KR102652813B1 - Nk세포배양액을 포함하는 신규한 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 인체나 피부에 대한 부작용은 줄이면서도 피부 리프팅 개선, 피부 탄력 개선, 피부장벽 보호 등에 우수한 효과를 발휘할 수 있도록 자연살해세포 배양액 및 천연 복합추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 본 발명의 일측면에 따르면 화학물질의 함량을 현저하게 줄이면서 피부 리프팅 및 탄력 증진, 피부장벽 보호 등을 도모할 수 있고, NK세포 배양액 및 복합 천연 추출물을 활용한 새로운 화장료 조성물을 제공할 수 있으므로 소비자에게 선택권 보장 및 관련 산업 발전에 기여할 수 있다.

Description

NK세포배양액을 포함하는 신규한 화장료 조성물{NOVEL COSMETIC COMPOSITION COMPRISING NK CELLS CULTIVATION SOLUTION}

본 명세서는 NK세포배양액을 포함하는 신규한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다.

기존의 피부 미용 관련 기술이나 화장료 조성물의 경우 미용 효과나 피부의 색조를 개선시키기 위한 목적으로 양산 및 화장 효과에 주안점을 두어 제품을 개발하다 보니 그와 관련된 여러 화학물질 및 합성물질 등이 다량 함유되어 있는 경우가 많았다. 그러한 제품들은 피부 관리 면에서 일시적인 효과를 가져다 주기도 하나 제품에 첨가된 메칠파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올과 같은 화학 방부제 등으로 인해 해당 제품을 피부에 지속적으로 사용하는 경우에는 자극, 염증, 가려움 등 다양한 부작용이 나타난다는 문제점이 있었다.

생활 및 문화 수준이 향상됨에 따라 현대인들은 보다 친환경적이고 보다 안전하게 외모와 피부를 가꿀 수 있는 방법에 관하여 많은 관심을 가지게 되었고, 산업계에서도 그러한 화장품 등을 개발하기 위한 노력을 꾸준히 지속해 오고 있으며 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 다양한 방안을 찾고 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 안전성이 높고 피부 부작용이 적은 천연 유래 추출물을 대상으로 피부 개선효과를 가지는 화장용 조성물을 연구하였고, 특히 자연살해세포(Natural killer cell, NK 세포)의 배양액을 활용하여 새롭고도 효과 좋은 화장료 조성물을 개발하기 위해 노력한 끝에 본 발명을 완성하였다.

(대한민국 출원특허) 제10-2013-0001333호(2013.01.04)

본 명세서는 종래의 화학성분이 과도하게 첨가된 화장품 등의 문제점을 해결하기 위하여 개발한 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 명세서의 목적은 인체나 피부에 대한 부작용은 수반하지 않으면서 피부 리프팅 개선, 피부 탄력 개선, 피부장벽 보호 등에 우수한 효과를 발휘할 수 있도록 자연살해세포 배양액 및 천연 복합추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 명세서는 자연살해세포 배양액, 쇠비름(Portulaca Oleracea), 질경이씨(Plantago Asiatica Seed), 연꽃씨(Nelumbo nucifera Seed)의 혼합 추출물, 글루콘산 용액, 포름산게라닐(geranyl formate) 및 L-테아닌을 포함하는 피부 리프팅 및 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 쇠비름, 질경이씨, 연꽃씨의 중량비는 1 : 2.5 : 3.5일 수 있다.

또한, 상기 글루콘산 용액은 글루콘산 50중량% 정제수 50중량%일 수 있다.

한편, 상기 L-테아닌은 상기 화장료 조성물 100중량부를 기준으로 0.7 내지 0.9중량부일 수 있다.

아울러, 상기 화장료 조성물은 카퍼트리펩타이드를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 따른 화장료 조성물을 사용할 경우 기존의 화장료 제품 보다 화학물질의 함량을 현저하게 줄이면서 피부 리프팅 및 탄력 증진, 피부장벽 보호 등을 도모할 수 있고, NK세포 배양액 및 복합 천연 추출물을 활용한 새로운 화장료 조성물을 제공함으로써 친환경적이고도 안전한 제품을 택하려는 소비자에게 선택권을 보장할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일측면에 따른 조성물을 사용하였을 때 볼 리프팅 효과가 우수함을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일측면과 성분이나 함량을 다르게 한 경우 안면 볼 리프팅 개선 효과가 거의 나타나지 않는다는 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일측면에 따른 조성물을 사용할 경우 피부 탄력 개선 효과가 우수함을 나타낸 것이다.

이하 본 명세서에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 실시예, 비교예, 실험예, 제조예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예, 비교예, 실험예, 제조예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 명세서 NK세포란 자연살해세포를 포함하고, 자연살해세포 분비물이란 예를 들면 자연살해세포를 배양하고 이를 분리 정제하여, 잔재하는 배양액으로부터 얻어질 수 있고, 잔재하는 배양액 자체를 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 하기 동물세포 배양배지 및 하기 성분들은 통상 세포의 성장에 도움을 주는 성분, 세포를 안정화시키는 성분들로서, 이는 세포의 성장에 영향을 미치는 것으로서, 이들 성분이 달라진다고 하여 세포 성장 정도가 달라질 수는 있으나, 세포의 분비 성분은 그에 영향을 받지 않는 것이고, 하기 예시는 일 구현예일뿐 그에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 자연살해세포의 배양은 당 분야에 공지된 통상의 동물세포배양 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, XVIVO 20, RPMI1640 등을 들 수 있다. 자연살해세포의 배양은 원료 세포를 배양하여 자연살해세포를 얻는 것 또는 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 원료세포(seed cell)는 적절한 배양을 통해 자연살해세포로 증식될 수 있는 세포를 포함하며, 구체적으로는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포일 수 있다. 이는 예를 들면 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(Peripheral blood mononuclear cell, 말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포, 만능유도 줄기세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.

원료세포의 배양은 자연살해세포의 배양 촉진을 위한 성분들이 추가로 포함된 배지에서 수행된 것일 수 있다. 상기 배양 촉진을 위한 성분은 예를 들면 지지세포, 지지세포 자극인자, 성장인자 등일 수 있다.

본 명세서에서 지지세포(feeder cell)는 분열증식하지 못하게 하였으나 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 자연살해세포 증식을 돕는 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 지지세포로는 자연살해세포의 증식을 돕는 것이라면 제한 없이 적용가능하며, 예를 들면 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-cell, B-cell, 단핵구(monocyte), CD4 양성(이하"(+)"라 한다) T 세포 등을 들 수 있으며, 구체적인 예를 들자면 자기 말초혈 백혈구 세포(PBL) 및 CD4(+) T 세포 중 적어도 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 지지세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 불활성화시킨 지지세포(feeder cell)는 분리된 T-세포(purified T cell)를 포함한다.

지지세포 자극인자로는 예를 들어 항-CD3 항체를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용가능하며, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 항-CD3 항체는 예를 들면 01~100 ng/ml의 범위로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 여기에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양한 것일 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, PBMC로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 배지는 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 더 포함하는 것일 수 있고, 혈청 또는 혈장 자체를 포함하는 것일 수 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 바람직하며, 예를 들면 human AB serum 또는 auto plasma일 수 있다.

본 발명은 일측면에서 자연살해세포 배양액, 쇠비름(Portulaca Oleracea), 질경이씨(Plantago Asiatica Seed), 연꽃씨(Nelumbo nucifera Seed)의 혼합 추출물, 글루콘산 용액, 포름산게라닐(geranyl formate) 및 L-테아닌을 포함하는 피부 리프팅 및 탄력 증진용 화장료 조성물일 수 있다.

일 예로서, 상기 쇠비름은 잎, 줄기 및 뿌리 중 어느 하나 이상일 수 있다.

다른 예로서, 상기 혼합 추출물의 함량은 상기 화장료 조성물 총 100중량% 대비 0.9중량% 이상 또는 1.4 중량% 이하일 수 있다.

일측면에서 상기 쇠비름, 질경이씨, 연꽃씨의 중량비는 1 : 4.5 : 2.8일 수 있다.

다른 측면에서, 상기 글루콘산 용액은 용액 전체 함량 100중량% 기준으로 글루콘산 50중량% 정제수 50중량%일 수 있다. 바람직하게는 상기 글루콘산 용액의 상기 화장료 조성물 내 함량은 1.8 내지 2.2중량%일 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 L-테아닌은 상기 화장료 조성물 100중량부를 기준으로 0.7 내지 0.9중량부일 수 있다. 바람직하게는 0.7 내지 0.8중량부일 수있다.

일 구현예로, 상기 화장료 조성물은 카퍼트리펩타이드를 더 포함하는 것일 수 있다. 바람하게는 상기 카퍼트리펩타이드는 카퍼트리펩타이드-1일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 NK세포 배양액의 함량은 화장료 조성물 총 100중량% 대비 1.0중량% 이상 또는 1.3중량% 이하일 수 있다. 바람직하게는 1.0 내지 1.3중량%일 수 있다.

일 측면에서 상기 포름산게라닐(geranyl formate)은 상기 화장료 조성물 내에서 0.8 내지 1.2중량%일 수 있다.

하기 제조예 및 실험예를 통해, 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물을 사용할 경우 안면 특히 볼 리프팅 효과가 뛰어나고, 피부 탄력 개선 효과가 우수하며, 피부 장벽 강화 효과도 현저함을 확인하였다. 각각의 실험을 통해 제조예 2 내지 7과 같이 주요 성분의 함량이 상기 제시된 범위를 벗어나 미달할 경우 위와 같은 효과는 발생하지 않음을 확인하였다. 한편, 표 2에 제시된 주요 성분의 함량이 상기 기재된 범위를 벗어나 초과할 경우에는 화장료로서의 제형을 유지하기 어렵거나 성분이 균질화 되지 않아 품질상 화장료로 사용하기 불가능함을 알 수 있었다.

한편, 본 명세서에 따른 화장료 조성물은, 바람직하게는 상기 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형으로 이루어진 기초화장료 제형, 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형, 스킨, 로션, 아이크림, 수딩젤, 연고, 마스크팩용 제형, 바디워시용 제형, 필링젤, 수중유형 메이크업베이스, 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형, 선크림, 비비크림 및 두피용 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

한편, 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테를 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 드라가칸트 등이 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이드, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이드, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예, 제조예, 실험예 등을 통하여 본 발명의 일측면에 따른 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 예들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 예에 한정되지 않는다는 것은 자명할 것이다.

[실시예 1]

시중에서 판매되는 쇠비름(Portulaca Oleracea) 잎, 질경이씨(Plantago Asiatica Seed) 및 연꽃씨(Nelumbo nucifera Seed)를 구매하여 정제수로 3회 세척 후 1 : 4.5 : 2.8의 중량비로 측량하여 혼합한 다음 잘게 분쇄하여 분쇄물을 만들었다. 상기 분쇄물 200g에 70% 에탄올 800g을 가한 후 섭씨80도에서 2시간 동안 가열하여 추출한 다음 하루 동안 상온에서 불순물을 침전시킨 후 여과지를 이용하여 2회 여과한 여액에 대해 감압 농축하여 추출물을 수득하였다(18.0 brix).

[실시예 2]

자연살해세포의 분비물을 수득하기 위해 먼저 CD3 음성(이하 "(-)"라 한다) PBMC 원료세포를 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자로부터 채취한 PBMC에 PBS(phosphate buffered saline, LONZA, 17-516Q)를 1:1 비율로 추가하여 1500rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. PBMC 펠렛을 10x10⁶cells/mL로 MACS 러닝 버퍼(running buffer, 2% FBS와 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 현탁하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포수를 측정하였다.

CD3 양성(이하"(+)"라 한다) 세포를 제거시킨(depletion) 원료세포를 수득하기 위해 5~10x10⁶ cells을 50 mL 튜브로 옮긴 후 1200rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 5~10x10⁶ cells의 PBMC 세포에 400 ~ 800 μL의 MACS running buffer와 100 ~ 200 μL의 CD3 자기비드(Miltenyi biotech, 130050101)를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 10배 이상의 MACS 러닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1350 rpm, 4℃에서 7분간 원심분리하고 최종 2 mL의 MACS 러닝 버퍼에 현탁하였다. VarioMACS (Miltenyi Biotech)에 CS컬럼(column, Miltenyi Biotech, 130-041-305)을 장착하여 세포를 분리하고, 컬럼을 3회 세척하여 세포를 회수하였다. 자동 세포 계수기를 사용하여 CD3(-) PBMC 세포수를 측정하였다. 수득한 CD3(-) PBMC를 CellGro SCGM 배지(Cellgenix, 20802-0500)에 현탁하고, 1x10⁵cells/mL에 맞춰 CellGro SCGM 배지에 현탁하였다.

말초혈 PBMC 지지세포는 PBS(phosphate buffered saline, LONZA, 17-516Q)를 1:1 비율로 추가하여 1500rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. PBMC 펠렛을 10x10⁶cells/mL로 MACS 러닝 버퍼(running buffer, 2% FBS와 2mM EDTA가 포함된 PBS)에 현탁하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포수를 측정하였다. 이후 CellGro SCGM 배지로 5x10⁶cells/mL로 현탁하고 감마선 조사기로 2000cGy로 조사하여 불활성화시켰다.

다음으로 자연살해세포를 배양한 다음 배양액을 수득하였다. 구체적으로, Cellgro SCGM 배지에 500 IU/mL의 IL-2(프로류킨 주,한국노바티스), 10 ng/mL의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)와 1~2부피% 공여자 혈장을 넣고 배양배지를 준비한다. 배양 0일째 CD3(-) PBMC 원료세포와 감마선 조사된 지지세포를 1:5의 비율로 섞어준 후 총 세포수를 기준으로 2x10⁶cells/mL로 세포 농도를 맞추어서 5일간 정치 배양하였다(37℃).

배양 5일째에 동량의 배양배지(Cellgro SCGM, 500 IU IL-2, 1부피% 공여자 혈장)를 넣고 다시 정치 배양하였다. 배양 7일째 배양 0일째와 동일한 방식으로 배양 중인 세포를 1:5비율의 지지세포주, 500 IU/mL IL-2, 10 ng/mL의 OKT-3, 그리고 1 부피% 공여자 혈장을 넣고 총 세포수 기준 1x10⁶ cells/mL로 세포 농도를 맞추어서 재자극을 수행 후 3일간 정치 배양한다. 이후 2~3일 간격으로 세포수를 측정하고 0.5~1x10⁶ cells/mL이 되도록 배양배지를 추가하며 20~21일까지 배양하였다. 이후 배양 중인 세포를 1L 원심분리용 튜브에 옮긴 후 1500 rpm, 4℃에서 15 분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 회수하였고 이를 "NK세포 분비물" 또는 "NK세포 배양액"으로 명명하였다. 즉, 상기 "NK세포 분비물" 또는 "NK세포 배양액"는 NK 세포 자체는 포함하지 않되 NK세포 배양시에 NK세포가 분비하는 물질을 포함한다.

한편, Cellgro SCGM 배지에 500 IU/mL의 IL-2, 10 ng/mL의 OKT-3와 1~2부피% 공여자 혈장을 첨가한 배양배지를 NK 세포배지로 명명하였다.

[실시예 3]

실시예 1의 혼합 추출물, 실시예 2의 NK세포 배양액, 글루콘산 용액(글루콘산 50중량%, 정제수 50중량%, 주식회사 덕산종합과학), 포름산게라닐(Geranyl formate, 95중량%이상, CAS Number 105-86-2, 시그마알드리치), L-Theanine(씨그마알드리치코리아 유한회사, 대한민국) 및 리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1(정제수 93.9중량%, 1,2-헥산다이올 5중량%, 카퍼트리펩타이드-1 0.1중량% 및 hydrogenated lecithin 1중량%, (주)AN, 대한민국)를 균질하게 혼합하여 스킨 크림 제조용 화장료 조성물을 제조하되, 세부 함량은 하기 표 1과 같이 하였다(단위: mg).

구분	함량(mg)
실시예 1의 혼합 추출물	1.4
실시예 2의 NK세포 배양액	1.3
글루콘산 용액(글루콘산 50중량%, 정제수 50중량%)	2.2
Geranyl formate	1.2
L-Theanine	0.8
리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1	1.2

[비교예]

상기 실시예 3과 같이 화장료 조성물을 제조하되, 상기 혼합 추출물, NK 세포 배양액, 글루콘산 용액, 포름산게라닐, L-테아닌 및 리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1의 함량을 하기 표 2와 같이 각각 달리하여 화장료 조성물(비교예 1 내지 비교예 6)을 제조하였다(단위: mg).

구분	실시예 3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4	비교예5	비교예6
실시예 1의 혼합 추출물	1.4	0.8	1.4	1.4	1.4	1.4	1.4
실시예 2의 NK세포배양액	1.3	1.3	0.9	1.3	1.3	1.3	1.3
글루콘산 용액(글루콘산 50중량%, 정제수 50중량%)	2.2	2.2	2.2	1.7	2.2	2.2	2.2
Geranyl formate	1.2	1.2	1.2	1.2	0.7	1.2	1.2
L-Theanine	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.6	0.8
리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	0.7

[제조예]

상기 실시예 3과 비교예 1 내지 6의 화장료 조성물을 원료로 하되 부가 성분을 추가하여 스킨 크림을 제조하였고, 구체적인 조성은 하기 표 3과 같다(단위: mg).

구분	제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	제조예7
실시예 1의 혼합 추출물	1.4	0.8	1.4	1.4	1.4	1.4	1.4
실시예 2의 NK세포배양액	1.3	1.3	0.9	1.3	1.3	1.3	1.3
글루콘산 용액(글루콘산 50중량%, 정제수 50중량%)	2.2	2.2	2.2	1.7	2.2	2.2	2.2
Geranyl formate	1.2	1.2	1.2	1.2	0.7	1.2	1.2
L-Theanine	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.6	0.8
리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	0.7
부틸렌글라이콜	7.5	7.5	7.5	7.5	7.5	7.5	7.5
베타인	6.5	6.5	6.5	6.5	6.5	6.5	6.5
에탄올	4.5	4.5	4.5	4.5	4.5	4.5	4.5
나이아신아마이드	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5
1,2-헥산다이올	5.2	5.2	5.2	5.2	5.2	5.2	5.2
글리세린	8.2	8.2	8.2	8.2	8.2	8.2	8.2
착향료	2.8	2.8	2.8	2.8	2.8	2.8	2.8
PEG-40 hydrogenated castor oil	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2
PPG-26-buteth-26	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

[실험예 1] 볼 리프팅 개선 효과

안면 볼 리프팅 개선 정도 평가 실험은 남녀 구분 없이 평균연령 50세의 피시험자 10명에게 6주간 아침 및 저녁 세안 후 상기 표 3의 제조예 1의 스킨 크림을 안면 볼 부위에 고르게 펴 바르게 하였고, 사용 전과 6주 사용 후 피시험자의 좌측 볼을 촬영(ANTERA 3D, Miravex, Ireland)하고 ANTERA CS software를 이용하여 측정 부위의 함몰 부피를 나타내는 Depressions medium 값(평균)으로 안면 볼 리프팅 개선 정도를 비교하였다. 표 3의 제조예 2 내지 7로 제조한 스킨 크림에 대해서도 동일한 평균 연령대의 각각 다른 피시험자 10명씩에게 각각 상기와 같이 안면 볼 리프팅 개선 정도를 비교하였다.

그 결과, 실시예 3으로 제조한 스킨 크림(제조예 1)을 사용한 경우 6주 후 피부의 함몰된 부피를 나타내는 Depressions medium 값이 0.92에서 0.526으로 변화하여 개선율이 42.8%에 이르는 등 볼 리프팅 효과가 매우 우수한 것을 알 수 있었으나(p<.001, 도 1), 제조예 2 내지 7을 사용한 경우 그러한 안면 볼 리프팅 개선 효과가 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 2).

한편, 상기 실시예 1의 혼합추출물 대신 쇠비름 잎, 질경이씨 및 연꽃씨의 중량비를 1:1:1로 한 혼합추출물을 사용하되 나머지 성분들은 제조예 1과 동일하게 하여 제조한 스킨크림을 사용한 경우 Depressions medium 값 개선율이 2.1% 정도에 불과하여 상기 제조예 1과 같은 수준의 볼 리프팅 효과는 나타나지 않았고, 제조예 2 내지 7과 큰 차이가 없는 수준인 것으로 확인되었다.

[실험예 2] 피부 탄력 개선 효과

평균연령 47세인 피시험자 10명에게 6주 동안 아침 및 저녁 세안 후 상기 표 3의 제조예 1의 스킨 크림을 우측 볼 부위에 고르게 펴 바르게 하였고, 사용 전과 6주 사용 후 피시험자의 피부 탄력 상태를 측정하였다. 구체적으로, 발리스토미터(Ballistometer BLS780, DiaStron Ltd, UK)를 사용하였고, 피부 탄력 개선 여부는 CoR 값(Coefficient of Restitution)으로 평가하였다. 표 3의 제조예 2 내지 7의 스킨 크림에 대해서도 동일한 평균 연령대의 각각 다른 피시험자 10명씩에게 각각 상기와 같이 피부 탄력 상태를 비교하였다.

그 결과, 표 3의 제조예 2 내지 7의 스킨 크림 경우 6주 후 CoR값의 개선율이 거의 0%에 가까웠고, 제조예 1을 사용한 경우 6주 후 CoR 값이 8.17% 증가(P<.001)된 것을 확인하였다. 이를 통해 제조예 1을 사용할 경우 피부 탄력 개선에 큰 도움이 됨을 알 수 있었다.(도 3)

한편, 실시예 1에서 쇠비름 잎이 아닌 줄기를 사용하여 제조한 혼합 추출물을 사용하되 나머지 성분은 상기 제조예 1과 동일하게 하여 제조한 스킨 크림을 사용하여 동일한 실험을 진행한 결과, CoR 값의 차이가 거의 없어 제조예 1과는 전혀 다른 결과가 나타남을 확인하였다.

[실험예 3] 엘라스타제(elastase)의 활성저해측정 실험

돼지췌장 elastase (Porcine pancreatic elastase, PPE) 저해활성에 대해 기질로 N-succinyl-ala-ala-ala-p-nitroanilide (SANA)를 사용하여 분광광도법을 통해 실시하였다. 구체적으로, 0.2 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 0.1 mg/mL elastase, 기질로 12.5 mM SANA 그리고 각 시료들을 농도별로 준비하였다. 96 well plate에 완충액 165 μL, SANA 5 μL, elastase 10 μL 그리고 시료용액 20 μL를 넣고 25 ℃에서 15 분간 반응시킨 후, ELISA reader 를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율(%)을 아래의 식에 의해 계산하였으며, 각 시료가 elastase를 50 % 저해할 때의 농도(IC₅₀)를 구하였다. 각 시료는 5 회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이때 대조군으로는 oleanolic acid와 ursolic acid를 사용하였다.

Elastase Inhibition(%)=[1-{(B-C)/(A-D)}]×100

여기서 A는 효소만 첨가된 반응 용액, B는 효소와 시료가 모두 첨가된 반응 용액, C는 시료만 첨가된 반응 용액, D는 효소와 시료가 모두 첨가되지 않은 반응 용액의 410 nm에서의 흡광도 값이다.

시료에 따른 결과값은 하기 표 4와 같다.

시료	elastase inhibition(%)			IC50(μg/mL)
	처리 농도(μg/mL)
	1.5	3.1	4.0
대조군1 (oleanolic acid)	8.1	11.2	17.4	12.6
대조군2 (ursolic acid)	7.0	9.1	15.3	11.5
실시예3	39.8	52.2	81.6	4.1
비교예1	4.1	5.3	5.5	52.3
비교예2	3.9	4.6	4.5	60.2
비교예3	4.0	6.3	5.2	67.9
비교예4	3.6	4.1	4.5	65.8
비교예5	4.1	3.8	5.3	58.8
비교예6	4.0	4.7	5.5	61.7

한편, 상기 실시예 1의 혼합추출물 대신 쇠비름 잎, 질경이씨 및 연꽃씨의 중량비를 1 : 1 : 1로 한 혼합추출물을 사용하되 나머지 성분들은 실시예 3과 동일하게 한 시료를 4 μg/mL의 농도로 처리한 경우에도 엘라스타제 저해활성 저해는 5.5% 수준인 것으로 확인되었다.

[실험예 4]

피부장벽 강화 효과를 확인하기 위해 경피 수분 손실량(TEWL, Transepidermal Water Loss)을 측정하였다.

구체적으로, Tewameter TM300 (Courage and Khazaka electronic GmbH, Germany) 를 사용하여 측정하였으며, 40대 20명을 대상으로 시중의 일반 스킨크림을 각각 매일 2회씩 4주간 전완부에 도포하게 하되, 도포 개시 전, 도포 후 2주 및 4주 경과 시점, 4주간 도포한 다음 도포를 중지한 후 2주 경과 뒤에 측정하였다. 측정은 항온항습(24℃, 상대습도 40%)이 유지되는 측정실 내에서 약 30분간 안정을 취한 후 측정하고 Probe를 측정부위에 대고 1초 간격으로 디스플레이되는 값이 안정화될 때까지 계속 측정한 후 최종 5회의 측정값을 평균하여 평가하였다.

또한 제조예 1 내지 7에 대해서도 같은 방식으로 TEWL을 측정하였다. 그 결과 하기 표 5와 같은 결과가 나타났다(단위: g/h/m², 평균±표준편차).

구분	도포 전	도포 2주 후	도포 4주 후	도포 중단 후 2주 경과
대조군(일반수분크림)	8.2±1.31	8.1±1.45	7.8±2.05	8.1±1.77
제조예1	8.2±1.82	3.1±2.18	3.0±1.81	3.5±1.15
제조예2	7.8±2.55.	7.7±2.47	8.5±1.75	7.9±1.71
제조예3	8.3±1.33	7.5±1.98	7.6±2.04	8.1±1.21
제조예4	7.9±2.42	8.2±2.25	8.1±1.58	8.2±1.73
제조예5	8.0±1.78	7.9±1.87	7.7±1.65	8.0±2.01
제조예6	8.1±2.03	8.1±2.65	7.8±1.84	8.2±1.65
제조예7	8.1±2.61	7.7±1.89	8.2±1.74	7.9±1.49

상기 표와 같이 제조예 1의 스킨 크림을 사용한 경우 도포 후부터 도포 중단 후 2주에 이르기까지 경피수분손실량이 도포 전에 비해 50% 이상 현저하게 감소하여 피부장벽 강화 효과가 대조군 및 제조예 2 내지 7에 비해 현저한 것으로 확인되었다.

또한, 상기 실시예 1의 혼합추출물 대신 쇠비름 잎, 질경이씨 및 연꽃씨의 중량비를 1 : 1 : 1로 하여 제조한 혼합추출물을 사용하되 나머지 성분들은 제조예 1과 동일하게 한 크림에 대해 상기와 같은 방식으로 경피수분손실량을 측정한 결과 도포 전후 별 차이가 없음이 확인되었다(도포 전 평균 8.0±1.58, 도포 2주 후 7.9±1.71, 도포 4주 후 8.1±0.98, 도포 중단 후 2주 경과 8.0±1.32).

[제조예 8]

상기 실시예 3과 하기 표 6과 같이 부원료를 혼합 및 균질화하여 스킨 에센스를 제조하였다.

원료	함량 (중량%)
실시예 1의 혼합 추출물	1.4
실시예 2의 NK세포배양액	1.3
글루콘산 용액(글루콘산 50중량%, 정제수 50중량%)	2.2
Geranyl formate	1.2
L-Theanine	0.8
리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1	1.2
부틸렌글라이콜	3.7
인체지방기질세포배양액	1.5
베타인	4.6
에탄올	4.5
1,2-헥산다이올	3.9
나이아신아마이드	3.5
글리세린	5.2
탱자추출물	2.4
폴리아크릴레이트-13	2.3
트로메타민	1.8
아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	2.4
폴리아이소부텐	2.3
PEG-40 hydrogenated castor oil	7.1
카보머	3.6
착향료	2.8
PPG-26-buteth-26	6.5
다이포타슘글리시리제이트	3.3
아데노신	2.5
피이지-40하이드로제네이티드캐스터오일	3.5
잔탄검	1.2
다이소듐이디티에이	1.6
폴리솔베이트20	2.2
솔비탄아이소스테아레이트	1.6
소듐하이알루로네이트	0.8
병풀추출물	1.2
보스웰리아추출물	0.2
정제수	to 100

Claims (5)

1. 쇠비름(Portulaca Oleracea), 질경이씨(Plantago Asiatica Seed) 및 연꽃씨(Nelumbo nucifera Seed)의 혼합 추출물 1.4중량%, 자연살해세포 배양액 1.3중량%, 글루콘산 용액 2.2중량%, 포름산게라닐(geranyl formate) 1.2중량%, L-테아닌 0.8중량%, 리포좀 카퍼트리펩타이드-AJ1 1.2중량%, 부틸렌글라이콜 7.5중량%, 베타인 6.5중량%, 에탄올 4.5중량%, 나이아신아마이드 3.5중량%, 1,2-헥산다이올 5.2중량%, 글리세린 8.2중량%, 착향료 2.8중량%, PEG-40 하이드로제네이티드캐스터오일 10.2중량%, 피피지-26-부테스-26(PPG-26-Buteth-26) 8.5중량%, 및 정제수 34중량%를 포함하는 피부 리프팅 및 탄력 증진용 화장료 조성물.
   
   
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