KR102633387B1 - Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis - Google Patents
Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis Download PDFInfo
- Publication number
- KR102633387B1 KR102633387B1 KR1020230153812A KR20230153812A KR102633387B1 KR 102633387 B1 KR102633387 B1 KR 102633387B1 KR 1020230153812 A KR1020230153812 A KR 1020230153812A KR 20230153812 A KR20230153812 A KR 20230153812A KR 102633387 B1 KR102633387 B1 KR 102633387B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- paternity
- trha
- dace
- marker
- analysis
- Prior art date
Links
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 241001640610 Tribolodon hakonensis Species 0.000 title description 2
- 241000594011 Leuciscus leuciscus Species 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 101100261281 Oncorhynchus nerka trha gene Proteins 0.000 claims description 56
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 40
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000269798 Perca flavescens Species 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 abstract description 25
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 11
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 50
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 23
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 7
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 4
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 3
- 241000157468 Reinhardtius hippoglossoides Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000282985 Cervus Species 0.000 description 1
- 241000252210 Cyprinidae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- -1 NED Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001024083 Pseudopleuronectes yokohamae Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001640620 Tribolodon Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 241001233061 earthworms Species 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명의 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인법을 제공함으로써 황어 식별용 황어에 대한 정확한 유전형 분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자 유전학적 연구를 과학적이고 체계적으로 수행할 수 있다.By providing the genetic marker for dace paternity identification of the present invention and the paternity confirmation method using the same, it is possible to scientifically and systematically conduct overall molecular genetic research, such as release effect investigation, selection breeding, and breeding guidelines, through accurate genotyping of dace for dace identification. there is.
Description
본 발명은 황어에 대한 유전적다양성 및 집단구조분석, 혈연 관계 확인, 가계 선발, 육종 등에 대해 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 시간과 비용절감이 가능한 동시증폭마커(multiplex PCR set)를 개발하여 황어에 대한 정확한 유전형분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자유전학적연구를 과학적이고 체계적으로 수행 가능할 수 있는 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of analyzing genotypes for dace so that genetic diversity and population structure analysis, kinship confirmation, lineage selection, breeding, etc. can be scientifically quickly and easily known. More specifically, NGS (Next-Generation Sequencing) ) to secure a large amount of base sequence information, discover microsatellite regions (supersatellite regions), develop a simultaneous amplification marker (multiplex PCR set) that can save time and cost, investigate the effect of release through accurate genotyping of yellow perch, This is about a genetic marker for paternity identification of dace that can carry out general molecular genetic research, including selection breeding and breeding guidelines, in a scientific and systematic manner, and a paternity confirmation method using the same.
황어(Tribolodon hakonensis)는 잉어과(Cyprinidae), 황어아과(Leuciscinae)에 속하는 회유성 어류로 번식 시기에 황갈색의 줄이 몸에 나타나는 것이 특징이며 대부분 일생을 바다에서 보내고 봄에 물이 맑고 물의 흐름이 잔잔한 하천으로 소상하여 자갈이나 모랫바닥에 집단으로 알을 낳는다. 이러한 소하성(anadromous) 행동은 잉어과 어류에서는 드문 현상으로 황어의 이주 및 생식 생태에 대한 자세한 연구 자료는 아직 없는 실정이다.Dace (Tribolodon hakonensis) is a migratory fish belonging to the carp family (Cyprinidae) and the dace subfamily (Leuciscinae). It is characterized by yellow-brown stripes that appear on its body during the breeding season. It spends most of its life in the sea, and in the spring it lives in rivers with clear water and calm water currents. They live in small groups and lay eggs in groups on gravel or sandy ground. This anadromous behavior is a rare phenomenon in carp fish, and there is still no detailed research data on the migration and reproductive ecology of dace.
황어는 잡식성으로, 수온이 낮을 때는 강바닥의 수생곤충 등을 먹고 살다가 수온이 상승하면 육지에서 흘러온 지렁이 등을 섭이한다. 몸은 길게 옆으로 납작하고, 성어가 되면 3열의 굵은 황금색 줄이 선명하게 드러난다. 길이는 성어기준으로 평균 40cm 내외로 큰 편이다. 산란기는 4~6월로 배에 붉은 띠가 나타나고 지느러미도 붉은색으로 변하여 혼인색을 갖는다. 이러한 색은 수컷에서 두드러지며 강을 거슬러 오를 때 한 마리의 암컷에 여러 마리의 수컷이 뒤따른다.Dace is omnivorous, and when the water temperature is low, it feeds on aquatic insects from the river bottom, but when the water temperature rises, it feeds on earthworms from the land. The body is long and flat laterally, and when it becomes an adult, three thick golden lines are clearly visible. The length is large, averaging about 40cm for adult fish. The spawning season is from April to June, and a red band appears on the belly, and the fins also turn red, giving them their wedding color. These colors are prominent in males, and when traveling up a river, a single female is followed by several males.
황어는 한국 동해와 남해로 유입하는 하천에 주로 분포하며, 일본 전 지역과 사할린 등지의 여러 하천에도 서식하는 것으로 알려져 있다. Tribolodon속에도 여러 종이 존재하지만, 황어와 같이 동북아 전체에 걸쳐 광범위한 분포역을 가지면서 소하성 행동을 보이는 종은 없다. 또한 황어는 지역에 따라서 귀중한 수산자원으로 또는 game fish로서 그 가치를 인정받고 있기도 하다.Dace is mainly distributed in rivers flowing into the East and South Seas of Korea, and is known to inhabit many rivers throughout Japan and Sakhalin. There are several species in the genus Tribolodon, but none, like dace, has a wide distribution area across Northeast Asia and shows anadromous behavior. In addition, dace is recognized for its value as a valuable fishery resource or game fish depending on the region.
그러나, 황어의 자원관리에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이에 산업 경재력 확보를 위해서 황어의 육종기술에 의한 우량 양식품종 개발이 필요하다. 선발육종은 기존의 양식품종을 유전적으로 우수한 개체나 집단을 선발해 이들의 자손을 보다 우수한 품종으로 개량하는 기존 품종의 개량에만 국한되는 것이 아니라 실용가치가 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발해 산업화하는 것까지 포함된다. However, research on resource management of dace is still insufficient. Accordingly, in order to secure industrial economic power, it is necessary to develop excellent aquaculture varieties using dace breeding technology. Selective breeding is not limited to improving existing aquaculture varieties by selecting genetically superior individuals or populations and improving their offspring into better varieties, but also involves developing and industrializing new lines or varieties with high practical value. Included.
선발 육종에 따른 유전적 개량량은 세대를 거듭할수록 누진적으로 커지게 되어 생산성을 지속적으로 제고시킬 수 있다. 특히, 어류는 일회 산란수가 많고 표현형(phenotype)의 유전적 변이가 커서 선발육종에 의한 유전적 개량에 이점을 가지고 있어 체중, 체장 등 어류의 주요 계측형질들은 생산성 관련 형질로써 직접 선발에 이용되어 질 수 있다. 따라서, 황어의 지속적 개량 및 소득 증대를 위해서는 DNA 마커를 활용한 분자육종 기술방법 개발이 필요하다.The amount of genetic improvement resulting from selective breeding increases progressively with each generation, allowing continuous improvement in productivity. In particular, fish have an advantage in genetic improvement through selective breeding due to the large number of eggs per spawning and the large genetic variation in the phenotype, so major measurement traits of fish such as body weight and length can be used for direct selection as productivity-related traits. You can. Therefore, in order to continuously improve dace and increase income, it is necessary to develop molecular breeding technology using DNA markers.
유전자 표지자(genetic marker)는 DNA서열로 생물에서 의 알려진 위치를 확인 할 수 있는 수단으로 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다.A genetic marker is a means of identifying a known location in an organism through a DNA sequence. It is a technology that can analyze the genetic characteristics of a biological species and can be used in evaluation research for the preservation of genetic resources. Genetic markers can show variation caused by mutations or modifications at a genetic locus.
유전자 표지자는 짧은 DNA서열로, 예를 들어 하나의 염기의 변화로 생긴 단일 염기 다형성(SNP), RFLP(제한효소 절편길이 다형성, Restriction fragment length polymorphism), SSLP(단순 염기서열 길이 다형성, Simple sequence length polymorphism), AFLP(유전자 증폭산물 길이 다형성, Amplified fragment length polymorphism), RAPD(DNA 다형성 무작위 증폭, Random amplification of polymorphic DNA) VNTR(가변수 직렬반복, Variable number tandem repeat) SSR, 단순 서열반복, Simple sequence repeat) 같은 것들이 있다.Genetic markers are short DNA sequences, such as single nucleotide polymorphism (SNP) caused by a change in one base, RFLP (restriction fragment length polymorphism), and SSLP (simple sequence length polymorphism). polymorphism), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplification of polymorphic DNA), VNTR (Variable number tandem repeat) SSR, Simple sequence repeat There are things like repeat).
SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. 이를 이용한 SSR마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.SSR (simple sequence repeat, or microsatellite) is a simple repeating structure of 2 to 8 bp base sequence that exists in the genome of an organism, and is a part where polymorphism appears due to differences in the number of base sequence repetitions. SSR markers using these have a high degree of polymorphism, so they are widely used to evaluate genetic diversity and flexible relationships. In the fisheries field, SSR markers are also used in many areas such as investigation of release effects, genetic diversity analysis, lineage confirmation, and selective breeding. .
일반적으로 사람 및 동물에서처럼 많은 유전체 연구가 진행된 경우는 데이터베이스상에서 SSR 정보를 확인 및 선발을 통해 마커 개발이 가능하나 수산분야에서는 현재 많은 유전체분석 연구가 진행되지 않아 직접 대량의 염기서열데이터 정보를 확보하고 목적에 맞는 마커를 발굴해 나아가야 한다.In general, in cases where a lot of genome research has been conducted, such as in humans and animals, marker development is possible through confirmation and selection of SSR information in the database. However, in the fisheries field, there is not much genome analysis research currently underway, so it is necessary to directly secure a large amount of base sequence data information. We need to find a marker that suits our purpose and move forward.
최근에는 수산전문기관에서 각 수산 종에 대한 NGS 분석(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)뿐만 아니라 다른 여러 유전체분석 방법을 이용하여 목적에 맞는 마커 발굴 및 개발을 진행하고 있다. 우선적으로는 확보되는 전장유전체염기서열을 이용하여 SSR 영역을 탐색하고 변별력, 효율성, 정확성 등을 검증함으로써 SSR 마커를 개발하고 있는 추세이다.Recently, specialized fisheries organizations are using NGS analysis (next generation sequencing) for each fishery species as well as various other genome analysis methods to discover and develop markers suitable for their purposes. First, there is a trend to develop SSR markers by exploring the SSR region using the secured whole genome base sequence and verifying discrimination, efficiency, and accuracy.
또한 많은 종에 대한 판별 및 집단, 계통분석, 친자확인 등에 과학적인 조사 방법으로 이용이 되고 있어 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다. 국내등록특허번호 제10-2301324호에는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있고, 국내 등록특허번호 제10-2077917호에는 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있으나, 상기 선행문헌은 본 발명과 대상 어종이 상이한 차이점이 있다.In addition, it is being used as a scientific research method for identification and grouping of many species, phylogenetic analysis, and paternity confirmation, so the justification for developing markers is increasing. Domestic registered patent number 10-2301324 discloses a genetic marker for paternity identification in flounder and a method for confirming paternity using the same, and domestic registered patent number 10-2077917 discloses a genetic marker for paternity identification in flounder and paternity confirmation using the same. Although the method is disclosed, the above prior literature has differences from the present invention in that the target fish species are different.
본 발명은 NGS를 이용하여 황어의 염기서열을 밝혀내고 SSR 부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 대한 마커를 제공하고 이를 이용한 친자확인법을 제공하고자 한다.The present invention aims to reveal the base sequence of dace using NGS, provide markers for paternity confirmation, population structure analysis, selection, and ancestry analysis using the SSR region, and provide a paternity confirmation method using the same.
본 발명의 목적은 이러한 분석을 기초로 황어의 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석하여 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 황어의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사, 선발육종 등 유전학적 연구에 과학적이고 정확한 기초자료로 이용할 수 있는 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인법을 제공하고자 한다.The purpose of the present invention is to secure the diversity of genetic resources by analyzing the genetic differences and molecular biological relationships between groups of yellow perch based on this analysis, select the most suitable marker for testing individual identity, and statistically determine the probability of individual identification according to the marker. We aim to provide genetic markers for dace paternity identification and a paternity confirmation method using them that can be used as scientific and accurate basic data for genetic research such as the production and history system of dace with secured diversity, release effect investigation, and selective breeding.
본 발명의 일실시예에 따른 황어의 친자 식별용 프라이머 세트를 포함하는 황어 친자 식별용 마커 조성물은 TrHa(3)014, TrHa(4)005, TrHa(4)003, TrHa(4)014, TrHa(4)007, TrHa(4)015, TrHa(3)012, TrHa(4)001의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며, 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 것일 수 있다.A marker composition for paternity identification of dace including a primer set for paternity identification of dace according to an embodiment of the present invention is TrHa(3)014, TrHa(4)005, TrHa(4)003, TrHa(4)014, TrHa (4)007, TrHa(4)015, TrHa(3)012, TrHa(4)001, and is specific for a microsatellite marker consisting of a group of 8, SEQ ID NO: 1 and 2, 3 and 4, 5 and It may include forward and reverse primer pairs of 6, 7 and 8, 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16.
본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면 황어 친자 식별 방법은 황어 어미의 핵산 시료를 분리하여 청구항 1의 황어 친자식별용 마커 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계, 황어 종자의 핵산 시료를 분리하고 청구항 1의 황어 친자식별용 마커 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계, 상기 증폭된 산물을 이용하여 황어 어미와 황어 종자 간의 친자를 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the dace paternity identification method includes the steps of isolating the nucleic acid sample of the dace mother and performing multiplex PCR using the marker composition for dace paternity identification of claim 1 to amplify the target sequence, Isolating a nucleic acid sample and amplifying the target sequence by performing multiplex PCR using the marker composition for dace paternity identification of claim 1, Containing the step of confirming paternity between the dace mother and the dace seed using the amplified product. It may be.
