KR102617487B1 - Recombiant kilham rat virus and the use thereof - Google Patents
Recombiant kilham rat virus and the use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR102617487B1 KR102617487B1 KR1020210048174A KR20210048174A KR102617487B1 KR 102617487 B1 KR102617487 B1 KR 102617487B1 KR 1020210048174 A KR1020210048174 A KR 1020210048174A KR 20210048174 A KR20210048174 A KR 20210048174A KR 102617487 B1 KR102617487 B1 KR 102617487B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- recombinant
- virus
- parvovirus
- rat virus
- Prior art date
Links
- 241000724834 Kilham rat virus Species 0.000 title claims abstract description 47
- 241000702620 H-1 parvovirus Species 0.000 claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 61
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 34
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 31
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 abstract description 5
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 6
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 6
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- -1 E2F Proteins 0.000 description 2
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 2
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 description 1
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham rat virus) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 킬함 쥐 바이러스는 야생형 킬함 쥐 바이러스와는 달리 H-1 파보바이러스의 유전자가 도입, 치환되어 인간 암세포에 대한 감염, 사멸유도능을 가질 수 있다. 그에 따라, 상기 재조합 킬함 쥐 바이러스는 항암 치료제로서의 활용 가능성을 제공할 수 있다. The present invention relates to a recombinant Kilham rat virus and its use. Unlike the wild-type Kilham rat virus, the recombinant Kilham rat virus of the present invention has the gene of H-1 parvovirus introduced and replaced, and is effective against human cancer cells. It may have the ability to induce infection and death. Accordingly, the recombinant Kilham rat virus may provide potential for use as an anticancer treatment.
Description
본 발명은 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham rat virus) 제조 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the production of recombinant Kilham rat virus and its use.
암은 전세계적으로 두 번째로 높은 사망 원인이다. 남성 중 ½ 및 여성 중 1/3이 그의 일생 동안 일부 형태의 암 진단을 받게 될 것으로 추정된다. 추가로, 암은 대개 노화 질병이기 때문에, 노인 비율 증가에 기인하여 전세 계 암에 의한 사망수는 2007년부터 2030년까지 약 45% 증가 (사망건이 790만 건에서 1,150만 건으로 증가)할 것으로 예측된다 (WHO 추산, 2008년). 암은 또한 비용이 가장 많이 드는 질환이다. 미국 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 최근 추산에 따르면, 미국에서의 암으로 인한 전체 경제적 비용은 2007년 2,268억 달러였고, 더욱 성공적인 예방적 개입, 조기 검출, 더욱 효과적인 치료법이 개발되었음에도 불구하고, 이러한 거대한 경제적 부담은 다음 20년 동안 더욱 증가할 것으로 예상된다. Cancer is the second leading cause of death worldwide. It is estimated that half of men and one third of women will be diagnosed with some form of cancer during their lifetime. Additionally, because cancer is largely a disease of aging, the number of deaths due to cancer worldwide is expected to increase by approximately 45% from 2007 to 2030 (from 7.9 million to 11.5 million deaths) due to the increasing proportion of older people. (WHO estimate, 2008). Cancer is also the most costly disease. According to recent estimates from the National Cancer Institute, the total economic cost of cancer in the United States was $226.8 billion in 2007, despite the development of more successful preventive interventions, earlier detection, and more effective treatments. This huge economic burden is expected to increase further over the next 20 years.
정상 세포는 손상시키지 않으면서 동시에 암 세포는 사멸시키기 위해 암 특이적 취약성을 이용하는 종양 살상 바이러스는 이러한 암환자들의 암 퇴치를 위한 유망한 도구로서 빠르게 부상하고 있다 (Fountzilas et al., Oncotarget 2017, pp 102617). 다양한 악성 종양에 대한, 단독으로 또는 화학 항암제, 면역 항암제와 함께 조합하여 사용되는 12종 미만의 상이한 종양 살상 바이러스에 대해서 현재 I-III상 임상 시험이 진행되고 있다 (Sivanandam et al., Molecular Therapy Oncolytics 2019, pp 93; Twumasi-Boateng et al., Nature Reviews Cancer, 2018, pp 419). 그 중, 종양 살상 래트 파보바이러스 H-1PV가 현재 재발성 다형성 교모세포종 (GBM) 환자에서의 I/IIa상 임상 시험에서 안전성 및 효능의 제1 징후에 대해서 평가되고 있다 (Geletneky et al., Molecular Therapy, 2017, pp 2620).Oncolytic viruses, which exploit cancer-specific vulnerabilities to kill cancer cells while leaving normal cells intact, are rapidly emerging as a promising tool to combat cancer in these cancer patients (Fountzilas et al., Oncotarget 2017, pp 102617 ). Phase I-III clinical trials are currently underway for less than a dozen different oncolytic viruses against a variety of malignancies, either alone or in combination with chemotherapy or immunotherapy (Sivanandam et al., Molecular Therapy Oncolytics 2019, pp 93; Twumasi-Boateng et al., Nature Reviews Cancer, 2018, pp 419). Among them, the oncolytic rat parvovirus H-1PV is currently being evaluated for safety and first signs of efficacy in phase I/IIa clinical trials in patients with relapsed glioblastoma multiforme (GBM) (Geletneky et al., Molecular Therapy, 2017, pp 2620).
H-1 파보바이러스 (H-1 PV)는 약 5.1 kb 길이의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은 (직경 ~25 nm), 비-외피성 20면체 입자이다. H-1 파보바이러스의 게놈 구조는 두 프로모터, P4 초기 프로모터, 및 P38 후기 프로모터의 제어하에 있는 2개의 전사 유니트로 구성된다. P4는 비-구조 (NS) 단백질 (NS1 및 NS2)를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하고, P38은 캡시드 (VP) 단백질 (VP1, VP2)을 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다. VP1 (83 kDa)와 VP2 (60 kDa)단백질은 같은 mRNA 전사체에서 대체 스플라이싱(alternative splicing)으로 만들어지고 있으며, 두 단백질간 C-말단 아미노산을 공유(593개 아미노산)하고 있으며, VP1 단백질은 N-말단 142 아미노산을 추가적으로 더 가지고 있는 것이다. 비리온(Virion ; 바이러스 20면 구조체)은 약 50개의 VP2 단백질과 약 10개의 VP1 단백질로 구성되어 있는 것으로 알려지고 있다 (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128 ; Bretscher and Marchini., Viruses, 2019, pp 562). 또한, 상기 바이러스는 우선적으로 빠르게 분열 하는 암 세포에서 증식한다. 이러한 종양-선택성은 암성 세포가 바이러스를 더 잘 흡수하는 것에 기초하는 것이 아니라, 암 세포가 바이러스 DNA 복제에 필요한 인자, 예컨대, 사이클린 A, E2F, 또는 CREB/ATF를 과다발현 한다는 사실에 기인하는 것이다. 파보바이러스와 화학요법, HDAC 억제제의 조합, 또는 면역항암제의 조합을 이용한 암 요법이 최근 기술되었다 (WO 2009/083232 A1; WO 2011/113600 A1; Stepanenko et al., 2018, Cancers, pp 492).H-1 parvovirus (H-1 PV) is a small (∼25 nm in diameter), non-enveloped icosahedral particle containing a single-stranded DNA genome approximately 5.1 kb long. The genome structure of H-1 parvovirus consists of two transcription units under the control of two promoters, the P4 early promoter and the P38 late promoter. P4 regulates the expression of genes encoding non-structural (NS) proteins (NS1 and NS2), and P38 regulates the expression of genes encoding capsid (VP) proteins (VP1, VP2). VP1 (83 kDa) and VP2 (60 kDa) proteins are made from the same mRNA transcript through alternative splicing, and the two proteins share C-terminal amino acids (593 amino acids), and the VP1 protein has an additional 142 amino acids at the N-terminus. Virion (viral 20-faceted structure) is known to be composed of approximately 50 VP2 proteins and approximately 10 VP1 proteins (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128; Bretscher and Marchini., Viruses, 2019, pp 562). Additionally, the virus preferentially proliferates in rapidly dividing cancer cells. This tumor-selectivity is not based on the better uptake of the virus by cancerous cells, but rather on the fact that cancer cells overexpress factors required for viral DNA replication, such as cyclin A, E2F, or CREB/ATF. . Cancer therapy using a combination of parvovirus and chemotherapy, HDAC inhibitors, or immunotherapy has recently been described (WO 2009/083232 A1; WO 2011/113600 A1; Stepanenko et al., 2018, Cancers, pp 492).
