KR102627853B1 - Atp―결합 카세트 패밀리 코딩 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 제제 - Google Patents

Atp―결합 카세트 패밀리 코딩 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 제제 Download PDF

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카르스텐 루돌프
마니쉬 쿠마르 아네자
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에트리스 게엠베하
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Abstract

펩티드, 단백질, 효소, 및 그의 기능성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 효과적으로 기관, 예컨대, 폐로 전달될 수 있고, 기관의 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리, 예컨대, ABCA3의 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

ATP―결합 카세트 패밀리 코딩 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 제제
상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119하에 2015년 6월 30일 출원된 EP15174677.3의 이익을 주장하며, 상기 특허는 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
배경
메신저 RNA (mRNA)는, 각각이 당, 포스페이트, 및 염기로 구성된 것인 다수의 연결된 뉴클레오티드를 함유하는 중합체이다. 각 mRNA 중합체는 뉴클레오티드 쇄를 따라 유전 정보를 저장한다. 메신저 RNA 중합체는 세포의 핵 중의 DNA로부터 단백질이 제조되는 세포질로 유전 정보를 운반한다. mRNA에서 뉴클레오티드로 이루어진 각 트리플렛은 코돈으로 명명되며, 각 코돈이 번역된 단백질 중 아미노산의 아이덴티티를 나타낸다.
세포는 또한 외인성 RNA도 흡수하고, 번역할 수 있지만, 다수의 인자가 효율적인 흡수 및 번역에 영향을 미친다. 예를 들어, 면역계는 다수의 외인성 RNA를 외래 물질로서 인식하고, RNA를 불활성화시키는 것을 목적으로 하는 반응을 일으킨다. 추가로, 다수의 외인성 RNA는 숙주 세포 내에서 적절히 발현될 정도로 충분히 안정적이지 않다.
본 개시내용은 호흡 곤란 증후군과 연관이 있을 수 있는 ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리, 예컨대, ABCA3의 유전자와 연관된 질환을 앓거나, 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한, 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 대상체의 세포 내에서의 번역을 위해 최적화된 코돈 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 번역시 질환의 증상을 호전시키는 폴리펩티드를 생산하게 된다. ATP-결합 카세트 패밀리 중 유전자는 ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCA12, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCG5, ABCG8, 및 CFTR로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에서, ATP-결합 카세트 패밀리 중 유전자는 ABCA3이거나, 또는 인간 ABCA3과 적어도 70% 상동성인 것이다. 일부 경우에서, 조성물은 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 포스페이트 기의 몰 대비 양이온성 중합체의 아민 기의 몰의 비가 적어도 약 8인 몰비로 포함한다. 일부 경우에서, 조성물은 하기 표 8로부터 선택된다. 일부 경우에서, 최적화된 코돈 서열은 대상체의 세포 내에서 비최적화된 코돈 서열보다 적어도 20% 더 효과적으로 번역된다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 본 개시내용의 조성물은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있고, 질환은 연령 관련 황반 변성, 양성 재발성 간내 담즙울체증, 칸투 증후군(Cantu syndrome), 선천성 양측 정관 형성 부전증, 선천성 과인슐린증, 낭성 섬유증, 듀빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), 가족성 확장성 심근병증, 가족성 HDL 결핍증, 유아기의 전신 동맥 석회화, 할리퀸 어린선, 유전성 췌장염, 임신 중 간내 담즙울체증, 층판상 어린선, 영구 신생아 진성 당뇨병, 진행성 가족성 간내 담즙울체증, 탄력 섬유성 가황색종, 망막 색소변성증, 시토스테롤혈증, 스타카르트 황반 변성, 계면활성제 기능 장애, 탄지에르병, X-연관 부신백질이영양증, X-연관 철적모구 빈혈 및 실조증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 가지는 대상체의 세포에서 일정 기간 동안 폴리펩티드의 발현을 제공하며, 여기서, 일정 기간은 최대 4주이고, 여기서, 발현은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 비변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 대조군 세포에서의 발현과 비교하여 증진된다. 일정 기간은 적어도 약 30초 내지 최대 5일일 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 서열 측면에 위치하는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 포함하며, 여기서, 비코딩 영역은 세포에서의 폴리펩티드의 발현 증진에 도움을 준다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 나노입자, 나노캡슐, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 나노에멀젼으로 제제화된다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 우리딘의 유사체 또는 시티딘의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 5% 내지 50% 우리딘의 유사체 또는 5% 내지 50% 시티딘의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 15% 내지 30% 우리딘의 유사체 또는 15% 내지 30% 시티딘의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 우리딘의 유사체는 슈도우리딘, 2-티오우리딘, 5-아이오도우리딘, 및 5-메틸우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에서, 시티딘의 유사체는 5-메틸시티딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 및 5-아이오도시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 5-메틸시티딘 또는 슈도우리딘을 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 (i) 우리딘 및 시티딘; 및 (ii) 우리딘 및 시티딘의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 아데노신의 유사체 또는 구아노신의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 (i) 아데노신 또는 구아노신; 및 (ii) 아데노신 또는 구아노신의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 50% 미만의 아데노신 또는 구아노신의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 (i) 아데노신 및 구아노신; 및 (ii) 아데노신 및 구아노신의 유사체를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 세포 중에서 80% 초과의 형질감염(transfection) 효율을 가진다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 발현된 적어도 하나의 염증성 마커의 어떠한 수준 변화도 실질적으로 유도하지 않는다. 일부 경우에서, (i) 코돈 서열은 그의 결함 또는 결핍이 질환의 존재와 연관이 있는 것인 유전자 또는 단편이거나, 또는 (ii) 폴리펩티드의 결여 또는 결핍이 질환의 존재와 연관이 있다. 예를 들어, ABCA3 유전자의 결핍은 호흡 곤란 증후군의 원인이 될 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 비변형된 폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 대상체의 면역 반응을 저하시키며, 여기서, 상기 면역 반응은 비변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 대조군에서의 말초 혈액 단핵 세포 중의 적어도 하나의 염증성 마커의 수준과의 비교로 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 발현되는 TNF-α, IL-2 및 IL-8로부터 선택되는 적어도 하나의 염증성 마커의 수준으로 측정되는 바와 같다.
본 개시내용의 추가의 측면 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 자명해질 것이며, 여기서는 오직 본 개시내용의 예시적인 실시양태만이 제시되고, 기술된다. 알게 되는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 상이한 실시양태도 가능하며, 그의 여러 세부 사항들은 모두 본 개시내용으로부터 벗어남 없이 각종의 명백한 측면들에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 기술내용은 제한적인 것이 아니라, 사실상 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
참고 문헌 인용
본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 특허청구범위를 통해 기술된다. 본 발명의 원리가 사용되는, 예시적인 실시양태를 기술하는 하기의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점은 더욱 잘 이해할 것이다:
도 1은 마우스에게로의 본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 에어로졸 투여의 예를 도시한 것이다.
도 2는 형질감염 후 6시간째 A549 세포에서의 상이한 UTR을 가지는 ABCA3 mRNA의 번역을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
도 3은 HEK-293 세포에서의 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 mRNA로부터의 ABCA3 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
도 4는 A549 세포에서의 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 mRNA로부터의 ABCA3 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
도 5는 MLE-15 세포에서의 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 mRNA로부터의 ABCA3 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
도 6은 HEK-293 세포, A549 세포, 및 MLE-15 세포에서의 mRNA 형질감염 후 6시간째의 웨스턴 블롯에 의해 측정된 ABCA3 단백질 발현 수준 비교를 도시한 것이다.
도 7은 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 ABCA3-FLAG mRNA로부터 ABCA3 단백질을 번역하는 A549 세포에서의 IL-6의 유도를 도시한 것이다.
도 8은 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 ABCA3-FLAG mRNA로부터 ABCA3 단백질을 번역하는 HepG2 세포에서의 IP-10의 유도를 도시한 것이다.
도 9는 다양한 화학적 변형을 포함하는 mRNA로의 형질감염 이후의 A549 세포의 세포 생존가능성을 도시한 것이다.
도 10은 다양한 화학적 변형을 포함하는 mRNA로의 형질감염 이후의 HEP G2 세포의 세포 생존가능성을 도시한 것이다.
도 11은 다양한 화학적 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 이후의 A549 세포로부터의 IL-6의 수준을 측정한 ELISA 검정법의 결과를 도시한 것이다.
도 12는 다양한 화학적 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 이후의 A549 세포로부터의 IP-10의 수준을 측정한 ELISA 검정법의 결과를 도시한 것이다.
도 13은 시험관내에서 폐 세포에서 서열 번호: 17로부터 발현된 ABCA3 폴리펩티드의 시간 경과에 따른 번역을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시되고, 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 예로서만 제공된다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명으로부터 벗어남 없는 다수의 변형, 변경 및 치환이 당업자에게 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 일반적으로 인간을 지칭한다. 일부 경우에서, 대상체는 또한 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 토끼, 및 각종의 다른 동물일 수 있다. 대상체는 임의 연령일 수 있으며, 예를 들어, 대상체는 영아, 유아, 아동, 사춘기 이전의 청소년, 청소년, 성인, 또는 노인일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "질환"이라는 용어는 일반적으로 대상체의 일부분 또는 그 전체에 영향을 주는 비정상적인 생리학적 병태, 예컨대, 질병 (예컨대, 천식) 또는 암을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "암"이라는 용어는 일반적으로 세포의 비정상적인 분열로부터 발생하는 임의의 성장을 지칭한다. 암은 비정상적인 세포 분열로부터 발생하는 악성 또는 양성 성장 또는 종양일 수 있다. 암은 혈액암일 수 있거나, 또는 암은 고형 암일 수 있다. 암은 대상체 신체의 임의의 일부분에서의 비정상적인 세포의 양성 또는 악성의 비제어된 분열일 수 있는 질환일 수 있다. 포함되는 암의 비제한적인 예로는 유방암 및 폐암을 포함한다. 폐암의 예로는 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 및 폐 카르시노이드 종양이 있다. 유방암의 예로는 전이성 유방암, 염증성 유방암, 삼중 음성 유방암 (프로게스테론, 에스트로겐, 및 HER2/neu 수용체에 대하여 음성), 침윤성 관상 암종, 및 관상 상피내 암종을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이라는 용어는 퓨린 및 피리미딘 염기, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 천연 또는 비천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는, 임의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드인, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 퓨린 및/또는 피리미딘 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 또는 리보핵산의 DNA 카피 (cDNA)의 서열을 포함하며, 이들은 모두 재조합적으로 제조될 수 있거나, 인공적으로 합성될 수 있거나, 또는 단리될 수 있고, 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 백본은, 전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있는 것과 같은 당 및 포스페이트 기, 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생된 또는 비천연적으로 발생된 뉴클레오티드를 비롯한 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 (또는 아날로그)를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리리보뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로 비변형된 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 비롯한, 50% 초과의 리보스 염기를 함유하는 폴리뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 용어는 또한, 비변형된 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 비롯한, 예컨대, 50% 초과의 리보스 염기를 함유하는 것과 같은, 리보핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 용어는 또한 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중합체, 예컨대, 유사체를 지칭한다. 폴리리보뉴클레오티드는 자연에서 발견될 수 있는 d-리보스, 및 자연에서 발견되지 않는 l-리보스 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"라는 용어는 일반적으로 아미드 결합 (펩티드 결합)을 통해 연결된, 아미노산 잔기 단량체로 구성된 중합체 쇄를 지칭한다. 아미노산은 l-광학 이성질체 또는 d-광학 이성질체일 수 있다. 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산으로 이루어진 쇄, 펩티드-모방체, 단백질, 재조합 단백질, (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체, 항체 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 항원, 에피토프, 효소, 수용체, 비타민, 또는 구조적 유사체 또는 그의 조합일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 폴리펩티드를 형성하는 l-거울상이성질체 및 d-거울상이성질체 아미노산에 대한 약어는 하기와 같다: 알라닌 (A, Ala); 아르기닌 (R, Arg); 아스파라긴 (N, Asn); 아스파르트산 (D, Asp); 시스테인 (C, Cys); 글루탐산 (E, Glu); 글루타민 (Q, Gln); 글리신 (G, Gly); 히스티딘 (H, His); 이소류신 (I, Ile); 류신 (L, Leu); 리신 (K, Lys); 메티오닌 (M, Met); 페닐알라닌 (F, Phe); 프롤린 (P, Pro); 세린 (S, Ser); 트레오닌 (T, Thr); 트립토판 (W, Trp); 티로신 (Y, Tyr); 발린 (V, Val). X 또는 Xaa는 임의의 아미노산을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "조작된"이라는 용어는 일반적으로 세포내에서 폴리뉴클레오티드를 제공하도록 유전적으로 디자인되고, 조작 처리된, 비천연적으로 발생된, 유전적으로 변형된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 핵산 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조작된이라는 것은 세포내에서 폴리뉴클레오티드를 제공하도록 유전적으로 디자인되고, 조작 처리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 핵산 구축물을 지칭한다. 조작된 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 부분적으로 또는 전체적으로 합성될 수 있다. 조작된 폴리뉴클레오티드는 또한 클로닝될 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 염기들 또는 염기 또는 당 유사체, 예컨대, 메신저 RNA에서는 자연적으로는 발견되지 않는 리보뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 가이드 RNA (gRNA), 소핵 RNA (snRNA), 소핵소체 RNA (snoRNA), SmY RNA, 스플라이싱된 리더 RNA (SL RNA), CRISPR RNA, 긴 비코딩 RNA (lncRNA), 마이크로RNA (miRNA), 또는 또 다른 적합한 RNA에 존재하는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다.
개요
본 개시내용은 단백질 또는 단백질 단편(들)을 코딩하는 안정적인 핵산을 이용하여 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 계면활성제 생산에 관여하는 세포 내에서 번역될 수 있는 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 예를 들어, ABCA3 유전자는 계면활성제 생산에 관여하는 단백질을 제조하기 위한 지침을 제공한다. 계면활성제는 폐 조직 안에서 막을 형성하고, 폐의 팽창 및 수축, 및 대상체의 호흡을 촉진시키는, (인지질로 불리는) 특정 지방과 단백질의 혼합물일 수 있다. 정상적인 계면활성제가 없다면, 폐에서 폐포 (허파꽈리) 주변의 조직은 (표면 장력이라 불리는 힘 때문에) 호기 이후에 함께 붙게 되고, 이는 허파꽈리의 허탈을 유발한다. 그 결과로서, 숨을 쉴 때마다 공기로 폐를 충전시키는 것이 어려울 수 있으며, 신체에 산소를 전달하는 것은 손상될 수 있다. 이는 대상체, 예컨대, 영아에서 호흡 곤란 증후군을 일으킬 수 있다.
ABCA3 단백질은 전형적으로, 계면활성제를 구성하는 인지질 및 단백질이 패키징된 세포 구조인 층판소체 주변의 막에서 발견된다. ABCA3 단백질은 인지질을 층판소체 내로 수송할 수 있고, 층판소체에서 인지질은 계면활성제 단백질과 상호작용하여 계면활성제를 형성한다. ABCA3 단백질은 또한 정상적인 층판소체의 형성에도 관여하는 것으로 보인다. 패키징 이외에도, 층판소체는, 단백질이 성숙화되고, 기능을 가지게 되는 데 필요한, 계면활성제 단백질의 올바른 프로세싱에도 중요할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 대상체의 세포로 전달되고, 그 안에서 번역되어 ABCA3 단백질, 그의 기능성 단편, 또는 기능성 동족체를 생산할 수 있고, 이로써, 예를 들어, 계면활성제 생산의 결함과 연관된 병태를 치료할 수 있다.
일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하기 표 1에 제시된 5' 비번역 영역 (UTRs) 및 3' UTRS의 유전자 코드를 포함한다:
Figure 112018008981144-pct00001
조작된 폴리뉴클레오티드는 ABCA3 유전자의 mRNA 서열 (서열 번호: 8), ABCA3의 DNA 서열 (서열 번호: 9), 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 천연 ABCA3 DNA 서열 (서열 번호: 10), 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 천연 ABCA3 mRNA 서열 (서열 번호: 11), 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 코돈 최적화된 ABCA3 DNA 서열 (서열 번호: 12), 또는 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 코돈 최적화된 ABCA3 mRNA 서열 (서열 번호: 13)을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리 중 유전자의 서열의 적어도 일부를 포함한다. ATP-결합 카세트 패밀리 중 유전자는 ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCA12, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCG5, ABCG8, 또는 CFTR일 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리 중 유전자의 서열과 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성인 서열을 포함할 수 있다.
조작된 폴리뉴클레오티드
본 개시내용은 관심의 대상이 되는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대, 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 핵산이라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 50% 초과의 리보스 염기를 함유하는 뉴클레오티드 중합체 또는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체는 폴리리보뉴클레오티드로서 지칭된다. 조작된 폴리뉴클레오티드의 서열은 예를 들어, DNA, RNA, mRNA 전사체, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 미토콘드리아 RNA, 또는 관심의 대상이 되는 유전자의 유전 정보를 포함하는 또 다른 적합한 핵산으로부터 유도될 수 있다. 핵산 구축물, 벡터, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드, 또는 조성물은 돌연변이화된 유전자 및 다형성을 보유하는 핵산으로부터 유도될 수 있다.
4종의 고전적/정규 리보뉴클레오티드, 즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우리딘 이외에도, 수개의 세포 RNA는 또한 구조상 다양한 다수의 리보뉴클레오티드를 함유한다. 약 100여 종의 구조상 상이한 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체가 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 메신저 RNA (mRNA) 및 소핵 RNA (snRNA)에서 확인되었다. tRNA에서, 일부 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드는 아미노아실화 및 코돈 인식의 특이성 및 효율의 중요한 결정인자일 수 있다. 상기의 구조상 다양한 리보뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체를 포함하도록 조작된다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있는 예시적인 핵산으로는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 또는 그의 하이브리드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 형성할 수 있는 예시적인 변형된 뉴클레오티드로는 슈도우리딘 (ψ), 5-아이오도우리딘 (I5U), 5-아이오도시티딘 (I5C), 2-티오우리딘 (s2U), 5-메틸시티딘 (m5C)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
변형, 예컨대, 화학적 변형은 하나 이상의 뉴클레오시드(들) 또는 핵산 분자의 백본 상에 위치할 수 있다. 변형은 뉴클레오시드 및 백본 연결부, 둘 모두에 위치할 수 있다. 변형은 시험관내에서 폴리뉴클레오티드로 조작될 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드 및 핵산 유사체는 또한 고전적 리보뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 전사 이후에 합성될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 퓨린 및 피리미딘 또는 퓨린 및 피리미딘 유사체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 피리미딘, 예컨대, 변형된 우리딘 및/또는 변형된 시티딘을 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 우리딘 또는 우리딘 유사체는 슈도우리딘 (Ψ), 2-티오우리딘 (s2U), 5-메틸우리딘 (m5U), 5-메틸우리딘 (m5U), 5-아이오도우리딘 (I5U), 4-티오우리딘 (s4U), 5-브로모우리딘 (Br5U), 2'O-메틸우리딘 (U2'm), 2'-아미노-2'-데옥시우리딘 (U2'NH2), 2'-아지도-2'-데옥시우리딘 (U2'N3), 및 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘 (U2'F)으로부터 선택된다. 일부 경우에서, 변형된 시티딘은 5-메틸시티딘 (m5C), 3-메틸시티딘 (m3C), 2-티오시티딘 (s2C), 2'-O-메틸시티딘 +(C2'm), 2'-아미노-2'-데옥시시티딘 (C2'NH2), 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘 (C2'F), 5-아이오도시티딘 (I5C), 5-브로모시티딘 5'-트리포스페이트 (Br5C) 및 2'-아지도-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 (C2'N3)로부터 선택된다. 아날로그를 언급할 때, 상기의 것 (또는 하기 표에 열거된 아날로그)은 또한 그의 5' 트리포스페이트 형태의 아날로그를 언급한다는 것에 주의한다.
일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않은 (또는 비변형된) 리보뉴클레오티드와 비교하였을 때, 대상체에서 적어도 25% 더 안정적이다. 일부 경우에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드와 비교하였을 때, 대상체에서 적어도 30% 더 안정적, 적어도 35% 더 안정적, 적어도 40% 더 안정적, 적어도 45% 더 안정적, 적어도 50% 더 안정적, 적어도 55% 더 안정적, 적어도 60% 더 안정적, 적어도 65% 더 안정적, 적어도 70% 더 안정적, 적어도 75% 더 안정적, 적어도 80% 더 안정적, 적어도 85% 더 안정적, 적어도 90% 더 안정적, 또는 적어도 95% 더 안정적일 수 있다.
폴리리보뉴클레오티드는 동일한 형태로 변형된 뉴클레오티드, 또는 그렇지 않다면, 상이한 변형된 뉴클레오티드들의 혼합물을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 메신저 RNA에서 천연적으로 발생된, 또는 비천연적으로 발생된 변형을 가질 수 있다. 각종의 변형된 뉴클레오티드들의 혼합물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 천연 변형을 가질 수 있는 반면, 또 다른 부분은 mRNA에서 천연적으로 발견되지 않는 변형을 가진다. 일부 경우에서, RNA의 안정성은 변형된 폴리리보뉴클레오티드 내의 변형된 염기의 성질을 변화시킴으로써 선택적으로 최적화될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성에 영향을 주는 우리딘 변형의 비제한적인 예는 하기 표 2에 제시되어 있다.
표 2
명칭 염기 변형 당 변형 (2'번 위치) mRNA의 천연적으로 발생 여부
슈도우리딘 - 천연적으로 발생
5-메틸우리딘 (m5U) CH3 비천연적으로 발생
5-아이오도우리딘 (I5U) I 비천연적으로 발생
5-브로모우리딘 (Br5U) Br 비천연적으로 발생
2-티오우리딘 (s2U) (2번 위치에) S 비천연적으로 발생
4-티오우리딘 (s4U) (4번 위치에) S 비천연적으로 발생
2'-O-메틸우리딘 (U2'm) - CH3 천연적으로 발생
2'-아미노-2'-데옥시우리딘 (U2'NH2) - NH2 비천연적으로 발생
2'-아지도-2'-데옥시우리딘 (U2'N3) - N3 비천연적으로 발생
2'-플루오로-2'-데옥시우리딘 (U2'F) - F 비천연적으로 발생
폴리뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성에 영향을 주는 시티딘 변형의 비제한적인 예는 하기 표 3에 제시되어 있다.
표 3
명칭 염기 변형 당 변형 (2'번 위치) mRNA의 천연적으로 발생 여부
5-메틸시티딘 (m5C) CH3 천연적으로 발생
5-아이오도시티딘 (I5C) I 비천연적으로 발생
5-브로모시티딘 (Br5C) Br 비천연적으로 발생
2-티오시티딘 (s2C) (2번 위치에) S 비천연적으로 발생
2'-O-메틸시티딘 (C2'm) - CH3 천연적으로 발생
2'-아미노-2'-데옥시시티딘 (C2'NH2) - NH2 비천연적으로 발생
2'-아지도-2'-데옥시시티딘 (C2'N3) - N3 비천연적으로 발생
2'-플루오로-2'-데옥시시티딘 (C2'F) - F 비천연적으로 발생
폴리뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성에 영향을 주는 아데노신 변형의 비제한적인 예는 하기 표 4에 제시되어 있다.
표 4
명칭 염기 변형 당 변형 (2'번 위치) mRNA의 천연적으로 발생 여부
N6-메틸아데노신 (m6A) (6번 위치에) CH3 천연적으로 발생
N1-메틸아데노신 (m1A) (1번 위치에) CH3 비천연적으로 발생
2'-O-메틸아데노신 (A2'm) - CH3 천연적으로 발생
2'-아미노-2'-데옥시아데노신 (A2'NH2) - NH2 비천연적으로 발생
2'-아지도-2'-데옥시아데노신 (A2'N3) - N3 비천연적으로 발생
2'-플루오로-2'-데옥시아데노신 (A2'F) - F 비천연적으로 발생
폴리뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성에 영향을 주는 구아노신 변형의 비제한적인 예는 하기 표 5에 제시되어 있다.
표 5
명칭 염기 변형 (5'번 위치) 당 변형 (2'번 위치) mRNA의 천연적으로 발생 여부
N1-메틸구아노신 (m1G) (1번 위치에) CH3 비천연적으로 발생
2'-O-메틸구아노신 (G2'm) - CH3 천연적으로 발생
2'-아미노-2'-데옥시구아노신 (G2'NH2) - NH2 비천연적으로 발생
2'-아지도-2'-데옥시구아노신 (G2'N3) - N3 비천연적으로 발생
2'-플루오로-2'-데옥시구아노신 (G2'F) - F 비천연적으로 발생
변형된 뉴클레오티드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2, 6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에서, 적어도 약 5%의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 비천연적으로 발생된 (예컨대, 변형된 또는 조작된) 우라실, 아데닌, 구아닌, 또는 시토신, 예컨대, 본원에 기술된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 비천연적으로 발생된 우라실, 아데닌, 구아닌, 또는 시토신을 포함한다. 일부 경우에서, 최대 약 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%의 조작된 폴리리보뉴클레오티드가 비천연적으로 발생된 우라실, 아데닌, 구아닌, 또는 시토신을 포함한다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 프로모터 서열 및 임의의 연관된 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열 및/또는 연관된 조절 서열은 임의 개수의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 프로모터 서열 및/또는 임의의 연관된 조절 서열은 예를 들어, 적어도 150개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 적어도 10,000개의 염기 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 프로모터 서열 및/또는 연관된 조절 서열은 임의 개수의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 최대 10,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 또는 100개의 염기 또는 염기쌍을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 프로모터 서열 또는 연관된 조절 영역 중의 전체 뉴클레오티드보다 적은 뉴클레오티드가 변형된 것이다. 예를 들어, 일부 경우에서, 프로모터 또는 연관된 조절 영역 중 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하의 뉴클레오티드. 일부 경우에서, 프로모터 또는 연관된 조절 영역 중의 모든 뉴클레오티드가 변형된 것이다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 조작된 5' 캡을 포함할 수 있거나, 또는 5' 캡이 세포내에서 폴리리보뉴클레오티드에 부가될 수 있다. mRNA의 5' 캡 구조는 mRNA 캡 결합 단백질 (CBP)에의 결합에 관여할 수 있으며, 이는 CBP와 폴리(A) 결합 단백질의 회합을 통해 성숙한 사이클릭 mRNA 종을 형성하는 데 있어서 세포에서의 mRNA의 안정성 및 번역 수행 능력을 담당한다. 5' 캡 구조는 또한 핵 외수송, mRNA 안정성 증가, 및 mRNA 스플라이싱 동안의 5' 근위부 인트론 제거를 지원하는 데에도 관여할 수 있다.
조작된 폴리리보뉴클레오티드는 5-단부 캡핑될 수 있고, 이로써, 말단 구아노신 캡 잔기와 mRNA 분자의 5-말단 전사된 센스 뉴클레오티드 사이에 5-ppp-5'-트리포스페이트 연결이 생성될 수 있다. 캡-구조는 5'-5' 트리포스페이트 브릿지를 통해 첫 번째 뉴클레오티드에 연결된 변형된 또는 비변형된 7-메틸구아노신을 포함할 수 있다. 이어서, 상기 5-구아닐레이트 캡은 메틸화될 수 있고, 이로써, N7-메틸-구아닐레이트 잔기가 생성될 수 있다. mRNA의 5' 단부의 말단 및/또는 전말단 전사된 뉴클레오티드의 리보스 당은 또한 임의적으로 2'-O-메틸화될 수 있다. 구아닐레이트 캡 구조의 가수분해 및 절단을 통한 5'-디캡핑은 분해를 위해 핵산 분자, 예컨대, mRNA 분자를 표적화할 수 있다.
일부 경우에서, 캡은 mRNA의 5' 단부의 맨 처음의 두 리보스 당의 2' 히드록시 기의 메틸화를 비롯한, 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵성 캡-1은 첫 번째 리보스 당 상에 메틸화된 2'-히드록시 기를 가지는 반면, 캡-2는 맨 처음의 두 리보스 당 상에 메틸화된 2'-히드록시 기를 가진다. 상기의 이중 변형은 5' 엑소뉴클레아제에 대하여 상당한 저항성을 제공할 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있는 5' 캡 구조의 비제한적인 예로는 m7G(5')ppp(5')N (Cap-0), m7G(5')ppp(5')N1mpNp (Cap-1), 및 7mG(5')-ppp(5')N1mpN2mp (Cap-2)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 변형된 mRNA에의 변형을 통해 디캡핑을 막고, 이로써, mRNA 반감기를 증가시키는 비가수분해성 캡 구조를 생성할 수 있다. 캡 구조 가수분해는 5'-ppp-5'포스포로디에스테르 결합의 절단을 필요로 하기 때문에, 캡핑 반응 동안 변형된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 5'-ppp-5' 캡에서 포스포로티오에이트 연결부를 생성하기 위해 제조사의 설명서에 따라 a-티오-구아노신 뉴클레오티드와 함께 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터의 백시니아 캡핑 효소가 사용될 수 있다. 추가의 변형된 구아노신 뉴클레오티드, 예컨대, a-메틸-포스포네이트 및 셀레노-포스페이트 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 추가의 변형으로는 당 고리의 2'-히드록실 기 상의 mRNA의 5'-말단 및/또는 5'-전말단 뉴클레오티드의 리보스 당의 2'-O-메틸화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리리보뉴클레오티드의 5'-캡을 생성하는 데 다중의 상이한 5'-캡 구조가 사용될 수 있다.
변형된 mRNA는 전사 후에 캡핑될 수 있다. 본 개시내용에 따라, 5' 말단 캡은 내인성 캡 또는 캡 유사체를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따라, 5' 말단 캡은 구아닌 유사체를 포함할 수 있다. 유용한 구아닌 유사체로는 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
추가로, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 내부 리보솜 유입 부위(들) (IRES)를 함유할 수 있다. IRES 서열은 5' 캡 구조의 부재하에서 단백질 합성을 개시할 수 있다. IRES 서열는 또한 유일의 리보솜 결합 부위일 수 있거나, 또는 mRNA의 다중의 리보솜 결합 부위 중 하나로서 작용할 수 있다. 1개 초과의 기능성 리보솜 결합 부위를 함유하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜에 의해 번역되는 수개의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다 ("폴리시스트론성 또는 멀티시스트론성 폴리뉴클레오티드"). 본원에 기술된 조작된 폴리뉴클레오티드는 적어도 1개의 IRES 서열, 2개의 IRES 서열, 3개의 IRES 서열, 4개의 IRES 서열, 5개의 IRES 서열, 6개의IRES 서열, 7개의 IRES 서열, 8개의 IRES 서열, 9개의 IRES 서열, 10개의 IRES 서열을 포함할 수 있거나, 또는 또 다른 적합한 개수의 것이 조작된 폴리리보뉴클레오티드에 존재한다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 IRES의 예로는 제한 없이, 피코르나바이러스 (예컨대, FMDV), 해충 바이러스 (CFFV), 폴리오 바이러스 (PV), 뇌심근염 바이러스 (ECMV), 구제역 질환 바이러스 (FMDV), C형 간염 바이러스 (HCV), 고전적 돼지 열 바이러스 (CSFV), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 시미안 면역 결핍증 바이러스 (SIV) 또는 귀뚜라미 마비 바이러스 (CrPV)로부터의 것을 포함한다. IRES 서열은 예를 들어, 예컨대, 클론테크(Clontech)™, 진코포에이아(GeneCopoeia)™, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)™로부터 이용가능한 IRES 서열과 같이 상업적으로 이용가능한 벡터로부터 유래될 수 있다. IRES 서열은 예를 들어, 적어도 150개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 10,000개의 염기 또는 염기쌍일 수 있다. IRES 서열은 최대 10,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 100개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 또는 10개의 염기 또는 염기쌍일 수 있다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 비번역 영역을 포함할 수 있다. 비번역부는 임의 개수의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유전자의 비번역 영역 (UTR)은 전사는 되지만, 폴리펩티드로 번역되지는 않는다. 일부 경우에서, 비번역 서열은 핵산 분자의 안정성 및 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 분자의 안정성을 증가시키기 위해 UTR의 조절 특징이 본 개시내용의 변형된 mRNA 분자 내로 도입될 수 있다. 원하지 않는 기관 부위로 잘못 지시되는 경우, 전사체의 하향 조절이 확실하게 제어될 수 있도록 하기 위해 특정 특징 또한 도입될 수 있다. 일부 5' UTR은 번역 개시에서 중요한 역할을 한다. 5' UTR은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시시키는 프로세스에 관여하는 코작(Kozak) 서열을 포함할 수 있다. 코작 서열은 콘센서스 CCR(A/G)CCAUGG를 가질 수 있고, 여기서, R은 출발 코돈 (AUG)의 상류 쪽으로 3개의 염기만큼의 거리에 위치하는 퓨린 (아데닌 또는 구아닌)이다. 5' UTR은 번역 신장 인자의 결합에 관여하는 2차 구조를 형성할 수 있다. 일부 경우에서, 특정 표적 기관의 풍부하게 발현된 유전자에서 전형적으로 발견되는 특징을 조작함으로써 본 개시내용의 조작된 폴리뉴클레오티드 분자의 안정성 및 단백질 제조를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 간에서 조작된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 데 간 발현된 mRNA, 예컨대, 알부민, 혈청 아밀로이드 A, 아포지질단백질 A/B/E, 트랜스페린, 알파 태아단백질, 에리트로포이에틴, 또는 인자 VIII의 5 'UTR의 도입이 사용될 수 있다. 유사하게, 원하는 세포 또는 조직에서의 조작된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키기 위해 내피 세포의 경우 (Tie-1, CD36), 골수양 세포의 경우 (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD1 1b, MSR, Fr-1, i-NOS), 백혈구의 경우 (CD45, CD18), 지방 조직의 경우 (CD36, GLUT4, ACRP30, 아디포넥틴) 및 폐 상피 세포의 경우 (SP-A/B/C/D), 근육 단백질 (MyoD, 미오신, 미오글로빈, 미오게닌, 헤르쿨린)로부터의 5' UTR의 사용이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 UTR은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA), α-글로빈 유전자, 또는 ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리의 유전자, 예컨대, ABCA3 유전자의 서열로부터 유래된 것일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 본원 상기 및 하기에 기술된 바와 같은 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리의 유전자를 코딩하는 것인 조성물이다.
하기에 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 비번역 영역(들) (UTR)의 바람직한 실시양태가 기술된다:
상기 표 1에서, 인간 CYBA 유전자 5' 및 3' UTR을 나타내는 DNA 서열은 각각 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2로 제시되어 있다.
본 발명은 주로 RNA 분자 (즉, 본 발명과 관련하여 변형된 폴리리보뉴클레오티드 분자)에 관한 것이라는 사실에 비추어, 하기에서는 상기 UTR의 상응하는 RNA 서열을 참조한다.
상기 DNA 서열로부터 유래된, 서열 번호: 1은 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응하는 것이다:
5'-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3' (서열 번호: 14).
상기 5'UTR 서열은 인간 CYBA 유전자의 출발 코돈 바로 앞에 위치한다.
상기 DNA 서열로부터 유래된, 서열 번호: 2는 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응하는 것이다:
5'-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC
ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3' (서열 번호: 15)).
서열 번호: 5는 RNA 수준에서 서열 번호: 16에 기재된 서열에 상응하는 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 바, "비번역 영역" 또는 "UTR"이라는 용어는 출발 코돈 상류 쪽 및 번역되지 않는 정지 코돈 하류 쪽 mRNA의 부분에 관한 것이며, 따라서, 이는 각각 5 프라임 비번역 영역 (5' UTR) 및 3 프라임 비번역 영역 (3' UTR)으로 명명된다. 상기 영역은 코딩 영역과 함께 전사되고, 따라서, 성숙한 mRNA에 존재하는 바, 이에 엑손이다.
본 발명에서 사용되는 바, 3' 비번역 영역 (3'-UTR)은 번역 종결 코돈 바로 다음에 위치하는 메신저 RNA (mRNA) 부분이다. mRNA 분자는 DNA 서열로부터 전사되고, 후에 단백질로 번역된다. 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 테일을 비롯한, mRNA 분자의 여러 영역은 단백질로 번역되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 바, 5' 비번역 영역 (5' UTR) (이는 또한 리더 서열 또는 리더 RNA로도 알려져 있다)은 출발 코돈으로부터 바로 앞 상류 쪽에 위치하는 mRNA의 영역이다. 5' UTR은 전사 출발 부위에서 시작하고, 코딩 영역의 출발 코돈 (일반적으로 AUG) 앞 1개의 뉴클레오티드 (nt)만큼의 위치에서 끝난다. 원핵생물에서, 5' UTR의 길이는 3-10개의 뉴클레오티드 길이가 되는 경향이 있는 반면, 진핵생물에서는 그보다 긴, 일반적으로는 100개 내지 수천 개의 뉴클레오티드 길이가 되는 경향이 있지만, 종종 그보다 더 짧은 UTR 또한 진핵생물에 존재한다.
본 발명에서 사용되는 바, 3' UTR은 3'-비번역 영역 내에, mRNA의 안정성 및 폴리아데닐화에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 조절 영역을 포함할 수 있다. 다수의 3'-UTR은 AU가 풍부한 요소 (ARE) 또한 함유한다. 추가로, 3'-UTR은 폴리(A) 테일로 불리는 수백 개의 아데닌 잔기의 mRNA 전사체의 단부에의 부가를 지시하는 서열 AAUAAA를 함유한다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA 분자는 폴리-A 테일 또한 함유할 수 있다. 폴리-A 테일은 폴리아데닐화로 불리는 프로세스에 의해 프리-mRNA의 3' 단부에 부가되는 (대개는 수백 개의) 아데닌 뉴클레오티드로 이루어진 장쇄 서열이다. 상기 테일은 핵으로부터의 외수송 및 번역을 촉진시키고, mRNA를 분해되지 못하게 보호한다. 폴리아데닐화는 폴리(A) 테일의 메신저 RNA에의 부가이다. 폴리(A) 테일은 다중의 아데노신 모노포스페이트로 이루어지고; 다시 말해, 이는 오직 아데닌 염기만을 가지는 RNA 스트레치이다. 진핵생물에서, 폴리아데닐화는 번역을 위해 성숙한 메신저 RNA (mRNA)를 생산하는 프로세스의 일부분이다. 본원에서 사용되는 바, 폴리-A 테일은 RNA의 3' 단부에 위치하는 아데닌 뉴클레오티드로 이루어진 서열에 관한 것이다. 폴리-A 테일은 일반적으로는 폴리아데닐화로 불리는 프로세스에 의해 RNA의 3' 단부에 부가된다. 따라서, 본 발명은 RNA 분자가 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함하는 것인, 상기 기술된 RNA 중 임의의 것에 관한 것이다.
폴리-A 테일의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 폴리-A 테일의 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개의 뉴클레오티드 길이인 것인, 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 폴리-A 테일의 길이가 적어도 120개의 뉴클레오티드 길이인 것인, 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 폴리-A 테일의 길이가 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000개의 뉴클레오티드 길이인 것인, 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드/RNA 분자를 포함하는 조성물은, 하나 이상의 UTR(들)이 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 것인 조성물이다.
상기와 관련하여 "하나 이상의"이라는 것은 RNA 분자가 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 본 발명의 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 한 UTR을 보유할 수 있다는 것을 의미한다. RNA 분자는 또한 본 발명의 상기 UTR을 2, 3, 또는 4개 보유할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 또한 본 발명의 상기 UTR을 5개 또는 심지어 그 초과로 보유할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드/RNA 분자를 포함하는 조성물은, 하나 이상의 UTR(들)이 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 것인 조성물이다.
상기와 관련하여 "하나 이상의"이라는 것은 RNA 분자가 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 본 발명의 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 한 UTR을 보유할 수 있다는 것을 의미한다. RNA 분자는 또한 본 발명의 상기 UTR을 2, 3, 또는 4개 보유할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 또한 본 발명의 상기 UTR을 5개 또는 심지어 그 초과로 보유할 수 있다.
그러나, 본 발명에서 사용되는 바, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 유전자로부터 유래된 UTR은 상기의 서열 번호: 14의 특정 서열로 특별히 제한되는 것은 아니지만, 이는 또한 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 UTR 서열일 수 있다. 대안적으로, UTR 서열은 또한 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 3개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 2개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. 가장 바람직하게, UTR 서열은 또한 서열 번호: 14와 비교하여 1개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다.
바람직하게, 서열 번호: 14와 비교하여 상기 뉴클레오티드 치환의 위치는 서열 번호: 14의 서열 중 32번 위치에서 수행된다. 바람직하게, 상기 위치의 뉴클레오티드 "U"는 "C"에 의해 치환된다. 이러한 치환을 통해서 서열 번호: 1에 (부분적으로) 존재하는 CYBA의 코작 요소가 척추동물의 코작 콘센서스 서열에 더욱 가까워지기 때문에 상기 치환이 바람직하다. 척추동물의 코작 콘센서스 서열은 GCCRCCAUGG의 서열 (출발 코돈은 밑줄로 표시되어 있고, 여기서, "R"은 임의의 퓨린을 나타낸다)을 가지는 반면, CYBA의 코작 요소는 GuCGCCAUGG의 서열 (출발 코돈은 밑줄로 표시되어 있고, 여기서, 척추동물 콘센서스 서열로부터의 편차는 소문자 "u"로 표시되어 있다)을 가진다.
서열 번호: 14와 비교하여 상기 치환 중 하나 이상의 것을 가지는 UTR 서열(들)을 통해 번역 효율면에서 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 유사한 능력을 보이는, 바람직하게는, 번역 효율면에서 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자보다 더 높은 능력을 보이는 RNA 분자가 생성될 수 있다. 번역 효율과 관련하여 번역 효율면에서 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 비교되는 주어진 변형된 UTR 서열의 특성/능력은 당업계에 공지된 방법에 의해 및 첨부된 실시예에 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 당업자에 의해 측정될 수 있다.
번역 효율은 세포 내에서의 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA 번역률이다. 주어진 mRNA의 번역 효율은 시간 단위당 1개의 mRNA에 대해 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수로서 측정된다. 번역은 세포 리보솜이 단백질을 생성하는 프로세스로서, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 간략하면, 번역시, DNA로부터 전사에 의해 생성된 메신저 RNA (mRNA)는 리보솜에 의해 디코딩되어 특정 아미노산 쇄 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성한다.
따라서, 변형된 UTR 서열을 보유하는 본 발명의 주어진 RNA 분자의 번역 효율은 동일하되, 단, 서열 번호: 14의 UTR을 보유하는 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하였을 때, 바람직하게 더 높다. 따라서, 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수는 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 서열 번호: 14의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수보다 높다.
변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 동일하되, 단, 서열 번호: 14의 UTR을 보유하는 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나, 또는 동일한 경우, 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수는 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 서열 번호: 14의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수와 유사하거나, 또는 동일하다. "번역 효율"은 예컨대, 첨부된 실시예에 기술되어 있는 방법에 의해 및 하기에서 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 측정될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 번역 효율은 특정 시점에 세포에서 각 단백질을 코딩하는 mRNA의 양과 관련하여 동 시점에 상기 세포 내에서 mRNA가 단백질로 번역되는 비율이다. 따라서, 번역 효율은 특정 시점에 세포 내에서 번역되는 mRNA와 각 단백질을 코딩하는 mRNA의 양의 비율이다. 두 파라미터, 즉, 단백질로 번역되는 mRNA 뿐만 아니라, 각 단백질을 코딩하는 mRNA의 양은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 첨부된 실시예예서 비제한적인 예로서 수행되는 바와 같이, 세포 내에서 단백질로 번역되는 mRNA의 양은 예컨대, 유세포 분석법 (FC)에 의해 측정될 수 있는 반면, 각 단백질을 코딩하는 mRNA의 양은 예컨대, qPCR에 의해 측정될 수 있다.
서열 번호: 14에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 본 발명에서 사용되는 것과 같이 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 UTR(들)은 특별히 상기의 특정 서열로 제한되지 않고, 상기 기술된 치환은 또한 서열 번호: 14와 비교하여 (한) 뉴클레오티드(들) 부가(들)를 보이는 서열을 포함하는 (한) UTR 서열(들)에 관한 것일 수 있다. (한) 뉴클레오티드(들)의 부가는 측면에 위치하는 것일 수 있다. 따라서, 추가의 뉴클레오티드(들)는 본 발명의 UTR(들)의 3'-단부 또는 5'-단부에 부가될 수 있다. 추가의 뉴클레오티드(들)는 최대 0 (변이 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게, 최대 20개의 뉴클레오티드 또는 더욱더 바람직하게, 최대 30개의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함한다. 뉴클레오티드의 부가가 본 발명의 UTR(들)의 상기 기능성 특성을 변화시킬 가능성은 없다는 이론적 설명에 비추어, 이들 서열이 서열 번호: 14와 (상기 기술된 번역 효율면에서) 유사한 능력을 가지는 한, 바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 서열 번호: 14보다 더 높은 번역 효율을 가지는 한, 뉴클레오티드의 부가는 또한 최대 40, 50, 60, 70, 80, 90개, 또는 심지어 100개 뉴클레오티드 또는 더욱 크게는, 최대 200, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이를 가질 수 있다.
(한) 뉴클레오티드(들)의 상기와 같은 측면 부가에 대하여 대안적으로, 또는 그 이외에도, (한) 뉴클레오티드(들)의 부가는 사이에 배치될 수 있다. 따라서, 추가의 뉴클레오티드(들)는 본 발명의 UTR(들)의 뉴클레오티드 서열 내에 부가/삽입될 수 있다. 이들 서열이 서열 번호: 14와 (상기 기술된 번역 효율면에서) 유사한 능력을 가지는 한, 바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 서열 번호: 14보다 더 높은 번역 효율을 가지는 한, 이들 뉴클레오티드(들) 삽입은 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 UTR은 서열 번호: 14의 상기 특정 서열 및 그의 변형으로 특별히 제한되지 않는다. 오히려, 서열 번호: 14의 특정 서열 및 그의 변형은 단순히 CYBA 5' 코어 영역을 정의할 뿐이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14에 제시된 UTR은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 연장된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14에 제시된 UTR은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 1 내지 20개의 뉴클레오티드만큼 연장된다. 그러므로, 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14의 서열은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 20개의 뉴클레오티드만큼 연장된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14의 서열은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 18, 15, 13, 10, 7 또는 5개의 뉴클레오티드만큼 연장된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14의 서열은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 4, 5 또는 2개의 뉴클레오티드만큼 연장된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 서열 번호: 14의 서열은 5' 단부상에서 (즉, 상류) 1개의 뉴클레오티드만큼 연장된다.
5' 단부상에서 (즉, 상류) 연장된 이들 UTR 서열은 또한 서열 번호: 14에 대하여 본원 상기에서 정의된 바와 같이 변형될 수 있다. 따라서, 이를 준용하여 서열 번호: 14의 UTR과 관련하여 기술된 바와 같이 상기 정의된 바와 같이 5' 단부상에서 연장된 UTR에도 동일 내용이 적용된다.
추가로, 본 발명에서 사용되는 UTR은 서열 번호: 15의 상기 특정 서열 및 그의 변형으로 특별히 제한되지 않고, 이는 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 UTR 서열일 수 있다. 대안적으로, UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 6개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 5개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 3개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 2개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. UTR 서열은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 3개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다. 가장 바람직하게, UTR 서열은 서열 번호: 15와 비교하여 1개의 치환을 보이는 서열을 포함하는 서열일 수 있다.
이를 통해 서열 번호: 15와 비교하여 상기 치환 중 하나 이상의 것을 가지는 UTR 서열(들)은 번역 효율면에서 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 유사한 능력을 보이는, 바람직하게는, 번역 효율면에서 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자보다 더 높은 능력을 보이는 RNA 분자가 생성될 수 있다. 번역 효율과 관련하여 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 같은 번역 효율면에서의 비교에 의한 주어진 변형된 UTR 서열의 특성/능력은 당업계에 공지된 방법에 의해 및 첨부된 실시예에서 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 당업자에게 측정될 수 있다.
번역 효율은 세포 내에서의 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA 번역률이다. 주어진 mRNA의 번역 효율은 시간 단위당 1개의 mRNA에 대해 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수로서 측정된다. 번역은 세포 리보솜이 단백질을 생성하는 프로세스로서, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 간략하면, 번역시, DNA로부터 전사에 의해 생성된 메신저 RNA (mRNA)는 리보솜에 의해 디코딩되어 특정 아미노산 쇄 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성한다.
따라서, 변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율은 동일하되, 단, 서열 번호: 15의 UTR을 보유하는 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하였을 때, 바람직하게 더 높다. 따라서, 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수는 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 서열 번호: 15의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수보다 높다.
변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 동일하되, 단, 서열 번호: 15의 UTR을 보유하는 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나, 또는 동일한 경우, 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수는 시간 단위당 1개의 RNA에 대해 번역되는, 서열 번호: 15의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개수와 유사하거나, 또는 동일하다.
"번역 효율"은 예컨대, 첨부된 실시예에 기술되어 있는 방법에 의해 및 상기에서 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 측정될 수 있다.
서열 번호: 15에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 본 발명에서 사용되는 것과 같이 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 UTR(들)은 특별히 상기의 특정 서열로 제한되지 않고, 상기 기술된 치환은 또한 서열 번호: 15와 비교하여 (한) 뉴클레오티드(들) 부가(들)를 보이는 서열을 포함하는 (한) UTR 서열(들)에 관한 것일 수 있다. 뉴클레오티드(들)의 부가는 측면에 위치하거나, 또는 사이에 배치될 수 있다. 따라서, 추가의 뉴클레오티드(들)의 부가는 본 발명의 UTR(들)의 3'-단부 또는 5'-단부에 부가될 수 있다. 상기와 같은 측면에 위치하는 추가의 뉴클레오티드(들)에 대하여 대안적으로, 또는 그 이외에도, 추가의 뉴클레오티드(들)는 본 발명의 UTR(들)의 뉴클레오티드 서열 내에 존재할 수 있다. 추가의 뉴클레오티드(들)는 최대 0 (변이 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게, 최대 20개의 뉴클레오티드 또는 더욱더 바람직하게, 최대 30개의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함한다. 뉴클레오티드의 부가가 본 발명의 UTR(들)의 상기 기능성 특성을 변화시킬 가능성은 없다는 이론적 설명에 비추어, 이들 서열이 서열 번호: 15와 (상기 기술된 번역 효율면에서) 유사한 능력을 가지는 한, 바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 서열 번호: 15보다 더 높은 번역 효율을 가지는 한, 뉴클레오티드의 부가는 또한 최대 40, 50, 60, 70, 80, 90개, 또는 심지어 100개 뉴클레오티드 또는 더욱 크게는, 최대 200, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 UTR(들) 뿐만 아니라, 상기 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 재조합적으로 (예컨대, 생체내 또는 시험관내 시스템에서) 또는 합성적으로 생성/합성될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 UTR 및 상기 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 생체내에서 시스템에서 재조합적으로 제조될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 UTR 및 상기 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 시험관내 시스템에서, 예를 들어, 시험관내 전사 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 시험관내 전사 시스템은 보편적으로 공지되어 있고, 일반적으로는, DNA 서열이 적절한 프로코터의 제어하에 있는 것인, 하기에서 추가로 상세하게 개략적으로 설명되는 바와 같이 모듈 (b) 및/또는 모듈 (c)을 "코딩하는" DNA 서열을 함유하는 정제된 DNA 주형을 필요로 한다. 추가로, 시험관내 전사 시스템은 또한 보편적으로 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충제 시스템, 및 상기 UTR(들)을 "코딩하는" DNA 서열의 본 발명의 UTR(들)로의 시험관내 전사를 위한 효소 활성을 제공하는 적절한 RNA 폴리머라제를 요구한다.
추가로, 본 발명의 UTR 및 상기 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 예컨대, 고체상 지지체 및 표준 기술을 사용하여 자동화 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상의 화학적 합성에 의해, 또는 각각의 DNA 서열의 화학적 합성 및 이어서, 동일의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
분자 생물학 및 유전학에서, 상류 및 하류, 이 둘 모두는 RNA 분자에서의 상대적인 위치를 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 상류는 RNA 분자의 5' 단부로의 방향이고, 하류는 상기 분자는 3' 단부로의 방향이다.
따라서, 한 실시양태에서, (하기에서 "모듈 (b)로 지칭되는) 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 본원 상기에서 정의된 바와 같은 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 UTR은 (하기에서 "모듈 (a)"로 지칭되는) 본원 상기 및 하기에서 기술되는 바와 같은 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 상류에 위치한다. 추가로, 한 실시양태에서, (하기에서 "모듈 (c)로 지칭되는) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 본원 상기에서 정의된 바와 같은 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 UTR은 (하기에서 "모듈 (a)"로 지칭되는) 본원 상기 및 하기에서 기술되는 바와 같은 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 하류에 위치한다. 그러나, 바람직하게, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 유전자 ("모듈 (a)")는 UTR 모듈 (b)와 UTR 모듈 (c) 사이에 위치하며, 따라서, RNA 분자는 바람직하게 5'-(b)-(a)-(c)-3'의 배열을 가진다.
RNA 분자가 오직 단 하나의 UTR 모듈 (즉, 모듈 (b) (즉, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 본원 상기에서 정의된 바와 같은 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)) 또는 모듈 (c) (즉, 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 본원 상기에서 정의된 바와 같은 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)))을 보유하는 경우, RNA 분자는 바람직하게 5'-(b)-(a)-3' 또는 5'-(a)-(c)-3'의 배열을 가진다.
하기에서, (CYBA mRNA의 상기 정의된 5' UTR 단편에 상응하는) UTR 모듈 (b)가 코딩 영역의 상류에 (즉, 코딩 영역의 5' 단부에) 위치하고/거나, (CYBA mRNA의 상기 정의된 3' UTR에 상응하는) UTR 모듈 (c)가 코딩 영역의 하류에 (즉, 코딩 영역의 3' 단부에) 위치하는 것인, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 변형된 폴리리보뉴클레오티드 ("모듈 (a)")와 관련하여 본 발명의 UTR 모듈 (b) 및/또는 (c)의 바람직한 배열을 기술한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 및 상기 내용에 따라, 본 발명은 (a) 변형된 폴리리보뉴클레오티드, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서, (b)에서 정의된 상기 UTR(들)은 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 단부에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 및 상기 내용에 따라, 본 발명은 (a) ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역; 및 (c) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서, (c)에서 정의된 상기 UTR(들)은 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 단부에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 및 상기 내용에 따라, 본 발명은 (a) ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및 (c) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서, (b)에서 정의된 상기 UTR(들)은 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 단부에 위치하고, 여기서, (c)에서 정의된 상기 UTR(들)은 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 단부에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 및 상기 내용에 따라, 본 발명은 (a) ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 14와 비교하여 1 내지 4개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 14를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 하나의 UTR; 및 (c) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 2개의 UTR들을 포함하는 RNA 분자로서; 여기서, 상기 RNA 분자는 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 단부에 (b)에서 정의된 상기 하나의 UTR를 포함하고, (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 단부에 (c)에서 정의된 상기 2개의 UTR들을 포함하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 및 상기 내용에 따라, 본 발명은 (a) ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역; 및 (c) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 서열, 또는 서열 번호: 15와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 보이고, 이를 통해 서열 번호: 15를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 번역 효율을 가지는 RNA 분자가 생성되는 것인 서열을 포함하는 2개의 UTR들을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서, 상기 RNA 분자는 (a)에서 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 단부에 (c)에서 정의된 상기 2개의 UTR들을 포함하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 구축물은 상기 3개의 주요 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)만을 포함할 수 있는 것은 아니다. 오히려, 개별 모듈 사이에 예컨대, 구축물의 구축을 촉진시키는 (a) 링커 모이어티/모이어티들 및/또는 다중 클로닝 부위(들)가 배치되어 있는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 링커 모이어티들 및 다중 클로닝 부위는 당업자에게 공지되어 있다.
모듈 (a) (즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 및/또는 (c)의 위치는 특별히 제한되지 않고, 따라서, 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이에는 주요 모듈 (a), (b) 및/또는 (c)의 일부가 아닌 하나 이상의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 충전된 간격 또는 갭이 존재할 수 있다.
이와 관련하여 "하나 이상의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C"란, 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이의 간격 또는 갭이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 충전되어 있다는 것을 의미한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자의 개별 모듈 사이의 간격 또는 갭은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 G, A, U 및/또는 C로 충전되어 있다.
그러나, 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내의 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는 그 사이에 어떤 간격 또는 갭 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 출발 코돈에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 출발 코돈의 상류 쪽에 바로 배치되어 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내의 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는 그 사이에 어떤 간격 또는 갭 없이 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 바로 인접하게, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 하류 쪽에 바로 배치되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내의 UTR 모듈 (b)는 그 사이에 어떤 간격 또는 갭 없이 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 출발 코돈에 바로 인접하게, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 출발 코돈의 상류 쪽에 바로 배치되어 있고, 모듈 (a) (즉, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내의 UTR 모듈 (c)는 그 사이에 어떤 간격 또는 갭 없이 ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 바로 인접하게, 즉, ABC-결합 카세트 (ABC) 패밀리 구성원을 코딩하는 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 하류 쪽에 바로 배치되어 있다.
더욱더 바람직한 실시양태에서, 본원 상기에서 정의된 바와 같은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은, 변형된 폴리뉴클레오티드가 ABC-결합 카세트 (ABC) 3 단백질 (ABCA3)을 코딩하는, 바람직하게, 인간 ABCA3 단백질을 코딩하는 것인 조성물로서, 여기서, 상기 변형된 폴리뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 대상체의 세포 내에서의 번역을 위해 최적화된 코돈 서열을 포함하는 것인 조성물이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본원 상기에서 정의된 바와 같은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)의 서열로부터 유래된 하나 이상의 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 본 발명의 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 코돈 최적화된 ABCA3 DNA 서열 (서열 번호: 12), 또는 5' CYBA UTR 및 3' CYBA UTR을 포함하는 코돈 최적화된 ABCA3 mRNA 서열 (서열 번호: 13)이다.
다른 비-UTR 서열이 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드의 5' (또는 3' UTR) UTRs 내로 도입될 수 있다. 5' 및/또는 3' UTRs은 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 및/또는 번역 효율을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인트론 또는 인트론 서열의 일부가 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 측면에 위치하는 영역 내로 도입될 수 있다. 인트론 서열의 도입은 또한 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율을 증가시킬 수 있다.
3' UTR은 그 안에 포매된 아데노신 및 우리딘으로 이루어진 스트레치를 가질 수 있다. 이러한 AU가 풍부한 시그니처는 특히 전환율이 높은 유전자에 우세하게 존재한다. 그의 서열 및 기능성 특성에 기초하여 AU가 풍부한 요소 (ARE)는 하기 부류로 분류될 수 있다: 부류 I ARE는 U가 풍부한 영역 내에 수개의 분산된 AUUUA 모티프 카피를 함유한다. C-Myc 및 MyoD가 부류 I ARE를 함유한다. 부류 II ARE는 2개 이상의 중복 UUAUUUA(U/A)(U/A) 구량체를 가진다. 이러한 유형의 ARE를 함유하는 분자로는 GM-CSF 및 TNF-α를 포함한다. 부류 III ARES는 그리 잘 정의되어 있지 않다. 상기의 U가 풍부한 영역이 AUUUA 모티프를 함유하지 않는 것인 c-Jun 및 미오게닌은 연구가 잘 이루어진 상기 부류의 2가지 예이다. ARE에 결합하는 단백질은 메신저를 탈안정화시킬 수 있는 반면, ELAV 패밀리의 구성원, 예컨대, HuR은 mRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. HuR은 3가지 부류 모두의 ARE에 결합할 수 있다. HuR 특이적 결합 부위를 핵산 분자의 3' UTR로 조작하면, HuR 결합이 이루어질 수 있고, 이로써, 생체내에서 메세지는 안정화될 수 있다.
3' UTR AU가 풍부한 요소 (ARE)의 조작을 사용하여 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 안정성을 조정할 수 있다. 하나 이상의 ARE 카피를 폴리리보뉴클레오티드로 조작하여 폴리리보뉴클레오티드의 안정성을 조정할 수 있다. ARE를 확인, 제거 또는 돌연변이화시켜 생성된 단백질의 세포내 안정성을 증가시키고, 이로써, 그의 번역 및 생산을 증가시킬 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 사용하여 관련된 세포주에서 형질감염 실험을 수행할 수 있고, 형질감염 후 다양한 시점에 단백질 생산을 검정할 수 있다. 예를 들어, 세포를 관련 단백질에 대한 ELISA 키트를 사용하여 및 상이한 ARE 조작 분자로 형질감염시킬 수 있고, 형질감염 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 및 7일 후 생산된 단백질을 검정할 수 있다.
비번역 영역은 임의 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비번역 영역의 길이는 약 1 내지 약 10개의 염기 또는 염기쌍, 약 10 내지 약 20개의 염기 또는 염기쌍, 약 20 내지 약 50개의 염기 또는 염기쌍, 약 50 내지 약 100개의 염기 또는 염기쌍, 약 100 내지 약 500개의 염기 또는 염기쌍, 약 500 내지 약 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 1,000 내지 약 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 2,000 내지 약 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 3,000 내지 약 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 4,000 내지 약 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 5,000 내지 약 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 6,000 내지 약 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 7,000 내지 약 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 8,000 내지 약 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 약 9,000 내지 약 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 비번역 영역의 길이는 예를 들어, 적어도 1개의 염기 또는 염기쌍, 2개의 염기 또는 염기쌍, 3개의 염기 또는 염기쌍, 4개의 염기 또는 염기쌍, 5개의 염기 또는 염기쌍, 6개의 염기 또는 염기쌍, 7개의 염기 또는 염기쌍, 8개의 염기 또는 염기쌍, 9개의 염기 또는 염기쌍, 10개의 염기 또는 염기쌍, 20개의 염기 또는 염기쌍, 30개의 염기 또는 염기쌍, 40개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 60개의 염기 또는 염기쌍, 70개의 염기 또는 염기쌍, 80개의 염기 또는 염기쌍, 90개의 염기 또는 염기쌍, 100개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 인트론은 임의 개수의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 인트론은 예를 들어, 적어도 1개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 100개의 염기 또는 염기쌍, 150개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 5,000개의 염기 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 인트론은 예를 들어, 최대 10,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 또는 100개의 염기 또는 염기쌍을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 인트론 중의 뉴클레오티드의 비율(%)은 변형된다. 예를 들어, 일부 경우에서, 인트론 중 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 경우에서, 인트론 중의 모든 뉴클레오티드가 변형된다.
본 개시내용의 조작된 폴리리보뉴클레오티드은 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 폴리A 서열 (예컨대, 폴리A 테일)은 임의 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리A 서열의 길이는 약 1 내지 약 10개의 염기 또는 염기쌍, 약 10 내지 약 20개의 염기 또는 염기쌍, 약 20 내지 약 50개의 염기 또는 염기쌍, 약 50 내지 약 100개의 염기 또는 염기쌍, 약 100 내지 약 500개의 염기 또는 염기쌍, 약 500 내지 약 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 1,000 내지 약 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 2,000 내지 약 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 3,000 내지 약 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 4,000 내지 약 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 5,000 내지 약 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 6,000 내지 약 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 7,000 내지 약 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 8,000 내지 약 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 약 9,000 내지 약 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리A 서열의 길이는 적어도 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개의 뉴클레오티드 길이이다. 폴리A 서열의 길이는 예를 들어, 적어도 1개의 염기 또는 염기쌍, 2개의 염기 또는 염기쌍, 3개의 염기 또는 염기쌍, 4개의 염기 또는 염기쌍, 5개의 염기 또는 염기쌍, 6개의 염기 또는 염기쌍, 7개의 염기 또는 염기쌍, 8개의 염기 또는 염기쌍, 9개의 염기 또는 염기쌍, 10개의 염기 또는 염기쌍, 20개의 염기 또는 염기쌍, 30개의 염기 또는 염기쌍, 40개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 60개의 염기 또는 염기쌍, 70개의 염기 또는 염기쌍, 80개의 염기 또는 염기쌍, 90개의 염기 또는 염기쌍, 100개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 폴리A 서열의 길이는 최대 100개의 염기 또는 염기쌍, 90개의 염기 또는 염기쌍, 80개의 염기 또는 염기쌍, 70개의 염기 또는 염기쌍, 60개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 40개의 염기 또는 염기쌍, 30개의 염기 또는 염기쌍, 20개의 염기 또는 염기쌍, 10개의 염기 또는 염기쌍, 또는 5개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 폴리A 서열 중의 뉴클레오티드의 비율(%)은 변형된다. 예를 들어, 일부 경우에서, 폴리A 서열 중 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 경우에서, 폴리 중의 모든 뉴클레오티드가 변형된다.
링커 서열은 임의 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 링커는 N-3 또는 C-5 위치의 변형된 핵염기에 부착될 수 있다. 핵염기에 부착되는 링커는 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 2가 알킬, 알케닐, 알키닐 모이어티, 에스테르, 아미드, 또는 에테르 모이어티일 수 있다. 링커 서열의 길이는 약 1 내지 약 10개의 염기 또는 염기쌍, 약 10 내지 약 20개의 염기 또는 염기쌍, 약 20 내지 약 50개의 염기 또는 염기쌍, 약 50 내지 약 100개의 염기 또는 염기쌍, 약 100 내지 약 500개의 염기 또는 염기쌍, 약 500 내지 약 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 1,000 내지 약 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 2,000 내지 약 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 3,000 내지 약 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 4,000 내지 약 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 5,000 내지 약 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 6,000 내지 약 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 7,000 내지 약 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 약 8,000 내지 약 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 약 9,000 내지 약 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 링커 서열의 길이는 예를 들어, 적어도 1개의 염기 또는 염기쌍, 2개의 염기 또는 염기쌍, 3개의 염기 또는 염기쌍, 4개의 염기 또는 염기쌍, 5개의 염기 또는 염기쌍, 6개의 염기 또는 염기쌍, 7개의 염기 또는 염기쌍, 8개의 염기 또는 염기쌍, 9개의 염기 또는 염기쌍, 10개의 염기 또는 염기쌍, 20개의 염기 또는 염기쌍, 30개의 염기 또는 염기쌍, 40개의 염기 또는 염기쌍, 50개의 염기 또는 염기쌍, 60개의 염기 또는 염기쌍, 70개의 염기 또는 염기쌍, 80개의 염기 또는 염기쌍, 90개의 염기 또는 염기쌍, 100개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 6,000개의 염기 또는 염기쌍, 7,000개의 염기 또는 염기쌍, 8,000개의 염기 또는 염기쌍, 9,000개의 염기 또는 염기쌍, 또는 적어도 10,000개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 링커 서열의 길이는 예를 들어, 최대 10,000개의 염기 또는 염기쌍, 5,000개의 염기 또는 염기쌍, 4,000개의 염기 또는 염기쌍, 3,000개의 염기 또는 염기쌍, 2,000개의 염기 또는 염기쌍, 1,000개의 염기 또는 염기쌍, 900개의 염기 또는 염기쌍, 800개의 염기 또는 염기쌍, 700개의 염기 또는 염기쌍, 600개의 염기 또는 염기쌍, 500개의 염기 또는 염기쌍, 400개의 염기 또는 염기쌍, 300개의 염기 또는 염기쌍, 200개의 염기 또는 염기쌍, 또는 100개의 염기 또는 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 링커 서열 중의 뉴클레오티드의 비율(%)은 변형된다. 예를 들어, 일부 경우에서, 링커 서열 중 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 경우에서, 링커 서열 중의 모든 뉴클레오티드가 변형된다.
일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 3' 비번역 영역 (UTR) 앞에 적어도 하나의 정지 코돈을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 다중의 정지 코돈을 포함한다. 정지 코돈은 TGA, TAA 및 TAG로부터 선택될 수 있다. 정지 코돈은 변형되거나, 또는 비변형될 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 정지 코돈 TGA 및 하나의 추가 정지 코돈을 포함한다. 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 TAA 정지 코돈의 부가를 포함한다.
코딩된 폴리펩티드
코딩된 폴리펩티드는 아미드 결합 (펩티드 결합)을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기 단량체로 구성된 중합체 쇄이다. 아미노산은 l-광학 이성질체 또는 d-광학 이성질체일 수 있다. 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산으로 이루어진 쇄, 펩티드 모방체, 단백질, 재조합 단백질, (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체, 항체, 에피토프, 효소, 수용체, 비타민, 또는 구조 유사체 또는 그의 조합일 수 있다. 대상체의 체내에서 번역되는 폴리리보뉴클레오티드는 대상체의 세포, 조직 내에서, 또는 다수의 세포 및 조직 간에 걸쳐 특이적인 펩티드 또는 단백질의 충분한 공급을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 폴리리보뉴클레오티드는 특이적인 표적 세포(들) 유형 또는 표적 조직의 시토졸 내인 생체내에서 번역될 수 있다. 일부 경우에서, 폴리리보뉴클레오티드는 생체내에서 번역되어 ABCA3 단백질, 그의 기능성 단편, 또는 인간 ABCA3 단백질과 적어도 70% 상동성인 단백질을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 폴리리보뉴클레오티드는 생체내 다양한 비-표적 세포 요형 또는 표적 조직(들)에서 번역될 수 있다. 표적 또는 비-표적 세포일 수 있는 세포의 비제한적인 예로는 a) 피부 세포, 예컨대: 각질 세포, 멜라닌 세포, 요로 상피 세포; b) 신경 세포, 예컨대: 뉴런, 슈반 세포, 희소 돌기 아교 세포, 성상세포; c) 간 세포, 예컨대: 간세포; d) 장내 세포, 예컨대: 배상 세포, 장세포; e) 혈액 세포; 예컨대: 림프구양 또는 골수양 세포를 포함한다. 조직의 비제한적인 예로는 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직, 또는 상피 조직을 포함한다. 일부 경우에서, 표적 세포 또는 표적 조직은 암성 세포, 조직, 또는 기관이다.
폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 마우스 (예컨대, 무스 무스쿨루스(Mus musculus)), 래트 (예컨대, 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) 또는 라투스 라투스(Rattus rattus)), 낙타 (예컨대, 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius) 또는 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus)), 라마 (라마 비쿠냐(Lama vicugna)), 또는 임의의 다른 적합한 생물로부터 유래될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 종의 서열의 키메라 조합일 수 있다.
일부 경우에서, 내인성 번역 기구는 번역 후 변형을 코딩된 펩티드에 부가할 수 있다. 번역 후 변형은 막 국재화를 위해 폴리펩티드를 표적화할 수 있는 소수성 기의 부가, 증가된 효소 활성을 위한 보조 인자의 부가, 또는 더 작은 화학기의 부가를 포함할 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 또한 다른 펩티드 또는 단백질 모이어티들의 부가를 받기 위해 번역 후에 변형될 수 있다. 예를 들어, 유비퀴틴화는 유비퀴틴을 코딩된 폴리펩티드에 공유적으로 연결시킬 수 있고, SUMO화는 SUMO (소형 유비퀴틴 관련 개질제)를 코딩된 폴리펩티드에 공유적으로 연결시킬 수 있고, ISG화는 ISG15 (인터페론 자극 유전자 15)를 공유적으로 연결시킬 수 있다.
일부 경우에서, 코딩된 폴리펩티드는 다른 유형의 구조적 변화가 일어나도록 하기 위해 번역 후에 변형될 수 있다. 예를 들어, 코딩된 폴리펩티드는 단백질 분해 방식으로 절단될 수 있고, 하나 이상의 단백질 분해 단편은 세포내 경로의 활성을 조정할 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 세포내에서 폴딩될 수 있다. 일부 경우에서, 코딩된 폴리펩티드는 보조 인자 및 분자 샤프론의 존재하에서 폴딩된다. 폴딩된 폴리펩티드는 2차 구조 및 3차 구조를 가질 수 있다. 폴딩된 폴리펩티드는 다른 폴딩된 펩티드와 회합하여 4차 구조를 형성할 수 있다. 폴딩된 펩티드는 예컨대, 사량체 4차 구조를 가지는 항체 분자와 같은, 기능성 다중 서브유니트 복합체를 폴리오할 수 있다. 부류 또는 이소타입의 항체를 형성하는 다양한 폴리펩티드는 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다.
코딩된 폴리펩티드는 코딩된 아미노산의 화학적 성질을 변화시키기 위해 번역 후 변형될 수 있다. 예를 들어, 코딩된 폴리펩티드는, 아르기닌의 시트룰린으로의 전환인, 번역 후 시트룰린화 또는 탈이민화의 대상이 될 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 글루타민의 글루탐산으로의, 또는 아스파라긴의 아스파르트산으로의 전환인, 번역 후 탈아미드화의 대상이 될 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 포스포트레오닌 및 포스포세린의 베타-제거, 또는 트레오닌 및 세린의 탈수에 의한, 그 뿐만 아니라, 시스테인의 탈카르복실화에 의한 알켄의 전환인 엘리미닐화(eliminylation)의 대상이 될 수 있다. 코딩된 펩티드는 또한 리신의 호모시트룰린으로의 전환인 카르바밀화의 대상이 될 수 있다. 코딩된 펩티드는 또한 라세미화, 예를 들어, 프롤릴 이소머라제에 의한 프롤린의 라세미화 또는 단백질-세린 에피머라제에 의한 세린의 라세미화의 대상이 될 수 있다.
복수 개의 생체분자의 활성은 폴리리보뉴클레오티드에 의해 코딩된 분자에 의해 조정될 수 있다. 그의 활성이 코딩된 폴리뉴클레오티드에 의해 조정될 수 있는 것인 분자의 비제한적인 예로는 아미노산, 펩티드, 펩티드-모방체, 단백질, (모노클로날 또는 폴리클로날) 재조합 단백질 항체, 항체 단편, 항원, 에피토프, 탄수화물, 지질, 지방산, 효소, 천연 생성물, 핵산 (DNA, RNA, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 구조 유사체 또는 그의 조합 포함), 영양소, 수용체, 및 비타민을 포함한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 일부분이 될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 하기 표 6에 개시되어 있다.
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폴리펩티드 서열은 내인성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상동성(%)을 공유할 수 있다. 폴리펩티드 서열은 내인성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 최대 10%의 상동성, 최대 20%의 상동성, 최대 30%의 상동성, 최대 40%의 상동성, 최대 50%의 상동성, 최대 60%의 상동성, 최대 70%의 상동성, 최대 80%의 상동성, 최대 90%의 상동성, 또는 최대 99%의 상동성을 공유할 수 있다. 둘 이상의 펩티드 사이의 상동성을 측정하는 데 각종 방법 및 소프트웨어 프로그램, 예컨대, NCBI BLAST, 클러스탈 W(Clustal W), MAFFT, 클러스탈 오메가(Clustal Omega), 얼라인메(AlignMe), 프랄린(Praline), 또는 또 다른 적합한 방법 또는 알고리즘이 사용될 수 있다.
면역원성
다양한 크기의 분자 (폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소)를 포함하는 조성물을 비롯한, 다수의 제약 제제는 대상체에게 투여되었을 때, 면역 반응을 일으킬 수 있다. 다수의 경우에서, 면역계는 조성물을 이물질로 인식하고, 그의 제약 작용을 중화시킨다. 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드 및 조성물은 면역원성이 낮을 수 있거나, 또는 비면역원성을 띨 수 있으며, 이로써, 면역계에 의해 작은 반응을 일으킬 수 있거나, 또는 어느 면역 반응도 전혀 일으키지 않을 수 있다.
면역원성은 또한 예를 들어, TNF-α 및 IL-8 수준, 및 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 헬리카제 RIG-1에의 결합 능력을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이로써, 폴리리보뉴클레오티드가 원하는 낮은 면역원성을 가지는지 여부를 확립하기 위해, 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 투여한 후, 인자 중 하나 이상의 것의 정량을 측정할 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성은 폴리펩티드의 대상체에게로의 투여시 백혈구 개수 증가와 관련하여 측정될 수 있다. 일부 경우에서, 조성물이 대상체에게로의 투여시, 대상체는 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만의 백혈구 개수의 증가를 보인다. 본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 최소의 또는 미미한 염증성 또는 면역학적 반응을 일으킬 수 있다.
폴리리보뉴클레오티드의 면역원성 특정을 위해, 다양한 방법이 사용될 수 있다. 매우 적합한 방법은 폴리리보뉴클레오티드 투여에 대한 반응으로서 세포 중 염증성 마커 측정, 또는 간단한 백혈구 계수 측정이다. 상기 방법은 실시예에 기술되어 있다. 염증과 연관된 시토카인, 예컨대, 예를 들어 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-8, IL-6, 및/또는 IL-12를 측정할 수 있다. 수지상 세포 활성화 마커의 발현 또한 면역원성을 추정하는 데 사용될 수 있다. 면역학적 반응을 나타내는 추가의 지표는 톨(Toll)-유사 수용체 TLR-3, TLR-7 및 TLR-8에의 결합 및 헬리카제 RIG-1에의 결합 검출일 수 있다.
폴리리보뉴클레오티드의 면역원성은 폴리리보뉴클레오티드 투여 이전 수준과 비교하여 염증성 마커 또는 백혈구 계수 수준의 전반적인 증가로서 측정될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 또는 변형된 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 세포에, 또는 대상체에게 투여할 수 있고, 폴리리보뉴클레오티드 투여에 대한 반응으로서 정의된 시간 간격으로 염증성 마커의 분비를 측정할 수 있다.
조성물
"네이키드" 폴리뉴클레오티드 조성물은 담체, 안정제, 희석제, 분산제, 현탁화제, 증점제, 및/또는 부형제의 도움없이, 성공적으로 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체의 세포에 의해 흡수될 수 있다 (문헌 [Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468]). 그러나, 다수의 경우에서, 세포내이입 흡수를 증가시킬 수 있는 제제화를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 캡슐화하는 것이 본 개시내용의 조성물의 효과를 증가시킬 수 있다.
폴리리보뉴클레오티드를 다세포 유기체에게로 전달하는 것의 기초가 되는 또 다른 기술상의 도전 과제는 대상체의 세포 또는 조직 내에서 번역되는 폴리리보뉴클레오티드를 높은 효율로 전달할 수 있는 조성물을 확인하는 것이다. 네이키드 핵산을 투여하는 것은 고도로 비효율적일 수 있으며, 폴리뉴클레오티드를 다세포 유기체에게로 투여하는 데 적합한 접근법을 제공하지 못할 수 있다는 것이 이해되고 있다.
이러한 도전 과제를 해소하기 위해, 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제약 담체를 이용하여 캡슐화하거나, 또는 제제화할 수 있다. 제제는 제한하는 것은 아니지만, 나노입자, 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA) 마이크로스피어, 리피도이드, 리포플렉스, 리포솜, 중합체, 탄수화물 (단순당 포함), 양이온성 지질, 피브린 겔, 피브린 히드로겔, 피브린 글루, 피브린 실란트, 피브리노겐, 트롬빈, 신속하게 제거되는 지질 나노입자 (reLNP) 및 그의 조합일 수 있다. 본원에 개시된 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 담체 시스템의 약 1중량/부피% 내지 약 99중량/부피%를 포함할 수 있다. 담체 시스템 중에 존재하는 담체의 양은 제제 제조사에 의한 수개의 상이한 인자 또는 선택, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 최종 농도 및 가용화제의 양에 기초한다. 각종의 담체가 상이한 부류의 치료제를 전달하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이들 담체들 중 생체화합성 중합체 폴리(d, l-락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리락티드 (PLA)로부터 제제화되는 생체분해성 나노입자는 상이한 치료제를 지속적으로 세포내 전달하는 데 효능을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
조성물 중 조작된 폴리뉴클레오티드의 부하 중량%는 적어도 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1%, 2%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%일 수 있다. PLGA 마이크로스피어 중 변형된 mRNA의 캡슐화율은 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%일 수 있다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오티드, 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 세포 내로 또는 조직 내로 전달하는 데 유용한, 대체, 비-동일한 알킬렌 아민 단위를 함유하는 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 나노입자, 올리고머, 중합체 또는 리피도이드를 기술한다. 본원에 기술된 조성물은 적어도 약 1분, 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 동안 안정적일 수 있다. 본원에 개시된 제제는 예를 들어, 적어도 약 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 60℃, 70℃, 또는 80℃의 온도에서 안정적일 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 원하는 밀도를 가질 수 있다. 조성물의 밀도는 조성물의 특성, 예컨대, 조성물의 리올로지를 개선시킬 수 있다.
나노입자
본 개시내용은 또한 대상체에게로의 투여 후 전위 가능한 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 제제에 기초한 나노입자를 제공한다. 일부 경우에서, 투여는 폐 투여이고, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 무손상 상태로 투여 부위에서부터 전신 혈액 공급으로 능동적으로 또는 수동적으로 이동한 후, 이어서, 상이한 세포 또는 조직, 예컨대, 예컨대, 유방에 침착될 수 있다. 치료학적 단백질, 예컨대, 예컨대, ABCA3 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 나노입자의 상기와 같은 전위가 활성 제약 성분을 폐 너머로의 비-침습성 전신 전달을 구성하며, 이를 통해 기능성 단백질의 전신 접근가능한 비-폐 세포 또는 조직으로의 생산이 이루어지게 된다.
나노입자는 입자 크기가 약 10 나노미터 (nm) 내지 5,000 nm, 10 nm 내지 1,000 nm, 또는 60 nm 내지 500 nm, 또는 70 nm 내지 300 nm인 입자일 수 있다. 일부 예에서, 나노입자의 입자 크기는 약 60 nm 내지 225 nm이다. 나노입자는 조작된 폴리리보뉴클레오티드일 수 있는 하나 이상의 폴리리보뉴클레오티드를 캡슐화하는 캡슐화제 (예컨대, 코팅제)를 포함할 수 있다. 나노입자는 조작된 및/또는 천연적으로 발생된 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 캡슐화제는 중합체 물질, 예컨대, PEI 또는 PEG일 수 있다.
전달제로서 사용될 수 있는 리피도이드 또는 지질 나노입자는 C12-200, MD1, 98N12-5, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, PEG화된 지질 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 지질을 포함할 수 있다. 적합한 나노입자는 하나 이상의 지질을 다양한 비로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 C12-200:DOPE:콜레스테롤:DMG-PEG2000을 40:30:25:5 비로, 또는 HGT5001:DOPE:콜레스테롤: DMG-PEG2000을 비로 포함할 수 있다. 나노입자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 지질 또는 또 다른 적합한 개수의 지질을 포함할 수 있다. 나노입자는 임의의 적합한 비의, C12-200, MD1, 98N12-5, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, PLGA, PEG, PEG-DMG로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질로 형성될 수 있다.
나노입자 제제의 평균 크기는 60 나노미터 (nm) 내지 225 nm의 변형된 mRNA를 포함할 수 있다. 변형된 mRNA를 포함하는 나노입자 제제의 다분산 지수 PDI는 0.03 내지 0.15일 수 있다. 나노입자 제제의 제타 전위는 pH 7.4에서 -10 내지 +10일 수 있다. 변형된 mRNA의 제제는 융해성 지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 제제는 몰비 50:10:38.5:1.5-3.0 (양이온성 지질: 융해성 지질: 콜레스테롤: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지질)을 가질 수 있다. PEG 지질은 제한하는 것은 아니지만, PEG-c-DOMG, PEG-DMG로부터 선택될 수 있다. 융해성 지질은 DSPC일 수 있다. 본 개시내용의 지질 나노입자는 실란트, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 피브린 실란트로 제제화될 수 있다.
올리고(알킬렌 아민 기)
비록 일부 제제화를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 캡슐화하는 것이 조성물의 세포내이입 흡수를 증가시킬 수는 있지만, 세포에 의해 흡수되는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 효과적으로 전위될 수 없다는 것 또한 이해되고 있다. 폴리리보뉴클레오티드의 전달에서의 사용에서는 실용적인 것은 아니지만, 일부 제제화가 플라스미드 DNA 및/또는 siRNA 전달을 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용은 폴리리보뉴클레오티드 조성물의 대상체에게로의 효과적인 전달 및 번역을 위해 사용될 수 있는 제제를 제공한다.
본 개시내용의 조성물은 세포 내에서 효과적으로 번역되는 폴리리보뉴클레오티드를 제공하도록 디자인될 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 세포를 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 조작된 폴리리보뉴클레오티드로 형질감염시키기 위해 3개 이상의 단위로 이루어진 기 중 교대식 길이를 가지며, 조성물 중 에틸렌아민을 함유하는 알킬렌 아민의 배열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 비-교대식 길이를 가지는 알킬렌 아민 단위의 유사한 배열보다 더욱 효과적으로 폴리리보뉴클레오티드를 세포로 전달할 수 있다.
하기 화학식 (I)에 도시된 일반 구조 엔티티를 공유하는 올리고머, 중합체 또는 리피도이드를 제공할 수 있다:
<화학식 (I)>
Figure 112018008981144-pct00003
본 개시내용의 조성물은 하기로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)을 포함할 수 있다:
a) 측쇄로서 및/또는 말단기로서 복수 개의, 하기 화학식 (II)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:
<화학식 (II)>
Figure 112018008981144-pct00004
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n, 및 R2 내지 R6은 복수 개의 상기 기 중 화학식 (II)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5은 서로 독립적으로 수소; 기
-CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH,-CH2-CH2-C=O)-O-R7,
-CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH,
-CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; -C(NH)-NH; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고,
여기서, 화학식 (II)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 화학식 (II)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
b) 반복 단위로서 복수 개의, 하기 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:
<화학식 (III)>
Figure 112018008981144-pct00005
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n, 및 R2 내지 R5는 복수 개의 상기 기 중 화학식 (III)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5은 서로 독립적으로 수소; 기
-CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7,
-CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, -CH2-R7 또는 -CH2- (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
여기서, 화학식 (III)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
c) 하기 화학식 (IV)의 구조를 가지는 리피도이드:
<화학식 (IV)>
Figure 112018008981144-pct00006
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n, 및 R2 내지 R6은 하기와 같이 정의되며:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 기
-CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7,
-CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)이고;
여기서, 화학식 (IV)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 화학식 (IV)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
알케닐 및 알케닐렌의 비제한적인 예로는 직쇄형, 분지형, 및 시클릭 알케닐 기를 포함한다. 알케닐 기의 올레핀 또는 올레핀들은 예를 들어, E, Z, 시스, 트랜스, 말단, 또는 엑소-메틸렌일 수 있다. 알케닐렌 기는 예를 들어, 치환 또는 비치환된, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C48, C49, 또는 C50 기일 수 있다.
화학식 (II), (III) 및 (IV)의 올리고(알킬렌 아민) 구조는 이는 (또한 "S"로서 표시된 것을 지칭하는) 더 짧은 에틸렌 아민 단위 (즉, a 또는 b는 1이다)를 (또한 "L"로서 표시된 것을 지칭하는) 더 긴 알킬렌 아민 단위 (즉, a 또는 b 중 나머지 다른 하나는 정수 2 내지 4이다)를 교대 방식으로 조합할 수 있다는 것을 특징으로 한다. 양성자화 가능한 단위의 상기와 같은 배열은 생성된 기의 적합성 면에서 폴리리보뉴클레오티드를 세포 내로 전달하기 위한 비히클을 제공할 수 있다는 이점을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 측쇄로서 또는 말단기로서 복수 개의 하기 화학식 (II)의 올리고(알킬렌 아민) 기를 포함할 수 있다:
<화학식 (II)>
-NR2 {CH2- (CH2)a-NR3- [CH2- (CH2)b-NR4]p}m- [CH2- (CH2)a-NR5]n-R6 (II)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n, 및 R2 내지 R6은 복수 개의 상기 기 중 화학식 (II)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 기
-CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7,
-CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기;
-C(NH)-NH2-; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH,
-CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; -C(NH)-NH; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택된다.
일부 경우에서, R2 내지 R5는 수소이고, R6은 수소, 아미노 기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택된다. 일부 경우에서, R2 내지 R6은 수소이다. 일부 경우에서, R7은 C8-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C8-C18 알케닐로부터, 또는 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C8-C12 알케닐로부터, 또는 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다. 본 개시내용의 조성물은 화학식 (II)-(IV)의 1개, 또는 다중의 알킬렌 기를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용에 따라 조성물 중에서 사용될 수 있는 올리고머 또는 중합체는 반복 단위로서 복수 개의, 하기 화학식 (III)의 올리고 (알킬렌 아민) 기를 포함한다:
<화학식 (III)>
NR2 {CH2- (CH2)a-NR3- [CH2- (CH2)b-NR4]p}m-[CH2- (CH2)a-NR5]n- (III)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n, 및 R2 내지 R5는 복수 개의 상기 기 중 화학식 (III)의 각각의 기에 대해 독립적으로 하기와 같이 정의되며:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R2 내지 R5는 서로 독립적으로 수소; 기
-CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7,
-CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, -CH2-R7 또는 -CH2- (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; -C(NH) -NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 엔도솜 탈출 이펙터 및 수용체 리간드로부터 선택된다. 일부 경우에서, R2 내지 R5는 수소이다. 일부 경우에서, R7은 C8-C18 알킬 또는 1개의 C-C를 가지는 C8-C18로부터 선택된다. R7은 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C를 가지는 C8-C12 알케닐로부터 선택될 수 있다. 대안으로서, R7은 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C를 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택될 수 있다.
화학식 (III)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 화학식 (III)의 양이온성 기를 제공할 수 있다.
임의적으로, 반복 단위로서 복수 개의 화학식 (III)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체는 측쇄로서 및/또는 말단기로서 화학식 (II)의 하나 이상의 올리고(알킬렌 아민) 기(들)를 추가로 포함할 수 있다.
반복 단위로서 복수 개의 화학식 (III)의 기에서, 2, 3개 또는 그 초과의 화학식 (III)의 기가 올리고머 또는 중합체에 함유될 수 있다. 일반적으로, 2 내지 9개의 반복 단위를 포함하는 물질은 본원에서 올리고머로서 지칭되고, 1개 이상의 반복 단위를 포함하는 것은 중합체로서 지칭된다. 따라서, 반복 단위로서 복수 개의 화학식 (III)의 기를 함유하는 중합체에 10개 이상의 화학식 (III)의 기가 존재할 수 있다. 화학식 (III)의 기는 중합체 또는 올리고머 내에 동일한 구조를 가질 수 있거나, 또는 화학식 (III)의 범주 내에서 2개 이상의 상이한 구조를 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 경우에서, 반복 단위로서 복수 개의 화학식 (III)의 기를 함유하는 올리고머 또는 중합체는 화학식 (III)의 상이한 기로부터 조절형의 단계식 중합화 방식으로 제조되는 서열 정의된 중합체 라이르버리 형태로 제공될 수 있다.
상기 화학식 (II) 및 (III)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교대 쇄에서 1회 반복될 수 있고, 이로써, -S-L-L-S- 또는 -S-L-L-S- 유형의 올리고(알킬렌 아민) 모이어티들이 생성될 수 있으며, 여기서, S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 일부 경우에서, 화학식 (II) 및 (III)의 기는 반복이 존재하지 않는 것, 즉, p가 1인 것이며, 이로써, 더 짧거나, 또는 더 긴 단위는 쌍으로 출현하지 않게 된다. 화학식 (II)의 기는 하기 화학식 (IIa)의 올리고(알킬렌 아민) 기일 수 있고, 화학식 (III)의 기는 하기 (IIIa)의 올리고(알킬렌 아민) 기일 수 있다:
<화학식 (IIa)>
-NR2{CH2-(CH2)a-NR3-CH2-(CH2)b-NR4}m-[CH2- (CH2)a-NR5]n- R6(IIa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IIa)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있고;
<화학식 (IIIa)>
-NR2{CH2- (CH2)a-NR3-CH2- (CH2)b-NR4}m-[CH2- (CH2)aNR5]n-(IIIa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IIIa)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있다.
추가로, 일부 경우에서, 화학식 (II) 및 (III)의 올리고(알킬렌 아민) 기는 n = 1인 것을 가질 수 있다. 일부 경우에서, m은 1이고, n은 1이다. 일부 경우에서, 화학식 (II)의 기는 화학식 (IIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기이고, 화학식 (III)의 기는 화학식 (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기이다:
<화학식 (IIb)>
-NR2-CH2- (CH2)a-NR3-CH2- (CH2)b-NR4-CH2- (CH2)a- (NR5) -R6 (IIb)
상기 식에서, a, b, 및 R2 내지 R6은 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IIb)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있고;
<화학식 (IIIb)>
-NR2-CH2- (CH2)a-NR3-CH2- (CH2)b-NR4 -CH2- (CH2)a-NR5- (IIIb)
상기 식에서, a, b, 및 R2 내지 R5는 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IIIb)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (III), (IIIa), (IIIb)의 올리고(알킬렌 아민) 기 중의 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 교대 단위는 에틸렌 아민 단위일 수 있다 (즉, a 또는 b 중 어느 하나는 1이다). 나머지 다른 한 교대 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위 또는 펜틸렌 아민 단위일 수 있다 (즉, a 또는 b 중 나머지 다른 하나는 정수 2 내지 4일 수 있다). 일부 경우에서, a 또는 b 중 나머지 다른 하나는 2 또는 3일 수 있고, 일부 경우에서, a는 1이고, b는 2이거나, 또는 a는 2이고, b는 1이다. 일부 경우에서, 화학식 (IIc)의 올리고(알킬렌 아민) 기는 기 (II) 대신, 또는 그에 추가로 사용되고/거나, 또는 화학식 (IIIc)의 올리고(알킬렌 아민) 기는 기 (III) 대신, 또는 그에 추가로 사용된다. 기 (IIc) 및 기 (IIIc)의 화학식은 하기와 같다:
<화학식 (IIc)>
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5- R6 (IIc)
상기 식에서, R2 내지 R6은 화학식 (II)에서 정의된 바와 같고, 여기서, R2 내지 R6은 수소이고, 여기서, 화학식 (IIc)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있고;
<화학식 (IIIc)>
-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5- (IIIc)
상기 식에서, R2 내지 R5는 화학식 (III)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IIIc)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공할 수 있다.
일부 경우에서, 화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc)에서 기 R2 내지 R6, 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5는 아미노 기에 대한 보호기일 수 있다. 보호기의 비제한적인 예로는 t-부톡시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 또는 카르보벤질옥시 (Cbz)를 포함한다.
일부 경우에서, 화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIIc)에서 기 R1 내지 R6 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5는 수용체 리간드, 예컨대, 문헌 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 기술된 수용체 리간드이다. 폐 조직을 표적화하는 수용체 리간드의 예는 문헌 [Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1 (1): 133-48]에 기술되어 있다. 수용체 리간드는 합성 시클릭 또는 선형 펩티드, 예컨대, 특정 세포 표면 구조 또는 특정 세포 유형에의 결합에 대한 펩티드 라이브러리의 스크리닝으로부터 유도된 것, 시클릭 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대, 시알산, 갈락토스 또는 만노스, 또는 탄수화물과 예를 들어, 펩티드의 반응으로부터 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 표피 성장 인자 및 그로부터 유도된 펩티드, 트랜스페린, 항트랜스페린 수용체 항체, 나노바디 및 항체 단편, 세포 표면 분자 (예컨대, 세포 표면 수용체)에 결합할 수 있는 승인받은 약물 등을 포함할 수 있다.
화학식 (II), (IIa), (IIb) 및 (IIc)에서 기 R1 내지 R6, 또는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb) 및 (IIIc)에서 기 R2 내지 R5 중 임의의 것이 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄인 한, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 분자량은 약 100 g/mol 내지 20,000 g/mol, 약 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol 또는 약 1,000 g/mol 내지 5,000 g/mol일 수 있다.
일부 경우에서, 기 (II)는 하기 화학식 (IId)의 올리고(알킬렌 아민) 기일 수 있다:
<화학식 (IId)>
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH-H (IId)
여기서, 화학식 (IId)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 중합체 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 기 (III)는 하기 화학식 (IIId)의 올리고(알킬렌 아민) 기일 수 있다:
<화학식 (IIId)>
-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH- (IIId)
여기서, 화학식 (IIId)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 중합체 또는 덴드리머 구조를 제공할 수 있다.
리피도이드
조작된 폴리리보뉴클레오티드는 리피도이드 제제로 캡슐화될 수 있다. 리피도이드 제제는 지질, 예컨대, 지방, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민 (예컨대, 비타민 A, D, E, 및 K), 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질 등의 특징을 가지는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 지질 또는 리피도이드 제제는 지질, 예컨대, 과학 문헌에서 헬퍼 지질로서 지칭되는 콜레스테롤, DOPE, DOPC 또는 DSPC, 및/또는 PEG화된 지질 또는 리포플렉스를 제조하는 데 유용한 임의의 다른 지질을 포함할 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제제는 적어도 하나의 지질을 포함할 수 있는 나노입자일 수 있다. 리피도이드 제제는 지질 나노입자일 수 있다. 지질은 제한하는 것은 아니지만, DOPE, DOPC, DSPC, 콜레스테롤, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG 및 PEG화된 지질로부터 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 지질은 양이온성 지질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA 및 DODMA일 수 있다.
리피도이드를 함유하는 조성물은 (조성물 총 중량 기준으로 중량%) 약 40-60중량% 리피도이드, 약 40-60중량% 콜레스테롤, 및 약 5-20중량% PEG-지질일 수 있다. 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 50-75% 리피도이드, 약 20-40% 콜레스테롤, 및 약 1-10% PEG-지질일 수 있다. 리피도이드를 함유하는 조성물은 약 60-70% 리피도이드, 약 25-35% 콜레스테롤, 및 약 5-10% PEG-지질일 수 있다. 조성물은 예를 들어, 문헌 [Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569]; [Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9]; [Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9]; US 8,450,298, O2006/138380에 기재된 기술과 함께 제공될 수 있다. RNA/리피도이드 복합체는 RNA, 예컨대, 단일 가닥 RNA 또는 mRNA를 세포 내로 전달하는 데 유용한 입자를 형성할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 하기 화학식 (IV)의 리피도이드에 의해 캡슐화된 조작된 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다:
<화학식 (IV)>
R1-NR2 {CH2- (CH2)a-NR3- [CH2- (CH2)b-NR4]p}m- [CH2- (CH2)a-NR5]n-R6 (IV)
상기 식에서, 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 하기 정의되는 바와 같고:
a는 1이고 b는 정수 2 내지 4이거나; 또는 a는 정수 2 내지 4이고, b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고, m + n은 ≥ 2이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7,-CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2- (C=O) -NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; -C(NH) -NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2- (C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)이다.
일부 경우에서, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 기 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다); 아미노 기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-C(OH)H-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)로부터 선택된다. 일부 경우에서, R1 내지 R6은 독립적으로 수소; 및 기 -CH2-CH(OH) -R7 또는 -CH(R7) -CH2-OH (여기서, R7은 C3-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C16 알케닐로부터 선택된다)로부터 선택되고; 단, R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)이다. 일부 경우에서, R1 및 R6은 독립적으로 수소; 및 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)로부터 선택되고; R2 내지 R5는 모두 기 -CH2-CH(OH)-R7 또는 -CH(R7)-CH2-OH (여기서, R7은 C3-C18 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C3-C18 알케닐로부터 선택된다)이다. 일부 경우에서, R7은 C8-C16 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C8-C18 알케닐로부터, 또는 C8-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C8-C12 알케닐로부터, 또는 C10-C12 알킬 또는 1개의 C-C 이중 결합을 가지는 C10-C12 알케닐로부터 선택된다.
화학식 (IV)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
상기 화학식 (IV)에 따라, 알킬렌 아민 단위는 교대 쇄에서 1회 반복될 수 있고, 이로써, -S-L-L-S- 또는 -L-S-S-L- 유형의 올리고(알킬렌 아민) 모이어티들이 생성될 수 있으며, 여기서, S는 더 짧은 에틸렌 아민 단위를 나타내고, L은 더 긴 알킬렌 아민 단위를 나타낸다. 일부 경우에서, 화학식 (IV)의 리피도이드는 반복이 존재하지 않는 것, 즉, p가 1인 것이며, 이로써, 더 짧거나, 또는 더 긴 단위는 쌍으로 출현하지 않게 된다. 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 (IVa)의 리피도이드일 수 있다:
<화학식 (IVa)>
R1-NR2 {CH2- (CH2)a-NR3-CH2- (CH2)b-NR}m- [CH2-(CH2)a-NR5]n- R6 (IVa)
상기 식에서, a, b, m, n, 및 R1 내지 R6은 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IVa)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
일부 경우에서, 리피도이드는 화학식 (IV)의 리피도이드이다. 일부 경우에서, 화학식 (IV)의 리피도이드에서 'n'은 1이다. 일부 경우에서, 화학식 (IV)의 리피도이드에서 'm'은 1이고, n은 1이다. 일부 경우에서, 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 화학식 (IVb)의 리피도이드이다:
<화학식 (IVb)>
R-NR2-CH2- (CH2)a-NR3-CH2- (CH2)b-NR4-CH2- (CH2)a-NR5-R6 (IVb)
상기 식에서, a, b, 및 R1 내지 R6은 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IVb)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
화학식 (IV), (IVa) 및 (IVb)의 리피도이드에서 알킬렌 아민 단위의 길이와 관련하여, 교대 단위 중 하나는 에틸렌 아민 단위여야 한다는 것 (즉, a 또는 b 중 어느 하나는 1이다)을 이해할 것이다. 나머지 다른 한 교대 단위는 프로필렌 아민 단위, 부틸렌 아민 단위, 펜틸렌 아민 단위, 또는 또 다른 적합한 단위일 수 있다 (즉, a 또는 b 중 나머지 다른 하나는 정수 2 내지 4일 수 있다). 일부 경우에서, 화학식 (IV)의 리피도이드는 하기 화학식 (IVc)의 리피도이드이다:
<화학식 (IVc)>
R1-NR2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-CH2-NR4-CH2-CH2-NR5-RS (IVc)
상기 식에서, R1 내지 R6은 화학식 (IV)에서 정의된 바와 같고, 여기서, 화학식 (IVc)에 명시된 질소 원자 중 하나 이상의 것은 양성자화될 수 있고, 이로써, 양이온성 리피도이드를 제공할 수 있다.
일부 경우에서, 화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 기 R1 내지 R6은 아미노 기에 대한 보호기이다. 보호기의 비제한적인 예로는 t-부톡시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 또는 카르보벤질옥시 (Cbz)를 포함한다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 기 R1 내지 R6이 수용체 리간드인 한, 예컨대, 문헌 [Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy -Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009]에 기술되어 있는 수용체 리간드이다. 폐 조직을 표적화하는 수용체 리간드의 예는 문헌 [Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1 (1): 133-48]에 기술되어 있다. 수용체 리간드는 합성 시클릭 또는 선형 펩티드, 예컨대, 특정 세포 표면 구조 또는 특정 세포 유형에의 결합에 대한 펩티드 라이브러리의 스크리닝으로부터 유도된 것, 시클릭 또는 선형 RGD 펩티드, 합성 또는 천연 탄수화물, 예컨대, 시알산, 갈락토스 또는 만노스, 또는 탄수화물과 예를 들어, 펩티드의 반응으로부터 유도된 합성 리간드, 세포 표면 구조를 특이적으로 인식하는 항체, 엽산, 표피 성장 인자 및 그로부터 유도된 펩티드, 트랜스페린, 항트랜스페린 수용체 항체, 나노바디 및 항체 단편, 세포 표면 분자 (예컨대, 세포 표면 수용체)에 결합할 수 있는 승인받은 약물 등을 포함할 수 있다.
화학식 (IV), (IVa), (IVb) 및 (IVc)에서 R1 내지 R6이 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄인 한, 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 분자량은 약 100 g/mol 내지 20,000 g/mol, 약 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol 또는 약 1,000 g/mol 내지 5,000 g/mol일 수 있다. 일부 경우에서, PEG 쇄의 분자량은 원하는 밀도를 가지는 조성물을 제공할 수 있다.
다중 리피도이드 분자는 조작된 폴리리보뉴클레오티드와 회합될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1개의 조작된 폴리리보뉴클레오티드 내지 100개의 리피도이드 분자, 1개의 조작된 폴리리보뉴클레오티드 내지 1,000개의 리피도이드 분자, 10개의 조작된 폴리리보뉴클레오티드 내지 1,000개의 리피도이드 분자, 또는 100개의 조작된 폴리리보뉴클레오티드 내지 10,000개의 리피도이드 분자를 포함할 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드 및 리피도이드의 복합체는 입자를 형성할 수 있다. 입자의 직경 범위는 예컨대, 10 나노미터 내지 1,200 나노미터일 수 있다. 일부 경우에서, 입자의 직경 범위는 10 나노미터 내지 500 나노미터이다. 일부 경우에서, 입자의 직경은 20 나노미터 내지 150 나노미터이다.
대상체에게로의 투여
본원에서는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 폴리리보뉴클레오티드)를 대상체에게 투여하는 방법을 추가로 기술한다. 폴리리보뉴클레오티드는, 폴리리보뉴클레오티드를 캡슐화하는 캡슐화제와 함께 전달제, 예컨대, 입자 또는 캡슐을 통해 대상체에게 제공될 수 있다. 전달제는 치료제일 수 있다. 대상체는 인간, 예컨대, 암에 걸린 인간일 수 있다. 전달제는 주어진 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있고 (예컨대, 자기 투여 또는 제3자, 예컨대, 건강 관리 제공자에 의한 투여), 투여량은 시간 경과에 따라 증량될 수 있거나, 시간 경과에 따라 감량될 수 있거나, 또는 일정하게 유지될 수 있다. 투여량은 대상체에서 질환, 예컨대, 희귀 질환 또는 암의 진행 또는 퇴행에 기초하여 변경될 수 있다.
본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 투여될 수 있도록 하나 이상의 제약상 허용되는 담체(들)와 함께 제제화될 수 있다. 일부 경우에서, 폴리리보뉴클레오티드는 표적 세포 또는 세포 집단에의 표적화된 전달을 위해 제제화될 수 있다. 일부 경우에서, 폴리리보뉴클레오티드는 세포 또는 세포 집단에의 비표적화된 전달을 위해 제제화될 수 있다. 이어서, 폴리리보뉴클레오티드의 코딩된 폴리펩티드 생성물은 전사되고, 이는 수혜자 세포 내에 축적된다.
조성물은 본원에 기술된 임의의 조작된 폴리리보뉴클레오티드와 다른 화학적 성분, 예컨대, 담체, 안정제, 희석제, 분산화제, 현탁화제, 증점제, 및/또는 부형제와의 조합일 수 있다. 조성물은 유기체로의 화합물 투여를 촉진시킨다. 제약 조성물은 예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 직장, 에어로졸, 비경구적, 안구, 폐, 경피, 질, 귀, 비강, 및 국소적 투여를 비롯한 다양한 형태 및 경로에 의해 제약 조성물로서 치료학상 유효량으로 투여될 수 있다.
조성물은 국부 또는 전신 방식으로, 예를 들어, 화합물을 기관 내로 직접 주사하는 방식을 통해, 임의적으로 데포 또는 지속 방출형 제제로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 신속 방출형 제제의 형태로, 장기 방출형 제제의 형태로, 또는 중간 방출형 제제의 형태로 제공될 수 있다. 신속 방출형 형태는 중간 방출형을 제공할 수 있다. 장기 방출형 제제는 방출 조절형 또는 지속 지연형 방출을 제공할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 활성 화합물은 에어로졸, 미스트, 증기, 스프레이, 또는 분제 형태일 수 있다. 제약 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하는, 가압형 팩 또는 네블라이저로부터 에어로졸 스프레이를 제공하는 형태로 편리하게 전달된다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물 및 예컨대, 락토스 또는 전분과 함께 적합한 분말 기재로 이루어진 분제 믹스를 사용하는 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴으로 이루어진 캡슐 및 카트리지가 제제화될 수 있다.
눈은 시력 유지에 중요한 시각적 성분을 공급하는, 구조상 및 기능상 상이한 수개의 혈관상을 포함한다. 이들 상은 각각 망막의 내측부 및 외측부를 공급하는 망막 및 맥락막 맥관 구조, 및 각막 주변부에 위치하는 윤부의 맥관 구조를 포함한다.
조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물은 예를 들어, 국소적, 경구적, 전신, 유리체내, 전방내, 결막하, 테논낭하, 안구후부, 안구내, 후방 공막근처, 안구주위, 망막하, 및 맥락막상 투여를 비롯한, 임의의 적합한 형태 또는 경로를 통해 눈으로 투여될 수 있다. 조성물은 전방, 후방, 유리체방 (유리체내), 고유 망막, 및/또는 망막하 공간을 비롯한, 눈의 임의의 일부분에 제제를 주사함으로써 투여될 수 있다. 조성물은 또한 비-침습성 방법을 통해 전달될 수 있다. 제제를 투여하는 비-침습성 모드는 바늘이 없는 주사 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 제약 조성물의 효율적인 전달을 위해 다중 투여 경로가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 내피 세포 예컨대, 혈관 내피 세포, 망막의 세포, 예컨대, 망막 색소 상피 (RPE), 각막 세포, 섬유아세포, 성상세포, 신경아교세포, 혈관주위세포, 홍채 상피 세포, 신경 기원의 세포, 모양체 상피 세포, 뮐러 세포, 눈 주변의 부착된 근육 세포, 예컨대, 외측직근의 세포, 안와 지방체 세포, 공막 및 공막외의 세포, 섬유주 그물 세포, 및 결합 조직 세포를 비롯한, 임의의 적합한 안구 세포에 전달될 수 있다.
본원에서는 대상체에게로의 투여시 대상체의 세포에 의해 적어도 약 80%, 90%, 또는 95%의 형질감염율을 가질 수 있는 조성물을 개시한다. 일부 경우에서, 대상체에게로의 투여시, 캡슐화된 조성물의 형질감염율은 캡슐화되지 않은 폴리리보뉴클레오티드 대비로 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450%, 또는 500%이다. 일부 상황에서, 대상체에게로의 투여시, 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 (일부 경우에서, 비변형된 폴리리보뉴클레오티드 또한 포함하는) 조성물의 형질감염율은 오직 비변형된 폴리리보뉴클레오티드만을 함유하는 조성물 대비로 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450%, 또는 500%이다. 조성물의 형질감염율은 캐리어, 예컨대, 세포 투과 펩티드 또는 양이온성 코팅제를 조성물의 외부 층에 첨가함으로써 증가될 수 있다. 조성물의 형질감염율은 조성물의 밀도에 의 조정될 수 있다.
본원에 기술된 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 화합물은 하나 이상의 불활성, 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 함께 제제화하여 고체, 반고체 또는 액체 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 고체 조성물로는 예를 들어, 분제, 정제, 분산가능한 과립제, 캡슐, 카세제 및 좌제를 포함한다. 액체 조성물로는 예를 들어, 화합물이 용해되어 있는 액제, 화합물을 포함하는 에멀젼, 또는 본원에 기술된 바와 같은 화합물을 포함하는 리포솜, 미셀, 또는 나노입자를 함유하는 액제를 포함한다. 반고체 조성물로는 예를 들어, 겔, 현탁제 및 크림을 포함한다. 조성물은 액체 액제 또는 현탁제, 사용 전 액체 중 액제 또는 현탁제로 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 조성물은 또한 소량의 비독성, 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, pH 완충화제, 및 다른 제약상 허용되는 첨가제를 함유할 수 있다.
제약상 허용되는 부형제의 비제한적인 예는 예를 들어, 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)]; [Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975]; [Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)] (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
폴리뉴클레오티드 (예컨대, 폴리리보뉴클레오티드)를 포함하는 조성물은 다양한 투여량으로 제공될 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리리보뉴클레오티드의 용량은 조작된 폴리리보뉴클레오티드 약 1 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 또는 약 25 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍일 수 있다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드의 용량은 조작된 폴리리보뉴클레오티드 약 1 mg 내지 약 100 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 10 mg 내지 약 50 mg, 약 20 mg 내지 약 50 mg, 약 25 mg 내지 약 50 mg, 약 30 mg 내지 약 50 mg, 약 40 mg 내지 약 50 mg, 약 50 mg 내지 약 100 mg, 약 1 mg 내지 약 25 mg, 약 2 mg 내지 약 25 mg, 약 3 mg 내지 약 25 mg, 약 4 mg 내지 약 25 mg, 약 5 mg 내지 약 25 mg, 약 1 mg 내지 약 20 mg, 약 1 mg 내지 약 20 mg, 약 2 mg 내지 약 20 mg, 약 3 mg 내지 약 20 mg, 약 4 mg 내지 약 20 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 20 mg이다.
(예컨대, 캡슐화된 작용제 내의) 제제 중 폴리리보뉴클레오티드의 비율은0.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 0.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 0.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19.25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19.75중량% 폴리리보뉴클레오티드, 20중량% 폴리리보뉴클레오티드, 20.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 21중량% 폴리리보뉴클레오티드, 21.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 22중량% 폴리리보뉴클레오티드, 22.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 23중량% 폴리리보뉴클레오티드, 23.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 24중량% 폴리리보뉴클레오티드, 24.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 또는 25중량% 폴리리보뉴클레오티드 이상일 수 있다. 대안적으로, (예컨대, 캡슐화된 작용제 내의) 제제 중 폴리리보뉴클레오티드의 비율은 약 25중량% 폴리리보뉴클레오티드, 24.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 24중량% 폴리리보뉴클레오티드, 23.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 23중량% 폴리리보뉴클레오티드, 22.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 22중량% 폴리리보뉴클레오티드, 21.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 21중량% 폴리리보뉴클레오티드, 20.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 20중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 19중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 18중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 17중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 16중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 15중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 14중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 13중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 12중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 11중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 10중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 9중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 8중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 7중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 6중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 4중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 3중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 2중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 1중량% 폴리리보뉴클레오티드, 0.5중량% 폴리리보뉴클레오티드, 또는 0.1중량% 폴리리보뉴클레오티드 미만일 수 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 캡슐화된 조성물은 대상체에서 장치 사용 약 1초 내지 약 30분, 약 1초 내지 20분, 약 1초 내지 10분, 약 1초 내지 5분, 약 1초 내지 2분, 약 1초 내지 1분, 약 1초 내지 약 30초, 약 30초 내지 30분, 약 30초 내지 20분, 약 30초 내지 10분, 약 30초 내지 5분, 약 30초 내지 2분, 약 30초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 30분, 약 1분 내지 약 25분, 약 1분 내지 약 20분, 약 1분 내지 약 15분, 약 1분 내지 약 10분, 약 5분 내지 약 30분, 약 5분 내지 약 25분, 약 5분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 5분 내지 약 10분, 약 10분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 25분, 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 10분 내지 약 15분 이내에 폴리리보뉴클레오티드, 제약 담체, 캡슐화제, 또는 중합체 물질 (예컨대: 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌이민)의 혈장, 혈청 또는 혈액 농도를 나타낼 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드, 제약 담체, 캡슐화제, 또는 중합체 물질 (예컨대: 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌이민)의 혈장, 혈청 또는 혈액 농도는 최고 농도 또는 평균 농도일 수 있다.
치료 및 병태
본 개시내용의 방법, 폴리리보뉴클레오티드, 및 제약 조성물은 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 치료는 대상체 (예컨대, 질환을 앓는 환자 및/또는 병태를 앓는 실험실용 동물)를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 병태는 암이다. 일부 경우에서, 병태는 폐암이다. 일부 경우에서, 병태는 유방암이다. 일부 경우에서, 대상체는 인간이다. 치료는 질환의 임상적 발병 이전에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 발병 이후에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 발병시에 그 후 1분, 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 1일, 1주, 6개월, 12개월, 또는 2년 경과 후에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 발병 이후에 1분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 6개월, 12개월, 2년 또는 그 초과보다 긴 또는 그와 동일한 기간 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 발병 이후에 2년, 12개월, 6개월, 1개월, 1주, 1일, 12시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분, 10분, 또는 1분 미만 또는 그와 동일한 기간 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 또한 임상 시험에서 인간을 치료하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물은 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 질환, 예컨대, 폐암 또는 유방암을 이미 앓고 있는 대상체에게 상기 질환의 증상을 치유하거나, 또는 적어도 그를 호전시키는 양의 코딩된 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 또한 질환이 발병되거나, 질환에 걸리거나, 또는 질환이 악화될 가능성을 감소시키기 위해서도 투여될 수 있다. 상기 용도에 효과적인 양은 질환 또는 장애의 중증도 및 경과 과정, 조작된 폴리뉴클레오티드의 형질감염율, 코딩된 폴리펩티드의 표적 분자에의 친화도, 이전 요법, 대상체의 건강 상태, 체중, 약물에 대한 반응, 주치의의 판단에 따라 달라질 수 있다.
본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리의 유전자의 결함 또는 기능 장애와 연관된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. ATP-결합 카세트 (ABC) 패밀리의 유전자와 연관된 병태의 비제한적인 예로는 연령 관련 황반 변성, 양성 재발성 간내 담즙울체증, 칸투 증후군, 선천성 양측 정관 형성 부전증, 선천성 과인슐린증 , 낭성 섬유증, 듀빈-존슨 증후군, 가족성 확장성 심근병증, 가족성 HDL 결핍증, 유아기의 전신 동맥 석회화, 할리퀸 어린선, 유전성 췌장염, 임신 중 간내 담즙울체증, 층판상 어린선, 영구 신생아 진성 당뇨병, 진행성 가족성 간내 담즙울체증, 탄력 섬유성 가황색종, 망막 색소변성증, 시토스테롤혈증, 스타카르트 황반 변성, 계면활성제 기능 장애, 탄지에르병, X-연관 부신백질이영양증, X-연관 철적모구 빈혈 및 실조증을 포함한다.
본 개시내용의 폴리리보뉴클레오티드, 방법 및 제약 조성물은 예를 들어, 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 암의 비제한적인 예로는 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수양 백혈병, 부신 피질 암종, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌 종양, 예컨대, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경아교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 원발 기원 상세불명의 암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 섬유조직형성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유윙 육종, 생식 세포 종양, 담낭암, 위암(gastric cancer), 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양, 신경아교종, 모발 세포성 백혈병, 두부경부암, 심장암, 간세포암 (간암), 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종 섬 세포 암종, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 구순암 및 구강암(oral cavity cancer), 지방육종, 간암, 폐암, 예컨대, 비소세포 및 소세포 폐암, 림프종, 백혈병, 마크로글로불린혈증, 골의 악성 섬유 조직구종/골육종, 수모세포종, 흑색종, 중피종, 잠복 원발성을 동반한 전이성 경부 편평 세포 암, 구강암(mouth cancer), 다발성 내분비선종증, 골수이형성 증후군, 골수양 백혈병, 비강암 및 부비강암, 비인두 암종, 신경아세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강암(oral cancer), 구강인두암, 골육종/골의 악성 섬유 조직구종, 난소암, 난소 상피 암, 난소 생식 세포 종양, 췌장암, 췌장 섬 세포 암, 부비강암 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 임두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배세포종, 뇌하수체 선종, 흉막폐아세포종, 형질 세포 신생물, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종, 신우 및 요관 이행 세포 암, 망막아세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 피부암, 메르켈 세포 피부 암종, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 위암(stomach cancer), T 세포 림프종, 인후암, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선암, 영양막 종양 (임신성), 원발 부위 상세불명의 암, 요도암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 및 빌름스 종양을 포함한다. 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 폐암 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에서, 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 유방암 치료를 위해 대상체에게 투여된다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 ATP-결합 카세트, 서브패밀리 A, 예컨대, ABCA3의 단백질과 적어도 80% 상동성인 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
다중 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 임의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 동일 표적 분자를 표적화하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 단일 패키지로, 또는 복수 개의 패키지로 함께 또는 별개로 패킹될 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드 중 하나 또는 그들 모두는 다회 투약으로 제공될 수 있다. 동시 투약이 아닐 경우, 다회 투약 사이의 기간은 달라질 수 있다.
조작된 폴리리보뉴클레오티드는 중상 발병 후 가능한 빨리 대상체에게 투여될 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드는 질환 또는 장애 발병이 검출되거나, 또는 의심된 이후 실현화되는 즉시, 및 질환 치료를 위한 필요한 기간, 예컨대, 약 1개월 동안, 예컨대, 약 6개월 동안, 약 12개월 동안, 약 18개월 동안, 또는 약 24개월 동안, 또는 임의의 적절한 기간 동안 투여될 수 있다. 치료 기간은 각 대상체마다 달라질 수 있다.
실시예
실시예 1: 폐 장애를 앓는 인간 대상체 치료용의 조작된 폴리리보뉴클레오티 드를 포함하는 조성물의 제제화
조성물을 하기와 같이 제제화한다:
ABCA3 유전자 서열, NCBI 참조 서열: NM_001089.2를 코딩하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 WO2011012316, WO2014207231, WO2014153052, WO2013185069에 기술된 바와 같이 제조한다. 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI, 평균 MW = 25 kDa)을 시그마-알드리치™ (독일 슈넬도르프)로부터 구입한 것이고, 추가 정제없이 사용한다. PEI를 내독소 무함유 물에 희석시키고, HCl을 이용하여 pH 7.4로 조정한다. 내독소 무함유 물은 B. 브라운(B. Braun: 독일 멜중겐)으로부터 구입한 것이다.
조작된 폴리리보뉴클레오티드 및 PEI를 4.0 ml의 이중 증류수 중에 희석시켜 (대략 10인 PEI에 대한 폴리뉴클레오티드의 비로) 각각 250 ㎍/ml 농도의 mRNA 및 326.3 ㎍/ml 농도의 PEI를 수득할 수 있다. 조작된 폴리리보뉴클레오티드 용액을 PEI 용액 내로 피펫팅하고, 상하로 피펫팅하여 혼합하여 125 ㎍/ml의 최종 폴리리보뉴클레오티드 농도를 수득할 수 있다. 상기 복합체를 대상체에게 투여하기 이전에서 실온에서 20 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다.
실시예 2: 인간 ABCA3 합성을 위한 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 디자인, 합성, 제제화, 및 세포 기반 특징 규명
하기 서열을 포함하는, 인간 ABCA3의 변이를 코딩하는 8개의 상이한 버전의 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 제조한다.
표 7
천연 ORF 단독 (UTRs 비포함)
천연 ORF + 천연 UTRs
천연 ORF + CYBA UTRs
천연 ORF + α-글로빈 5' UTR ETH
코돈 최적화된 ORF
코돈 최적화된 ORF + 천연 UTRs
코돈 최적화된 천연 ORF + CYBA UTRs
코돈 최적화된 ORF + UTR-ETH
구축물을 벡터 내로 서브 클로닝하고, 표준 방법 (예컨대: 맥시 프렙(maxi prep))을 이용하여 증폭시킨다. 서열분석 기술을 사용하여 각 구축물의 핵산 서열을 확인한다.
실시예 3: 인간 폐포 상피 세포주에서의 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 발현
표 6에 기술된 서열을 발현하는 상이한 구축물을 인간 폐포 상피 세포주 A549, HepG2, 및 HEK293 세포에 투여한다. 약 8의 N/P 비 (N/P = DNA의 포스페이트 기의 몰에 대한 양이온성 중합체의 아민 기의 몰의 비)를 포함하는 제제 내로 각 구축물을 도입한다. 제제 및 각 성분의 몰비의 예는 하기 표 8에 제시되어 있다.
표 8
제제 양이온성 지질 DPPC 콜레스테롤 DMG - PEG2000
제제 1 40 % dL_01 및 60 % dL_05 5.29 4.41 0.88
제제 2 60 % dL_01 및 40 % dL_05 5.29 4.41 0.88
제제 3 100 % dL_05 5.29 4.41 0.88
제제 4 100 % dL_01 5.29 4.41 0.88
본원에서 사용되는 바, dL_01은
Figure 112018008981144-pct00007
이다.
본원에서 사용되는 바, dL_05는
Figure 112018008981144-pct00008
이다.
각 제제의 폴리플렉스 크기 및 제타 전위를 측정한다. 각 제제의 안정성을 다양한 pH, 온도에서 및 왕성하게 진탕시킨 후에 측정한다.
각 폴리리보뉴클레오티드 제제의 반감기, RNA 흡수, 및 면역원성을 3개의 (A549, HepG2 및 HEK293) 모두에서 측정한다.
실시예 4: 리포터 유전자를 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 흡수, 발현 및 분포
반딧불이 루피페라제 (FFL, 1.64 kb), 토마토 레드(Tomato Red) (TR, 1.86 kb), 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP, 0.94 kb), 및 LacZ (3.3 kb) 리포터를 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드. 본 연구는 폴리에틸렌이민 ("PEI") 및 EPE (아미노에틸 및 아미노프로필 단위의 통계학적 중합체; EP-A1 3034539 (본원에서 참조로 포함된다) 참조) 제제 사이의 비교, 세포 분포 (예컨대, 폐포 II형 상피 세포, 폐포 I형 상피 세포, 폐 미세혈관 내피 세포) 및 최적의 흡수를 위한 용량 범위의 가변성, 리포터 유전자를 코딩하는 상이한 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 발현 및 분포 또한 기술한다. 하기 표 9에는 마우스 모델에서 시험된 상이한 투약 요법이 예시되어 있다.
표 9
군 번호 조작된
폴리리보뉴클레오티드		 용량* 투약 요법 N 시점
1 폴리에틸렌이민 ("PEI") 비히클 - 단일 투약 3 24시간
2 EPE 비히클 - 단일 투약 3 24시간
3 PEI + FFL 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
4 PEI + FFL 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
5 EPE + FFL 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
6 EPE + FFL 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
7 PEI + 토마토 레드 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
8 PEI + 토마토 레드 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
9 EPE + 토마토 레드 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
10 EPE + 토마토 레드 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
11 PEI + EGFP 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
12 PEI + EGFP 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
13 EPE + EGFP 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
14 EPE + EGFP 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
15 PEI + LacZ 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
16 PEI + LacZ 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
17 EPE + LacZ 0.1 내지 1 mg/kg 단일 투약 3 24시간
18 EPE + LacZ 1.0 내지 10.0 mg/kg 단일 투약 3 24시간
투여 경로: 흡입 (에어로졸). 도 1은 마우스에게로의 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 에어로졸 투여의 예를 도시한 것이다. 본 실험은 임의의 마우스, 예컨대, 야생형 C57B16 마우스에서 수행할 수 있다. 총 54마리의 마우스에서 반딧불이 루피페라제 (FFL, 1.64 kb), 토마토 레드 (TR, 1.86 kb), 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP, 0.94 kb), 및 LacZ (3.3 kb) 리포터의 발현을 측정한다.
실시예 5: ABCA3 단백질을 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 생체내 흡수, 발현 및 분포
표 8에 열거된 하나 이상의 제제로 제조된 표 7의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 구축물을 총 36마리의 야생형 C57B16 마우스에 투여한다. 투여 경로로서 기관내 튜브를 사용한다.
각 펩티드의 기관내 투여 후 약 24시간째에 각 마우스의 폐 조직을 수집한다. 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 급속 냉동시키고, qPCR, 웨스턴 블롯, 및 ELISA에 의해 ABCA3 단백질 발현에 대하여 분석한다. 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 포르말린 중에서 고정시키고, 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 계내 존재 및 조직학적 분석에 대하여 분석한다. 기관지 폐포 세척액 (BALF)을 수집하고, 마커 IL-10, MIP-1α, INF-α, TNF-α, IL-12, 및 IL-6의 발현 수준을 분석하여 각 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성을 측정한다.
실시예 6: ABCA3 단백질을 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 생체내 투약 연구
표 8에 열거된 하나 이상의 제제로 제조된 표 7의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 구축물을 야생형 C57B16 마우스에 투여한다. 기관내 튜브를 사용하여 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 각 마우스에 투여한다. 범위가 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 및 1 mg/kg 내지 10 mg/kg인 투여량을 비롯한, 상이한 투여량의 각 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 시험한다.
각 펩티드의 기관내 투여 후 약 24시간째에 각 마우스의 폐 조직을 수집한다. 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 급속 냉동시키고, qPCR, 웨스턴 블롯, 및 ELISA에 의해 ABCA3 단백질 발현에 대하여 분석한다. 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 포르말린 중에서 고정시키고, 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 계내 존재 및 조직학적 분석에 대하여 분석한다. 기관지 폐포 세척액 (BALF)을 수집하고, 마커 IL-10, MIP-1α, INF-α, TNF-α, IL-12, 및 IL-6의 발현 수준을 분석하여 각 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성을 측정한다.
폐 및 생물학적 샘플로부터 측정된 메트릭스를 사용하여 각 투여량의 안전성 및 효능을 평가한다.
실시예 7: ABCA3 단백질을 코딩하는 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 생체내 투약 연구
야생형 C57B16 마우스는 표 7에 열거된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 구축물을 포함하는 에어로졸을 반복적으로 흡입한다. 범위가 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 및 1 mg/kg 내지 10 mg/kg인 투여량을 비롯한, 상이한 투여량의 각 조작된 폴리리보뉴클레오티드를 시험한다.
상이한 마우스는 초기 투여 후 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 120시간째에 반복 투여받는다. 각 펩티드의 투여 후 약 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 120시간째에 상이한 마우스의 폐 조직 및 생물학적 샘플을 수집한다. 언급된 각 시점에, 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 급속 냉동시키고, qPCR, 웨스턴 블롯, 및 ELISA에 의해 ABCA3 단백질 발현에 대하여 분석한다. 마우스 1마리당 폐 1개의 조직을 포르말린 중에서 고정시키고, 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 계내 존재 및 조직학적 분석에 대하여 분석한다. 기관지 폐포 세척액 (BALF)을 수집하고, 마커 IL-10, MIP-1α, INF-α, TNF-α, IL-12, 및 IL-6의 발현 수준을 분석하여 각 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성을 측정한다. 혈액, 간 및 비장 또한 수집하고, 급속 냉동시키고, 조직학적 분석을 위해 프로세싱한다.
폐 및 생물학적 샘플로부터 측정된 메트릭스를 사용하여 에어로졸화된 조작된 폴리리보뉴클레오티드의 반복 투여의 안전성 및 효능을 평가한다.
실시예 8: 포유동물 세포에서의 ABCA3 리보핵산의 발현
본 실험은 시험관내에서의 두 ABCA3-FLAG mRNA의 발현 (번역)을 입증한다. 본 실험을 위해, 5' UTR이 결여된 ABCA3-FLAG DNA (서열 번호: 17) (도 2: 20분 동안 후속 폴리아데닐화된 ABCA3-FLAG-폴리A~30; 테일 연장을 위해 20분 동안 후속 폴리아데닐화된 30A 폴리A 테일을 포함하는 주형으로부터 제조) 및 5' 인간 α-글로빈 UTR을 포함하는 ABCA3-FLAG DNA (서열 번호: 18) (도 2: ABCA3-FLAG-폴리A~120, DNA 수준에서 서열 번호: 5, 및 RNA 수준에서 서열 번호: 16의 5' UTR을 포함)를 사용하여 시험관내에서 상응하는 mRNA를 4개의 정규 뉴클레오티드를 이용하여 전사시키고, 캡1 구조로 캡핑하고, 폴리아데닐화시켰다. 상기 두 ABCA3-FLAG mRNA인, 폴리아데닐화된 ABCA3-FLAG-폴리A~30 및 ABCA3-FLAG-폴리A~100을 A549 세포 내로 형질감염시켰다. 도 2는 형질감염 후 6시간째 A549 세포에서의 ABCA3 mRNA의 번역을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
본 실험을 위해, 2 x 106개의 A549 세포 (p7)를 7.5 ㎍의 ABCA3-FLAG-폴리A~30 또는 ABCA3-FLAG-폴리A~100으로 형질감염시키고, 형질감염 후 6시간째에 수거하였다. 세포를 웰로부터 스크랩핑하고, 펠릿화하고, 펠릿을 RIPA 완충제 중에서 용해시켰다. 75 ㎍의 전체 단백질을 겔 상에 로딩하였다. 플롯을 1:10,000으로 접합된 M2 항 플래그(flag)-HRP로 O/N 동안 프로빙하고, 펨토 슈퍼(Femto Super) 신호 기질을 사용하여 발색시켰다. MLE-15 세포에 대해서도 유사한 웨스턴 블롯 결과를 수득하였다.
A549 세포 중의 형질감염된 mRNA로부터의 ABC3A 단백질의 성공적인 발현을 입증하는 추가의 실험을 수행하였다 (데이터는 나타내지 않음). 간략하면, 인간 ABC3A를 코딩하는 mRNA로 A549 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 6시간째, 세포를 수거하고, 용해시키고, 웨스턴 블롯에 의해 ABC3A 단백질 발현을 검출하였다. 본 실험을 위해, CYBA 5' UTR 및 CYBA 3' UTR을 가지는, 코돈 최적화된 ABCA3-DNA를 사용하여 시험관내에서 상응하는 mRNA를 전사시켰다.
실시예 9: 시험관내 ABCA3 mRNA 발현
다양한 비 및 조합으로 특이적인 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 도입하는 것이 상이한 세포 유형에서의 번역 효율에 미치는 효과를 비교하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 본원에 기술된 실험은 1) 50% ψ; 2) 100% ψ; 3) 25% s2U + 25% m5C (Mod 1); 4) 50% I5U (Mod 2); 또는 5) 35% I5U + 7.5% I5C (Mod 3)를 포함하는 시험관내 전사 반응물에 의해 제조된 ABCA3 mRNA (서열 번호: 17)로부터의 시험관내 번역을 평가하였다. 본 실험에서 사용된 ABCA3 mRNA 주형은 인간에서의 ABCA3을 위한 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임, 길이가 약 30 A인 폴리A, 캡1 구조를 포함하였고, 이는 UTR (서열 번호: 17)은 포함하지 않았다.
HEK-293 세포로부터의 ABCA-FLAG mRNA 발현 (3개의 생물학적 사본): 간략하면, 1 x 106개의 A549 세포 (3개의 생물학적 사본)를 7.5 ㎍의 ABCA3-FLAG /11.25 ㎕ 메신저 맥스(Messenger Max)로 형질감염시키고, 6 hr 후에 수거하였다. 50 ㎍의 전체 단백질을 겔 상에 로딩하였다. ABCA3-FLAG 검출을 위해: WB를 1:10,000으로 접합된 M2 항 플래그-HRP로 밤새도록 프로빙하고, 펨토 슈퍼 신호 기질을 사용하여 발색시켰다. 도 3은 HEK-293 세포에서의 1) 50% ψ; 2) 100% ψ; 3) 25% s2U + 25% m5C (Mod 1); 4) 50% I5U (Mod 2); 5) 35% I5U + 7.5% I5C (Mod 3)를 포함하는 시험관내 전사 반응물에 의해 전사된 상이한 ABCA-FLAG mRNA; 또는 대조군으로부터의 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다. 도 3에 제시된 바와 같이, NTC = 모의 형질감염된 세포 (mRNA 또는 플라스미드 비포함).
도 4는 A549 세포에서의 유사한 실험의 결과를 나타낸 웨스턴 블롯이다. 도 4는 A549 세포에서의 1) 50% ψ; 2) 100% ψ; 3) 25% s2U + 25% m5C (Mod 1); 4) 50% I5U (Mod 2); 또는 5) 35% I5U + 7.5% I5C (Mod 3)를 포함하는 시험관내 전사 반응물에 의해 전사된 상이한 ABCA-FLAG mRNA로부터의 단백질 발현을 나타낸 것이다.
유사하게, 도 5는 MLE-15 세포에서의 시험관내 ABCA3 mRNA 발현의 결과를 나타낸 웨스턴 블롯이다. 도 5는 MLE-15 세포에서의 1) 50% ψ; 2) 100% ψ; 3) 25% s2U + 25% m5C (Mod 1); 4) 50% I5U (Mod 2); 또는 5) 35% I5U + 7.5% I5C (Mod 3)를 포함하는 시험관내 전사 반응물에 의해 전사된 상이한 ABCA-FLAG mRNA로부터의 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 HEK-293 세포, A549 세포, 및 MLE-15 세포에서의 mRNA 형질감염 후 6시간째의 웨스턴 블롯에 의해 측정된 ABCA3 단백질 발현 수준 비교를 도시한 것이다. 본 결과는 전체 단백질 염색 (SYPRO 루비(SYPRO Ruby))에 대해 정규화된 결과이다. 각 데이터 점은 3개의 생물학적 (형질감염) 복제물의 평균, 오차 막대 +/- 표준 편차이다. 본 도면에 제시된 ABCA3 mRNA는 모두 동일한 서열을 가지며, 이는 동일한 플라스미드로부터 제조되었다. 본 실험에서 사용된 ABCA3 mRNA 주형은 어떤 UTR도 포함하지 않았고, 상기 주형은 ABCA3에 대하여 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임, 길이가 약 30 A인 폴리A, 및 캡1 구조를 가졌다.
실시예 10: 시험관내에서의 ABCA3 mRNA의 면역원성
2개의 세포주에서, 즉, A549 선암종 인간 폐포 기저 상피 세포 및 HepG2 인간 간 암종 세포에서 시토카인 생산을 측정함으로써 상기 언급된 ABCA-FLAG mRNA의 면역원성을 시험하였다. 전사체에 대한 반응으로 나타나는 IL-6 생산은 A549 세포에서 측정한 반면, IP-10 생산은 HepG2 세포에서 측정하였다. 각 세포주를 각 RNA를 적정하여 삼중으로 형질감염시켰다. 간략하면, 형질감염 24시간 전에 96 웰 플레이트에 웰당 20,000개 (A549) 또는 40,000개 (HepG2)의 세포를 플레이팅하였다. 이어서, 1:1.5인 RNA:메신저 맥스 비로 메신저 맥스를 사용하여 세포를 각 전사체를 적정하여 웰당 250 ng 내지 7 ng으로 형질감염시켰다.
형질감염 후 18시간째에 배양물 상청액을 수거하였다. 상청액을 제거한 후 즉시, 대사 활성을 띠는 세포를 나타내는 지표로서 ATP 수준을 측정하는 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 검정용 키트 (프로메가(Promega))를 사용하여 세포 생존가능성을 측정하였다. IL-6 검출을 위해, A549 세포 배양물 상청액을 검정용 완충제 중에 1:20으로 희석시키고, IL-6 고감도 인간 ELISA 키트 (에이비캠(Abcam) ab46042)를 사용하여 IL-6 수준을 측정하였다. IP-10은 인간 IP-10 ELISA 키트 심플스텝(Human IP-10 ELISA Kit SimpleStep) (에이비캠 ab173194)을 사용하여 희석되지 않은 HepG2 세포 배양물 상청액 중에서 검출하였다.
도 7은 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 ABCA3-FLAG mRNA로부터 ABCA3 단백질을 번역하는 A549 세포에서의 IL-6의 유도를 도시한 것이다. IL-6 발현은 ELISA에 의해 측정된 바, 다양한 양의 각 ABCA-FLAG mRNA에 의해 유도되었다. 도 7은 다양한 양의 각 ABCA-FLAG mRNA로의 형질감염 이후의, 셀타이터-글로 검정법을 사용하여 측정된 세포 생존가능성을 도시한 것이다. 도 8은 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 ABCA3-FLAG mRNA로부터 ABCA3 단백질을 번역하는 HepG2 세포에서의 IP-10의 유도를 도시한 것이다. IP-10 발현은 ELISA에 의해 측정된 바, 다양한 양의 각 ABCA-FLAG mRNA에 의해 유도되었다. 도 8은 다양한 양의 각 DNAI1 mRNA로의 형질감염 이후의, 셀타이터-글로 검정법을 사용하여 측정된 세포 생존가능성을 도시한 것이다.
실시예 11: 세포 생존가능성 및 시토카인 유도
도 9-12는 시험관내에서의 세포 생존가능성 및 시토카인 유도의 결과를 도시한 것이다.
방법: 형질감염 24 hr 전에 96 웰 플레이트 상에 A549 세포 (2 x 104개/웰) 또는 HEPG2 세포(4 X 104개/웰) 중 어느 하나를 플레이팅하였다. 1:1.5인 RNA 대 형질감염 시약의 비로 메신저 맥스를 이용하여 형질감염을 수행하였다. 본 실험은 하기 대조군을 이용한다: 양성 대조군: 1. 폴리 I:C를 snim으로서 사용하고, 동일한 농도로 형질감염시켰고; 양성 대조군: 2. mRNA eGFP (트리링크(trilink)). 음성 대조군: 1. 옵티 멤+맥스(Opti Mem+Max) 시약 믹스로 처리된 A549/HEP G2; 및 음성 대조군: 2. 비처리된 A549/ HEP G2 세포. 2개의 생물학적 사본을 3개의 상이한 96 웰 플레이트 상에 플레이팅시켰다.
형질감염 후 18 hr째 상청액을 수거하고, 상청액 제거 후 즉시 세포 생존가능성을 사정하였다. 도 9 및 도 10은 각각 A549 세포 및 HEP G2의 세포 생존가능성을 도시한 것이다. 도 11 및 도 12는 IL-6 및 IP-10의 수준을 측정한 ELISA 검정법의 결과를 도시한 것이다. IL-6 ELISA를 위해, 샘플을 검정을 수행하는 전 기간 동안 내내 검정용 완충제 중에 1:20으로 희석시켰다. IP-10의 경우, 희석되지 않은 샘플을 시험하였다.
실시예 12: 폐 세포에서의 ABCA3 mRNA의 번역을 위한 시간 경과
계대수 10의, 1 x 106개의 A549 세포 (인간 폐 세포)를 이중으로 7.5 ug의 RNA/11.5 메신저 맥스를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 4 h째에 형질감염 배지를 교체하였고, 형질감염 후 상이한 시점: 6 hr, 18 hr, 24 hr, 32 hr 및 48 hr째에 세포를 수거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 실온에서 5 min 동안 트립신으로 처리하였다. FBS 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 정지시키고, 세포를 수집하고, 원심분리하고, 펠릿을 냉 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 펠릿을 냉동시켰다. 일단 샘플 모두를 수집하고 나면, 냉동된 펠릿을 얼음 상에서 해동시키고, TTX 프로토콜에 따라 RIPA 완충제 중에서 용해시켰다. 50 ug의 단백질을 SDS-PAGE에 첨가하였다. 도 13은 시험관내에서 폐 세포에서 서열 번호: 17로부터 발현된 ABCA3 폴리펩티드의 시간 경과에 따른 번역을 나타낸 웨스턴 블롯이다. ABCA3-FLAG 검출을 위해: WB를 1:10,000으로 접합된 M2 항 플래그-HRP로 O/N 동안 프로빙하고, 펨토 슈퍼 신호 기질을 사용하여 발색시켰다.
본원에서 본 발명의 바람직한 실시양태를 제시하고, 기술하였지만, 상기 실시양태는 단지 예로서만 제공된다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명을 명세서 내에서 제공된 구체적인 예로 제한하고자 하지 않는다. 본 발명이 상기 언급된 명세서를 참조로 기술되었지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것으로 의도되지 않는다. 이에, 본 발명으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환이 당업자에게 이루어질 수 있을 것이다. 추가로, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 기술된 특정 서술, 입체배치 또는 상대적인 비율로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러므로, 본 발명은 또한 상기와 같은 임의의 대안, 수정, 변형 또는 등가물도 포괄하여야 한다는 것이 고려된다. 하기의 특허청구범위가 본 발명의 범주를 정의하고, 이들 특허청구범위의 범주 내에 있는 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포괄되어야 하는 것으로 의도된다.
본 출원에 기술된 예시적인 서열은 하기에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 서열 번호: 17, 18, 또는 19에 기재된 서열, 또는 상기 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 중 임의의 것에 상응하거나, 또는 그에 의해 코딩되는 폴리리보뉴클레오티드 서열, 예컨대, an mRNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호: 17 또는 18에 기재된 서열은 포함하되, FLAG 및/또는 myc 태그의 부재하에 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, ABC 패밀리 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 사용하기 위한 5'-UTR은 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 유전자로부터 유래된 비번역 영역, 또는 알파-글로빈 폴리펩티드 유전자로부터, 예컨대, 인간 유전자로부터 유래된 비번역 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, ABC 패밀리 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 사용하기 위한 5'-UTR은 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 16에 기재된 서열을 포함한다. 상기 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드는 변형된다 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 뉴클레오티드 유사체를 포함한다).
서열 목록
Figure 112018008981144-pct00009
Figure 112018008981144-pct00010
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Figure 112018008981144-pct00028
Figure 112018008981144-pct00029
SEQUENCE LISTING <110> ETHRIS GMBH <120> ATP-BINDING CASSETTE FAMILY CODING POLYRIBONUCLEOTIDES AND FORMULATIONS THEREOF <130> IPA171322-DE <140> PCT/EP2016/065321 <141> 2016-06-30 <150> EP 15174677.3 <151> 2015-06-30 <160> 19 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..36 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="CYBA 5‘" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 cgcgcctagc agtgtcccag ccgggttcgt gtcgcc 36 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..64 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="CYBA 3‘" /organism="Artificial Sequence" <400> 2 cctcgccccg gacctgccct cccgccaggt gcacccacct gcaataaatg cagcgaagcc 60 ggga 64 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..66 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="α-globin 5’ UTR (HBA1)" /organism="Artificial Sequence" <400> 3 cataaaccct ggcgcgctcg cggcccggca ctcttctggt ccccacagac tcagagagaa 60 cccacc 66 <210> 4 <211> 66 <212> 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cgccuuccug cugugcuucg ccaucucuac caucuccuuc 1080 agcuucaugg ucagcaccuu cuucagcaaa gccaacaugg cagcagccuu cggaggcuuc 1140 cucuacuucu ucaccuacau ccccuacuuc uucguggccc cucgguacaa cuggaugacu 1200 cugagccaga agcucugcuc cugccuccug ucuaaugucg ccauggcaau gggagcccag 1260 cucauuggga aauuugaggc gaaaggcaug ggcauccagu ggcgagaccu ccugaguccc 1320 gucaacgugg acgacgacuu cugcuucggg caggugcugg ggaugcugcu gcuggacucu 1380 gugcucuaug gccuggugac cugguacaug gaggccgucu ucccagggca guucggcgug 1440 ccucagcccu gguacuucuu caucaugccc uccuauuggu gugggaagcc aagggcgguu 1500 gcagggaagg aggaagaaga cagugacccc gagaaagcac ucagaaacga guacuuugaa 1560 gccgagccag aggaccuggu ggcggggauc aagaucaagc accuguccaa gguguucagg 1620 gugggaaaua aggacagggc ggccgucaga gaccugaacc ucaaccugua cgagggacag 1680 aucaccgucc ugcugggcca caacggugcc gggaagacca ccacccucuc caugcucaca 1740 ggucucuuuc cccccaccag uggacgggca uacaucagcg gguaugaaau uucccaggac 1800 augguucaga uccggaagag ccugggccug ugcccgcagc acgacauccu guuugacaac 1860 uugacagucg cagagcaccu 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auucugggcc auguuccuga agaaggccgc auacagcugg 2760 cgcgagugga aaaugguggc ggcacagguc cuggugccuc ugaccugcgu cacccuggcc 2820 cuccuggcca ucaacuacuc cucggagcuc uucgacgacc ccaugcugag gcugaccuug 2880 ggcgaguacg gcagaaccgu cgugcccuuc ucaguucccg ggaccuccca gcugggucag 2940 cagcugucag agcaucugaa agacgcacug caggcugagg gacaggagcc ccgcgaggug 3000 cucggugacc uggaggaguu cuugaucuuc agggcuucug uggagggggg cggcuuuaau 3060 gagcggugcc uuguggcagc guccuucaga gaugugggag agcgcacggu cgucaacgcc 3120 uuguucaaca accaggcgua ccacucucca gccacugccc uggccgucgu ggacaaccuu 3180 cuguucaagc ugcugugcgg gccucacgcc uccauugugg ucuccaacuu cccccagccc 3240 cggagcgccc ugcaggcugc caaggaccag uuuaacgagg gccggaaggg auucgacauu 3300 gcccucaacc ugcucuucgc cauggcauuc uuggccagca cguucuccau ccuggcgguc 3360 agcgagaggg ccgugcaggc caagcaugug caguuuguga guggagucca cguggccagu 3420 uucuggcucu cugcucugcu gugggaccuc aucuccuucc ucauccccag ucugcugcug 3480 cugguggugu uuaaggccuu cgacgugcgu gccuucacgc gggacggcca cauggcugac 3540 acccugcugc ugcuccugcu 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cgagggacag 1680 atcaccgtcc tgctgggcca caacggtgcc gggaagacca ccaccctctc catgctcaca 1740 ggtctctttc cccccaccag tggacgggca tacatcagcg ggtatgaaat ttcccaggac 1800 atggttcaga tccggaagag cctgggcctg tgcccgcagc acgacatcct gtttgacaac 1860 ttgacagtcg cagagcacct ttatttctac gcccagctga agggcctgtc acgtcagaag 1920 tgccctgaag aagtcaagca gatgctgcac atcatcggcc tggaggacaa gtggaactca 1980 cggagccgct tcctgagcgg gggcatgagg cgcaagctct ccatcggcat cgccctcatc 2040 gcaggctcca aggtgctgat actggacgag cccacctcgg gcatggacgc catctccagg 2100 agggccatct gggatcttct tcagcggcag aaaagtgacc gcaccatcgt gctgaccacc 2160 cacttcatgg acgaggctga cctgctggga gaccgcatcg ccatcatggc caagggggag 2220 ctgcagtgct gcgggtcctc gctgttcctc aagcagaaat acggtgccgg ctatcacatg 2280 acgctggtga aggagccgca ctgcaacccg gaagacatct cccagctggt ccaccaccac 2340 gtgcccaacg ccacgctgga gagcagcgct ggggccgagc tgtctttcat ccttcccaga 2400 gagagcacgc acaggtttga aggtctcttt gctaaactgg agaagaagca gaaagagctg 2460 ggcattgcca gctttggggc atccatcacc accatggagg aagtcttcct 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gcctgaggac 4140 caggatgtgg ccgacgagcg gacaagaatc ctggccccta gccccgatag cctgctgcac 4200 acccccctga tcatcaaaga actgtccaag gtgtacgagc agcgggtgcc actgctggct 4260 gtggacagac tgagtctggc tgtgcagaaa ggcgagtgct tcggactgct gggcttcaac 4320 ggcgcaggca agaccacaac cttcaagatg ctgacaggcg aggaaagcct gacctccggc 4380 gacgcctttg tgggcggaca caggatctct tccgatgtgg gcaaagtgcg gcagcggatc 4440 ggctactgcc ctcagttcga cgccctgctg gatcacatga ccggcaggga aatgctcgtg 4500 atgtacgccc ggctgagggg catccccgag agacacattg gcgcctgcgt ggaaaacacc 4560 ctgcggggcc tgctgctgga accccacgct aacaaactcg tgcggaccta cagcggcggc 4620 aacaagagaa agctgtctac cggcattgca ctgatcggcg agccagccgt gatctttctg 4680 gatgagccca gcacaggcat ggaccccgtg gctcggagac tgctgtggga tacagtggcc 4740 agagccagag agtccggcaa ggccatcatt atcaccagcc acagcatgga agagtgcgag 4800 gccctgtgta caagactggc aattatggtg cagggacagt tcaagtgtct gggcagccct 4860 cagcacctga agtccaagtt cggctccggc tacagcctgc gggccaaggt gcagtctgaa 4920 gggcagcagg aagccctgga agagttcaaa gccttcgtgg acctgacctt ccccggctct 4980 gtgctggaag atgagcacca gggaatggtg cactaccatc tgcctggcag ggacctgtcc 5040 tgggccaaag tgtttggcat cctggaaaag gccaaagaga agtacggcgt ggacgattac 5100 agcgtgtccc agatcagcct ggaacaggtg ttcctgtcct ttgcccatct gcagccccct 5160 accgccgaag agggaaga 5178

Claims (30)

  1. ABCA3 유전자와 연관된 질환을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한, 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
    변형된 폴리리보뉴클레오티드가 ABC-결합 카세트(ABC) 패밀리 구성원을 암호화하고, 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 유전자로부터 유래된 비번역 영역(UTR)을 포함하고, 여기서
    UTR이 (a) 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR, (b) 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR, 또는 (c) 둘 다를 포함하고,
    변형된 폴리리보뉴클레오티드가 i) 5% 내지 50%의 슈도우리딘(Ψ), ii) 15% 내지 30% 2-티오우리딘(s2U) 및 15% 내지 30%의 5-메틸시티딘(m5C), iii) 5% 내지 50% 5-아이오도우리딘(I5U), 또는 iv) 15% 내지 35% 5-아이오도우리딘(I5U) 및 7.5% 내지 30% 5-아이오도시티딘(I5C)을 포함하고,
    변형된 폴리리보뉴클레오티드가 번역 시 ABCA3 폴리펩티드를 생산하고,
    ABCA3 유전자와 연관된 질환이 계면활성제 기능장애(surfactant dysfunction)인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 대상체의 세포 내에서의 번역을 위해 최적화된 코돈 서열을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 조성물이 적어도 약 8인 변형된 폴리리보뉴클레오티드의 포스페이트 기의 몰 대비 양이온성 중합체의 아민 기의 몰의 비를 포함하는, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 최적화된 코돈 서열이 대상체의 세포 내에서 비최적화된 코돈 서열보다 적어도 20% 더 효과적으로 번역되는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 가지는 대상체의 세포에서 소정 기간 동안 폴리펩티드의 발현을 제공하되, 상기 소정 기간이 최대 24시간이고, 여기서 발현이 상기 폴리펩티드를 코딩하는 비변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출되었던 대조군 세포에서의 발현과 비교하여 증진되는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 소정 기간이 적어도 약 30초인, 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 서열 측면에 위치하는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 포함하되, 상기 비코딩 영역이 세포에서의 폴리펩티드의 발현 증진에 도움을 주는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 나노입자 또는 나노캡슐로 제제화되는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 또는 나노에멀젼으로 제제화되는, 조성물.
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  14. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 15% 내지 30%의 5-아이오도우리딘(I5U) 및 15% 내지 30%의 5-아이오도시티딘(I5C)을 포함하는, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 세포 중에서 80% 초과의 형질감염 효율을 가지는, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 발현된 적어도 하나의 염증성 마커의 수준에 변화를 유도하지 않는, 조성물.
  17. 제2항에 있어서, (i) 코돈 서열이 그의 결함 또는 결핍이 질환의 존재와 연관이 있는 유전자 또는 단편이거나, 또는 (ii) 폴리펩티드의 결여 또는 결핍이 질환의 존재와 연관이 있는, 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 변형된 폴리리보뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 비변형된 폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 대상체의 면역 반응을 저하시키며, 면역 반응이 비변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출되었던 대조군에서의 말초 혈액 단핵 세포 중의 적어도 하나의 염증성 마커의 수준과 비교하여, 변형된 폴리리보뉴클레오티드에 노출된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 발현되는 TNF-α, IL-2 및 IL-8로부터 선택되는 적어도 하나의 염증성 마커의 수준으로 측정되는, 조성물.
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