본 발명의 유전적 다양성 분석은 유전자당 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수 (Polymorphic Information Content; PIC), 대립유전자 수(K), 관찰치 및 기대치 이형접합체율(Ho, He), 대립유전자수 보정치(Allelic richness; Ar)와 유전자다양성(Gene diversity) 지수, 근교계수(FIS)값 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.The genetic diversity analysis of the present invention includes allele frequency per gene, polymorphic information content (PIC), number of alleles (K), observed and expected heterozygosity rates (Ho, He), and allele It may be one or more values selected from allelic richness (Ar), gene diversity index, and inbreeding coefficient (FIS) values.
본 발명은 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 동시 증폭 마커(multiplex PCR ) 2set을 제공함으로써 황어에 대한 유전형 분석시간과 비용절감이 가능한 효과가 있다.The present invention secures a large amount of base sequence information by performing NGS (Next-Generation Sequencing), discovers microsatellite regions, and provides two sets of simultaneous amplification markers (multiplex PCR) to reduce the time and cost of genotyping for yellow perch. There is a possible saving effect.
도 1은 본 발명의 황어 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.
도 2는 마커별 대립유전자 빈도 비교를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 황어 섬진강 부모집단 57개체 암수 정보를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 황어 섬진강 부모집단 유전자형 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 황어 종자 개체 유전자형 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예에 따른 친모 및 친부 확인결과를 나타내고, 하기의 표 4는 친자검출 정확도 결과를 나타낸다.
도 7은 본발명의 실험예 8에 따른 친자관계지수를 이용한 정규분포를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예 8에 따른 위양성(False positive) & 위음성(False negative)에 대한 값을 도출한 것을 나타낸다.Figure 1 shows the combination of the dace multiplex PCR set of the present invention.
Figure 2 shows a comparison of allele frequencies for each marker.
Figure 3 shows the sex information of 57 individuals of the Seomjin River dace parent group according to the present invention.
Figure 4 shows the results of genotyping analysis of the dace Seomjin River parent population according to the present invention.
Figure 5 shows the results of dace seed genotyping analysis according to the present invention.
Figure 6 shows the results of confirming the biological mother and father according to an experimental example of the present invention, and Table 4 below shows the accuracy results of paternity detection.
Figure 7 shows a normal distribution using the paternity index according to Experimental Example 8 of the present invention.
Figure 8 shows the derived values for false positive and false negative according to Experimental Example 8 of the present invention.
본 발명의 용어 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.The term “marker” of the present invention refers to a base sequence used as a reference point when identifying genetically unspecified related loci.
본 발명의 용어 유전자 표지자(genetic marker)는 DNA 서열로 생물에서 의 알려진 위치를 확인 할 수 있는 수단으로 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다. 유전자 표지자는 짧은 DNA서열로, 예를 들어 하나의 염기의 변화로 생긴 SNP(), RFLP(제한효소 절편길이 다형성, Restriction fragment length polymorphism), SSLP(Simple sequence length polymorphism), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RAPD(Random amplification of polymorphic DNA) VNTR(가변수직렬반복, Variable number tandem repeat), SSR(단순서열반복, Simple sequence repeat) 같은 것들이 있다. SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. 이를 이용한 SSR 마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다. The term genetic marker of the present invention is a technology that can analyze the genetic characteristics of biological species as a means of identifying a known location in an organism through a DNA sequence and can be used in evaluation research for the preservation of genetic resources. You can. Genetic markers can show variation caused by mutations or modifications at a genetic locus. Genetic markers are short DNA sequences, such as SNP(), RFLP (restriction fragment length polymorphism), SSLP (simple sequence length polymorphism), and AFLP (Amplified fragment length polymorphism) resulting from a change in one base. ), RAPD (Random amplification of polymorphic DNA), VNTR (Variable number tandem repeat), and SSR (Simple sequence repeat). SSR (simple sequence repeat, or microsatellite) is a simple repeating structure of 2 to 8 bp base sequence that exists in the genome of an organism, and is a part where polymorphism appears due to differences in the number of base sequence repetitions. SSR markers using these have a high degree of polymorphism, so they are widely used to evaluate genetic diversity and flexible relationships. In the fisheries field, SSR markers are also used in many areas such as investigation of release effects, genetic diversity analysis, lineage confirmation, and selective breeding. .
본 발명의 Simple sequence repeats (SSR)라 불리는 microsatellite는 non-coding 부위에 존재하는 1-6 bp의 단순 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마커로써 집단유전학, 유연관계 분석, 친자확인 및 개체식별에 있어 유용한 DNA 마커를 지칭한다.The microsatellite, called simple sequence repeats (SSR) of the present invention, is a repeating 1-6 bp simple base sequence that exists in a non-coding region, and is a marker with frequent distribution on the genome, high discriminatory power, and easy detection, used in population genetics and flexible use. It refers to a DNA marker that is useful in relationship analysis, paternity confirmation, and individual identification.
본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.In the present invention, the term "multiplex PCR" refers to a PCR technique that amplifies multiple genes simultaneously, unlike single PCR, which amplifies one gene for one template DNA. In multiplex PCR, several primer pairs are included in a single PCR mixture, and at this time, it is desirable to indicate the size range of the amplification products specific to each different DNA sequence to prevent the sizes from overlapping.
멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.In the multiplex PCR technique, several different primer pairs are put into one tube and reacted, so inhibition may occur between primers, so when applying multiplex PCR, it is important to select primers for the genes to be amplified. do. In addition, since the appropriate binding temperature may be different for each primer included, when applying multiplex PCR, optimization of the binding temperature suitable for multiplex PCR is required so that all PCR primer pairs included in a single PCR reaction can bind effectively.
본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머들이라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA가닥을 연장할 수 있다.In the present invention, “primer” generally refers to an oligonucleotide, and the term primers defined herein refers to DNA strands that can prepare for the synthesis of DNA. DNA polymerase cannot synthesize DNA from scratch without primers. DNA polymerase can only extend the existing DNA strand in the reaction, using it as a template to dictate the order of nucleotides from which the complementary strand is assembled.
그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.And it can serve as a starting point for synthesis under suitable temperature and pH conditions. Preferably, the primers are deoxyribonucleotides and are single stranded. Primers used in the present invention may include natural dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or synthetic nucleotides. Additionally, primers may also contain ribonucleotides.
본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적 생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다.The term "next generation sequencing (NGS)" of the present invention is a sequencing technology that can generate the sequence of large amounts of reads, typically thousands or more than a few hundred sequence reads simultaneously. Next-generation sequencing is It is distinct and distinct from classical Sanger or capillary sequencing.
전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.Typically, sequenced products have relatively short reads, typically between approximately 600 and 30 base pairs. The above technologies typically additionally constitute extensive and sophisticated data processing workflows for data storage and read assembly.
분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커를 개발할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용하고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는 데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.If the base sequence information of the species to be analyzed is sufficiently known, markers can be developed by directly searching the SSR information, but if the base sequence information is insufficient, a new area must be developed. To develop this, a method of developing SSR markers by analyzing a large amount of base sequence information from the target species for marker development using NGS (next generation sequencing) and directly searching the SSR region has been used. In the case of early large-scale sequencing, it took a long time due to high cost, but with the advancement of technology, analysis has become faster and cheaper and is being used to reveal the genes of many species. Base sequences are secured using NGS for fishery species for which SSR markers have not been developed. The justification for developing microsatellite markers is increasing.
본 발명은 NGS를 이용하여 황어의 염기서열을 밝혀내고 SSR부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 적용할 수 있는 마커를 제공 하고자 한다.The present invention aims to reveal the base sequence of dace using NGS and provide markers that can be applied to paternity confirmation, population structure analysis, selection, and ancestry analysis using the SSR region.
본 발명의 최종 선발된 8개의 동시다중증폭마커세트(Multiplex PCR set)는 식별력, 증폭효율, 안정성, 마커의 다양성이 우수하며 개체식별력은 1.12X10-9으로 매우 높다. 또한 8개의 마커를 1set로 구성하여 동시에 증폭할 수 있는 multiplex PCR set를 개발함으로써 빠르고 신속하게 분석이 가능하도록 함으로써 본 발명을 완성하였다. The eight simultaneous multiplex amplification marker sets (Multiplex PCR set) selected in the present invention are excellent in discrimination power, amplification efficiency, stability, and marker diversity, and the individual identification power is very high at 1.12X10 -9 . In addition, the present invention was completed by developing a multiplex PCR set that can simultaneously amplify eight markers in one set, enabling rapid and rapid analysis.
본 발명의 조성물을 이용한 유전자 분석 및 이를 이용한 친자 확인방법은 황어의 방류효과조사, 선발육종, 교배지침, 유전적 다양성 및 집단구조분석등 전반적인 분자 유전학적연구를 포함하는 것일 수 있다. Genetic analysis using the composition of the present invention and paternity confirmation method using the same may include overall molecular genetic research such as investigation of the effect of releasing dace, selection breeding, breeding guidelines, genetic diversity and population structure analysis.
이하, 본 발명의 실험예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with an experimental example as follows.
<실험예 1> 황어 DNA 추출과정<Experimental Example 1> Dace DNA extraction process
NGS 분석하기 위해서는 High quality DNA를 추출하며, 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 이용하여 수행하였다. For NGS analysis, high quality DNA was extracted, and extraction was performed using the phenol/chloroform extraction method commonly used in the industry or the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).
NGS(Next-Generation Sequencing, 차세대염기서열분석법) 수행 시 정확한 데이터 생산을 위해 High quality DNA 추출을 진행하였다. High quality DNA를 추출하기 위해서는 샘플 수령 후 다음 날 즉시 채취된 조직의 약 1 cm2 내외로 절단하고 멸균 3차 증류수로 세정 후 BIONEER/OMEGA사의 DNA 추출키트를 이용하여 진행하였다.When performing NGS (Next-Generation Sequencing), high quality DNA was extracted to produce accurate data. In order to extract high quality DNA, the tissue collected immediately the next day after receiving the sample was cut into approximately 1 cm 2 , washed with sterilized tertiary distilled water, and then used a DNA extraction kit from BIONEER/OMEGA.
<실험예 2> Library 제작<Experimental Example 2> Library production
DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다. Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다.DNA library production was conducted through a library QC (quality control) test to produce high-quality raw data and was confirmed using Agilent's 2100 BioAnalyzer. When the total volume, which is the concentration standard for passing library QC, is 10ug, it was made to be at least 5nM. After library QC was passed, de novo assembly was performed.
llumina sequencer 인 Hiseq4000을 이용하여 황어의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산된 Total base reads를 확인한 후 Q20에 해당하는 data를 filter 하여 정렬하였다.NGS raw data of dace was produced using Hiseq4000, an llumina sequencer, and the total data production was over 15Gb, which is more than 15 times the genome size. After checking the total base reads produced, the data corresponding to Q20 was filtered and sorted.
<실험예 3> 마커 선발<Experimental Example 3> Marker selection
3-1 NGS 분석진행 후 SSR 영역 marker design3-1 SSR area marker design after NGS analysis
Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘 못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다.Q-score can be viewed as a logarithmic number for the possibility of errors that may occur when calling bases, and Q20 is the probability of incorrectly calling 1 base when calling 100 bases, indicating 99% accuracy.
생산된 data는 Q20이 90% 이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~350bp 마커를 디자인하였다.The produced data was filtered to leave only reads with a Q20 of 90% or more, and after de novo assembly, only the SSR region was selected, and a marker for the region was designed using the Primer3 (version 0.4.0) program. For simultaneous amplification, the annealing temperature was set at 58~60℃, and a marker with GC contents of 40~60% and product size of 100~350bp was designed.
3-2 동시 증폭 위한 marker 제작3-2 Marker production for simultaneous amplification
최종 선발되는 마커는 모든 분석을 마친 후에 되므로 사이즈별 구간을 나누어 random 하게 형광 Dye를 부착하였다. labeled primer는 정방향 올리고 (forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지의 형광물질을 부착하고 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지시켰다. 또한 PCR 조합은 각 마커 간에 사이즈가 오버랩 되지 않으며 형광dye가 겹치지 않도록 임의조합을 구성하고 진행하였다.Since the final marker selected was made after all analyzes were completed, sections were divided by size and fluorescent dye was randomly attached. The labeled primer attaches four types of fluorescent substances, such as FAM, VIC, NED, and PET, to the 5' side of the forward oligo, and if the size of the amplicon overlaps, it is labeled with a different colored fluorescent substance so that it can be distinguished by the color of the fluorescent substance. It was marked. In addition, the PCR combination was performed in a random combination so that the sizes did not overlap between each marker and the fluorescent dyes did not overlap.
하기의 표 1은 황어에 대해 개발된 동시 증폭(Multiplex) 유전자 마커 정보를 나타내고, 도 1은 본 발명의 황어 multiplex PCR set 조합을 나타낸다.Table 1 below shows information on multiplex gene markers developed for yellow carp, and Figure 1 shows the combination of the yellow carp multiplex PCR set of the present invention.
<실험예 4> 동시증폭 중합효소 연쇄 반응(Multiplex PCR 증폭)<Experimental Example 4> Simultaneous amplification polymerase chain reaction (Multiplex PCR amplification)
8개의 marker를 포함한 Multiplex PCR set을 이용하여 유전형분석을 실시하였다. 동시 증폭(multiplexPCR)의 경우 annealing temperature에 따른 영향 및 시약 농도의 영향을 많이 받게 된다. Genotyping was performed using a Multiplex PCR set containing 8 markers. In the case of simultaneous amplification (multiplex PCR), it is greatly affected by annealing temperature and reagent concentration.
PCR 시약의 조성으로는 하나의 샘플 당 DNA template의 경우 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(10mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(2.5U/ul) 0.6ul를 혼합하였으며, 형광이 표지된 마커 세트의 경우 TrHa(3)_014는 0.35ul, TrHa(4)_005는 0.15ul, TrHa(4)_003은 0.1ul, TrHa(4)_014는 0.35ul, TrHa(4)_007는 0.1ul, TrHa(4)_015는 0.35ul, TrHa(3)_012는 0.35ul, TrHa(4)_001는 0.1ul로 구성하여 primer mixture로 만들어 사용하였다. The composition of the PCR reagent included 1ul (100ng/ul) of DNA template, 1.5ul of 10X buffer, 1.5ul of dNTP (10mM), and 0.6ul of Hot-taq polymerase (2.5U/ul) per sample. For this set of labeled markers, TrHa(3)_014 is 0.35ul, TrHa(4)_005 is 0.15ul, TrHa(4)_003 is 0.1ul, TrHa(4)_014 is 0.35ul, and TrHa(4)_007 is 0.1ul. ul, TrHa(4)_015 was used as a primer mixture consisting of 0.35ul, TrHa(3)_012 was 0.35ul, and TrHa(4)_001 was 0.1ul.
총량이 15ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다. PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 9 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 5분간 최종신장반응을 시켜 준 후 4℃로 마무리하였다. Distilled water was added to make the total amount 15ul. The PCR conditions were a touch-down PCR method, lowering the temperature and minimizing the impact of annealing temperature. Denature the template DNA at 95°C for 10 min, followed by a first step of 1 min at 94°C; 9 cycles of 90 sec at 58°C and 1 min at 72°C, repeated for 9 cycles, followed by a second step of 1 min at 94°C; 5 cycles of 90 sec at 57°C and 1 min at 72°C, third at 94°C for 1 min; 25 cycles of 90 sec at 56°C and 1 min at 72°C were repeated. Finally, a final elongation reaction was performed at 65°C for 5 minutes and then finished at 4°C.
<실험예 5> 유전자형 분석(Genotyping analysis)<Experimental Example 5> Genotyping analysis
증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다. After completing the amplification, the PCR product was diluted 30X, and then 1㎕ of the amplification product and a mixture of GeneScan 500 LIZ dye Size Standard (ThermoFisher Scientific, USA) and Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) were diluted 1:9 for analysis. It was used as a sample.
상기 시료는 자동염기서열 분석장치인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하였다. 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.The samples were electrophoresed to be classified by size using an automatic sequence analysis device, 3730xl DNA Analyzer (ThermoFisher Scientific, USA). A standard allele ladder was created for each marker, and all individuals were scored using an analysis program such as GeneMapper version 4.0 (ThermoFisher Scientific, USA), classified by size and type of marker, and data were collected and analyzed.
도 2는 마커별 대립유전자 빈도 비교를 나타낸다. 각 마커 별로 사이즈가 오버랩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료 색 차이로 구분될 수 있으며 파란색으로 나타나는 피크는 FAM, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC, 노란색으로 나타나는 피크는 NED, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET이며 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 를 이용하여 각 마커에 대한 증폭 사이즈(bp)를 알 수 있었다. 각 마커에 대한 빈도를 확인한 결과 전체적으로 안정적인 빈도분포가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.Figure 2 shows a comparison of allele frequencies for each marker. Markers in areas where the size overlaps for each marker can be distinguished by the difference in the color of the labeled fluorescent dye. The peak that appears in blue is FAM, the peak that appears in green is VIC, the peak that appears in yellow is NED, and the peak that appears in red is PET. The amplification size (bp) for each marker could be determined using GeneScan 500 LIZ dye Size Standard (ThermoFisher Scientific, USA). As a result of checking the frequency of each marker, it was confirmed that an overall stable frequency distribution appeared.
<실시예 6> 마커에 대한 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석<Example 6> Polymorphism information index and genetic diversity analysis for markers
하기의 표 2는 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석결과를 나타낸다. 8 loci에 대해 개발된 황어 multiplex PCR set를 이용하여 22년 태화강 부모 7개체, 22년 태화강 종자 192개체, 22년 섬진강 부모 57개체, 22년 섬진강 종자 143개체 총 399개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다. Table 2 below shows the polymorphism information index and genetic diversity analysis results. Using the dace multiplex PCR set developed for 8 loci, genetic diversity and population inheritance of a total of 399 individuals, including 7 22-year Taehwa River parents, 192 22-year Taehwa River seeds, 57 22-year Seomjin River parents, and 143 22-year Seomjin River seeds, were analyzed. A scientific analysis was conducted.
※ 대립유전자수(k), 집단 크기를 보정한 대립유전자수(Ar; allelic richness), 이형접합체율 관찰치(Ho; observed heterozygosity), 이형접합체율 기대치(He; expected heterozygosity), 다형성 정보지수(PIC; polymorphism information contents), 근교계수(F IS; inbreeding coefficient)※ Number of alleles (k), number of alleles corrected for population size (Ar; allelic richness), observed heterozygosity rate (Ho; observed heterozygosity), expected heterozygosity rate (He; expected heterozygosity), polymorphism information index (PIC) ; polymorphism information contents), inbreeding coefficient ( F IS ; inbreeding coefficient)
총 399개체에 대한 집단유전학적 분석의 결과를 확인하였을 때 대립유전자의 수(K)는 13~31개로 평균 19.38로 나타났으며, 집단의 크기를 보정한 대립유전자 수인 대립유전자 수 보정치(Ar, allele richness)의 평균값도 19.36으로 나타났다. 이형접합률 관찰치(Ho) 및 기대치(He)는 평균 0.879, 0.876로 나타났으며, 집단 내 근친도를 의미하는 Inbreeding coefficient(F IS)의 평균은 -0.003으로 나타났다.When the results of the population genetic analysis of a total of 399 individuals were confirmed, the number of alleles (K) was 13 to 31, with an average of 19.38, and the allele number correction value (Ar, which is the number of alleles corrected for the population size) The average value of allele richness was also found to be 19.36. The average observed (Ho) and expected (He) heterozygosity rates were 0.879 and 0.876, and the average of the Inbreeding coefficient ( F IS ), which indicates the degree of relatedness within the group, was -0.003.
다형성정보지수(PIC)는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률로 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있는데 개발된 8개의 마커에 대한 다형성 정보지수의 값은 평균 0.862로 매우 식별력이 높은 마커라는 것이 확인되었다.The polymorphism information index (PIC) is the probability of distinguishing alleles passed from parents to offspring and can be considered a measure of diversity from the perspective of individual identification. The values of the polymorphism information index for the eight developed markers are It was confirmed that it was a marker with very high discriminatory power, with an average of 0.862.
<실험예 7>친자확인 분석 및 혈연관계 분석위한 마커 식별력 검증<Experimental Example 7> Verification of marker identification for paternity analysis and kinship analysis
가축이나 어류에서 친자확인법은 주로 maximum likelihood 방법을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 여기서 중요한 것은 사용되는 마커가 높은 식별력을 가지는 정확한 마커를 사용해야 하며 식별력 계산은 하기의 공식에 따라 산정되었다. Paternity confirmation in livestock or fish mainly uses the maximum likelihood method, which is a statistical analysis method using multiple genotypes. What is important here is that the marker used must be an accurate marker with high discrimination power, and the discrimination power was calculated according to the formula below.
[계산식 1][Calculation Formula 1]
하기의 표 3은 마커별 식별력 계산값을 나타낸다. 황어 399개체 분석 결과에 대한 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석하였다. 마커 전체의 Exclusion power는 1.12X10-9으로 높은 변별력을 나타내었으며, 이는 개체식별 시 99.99% 이상으로 통계적 신뢰수준이 높다는 것을 말한다. 또한 대립유전자빈도에서도 각 마커들이 특정 유전형에 편중된 것이 아닌 것으로 보아 마커의 식별력은 우수하는 것을 뒷받침한다. Table 3 below shows the calculated discrimination power for each marker. The exclusion power of the multiplex PCR set for the analysis results of 399 dace was calculated and analyzed. The exclusion power of all markers was 1.12 In addition, the allele frequency also shows that each marker is not biased towards a specific genotype, supporting the excellent discriminatory power of the marker.
따라서 이후에는 본 개발 마커를 이용하여 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계검증, 개체식별, 선발육종 등 많은 부분에 사용 가능한 마커로 나타났다. 그러나 추가적으로 마커의 고도화를 위해 실제 친자관계의 가계를 이용한 마커 검증과 친자식별력을 분석하고 최종적으로는 오류의 가능성을 고려한 통계적 친자관계 판정을 위해 LOD Score(log of likelihood ratio, 관계지수 로그 값)을 확립하는 과정이 필요할 것이다. Therefore, this developed marker was later shown to be a marker that can be used in many areas such as release effect investigation, genetic diversity analysis, pedigree verification, individual identification, and selective breeding. However, in order to further advance the marker, marker verification using the actual paternity pedigree and paternity identification power were analyzed, and finally, the LOD Score (log of likelihood ratio, log value of the relationship index) was used to determine statistical paternity considering the possibility of error. An establishment process will be necessary.
<실험예 8> 친자확인 분석(parentage analysis)<Experimental Example 8> Paternity analysis
개발된 8개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 혈연관계로 추정되는 부모 집단 및 종자 집단 샘플을 확보하도록 하며, 분석 방법은 개발된 8개 마커를 이용한 동시 증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 진행하였다.In order to analyze the accuracy of the paternity test for the eight developed markers, samples from the parent group and seed group presumed to be related are secured, and the analysis method is genotyping through simultaneous amplification polymerase chain reaction using the eight developed markers. Analysis was conducted.
8-1. 부모 집단(22_TrHa_SJK_P)8-1. Parent group (22_TrHa_SJK_P)
도 3은 본 발명의 실험예 8에 따른 황어 섬진강 부모집단 57개체 암수 정보를 나타낸다. 부모 집단 중 22년 섬진강 부모 집단 일부인 57개체를 확보하여 개발된 8개 마커를 이용한 동시 증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 실시하였으며, 확보한 부모 개체 유전자 샘플 정보는 하기와 같다. Figure 3 shows the sex information of 57 individuals of the Seomjin River dace parent group according to Experimental Example 8 of the present invention. Among the parent population, 57 individuals, part of the 22-year-old Seomjin River parent population, were obtained and genotype analysis was performed through simultaneous amplification polymerase chain reaction using 8 markers developed, and the obtained genetic sample information of the parental individuals is as follows.
도 4는 본 발명의 실험예 8에 따른 황어 섬진강 부모집단 유전자형 분석 결과를 나타낸다. 22년 섬진강 부모 집단은 22_TrHa_SJK_P로 명명하며, 1번 개체의 경우 22_TrHa_SJK_P_001로 명명하였으며 유전형 정보는 하기와 같다.Figure 4 shows the results of genotyping analysis of the dace Seomjin River parent population according to Experimental Example 8 of the present invention. The 22-year Seomjin River parent group was named 22_TrHa_SJK_P, and individual number 1 was named 22_TrHa_SJK_P_001, and the genotype information is as follows.
8-2. 종자개체(22_TrHa_TH_J, 23_TrHa_SJK_J)8-2. Seed entity (22_TrHa_TH_J, 23_TrHa_SJK_J)
22년 섬진강 부모 집단(22_TrHa_SJK_P)으로부터 생산된 22년 태화강 종자 25개체 및 23년 섬진강 종자 4개체를 확보하여 개발된 8개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 유전자형 분석을 실시하였다. Genotyping was performed to analyze the accuracy of the paternity test for the 8 markers developed by securing 25 22-year Taehwa River seeds and 4 23-year Seomjin River seeds produced from the 22-year Seomjin River parent group (22_TrHa_SJK_P).
도 5는 본 발명의 실험예 8에 따른 황어 종자 개체 유전자형 분석 결과를 나타낸다. 22년 태화강 종자 집단은 22_TrHa_TH_J로 명명하며, 1번 개체의 경우 22_TrHa_TH_J_001로 명명하였다. 23년 섬진강 종자 집단은 23_TrHa_SJK_J로 명명하며, 1번 개체의 경우 22_TrHa_SJK_J_001로 명명하였다.Figure 5 shows the results of genotyping analysis of dace seed individuals according to Experimental Example 8 of the present invention. The 22-year Taehwagang seed group was named 22_TrHa_TH_J, and individual number 1 was named 22_TrHa_TH_J_001. The 23-year Seomjin River seed population was named 23_TrHa_SJK_J, and the number 1 individual was named 22_TrHa_SJK_J_001.
8-3. 친자확인 분석 및 통계적 분석8-3. Paternity analysis and statistical analysis
일반적으로 통계분석 및 친자확인을 통해 방류 종자 생산에 참여한 부모와 시료간의 친자확인을 통해 혼획률을 산정하는 것을 parentage analysis(=친자확인) 라고 말한다. 통상적으로 친자확인 분석에서 사용되는 통계적인 친자확인 방법은 휴먼에러를 허용하여 통계적으로 접근하는 Maximum likelihood ratio (Log of likelihood ratio)방법과 1개의 allele에서라도 상이한 경우 친자관계에서 제외하는 exclusion 방법을 사용한다. In general, calculating the bycatch rate through paternity confirmation between the parents who participated in the production of released seeds and samples through statistical analysis and paternity confirmation is called parentage analysis (=paternity confirmation). Statistical paternity confirmation methods commonly used in paternity analysis use the Maximum likelihood ratio (Log of likelihood ratio) method, which takes a statistical approach by allowing for human error, and the exclusion method, which excludes from paternity relationships if there is a difference in even one allele. .
Exclusion method의 경우는 사람의 재난, 재해, 법의학적 증거자료 등으로서 이용이 대부분 되고 있기 때문에 false positive 혹은 negative가 있어서는 안 되기 때문이며 통상적으로 모든 마커에 대한 분석 및 대조가 이루어진다. 그러나 Maximum Log of likelihood ratio를 이용하는 방법은 allele의 matching에 있어서 일부 휴먼에러 및 돌연변이로 인한 에러를 허용하고 통계적인 신뢰도 결과를 바탕으로 분석하는 것이다. In the case of the exclusion method, since it is mostly used for human disasters, disasters, forensic evidence, etc., there should be no false positives or negatives, and all markers are usually analyzed and compared. However, the method of using the Maximum Log of likelihood ratio allows for some human errors and errors due to mutations in allele matching and analyzes based on statistical reliability results.