한편, 래트 파보바이러스 중 하나인 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat virus, KRV)는 특정 래트 스트레인 당뇨병-저항성 (Diabetes-Resistant) 바이오브리딩 (Biobreeeding) 래트에 자가면역 당뇨병을 유도하는 것으로 알려지고 있고 (Guberski et al., 1991, Science pp 1013), 이 때 킬함 쥐 바이러스는 Th2 면역 반응은 낮추고, Th1 면역 반응을 유도하여 자가면역 당뇨병을 일으키는 것으로 그 기전을 설명하고 있다 (Chung et al., Journal of Immunology, 2000, pp 2866). 킬함 쥐 바이러스는 래트 세포주 (Normal rat kidney : NRK)에 대해서는 감염 및 사멸능을 가지고 있으나, 인간 암세포 (Chang 세포주)에 대해서는 H-1 파보바이러스와 달리 감염성 및 세포 사멸능을 가지고 있지 않는다 (Chung Young-Hwa, 캐나다 캘거리 박사학위 논문, 1998, pp 217). Meanwhile, Kilham Rat virus (KRV), one of the rat parvoviruses, is known to induce autoimmune diabetes in certain rat strains of Diabetes-Resistant and Biobreeding rats (Guberski et al. al., 1991, Science pp 1013), in which the mechanism of the Kilham rat virus is explained as causing autoimmune diabetes by lowering the Th2 immune response and inducing a Th1 immune response (Chung et al., Journal of Immunology, 2000, pp 2866). Kilham rat virus has the ability to infect and kill rat cell lines (Normal rat kidney: NRK), but unlike H-1 parvovirus, it does not have the ability to infect and kill human cancer cells (Chang cell line) (Chung Young -Hwa, PhD thesis, Calgary, Canada, 1998, pp 217).
H-1 파보바이러스를 다른 종, 예를 들면 개, 고양이, 돼지, 마우스 파보바이러스들 간에 제일 중요 캡시드 단배질 VP2 아미노산 서열을 비교 분석하였을 때, 다른 부위 (Variable Region ;VR) 10군데가 있음을 알게 되었고 (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128), 이에 본 발명의 발명자들은 래트 파보바이러스인 H-1 파보바이러스와 킬함 쥐 바이러스의 상관성 및 적용, 활용 가능성을 연구한 결과, VP2 캡시드 단백질 아미노산 서열이 상대적으로 많이 다른 5군데 VR(VR0,VR2, VR4b, VR6, 그리고 VR8)에 주목하였고, H-1 파보바이러스 VP2 유전자의 이들 VR를 포함하는 여러 도메인(domain) 조합들을 인간 암세포에 대한 감염, 사멸능력이 없는 킬함 쥐 바이러스 VP2 유전자와 치환하여 제조된 재조합 킬함 쥐 바이러스가 인간 암세포에 사멸능력을 획득하는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다. When the VP2 amino acid sequence of the most important capsid protein was compared and analyzed between H-1 parvovirus and other species, such as dog, cat, pig, and mouse parvoviruses, it was found that there were 10 different regions (Variable Region (VR)). (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128), and the inventors of the present invention studied the correlation, application, and usability of H-1 parvovirus, a rat parvovirus, and Kylham rat virus, and as a result, VP2 We focused on five VRs (VR0, VR2, VR4b, VR6, and VR8) whose capsid protein amino acid sequences are relatively different, and several domain combinations including these VRs of the H-1 parvovirus VP2 gene were used in human cancer cells. The present invention was completed by confirming that the recombinant Kielham rat virus produced by substituting the VP2 gene of the Kielham rat virus, which does not have the ability to infect or kill, acquired the ability to kill human cancer cells.
본 발명의 일 양상은 H-1 파보바이러스의 유전자가 도입된 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV)를 제공하는 것을 목적으로 한다.One aspect of the present invention aims to provide a recombinant Kilham Rat Virus (KRV) into which the H-1 parvovirus gene has been introduced.
본 발명의 일 양상은 H-1 파보바이러스의 유전자가 도입된 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV)를 제공한다.One aspect of the present invention provides a recombinant Kilham Rat Virus (KRV) into which the H-1 parvovirus gene has been introduced.
상기 H-1 파보바이러스 (H-1 PV)는 쥐에서 발견된 5.1 kb 길이의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은 (직경 ~25 nm), 비-외피성 20면체 입자로서, 인간 암세포에 대한 감염, 사멸능을 가진 바이러스이다.The H-1 parvovirus (H-1 PV) is a small (~25 nm in diameter), non-enveloped icosahedral particle containing a 5.1 kb long single-stranded DNA genome found in mice and capable of infecting human cancer cells. , It is a virus with the ability to kill.
상기 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV) 또한 쥐에서 유래된 파보 파이러스 중 하나로서 특정 인간 암세포에 대한 감염, 사멸능은 없다. The Kilham Rat Virus (KRV) is also one of the parvopyruses derived from mice and does not have the ability to infect or kill specific human cancer cells.
본 발명에 있어서, "도입" 이란 외부로부터 주어진 DNA를 벡터를 이용하여 어떤 대상 내에 이식하는 것을 의미하며, 즉 생물의 어떤 계통의 대상에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 벡터로 제한효소와 변형효소로 주입하였을 때, 그 재조합된 벡터로 주입된 유전정보로 인하여, 유전형질이 변화하는 현상이다. 즉, "도입"이란 특정 유전자를 어떤 벡터 내에 도입하여 새로운 재조합된 유전정보가 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다.In the present invention, "introduction" means transplanting DNA given from outside into a target using a vector, that is, DNA, a type of nucleic acid extracted from a target of a certain species of organism, is modified with restriction enzymes in another vector. This is a phenomenon in which genetic traits change due to the genetic information injected into the recombinant vector when injected with an enzyme. In other words, “introduction” means introducing a specific gene into a vector so that new, recombinant genetic information can be expressed.
본 발명의 일 구체적인 예로 상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 H-1 파보바이러스의 캡시드 VP2 유전자 VR2에서 VR8전까지, 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위의 유전자일 수 있고, 더욱 구체적으로, H-1 파보바이러스의 208K-554Q 또는 208K-435L 위치의 유전자일 수 있으며, 가장 구체적으로, 상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 서열번호 1 또는 2일 수 있다. As a specific example of the present invention, the gene of the H-1 parvovirus may be the gene of the capsid VP2 gene of the H-1 parvovirus from VR2 to before VR8, or from VR2 to before VR4b, and more specifically, the H-1 parvovirus It may be the gene at position 208K-554Q or 208K-435L of the virus, and most specifically, the gene of the H-1 parvovirus may be SEQ ID NO: 1 or 2.
H-1 파보바이러스는 킬함 쥐 바이러스와 염기서열의 유사도가 높으나 (유전자 염기배열 측면에서 NS1와 NS2 유전자 99.8%, VP1 86.2 %, VP2 83.3%), 암 세포에 따른 다른 감염성 패턴 (tropism)이 나타나는 것을 확인하였다. 구체적으로, H-1 파보바이러스는 쥐 세포주(Normal Rat Kideny)와 인간 암세포 (HeLa; 사람 자궁경부암세포) 에 대하여 감염 및 세포사멸능을 보이고 있으나, 킬함 쥐 바이러스는 쥐세포주에만 감염 및 세포사멸능을 보이고 있으나, HeLa 세포주에서 감염. 세포 사멸능을 보이지 않고 있다. H-1 parvovirus has a high degree of similarity in base sequence with the Kylham rat virus (99.8% for NS1 and NS2 genes, 86.2% for VP1, 83.3% for VP2 in terms of gene base sequence), but shows different infectivity patterns (tropism) depending on cancer cells. confirmed. Specifically, H-1 parvovirus shows infection and apoptosis ability against rat cell lines (Normal Rat Kidney) and human cancer cells (HeLa; human cervical cancer cells), but Killham rat virus only infects and kills mouse cell lines. However, infection occurs in HeLa cell lines. It does not show cell death ability.
이에 킬함 쥐 바이러스와 H-1 파보바이러스 사이에 아미노산 서열이 상대적으로 많이 차이나는 VR이 5군데 존재함을 알았으며 (KRV 기준으로 VR0 (88-99), VR2 (224-242), VR4b (430-441), VR6 (385-363) 그리고 VR8 (549-557); 도 1), 이들 정보에 기초하여 재조합 킬함 쥐 바이러스를 제조하였다. 구체적으로, 인간 암세포에 감염하여 사멸능력이 없는 킬함 쥐 바이러스 캡시드 VP2 유전자에 H-1 파보바이러스 캡시드 VP2 유전자의 VR를 포함하는 도메인(domain) 조합들로 치환하면서, H-1 파보바이러스의 VP2 유전자내 어느 도메인이 킬함 쥐 바이러스가 인간 암세포에 사멸능을 획득하게 하는지 확인하였고, 그 결과, H-1 파보바이러스 VP2 유전자 중 VR2 부터 VR8전 또는 VR2부터 VR4b 전까지 해당하는 부위를 포함하는 재조합 킬함 쥐바이러스(YCH9 와 YCH10)만이 감염성을 나타냄을 알 수 있었으며 (도 4B), 이 재조합 바이러스들은 사람 자궁경부암세포주 (HeLa) 뿐만 아니라, 사람 췌장암 세포주 (Panc-1), 사람 대장암 세포주 (HCT116) 도 감염, 사멸시킴을 알 수 있었다 (실시예 5, 6). 이렇게 재조합된 킬함 쥐 바이러스를 암환자 치료를 위한 항암바이러스 치료제로서의 활용가능성이 있다. Accordingly, it was found that there are five VRs with relatively large amino acid sequence differences between the Killham rat virus and H-1 parvovirus (based on KRV, VR0 (88-99), VR2 (224-242), and VR4b (430). -441), VR6 (385-363) and VR8 (549-557); Figure 1), and recombinant Kilham rat virus was prepared based on this information. Specifically, the Killham rat virus capsid VP2 gene, which has no ability to infect and kill human cancer cells, was replaced with domain combinations including the VR of the H-1 parvovirus capsid VP2 gene, and the VP2 gene of the H-1 parvovirus was replaced. We identified which domain allows the Kylham rat virus to acquire the ability to kill human cancer cells, and as a result, a recombinant Kylham rat virus containing the corresponding region from VR2 to VR8 or VR2 to VR4b of the H-1 parvovirus VP2 gene. Only (YCH9 and YCH10) were found to be infectious (Figure 4B), and these recombinant viruses not only infected human cervical cancer cell line (HeLa), but also human pancreatic cancer cell line (Panc-1) and human colon cancer cell line (HCT116). , it was found that it was killed (Examples 5 and 6). There is a possibility of using this recombinant Kilham rat virus as an anti-cancer virus treatment for treating cancer patients.
본 발명의 일 구체예로 상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 킬함 쥐 바이러스의 VR2 영역을 포함하는 영역의 유전자를 치환시키는 것일 수 있으며, 상기 킬함 쥐 바이러스의 VR2 영역을 포함하는 영역은 킬함 쥐 바이러스 의 203K-548Q, 또는 203K-429L 위치의 유전자일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the gene of the H-1 parvovirus may be substituted for the gene of the region containing the VR2 region of the Kylham rat virus, and the region containing the VR2 region of the Kylham rat virus may be substituted for the gene of the region containing the VR2 region of the Kylham rat virus. It may be the gene at position 203K-548Q, or 203K-429L.
전술한 바와 같이, 인간 암세포에 대한 감염성을 가진 H-1 파보바이러스와 인간 암세포에 대한 감염성이 없는 킬함 쥐 바이러스의 유사성에 기초하여 H-1 파보바이러스의 VP2 유전자 서열을 킬함 쥐 바이러스 VP2 유전자에 도입하였으며, 구체적으로, H-1 파보바이러스의 VR2에서 VR8전, 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위의 유전자, 더욱 구체적으로, H-1 파보바이러스의 208K-208K-435L 또는 208K-554Q 위치의 유전자, 가장 구체적으로, 서열번호 1 또는 2 H-1 파보바이러스의 유전자를 킬함 쥐 바이러스내 대응되는 위치에 치환, 도입한 것으로, H-1 파보바이러스의 유전자가 도입된 재조합 킬함 쥐 바이러스는 인간 암세포에 감염, 사멸능을 가지게 되며, 이는 감염 후 캡슐화가 가능한 것 또한 의미한다. As described above, based on the similarity between H-1 parvovirus, which has infectivity for human cancer cells, and Killham rat virus, which is not infective for human cancer cells, the VP2 gene sequence of H-1 parvovirus was introduced into the VP2 gene of Killham rat virus. Specifically, the gene in the region from VR2 to VR8 or from VR2 to VR4b of H-1 parvovirus, more specifically, the gene at position 208K-208K-435L or 208K-554Q of H-1 parvovirus, most Specifically, the gene of SEQ ID NO. 1 or 2 H-1 parvovirus is replaced or introduced into the corresponding position in the Killham mouse virus, and the recombinant Killham mouse virus into which the gene of H-1 parvovirus is introduced infects human cancer cells. It has the ability to kill, which also means that encapsulation is possible after infection.
상기 서열번호 1 또는 2의 유전자 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 유전자 서열이라면 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. The gene sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 and at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, even more specifically at least 95%, even more specifically at least 98%, most specifically Any gene sequence showing 99% or more homology may be included in the scope of the present invention.
나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호 1 또는 2의 유전자와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 유전자 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.Furthermore, if it is a gene sequence that is homologous to the above sequence and has a biological activity that is substantially the same as or corresponds to the gene of SEQ ID NO: 1 or 2, even if some of the sequences have deletions, modifications, substitutions, or additions. It is obvious that it is included within the scope of the present invention.
본 발명에서 용어 "상동성"은 주어진 유전자 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시 될 수 있다. 본 발명에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건 하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989 참고), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.In the present invention, the term “homology” refers to the degree of matching with a given gene sequence and can be expressed as a percentage. In the present invention, a given amino acid sequence or base sequence and its homologous sequence having the same or similar activity are expressed as “% homology”. For example, using standard software, specifically BLAST 2.0, to calculate parameters such as score, identity and similarity, or by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions. can be confirmed by comparing, and the appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the relevant technology (e.g., see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989) and can be determined by methods well known to those skilled in the art.
다음으로, 상기 H-1 파보바이러스의 유전자 서열을 도입하는 방법은, 특별히 한정되지 않으나, 핵산 서열을 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행할 수 있다. 구체적인 상기 도입 방법은 공지의 방법을 활용할 수 있고, 구체적으로는 재조합 벡터를 활용하여 이루어질 수 있다. Next, the method of introducing the gene sequence of the H-1 parvovirus is not particularly limited, but can be performed by inducing mutations in the expression control sequence by non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence or a combination thereof. The specific introduction method may utilize a known method, and specifically, may be accomplished using a recombinant vector.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주에서 상기 목적 유전자를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 유전자 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주에서 발현 가능할 수 있다.In the present invention, the "recombinant vector" can be used as a target gene expression vector that can express the target gene with high efficiency in an appropriate host when the target gene to be expressed is operably linked. may be expressed in the host.
본 발명에 있어서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 제한 효소와 연결효소 등을 사용한다.In the present invention, “operably linked” means that a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest are functionally linked to perform a general function. For example, a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA can be operably linked to affect the expression of the coding sequence. Operational linkage with a recombinant vector can be made using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cutting and ligation uses restriction enzymes and ligases commonly known in the art. .
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. The recombinant vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and can be produced using any vector known in the art.
본 발명의 재조합 킬함 쥐 바이러스는 야생형 킬함 쥐 바이러스와는 달리 H-1 파보바이러스의 유전자가 도입, 치환되어 인간 암세포에 대한 감염, 사멸유도능을 가질 수 있다. 그에 따라, 상기 재조합 킬함 쥐 바이러스는 항암 치료제로서의 활용 가능성이 있다. The recombinant Kielham rat virus of the present invention, unlike the wild-type Kielham rat virus, has the ability to infect and induce death of human cancer cells by introducing and replacing the H-1 parvovirus gene. Accordingly, the recombinant Kilham rat virus has the potential to be used as an anticancer treatment.
도 1은 킬함 쥐 바이러스와 H-1 파보바이러스 VP2 캡시드 단백질 간 아미노산을 비교한 도면이다.
도 2는 킬함 쥐 바이러스의 VP2 캡시드 단백질 유전자에 대한 재조합 디자인을 나타내는 도면이다.
도 3은 재조합 킬함 쥐 바이러스 벡터의 클로닝 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 재조합 킬함 쥐 바이러스 벡터의 형질 주입(transfection)을 통하여 재조합 킬함 쥐 바이러스 제조한 결과이다.
도 5는 재조합 킬함 쥐 바이러스가 야생형 킬함 쥐 바이러스와 달라진 세포 감염성 패턴을 확인한 결과이다.
도 6은 인간 췌장암과 대장암 세포주에 대한 재조합 킬함 쥐 바이러스의 감염성을 확인한 결과이다.Figure 1 is a diagram comparing amino acids between Khilham rat virus and H-1 parvovirus VP2 capsid proteins.
Figure 2 is a diagram showing the recombinant design for the VP2 capsid protein gene of Khilham rat virus.
Figure 3 shows the results of confirming cloning of the recombinant Kilham rat virus vector.
Figure 4 shows the results of producing a recombinant Kilham mouse virus through transfection of a recombinant Kilham mouse virus vector.
Figure 5 shows the results of confirming the cell infectivity pattern of the recombinant Kielham mouse virus is different from that of the wild-type Kielham mouse virus.
Figure 6 shows the results of confirming the infectivity of the recombinant Kilham rat virus on human pancreatic cancer and colon cancer cell lines.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more specific examples will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate one or more embodiments and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: H-1 파보바이러스와 킬함 쥐 바이러스 VP2 캡시드 단백질 아미노산 비교Example 1: Comparison of H-1 parvovirus and Khilham rat virus VP2 capsid protein amino acids
Genbank에 기탁된 H-1 파보바이러스(JX505432)의 VP2 단백질 아미노산 순서 배열과 킬함 쥐 바이러스 VP2 단백질 아미노산 서열을 비교하였다. The amino acid sequence of the VP2 protein of H-1 parvovirus (JX505432) deposited in Genbank was compared with the amino acid sequence of the VP2 protein of Khilham rat virus.
그 결과, 각 파보바이러스 VP2 서열간 아미노산 서열에 차이가 나는 10 곳이 보고 (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128)되었으나, 5 곳 VR에서 확연히 다른 아미노산 서열을 확인하였고, 두 바이러스 간 VP2 캡시드 단백질 VR0, VR2, VR6, VR4b, 그리고 VR8에서 크게 차이가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1).As a result, 10 amino acid sequence differences between each parvovirus VP2 sequence were reported (Halder et al., Journal of Virology, 2013, pp 5128), but significantly different amino acid sequences were confirmed in 5 VR locations, and the two viruses It was confirmed that there were significant differences in the liver VP2 capsid proteins VR0, VR2, VR6, VR4b, and VR8 (Figure 1).
실시예 2: 킬함 쥐 바이러스의 VP2 캡시드 단백질 유전자에 대한 재조합 디자인Example 2: Recombinant design for the VP2 capsid protein gene of Khilham rat virus
킬함 쥐 바이러스와 H-1 파보바이러스의 제한 효소 Hind III 와 Hpa I사이의 유전자(VP2 유전자와 극히 일부 VP1 5’ 말단 유전자 포함) 간에 VR을 고려하여 도 2와 같이 여러 가지 조합으로 재조합 VP2 유전자를 디자인하였다.Considering the VR between the genes between the restriction enzymes Hind III and Hpa I of Kilham rat virus and H-1 parvovirus (including the VP2 gene and very few VP1 5' end genes), recombinant VP2 genes were prepared in various combinations as shown in Figure 2. Designed.
실시예 3: 재조합 킬함 쥐 바이러스 벡타의 클로닝 및 확인 Example 3: Cloning and identification of recombinant Kielham murine virus vector
실시예 2에서 디자인된 재조합된 VP2 유전자를 합성(Bioneer, 대전)하고, pBHA 벡타에 삽입하여 준비하였다. 도 3A와 같은 방법으로 pSR19 벡타 (네브라스카 의대 S. Rhode 교수로부터 얻음)에 제한 효소 Hind III와 Hpa I을 이용하여 야생형 H-1 유전자 VP2 유전자를 제거하고, 같은 제한 효소로 자른 재조합된 킬함 쥐 바이러스 VP2 유전자를 도입하였다. The recombinant VP2 gene designed in Example 2 was synthesized (Bioneer, Daejeon) and inserted into pBHA vector. In the same manner as in Figure 3A, the wild-type H-1 gene VP2 gene was removed from the pSR19 vector (obtained from Professor S. Rhode of the University of Nebraska Medical Center) using restriction enzymes Hind III and Hpa I, and the recombinant Kilham rat virus was cut with the same restriction enzymes. The VP2 gene was introduced.
재조합된 킬함 쥐 바이러스 VP2 유전자가 도입된 재조합 pSR19 벡터는 E.Coli 에 형질전환 (Transformation)하여 항생제 (Ampicillin) 들어 있는 고체배지에서 콜로니 (Colony)들을 고른다. 이러한 콜로니들로부터 DNA 분리 미니 키트를 이용하여 플라즈미드 (Plasmid)를 분리한다. 이렇게 분리된 플라즈미드를 제한효소 Hind III 와 재조합 VP2 유전자 합성하면서 새롭게 도입된 Not I을 이용하여, 잘라 1.2% DNA 젤에서 약 2.0 Kb 유전자 조각이 나오는지, 그 포지티브 클론을 확인하였다 (도 3B). The recombinant pSR19 vector into which the recombinant Kilham rat virus VP2 gene is introduced is transformed into E.Coli and colonies are selected on a solid medium containing antibiotics (Ampicillin). Plasmid is isolated from these colonies using a DNA isolation mini kit. The isolated plasmid was cut using the newly introduced Not I while synthesizing the recombinant VP2 gene with the restriction enzyme Hind III, and a positive clone was confirmed by determining whether a 2.0 Kb gene fragment was released on a 1.2% DNA gel (Figure 3B).
실시예 4: 재조합 킬함 쥐 벡타의 형질주입부터 재조합 킬함 쥐 바이러스 제조 가능성 확인 Example 4: Confirmation of feasibility of producing recombinant Kylham rat virus from transfection of recombinant Kylham rat vector
전면 성장된 Rat1 세포주를 12 well plate에 well 당 2x105 cells 분획하여 37oC, 5% CO2 배양기에 넣어 12시간 배양한다. 70-80% 전면성장된 것을 확인하고, 각 재조합 킬함 쥐 바이러스 벡터 (2 νg)를 Opti-MRM I 배지 (50 νL)와 Lipofectamine 3000 (4 νL) 가 들어있는 튜브에 넣어 섞어, 10 분 동안 상온에 방치한 다음 세포주에 한 방울씩 떨어드려, 5일간 배양하였다. 5일 뒤에 상층액뿐만 아니라 부착된 각 세포주를 같이 회수하였다. 회수된 세포용해액은 바이러스 파티클이 형성되었는지 면역 블로팅으로 확인하였다. The fully grown Rat1 cell line was divided into 2x10 5 cells per well in a 12 well plate, placed in an incubator at 37 o C, 5% CO 2 and cultured for 12 hours. After confirming 70-80% complete growth, each recombinant Killham rat virus vector (2 νg) was mixed in a tube containing Opti-MRM I medium (50 νL) and Lipofectamine 3000 (4 νL), and incubated at room temperature for 10 minutes. Then, droplets were added to the cell lines and cultured for 5 days. Five days later, not only the supernatant but also each attached cell line was recovered. The recovered cell lysate was confirmed by immunoblotting to see if virus particles were formed.
그 결과 도 4A에서 확인되는 바와 같이 YCH4, YCH6, YCH9 그리고 YCH10가 재조합 바이러스 파티클이 형성됨을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 4A, it was confirmed that YCH4, YCH6, YCH9, and YCH10 formed recombinant virus particles.
상기의 재조합 킬함 쥐 바이러스 벡터로 형질 주입(Transfection) Rat1 세포주 의 세포용해액(Cell lysates)은 동결-해동을 3차례 반복하여, 세포내 만들어진 제조합 킬함 쥐 바이러스가 세포 밖으로 나올 수 있도록 하여, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상층액만을 재조합 킬함 쥐 바이러스 파티클로 사용하였다. HeLa 세포주 (인간 자궁경부암)를 6 well plate에 계대배양 후 12시간 뒤에, 60-70% 전면성장된 것을 확인하고, 넣어주었던 배지를 들어내고, 제조된 바이러스 파티클이 포함된 세포 용해액 (2 ml)를 HeLa 세포주 위에 넣어 주고 1시간 동안 37oC, 5% CO2 배양기에 배양하고, 그 후에 다시 배지 3 ml를 넣어 5일간 배양하였다. 5일후에 HeLa 세포주는 회수되어 면역 브라팅으로 감염성 재조합 킬함 쥐 바이러스가 제조되었는지 확인하였다.Cell lysates of the Rat1 cell line transfected with the above recombinant Killham rat virus vector were frozen and thawed three times to allow the recombinant Killham rat virus created inside the cells to come out of the cells, 3000 After centrifugation at rpm for 10 minutes, only the supernatant was used as recombinant Killham rat virus particles. 12 hours after subculturing the HeLa cell line (human cervical cancer) in a 6 well plate, confirm that 60-70% full growth was observed, remove the medium, and add the cell lysate (2 ml) containing the prepared virus particles. ) was placed on the HeLa cell line and cultured in an incubator at 37 o C, 5% CO 2 for 1 hour, and then 3 ml of medium was added again and cultured for 5 days. Five days later, the HeLa cell line was recovered and confirmed by immunoblotting to confirm that infectious recombinant Kylham rat virus was produced.
그 결과 도 4B에서 확인되는 바와 같이, YCH4 와 YCH6은 바이러스 파티클은 형성되었지만, 감염성 바이러스가 형성되지 못하였다. 하지만 YCH9와 YCH10 재조합 킬함 쥐 바이러스 가 생성되었음을 알 수 있었다. As a result, as confirmed in Figure 4B, virus particles were formed in YCH4 and YCH6, but infectious viruses were not formed. However, it was found that YCH9 and YCH10 recombinant Kilham mouse viruses were produced.
실시예 5: 재조합 킬함 쥐 바이러스의 감염성 패턴 변화 확인Example 5: Confirmation of changes in infectivity pattern of recombinant Kilham rat virus
야생형 킬함 쥐 바이러스는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구매하였으며, H-1 파보바이러스는 S. Rhode 박사(미국, 네브라스카 의대)로부터 얻은 pSR19 벡타(H-1전체 게놈이 들어 있는 벡타)로부터 HeLa 세포주에 형질주입 (transfection)하여, 야생형 H-1 파보바이러스를 자체적으로 준비하였다. Wild-type Kilham mouse virus was purchased from ATCC (Manassas, VA, USA), and H-1 parvovirus was obtained from HeLa pSR19 vector (vector containing the entire H-1 genome) obtained from Dr. S. Rhode (Medicine University of Nebraska, USA). Wild-type H-1 parvovirus was prepared in-house by transfection into cell lines.
포지티브 바이러스로 야생형 H-1 파보바이러스, 네가티브 바이러스로 야생형, 그리고 제조된 재조합 킬함 쥐바이러스 (YCH9와 YCH10)을 NRK(Normal Rat Kindey) 세포주와 HeLa 세포주에 감염시켜 3일 뒤에 세포 사멸을 현미경 관찰과 노란색의 수용성 tetrazolium 을 처리하면 세포내 미토콘드리아의 탈 수소 효소에 의하여 tetrazolium 의 ring 구조가 끊어져, 청자색의 비 수용성 물질 formazan으로 전환되는 MTT 방법으로 조사하였다. NRK (Normal Rat Kindey) cell line and HeLa cell line were infected with wild type H-1 parvovirus as positive virus, wild type as negative virus, and manufactured recombinant Killham rat virus (YCH9 and YCH10), and cell death was observed 3 days later by microscopic observation. When treated with yellow water-soluble tetrazolium, the ring structure of tetrazolium is broken by intracellular mitochondrial dehydrogenase and converted to formazan, a bluish-purple insoluble substance. This was investigated using the MTT method.
그 결과 NRK 세포주에서는 야생형 H-1 파보바이러스, 야생형 킬함 쥐 바이러스, 그리고 재조합 킬함 쥐 바이러스 (YCH9 와 YCH10)에 감염에 대하여 세포사멸을 나타내었다 (도 5 A). 하지만 HeLa (인간 자궁경부암) 세포주는 야생형 킬함 쥐 바이러스 감염에 저항성을 나타내고 있으며, 야생형 H-1 파보바이러스에 대하여 민감성을 나타내며 세포사멸을 보이고 있다. 그리고 재조합 킬함 쥐 바이러스 (YCH9, YCH10)에 대하여서도 야생형 H-1 파보바이러스처럼 민감성을 나타내며 세포사멸 현상을 확인하였다 (도 5B). As a result, the NRK cell line showed apoptosis upon infection with wild-type H-1 parvovirus, wild-type Kylham rat virus, and recombinant Kylham rat virus (YCH9 and YCH10) (Figure 5A). However, the HeLa (human cervical cancer) cell line is resistant to wild-type Killham rat virus infection, is sensitive to wild-type H-1 parvovirus, and shows apoptosis. In addition, it was as sensitive to the recombinant Kilham rat virus (YCH9, YCH10) as the wild-type H-1 parvovirus, and cell death was confirmed (Figure 5B).
이러한 결과를 통해 H-1 파보바이러스의 VR2에서 VR8전까지 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위 (H-1 파보바이러스 기준으로 208K- 554Q, 또는 208K-435L)가 도입된 재조합 킬함 쥐 바이러스의 경우 야생형 킬함 쥐 바이러스와 다른 감염성 패턴을 나타내고, 상기 H-1 파보바이러스의 VR2에서 VR8전까지 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위가 인간 암세포 특이적 감염 패턴을 나타냄을 확인하였다.These results show that in the case of the recombinant Khilham rat virus introduced with the region from VR2 to VR8 or from VR2 to VR4b of H-1 parvovirus (208K-554Q or 208K-435L based on H-1 parvovirus), the wild-type Kylham mouse virus It was confirmed that it showed an infectivity pattern different from that of the virus, and that the region from VR2 to pre-VR8 or VR2 to pre-VR4b of the H-1 parvovirus showed a human cancer cell-specific infection pattern.
실시예 6: 재조합 킬함 쥐 바이러스의 다른 종류의 인간 암세포 감염성 및 사멸능 확인Example 6: Confirmation of infectivity and killing ability of recombinant Kilham rat virus on different types of human cancer cells
포지티브 바이러스로 야생형 H-1 파보바이러스, 네가티브 바이러스로 야생형, 그리고 제조된 재조합 킬함 쥐바이러스 (YCH9와 YCH10)을 인간 Panc-1 췌장암과 대장암 HCT116 세포주에 감염시켜 3일 뒤에 세포사멸을 현미경 관찰과 상기한 MTT 방법으로 조사하였다. Human Panc-1 pancreatic cancer and colon cancer HCT116 cell lines were infected with wild-type H-1 parvovirus as a positive virus, wild-type as a negative virus, and manufactured recombinant Killham rat virus (YCH9 and YCH10), and cell death was observed 3 days later by microscopic observation. The investigation was conducted using the MTT method described above.
그 결과, 전술한 바와 같이 인간 HeLa 자궁경부암 세포주에서 관찰되었듯이, Panc-1 와 HCT116세포주는 야생형 킬함 쥐 바이러스 감염에 대하여 저항성을 확인하였다. 하지만 재조합 킬함 쥐 바이러스(YCH9, YCH10)는 야생형 H-1 파보바이러스처럼 Panc-1와 HCT116세포주에 대하여 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다 (도 6). As a result, as observed in the human HeLa cervical cancer cell line as described above, the Panc-1 and HCT116 cell lines were confirmed to be resistant to wild-type Kylham rat virus infection. However, the recombinant Kilham rat virus (YCH9, YCH10) was confirmed to induce apoptosis in Panc-1 and HCT116 cell lines like wild-type H-1 parvovirus (FIG. 6).
이러한 결과를 통해 H-1 파보바이러스의 VR2에서 VR8전까지 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위(H-1 파보바이러스 기준으로 208K- 554Q 또는 208K-435L)가 인간 암세포 특이적 감염을 결정짓는 중요한 특성을 가지고 있는 것을 재확인하였다. These results show that the region from VR2 to VR8 or VR2 to VR4b of H-1 parvovirus (H-1 parvovirus As a reference, it was reconfirmed that 208K-554Q or 208K-435L) has important characteristics that determine specific infection of human cancer cells.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been examined focusing on its preferred embodiments. A person skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a restrictive perspective. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope should be construed as being included in the present invention.
<110> HaYoung Meditech Inc. Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> RECOMBIANT KILHAM RAT VIRUS AND THE USE THEREOF <130> PN210046 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-1PV 208K-554Q <400> 1 aaaccaaccg caccagctcc ttacagatac tactttttca tgcctagaca actcagtgta 60 acctctagca actctgctga aggaactcaa atcacagaca ccattggaga gccacaggca 120 ctaaactctc aattttttac tattgagaac accttgccta ttactctcct gcgcacaggt 180 gatgagttta caactggcac ctacatcttt aacactgacc cacttaaact tactcacaca 240 tggcaaacca acagacactt gggcatgcct ccaagaataa ctgacctacc aacatcagat 300 acagcaacag catcactaac tgcaaatgga gacagatttg gatcaacaca aacacagaat 360 gtgaactatg tcacagaggc tttgcgcacc aggcctgctc agattggctt catgcaacct 420 catgacaact ttgaagcaaa cagaggtggc ccatttaagg ttccagtggt accgctagac 480 ataacagctg gcgaggacca tgatgcaaac ggagccatac gatttaacta tggcaaacaa 540 catggcgaag attgggccaa acaaggagca gcaccagaaa ggtacacatg ggatgcaatt 600 gatagtgcag ctgggaggga cacagctaga tgctttgtac aaagtgcacc aatatctatt 660 ccaccaaacc aaaaccagat cttgcagcga gaagacgcca tagctggcag aactaacatg 720 cattatacta atgtttttaa cagctatggt ccacttagtg catttcctca tccagatccc 780 atttatccaa atggacaaat ttgggacaaa gaattggacc tggaacacaa acctagacta 840 cacgtaactg caccatttgt ttgtaaaaac aacccaccag gtcaactatt tgttcgcttg 900 gggcctaatc tgactgacca atttgaccca aacagcacaa ctgtttctcg cattgttaca 960 tatagcactt tttactggaa gggtattttg aaattcaaag ccaaactaag accaaatctg 1020 acctggaatc ctgtatacca a 1041 <210> 2 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-1PV 208K-435L <400> 2 aaaccaaccg caccagctcc ttacagatac tactttttca tgcctagaca actcagtgta 60 acctctagca actctgctga aggaactcaa atcacagaca ccattggaga gccacaggca 120 ctaaactctc aattttttac tattgagaac accttgccta ttactctcct gcgcacaggt 180 gatgagttta caactggcac ctacatcttt aacactgacc cacttaaact tactcacaca 240 tggcaaacca acagacactt gggcatgcct ccaagaataa ctgacctacc aacatcagat 300 acagcaacag catcactaac tgcaaatgga gacagatttg gatcaacaca aacacagaat 360 gtgaactatg tcacagaggc tttgcgcacc aggcctgctc agattggctt catgcaacct 420 catgacaact ttgaagcaaa cagaggtggc ccatttaagg ttccagtggt accgctagac 480 ataacagctg gcgaggacca tgatgcaaac ggagccatac gatttaacta tggcaaacaa 540 catggcgaag attgggccaa acaaggagca gcaccagaaa ggtacacatg ggatgcaatt 600 gatagtgcag ctgggaggga cacagctaga tgctttgtac aaagtgcacc aatatctatt 660 ccaccaaacc aaaaccagat cttgcagcga gaagacgcca tagctggcag aactaacatg 720 cattatacta atgtttttaa cagctatggt ccacttagtg catttcctca tccagatccc 780 atttatccaa atggacaaat ttgggacaaa gaattggacc tggaacacaa acctagacta 840 cacgtaactg caccatttgt ttgtaaaaac aacccaccag gtcaactatt tgttcgcttg 900 gggcctaatc tgactgacca atttgaccca aacagcacaa ctgtttctcg cattgttaca 960 tatagcactt tttactggaa gggtattttg aaattcaaag ccaaactaag accaaatctg 1020 acctggaatc ctgtatacca a 1041 <110> HaYoung Meditech Inc. Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> RECOMBIANT KILHAM RAT VIRUS AND THE USE THEREOF <130> PN210046 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-1PV 208K-554Q <400> 1 aaaccaaccg caccagctcc ttacagatac tactttttca tgcctagaca actcagtgta 60 acctctagca actctgctga aggaactcaa atcacagaca ccattggaga gccacaggca 120 ctaaactctc aattttttac tattgagaac accttgccta ttactctcct gcgcacaggt 180 gatgagttta caactggcac ctacatcttt aacactgacc cacttaaact tactcacaca 240 tggcaaacca acagacactt gggcatgcct ccaagaataa ctgacctacc aacatcagat 300 acagcaacag catcactaac tgcaaatgga gacagatttg gatcaacaca aacacagaat 360 gtgaactatg tcacagaggc tttgcgcacc aggcctgctc agattggctt catgcaacct 420 catgacaact ttgaagcaaa cagaggtggc ccatttaagg ttccagtggt accgctagac 480 ataacagctg gcgaggacca tgatgcaaac ggagccatac gatttaacta tggcaaaacaa 540 catggcgaag attgggccaa acaaggagca gcaccagaaa ggtacacatg ggatgcaatt 600 gatagtgcag ctgggaggga cacagctaga tgctttgtac aaagtgcacc aatatctatt 660 ccaccaaacc aaaaccagat cttgcagcga gaagacgcca tagctggcag aactaacatg 720 cattatacta atgtttttaa cagctatggt ccacttagtg catttcctca tccagatccc 780 atttatccaa atggacaaat ttgggacaaa gaattggacc tggaaacacaa acctagacta 840 cacgtaactg caccattatgt ttgtaaaaac aacccaccag gtcaactatt tgttcgcttg 900 gggcctaatc tgactgacca atttgaccca aacagcacaa ctgtttctcg cattgttaca 960 tatagcactt tttactggaa gggtattttg aaattcaaag ccaaactaag accaaatctg 1020 acctgggaatc ctgtatacca a 1041 <210> 2 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-1PV 208K-435L <400> 2 aaaccaaccg caccagctcc ttacagatac tactttttca tgcctagaca actcagtgta 60 acctctagca actctgctga aggaactcaa atcacagaca ccattggaga gccacaggca 120 ctaaactctc aattttttac tattgagaac accttgccta ttactctcct gcgcacaggt 180 gatgagttta caactggcac ctacatcttt aacactgacc cacttaaact tactcacaca 240 tggcaaacca acagacactt gggcatgcct ccaagaataa ctgacctacc aacatcagat 300 acagcaacag catcactaac tgcaaatgga gacagatttg gatcaacaca aacacagaat 360 gtgaactatg tcacagaggc tttgcgcacc aggcctgctc agattggctt catgcaacct 420 catgacaact ttgaagcaaa cagaggtggc ccatttaagg ttccagtggt accgctagac 480 ataacagctg gcgaggacca tgatgcaaac ggagccatac gatttaacta tggcaaaacaa 540 catggcgaag attgggccaa acaaggagca gcaccagaaa ggtacacatg ggatgcaatt 600 gatagtgcag ctgggaggga cacagctaga tgctttgtac aaagtgcacc aatatctatt 660 ccaccaaacc aaaaccagat cttgcagcga gaagacgcca tagctggcag aactaacatg 720 cattatacta atgtttttaa cagctatggt ccacttagtg catttcctca tccagatccc 780 atttatccaa atggacaaat ttgggacaaa gaattggacc tggaaacacaa acctagacta 840 cacgtaactg caccattatgt ttgtaaaaac aacccaccag gtcaactatt tgttcgcttg 900 gggcctaatc tgactgacca atttgaccca aacagcacaa ctgtttctcg cattgttaca 960 tatagcactt tttactggaa gggtattttg aaattcaaag ccaaactaag accaaatctg 1020 acctgggaatc ctgtatacca a 1041
Claims (6)
상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 H-1 파보바이러스의 캡시드 VP2 유전자 VR(Variable Region)2에서 VR8 전까지, 또는 VR2에서 VR4b전까지 이르는 부위의 유전자인, 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV).
As a recombinant Kilham Rat Virus (KRV) into which the H-1 parvovirus gene was introduced;
The gene of the H-1 parvovirus is a recombinant Kilham Rat Virus (KRV), which is the gene of the capsid VP2 gene VR (Variable Region) 2 to VR8 of the H-1 parvovirus, or from VR2 to VR4b. .
상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 H-1 파보바이러스의 캡시드 VP2 유전자 208K-554Q, 또는 208K-435L 위치의 유전자인 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV)로서;
상기 208K-554Q는 서열번호 1의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열인 것이며,
상기 208K-435L은 서열번호 2의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열인 것인,
재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV).
According to paragraph 1,
The gene of the H-1 parvovirus is the capsid VP2 gene 208K-554Q of the H-1 parvovirus, or the gene at position 208K-435L of Kilham Rat Virus (KRV);
The 208K-554Q is an amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 1,
The 208K-435L is an amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 2,
Recombinant Kilham Rat Virus (KRV).
상기 H-1 파보바이러스의 유전자는 야생형 킬함 쥐 바이러스의 캡시드 VP2 유전자 VR2 영역을 포함하는 영역의 유전자를 치환시키는 것인 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV).
According to paragraph 1,
The gene of the H-1 parvovirus is a recombinant Kilham rat virus (KRV) that replaces the gene in the region including the VR2 region of the capsid VP2 gene of the wild-type Kilham rat virus.
상기 야생형 킬함 쥐 바이러스의 캡시드 VP2 유전자 VR2 영역을 포함하는
영역은 킬함 쥐 바이러스 의 203K-548Q, 또는 203K-429L 위치의 유전자인 재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus, KRV)로서;
상기 203K-548Q는 서열번호 1의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열 중 일부 영역이 결실 및 치환되는 것이며,
상기 203K-429L은 서열번호 2의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열 중 일부 영역이 결실 및 치환되는 것이며,
상기 서열번호 1의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열에서 결실 및 치환되는 일부 영역은 VR2, VR6, 및 VR4b인 것이고,
상기 서열번호 2의 유전자로부터 번역된 아미노산 서열에서 결실 및 치환되는 일부 영역은 VR2, 및 VR6인 것인,
재조합 킬함 쥐 바이러스 (Kilham Rat Virus,KRV).
According to clause 5,
Comprising the VR2 region of the capsid VP2 gene of the wild-type Kylham rat virus
The region is the recombinant Kilham Rat Virus (KRV), which is the gene at positions 203K-548Q or 203K-429L of Kilham Rat Virus (KRV);
The 203K-548Q is a deletion and substitution of some regions of the amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 1,
The 203K-429L is a deletion and substitution of some regions of the amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 2,
Some regions deleted and substituted in the amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 1 are VR2, VR6, and VR4b,
Some regions deleted and substituted in the amino acid sequence translated from the gene of SEQ ID NO: 2 are VR2 and VR6,
Recombinant Kilham Rat Virus (KRV).
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210048174A KR102617487B1 (en) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Recombiant kilham rat virus and the use thereof |
| PCT/KR2022/001753 WO2022220380A1 (en) | 2021-04-14 | 2022-02-04 | Preparation of recombinant kilham rat virus, and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210048174A KR102617487B1 (en) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Recombiant kilham rat virus and the use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220141991A KR20220141991A (en) | 2022-10-21 |
| KR102617487B1 true KR102617487B1 (en) | 2023-12-29 |
Family
ID=83640393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210048174A KR102617487B1 (en) | 2021-04-14 | 2021-04-14 | Recombiant kilham rat virus and the use thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102617487B1 (en) |
| WO (1) | WO2022220380A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130058899A1 (en) | 2010-03-17 | 2013-03-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Cancer Therapy with a Parvovirus Combined with an HDAC Inhibitor |
| US20130189265A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-07-25 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Modified parvovirus having enhanced anti-tumor efficacy |
| US20140234261A1 (en) | 2007-12-28 | 2014-08-21 | Ruprecht-Karls-Universitaet Heidelberg | Parvovirus Cancer Therapy and Combination with Chemotherapy |
-
2021
- 2021-04-14 KR KR1020210048174A patent/KR102617487B1/en active IP Right Grant
-
2022
- 2022-02-04 WO PCT/KR2022/001753 patent/WO2022220380A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140234261A1 (en) | 2007-12-28 | 2014-08-21 | Ruprecht-Karls-Universitaet Heidelberg | Parvovirus Cancer Therapy and Combination with Chemotherapy |
| US20130058899A1 (en) | 2010-03-17 | 2013-03-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Cancer Therapy with a Parvovirus Combined with an HDAC Inhibitor |
| US20130189265A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-07-25 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Modified parvovirus having enhanced anti-tumor efficacy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022220380A1 (en) | 2022-10-20 |
| KR20220141991A (en) | 2022-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102298579B1 (en) | Capsid-modified, raav3 vector compositions and uses in gene therapy of human liver cancer | |
| RU2233333C2 (en) | Viral vectors and their application in genetic therapy | |
| JP5945789B2 (en) | Oncolytic rhabdovirus | |
| JP2023524915A (en) | Oncolytic virus vaccine and tumor therapeutic drug by combination with immune cells | |
| US10435712B2 (en) | Evolution of high-titer virus-like vesicles for vaccine applications | |
| KR102617487B1 (en) | Recombiant kilham rat virus and the use thereof | |
| CN112587660B (en) | Application of Seneca valley virus 3D protein in preparation of immune response inducer or adjuvant | |
| CN105087648B (en) | The recombined glandulae correlation viral vectors and construction method of carrying MAGE-A3 antigen genes and application | |
| CN113416768A (en) | Application of PRKRA gene as target in inhibiting replication of peste des petits ruminants virus | |
| CN112500458A (en) | Novel variant subunit vaccine of chicken infectious bursal disease virus, preparation method and application thereof | |
| CN105018525B (en) | Carry HPV 16 saltant type E7m91The recombined glandulae correlation viral vectors and its construction method of antigen gene and application | |
| Bennett et al. | Genetic and phylogenetic characterization of the type II cyclobutane pyrimidine dimer photolyases encoded by Leporipoxviruses | |
| CN110462030B (en) | Stable production and utilization of highly toxic enterovirus 71 | |
| CN114213505B (en) | Adeno-associated virus mutant suitable for specifically infecting U87-MG cells | |
| CN113337476B (en) | Foot-and-mouth disease O-type PanASia-2 pedigree reserve vaccine strain, construction method and application thereof | |
| CN109136200A (en) | A kind of recombination infectious hematopoietic necrosis poison and its construction method and application | |
| EP1642981B1 (en) | RECOMBINANT GENE MEDICINE OF ADENOVIRUS VECTOR AND GENE p53 FOR TREATING PROLIFERATIVE DISEASES | |
| EP2558113A2 (en) | Serca2 therapeutic compositions and methods of use | |
| WO2007013719A1 (en) | Recombinant adeno-associated virus comprising vegfr truncated soluble cdna and gene therapeutic agent specific to large intestine cancer, bladder cancer and/or lung cancer comprising the same | |
| EP2201027A2 (en) | Viral modification of reoviridae | |
| CN105177047B (en) | Carry HPV 16 saltant type E7m94The recombined glandulae correlation viral vectors and its construction method of antigen gene and application | |
| CN114712393B (en) | Application of Hnf-1 alpha gene modified mesenchymal stem cells in preventing and treating liver cancer | |
| WO2007102140A2 (en) | A semliki forest virus replication competent vector with enhanced biosafety | |
| AU2004217830B2 (en) | A recombinant constructed by a virus vector and a human tumor suppressor gene and its use | |
| Li et al. | Molecular Characteristics and Phylogenetic Analysis of Short Beak and Dwarfism Syndrome-Related Novel Goose Parvovirus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |