KR102643836B1 - Monochamus alternatus solid medium composition for inducing cordycepin from fruitbodies of cordyceps and its manufacturing method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 유도하기 위한 솔수염하늘소 고체배지 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에탄올 추출된 솔수염하늘소 고체배지로 생산된 동충하초 자실체의 코디세핀 함량을 측정한 경우, 기존의 동충하초 자실체를 생산하기 위한 고체배지들에 비해서 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인함에 따라, 동충하초 자실체로부터 보다 더 효과적으로 코디세핀을 유도할 수 있다.The present invention relates to a solid medium composition for inducing cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies and a method for producing the same. More specifically, it relates to a method for measuring the cordycepin content of Cordyceps sinensis fruiting bodies produced with ethanol-extracted Cordyceps sinensis solid medium. In this case, as it was confirmed that the cordycepin content is higher than that of existing solid media for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies, cordycepin can be induced more effectively from Cordyceps sinensis fruiting bodies.
Description
본 발명은 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 유도하기 위한 솔수염하늘소 고체배지 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a solid medium composition for inducing cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies and a method for producing the same.
동충하초(冬蟲夏草)는 겨울에는 벌레, 여름에는 버섯으로 나온다는 뜻에서 이름이 붙여졌다. 대부분이 곤충병원성진균(entomopathogenic fungi)으로 약 800여종이 알려져 있으며, 기주곤충에 감염되어 내부에서 균사 생장을 하여 자실체를 생성하는 것이 큰 특징이다. 이러한 동충하초는 아시아(중국, 한국, 일본 등)에서 예전부터 약초로 쓰여 왔다. 그 효능으로는 면역력 증강, 성인병 예방, 천식, 빈혈에 좋은 약재로 사용되어져 왔다.Cordyceps sinensis (冬蟲夏草) got its name from the meaning that it comes out as bugs in the winter and as mushrooms in the summer. About 800 species are known, most of which are entomopathogenic fungi, and their main characteristic is that they infect host insects and grow internally to produce fruiting bodies. Cordyceps sinensis has long been used as a medicinal herb in Asia (China, Korea, Japan, etc.). For its efficacy, it has been used as a good herbal medicine for enhancing immunity, preventing adult diseases, asthma, and anemia.
동충하초는 동의보감을 통해서 오랫동안 많은 효능이 인정되어 각종 성인병 질환의 치료 및 건강유지를 위하여 사용되어 왔다. 중국에서는 육상선수들이 동충하초를 복용하고 기적의 기록들을 나타낸다고 하여 동충하초를 3대 천연식품 건강명약으로 인정하고 있다.Cordyceps sinensis has long been recognized for its many efficacy through Donguibogam and has been used to treat various adult diseases and maintain health. In China, Cordyceps sinensis is recognized as one of the top three natural food health medicines, as track and field athletes take Cordyceps sinensis and show miraculous records.
동충하초는 작물들 중 단백질 함량이 가장 높은 (건조함량의 28%이상) 군에 속하고, 면역력을 강화시키는 물질이 다량 함유되어 있다. 동충하초의 면역활성물질 중에는 키닉산(quinic acid)의 이성체로 밝혀진 '코디세핀 (Cordycepin :3'-deoxy-adenosine)' 이 포함되어 있으며, 동충하초 중에서도 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)가 다른 동충하초에 비하여 코디세핀의 함량이 월등히 높다. 코디세핀은 핵산 물질로서 세포의 유전정보에 관여하면서 저하된 면역기능을 활성화하여 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 방지하는 작용을 한다. 동충하초를 투입한 임상 실험에서 암세포를 죽이는 면역세포인 NK세포(natural killer cell/자연살해세포)와 면역세포에서 분비되는 사이토카인의 함량이 18%~25% 증가되는 것으로 확인되어 혈액암 치료용으로 활용되고, 건강기능식품으로서도 많은 관심을 받고 있다. 이러한 결과를 토대로 국내에서는 코디세핀이 함유된 동충하초가 버섯으로는 유일하게 건강 기능식품으로 식약처 인증을 받았다. 또한 동충하초는 혈압과 당뇨를 조절하는 효능과 폐와 간 기능 등에도 많은 도움을 주는 것으로 임상연구결과가 발표되고 있다.Cordyceps sinensis belongs to the group with the highest protein content among crops (more than 28% of dry content) and contains a large amount of substances that strengthen immunity. Among the immune-activating substances of Cordyceps sinensis, 'Cordycepin (3'-deoxy-adenosine)', which has been found to be an isomer of quinic acid, is included. Among Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris is more effective than other Cordyceps sinensis. The content of cordycepin is significantly higher. Cordycepin is a nucleic acid substance that participates in the genetic information of cells and acts to prevent normal cells from converting into cancer cells by activating decreased immune function. In clinical trials using Cordyceps sinensis, it was confirmed that the content of NK cells (natural killer cells), which are immune cells that kill cancer cells, and the content of cytokines secreted by immune cells increased by 18% to 25%, making it suitable for the treatment of blood cancer. It is used and is receiving a lot of attention as a health functional food. Based on these results, Cordyceps sinensis, which contains cordycepin, is the only mushroom in Korea to be certified by the Ministry of Food and Drug Safety as a health functional food. In addition, clinical research results show that Cordyceps sinensis is effective in controlling blood pressure and diabetes, and is helpful for lung and liver function.
하지만 코디세핀은 2021년 04월 기준 100 mg당 1,339,500원의 고가에 판매되며 (Sigma-Aldrich, Germany), 화학적인 합성 방법의 경우, 다량의 약품이 첨가되어 환경적 또는 산업적으로 불리한 문제점이 있다. 따라서 유일하게 자연적인 코디세핀 생산이 가능한 동충하초 연구가 지속적으로 이루어지고 있으며, 특히 동충하초의 자실체로부터 코디세핀을 증대시키는 연구가 절실하다. However, cordycepin is sold at a high price of 1,339,500 won per 100 mg as of April 2021 (Sigma-Aldrich, Germany), and in the case of chemical synthesis, a large amount of chemicals are added, which has environmental or industrial disadvantages. Therefore, research on Cordyceps sinensis, the only plant capable of naturally producing cordycepin, is being conducted continuously, and in particular, research on increasing cordycepin from the fruiting bodies of Cordyceps sinensis is urgently needed.
이에, 본 발명은 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 유도하기 위해서 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 이용한 고체배지의 제조방법을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention seeks to provide a method for producing a solid medium using ethanol-extracted pine cone to induce cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 얻어진 동충하초 자실체 생산을 위한 고체배지용 조성물을 제공하는데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition for a solid medium for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies obtained by the above production method.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 얻어진 동충하초 자실체 생산을 위한 고체배지용 조성물을 이용하여 동충하초 자실체 생산방법을 제공하는데 있다. In addition, another object of the present invention is to provide a method for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies using the composition for a solid medium for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies obtained by the above production method.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 동충하초 자실체 생산방법에 의해 생산된 자실체로부터 코디세핀 생산방법을 제공하는데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a method of producing cordycepin from the fruiting bodies produced by the Cordyceps sinensis fruiting body production method.
본 발명은 1) 곡류에 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 첨가하는 단계; 2) 상기 1)단계에서 제조된 혼합물에 물을 첨가하는 단계; 및 3) 상기 2)단계에서 제조된 혼합물을 고온 멸균하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔수염하늘소 고체배지의 제조방법을 제공한다.The present invention includes the steps of 1) adding ethanol-extracted pine beetles to grains; 2) adding water to the mixture prepared in step 1); and 3) sterilizing the mixture prepared in step 2) at high temperature.
본 발명은 곡류 5 내지 15 중량%, 에탄올 추출된 솔수염하늘소 35 내지 45 중량% 및 잔량의 물을 포함하는, 동충하초 자실체 생산용 고체배지용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for a solid medium for the production of Cordyceps sinensis fruiting bodies, comprising 5 to 15% by weight of grains, 35 to 45% by weight of ethanol-extracted seaweed, and the remaining amount of water.
본 발명은 가) 액체배양된 동충하초 균사체를 상기 제조된 솔수염하늘소 고체배지용 조성물에 투입하고 암배양 하는 단계; 및 나) 상기 가)단계에 의해 암배양 후 형광등 조건의 배양기로 이동하여 자실체를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체 생산방법을 제공한다.The present invention includes the following steps: a) adding liquid-cultured Cordyceps sinensis mycelium to the prepared composition for a solid medium and culturing it in the dark; and b) providing a method for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies, which includes the step of cultivating the fruiting bodies by moving them to an incubator under fluorescent lighting conditions after dark culturing in step a) above.
본 발명은 i) 상기 생산방법에 의해 생산된 동충하초 자실체를 동결 건조시키는 단계; ii) 상기 동결 건조된 동충하초 자실체를 분말로 제조 후 증류수에 혼합한 후, 초음파 처리하는 단계; 및 iii) 상기 초음파 처리한 혼합물을 원심분리한 후 상등액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention includes the steps of i) freeze-drying the Cordyceps sinensis fruiting bodies produced by the above production method; ii) preparing the freeze-dried Cordyceps sinensis fruiting body into powder, mixing it with distilled water, and then sonicating it; and iii) centrifuging the sonicated mixture and filtering the supernatant.
본 발명에 따른 에탄올 추출된 솔수염하늘소 고체배지로 생산된 동충하초 자실체로부터 코디세핀 함량을 측정한 경우, 기존의 동충하초 자실체를 생산하기 위한 고체배지들에 비해서 높은 코디세핀 함량을 나타냄을 확인함에 따라, 에탄올 추출된 솔수염하늘소 고체배지로 생산된 동충하초 자실체로부터 보다 더 효과적으로 코디세핀을 유도할 수 있다.When the cordycepin content was measured from the Cordyceps sinensis fruiting bodies produced with the ethanol-extracted Cordyceps sinensis solid medium according to the present invention, it was confirmed that the cordycepin content was higher than that of the existing solid media for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies, Cordycepin can be induced more effectively from Cordyceps sinensis fruiting bodies produced with ethanol-extracted solid medium.
도 1은 본 발명에 따른 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 이용한 고체배지 제조방법, 이를 이용한 동충하초 자실체 생산방법 및 이에 생산된 동충하초 자실체로부터 코디세핀 생산하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 고체배지 제조 공정에 따른 동충하초 자실체의 코디세핀 함량에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸다.
도 3은 RSM(Response surface methodology) 분석법을 통해 최적 고체배지 제조 조건에 대한 예측모델 및 그 예측모델을 최적화한 것으로, X1은 에탄올 추출된 솔수염하늘소 투입량(g), X2은 수분함량(%), X3은 배양기간(days)을 나타낸다. Figure 1 is a schematic diagram showing a method for producing a solid medium using ethanol-extracted Cordyceps sinensis according to the present invention, a method for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies using the same, and a method for producing cordycepin from the Cordyceps sinensis fruiting bodies produced thereby.
Figure 2 shows HPLC analysis peaks for the cordycepin content of Cordyceps sinensis fruiting bodies according to the solid medium manufacturing process.
Figure 3 shows a prediction model for optimal solid medium manufacturing conditions and optimizing the prediction model through RSM (Response surface methodology ) analysis, where Moisture content ( % ), Indicates the culture period (days).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
동충하초는 기주의 대상이 되는 곤충의 몸에 침입하여 기주의 양분을 통해 자실체를 형성시키는 약용버섯으로, 동물성 단백질을 영양성분으로 하기 때문에 일반 버섯류에서는 찾아볼 수 없는 유용한 물질, 즉 인간의 각종 질병치료에 이용되어질 수 있는 유용한 성분을 포함하여 기능성 식품으로서의 고부가가치가 있으나, 대량 재배가 어렵고 외부환경에 민감하여 재배가 매우 까다로운 문제점이 있는 바, 상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 이용한 고체배지를 개발하고, 이를 이용한 동충하초 자실체로부터 코디세핀 함량을 증대시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Cordyceps sinensis is a medicinal mushroom that invades the body of a host insect and forms a fruiting body through nutrients from the host. Since it uses animal protein as a nutritional ingredient, it is a useful substance that cannot be found in ordinary mushrooms, that is, the treatment of various human diseases. Although it has high added value as a functional food, including useful ingredients that can be used in food, it has the problem of being difficult to cultivate in large quantities and being sensitive to the external environment, so cultivation is very difficult. In order to solve the above problems, the present inventors developed ethanol-extracted pine beard. The present invention was completed by developing a solid medium using Sky Cow and confirming that it was possible to increase the cordycepin content from Cordyceps sinensis fruiting bodies using it.
본 발명은 1) 곡류에 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 첨가하는 단계; 2) 상기 1)단계에서 제조된 혼합물에 물을 첨가하는 단계; 및 3) 상기 2)단계에서 제조된 혼합물을 고온 멸균하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔수염하늘소 고체배지의 제조방법을 제공한다.The present invention includes the steps of 1) adding ethanol-extracted pine beetles to grains; 2) adding water to the mixture prepared in step 1); and 3) sterilizing the mixture prepared in step 2) at high temperature.
상기 곡류는 귀리, 현미, 쌀 및 보리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것으로 이에 한정되는 것은 아니다. The grains are not limited to one or more selected from the group consisting of oats, brown rice, rice, and barley.
상기 귀리는 다른 곡류에 비하여 단백질, 필수 아미노산, 수용성 섬유질이 풍부하기 때문에 동충하초 자실체 생산을 위한 영양분 역할을 수행할 수 있다.Since the oats are rich in protein, essential amino acids, and soluble fiber compared to other grains, they can serve as nutrients for Cordyceps sinensis fruiting body production.
상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소는 a) 솔수염하늘소와 에탄올 혼합 후 진탕배양하는 단계; b) 상기 a)단계에서 제조된 혼합물을 감압 여과하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에 의해 생성된 잔사를 건조하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.The ethanol-extracted pine beetle is a) mixing the ethanol with ethanol and cultivating it with shaking; b) filtering the mixture prepared in step a) under reduced pressure; and c) drying the residue generated in step b).
상기 a)단계는 에탄올 100 중량부에 대하여 솔수염하늘소를 2.5 내지 7.5 중량부로 혼합한 후 15 내지 25 ℃에서 2 내지 4시간 동안 90 내지 110 rpm으로 진탕배양할 수 있다. 상기 솔수염하늘소의 함량인 2.5 내지 7.5 중량부로 혼합할 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 14 내지 15 mg/g 범위를 나타냈지만, 상기 솔수염하늘소의 함량인 2.5 중량부 미만 또는 7.5 중량부 초과일 경우, 코디세핀 함량이 8 내지 10 mg/g 으로 저하되는 문제가 야기될 수 있다.Step a) can be performed by mixing 2.5 to 7.5 parts by weight of pine beetle with 100 parts by weight of ethanol and then cultivating the mixture with shaking at 90 to 110 rpm at 15 to 25°C for 2 to 4 hours. When mixed at 2.5 to 7.5 parts by weight, which is the content of the above-mentioned pine needles, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body ranged from 14 to 15 mg/g, but was less than 2.5 parts by weight or more than 7.5 parts by weight, which is the content of the pine needles. In one case, a problem may arise where the cordycepin content is lowered to 8 to 10 mg/g.
상기 c)단계는 상기 b)단계에 의해 생성된 잔사를 15 내지 25℃에서 40 내지 56시간 동안 건조할 수 있다.In step c), the residue produced in step b) may be dried at 15 to 25°C for 40 to 56 hours.
상기 1)단계는 에탄올 추출된 솔수염하늘소 100 중량부에 대하여 곡류 15 내지 30 중량부로 첨가할 수 있다. 상기 곡류의 함량인 15 내지 30 중량부일 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 약 15 mg/g을 나타냈지만, 상기 곡류의 함량인 15 중량부 미만 또는 30 중량부 초과일 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 약 10 mg/g으로 낮아지는 문제가 야기될 수 있다.In step 1), 15 to 30 parts by weight of grains can be added based on 100 parts by weight of ethanol-extracted pine beetles. When the content of the grain is 15 to 30 parts by weight, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was about 15 mg/g, but when the content of the grain is less than 15 parts by weight or more than 30 parts by weight, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was A problem may arise where the content is lowered to about 10 mg/g.
본 발명은 곡류 5 내지 15 중량%, 에탄올 추출된 솔수염하늘소 35 내지 45 중량% 및 잔량의 물을 포함하는, 동충하초 자실체 생산용 고체배지용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for a solid medium for the production of Cordyceps sinensis fruiting bodies, comprising 5 to 15% by weight of grains, 35 to 45% by weight of ethanol-extracted seaweed, and the remaining amount of water.
이때, 상기 곡류가 5 내지 15 중량% 함량 범위일 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 14.5 mg/g 내지 15.1 mg/g을 나타냈지만, 상기 함량 범위를 벗어날 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량은 8 mg/g 내지 10 mg/g으로 감소하는 문제가 야기될 수 있다. At this time, when the grain is in the range of 5 to 15% by weight, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body is 14.5 mg/g to 15.1 mg/g, but when it is outside the above content range, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body is 8 Problems may arise as the concentration decreases from mg/g to 10 mg/g.
또한, 상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소는 일부 단백질이 추출되어 빠져나감에 따라 상대적으로 탄수화물의 함량이 증대될 수 있다. 코디세핀은 탄수화물의 영향을 받으며, 특히 탄수화물이 증가할수록 코디세핀 함량이 증가 할 수 있다. 따라서 상대적으로 탄수화물 함량이 증가되었다고 판단되는 에탄올 추출된 솔수염하늘소는 코디세핀 함량 증대에 효과적인 역할을 수행하는바, 상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소의 35 내지 45 중량% 함량 범위에서 동충하초 자실체의 코디세핀 함량은 14.5 mg/g 내지 15.1 mg/g인 반면, 상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소의 중량%가 35 미만 또는 45 초과일 경우, 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 8 mg/g 내지 10 mg/g으로 감소하는 문제가 야기될 수 있다.In addition, the carbohydrate content of the ethanol-extracted black-eyed peacock may be relatively increased as some of the protein is extracted and removed. Cordycepin is affected by carbohydrates, and especially as carbohydrates increase, cordycepin content may increase. Accordingly, the ethanol-extracted sagebrush, which is judged to have a relatively increased carbohydrate content, plays an effective role in increasing the cordycepin content. In the 35 to 45% by weight content range of the ethanol-extracted sagebrush, the cordycepin of Cordyceps sinensis fruiting bodies The content is 14.5 mg/g to 15.1 mg/g, while when the weight percent of the ethanol-extracted pine cone is less than 35 or more than 45, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body is 8 mg/g to 10 mg/g. Decrease problems may arise.
상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소는 에탄올 100 중량부에 대하여 솔수염하늘소를 2.5 내지 7.5 중량부로 혼합한 후 15 내지 25℃에서 2 내지 4시간 90 내지 110 rpm으로 교반하고 여과한 잔사를 건조하여 수득할 수 있다.The ethanol-extracted pine needles can be obtained by mixing 2.5 to 7.5 parts by weight of pine needles with 100 parts by weight of ethanol, stirring at 90 to 110 rpm at 15 to 25°C for 2 to 4 hours, and drying the filtered residue. You can.
본 발명은 가) 액체배양된 동충하초 균사체를 상기 제조된 솔수염하늘소 고체배지용 조성물에 투입하고 암배양 하는 단계; 및 나) 상기 암배양 후 형광등 조건의 배양기로 이동하여 자실체를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체 생산방법을 제공한다.The present invention includes the following steps: a) adding liquid-cultured Cordyceps sinensis mycelium to the prepared composition for a solid medium and culturing it in the dark; and b) providing a method for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies, comprising the step of cultivating the fruiting bodies by moving them to an incubator under fluorescent lighting conditions after the dark culture.
상기 동충하초는 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The Cordyceps sinensis is Militaris Cordyceps ( Cordyceps) militaris ), but is not limited to this.
상기 암배양은 22 내지 26℃의 배양기에서 12 내지 16일 동안 암배양할 수 있다. 이때, 상기 암배양 조건에서는 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 15 mg/g 이상을 나타냈지만, 상기 암배양 조건을 벗어나면 코디세핀 함량이 10 mg/g 이하를 나타내는 문제가 야기될 수 있다.The cancer culture can be cultured in an incubator at 22 to 26°C for 12 to 16 days. At this time, under the dark culture conditions, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was 15 mg/g or more, but if the dark culture conditions are exceeded, a problem may arise where the cordycepin content is 10 mg/g or less.
상기 자실체 배양은 최초 발이가 발생한 시점을 기준으로 40 내지 60일간 배양할 수 있다. 이때, 상기 배양기간에서는 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 14 내지 15 mg/g을 나타냈지만, 상기 배양기간을 벗어나면 코디세핀 함량이 10 내지 11 mg/g을 나타내는 문제가 야기될 수 있다.The fruiting body culture can be cultured for 40 to 60 days based on the time when the first germination occurs. At this time, during the culturing period, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was 14 to 15 mg/g, but if the culturing period is exceeded, a problem may arise where the cordycepin content is 10 to 11 mg/g.
본 발명은 i) 본 발명에 따라 생산된 동충하초 자실체를 동결 건조시키는 단계; ii) 상기 동결 건조된 동충하초 자실체를 분말로 제조 후 증류수에 혼합한 후, 초음파 처리하는 단계; 및 iii) 상기 초음파 처리한 혼합물을 원심분리한 후 상등액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체로부터 코디세핀 생산방법을 제공한다.The present invention includes the steps of i) freeze-drying the Cordyceps sinensis fruiting bodies produced according to the present invention; ii) preparing the freeze-dried Cordyceps sinensis fruiting body into powder, mixing it with distilled water, and then sonicating it; and iii) centrifuging the sonicated mixture and filtering the supernatant.
상기 i)단계는 -70 내지 -90 ℃에서 60 내지 84시간 동결 건조할 수 있다.Step i) may be freeze-dried at -70 to -90°C for 60 to 84 hours.
상기 ii)단계는 증류수 100 중량부에 대하여 동충하초 자실체 분말을 15 내지 25 중량부로 혼합한 후 50 내지 70 분 동안 45 내지 55 ℃에서 초음파 처리할 수 있다. 상기 동충하초 자실체 분말의 함량인 15 내지 25 중량부 범위에서는 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 14.5 내지 15.5 mg/g으로 나타냈지만, 상기 동충하초 자실체 분말의 함량 범위를 벗어나면 동충하초 자실체의 코디세핀 함량이 5 내지 10 mg/g을 나타내는 문제가 야기될 수 있다.In step ii), 15 to 25 parts by weight of Cordyceps sinensis fruiting body powder can be mixed with 100 parts by weight of distilled water and then sonicated at 45 to 55 ° C. for 50 to 70 minutes. In the range of 15 to 25 parts by weight, which is the content of the Cordyceps sinensis fruiting body powder, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was 14.5 to 15.5 mg/g, but if it was outside the content range of the Cordyceps sinensis fruiting body powder, the cordycepin content of the Cordyceps sinensis fruiting body was 5 to 5 mg/g. Problems representing 10 mg/g may arise.
상기 iii)단계는 900 내지 1100 rpm으로 15 내지 25분간 원심분리할 수 있다.Step iii) can be centrifuged at 900 to 1100 rpm for 15 to 25 minutes.
상기 동충하초 자실체로부터 코디세핀 함량을 최대로 유도하기 위한 최적 배양 조건은 에탄올 추출된 솔수염하늘소의 투입량, 수분함량 및 배양기간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것일 수 있다.The optimal culture conditions for maximizing the cordycepin content from the Cordyceps sinensis fruiting bodies may have a correlation with the input amount, moisture content, and culture period of ethanol-extracted eucalyptus as shown in Equation 1 below.
[수학식 1][Equation 1]
Y1 = -93.51500+3.4465X1+1.0054X2+1.30883X3+0.0028X1X2-0.009X1X3+0.000267X2X3-0.102300X1 2-0.005252X2 2-0.013811X3 2 Y 1 = -93.51500 + 3.4465X 1 + 1.0054X 2 + 1.30883X 3 + 0.0028X 1 2
상기 수학식 1에서 Y1은 코디세핀 함량 (mg/g), X1은 에탄올 추출된 솔수염하늘소의 투입량 (g), X2는 수분함량 (%) 및 X3는 배양기간 (days)을 나타낸다.In the above equation 1 , Y 1 is the cordycepin content ( mg / g), indicates.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples to aid understanding. However, the following examples only illustrate the content of the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples. Examples of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
<< 실시예Example 1> 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 유도하기 위한 솔수염하늘소 고체배지 제조 공정 1> Process for producing solid medium for inducing cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 에탄올 추출한 솔수염하늘소를 이용한 고체배지 제조방법, 동충하초 자실체 생산방법 및 상기 생산방법으로 생산된 동충하초 자실체로부터 코디세핀 생산방법을 나타낸 모식도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing a method for producing a solid medium using ethanol-extracted Cordyceps sinensis according to an embodiment of the present invention, a method for producing Cordyceps sinensis fruiting bodies, and a method for producing cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies produced by the above production method.
1. 솔수염하늘소를 이용한 에탄올 추출방법1. Ethanol extraction method using pine needles
솔수염하늘소의 에탄올 추출은 삼각플라스크에서 솔수염하늘소 20 g과 에탄올 400 g을 투입한 후 진탕배양기를 이용하여 실온에서 100 rpm으로 3시간 반응시켰다.For ethanol extraction of Siberian snail, 20 g of snail's snail and 400 g of ethanol were added to an Erlenmeyer flask, and then reacted at room temperature at 100 rpm for 3 hours using a shaking incubator.
에탄올 추출 후, Whatman filter paper (No. 2)를 이용하여 감압 여과하고 잔사를 48시간 실온에서 건조시켰다.After ethanol extraction, it was filtered under reduced pressure using Whatman filter paper (No. 2), and the residue was dried at room temperature for 48 hours.
이렇게 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 획득하여 고체배지의 원료로 사용하였다.In this way, ethanol-extracted pine beard was obtained and used as a raw material for solid medium.
2. 솔수염하늘소를 이용한 고체배지 제조공정2. Solid medium manufacturing process using pine needles.
귀리 3.7 g, 상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소 16.3 g 및 물 20.2 g을 첨가하여 혼합한 후에 오토클레이브에서 121℃, 30분 동안 고온 멸균하여 배지를 제조하였다.A medium was prepared by adding and mixing 3.7 g of oats, 16.3 g of the ethanol-extracted pine beetle, and 20.2 g of water, followed by high-temperature sterilization in an autoclave at 121°C for 30 minutes.
3. 상기 고체배지에 의한 동충하초 자실체 생산방법3. Cordyceps sinensis fruiting body production method using the above solid medium
사부로오드 덱스트로즈 배지(Sabouraud dextrose broth; 펩톤 10 g, 덱스트로즈 20 g, 증류수 1 L; pH 5.6)에 7일간 액체배양된 동충하초 균사체 현탁액 5 mL를 앞서 준비된 고체배지에 투입 후 24℃ 배양기에서 14일간 암배양 하였다. 상기 동충하초 균사체는 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 이용하였다.5 mL of Cordyceps sinensis mycelium suspension cultured in Sabouraud dextrose broth (10 g peptone, 20 g dextrose, 1 L distilled water; pH 5.6) for 7 days was added to the previously prepared solid medium and placed in an incubator at 24°C. Cancer culture was performed for 14 days. The Cordyceps militaris mycelium was used as Cordyceps militaris .
암배양 종료 후, 온도 20℃, 습도 60 %, 24시간 형광등 조건의 배양기로 이동한 다음 60일간 자실체를 배양하였다.After the dark culture was completed, the cells were moved to an incubator with a temperature of 20°C, humidity of 60%, and fluorescent lighting for 24 hours, and the fruiting bodies were cultured for 60 days.
4. 상기 생산방법에 의해 생산된 동충하초 자실체로부터 코디세핀 생산방법4. Method of producing cordycepin from Cordyceps sinensis fruiting bodies produced by the above production method
상기 생산방법에 의해서 생산된 동충하초 자실체의 배양 종료 후 생장한 자실체를 배양용기로부터 분리하고 -80℃로 설정된 동결건조기를 이용하여 72시간 동결 건조시켰다.After completion of cultivation of the Cordyceps sinensis fruiting bodies produced by the above production method, the grown fruiting bodies were separated from the culture vessel and freeze-dried for 72 hours using a freeze dryer set at -80°C.
동결 건조 후 분말로 제조한 자실체 1 g에 증류수 5 g를 투입하고 1시간 동안 50 ℃에서 초음파 처리(ultrasonication) (40 kHz 250 W, JINWOO 2010, Korea)를 실시하였다.After freeze-drying, 5 g of distilled water was added to 1 g of powdered fruiting body, and ultrasonication was performed at 50°C for 1 hour (40 kHz 250 W, JINWOO 2010, Korea).
1000 rpm으로 20분간 원심분리 (Union 32R Plus, HANIL, Korea)한 후 상등액을 0.45 μm 여과지로 여과한 다음 코디세핀(cordycepin)을 얻었다. After centrifugation at 1000 rpm for 20 minutes (Union 32R Plus, HANIL, Korea), the supernatant was filtered through 0.45 μm filter paper to obtain cordycepin.
상기 코디세핀의 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였으며, HPLC 시스템은 Kinetex 5 μ C18 100A column (Phenomenex, Torrance, CA, USA)이 장착된 YL9100 HPLC (영린, 한국)를 사용하였다. 이동상은 70 % 메탄올을 사용하였으며, 유량는 1.2 mL/min로 설정하였다. 주입량은 20 μL이고 UV/Visible Detector (Shimadzu SPA-20A) 260 nm로 검출하였다. The content of cordycepin was analyzed using HPLC, and the HPLC system used was a YL9100 HPLC (Younglin, Korea) equipped with a Kinetex 5 μ C18 100A column (Phenomenex, Torrance, CA, USA). 70% methanol was used as the mobile phase, and the flow rate was set at 1.2 mL/min. The injection volume was 20 μL and detection was performed with a UV/Visible Detector (Shimadzu SPA-20A) at 260 nm.
표 1은 고체배지 제조 공정에 따른 동충하초 자실체의 코디세핀 함량을 나타낸다. 각 값은 평균 ± SE (n = 5)로 표시된다. Table 1 shows the cordycepin content of Cordyceps sinensis fruiting bodies according to the solid medium manufacturing process. Each value is expressed as mean ± SE (n = 5).
그 결과, 표 1 및 도 2에 따르면, 에탄올 추출된 솔수염하늘소를 투입한 고체배지에서 가장 높은 코디세핀 함량을 나타내었다. 따라서, 솔수염하늘소 고체배지를 제조하는 것이 동충하초 자실체로부터 코디세핀 유도에 효율적일 것으로 판단되며, 바람직하게는 에탄올 추출된 솔수염하늘소 배지를 제조하는 것이 더 효율적이었다.As a result, according to Table 1 and Figure 2, the highest cordycepin content was shown in the solid medium containing ethanol-extracted pine cone. Therefore, it is believed that producing a solid medium from Cordyceps sinensis is efficient in inducing cordycepin from Cordyceps fruiting bodies, and it is more efficient to produce an ethanol-extracted medium.
<< 실시예Example 2> 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 고효율로 생산하기 위한 2> To produce cordycepin with high efficiency from Cordyceps sinensis fruiting bodies 고체배지solid medium 제조공정의 최적화 Optimization of manufacturing processes
에탄올 추출된 솔수염하늘소 투입량, 수분함량 및 배양 기간을 변수로 하고, Design-expert version 12를 이용하여 표 2과 같이 최대 코디세핀 함량을 위한 RSM의 Box-behnken design으로부터 최적점을 도출하여 최적의 코드 및 실측값을 얻었으며, 하기 수학식 1을 이용하여 최적 고체배지 제조 조건을 도출하였다.Using the ethanol-extracted pine beetroot input amount, moisture content, and culture period as variables, the optimal point was derived from RSM's Box-behnken design for the maximum cordycepin content using Design-expert version 12, as shown in Table 2, and the optimal Codes and actual measurements were obtained, and the optimal solid medium manufacturing conditions were derived using Equation 1 below.
[수학식 1][Equation 1]
Y1 = -93.51500+3.4465X1+1.0054X2+1.30883X3+0.0028X1X2-0.009X1X3+0.000267X2X3-0.102300X1 2-0.005252X2 2-0.013811X3 2 Y 1 = -93.51500 + 3.4465X 1 + 1.0054X 2 + 1.30883X 3 + 0.0028X 1 2
상기 수학식 1에서 Y1은 코디세핀 함량 (mg/g), X1은 에탄올 추출된 솔수염하늘소의 투입량 (g), X2는 수분함량 (%) 및 X3는 배양기간 (days)을 나타낸다.In the above equation 1 , Y 1 is the cordycepin content ( mg / g), indicates.
그 결과, 도출된 회귀식으로부터 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 고효율로 생산하기 위한 고체배지 제조 조건을 도 3과 같이 도출할 수 있었으며 귀리 3.7 g, 에탄올 추출된 솔수염하늘소 16.3 g, 증류수 20.2 g 및 배양기간 43.0 일의 조건으로 배양할 때, 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 가장 효율적으로 생산할 수 있는 것으로 확인되었다.As a result, from the derived regression equation, solid medium manufacturing conditions for producing Cordycepin with high efficiency from Cordyceps sinensis fruiting bodies could be derived as shown in Figure 3, including 3.7 g of oats, 16.3 g of ethanol-extracted pine needles, 20.2 g of distilled water, and culture It was confirmed that Cordycepin can be most efficiently produced from Cordyceps sinensis fruiting bodies when cultured under conditions of 43.0 days.
또한, 표 3에 의한 ANOVA 분석으로 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 고효율로 생산하기 위한 최적 고체배지 제조 조건에 대한 예측모델의 신뢰성 테스트 결과로 도출된 동충하초 자실체로부터 코디세핀을 고효율로 생산하기 위한 최적 고체배지는 코디세핀 함량을 최대 15.2557 mg/g로 예측되었으며, 실측한 결과 15.9 mg/g의 유사한 코디세핀 함량을 나타내었다(R2=0.9834).In addition, the optimal solid medium for highly efficient production of Cordycepin from Cordyceps fruiting bodies derived from the reliability test results of the prediction model for the optimal solid medium production conditions for high efficiency production of Cordycepin from Cordyceps fruiting bodies through ANOVA analysis according to Table 3 The cordycepin content was predicted to be up to 15.2557 mg/g, and the actual measurement results showed a similar cordycepin content of 15.9 mg/g (R 2 =0.9834).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (16)
2) 상기 1)단계에서 제조된 혼합물에 물을 첨가하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 제조된 혼합물을 고온 멸균하는 단계
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔수염하늘소 고체배지의 제조방법으로,
상기 에탄올 추출된 솔수염하늘소는 a) 솔수염하늘소와 에탄올 혼합 후 진탕배양하는 단계; b) 상기 a)단계에서 제조된 혼합물을 감압 여과하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에 의해 생성된 잔사를 건조하는 단계를 포함하여 제조되고,
상기 고체배지는 귀리 8 내지 10 중량%, 에탄올 추출된 솔수염하늘소 40 내지 42 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 솔수염하늘소 고체배지의 제조방법.1) Adding ethanol-extracted pine beard to oats;
2) adding water to the mixture prepared in step 1); and
3) High-temperature sterilization of the mixture prepared in step 2) above.
A method for producing a solid medium for pine beetles, characterized in that it comprises,
The ethanol-extracted pine beetle is a) mixing the ethanol with ethanol and cultivating it with shaking; b) filtering the mixture prepared in step a) under reduced pressure; and c) drying the residue produced in step b),
The solid medium is a method for producing a solid medium, characterized in that it contains 8 to 10% by weight of oats, 40 to 42% by weight of ethanol-extracted pine needles, and the remaining amount of water.
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