는 'H.Chen 외 5인“Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced byBacillus subtilis”, 2007, Letters in Applied Microbiology Volume 47, Issue 3 p. 180-186' 을 참고하여 확인할 수 있었다.
[실시예 4: 본 발명 균주의 항균 물질 생산 확인 실험 2]
본 발명 균주(JC-9)를 미생물 농약으로 사용하였을 때 어떤 항균 물질을 얼마나 생산하여 항균 효과를 나타내는지를 확인하고자 했다.
사이드로포어(Siderophore)는 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원균을 억제하는 물질이다.
본 발명 균주의 사이드로포어 생산량은 CellAct-BS 배지에서 배양한 미생물 배양액 상등액을 ethyl acetate로 추출하여 Hathway's reagent와 반응 후 분광광도계로 700nm에서 흡광도를 측정하여 정량할 수 있었다 (도 5). 도 5을 보면, 본 발명 균주가 96시간에 8.52 mmol/ml 농도의 사이드로포어를 생산한 것을 확인할 수 있다.
[실시예 5: 본 발명 균주의 식물 생장 촉진능 확인 실험]
본 발명 균주(JC-9) 배양액을 실제 작물에 미생물 비료로 사용하여도 효과가 있을지 확인하고자 했다.
상추(청치마)에 배양액(1 x 10^9 CFU/ml)의 250배 희석액 또는 500배 희석액을 7일 간격으로 처리(엽면시비, 난괴법 방법 사용)하고, 변화를 관찰하였다 (도 6). 한편, 대조군은 배양액 무처리군으로 설정하였다.
상기 실험을 3회 반복하고, 생육정도를 구체적으로 알아보기 위해 상추의 엽수 및 엽생체중을 측정하고, 상추의 가장 긴 엽의 엽장, 엽폭, 낱중, 엽록소 함량을 측정하였다. 한편, 상기 엽록소 함량은 chlorophyll meter(model SPAD-50, Minolta, Japan.)로 가장 긴 엽의 중앙부위를 측정하였다.
상기 측정한 값의 평균값을 하기 표 1에 나타내었다. 각 조건별 측정 결과는 SPSS statistics 19 program을 이용하여 평균과 표준편차를 구하고 일원배치분산분석(one way ANOVA)을 실시한 후, Duncan’s multiple range test를 실시하여 유의성 검정하였다.
| 구분 | 엽장(cm) | 엽폭(cm) | 낱중(g) | 엽수 (No./plant) |
엽록소 (SPAD) |
엽생체중(g) |
| 무처리구 | 9.9a | 12.9a | 11.6a | 9.3a | 19.8a | 81.8a |
| 500배 희석액 처리구 | 15.1c | 17.1c | 14.5bc | 12.0b | 20.1a | 102.4bc |
| 250배 희석액 처리구 | 13.8b | 15.6b | 14.1b | 12.3bc | 20.7ab | 97.0b |
상기 표 1을 보면, 본 발명 균주가 처리된 (500배 희석액 처리구, 250배 희석액 처리구) 처리구의 경우 생장이 상당하게 촉진된 것을 확인할 수 있다.
[실시예 6: 본 발명 균주의 유전적 동정]
본 발명 균주(JC-9)를 16S rRNA 염기서열 분석 하여 동정을 수행하고자 했다. 분리 균주는 순수분리한 후 TSA 플레이트(Plate)상태로 냉장 택배를 이용하여 ㈜솔젠트(대전)에 의뢰하였고, 27F 및 1492R의 유니버설 프라이머 세트(universal primer set)를 사용하여 16S rRNA 염기서열 분석 수행하였다.
수행결과 본 발명 균주 JC-9의 16S rRNA 염기서열은 총 1,416bp 서열(서열번호 1)을 가진 것을 확인할 수 있었다.
해당 염기서열을 기초로 ncbi blast를 실행하였고, 그 결과 JC-9는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)와 99%의 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었고, 이에 본 발명 균주를 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9로 명명하였다.
그 후, 본 발명 균주 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9를 농촌진흥청 국립농업과학원(KACC)에 10월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 81190BP를 부여받았다.
기탁기관명 : 농촌진흥청 국립농업과학원
수탁번호 : KACCKACC81190BP
수탁일자 : 20211022
<110> Ecobiznet Inc.
<120> Bacillus velezensis JC-9 strain with plant growth promoting
ability and plant disease control ability and use thereof
<130> YP-21-224
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus velezensis JC-9
<400> 1
gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120
ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 240
gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360
tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420
gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720
gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960
ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200
aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380
cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgcc 1416
Claims (3)
- 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin) 및 수르팩틴(Surfactin)을 생산하고, 검은점 무늬병에 대해 방제효과를 발휘하며, 옥신(IAA, indol acetic acid) 생산을 통해 작물 생장 촉진 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP).
- 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin) 및 수르팩틴(Surfactin)을 생산하고, 검은점 무늬병에 대해 방제효과를 발휘하며, 옥신(IAA, indol acetic acid) 생산을 통해 작물 생장 촉진 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP), 이의 배양액 또는 이 배양액의 건조분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 비료 조성물.
- 바실로마이신 D (Bacillomycin D), 펜기신(Fengycin) 및 수르팩틴(Surfactin)을 생산하고, 검은점 무늬병에 대해 방제효과를 발휘하며, 옥신(IAA, indol acetic acid) 생산을 통해 작물 생장 촉진 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) JC-9 (KACC81190BP), 이의 배양액 또는 이 배양액의 건조분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 농약 조성물.
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