따라서 가축, 식물, 수산생물 등에서는 법적자료, 이산가족 확인 등과 같은 강력한 증거자료로 이용되기보다는 선발 육종, 방류효과조사, 개체선발, 세대생산 등을 위한 통계적인 평가 도구로서 사용되기 때문에 수산생물에서 주로 사용되는 방법이다. 이는 수산생물의 특성상(변온동물) 사람보다는 많은 variation과 돌연변이들이 존재하기 때문에 누적대립유전자빈도(allele frequency) 및 확률을 이용하여 통계적인 친자확인을 하는 것이 Maximum Likelihood 방법으로 이 방법은 통계적인 처리를 통하여 (대부분 LOD score = loge T/P, T= transmission probability, P= frequency of offspring genotypes in the population) 가장 높은 통계적 확률을 가진 부모에게로 친자확인이 되는 방법이다. Therefore, in livestock, plants, and aquatic life, it is used as a statistical evaluation tool for selection breeding, release effect survey, individual selection, and generation production, rather than as strong evidence such as legal data and confirmation of separated families. This is the mainly used method. Due to the nature of aquatic organisms (cold-blooded animals), there are more variations and mutations than humans, so statistical paternity confirmation using cumulative allele frequency and probability is the Maximum Likelihood method. This method uses statistical processing. This is a method of confirming paternity to the parent with the highest statistical probability (mostly LOD score = loge T/P, T= transmission probability, P= frequency of offspring genotypes in the population).
이것은 많은 데이터를 분석해야 하는 자연집단의 경우에 유리하며 약간의 genotyping error와 mutation 가능성도 수용 가능하기 때문에 수산생물의 자연집단의 친자확인 등 분석에는 더 강력한 방법이 된다. 특히 부모 또는 offspring의 수가 많은 경우 친자확인에 더 좋은 방법이 된다.This is advantageous in the case of natural populations where a lot of data must be analyzed, and because the possibility of slight genotyping errors and mutations is acceptable, it is a more powerful method for analysis such as paternity of natural populations of aquatic organisms. Especially when the number of parents or offspring is large, it is a better method for confirming paternity.
따라서 본 특허에서는 통상적으로 사용되고 있는 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 수치를 도출하였으며 부모에 대한 유전정보 및 자식 개체에 대해 친자확인(parentage analysis)을 진행 시 친자관계가 성립되는 개체에 대한 likelihood ratio를 산정하고 성립되지 않는 개체들에 대한 simulation을 통한 likelihood ratio 결과값을 비교 분석, 정규분포, false-positive & negative에 대한 threshold를 설정하였으며 본 개발 마커를 이용하여 친자관계 확인 시 mismatch 허용 기준과 Threshold 기준값도 동시에 설정하였다. 결론적으로는 mismatch를 무작정 허용하는 것은 과학적인 근거와 설명을 하기에는 다소 부족한 부분이 있어 본 개발에서는 상기 두 가지 방법을 적용하여 결과 검증을 시행하였다. Therefore, in this patent, the figures were derived through parentage analysis of the commonly used Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998), and when paternity analysis was performed on the genetic information of the parents and the child, the paternity relationship was confirmed. The likelihood ratio for established individuals was calculated, and the likelihood ratio results through simulation for non-established individuals were compared and analyzed, thresholds for normal distribution, false-positive & negative were set, and paternity relationship was established using this developed marker. Upon confirmation, mismatch acceptance criteria and threshold values were also set at the same time. In conclusion, blindly allowing mismatch is somewhat insufficient to provide scientific basis and explanation, so in this development, the above two methods were applied to verify the results.
도 6은 본 발명의 실험예에 따른 친모 및 친부 확인결과를 나타내고, 하기의 표 4는 친자검출 정확도 결과를 나타낸다. Figure 6 shows the results of confirming the biological mother and father according to an experimental example of the present invention, and Table 4 below shows the accuracy results of paternity detection.
개발된 유전자 마커에 대한 SSR 부위의 반복 수는 멘델의 유전 법칙에 의해 자손에게 전달되며, 부모 집단의 유전자형과 비교를 통해 친자 확인이 가능하다. 황어 친자확인 분석을 위해 확보한 부모 집단의 경우, 편부 / 편모로 추정되는 부모 57개체를 확보하여 종자 29개체에 대한 분석을 진행하였으며, 종자 29미 모두 mismatch '0' 기준으로 친자관계가 성립되는 것을 확인하였다. The number of repeats in the SSR region for the developed genetic marker is passed on to offspring according to Mendel's laws of inheritance, and paternity can be confirmed through comparison with the genotype of the parent population. In the case of the parent group secured for dace paternity analysis, 57 parents presumed to be single fathers/single mothers were secured and analysis was conducted on 29 seeds, and paternity was established based on mismatch '0' for all 29 seeds. confirmed.
추가적으로 친자관계 판정을 위한 통계적 기준설정을 위해 도 7에 도시된 바와 같이 정규분포를 작성하고 False positive & False negative rate(%)를 검증하였다. 친자확인 개체와 친자가 아닌 그룹에 대한 정규분포 분석 결과 'Log(LOD) =2' 기준으로 위양성 및 위음성률이 0.06~0.11%으로 매우 낮은 에러율을 나타냈으며 이는 높은 정확도로 친자관계 확인이 가능하다는 것이다.Additionally, to establish statistical standards for determining paternity, a normal distribution was created as shown in Figure 7 and the false positive & false negative rates (%) were verified. As a result of normal distribution analysis of paternity confirmation subjects and non-paternity groups, the false positive and false negative rates were 0.06~0.11% based on 'Log(LOD) = 2', which showed a very low error rate, which means that paternity can be confirmed with high accuracy. will be.
도 8은 본 발명의 실험예 8에 따른 위양성(False positive) & 위음성(False negative)에 대한 값을 도출한 것을 나타낸다. 친자관계 및 친자관계가 아닌 그룹에 대한 위양성(False positive) & 위음성(False negative)에 대한 값을 도출한 것으로 Log(LOD) 값이 '2'일 경우 위양성 에러율 0.11% 이며 위음성 에러율의 경우 0.06%로 매우 낮게 나타났으며 이는 Threshold LOD 값이 '2'일 경우 친자관계 확인 시 결과에 대한 신뢰도가 99%이상 이라고 말할 수 있다. 상기 통계적 검증을 통해 개발된 황어 8마커를 이용할 경우 높은 정확도로 친자관계 확인이 가능하다는 것을 알 수 있다.Figure 8 shows the derived values for false positive and false negative according to Experimental Example 8 of the present invention. False positive and false negative values for paternity and non-paternity groups were derived. When the Log(LOD) value is '2', the false positive error rate is 0.11% and the false negative error rate is 0.06%. It was found to be very low, which means that when the Threshold LOD value is '2', the reliability of the results when confirming paternity can be said to be over 99%. It can be seen that paternity can be confirmed with high accuracy when using the 8 markers of dace developed through the above statistical verification.
본 발명의 개발 마커를 이용하여 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계검증, 개체식별, 선발육종 등 많은 부분에 사용 가능한 마커로 나타났다. 그러나 추가적으로 마커의 고도화를 위해 실제 친자관계의 가계를 이용한 마커 검증과 친자식별력을 분석하고 최종적으로는 오류의 가능성을 고려한 통계적친자관계 판정을 위해 LOD Score(log of likelihood ratio, 관계지수 로그 값)을 확립하는 과정이 필요할 것이다.Using the marker developed in the present invention, it was found to be a marker that can be used in many areas such as release effect investigation, genetic diversity analysis, pedigree verification, individual identification, and selective breeding. However, in order to further advance the marker, marker verification and paternity identification using the actual paternity pedigree were analyzed, and finally, the LOD Score (log of likelihood ratio, log value of the relationship index) was used to determine statistical paternity considering the possibility of error. An establishment process will be necessary.
본 발명의 황어 친자 식별 마커 및 식별방법은 황어의 집단, 계통분석, 친자 확인 등에 적용하여 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발할 수 있도록 기본데이터 베이스를 제공함으로써, 고부가 가치의 황어 생산에 기여함으로 산업상 이용가능성이 있다.The dace paternity identification marker and identification method of the present invention can be applied to dace populations, phylogenetic analysis, and paternity confirmation, providing a basic database to develop new strains or varieties of dace, thereby contributing to the production of high-value dace for industrial use. There is a possibility.
Claims (2)
8: TrHa(3)014, TrHa(4)005, TrHa(4)003, TrHa(4)014, TrHa(4)007, TrHa(4)015, TrHa(3)012, TrHa(4)001 It is specific for the microsatellite marker consisting of the group consisting of forward primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, and Marker composition for paternity identification of yellow perch comprising a reverse primer set
황어 종자의 핵산 시료를 분리하고 청구항 1의 황어 친자식별용 마커 조성물을 이용하여 동시 증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 수행하는 단계,
상기 증폭된 산물을 이용하여 유전적 다양성을 분석하여, 황어 어미와 황어 종자 간의 친자를 확인하는 단계를 포함하는 황어의 친자 확인방법Separating a nucleic acid sample from a dace mother and performing genotyping through simultaneous amplification polymerase chain reaction using the marker composition for dace paternity identification of claim 1;
Separating nucleic acid samples from dace seeds and performing genotyping through simultaneous amplification polymerase chain reaction using the marker composition for dace paternity identification of claim 1;
A method for confirming paternity of dace, comprising the step of confirming paternity between the dace mother and the dace seed by analyzing genetic diversity using the amplified product.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230036307 | 2023-03-21 | ||
| KR20230036307 | 2023-03-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102633387B1 true KR102633387B1 (en) | 2024-02-06 |
Family
ID=89858177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230153812A KR102633387B1 (en) | 2023-03-21 | 2023-11-08 | Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102633387B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102062452B1 (en) | 2018-05-29 | 2020-01-03 | 주식회사 불루젠코리아 | Genetic maker for parentage and thereod in Turbot |
| KR102077917B1 (en) | 2018-05-29 | 2020-02-17 | 주식회사 불루젠코리아 | Genetic maker for parentage and thereof in Olive flounder |
-
2023
- 2023-11-08 KR KR1020230153812A patent/KR102633387B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102062452B1 (en) | 2018-05-29 | 2020-01-03 | 주식회사 불루젠코리아 | Genetic maker for parentage and thereod in Turbot |
| KR102077917B1 (en) | 2018-05-29 | 2020-02-17 | 주식회사 불루젠코리아 | Genetic maker for parentage and thereof in Olive flounder |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| Conservation genetics resources v.3 no.3 ,pp. 565 - 567 , 2011 , 1877-7252 , Springer-Verlag * |
| Journal of fishery sciences of China v.12 no.6 ,pp. 688 - 693 , 2005 , 1005-8737 , 中國水産科學編輯部 * |
| Journal of the Korean Fisheries Society v.18 no.4 ,pp. 381 - 400 , 1985 , 0374-8111 , 한국수산과학회 * |
| Korean journal of environment and ecology v.26 no.4 ,pp. 475 - 483 , 2012 , 1229-3857 , 한국환경생태학회 * |
| Korean journal of environment and ecology v.26 no.4 ,pp. 475 - 483 , 2012 , 한국환경생태학회 * |
| The Korean journal of zoology v.38 no.1 ,pp. 87 - 95 , 1995 , 0440-2510 , 한국통합생물학회 * |
| 국내 등록특허번호 제10-2064039호에는 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 개시하고 있다. |
| 국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 문치가자미(Limandayokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공함으로써, 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다. |
| 문정찬 외 14명, 멸종위기종 유전다양성 및 고유성 연구, 국립생태원 (2021) * |
| 전창영, 박사학위논문 (2006) 여수대학교 대학원 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zagalska-Neubauer et al. | 454 sequencing reveals extreme complexity of the class II Major Histocompatibility Complex in the collared flycatcher | |
| KR102301324B1 (en) | Genetic marker for parentage and thereof in Limanda yokohamae | |
| Lapegue et al. | Development of SNP‐genotyping arrays in two shellfish species | |
| Welsh et al. | Development and standardization of disomic microsatellite markers for lake sturgeon genetic studies | |
| KR102077917B1 (en) | Genetic maker for parentage and thereof in Olive flounder | |
| KR102062452B1 (en) | Genetic maker for parentage and thereod in Turbot | |
| Malausa et al. | Genetic structure and gene flow in French populations of two Ostrinia taxa: host races or sibling species? | |
| Poompuang et al. | Toward detection of quantitative trait loci and marker‐assisted selection in fish | |
| Osman et al. | The genetic variability and relationships of Japanese and foreign chickens assessed by microsatellite DNA profiling | |
| KR100960878B1 (en) | Method for identification and parentage using microsatellite marker in Olive flounder | |
| KR102064039B1 (en) | Method for identification and parentage using marker in Ephinephelus akaara | |
| Sawayama et al. | Identification and quantification of farmed red sea bream escapees from a large aquaculture area in Japan using microsatellite DNA markers | |
| Amish et al. | Rapid SNP genotyping, sex identification, and hybrid-detection in threatened bull trout | |
| Gebbie | Population genetic structure of New Zealand blue cod (Parapercis colias) based on mitochondrial and microsatellite DNA markers | |
| Eoche‐Bosy et al. | Experimentally evolved populations of the potato cyst nematode Globodera pallida allow the targeting of genomic footprints of selection due to host adaptation | |
| CN112080570A (en) | KASP labeled primer combination for identifying hybrid stichopus japonicus in Zhongrussia and application thereof | |
| KR102633387B1 (en) | Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis | |
| KR102111238B1 (en) | Microsatellite marker composition for analysis Epinephelus bruneus genes and method of analysis using the same | |
| KR102527604B1 (en) | Genetic marker for parentage and thereof in Tribolodon hakonensis. | |
| Maroso et al. | Species identification of two closely exploited flatfish, turbot (Scophthalmus maximus) and brill (Scophthalmus rhombus), using a ddRADseq genomic approach | |
| CN111607654B (en) | Zhuwei satellite polymorphic site, screening method, primer pair combination and amplification method | |
| Wesmajervi et al. | Evaluation of a novel pentaplex microsatellite marker system for paternity studies in Atlantic cod (Gadus morhua L.) | |
| KR102530346B1 (en) | Genetic maker for parentage and thereof in Stichopus japonicus | |
| KR102530342B1 (en) | Genetic maker for parentage and thereof in Stichopus japonicus | |
| CN111394478B (en) | PCR (polymerase chain reaction) microsatellite primer and method for paternity test of large yellow croaker by using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |