KR102616820B1 - 향상된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드 카세트, 발현 벡터 및 포유류 세포에서 유전자의 발현을 위한 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 3월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/472,892호의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
서열목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참고로 편입된다. 서열목록을 포함하는 파일명은 AVBI_009_01WO_ST25.txt이다. 파일은 86KB이며, 2018년 3월 16일자로 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 장애의 유전자 요법에 관한 것이다.
유전자 질환 및 다른 장애를 치료하고 예방하기 위한 유망한 접근은 유전자 전달 벡터에 의한 치료제의 전달이다. 바이러스 벡터는 고도로 효율적인 유전자 전달 비히클이고, 유전자 전달 벡터로서 유용할 수 있다. 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) 기반 벡터는, 특히, 그들의 바이러스 생활사의 비-통합 특성에 기인하여 바람직하다.
그러나, 유전자 요법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트 및 발현 벡터를 설계하는 것에 대해 다수의 도전이 남아있다. 하나의 상당한 도전은 유전자 전달 후 표적 세포에서 이식유전자의 충분한 발현을 얻는 것이다. 일부 경우에, 유전자 전달 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스)를 이용하는 질환 또는 유전자 장애의 효과적인 치료는 치료적 폴리펩타이드의 강한 발현과 효율적인 분비에 둘 다 의존할 수 있다. 따라서, 표적화된(예를 들어, 형질도입된) 세포로부터 고수준의 분비된 단백질을 유도할 수 있는 발현 카세트는 치료적으로 유효한 벡터 및 성공적인 유전자 요법 방법의 중요한 부분일 수 있다. 따라서, 포유류 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 개선된 방법 및 최적화된 핵산 발현 카세트 및 벡터에 대한 필요가 있다.
본 발명은 이런 필요를 충족시킨다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학 분야, 및 특히, 척추동물의 선택된 세포 및 조직에 대한 선택된 치료적 작제물을 암호화하는 핵산 세그먼트(예를 들어, 펩타이드 및 폴리펩타이드)의 전달을 위해 그들을 포함하는 유전자 발현 카세트 및 벡터에 관한 것이다. 이들 유전자 작제물은 포유류, 및 특히, 인간 질환, 장애 및 기능장애의 치료를 위해, 예를 들어, 단순포진바이러스(herpes simplex virus: HSV), 아데노바이러스(adenovirus: AV) 및 AAV 벡터를 포함하는, 유전자 전달 벡터의 개발에 유용한다.
더 구체적으로는, 본 발명은 진핵생물 또는 포유류 세포에 의한 분비된 단백질의 향상된 발현을 위한 유전자 발현 카세트, 및 치료가 필요한 대상체에서 하나 이상의 단백질 기능의 결핍, 부재 또는 상실에 의해 야기되거나 또는 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 연구 적용분야와 치료 적용분야 둘 다에서 사용하기 위해 이러한 카세트를 제조 및 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 카세트는 일반적으로 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 의학적 병태의 치료에서 유효한 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산 서열 또는 이식유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 분비 폴리펩타이드이다. 카세트는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 내로 혼입될 수 있고, 이어서, 이는 시험관내(예를 들어, 세포 배양물에서) 진핵생물 또는 포유류 세포에 또는 의학적 병태에 걸렸거나 또는 의학적 병태가 발생할 위험에 있는 포유류 대상체에게 투여될 수 있다.
개시된 조성물은 인간 질환의 예방 및 치료를 포함하는 다양한 탐구적, 진단적 및 치료적 섭생에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 안질환, 혈관신생-의존적 질환, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 저해제에 의한 치료에 반응하는 질환의 치료에서, 또는 효소 대체요법에서의 용도를 발견할 수 있되, 질환은 효소 기능의 결핍 또는 효소 기능의 상실에 의해 야기되거나 또는 이와 연관된다.
폴리뉴클레오타이드 발현 카세트, 및 특히 동물, 및 인간에서 질환, 장애 및 기능장애의 중심 및 표적화된 유전자 요법에서 유용한 의약의 제조에서 사용하기 위해 이들 발현 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터 조성물, 예를 들어, 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
본 발명의 실시형태는 5'에서 3' 순서로: (a) 제1 인핸서 영역; (b) 프로모터 영역; (c) 폴리펩타이드 유전자 산물을 암호화하는 암호화 서열; (d) 제2 인핸서 영역; 및 (e) 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 위해 비천연 유래 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 제2 인핸서의 하류 및 폴리아데닐화 부위의 상류에 위치된 리보핵산(RNA) 방출 신호를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 RNA 방출 신호를 함유하지 않는다. 더 구체적인 형태에서, 카세트는 제2 인핸서 하류 및 폴리아데닐화 부위의 상류의 RNA 방출 신호를 함유하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 프로모터의 하류 및 암호화 서열의 상류에 위치된 인트론을 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 암호화 서열의 상류 및 프로모터의 하류에 위치된 5' 비번역 영역(5'UTR)을 추가로 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드 유전자 산물은 분비 단백질이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 프로모터 영역의 상류에 위치된 제1 인핸서 영역을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 제1 인핸서 영역은 거대세포바이러스(cytomegalovirus: CMV) 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 인핸서 영역은 연장인자 1 알파(elongation factor 1 alpha: EF1α) 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 제1 인핸서 영역은 서열번호 1에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 프로모터 서열, 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터 영역은 진핵생물 세포, 또는 더 구체적으로는 포유류 세포에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 프로모터 영역은 액틴 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터 및 글리세르알데하이드 3-인산탈수소효소(GAPDH) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터 영역은 CMV 프로모터 서열 또는 EF1α 프로모터 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터 영역은 다음의 서열번호 3, 4 또는 96 중 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 프로모터 영역 하류의 인트론 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론 서열은 프로모터의 하류 및 5'UTR의 상류에 위치된다. 일부 실시형태에서, 인트론 영역은 연장인자 1 알파(EF1α), 액틴 또는 CMVc 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 인트론은 다음의 서열번호 5, 18 또는 97 중 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 본 명세서에서 5'UTR로서 지칭되는 암호화 서열의 비번역 영역 5'을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5'UTR 서열은 프로모터 서열에 대해 이종성이다. 5'UTR은 프로모터의 하류 및 암호화 서열의 상류에 위치된다. 일부 이러한 실시형태에서, 5'UTR은 UTR1, UTR2, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(eMLP)로부터의 인핸서 요소, 및 아데노바이러스로부터의 삼중 리더 서열(TPL 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5'UTR은 UTR1 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 5'UTR은 UTR2 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 5'UTR은 5'에서 3' 순서로, TPL 서열 및 eMLP 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5'UTR은 폴리뉴클레오타이드 ATG를 포함하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 5'UTR은 다음의 서열번호 6, 11, 12 또는 19 중 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명의 실시형태는 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 또한 이식유전자로서 지칭되는 암호화 서열을 포함한다. 하나의 구체적 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 하나의 암호화 서열 또는 이식유전자를 포함하고, 2개 이상의 이식유전자를 포함하지 않는다. 이식유전자는, 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같은 치료제를 암호화할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이식유전자는 분비 폴리펩타이드(또한 본 명세서에서 분비된 단백질 또는 분비 단백질로서 지칭됨)를 암호화한다. 암호화 서열에 의해 암호화될 수 있는 분비 폴리펩타이드의 예는 가용성 fms-유사 타이로신 키나제-1(또한 sFLT-1로서 알려짐), sFLT-1의 VEGF-결합 단편, 애플리버셉트 및 알파-1 항트립신 또는 α1-항트립신(A1AT)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 분비 폴리펩타이드는 항-혈관형성 또는 항-혈관내피성장인자(항-VEGF) 폴리펩타이드이다.
대상 발현 카세트는 기준 카세트로부터의 포유류 세포에서 이식유전자 산물의 발현에 비해 포유류 세포에서 이식유전자 산물(예를 들어, 폴리펩타이드)의 향상된 발현을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 대상 발현 카세트는 기준 카세트로부터 생체내 또는 시험관내에서(예를 들어, 세포 배양물 또는 조직 외식편에서) 진핵생물에서의 분비 단백질의 발현에 비해 생체내 또는 시험관내에서 진핵생물 세포에서의 분비 단백질의 향상된 발현을 제공한다. 일부 양상에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포이다. 또한 추가 양상에서, 포유류 세포는 인간 세포이다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포에서 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비 폴리펩타이드의 발현은 시험관내 또는 생체내에서 포유류 세포에서의 기준 카세트로부터의 분비 폴리펩타이드 발현보다 적어도 약 2배(즉, 2×), 3×, 5×, 9×, 10×, 20× 또는 50× 더 높다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포에서의 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터 얻은 비분비 폴리펩타이드의 발현 수준은 시험관내 또는 생체내에서 포유류 세포에서의 기준 카세트로부터 얻은 비분비 폴리펩타이드의 발현 수준과 거의 동일하거나, 비분비 폴리펩타이드의 발현 수준보다 약 1.5× 초과로 적거나, 또는 약 2× 초과로 더 적다. 비분비 폴리펩타이드의 하나의 비제한적 예는 녹색 형광 단백질(GFP)이다.
일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에서 상기에 그리고 이하에 지칭되는 기준 카세트(또한 본 명세서에서 CMV 기준 대조군 카세트로서 지칭됨)는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서 서열(서열번호 2), CMV 프로모터(서열번호 21), 키메라 인트론(서열번호 22), 5'UTR(서열번호 23), 펩타이드 또는 폴리펩타이드 유전자 산물을 암호화하는 암호화 서열, 3'UTR(서열번호 25), 및 SV40 폴리A 서열(서열번호 26)을 포함한다.
구체적 실시형태에 따르면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 향상된 발현은 HeLa 세포, HEK-293 세포 및 ARPE-19 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 포유류 세포에서 시험관내에서 관찰된다. 다른 실시형태에서, 포유류 세포는 망막 조직 외식편에 함유된다.
일부 형태에서, 시험관내 또는 생체내에서(예를 들어, 대상체에서) 포유류 세포에서의 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터 분비 단백질의 발현은 동일한 조건 하에 포유류 세포에서의 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 분비 단백질의 발현보다 적어도 2×, 적어도 5×, 적어도 10×, 또는 약 5× 내지 약 10× 초과이되, CMV 기준 대조군 카세트는 5'에서 3' 순서로, 서열번호 2에 제시된 CMV 인핸서 서열, 서열번호 21에 제시된 CMV 프로모터 서열, 서열번호 22에 제시된 키메라 인트론 서열, 서열번호 23에 제시된 5'UTR 서열, 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열, 서열번호 25에 제시된 3'UTR 서열 및 서열번호 26에 제시된 SV40 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 포유류 세포에서의 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 단백질 발현에 비해 적어도 2배(2×), 5배(5×), 10배(10×) 또는 약 5- 내지 약 10배만큼 포유류 세포에서 분비 단백질의 발현을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 형질도입된 포유류 세포에서의 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 단백질 발현에 비해 형질도입된 포유류 세포에서의 분비된 단백질의 발현을 향상시키거나 또는 증가시킨다.
폴리뉴클레오타이드 카세트는 암호화 서열의 하류 및 폴리아데닐화 신호 서열의 상류에 위치된 제2 인핸서 영역을 포함한다. RNA 방출 신호 서열이 존재할 때, 제2 인핸서 서열은 RNA 방출 신호 상류에(즉, 암호화 서열과 RNA 방출 신호 사이에) 위치되고, RNA 방출 신호는 폴리아데닐화 신호의 상류에 위치된다. 바람직한 실시형태에서, 제2 인핸서 영역은 완전한 EES, 410-564 EES 및 511-810 EES로 이루어진 군으로부터 선택된 발현 인핸서 서열(expression enhancer sequence: EES)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 제2 인핸서 하류에 그리고 폴리아데닐화 서열(또한 본 명세서에서 폴리A 서열, 폴리A 부위 또는 폴리아데닐화 영역으로서 지칭됨) 상류에 RNA 방출 신호를 포함한다. RNA 방출 신호는 인간 B형 간염 바이러스 전사후 요소(human hepatitis B virus post-transcriptional element: HPRE) 서열 및 우드처크 간염 바이러스 전사후 요소(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional element: WPRE) 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 방출 신호는 다음의 서열번호 8 또는 17 중 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 카세트는 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 폴리아데닐화 부위는 제2 인핸서 영역의 하류 또는 RNA 방출 영역의 하류에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 영역은 인간 성장 호르몬(human growth hormone: HGH 또는 hGH), 소 성장 호르몬(bovine growth hormone: BGH 또는 bGH) 또는 베타-글로빈(β-글로빈) 폴리A 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 폴리아데닐화 영역은 다음의 서열번호 9, 14 또는 20 중 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 동일성은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명의 일부 실시형태는 포유류 세포에서의 기준 카세트에 의한 단백질의 발현에 비해, 세포외 환경에서의 단백질 양(예를 들어, 농도 또는 양)으로 측정하여, 포유류 세포에 의한 분비 단백질의 향상된 또는 증가된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트에 관한 것이다. 샘플 내 단백질의 양은, 예를 들어, 면역분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포에서의 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) EF1α 서열(서열번호 3)을 포함하는 프로모터 영역; (c) EF1α 서열(서열번호 5)을 포함하는 인트론 영역; (d) UTR2 서열(서열번호 6)을 포함하는 5'UTR 영역; (e) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (f) 511-810 EES 서열(서열번호 7)을 포함하는 제2 인핸서 영역; (g) WPRE RNA 방출 서열(서열번호 8); 및 (h) BGH 폴리아데닐화 부위(서열번호 9)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 70 내지 75로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 45 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 46 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) CMV 서열(서열번호 4)을 포함하는 프로모터 영역; (c) 5'에서 3' 순서로, TPL 및 eMLP 서열(각각 서열번호 11 및 서열번호 12)을 포함하는 5'UTR 영역; (d) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (e) 완전한 EES 서열(서열번호 13)을 포함하는 제2 인핸서 영역; 및 (f) HGH 폴리아데닐화 부위(서열번호 14)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 76 내지 80 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 47 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 48 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 포유류 세포에서의 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) CMV 서열(서열번호 4)을 포함하는 프로모터 영역; (c) 5'에서 3' 순서로, TPL 및 eMLP 서열(각각 서열번호 11 및 서열번호 12)을 포함하는 5'UTR 영역; (e) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (f) 410-564 EES 서열(서열번호 16)을 포함하는 제2 인핸서 영역; (g) HPRE RNA 방출 서열(서열번호 17); 및 (h) BGH 폴리아데닐화 부위(서열번호 9)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 81 내지 86 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 49 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 50 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) 액틴 서열(서열번호 96)을 포함하는 프로모터 영역; (c) eMLP 서열(서열번호 12)을 포함하는 5'UTR; (e) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (f) 511-810 EES 서열(서열번호 7)을 포함하는 제2 인핸서 영역; (g) HPRE RNA 방출 서열(서열번호 17); 및 (h) 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 부위(서열번호 20)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 87 내지 91로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 51 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 52 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) CMV 서열(서열번호 4)을 포함하는 프로모터 영역; (c) CMVc 서열(서열번호 18)을 포함하는 인트론 영역; (d) UTR1 서열(서열번호 19)을 포함하는 5'UTR 영역; (e) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (f) 완전한 EES 서열(서열번호 13)을 포함하는 제2 인핸서 영역; (g) WPRE RNA 방출 서열(서열번호 8); 및 (h) 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 부위(서열번호 20)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 92 내지 95로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 53 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 54 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) 액틴 서열(서열번호 96)을 포함하는 프로모터 영역; (c) 닭 베타-액틴 서열(서열번호 97)을 포함하는 인트론 영역; (d) UTR1 서열(서열번호 19)을 포함하는 5'UTR 영역; (e) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (f) 410-564 EES 서열(서열번호 16)을 포함하는 제2 인핸서 영역; (g) HPRE RNA 방출 서열(서열번호 17); 및 (h) BGH 폴리아데닐화 부위(서열번호 9)를 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 92 내지 95로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 5' 아암은 서열번호 39 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트의 3' 아암은 서열번호 40 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) 5' 아암; (b) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; 및 (c) 3' 아암을 포함하거나 또는 본질적으로 이루어진다. 소정의 이들 실시형태에서, 5' 아암은 서열번호 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 및 61으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 3' 아암은 서열번호 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 5' 아암 및 3' 아암은 각각 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 35 및 36, 또는 서열번호 37 및 38, 또는 서열번호 39 및 40, 또는 서열번호 41 및 42, 또는 서열번호 43 및 44, 또는 서열번호 45 및 46, 또는 서열번호 47 및 48, 또는 서열번호 49 및 50, 또는 서열번호 51 및 52, 또는 서열번호 53 및 54 또는 서열번호 55 및 56, 또는 서열번호 57 및 58, 또는 서열번호 59 및 60, 또는 서열번호 61 및 62이다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트에서 암호화 서열에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 세포에서 그의 발현 후에 세포로부터 분비되거나 또는 방출된 것이다.
본 발명의 일부 양상에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 (a) 캡시드 단백질, 및 (b) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는, 재조합 바이러스이다. 더 구체적인 실시형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)이되, 재조합 아데노-연관 바이러스는 AAV 캡시드 단백질 및 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질이다. 다른 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 변이체 AAV 캡시드 단백질이되, 변이체 캡시드 단백질은 모 캡시드 단백질 또는 그로부터 유래된 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 함유한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 5 내지 약 11개의 아미노산은 대응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 VP1 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV에서 삽입 부위에 삽입된다. 적합한 예는 7m8 변이체 캡시드 단백질 또는 AAV 변이체 7m8 캡시드 단백질로부터 유래된 캡시드 단백질을 갖는 AAV 변이체 캡시드를 포함한다. 하나의 특정 예에서, 변이체 AAV는 AAV2.7m8 캡시드 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 유전자 전달 벡터 및 약제학적 부형제를 포함한다.
일 실시형태는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트로 형질감염되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포이다.
본 발명의 일부 양상에서, 시험관내 또는 생체내에서 포유류 세포에서 이식유전자를 발현시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 생체내 또는 시험관내에서 하나 이상의 포유류 세포를 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트, 유전자 전달 벡터 또는 약제학적 조성물의 양과 접촉시키는 단계를 포함하되, 이식유전자는 하나 이상의 포유류 세포에서 검출 가능한 수준으로 발현되거나, 또는 더 바람직하게는, 동일한 조건(즉, 일정하게 남아있는 다른 변수) 하에 측정된 세포 또는 세포 배양물에서 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서 서열(서열번호 2), CMV 프로모터(서열번호 21), 키메라 인트론(서열번호 22), 5'UTR(서열번호 23), 관심 대상의 이식유전자 또는 암호화 서열, 3'UTR(서열번호 25), 및 SV40 폴리A 서열(서열번호 26)을 포함하는, 기준 CMV 카세트로부터 얻은 것보다(즉, 이들로부터의 이식유전자의 발현에 비해) 약 2배, 5배 또는 10배 더 높은 수준으로 발현된다. 일부 실시형태는 시험관내 또는 생체내 하나 이상의 포유류 세포를 본 발명의 재조합 바이러스의 양과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체내 포유류 세포에서 이식유전자를 발현시키는 방법을 제공하되, 재조합 바이러스는 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 카세트 또는 이식유전자는 분비 단백질(또한 본 명세서에서 분비 폴리펩타이드로서 지칭됨)을 암호화하고, 분비 단백질은 세포를 동일한 단백질을 암호화하는 CMV 기준 대조군 카세트를 포함하는 재조합 바이러스와 접촉시킴으로써 얻어지는 것보다 적어도 적어도 2×, 5×, 10×, 약 5× 내지 약 10×, 또는 20× 초과로 더 높은 수준으로 하나 이상의 포유류 세포에서 발현된다. 일부 양상에서, 포유류 세포는 세포의 하나 이상의 특징을 변경시키거나 또는 개체에서 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키는 데 효과적인 폴리뉴클레오타이드 카세트, 약제학적 조성물 또는 벡터의 양과 접촉된다.
본 발명의 일부 양상에서, 질환 또는 장애에 대한 치료 또는 예방이 필요한 포유류에서의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 포유류에서 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 암호화 서열은 치료적 유전자 산물을 암호화한다. 일 실시형태에서, 질환은 안질환이고/이거나 세포의 단백질 산물 기능의 상실 또는 이의 결핍과 관련된 질환이다. 일 실시형태에서, 안질환은 눈의 신생혈관과 관련되거나 또는 이에 의해 야기된다. 일 실시형태는 치료적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 치료가 필요한 포유류의 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료가 필요한 포유류에서 안질환을 치료하는 방법이다. 더 구체적인 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물은 안내 주사에 의해 또는 유리체내 주사에 의해 치료가 필요한 개체의 눈에 투여된다.
대상 카세트, 조성물 및 방법에 대한 용도를 발견할 수 있는 안질환은 급성 황반 신경망막병증; 베체트병; 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization); 당뇨성 포도막염; 히스토플라스마증; 황반변성, 예컨대, 급성 황반변성, 비-삼출성 연령 관련 황반변성, 및 삼출성 연령 관련 황반변성; 부종, 예컨대, 황반 부종, 낭포 황반 부종 및 당뇨성 황반 부종; 다소성 맥락막염; 안구 후부 자리 또는 위치에 영향을 미치는 안구 외상; 안구 종양; 망막 장애, 예컨대, 망막 정맥 폐쇄, 중심 망막정맥 폐쇄, 당뇨성 망막증(증식성 당뇨성 망막증을 포함), 증식성 유리체망막병증(PVR), 망막 동맥 폐색성 질환, 망막 박리, 포도막염 망막 질환; 교감성 안염; 보그트-고야나기-하라다병(VKH) 증후군; 포도막 확산; 안구 레이저 치료에 의해 야기되거나 또는 영향받은 후부 안구 병태; 광역학 요법에 의해 야기되거나 또는 영향받는 후부 안구 병태; 광응고법, 방사선 망막증; 망막전막 장애; 망막 분지 정맥 폐쇄; 전방 허혈성 시신경병증; 비-망막증 당뇨성 망막 기능장애; 망막층간분리증; 망막색소변성증; 녹내장; 어셔 증후군, 추체-간체 이영양증; 스타카르트 질환(황반안저); 유전성 황반변성; 맥락망막염 변성; 레베르 선천성 흑암시; 선천성 야맹증; 맥락막결손; 바르데-비들 증후군; 황반 모세혈관확장증; 레베르시신경병증; 조숙의 망막증; 및 완전색맹, 적색맹, 녹색맹 및 청색맹을 포함하는 색각의 장애를 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점의 더 양호한 이해는 예시적 실시형태는 제시하는 다음의 상세한 설명 및 이의 수반하는 도면을 참고로 하여 얻을 것이며, 이때, 본 발명의 원칙이 이용된다:
도 1은 이식유전자 발현의 평가를 위해 작제된 일련의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 도시한 도면. 각각의 카세트에 존재하는 조절 요소 및 암호화 서열(즉, 유전자)은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 순서로 열거된다. 카세트는 카세트 번호에 의해 식별된다. 예를 들어, 카세트 번호 11은 카세트 번호 11, 카세트 11, 또는 단순히 C11로서 지칭될 수 있다.
도 2는 HeLa 세포 내로 형질감염 후 폴리뉴클레오타이드 카세트에 의해 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 비교하는 차트를 도시한 도면. 발현 수준은 도 1에 기재한 "염기 플라스미드"로부터 얻은 것에 대해 플롯팅한다.
도 3은 HEK 293 세포 내로 형질도입 후 선택 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 도시한 도면.
도 4a 및 도 4b는 형질도입 후 1주(도 4a) 및 2주(도 4b)에 형질도입된 돼지 망막 외식편에서 분비된 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 도시한 도면. 각각의 카세트를 AAV2의 변이체인 7m8 캡시드에서 패키징하였다. 분석과 관련된 배경 신호를 비히클(완충제 단독) 비-바이러스 대조군으로 결정하였다.
도 5는 형질감염된 ARPE-19 세포에서 기준 기준 카세트(CMV-sFLT1)를 포함하는 다양한 폴리뉴클레오타이드 카세트 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면. 카세트 10, 11 및 12에서 sFLT-1을 암호화하는 서열을 코돈 최적화(codon optimized: "CO")하였다. 기본 플라스미드는 단독으로 편재한 프로모터 하에서, 임의의 다른 조절 요소 없이 코돈-최적화된 sFLT1을 가졌다.
도 6은 형질감염된 HEK293 세포에서 다양한 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면.
도 7은 형질감염된 HeLa 세포에서 기준 카세트(CMV-sFLT1)를 포함하는 다양한 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면.
도 8은 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 GFP의 발현에 비해 그리고 비히클(완충제 단독) 대조군에 비해 형질감염된 HeLa 세포에서 폴리뉴클레오타이드 카세트 C7, C11 및 C13으로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 도시한 도면.
도 9는 형질도입된 HEK293 세포에서 다양한 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면. 데이터는 7m8 벡터로 형질도입 3일 후에 세포 배양물 상청액에서 sFLT-1의 양을 나타낸다. 각각의 경우에, 벡터는 표시된 카세트를 패키징하였다. 카세트 C10 및 C11로부터의 sFLT-1의 발현(세포 배양물 상청액에서 측정)을 CMV 기준 카세트로부터의 sFLT-1의 발현과 비교하였다. 배경 신호를 비히클(완충제 단독) 대조군으로 결정하였다. 추가적인 대조군으로서, 세포를 CMV-sFLT1 기준 대조군 카세트를 함유하는 재조합 AAV2 벡터로 형질도입하였다. 제1 실험에서, 카세트 11로부터 분비된 sFLT1의 양은 면역분석의 범위보다 더 높았고, 따라서 이는 추가로 희석되고 분석되어야 한다.
도 10A 및 도 10B는 형질도입된 돼지 망막 외식편에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 sFLT1의 발현을 도시한 도면. sFLT1 발현을 상청액에서(도 10A) 뿐만 아니라 조직 용해물에서(도 10B) 측정한다.
도 11은 카세트 11을 함유하는 재조합 플라스미드의 예시적인 실시형태를 도시한 도면. 아데노-연관 바이러스 혈청형 2(AAV2)로부터의 반전 말단 반복부(Inverted terminal repeat: ITR)는 카세트에 측접한다.
도 1은 이식유전자 발현의 평가를 위해 작제된 일련의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 도시한 도면. 각각의 카세트에 존재하는 조절 요소 및 암호화 서열(즉, 유전자)은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 순서로 열거된다. 카세트는 카세트 번호에 의해 식별된다. 예를 들어, 카세트 번호 11은 카세트 번호 11, 카세트 11, 또는 단순히 C11로서 지칭될 수 있다.
도 2는 HeLa 세포 내로 형질감염 후 폴리뉴클레오타이드 카세트에 의해 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 비교하는 차트를 도시한 도면. 발현 수준은 도 1에 기재한 "염기 플라스미드"로부터 얻은 것에 대해 플롯팅한다.
도 3은 HEK 293 세포 내로 형질도입 후 선택 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 도시한 도면.
도 4a 및 도 4b는 형질도입 후 1주(도 4a) 및 2주(도 4b)에 형질도입된 돼지 망막 외식편에서 분비된 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비된 단백질인 애플리버셉트의 발현을 도시한 도면. 각각의 카세트를 AAV2의 변이체인 7m8 캡시드에서 패키징하였다. 분석과 관련된 배경 신호를 비히클(완충제 단독) 비-바이러스 대조군으로 결정하였다.
도 5는 형질감염된 ARPE-19 세포에서 기준 기준 카세트(CMV-sFLT1)를 포함하는 다양한 폴리뉴클레오타이드 카세트 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면. 카세트 10, 11 및 12에서 sFLT-1을 암호화하는 서열을 코돈 최적화(codon optimized: "CO")하였다. 기본 플라스미드는 단독으로 편재한 프로모터 하에서, 임의의 다른 조절 요소 없이 코돈-최적화된 sFLT1을 가졌다.
도 6은 형질감염된 HEK293 세포에서 다양한 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면.
도 7은 형질감염된 HeLa 세포에서 기준 카세트(CMV-sFLT1)를 포함하는 다양한 작제물로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면.
도 8은 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 GFP의 발현에 비해 그리고 비히클(완충제 단독) 대조군에 비해 형질감염된 HeLa 세포에서 폴리뉴클레오타이드 카세트 C7, C11 및 C13으로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 도시한 도면.
도 9는 형질도입된 HEK293 세포에서 다양한 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 sFLT-1 발현의 비교를 도시한 도면. 데이터는 7m8 벡터로 형질도입 3일 후에 세포 배양물 상청액에서 sFLT-1의 양을 나타낸다. 각각의 경우에, 벡터는 표시된 카세트를 패키징하였다. 카세트 C10 및 C11로부터의 sFLT-1의 발현(세포 배양물 상청액에서 측정)을 CMV 기준 카세트로부터의 sFLT-1의 발현과 비교하였다. 배경 신호를 비히클(완충제 단독) 대조군으로 결정하였다. 추가적인 대조군으로서, 세포를 CMV-sFLT1 기준 대조군 카세트를 함유하는 재조합 AAV2 벡터로 형질도입하였다. 제1 실험에서, 카세트 11로부터 분비된 sFLT1의 양은 면역분석의 범위보다 더 높았고, 따라서 이는 추가로 희석되고 분석되어야 한다.
도 10A 및 도 10B는 형질도입된 돼지 망막 외식편에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 sFLT1의 발현을 도시한 도면. sFLT1 발현을 상청액에서(도 10A) 뿐만 아니라 조직 용해물에서(도 10B) 측정한다.
도 11은 카세트 11을 함유하는 재조합 플라스미드의 예시적인 실시형태를 도시한 도면. 아데노-연관 바이러스 혈청형 2(AAV2)로부터의 반전 말단 반복부(Inverted terminal repeat: ITR)는 카세트에 측접한다.
본 개시내용은 세포에서 유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오타이드 카세트 및 발현 벡터를 제공한다. 또한 세포에서, 예를 들어, 개체에서 유전자의 발현을 촉진시킴에 있어서의 임의의 조성물의 용도를 위한, 예를 들어, 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 이들 및 다른 목적, 이점 및 특징은 이하에 더 완전하게 기재하는 조성물 및 방법의 상세한 설명을 읽을 때 당업자에게 분명하게 될 것이다.
정의
"비천연 유래" 폴리뉴클레오타이드 카세트는 천연에서 발견되지 않는 것이다.
본 명세서에서 "분비된 단백질"로서도 지칭되는 "분비 단백질" 또는 "분비 폴리펩타이드"는 생세포에 의해 분비되거나 또는 이에 의해 방출된 임의의 단백질이다. 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 카세트와 함께 사용하기 위한 분비 단백질의 하나의 비제한적 예는 sFLT-1이다.
용어 "질환", "장애" 및 "의학적 병태"는 동의어이며, 본 명세서에서 동의어이며, 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이와 관련되고, 세포에 폴리뉴클레오타이드의 전달을 매개하기 위해 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합을 지칭한다. 예시적인 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터(즉, 바이러스, 예컨대, 아데노-연관 바이러스), 리포좀 및 다른 유전자 전달 비히클을 포함한다.
용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 약칭이며, 이는 바이러스 그 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 아형 및 천연 유래와 재조합 형태를 둘 다 아우른다. 용어 "AAV"는 AAV 1형(AAV-1), AAV 2형(AAV-2), AAV 3형(AAV-3), AAV 4형(AAV-4), AAV 5형(AAV-5), AAV 6형(AAV-6), AAV 7형(AAV-7), AAV 8형(AAV-8), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, "소 AAV"는 소 포유류 등을 감염시키는 AAV를 지칭한다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(전형적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의해) 및 캡시드에 싸인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 포유류 세포에 전달될 이식유전자)를 포함한다면, 이는 전형적으로 재조합 AAV 벡터 또는 rAAV로서 지칭된다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오타이드는 AAV 반전 말단 반복부 서열(ITR)에 의해 측접된다.
본 발명의 AAV 바이러스 벡터에 대해 본 명세서에서 사용되는 용어 "복제 결함"은 AAV 벡터가 독립적으로 복제할 수 었고, 그의 게놈을 패키지한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체의 세포가 rAAV 비리온으로 감염될 때, 이종성 유전자는 감염된 세포에서 발현되지만, 그러나, 감염된 세포가 AAV rep 및 cap 유전자 및 부속 기능 유전자를 결여한다는 사실에 기인하여, rAAV는 추가로 복제할 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 "AAV 변이체" 또는 "AAV 돌연변이체"는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 변이체 AAV 캡시드 단백질은 대응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 차이(예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)를 포함하고, 여기서 변이체 캡시드 단백질은 대응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염도에 비해 망막 세포의 증가된 감염도를 부여하며, AAV 캡시드 단백질은 천연 유래 AAV 캡시드 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 발현 카세트는 표적 조직에서 특정 세포 유형(예를 들어, 망막 세포)에 대한 카세트의 전달을 촉진하기 위해 변이체 AAV 입자에서 패키징될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자" 또는 "암호화 서열"은 시험관내 또는 생체내에서 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "이식유전자"는 벡터에 의해 세포 내로 전달된 암호화 서열 또는 유전자를 지칭한다. 암호화 서열 또는 유전자는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자를 암호화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "치료적 유전자" 및 "치료적 단백질"은 발현될 때, 그것이 존재하는 세포 또는 조직에 대해 또는 유전자 또는 단백질이 발현되는 포유류에 대해 유리한 효과를 부여하는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 유리한 효과의 예는 병태 또는 질환의 징후 또는 증상의 감소 또는 개선, 병태 또는 질환의 예방 또는 저해, 또는 목적으로 하는 특징의 부여일 수 있다. 치료적 유전자 및 단백질은 세포 또는 포유류에서 유전자 결핍증을 수정하는 유전자 및 단백질을 포함한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트, 재조합 바이러스 또는 약제학적 조성물은 대상체에서 질환 또는 의학적 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소를 초래하는 데 충분한 양이되, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 산물"은 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대, 펩타이드 또는 단백질의 목적으로 하는 발현 산물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 용어 "펩타이드"는 약 50개 이하의 아미노산의 아미노산 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 또는 인산화에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 일부 예에서, 대상 폴리펩타이드는 50개 초과의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
"포함하는(comprising)"은 인용된 요소가, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등에서 필요하지만, 청구범위의 범주 내에서 다른 요소가, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등을 형성하는 데 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 "포함하는" 발현 "카세트"는 유전자 및 프로모터, 예를 들어, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 요소, 다른 유전자, 링커 도메인 등에 추가로 다른 요소를 포함할 수 있는 발현 카세트이다.
"본질적으로 이루어진"은, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구체화된 물질 또는 단계에 대해 기재된, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등의 범주의 제한을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동 가능하게 연결된 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로 "본질적으로 이루어진" 발현 카세트는, 그들이 유전자의 전사 또는 번역에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 추가적인 서열, 예를 들어, 링커 서열을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 인용된 서열로 "본질적으로 이루어진" 변이체 또는 돌연변이체, 폴리펩타이드 단편은 그것이 유래된 전장 천연 폴리펩타이드를 기준으로 서열의 경계에서 인용된 서열의 아미노산 서열 + 또는 - 약 10개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 인용된 경계 아미노산 잔기보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 더 적은 잔기, 또는 인용된 경계 아미노산 잔기보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 더 많은 잔기를 가진다.
"로 이루어진"은 청구범위에서 구체화되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 조성물, 방법 또는 키트로로부터의 제외를 의미한다. 예를 들어, 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동 가능하게 연결된 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로 "이루어진" 발현 카세트는 프로모터, 치료적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 폴리아데닐화 서열로만 이루어진다. 다른 예로서, 인용된 서열로 "이루어진" 폴리펩타이드는 인용된 서열만을 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 "발현 벡터"는 관심 대상의 유전자 산물을 암호화하고, 대상 폴리뉴클레오타이드를 의도된 표적 세포에 전달하기 위해 사용되는, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 미니서클(minicircle), 바이러스 벡터, 리포좀 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합을 지시하고, 이에 의해 RNA 합성을 촉진하는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터 및 대응하는 단백질 또는 폴리펩타이드 발현은 편재할 수 있는데, 이는 다양한 세포, 조직 및 종 또는 세포-유형 특이적, 조직-특이적 또는 종 특이적으로 강하게 활성이라는 것을 의미한다. 프로모터는 지속적으로 활성인 것을 의미하는 "구성적" 또는 프로모터가 생물학적 또는 비생물학적 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성화 또는 비활성화될 수 있다는 것을 의미하는 "유도성"일 수 있다. 또한 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터에 프로모터 서열과 인접할 수도 있고 또는 인접하지 않을 수도 있는 인핸서 서열이 포함된다. 인핸서 서열은 프로모터-의존적 유전자 발현에 영향을 미치고, 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "인핸서"는 인접 유전자의 전사를 자극하거나 또는 저해하는 시스-작용성 요소를 포함한다. 전사를 저해하는 인핸서는 또한 "사일런서"로 지칭된다. 인핸서는 암호화 서열로부터 그리고 전사 영역 하류의 위치로부터 킬로염기쌍(kilobase pair: kb)까지의 거리에 걸쳐, 배향 중 하나에서 작용할 수 있다(즉, 암호화 서열과 관련될 수 있다).
본 명세서에서 사용되는 "폴리아데닐화 신호 서열"은 RNA 전사체의 엔도뉴클레아제 절단에 필요한 인식 영역을 포함하며, 이 다음에 폴리아데닐화 공통 서열 AATAAA이 이어진다. 폴리아데닐화 신호 서열은 "폴리A 부위", 즉, 아데닌 잔기가 전사후 폴리아데닐화에 의해 첨가되는 RNA 전사체 상의 부위를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 유전자 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결 신호 서열, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 지칭하되, 요소는 그들이 예상된 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사를 개시한다면, 프로모터는 암호 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이 기능적 관계가 유지된다면, 프로모터와 암호 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성"은 비교되는 독립체의 나머지와 유전자형이 별개인 독립체로부터 유래된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 유전자 조작 기법에 의해 도입된 폴리뉴클레오타이드는 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 다른 예로서, 천연 암호화 서열로부터 제거되고 연결이 자연적으로 발견되지 않는 암호화 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 따라서, 예를 들어, 이종성 유전자 산물을 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV는 천연 유래, 야생형 AAV에서 정상적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이며, 암호화된 이종성 유전자 산물은 천연-유래, 야생형 AAV에 의해 정상적으로 암호화되지 않는 유전자 산물이다.
뉴클레오타이드 분자 또는 유전자 산물에 관해 본 명세서에서 사용되는 용어 "내인성"은 숙주 바이러스 또는 세포에서 천연 유래이거나 또는 이와 관련된 핵산 서열, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 요소, 또는 유전자 산물, 예를 들어, RNA, 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "천연"은 야생형 바이러스 또는 세포에 존재하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 유전자, 또는 유전자 산물, 예를 들어, RNA, 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열, 예를 들어 천연 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 돌연변이체, 즉, 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것을 지칭한다. 바꿔 말하면, 폴리펩타이드 변이체는 기준 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 천연 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산 차이(예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)를 포함하고, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 기준 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 천연 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 차이(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 치환, 삽입 또는 결실)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성 백분율"은 뉴클레오타이드 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬될 때 2 이상의 폴리뉴클레오타이드 사이; 또는 아미노산 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬될 때 2 이상의 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성 정도를 지칭한다. 유사하게, 2 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 최대 대응도에 대해 비교되고 정렬될 때, 예를 들어, 서열 비교 알고리즘, 예를 들어, 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘 등을 이용하여 측정될 때, 또는 시각적 검사에 의해, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 동일한 또는 구체화된 백분율을 갖는 두 서열을 지칭한다. 예를 들어, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 블로섬 62(Blossum 62) 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램에 편입된 Needleman and Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 다른 예로서, 두 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 특히 바람직한 세트의 매개변수(및 달리 구체화되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 이용하는 블로섬 62 스코어링 매트릭스이다. 두 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 편입된 E. Meyers and W. Miller의 알고리즘(1989, Cabios, 4: 11-17)을 이용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련된 서열을 동정하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하도록 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul 등(1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 대해 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭핑된 정렬을 얻기 위해, 갭핑된 BLAST는 Altschul et al., (1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 세포 내 특정 생물학적 요소에 기인하는 활성을 지칭한다. 예를 들어, "면역글로불린", "항체" 또는 이의 단편 또는 변이체의 "생물학적 활성"은 항원 결정소에 결합하고, 이에 의해 면역학적 기능을 용이하게 하는 능력을 지칭한다. 다른 예로서, 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체의 생물학적 활성은 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체가, 예를 들어, 결합, 효소적 활성 등의 그의 천연 기능을 수행하는 능력을 지칭한다. 제3 예로서, 유전자 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 코작 서열 등의 생물학적 활성은 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는, 즉, 이의 번역을 각각 촉진시키거나, 향상시키거나 또는 활성화시키는 조절 요소 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여하는" 또는 "도입하는"은 세포에 대한, 대상체의 세포 및/또는 기관에 대한, 또는 대상체에 대한 재조합 단백질 발현을 위한 벡터의 전달을 지칭한다. 이러한 투여 또는 도입은 생체내, 시험관내 또는 생체밖에서 일어날 수 있다. 유전자 산물의 발현을 위한 벡터는 전형적으로 물리적 수단(예를 들어, 인산칼슘 형질감염, 전기천공법, 미량주사 또는 리포펙션)에 의한 세포 내로의 이종성 DNA의 삽입을 의미하는 형질감염에 의해; 또는 전형적으로 감염제, 즉, 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의한 세포 내로의 핵산 분자의 도입을 지칭하는 감염 또는 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
전형적으로, 세포는 세포 내로의 이종성 DNA(즉, 벡터)의 투여, 도입 또는 삽입을 위해 사용되는 수단에 따라서 "형질도입된", "감염된", "형질감염된" 또는 "형질전환된"으로서 지칭된다. DNA가 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입될 때 세포는 외인성 또는 이종성 DNA로 형질도입된다. 비바이러스 방법에 의해 DNA가 세포 내로 도입될 때 세포는 외인성 또는 이종성으로 형질감염된다. 비바이러스 방법은 화학적 방법(예를 들어, 리포펙션)과 비화학적 방법을 둘 다 포함한다. 용어 "형질도입된" 및 "감염된"은 바이러스 또는 바이러스 벡터로부터 이종성 DNA 또는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 받은 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 벡터로 형질도입, 감염, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등일 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 의해 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 분명할 것이다. 용어 "숙주 세포"는 본래의 형질도입, 감염, 형질감염 또는 형질전환된 세포 및 이의 자손을 지칭하는 것임이 인식될 것이다.
용어 "치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소를 지칭한다.
"안질환"은 눈 또는 눈의 하나 이상의 부분 또는 영역에 영향을 미치거나 또는 연루된 질환, 질병 또는 병태를 의미한다. 이렇게 해서, 안질환은 망막 질환 또는 눈 뒤쪽에서 조직의 광-민감성 층에 영향을 미치는 질환을 포함한다. 눈은 안구, 및 안구, 안구주위 근육(예컨대, 사근 및 직근) 및 안구 내의 또는 안구에 인접한 시신경의 일부를 구성하는 조직 및 유체를 포함한다.
조직 "외식편"은 동물로부터 영양 배지까지 전달된 조직의 조각이다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 유인원 및 인간을 비롯한, 인간과 비인간 영장류; 포유류 스포츠 동물(예를 들어, 말); 포유류 농장 동물(예를 들어, 양, 염소 등); 포유류 반려동물(개, 고양이 등); 및 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 포유류를 지칭한다.
본 발명의 다양한 조성물 및 방법을 이하에 기재한다. 특정 조성물 및 방법이 본 명세서에 예시되지만, 임의의 다수의 대안의 조성물 및 방법이 본 발명을 실행함에 있어서 사용하는 데 적용 가능하고 적합하다는 것이 이해된다. 또한 본 발명의 발현 작제물 및 방법의 평가는 당업계의 절차 표준을 이용하여 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술의 범주 내인 세포 생물학, 분자 생물학(재조합 기법을 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]에서 완전하게 설명되며, 이들 각각은 본 명세서에 명백하게 참고로 편입된다.
본 발명의 몇몇 양상은 예시를 위해 예시적 적용에 대해 이하에 기재한다. 수많은 구체적 상세한 설명, 관계 및 방법이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다는 것이 이해되어야 한다. 그러나, 적절한 분야의 당업자는 본 발명이 구체적인 상세한 설명 중 하나 없이 또는 다른 방법으로 실행될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본 발명은 작용 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는데, 일부 작용은 상이한 순서로 그리고/또는 다른 작용 또는 사건과 동시에 일어날 수 있다. 더 나아가, 모든 예시된 작용 또는 사건이 본 발명에 따른 방법을 실행하는 데 필요하지는 않다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 복수의 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 더 나아가, 용어 "포함하는(including)", "포함하다", "갖는", "가지다", "와 함께" 또는 이의 변형어가 상세한 설명 및/또는 청구범위 중 하나에서 사용되는 정도로, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정되거나 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "대략"은 주어진 값의 20%까지, 바람직하게는 10%까지, 더 바람직하게는 5%까지, 및 더 바람직하게는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 관해, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에 특정 값이 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내의 의미가 추정되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물과 관련하여 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본 명세서에 참고로 편입된다. 본 개시내용은 모순이 있는 정도로 편입된 간행물의 임의의 개시내용을 대체한다는 것이 이해된다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 초안이 작성될 수 있다는 것을 추가로 주목한다. 이렇게 해서, 이러한 언급은 청구범위 요소의 인용, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "유일하게", "단지" 등으로서 이러한 배타적 용어의 사용에 대한 선행적 기반으로서 작용하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명을 이유로 이러한 간행물보다 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 간행물의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제의 간행물과 상이할 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 당업자에 대해 동일한 의미를 가지며, 본 발명의 실행은 당업자의 지식 내에 있는 미생물의 통상적인 기법 및 재조합 DNA 기법을 사용할 것이다.
조성물
본 개시내용의 일부 양상에서, 조성물은 진핵생물 세포(들)에서 이식유전자의 발현을 제공한다. 일부 양상에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포이다. 일부 양상에서, 포유류 세포는 망막 세포, 예컨대, 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 광수용체 세포, 원추 세포, 간상 세포, 뮐러 아교 세포 또는 망막 색소 상피이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리뉴클레오타이드 카세트이다. "폴리뉴클레오타이드 카세트"는 전형적으로 서로 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 기능성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 조절 요소, 번역 개시 서열, 암호화 서열, 종결 서열 등을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 일반적으로, 대상 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA를 포함한다. 마찬가지로, 포유류 세포"에서 이식유전자의 발현을 위한 "폴리뉴클레오타이드 카세트는 세포에서 이식유전자의 발현을 촉진시키는 2개 이상의 기능성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'UTR, 번역 개시 서열, 암호화 서열, 종결 서열 등의 조합을 의미한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는: 5'에서 3' 순서로: (a) 선택적으로, 제1 인핸서 영역; (b) 프로모터 영역으로서, 상기 프로모터 영역은 진핵생물 세포에 특이적인, 상기 프로모터 영역; (c) 폴리펩타이드 유전자 산물을 암호화하는 암호화 서열; (d) 제2 인핸서 영역; 및 (e) 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 암호화 서열의 상류에 5' 비번역 영역(5'UTR)을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 프로모터 하류의 그리고 암호화 서열 상류의 인트론 영역을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 제2 인핸서 하류의 그리고 폴리아데닐화 부위 상류의 RNA 방출 신호를 추가로 포함한다. 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 카세트에 대해, 암호화 서열은 카세트에서 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 암호화 서열은 프로모터 영역, 인핸서 영역(들) 및 폴리아데닐화 부위에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트 내의 2 이상의 기능성 폴리뉴클레오타이드 서열의 배열은 포유류 세포에서 이식유전자의 향상된 발현을 제공한다. "향상된"은 비슷한 조절 요소와 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에 비해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 운반하는 세포에서 이식유전자의 발현이 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강해진다는 것을 의미한다. 바꿔 말하면, 본 개시내용의 하나 이상의 최적화된 요소, 즉, 기준 대조군 카세트, 예컨대, 본 명세서에 기재된 CMV 기준 대조군 카세트를 포함하지 않는 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 발현에 비해 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 이식유전자의 발현이 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강해진다. 소정의 실시형태에서, 향상된 발현은 하나 이상의 목적으로 하는 세포 유형에 특이적이거나 또는 이것으로 제한된다. 일 실시형태에서, 이식유전자는 세포를 둘러싸는 수성 환경 내로 세포에 의해 분비된 단백질을 암호화한다.
예를 들어, 이식유전자의 발현은 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에서보다 본 명세서에 개시된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 세포에서 향상되거나, 또는 증강되거나 또는 더 강해질 수 있다. 다른 예로서, 이식유전자의 발현은 상이한 인핸서 서열에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에서보다 본 명세서에 개시된 인핸서 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 세포에서 향상되거나, 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강해질 수 있다. 다른 예로서, 이식유전자의 발현은 상이한 5'UTR 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에서보다 본 명세서에 개시된 5'UTR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 세포에서 향상되거나, 또는 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강해질 수 있다. 다른 예로서, 이식유전자의 발현은 상이한 인트론 서열에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에서보다 본 명세서에 개시된 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 세포에서 향상되거나, 또는 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강할 수 있다. 또 다른 예에서, 이식유전자의 발현은 기준 대조군 카세트, 예컨대, 본 명세서에 개시된 CMV 기준 대조군 카세트에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 운반하는 세포에서보다 본 명세서에 개시된 바와 같은 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 세포에서, 향상되거나, 또는 증가되거나, 증강되거나 또는 더 강할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 발현 카세트는 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 특정 세포 또는 조직 유형에서 이식유전자의 발현(또는 기준 카세트에 비해 더 고수준의 발현)을 촉진시킨다. 세포 유형의 예는 HeLa 세포, HEK-293 세포, ARPE-19 세포(인간 망막 색소 상피 세포주), 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 광수용체 세포, 원추 세포, 간상 세포, 뮐러 아교 세포, 및 망막 색소 상피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 향상된 발현은 망막 조직 외식편 내 세포에서 관찰된다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포에서 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 분비 폴리펩타이드의 발현은 시험관내 또는 생체내에서 포유류 세포 내 기준 카세트로부터의 분비 폴리펩타이드의 발현보다 적어도 약 2×, 3×, 5×, 9×, 10×, 20× 또는 50× 더 높다. 더 일반적으로는, 분비 폴리펩타이드의 발현은 포유류 세포에서 기준 카세트로부터의 발현보다 2 내지 10×, 5 내지 10×, 9 내지 10×, 적어도 2×, 적어도 5×, 또는 적어도 10× 더 높다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 포유류 세포 배양물에서(예를 들어 이중 포유류 세포 배양물에서) 기준 카세트로부터 얻은 것보다 적어도 2배, 5배, 10배, 50배이거나 또는 더 많거나 또는 약 5 내지 약 10배인 수준으로 포유류 세포 배양물 내 분비 단백질을 발현시킨다.
이론에 의해 구속되는 일 없이, 세포외 환경(예를 들어, 배양물 상청액 또는 조직 기질)에서의 세포내 또는 세포외 이식유전자의 향상된 발현은 세포에서 유전자 산물의 더 빠른 증강 또는 세포에서 더 안정한 유전자 산물에 기인하는 것으로 여겨진다. 따라서, 대상 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트에 의한 이식유전자의 향상된 발현은 다수의 방법으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자가 비슷한 조절요소, 예컨대, 본 명세서에 기재된 CMV 기준 대조군 카세트의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다면 검출되는 발현보다, 조만간, 예를 들어, 7일후, 2주후, 3주후, 4주후, 8주후, 12주후 이상의 세포에 대한 폴리뉴클레오타이드 카세트의 접촉 후에 이식유전자의 발현을 검출함으로써 향상된 발현이 관찰될 수 있다. 세포당 유전자 산물 양의 증가로서 향상된 발현이 또한 관찰될 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포당 유전자 산물의 양에서 2배 이상의 증가, 예를 들어, 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가, 또는 10배 이상의 증가가 있을 수 있다. 향상된 발현은 또한 폴리뉴클레오타이드 카세트에 의해 운반된 검출 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키는 포유류 세포 수의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키는 포유류 세포 수의 2배 이상의 증가, 예를 들어, 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가 또는 10배 이상의 증가가 있을 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 폴리뉴클레오타이드 카세트에 비해 더 큰 백분율의 세포에서 검출 가능한 수준의 이식유전자를 촉진시킬 수 있으며; 예를 들어, 여기서 통상적인 카세트는, 예를 들어, 특정 영역에서 세포의 5% 미만에서 검출 가능한 수준의 이식유전자 발현을 촉진시킬 수 있고, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 해당 영역에서 5% 이상의 세포에서 검출 가능한 수준의 발현을 촉진시키며; 예를 들어, 접촉되는 세포의 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상, 일부 예에서 50% 이상, 55% 이상; 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상 또는 75% 이상, 예를 들어 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상은 검출 가능한 수준의 유전자 산물을 발현시킬 것이다. 세포의 생존도 및/또는 기능의 변경으로서 향상된 발현이 또한 관찰될 수 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 전형적으로 프로모터 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로모터 영역은 포유류 세포에서 암호화 서열의 발현을 촉진시킨다. 일부 예에서, 프로모터는 편재한 프로모터이며, 즉, 이는 다양한 세포, 조직 및 종에서 활성인 프로모터이다. 적합한 예는 액틴, 거대세포바이러스(CMV), 연장인자 1 알파(EF1α) 및 글리세르알데하이드 3-인산탈수소효소(GAPDH) 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 인핸서는 전사를 향상시키는 핵산 요소이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 암호화 서열 상류의 제1 인핸서 및 암호화 서열 하류의 제2 인핸서를 포함한다. 예시적인 적합한 인핸서는 EF1α, CMV, 완전한 EES 또는 이의 일부, 예컨대, 410-564 EES 또는 511-810 EES를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. EES(발현 인핸서 서열)는 인간 베타-인터페론의 인간 스캐폴드-부착 영역 또는 SAR에 대응한다(Agarwal, M et al. (1998) "Scaffold Attachment Region-Mediated Enhancement of Retroviral Vector Expression in Primary T Cells" J. Virol. 72(5):3720-3728). 소정의 실시형태에서, 상류의 인핸서는 EF1α 또는 CMV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 하류의 인핸서는 전체 발현 인핸서 서열(완전한 EES), 410-564 EES 또는 511-810 EES를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5' 비번역 영역을 암호화하는 서열, 즉, 암호화 서열에 대한 비번역 영역 5'(5'UTR로도 불림)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5'UTR은 폴리뉴클레오타이드 ATG를 함유하지 않는다. 예시적인 적합한 5'UTR 서열은 i) 아데노바이러스(TPL)로부터의 삼중 리더 서열(Logan, J et al. (June 1984) "Adenovirus tripartite leader sequence enhances translation of mRNAs late after infection" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81: 3655-3659); ii) 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(eMLP)로부터의 인핸서 요소 서열(Durocher, Y et al. (2002) "High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells" Nucl . Acids. Res. 30(2):e9); iii) UTR1; 및 iv) UTR2로부터 선택된 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 5'UTR은 5'에서 3' 순서로, TPL 및 eMLP 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 스플라이스 공여자/수용자 영역을 포함하는 인트론을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은 프로모터 영역의 하류에 위치되고, 유전자의 번역 개시 서열의 상류에 위치된다. 인트론은 인트론 스플라이싱을 통한 mRNA 가공 동안 RNA로 전사되고 제거되는 DNA 폴리뉴클레오타이드이다. 인트론을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 카세트는 일반적으로 인트론이 없는 것보다 더 높은 발현을 가진다. 인트론은 2- 내지 500배로 발현을 자극할 수 있다(Buchman and Berg, 1988. Mol Cell Bio, 8(10): 4395). 효율적으로 스플라이싱된 인트론은 사전-스플라이스 공여자, 분지점 및 Py 풍부 영역을 함유한다(Senapathy et al, 1990; Meth. Enzymol. 183, 252-78; Wu and Krainer, 1999; Mol Cell Biol 19(5):3225-36). 5' 인트론은 일반적으로 3' 단부에서의 인트론에 비해 더 효율적이다(Huang and Gorman, 1990; Mol Cell Bio, 10:1805). 인트론은 일반적으로 유전자 발현 수준의 증가로 알려져 있지만, 주어진 cDNA의 특정 증가는 (만약에 있다면) 경험적이며, 시험되어야 하고; 예를 들어, pSI 벡터에서 키메라 인트론은 21만큼 CAT 발현을 증가시키지만, 루시퍼라제 발현은 단지 3배만큼 증가시켰다. 예시적인 인트론 서열은 액틴, 연장인자 1 알파(EF1α), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터로부터의 인핸서 요소(eMLP) 및 CMV로부터의 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
세포에서 발현될 암호화 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 또는 cDNA일 수 있다. 암호화 서열은 그것이 작동 가능하게 연결된, 즉, 그것과 자연적으로 작동 가능하게 결합되지 않은 프로모터 서열 및/또는 5'UTR 서열에 대해 이종성일 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열은 그것이 작동 가능하게 연결된, 즉, 천연에서 프로모터 또는 5'UTR과 결합된 프로모터 서열 및/또는 5'UTR 서열에 대해 내인성일 수 있다. 유전자 산물은 본질적으로 포유류 세포에서 작용할 수 있거나, 또는 비본질적으로 작용할 수 있으며, 예를 들어, 분비될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자가 치료적 유전자일 때, 암호화 서열은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있는 목적으로 하는 유전자 산물 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 암호화하는 임의의 유전자일 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 카세트에서 암호화 서열은, 예를 들어, 옵신 단백질 또는 VEGF를 저해하는 단백질을 암호화할 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오타이드는 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키는 데 효과적인 단백질 또는 효소를 암호화할 수 있다.
다양한 바람직한 실시형태에서, 이식유전자는 세포로부터 분비된 펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 단백질은 치료적 단백질, 또는 대상체에서 치료를 위해 효과적인 단백질이다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 항-혈관형성 폴리펩타이드, 또는 새로운 혈관의 성장(혈관신생)을 저해하는 폴리펩타이드이다. 일부 형태에서, 분비된 단백질은 항-VEGF 단백질, 또는 혈관내피성장인자(VEGF)를 저해하는 단백질이다. 항-VEGF 단백질의 예는 라니비주맙, 베바시주맙 및 애플리버셉트를 포함한다. 항-VEGF 폴리펩타이드의 다른 예는 가용성 fms-유사 타이로신 키나제-1(sFLT-1)이다. 다른 예에서, 분비된 단백질은 VEGF-결합 단백질 또는 이의 기능성 단편, 예컨대, 미국 특허 제5,712,380호, 제5,861,484호 및 제7,071,159호에 개시된 임의의 것, 또는, 예를 들어, 미국 특허 제7,635,474호에 개시된 것과 같은 VEGF-결합 융합 단백질을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 일부 형태에서, 분비된 단백질은 단일 쇄 항체, 예를 들어 단일 쇄 항-VEGF 항체를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 실시형태에 따르면, 이식유전자는 sFLT-1, 더 구체적인 실시형태에서, 인간 sFLT-1을 암호화한다. 대안적으로, 이식유전자는 sFLT-1의 기능성 VEGF-결합 단편을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다(Wiesmann et al., 1997; Cell, 91: 695-704). 다른 실시형태에, 이식유전자는 A1AT, 또는 알파-1 항트립신을 암호화하며(Chiuchiolo et al., 2013, 24(4):161-173; Stoller and Aboussouan (2012) Am J Respir. Crit. Care Med.185(3):246-59), 이는 A1AT 결핍증과 관련된 질환을 치료하기 위한 방법에서의 용도를 발견할 수 있다.
sFLT-1은 VEGF 수용체 FLT-1의 가용성 절단 형태이고 또한 가용성 혈관내피성장인자 수용체-1(sVEGFR-1)로서 알려져 있다. 재조합 sFLT-1은 VEGF에 결합하고 저해한다(Kendall and Thomas, 1993; Proc Natl Acad Sci . 90(22): 10705-10709). 천연에서, 대안의 mRNA 스플라이싱에 의해 생성되고 막-근위 면역글로불린-유사 도메인, 막 신장 영역(transmembrane spanning region) 및 세포내 타이로신-키나제 도메인을 결여한다. 본 명세서에서 기재되는, "가용성" FLT-1 또는 sFLT-1은 세포막으로 제한되지 않는 FLT-1을 지칭한다. 비결합 sFLT-1은 세포외 공간 또는 용액 중에서 자유롭게 확산할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이식유전자 암호화 서열은 빈번하지 않게 나타난 코돈을 더 빈번하게 나타난 코돈으로 대체함으로써 발현을 향상시키도록 변형되거나 또는 "코돈 최적화"된다. 암호화 서열은 번역을 위해 아미노산을 암호화하는 mRNA 서열의 일부이다. 번역 동안, 각각의 61개의 트라이뉴클레오타이드 코돈은 20개의 아미노산 중 하나로 번역되어, 유전자 암호에서의 축퇴 또는 중복을 야기한다. 그러나, 상이한 세포 유형 및 상이한 동물 종은 동일한 아미노산에 대해 상이한 빈도로 tRNA(각각 안티코돈을 보유) 암호를 이용한다. 유전자 서열이 대응하는 tRNA에 의해 빈번하지 않게 나타나는 코돈을 함유할 때, 리보솜 번역 기작은 느릴 수 있어서, 효율적인 번역을 지연시킨다. 발현은 특정 종에 대해 "코돈 최적화"를 통해 개선될 수 있으며, 여기서 암호화 서열은 동일한 단백질 서열을 암호화하도록 변형되지만, 고도로 발현된 인간 단백질에 의해 고도로 나타나고/나타나거나 이용되는 코돈을 이용한다(Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). 일 양상에서, 암호화 서열은 영장류에서 번역을 위해 최적화된다. 본 발명의 일 양상에서, 이식유전자의 암호화 서열은 포유류 또는 영장류에서 빈번하게 발현되지 않는 코돈을 영장류에서 빈번하게 발현되는 코돈으로 대체하도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이식유전자에 의해 암호화된 암호화 서열은 상기 또는 본 명세서에 개시된 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하되, 암호화 서열 중 적어도 하나의 코돈은 상기 또는 본 명세서에 개시된 서열에서 대응하는 코돈보다 인간에서 더 높은 tRNA 빈도를 가진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 RNA 방출 신호를 추가로 포함한다. RNA 방출 신호는 핵으로부터 RNA의 방출을 향상시키는 시스-작용성 전사후 조절 요소이다. 예시적인 RNA 방출 서열은 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 및 우드처크 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)로부터의 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Higashimoto, T et al. "The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors" Gene Ther ., September 2007, 14(17):1298-1304).
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 폴리아데닐화 영역을 추가로 포함한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, RNA 중합효소 II 전사체는 또한 폴리(A) 신호, 폴리(A) 영역 또는 폴리(A) 꼬리로서 지칭될 수 있는 폴리아데닐화 영역의 절단 및 첨가에 의해 종결된다. 폴리 A 영역은 종종 모티프 AAUAAA의 반복부를 갖는 다중 연속적 아데노신 일인산염을 함유한다. SV40, 소 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 및 토끼 베타 글로빈으로부터 유래된 것을 포함하는 몇몇 효율적인 폴리아데닐화 부위가 동정되었다(Xu et al, 2001; Gene 272(1-2):149-156; Xu et al., 2002; J Control Rel. 81(1-2):155-163). 포유류 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 가장 효율적인 폴리A 신호는 관심 대사의 세포 유형 및 종 및 사용되는 특정 벡터에 의존할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 소 성장 호르몬(BGH), 인간 성장 호르몬(HGH) 및 베타-글로빈(β글로빈)으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리A 영역을 포함한다.
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 앞서 언급한 폴리뉴클레오타이드 요소 중 2 이상은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 생성하도록 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로 CMV 인핸서, CMV 또는 EF1α 프로모터, 선택적으로 CMVc 또는 EF1α 인트론, UTR1, UTR2 또는 TPL 및 eMLP 5'UTR, sFLT1에 대한 암호화 서열, 또는 분비된 폴리펩타이드, 완전한 EES, 410-564 EES, 또는 511-810 EES 인핸서, 선택적으로 HPRE 또는 WPRE RNA 방출 서열, 및 BGH, HGH, 또는 β글로빈 폴리아데닐화 신호 서열을 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다.
다른 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'으로부터 3' 순서로, CMV 인핸서, CMV 프로모터, TPL 및 eMLP 서열을 포함하는 5'UTR, 치료제를 암호화하는 암호화 서열(예를 들어, 치료적 폴리펩타이드), 전장 EES 인핸서, 및 HGH 폴리A 신호 서열을 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈-최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 76 내지 80으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, CMV 프로모터, TPL 및 eMLP 서열을 포함하는 5'UTR, 치료제를 암호화하는 암호화 서열, 410-564 EES 인핸서, HPRE RNA 방출 영역, 및 BGH 폴리아데닐화 신호를 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 81 내지 86으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, EF1α 프로모터, EF1α 인트론, UTR2 5'UTR, 치료제를 암호화하는 암호화 서열, 511-810 EES 인핸서, WPRE RNA 방출 영역, 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호를 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 70 내지 75로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, CMV 프로모터, CMVc 인트론, UTR1 5'UTR, 치료제를 암호화하는 암호화 서열, 전장 EES 인핸서, WPRE RNA 방출 영역, 및 베타-글로빈(β글로빈) 폴리아데닐화 신호를 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 92 내지 95로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, 액틴 프로모터, eMLP 인트론, 치료제를 암호화하는 암호화 서열, 511-810 EES 서열, HPRE RNA 방출 서열, 및 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호를 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈-최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 87 내지 91로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, 액틴 프로모터, 닭 베타-액틴 인트론, UTR1 5'UTR, 치료제를 암호화하는 암호화 서열, 410-564 EES 서열, HPRE RNA 방출 서열, 및 BGH 폴리아데닐화 부위를 작동 가능한 결합으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 항-혈관형성 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 암호화 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 이들 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 서열번호 92 내지 95로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위 및 특정 유전자 발현 벡터에 대한 조절 요소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 요소를 선택적으로 함유할 수 있다. 조절 서열의 예는 AAV 벡터에 대한 ITR, 플라스미드 벡터에 대한 박테리아 서열, 파지 인테그라제 벡터에 대한 attP 또는 attB 부위, 및 트랜스포존에 대한 전위요소를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양상에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 세포 장애 등을 치료하기 위해 유전자가 세포 생존도 및/또는 기능에 대해 갖는 효과를 결정하기 위해 동물 세포에 유전자를 전달하는 데 사용된다. 따라서, 본 발명의 일부 양상에서, 포유류 세포 내 이식유전자의 발현을 제공하는 조성물은 유전자 전달 벡터이되, 유전자 전달 벡터는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함한다.
포유류 세포에 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하는 용도를 발견하는 임의의 편리한 유전자 전달 벡터는 본 개시내용의 유전자 전달 벡터에 의해 포함된다. 예를 들어, 벡터는 단일 또는 이중 가닥 핵산, 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 전달 벡터는 DNA, 예를 들어, 네이키드 DNA, 예를 들어, 플라스미드 또는 미니서클 등일 수 있다. 벡터는 변형된 형태의 RNA를 포함하는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 유전자 전달 벡터는 RNA, 예를 들어, mRNA 또는 변형된 mRNA일 수 있다.
다른 예로서, 유전자 전달 벡터는 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 알파 바이러스 또는 레트로바이러스, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유선 종양 바이러스(MuMTV), 깁본 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 또는 렌티바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관 바이러스의 용도를 포함하는 실시형태가 이하에 더 상세하게 기재되지만, 당업자는 유사한 지식을 인식하고, 당업계의 기술은 비-AAV 유전자 전달 벡터도 마찬가지로 보유하게 할 수 있다는 것이 예상된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,585,676호 및 미국 특허 제8,900,858호에서 레트로바이러스 벡터의 논의, 및, 예를 들어, 미국 특허 제7,858,367호에서 아데노바이러스의 논의를 참조하며, 이들의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)이다. 이러한 실시형태에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 기능성 AAV 반전 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 5' 및 3' 단부 상에 측접된다. "기능성 AAV ITR 서열"은 ITR 서열 기능이 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징을 위해 의도되는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없고, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, 또는 AAV ITR은 임의의 몇몇 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 AAV 벡터는 전체 또는 부분으로 결실된 야생형 Rep 및 Cap 유전자를 갖지만, 기능성의 측접하는 ITR 서열을 보유한다. 특정 실시형태에서, AAV 바이러스 벡터는 AAV2 변이체 7m8이다.
일부 실시형태에서, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 등(이들 중 어떤 것은 유전자 전달 벡터로서 작용할 수 있음)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래될 수 있는 AAV 캡시드 내에서 캡시드에 싸여있다. 예를 들어, AAV 캡시드는 야생형, 또는 천연, 캡시드일 수 있다. 특정 관심 대상의 야생형 AAV 캡시드는 AAV2, AAV5 및 AAV9를 포함한다. 그러나, ITR에 의하는 바와 같이, 캡시드는 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없으며, 오히려 캡시드가 포유류 세포를 형질도입할 수 있다면, VP1, VP2 또는 VP3 서열에서 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 야생형 서열에 대해 변경될 수 있다. 바꿔 말하면, AAV 캡시드는 그것이 유래된 모 캡시드 단백질 또는 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는, 변이체 AAV 캡시드일 수 있다. 특정 관심 대상의 변이체 AAV는 본 명세서에 전체 개시내용이 참고로 편입된 미국 특허 제9,193,956호에 개시된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 AAV는 미국 특허 제9,193,956호에 개시된 7m8 변이체 캡시드 단백질(이는 본 명세서에서 AAV2.7m8 또는 7m8.AAV2로서 지칭될 수 있음)을 포함한다. 다른 실시형태에서, AAV는 미국 특허 제9,233,131호에서 서열번호 42로서 제공된 AAV2.5T 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, AAV는 AAVShH10 또는 AAV6 캡시드 단백질을 포함한다. 미국 특허 출원 공개 제20120164106호의 도 8A 내지 도 8C는 문헌[Klimczak, R.R. et al., PLOS One 4(10):e7467 (October 14, 2009)]에 또한 기재된 AAVShH10 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
바람직하게는, rAAV는 AAV 벡터가 그의 게놈을 독립적으로 추가로 복제하고 패키징할 수 없다는 점에서 복제 결함성이다. 예를 들어, 원추세포가 rAAV 비리온으로 형질도입될 때, 유전자는 형질도입된 원추 세포에서 발현되지만, 그러나, 형질도입된 원추세포가 AAV rep 및 cap 유전자 및 부속 기능 유전자를 결여한다는 사실 때문에, rAAV는 복제될 수 없다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 캡슐화하는 유전자 전달 벡터(예를 들어, rAAV 비리온)는 표준 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, rAAV 비리온의 경우에, 본 발명에 따른 AAV 발현 벡터는 생산자 세포 내로 도입될 수 있고, 이후에 AAV 헬퍼 작제물이 도입될 수 있으며, 여기서, 헬퍼 작제물은 생산자 세포에서 발현될 수 있는 AAV 암호 영역을 포함하고, 상보적 AAV 헬퍼는 AAV 벡터의 부재 하에 작용한다. 이 다음에 생산자 세포 내로 헬퍼 바이러스 및/또는 추가적인 벡터의 도입이 이어지되, 헬퍼 바이러스 및/또는 추가적인 벡터는 효율적인 rAAV 바이러스 생산을 뒷받침할 수 있는 부속 기능을 제공한다. 이어서, 생산자 세포는 rAAV를 생산하기 위해 배양된다. 이들 단계는 표준 방법을 이용하여 수행된다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 캡슐화하는 복제-결함 AAV 비리온은 AAV 패키징 세포 및 패키징 기법을 이용하여 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 이루어진다. 이들 방법의 예는, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 명확하게 편입된 미국 특허 제5,436,146호; 제5,753,500호, 제6,040,183호, 제6,093,570호 및 제6,548,286호에서 찾을 수 있다. 패키징을 위한 추가적인 조성물 및 방법은 Wang 등(미국 특허 제2002/0168342호)에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참고로 편입되어 있다.
포유류 세포를 효과적으로 형질도입하는 데 적합한 임의의 농도의 바이러스 입자는 시험관내 또는 생체내에서 포유류 세포와 접촉을 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는 108개 이상의 벡터 게놈/㎖(vg/㎖), 예를 들어, 5×108개의 벡터 게놈/㎖; 109개의 벡터 게놈/㎖; 5×109 개의 벡터 게놈/㎖, 1010 개의 벡터 게놈/㎖, 5×1010개의 벡터 게놈/㎖; 1011개의 벡터 게놈/㎖; 5 x1011개의 벡터 게놈/㎖; 1012개의 벡터 게놈/㎖; 5×1012개의 벡터 게놈/㎖; 1013개의 벡터 게놈/㎖; 1.5 x1013개의 벡터 게놈/㎖; 3×1013개의 벡터 게놈/㎖; 5×1013개의 벡터 게놈/㎖; 7.5×1013개의 벡터 게놈/㎖; 9x1013개의 벡터 게놈/㎖; 1×1014 개의 벡터 게놈/㎖, 5×1014개 이상의 벡터 게놈/㎖이지만, 전형적으로 1×1015개 이하의 벡터 게놈/㎖의 농도로 제형화될 수 있다. 유사하게, 목적으로 하는 효과를 부여하거나 또는 질환을 치료하기 위한 세포의 적절한 형질도입을 제공하는 데 적합한 임의의 총 수의 바이러스 입자가 포유류에게 투여될 수 있다. 다양한 바람직한 실시형태에서, 적어도 108; 5×108; 109; 5×109, 1010, 5×1010; 1011; 5 x1011; 1012; 5×1012; 1013; 1.5 x1013; 3×1013; 5×1013; 7.5×1013; 9x1013, 1×1014개의 바이러스 입자, 또는 5×1014개 이상의 바이러스 입자, 그러나 전형적으로는 1×1015개 이하의 바이러스 입자가 눈마다 주사된다. 포유류 또는 영장류 눈에 대한 벡터의 임의의 적합한 수의 투여가 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 단일 투여를 포함하고; 다른 실시형태에서, 담당 의사에 의해 적절한 것으로 여겨지는 시간에 걸쳐 다중 투여가 이루어진다.
대상 바이러스 벡터는 대상체에서 변화를 생성하기 위해 또는 대상체에서 질환을 치료하기 위해 대상체에 투여될 수 있는 임의의 적합한 단위 용량의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단위 용량은 1×108개 이상의 바이러스 벡터의 벡터 게놈, 예를 들어 적어도 약 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 또는 적어도 약 3×1014개 이상의 벡터 게놈, 소정의 예에서, 적어도 약 1×1014개의 벡터 게놈, 그러나 보통은 4x1015개 이하의 벡터 게놈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 단위 용량은 약 5×1015개 이하의 벡터 게놈, 예를 들어, 1×1014 또는 5×1014개 이하의 벡터 게놈, 예를 들어 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 또는 1×109개 이하의 벡터 게놈을 포함하고, 소정의 예에서, 1×108개 이하의 벡터 게놈, 및 전형적으로 1×108개 이하의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×1010 내지 1×1011개의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×1010 내지 3×1012개의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×109 내지 3×1013개의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×108 내지 3×1014개의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 약 1×1010 내지 약 5×1014개의 벡터 게놈을 포함한다.
일부 경우에, 약제학적 조성물의 단위 용량은 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)를 이용하여 측정될 수 있다. MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 다중도를 의미한다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 개시내용의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 이하의 MOI이다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물의 양은 약 1×108 내지 약 1×1015개의 재조합 바이러스, 약 1×109 내지 약 1×1014 재조합 바이러스, 약 1×1010 내지 약 1×1013개의 재조합 바이러스, 또는 약 1×1011 내지 약 3×1012 재조합 바이러스를 포함한다.
대상 rAAV 조성물을 제조함에 있어서, 예를 들어, 포유류 세포(예를 들어, 293 세포), 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포), 미생물 및 효모를 포함하는 rAAV 비리온을 생성하기 위한 임의의 숙주 세포는가 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 AAV rep 및 cap 유전자가 숙주 세포에서 안정하게 유지되는 패키징 세포 또는 AAV 벡터 게놈이 안정하게 유지되고 패키징되는 생산자 세포에서 일 수 있다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 SF-9, 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 정제되고 제형화된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로-허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물이다. 구체적 실시형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 유전자 전달 벡터는 일반적으로 안전하고, 비독성이며 바람직한 제형을 제조하는 데 유용한 약제학적으로-허용 가능한 담체, 희석제 및 시약과 조합될 수 있고, 영장류 용도에 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에 기체일 수 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 보충 활성 화합물은 또한 제형 내로 혼입될 수 있다. 제형을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아 화합물, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트 화합물, 예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대, 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염; 응집을 방지하기 위한 세정제, 예컨대, 트윈 20(Tween 20); 및 등장성 조절을 위한 화합물, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균이다.
원추 세포가 생체내에서 접촉되는 예에 대해, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 눈에 대한 전달을 위해 적절하게 처리될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제제에 대한 멸균 분말을 추가로 포함한다. 따라서, 약제학적 조성물은 멸균 주사용 용액 형태일 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 멸균이고, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 소정의 실시형태에서, 제조 및 저장 조건 하에서 안정하고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는, 예를 들어, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 분산물의 경우에 그리고 계면활성제의 사용에 의해 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 중에서 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 내부 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 용액은 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입시킨 다음, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산매 및 상기 열거한 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 이전의 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조이다.
일 실시형태에서, 조성물은 신체로부터의 빠른 제거에 대해 유전자 카세트 또는 발현 벡터를 보호하는 담체, 예컨대, 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형으로 제어된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명확할 것이다. 상기 물질은 또한 상업적으로 얻어질 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론성 항체로 감염된 세포에 표적화된 리포좀을 포함)은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위해 용량 단위 형태에서 경구, 안구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적으로 하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 사전 결정된 양의 유전자 전달 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 카세트를 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태에 대한 사항은 유전자 전달 벡터, 폴리뉴클레오타이드 카세트, 및 달성될 특정 치료적 효과의 독특한 특징에 의해 지시된다.
약제학적 조성물은 투여를 위한 설명과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서, 예를 들어, 주사기, 예를 들어, 사전 충전된 주사기에 포함될 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 그것이 투여되는 세포 또는 대상체에 대해 실질적으로 비독성인 재료, 물질, 희석제 또는 담체이다. 즉, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약제학적 조성물에 혼입될 수 있고, 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하는 일 없이 또는 그것이 함유되는 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호 작용하는 일 없이 세포 또는 환자에게 투여될 수 있다.
대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스(비리온)는 포유류 환자, 특히 영장류 및 더 구체적으로는 인간에 대한 투여를 위해 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들어, 비리온은 비독성, 비활성, 약제학적으로 허용 가능한 수성 담체에서 제형화될 수 있고, 바람직하게는 pH는 3 내지 8의 범위이고, 더 바람직하게는 6 내지 8, 또는 훨씬 더 바람직하게는 7 내지 8의 범위이다. 이러한 멸균 조성물은 재구성 시 허용 가능한 pH를 갖는 수성 완충제 중에 용해된 치료 분자를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터 또는 비리온을 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 식염수, 인산염 완충 식염수, 인산염 및 선택적으로 하나 이상의 다른 제제, 예컨대, 아미노산, 중합체, 폴리올, 당, 완충제, 보존제, 단백질 및 무기염, 예컨대, 염화나트륨과 혼합물로 치료적 유효량의 벡터 또는 비리온을 포함한다. 예시적인 아미노산, 중합체 및 당 등은 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터, 수크로스, 프럭토스, 덱스트로스, 말토스, 글루코스, 만니톨, 덱스트란, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 자일리톨, 락토스, 트레할로스, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트르산염, 아세트산염, 링거 및 행거 용액, 시스테인, 알기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 라이신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다. 바람직하게는, 이 제형은 적어도 6개월 동안 4℃에서 안정하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대, 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 멸균수 및 당업자에게 공지된 다른 완충제, 예컨대, 문헌[Good et al. (1966) Biochemistry 5(2):467-477]에 의해 기재된 것을 포함한다. 완충제의 pH는 6.5 내지 7.75, 바람직하게는 7 내지 7.5, 및 가장 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 범위일 수 있다. 약제학적 조성물은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 함유하는, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 아데노바이러스 벡터 전달 시스템을 포함할 수 있다.
방법
생체내에서 선택 세포를 표적화하고 세포에서 그리고 형질도입 사건 후 세포외 환경에서 치료적 유효량의 유전자 산물을 얻기 위해 본 발명의 유전자 발현 카세트를 전달하는 능력은 새로운 혈관의 성장에 의존하는 것을 포함하는, 다수의 상이한 질환의 치료에 유리할 수 있되, 치료 목적은 치료적 유효량으로 항-혈관형성 단백질을 분비하는 능력을 갖는 표적 세포를 구비하는 것일 수 있다. 임의의 이론에 의해 구속되는 일 없이, 발현 및 궁극적으로 치료적 단백질의 분비를 향상시킬 수 있는 발현 카세트는 표적 세포의 서브세트만이 유전자 전달 벡터에 의해 성공적으로 형질도입될 때조차 환자에 대해 임상적으로 상당한 이점을 제공하게 할 수 있다. 형질도입된 세포에 의한 치료적 단백질의 고수준 분비는 임의의 주어진 용량 또는 라운드의 유전자 요법으로 달성된 감염도 또는 형질도입 효율의 균형을 맞추게 할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 "대상 조성물"로서 총괄적으로 지칭되는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 및 유전자 전달 벡터는 동물 세포에서 이식유전자를 발현시키는 데 용도를 발견한다. 예를 들어, 대상 조성물은, 예를 들어, 유전자가 세포 생존도 및/또는 기능에 대해 갖는 효과를 결정하기 위해, 연구에서 사용될 수 있다. 다른 예로서, 대상 조성물은, 예를 들어, 장애를 치료하기 위해 의학에서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은, 적어도 부분적으로, 세포의 유전자 요법에 의해 처리될 수 있는 임의의 병태의 치료에서의 용도를 발견할 수 있다. 세포는 혈액, 눈, 간, 신장, 심장, 근육, 위, 장, 췌장 및 피부를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 치료적 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 바이러스 벡터 또는 비리온을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애, 예를 들어, 안질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 치료적 유전자 산물은 세포에서 그의 합성 후 세포로부터 분비되거나 또는 방출된 분비 폴리펩타이드, 또는 단백질이고, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 5'에서 3' 순서로: (a) CMV 서열(서열번호 1)을 포함하는 제1 인핸서 영역; (b) CMV 서열(서열번호 4)을 포함하는 프로모터 영역; (c) 5'에서 3' 순서로, TPL 및 eMLP 서열(각각 서열번호 11 및 서열번호 12)을 포함하는 5'UTR 영역; (d) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열; (e) 완전한 EES 서열(서열번호 13)을 포함하는 제2 인핸서 영역; 및 (f) HGH 폴리아데닐화 부위(서열번호 14)를 포함한다.
관련된 실시형태에서, 일부 방법은 시험관내 또는 생체내에서 세포 내 유전자의 발현을 제공하며, 상기 방법은 세포를 본 개시내용의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 시험관내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 생체내에서 일어나며, 즉, 대상 조성물은 대상체에게 투여된다. 조성물은 정맥내 주사 또는 주입을 통해 비경구로 또는 경구로 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 주사에 의해 눈에 투여될 수 있으며, 예를 들어, 망막, 망막하 또는 유리체에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 이는 망막 주사, 망막하 주사 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 소정의 실시형태에서, 이는 관심 대상의 조직 또는 기관에, 예를 들어 간 내로 주사를 통해 국소로 또는 직접적으로 투여된다.
대상체는 특정 질환 또는 장애에 대한 치료가 필요한 인간 대상체를 포함하는 포유류일 수 있다.
포유류 세포가 시험관내에서 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 접촉되는 예에 대해, 세포는 임의의 포유류 종, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 게르빌루스쥐, 다람쥐), 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 영장류, 인간으로부터 유래될 수 있다. 세포는 확립된 세포주로부터 유래될 수 있거나 또는 이는 1차 세포일 수 있고, 여기서 "1차 세포", "1차 세포주", 및 "1차 배양물"은 대상체로부터 유래되고 배양물의 제한된 수의 계대, 즉, 분할을 위해 시험관내에서 성장시킨 세포 및 세포 배양물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 예를 들어, 1차 배양물은 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회 또는 15회 계대될 수 있지만, 충분한 시간에 위기 단계를 거치지 않은 배양물이다. 전형적으로, 본 발명의 1차 세포주는 시험관내에서 10회 미만의 계대 동안 유지된다.
세포가 1차 세포라면, 그들은 임의의 편리한 방법, 예를 들어, 전체 외식편, 생검 등에 의해 포유류로부터 채취될 수 있다. 적절한 용액은 채취된 세포의 분산물 또는 현탁액에 대해 사용될 수 있다. 이러한 용액은 일반적으로 저농도, 일반적으로 5 내지 25mM에서 허용 가능한 완충제와 함께 송아지 태아 혈청 또는 다른 자연적으로 생기는 인자로 편리하게 보충된 균형 염 용액, 예를 들어, 정상 식염수, PBS, 행크스 균형 염 용액 등일 것이다. 편리한 완충제는 HEPES, 인산염 완충제, 락트산 완충제 등을 포함한다. 세포는 즉시 사용될 수 있거나 또는 그들은 장기간의 시간 동안 저장되고, 냉동되고, 해동되며, 재사용될 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 보통 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충 배지, 또는 이러한 냉동 온도에서 세포를 보존시키기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 일부 다른 이러한 용액에서 냉동될 것이고, 냉동된 배양 세포를 해동시키기 위해 당업계에 통상적으로 공지된 방식으로 해동된다.
이식유전자의 발현을 촉진시키기 위해, 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 약 30분 내지 24시간 이상, 예를 들어, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 24시간 등 동안 세포와 접촉될 것이다. 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 대상 세포에 1회 이상, 예를 들어, 1회, 2회, 3회, 또는 3회 초과로 제공될 수 있고, 세포는 각각의 접촉 사건 후의 일정한 시간, 예를 들어, 16 내지 24시간 동안 제제(들)와 함께 인큐베이션하도록 허용되며, 이 시간 후에 배지는 신선한 배지로 대체되고, 세포는 추가로 배양된다. 세포를 접촉시키는 것은 임의의 배양 배지에서 그리고 세포의 생존을 촉진시키는 임의의 배양 조건 하에 일어날 수 있다. 예를 들어, 세포는 송아지 태아 혈청 또는 열 비활성화 염소 혈청(약 5 내지 10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올 및 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충한 편리한 임의의 적절한 영양 배지, 예컨대, 이스코브 변형(Iscove's modified) DMEM 또는 RPMI 1640에서 현탁될 수 있다. 배양물은 세포가 반응하는 성장 인자를 함유할 수 있다. 본 명세서에 정의되는 성장 인자는 막관통 수용체 상의 특정 효과를 통해 배양물에서 또는 무손상 조직에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 인자를 포함한다.
전형적으로, 유효량의 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 세포에서 이식유전자의 발현을 생성하기 위해 제공된다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 유효량은, 예를 들어, 이식유전자 유전자 산물의 존재 또는 수준을 검출함으로써, 세포 등의 생존도 또는 기능에 대한 효과를 검출함으로써, 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 발현은 기준 또는 대조군 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 발현에 대해 2배 이상, 예를 들어 3배, 4배, 또는 5배 이상, 일부 예에서 10배, 20배 또는 50배 이상, 예를 들어, 100배로 향상될 수 있다. 비교 목적을 위한 기준 카세트의 일 예는 본 명세서에 기재된 CMV 기준 대조군 카세트이다. 구체적 실시형태에서, 이식유전자는 분비 단백질을 암호화하고, 폴리뉴클레오타이드 카세트는 포유류 세포에서 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 분비 단백질의 발현 수준보다 적어도 2배, 5배, 10배, 5 내지 10배, 5 내지 15배, 또는 10 내지 15배 더 높은 수준으로 포유류 세포에서 분비 단백질을 발현시킨다. 일부 실시형태에 따르면, 이식유전자가 비-분비 단백질을 암호화하는 것일 때, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 카세트는 포유류 세포에서 CMV 기준 대조군 카세트로부터의 비-분비 단백질 발현 수준과 거의 동일하거나, 10 내지 20% 내이거나, 약 1.5× 미만, 또는 약 2× 미만인 수준으로 포유류 세포에서 비분비 단백질을 발현시킨다. 각각의 카세트에 대한 분비 단백질의 발현 수준은 면역분석 또는 항원-포획 분석에 의해 측정될 수 있고, 세포외 환경(예를 들어, 세포 배양물 배지 또는 상청액)에서 상청액의 용적 당 단백질의 양 또는 농도로서 나타낼 수 있다.
생물학적 또는 세포 샘플에서 단백질의 존재 및 양(및 그에 따른 발현 수준)을 측정하기 위한 면역분석 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Hage, D.S. (1999) "Immunoassays" Analytical Chemistry 71(12):294-304; The Immunoassay Handbook, Fourth Edition: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques by David Wild (Editor), Elsevier Science (2013)] 참조). 일반적으로, 면역분석은 단백질에 특이적으로 결합하는 표적 단백질과 항체 또는 항체 단편 사이의 반응에 기반한다. 면역분석은 액체 또는 고체상 시스템에서 수행될 수 있지만, 검출의 용이함을 위해, 고체상이 바람직할 수 있다. 적합한 면역분석은 샌드위치 및 경쟁 분석, 웨스턴 블롯팅, ELISA(효소-결합 면역흡착 분석), 방사면역분석(radioimmunoassay: RIA), 형광면역분석(fluoroimmunoasay: FIA) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 세포 배양물 배지 또는 상청액(세포를 용해시키는 일 없이 배양물로부터 취한 샘플), 세포 용해물, 전체 세포, 혈액, 혈청, 혈장 또는 다른 체액 또는 조직일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식유전자가 선택 가능한 마커일 때, 세포의 집단은 변형된 세포를 남아있는 집단으로부터 분리시킴으로써 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 것이 풍부해질 수 있다. 분리는 사용되는 선택 가능한 마커에 적절한 임의의 편리한 분리 기법에 의할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자가 형광 마커라면, 세포는 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리될 수 있는 반면, 이식유전자가 세포 표면 마커라면, 세포는 친화도 분리 기법, 예를 들어, 자기 분리, 친화도 크로마토그래피, 고체 기질에 부착된 친화도 시약에 의한 "패닝(panning)" 또는 다른 편리한 기법에 의해 이종성 집단으로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 다양한 세련 정도를 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분류기, 예컨대, 다중 색 채널, 낮은 각도 및 둔감한 광산란 검출 채널, 임피던스 채널 등을 포함한다. 세포는 죽은 세포와 관련된 염료(예를 들어, 요오드화 프로피듐)를 사용함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 세포의 생존도에 지나치게 유해하지 않은 임의의 기법이 사용될 수 있다. 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포가 고도로 풍부한 세포 조성물은 이런 방식으로 달성된다. "고도로 풍부한"은 유전자 변형된 세포가 세포 조성물의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들어, 세포 조성물의 약 95% 이상, 또는 98% 이상일 것임을 의미한다.
세포가 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트 또는 대상 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 생체내에서 접촉되는 예에 대해, 대상은 임의의 포유류, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 게르빌루스쥐), 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 인간, 또는 비-인간 영장류일 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 적어도 부분적으로 세포의 유전자 요법에 의해 처리될 수 있는 임의의 병태의 치료에서의 용도를 발견한다. 세포는 혈액, 눈, 간, 신상, 심장, 근육, 위, 장, 췌장 및 피부를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태는 치료가 필요한 대상체에서 의학적 병태를 치료하기 위한 방법이며, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 카세트를 함유하는 유전자 전달 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 카세트는 의학적 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키는 데 효과적인 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 의학적 병태는 안질환이고, 유전자 전달 벡터는 아데노-연관 바이러스이고, 폴리펩타이드는 벡터에 의해 형질도입된 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드이다. 일 실시형태에서, 분비된 단백질은 VEGF 신호전달을 저해한다. 예를 들어, 분비된 단백질은 VEGF-결합 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 안질환은 맥락막 신생혈관 또는 황반변성이다. 황반변성의 구체적 형태는 급성 황반변성, 비-삼출성 연령 관련 황반변성, 및 삼출성 연령 관련 황반변성을 포함할 수 있다. 투여는, 예를 들어, 안구 전달, 유리체내 주사, 안내 주사, 망막 주사, 망막하 주사, 비경구 투여, 정맥내 주사 또는 주입, 및 간 내로의 주사를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 치료가 필요한 대상체의 눈에 투여된다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 안구내 주사를 통해, 유리체내 주사에 의해, 또는 임의의 다른 편리한 방식 또는 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 황반변성 또는 안구 신생혈관을 앓고 있거나 또는 이들이 발생할 위험에 있는 인간 대상체이다.
일부 실시형태에서, 대상 방법은 치료적 이점, 예를 들어, 장애의 발생 방지, 장애 진행의 중단, 장애 진행의 반전 등을 야기한다. 일부 실시형태에서, 대상 방법은 치료적 이점이 달성되었는지를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는 치료적 효능의 이러한 측정이 변형 중인 특정 질환에 적용 가능할 것임을 인식할 것이고, 치료적 효능을 측정하기 위해 사용하는 적절한 검출 방법을 인식할 것이다.
대상 이식유전자를 이용하는 이식유전자의 발현은 강하게 되는 것으로 예상된다. 따라서, 일부 예에서, 치료적 효능을 측정함으로써, 예를 들어, 유전자 산물의 수준을 측정하여 검출된 이식유전자의 발현은 대상 조성물의 투여 후 2개월 이하, 예를 들어, 투여 후 4, 3 또는 2주 이하, 예를 들어, 투여 후 1주에 관찰될 수 있다. 이식유전자의 발현은 또한 시간에 따라 지속되는 것으로 예상된다. 따라서, 일부 예에서, 치료적 효능 등을 측정함으로써, 예를 들어, 유전자 산물 수준을 측정하여 검출된 바와 같은 이식유전자의 발현은 대상 조성물의 투여 후 2개월 이상, 예를 들어, 4, 6, 8 또는 10개월 이상, 일부 예에서 1년 이상, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 5년, 소정의 예에서, 5년 초과에 관찰될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 상기 방법은 세포에서 이식유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하되, 발현은 본 개시내용의 하나 이상의 개선된 요소를 포함하지 않는 폴리뉴클레오타이드 카세트, 즉, 기준 대조군에 비해 향상된다. 전형적으로, 발현은, 예를 들어, 조기 검출, 더 고수준의 유전자 산물, 세포에 대한 더 강한 기능적 영향 등에 의해 증명되는 바와 같이, 기준, 즉, 대조군 폴리뉴클레오타이드 카세트로부터의 발현에 비해 2배 이상, 예를 들어, 3배, 4배 또는 5배 이상, 일부 예에서, 10배, 20배 또는 50배 이상, 예를 들어, 100배 향상될 것이다. 일 양상에서, 이식유전자는 분비 폴리펩타이드, 예컨대, sFLT1을 암호화한다.
전형적으로, 대상 조성물이 바이러스, 예를 들어 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는 rAAV라면, 대상체에서 변화를 달성하기 위한 또는 치료적 효과를 생산하는 유효량은 약 1×108개 이상의 벡터 게놈, 일부 경우에 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012 또는 1×1013개 이상의 벡터 게놈, 소정의 예에서, 1×1014개 이상의 벡터 게놈, 및 보통은 1×1016개 이하의 벡터 게놈일 것이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 약 1×1016개 이하의 벡터 게놈, 예를 들어, 1×1015개 이하의 벡터 게놈, 예를 들어 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010 또는 1×109개 이하의 벡터 게놈, 소정의 예에서 1×108개의 벡터 게놈, 및 전형적으로 1×108개 이하의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×1010 내지 1×1011개의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×1010 내지 3×1012개의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×109 내지 3×1013개의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×108 내지 3×1014개의 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 투여될 약제학적 조성물의 양은 감염다중도(MOI)를 이용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, MOI는 폴리뉴클레오타이드 카세트가 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 입자 또는 바이러스 게놈의 비 또는 다중도를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 또는 1×107 MOI이다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 재조합 바이러스의 약 1×108 내지 약 1×1015개의 입자, 재조합 바이러스의 약 1×109 내지 약 1×1014개의 입자, 재조합 바이러스의 약 1×1010 내지 약 1×1013개의 입자, 또는 재조합 바이러스의 약 1×1011 내지 약 3×1012개의 입자를 포함한다.
개개 용량은 전형적으로 대상체에 대해 측정 가능한 효과를 생성하는데 필요한 양 미만이 아니며, 대상 조성물 또는 그의 분산물의 흡수, 분포, 대사 및 배설(absorption, distribution, metabolism, and excretion: "ADME")을 위한 약물동태학 및 약리학에 기반하여, 그리고 그에 따라 대상 내의 조성물의 기질에 기반하여 결정될 수 있다. 이는 투여 경로뿐만 아니라 용량의 고려를 포함한다. 유효량의 용량 및/또는 용량 섭생은 전임상 분석으로부터, 안전성 및 점증 및 용량 범위 시험, 개개 임상의-환자 관계뿐만 아니라 시험관내 및 생체내 분석으로부터 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 모든 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개는 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
앞서 언급한 것으로부터, 본 발명의 구체적 실시형태가 예시의 목적을 위해 본 명세서에 기재되었지만, 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부하는 청구범위에 의하는 경우를 제외하고 제한되지 않는다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명으로 당업자에게 제공하기 위해 제시하며, 본 발명자들이 본 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도하지도, 그들이 이하의 실험이 수행하는 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도하지도 않는다. 사용한 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 관해 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 일부 실험적 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
분자 및 세포 생화학에서 일반적 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]으로서 이러한 표준 교재에서 찾을 수 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다. 본 개시내용에서 언급되는 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는 바이오래드(BioRad), 스트라타겐(Stratagene), 인비트로젠(Invitrogen), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 클론테크(Clontech)와 같은 상업적 공급업자로부터 입수 가능하다.
실시예 1
폴리뉴클레오타이드 발현 카세트의 작제
임의의 유전자 요법 방법의 개발에서 중요한 고려사항은 유전자를 전달하기 위해 사용하는 비히클 및 일단 세포 내에서 이식유전자의 생성을 유도하기 위해 사용하는 발현 카세트이다. 카세트는 바람직하게는 환자에 대해 빠르고 장기 지속적인 치료적 이점을 제공하기에 충분한 수준으로 이식유전자의 강한 발현을 촉진시키는 것이다. 이를 위하여 표준 재조합 DNA 클로닝 기법을 이용하여 조절 요소 및 단백질 암호화 서열의 다양한 조합 및 순열을 함유하는 일련의 폴리뉴클레오타이드 발현 카세트를 생성하였다(도 1).
실시예 2
재조합 플라스미드의 작제
각각의 후보 폴리뉴클레오타이드 카세트 및 애플리버셉트를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 작제하고, 통상적인 DNA 재조합 및 클로닝 기법을 이용하여 이콜라이에서 클로닝시켰다. 각각의 카세트를 AAV 게놈에 대한 카세트의 후속적 전달 및 재조합 AAV 비리온의 제조를 위해, 카세트 11에 대해 벡터에 나타낸 바와 같이(도 11) 아데노-연관 바이러스 혈청형 2(AAV2)의 반전 말단 반복부(ITR) 서열 사이에 위치시켰다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 카세트(11)는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, CMV 프로모터, TPL 및 eMLP로부터의 서열을 포함하는 5'UTR, 단백질 암호화 서열, 전체 발현 인핸서 서열(EES), 및 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(HGH polyA)을 포함하였다. 유사한 방식으로, 카세트(12)는 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서, CMV 프로모터, TPL 및 eMLP 5'UTR 서열, 단백질 암호화 서열, 발현 인핸서 서열의 410-564 부분(410-564 EES), B형 간염 바이러스의 시스-작용성 전사후 조절 요소(HPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리A)을 포함하였다. 이들 연구에서 사용한 바와 같은 카세트 10, 11, 12 및 14에 대한, 그리고 CMV 기준 대조군 카세트에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열을 각각 표 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸다. ITR, 조절 요소, 및 암호 영역을 표의 상부에서 시작하여 표의 하부까지 계속해서 플라스미드에서 5'에서 3 순서로, 그들이 나타나는 것과 같이 열거한다. CMV 기준 카세트(표 5)를 또한 작제하였고, 본 개시내용의 다른 선택 카세트와의 나란한 비교로 검사하였다.
실시예 3
시험관내 형질감염된 포유류 세포에서의 단백질 발현
시험관내에서 각각의 카세트의 발현 특성을 평가하기 위해, FuGENE(등록상표)6 형질감염 시약(프로메가(Promega))을 이용하여 포유류 세포에 형질감염시켰다. 제1 실험 시리즈에서(도 2), 카세트는 번역 시 세포로부터 분비된 단백질을 암호화하였다. 형질감염 후에, 세포를 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 각각의 배양물로부터의 세포 배양물 상청액을 샘플링하고 나서, 면역 분석에 의해 분석하여 각각의 형질감염 세포 배양물에 의한 분비된 단백질 수준을 평가하였다. 도 2는 도 1에 기재한 "기본 플라스미드" 카세트의 발현 수준에 대해 카세트 C1-C18에 대한 발현 수준을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 카세트 11 및 12로 형질감염시킨 해당 세포에 대해 HeLa 세포에 의한 가장 높은 평균 발현을 관찰하였다.
실시예 4
시험관내 형질도입된 포유류 세포에서의 단백질 발현
도 2에 나타낸 결과에 기반하여, 추가 연구를 위해 5개의 카세트(C7, C11, C12, C13 및 C14)를 선택하였다. 재조합 아데노-연관 바이러스에 의해 시험관내에서 포유류 세포에 전달될 때 각각의 카세트로부터의 분비된 단백질의 발현을 비교하기 위해 실험을 수행하였다. 도 2에 나타낸 HeLa 세포 연구에서 사용한 C7, C11, C12, C13 및 C14 카세트를 AAV7m8 캡시드 내에서 각각 패키징하였다(Dalkara et al. Sci. Transl. Med., 2013, Vol. 5, Issue 189, 189ra76). HEK293 세포의 별개의 배양물을 3×105의 MOI에서 각각 재조합 AAV7m8 벡터로 형질도입하고, 이어서, 3일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 상청액을 각각의 배양물로부터 수집하였고, 3일의 인큐베이션 과정에 걸쳐 각각의 배양물에 의한 상청액 중의 분비된 단백질 양을 측정하기 위해 면역분석을 이용하여 분석하였다. 형질감염된 HeLa 세포에서와 같이(도 2), 카세트 11 및 12로 형질도입된 해당 세포에 대해 HEK293 세포에서 가장 높은 발현이 관찰되었다(도 3).
실시예 5
형질도입된 돼지 망막 외식편 배양물에서의 단백질 발현
도 3에 나타낸 연구에서 사용한 재조합 AAV2.7m8 벡터를 돼지 망막 외식편 배양물에서 추가로 시험하였다. 돼지 망막은 인간과 유사하고 따라서 전임상 시험에서 적합한 대용물로서 작용할 수 있는 해부학적 및 생리적 특징을 가진다. 전층 망막의 외식편 배양물을 복잡한 세포내 과정 및 신경 망막 세포에서의 소통을 보존하며, AAV 벡터 변이체의 표적-조직 확인에서의 유용한 모델이다.
돼지 망막 외식편의 형질도입
7m8.AAV2 벡터는 야생형 AAV2보다 더 양호하게 광수용체를 도입할 수 있는 변이체 AAV2 벡터이다(Dalkara et al. Sci . Transl . Med. "In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous", 2013, Vol. 5, Issue 189, 189ra76). 전층 망막을 갖는 돼지 망막 외식편을 2 x 104의 MOI에서 7m8 벡터로 형질도입하였다. 형질도입 후 1주 및 2주에 상청액을 수집하였고, 상청액 중에 존재하는 분비된 단백질의 양을 면역 분석에 의해 측정하였다. 실험을 2회 중복하여 실행하였고(외식편 1 및 2), 배양물 상청액 중의 단백질 양으로 측정하여 각각의 형질도입된 외식편으로부터 발현되고 분비된 단백질 수준을 나타내는 결과를 비-형질도입된 "비히클" 대조군 외식편의 배경 수준과 함께 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 카세트의 이런 패널에 대한 단백질 발현 수준의 경향은 시험관내 형질도입된 HEK293 세포에 대해 관찰된 경향과 상관관계가 있으며(도 3), 카세트 11, 12 및 14는 3가지의 가장 높은 발현 수준을 제공하고, 카세트 7 및 13은 가장 낮은 발현 수준을 제공하였다.
실시예 6
시험관내 형질감염된 포유류 세포에서의 sFLT-1의 발현
다른 단백질 및 다른 포유류 세포 유형에 관해 카세트의 발현 특성을 연구하는데 관심이 있었다. 이 목적을 위해, 두 가지 다른 단백질, 즉, sFLT-1 및 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 암호화 서열을 폴리뉴클레오타이드 카세트 C10, C11 및 C12에 별개로 클로닝시켰다. 비교를 위해, sFLT1을 암호화하는 서열을 또한 기본 플라스미드 카세트(도 1) 및 CMV 제어 카세트("CMV-sFLT1")에 별개로 클로닝시켰다. CMV-sFLT1 대조군 작제물은 표 5에 기재하는 바와 같이 5'에서 3' 순서로, CMV 인핸서 서열(서열번호 2), CMV 프로모터(서열번호 21), 키메라 인트론(서열번호 22), 5'UTR(서열번호 23), sFLT-1을 암호화하는 암호화 서열(서열번호 24), 3'UTR(서열번호 25) 및 SV40 폴리A 서열(서열번호 26)을 포함하였다. CMV-sFLT1 대조군 작제물을 제외하고, sFLT-1에 대한 암호화 서열(또한 본 명세서에서 sFLT1로서 지칭)을 영장류 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화하였다(CO).
sFLT1-암호화 벡터를 3가지 상이한 세포주(망막 색소 상피 세포주(ARPE19 세포), HEK293 세포, 및 HeLa 세포)에 형질감염시켰다. FuGENE(등록상표)6 형질감염 시약을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염 단계 후에, 세포를 48시간 동안 인큐베이션시키고, 세포 배양물 상청액 중에 존재하는 sFLT1 단백질의 양을 알앤디 시스템즈(R & D Systems)로부터의 sFLT1 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 카세트 7, 11 또는 13의 제어 하에 GFP를 암호화하는 플라스미드를 HeLa 세포에 형질감염시키고 나서, CMV 프로모터(CMV-sFLT1, 상기 기재)의 제어 하에 GFP를 발현시키는 플라스미드와 비교하였다. 대략 48시간 후에, 세포를 트립신 처리하였고, 각각의 배양물에서 GFP-양성 세포의 백분율을 유세포분석에 의해 평가하였다(BD FACSCalibur(상표명)). 결과를 도 5 내지 8에 나타낸다. 일반적으로, 임의의 다른 시험 카세트에 비해 카세트 11 및 12로 형질감염시킨 세포에서 sFLT1의 가장 높은 발현을 관찰하였다(도 5 내지 7). 더 구체적으로는, ARPE19 세포에서 카세트 11로부터의 sFLT1의 발현( = 118,721pg/㎖)은 ARPE19 세포에서 CMV-sFLT1 제어 카세트로부터의 sFLT1의 발현( = 54268.53pg/㎖)보다 약 2.2×(또는 약 2배) 더 높았다(도 5). HEK293 세포에서 카세트 11로부터의 sFLT1의 발현( = 148985.40pg/㎖)은 HEK293 세포에서 CMV-sFLT1 제어 카세트로부터의 sFLT1의 발현( = 16525.9pg/㎖)보다 약 9× 더 높았다(도 6). 그리고 형질감염된 HeLa 세포에서 카세트 11로부터의 sFLT1의 발현( = 204957.57pg/㎖)은 HeLa 세포 배양물에서 CMV-sFLT1 제어 카세트로부터의 sFLT1의 발현( = 22363.03pg/㎖)보다 약 9× 더 높았다(도 7). 놀랍게도, 그러나, 카세트 11로부터 발현된 sFLT1의 수준은 시험한 임의의 다른 카세트로부터 발현된 sFLT1의 수준보다 지속적으로 더 높았고, 시험한 모든 세포주에서 CMV-sFLT1 제어 카세트로부터 발현된 sFLT1의 수준보다 상당히 더 높았지만(도 5 내지 7), 카세트 11은 암호화 서열이 GFP를 암호화한 것으로 바뀌었을 때의 CMV-제어 카세트에 비해 세포 당 유사한 수준의 단백질을 제공하였다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 카세트 11 및 CMV-sFLT1(앞서 각각의 카세트가 sFLT1을 암호화할 때에 관찰)에 의해 포유류 세포에서 발현된 단백질 양의 차이 배수는 암호화 서열이 분비된 단백질인 sFLT1을 암호화하는 것으로부터 비분비 세포질 단백질로 변화될 때 상당히 감소되었다. 이들 예상치 못한 결과에 기반하여, 다른 카세트에 비해 카세트 11은 세포로부터 분비된 폴리펩타이드를 발현시키는 데 특히 적합한 것으로 여겨진다.
실시예 7
형질도입된 포유류 세포에서 sFLT-1의 발현
추가 연구에서, 인간 FLT-1을 암호화하는 코돈-최적화된 암호화 서열을 함유하는 C10 및 C11 카세트, 및 대조군 CMV-sFLT-1 카세트를 7m8 캡시드에서 패키징하여 다양한 카세트 작제물의 제어 하에 sFLT-1을 암호화하는 재조합 7m8.AAV2 비리온을 형성하였다. CMV-sFLT1 대조군 작제물을 또한 야생형 AAV2 캡시드(AAV2-CMV-sFLT1)에서 패키징하였다. HEK293 세포를 1×105의 MOI에서 각각 아데노-연관 바이러스 작제물로 형질도입하였다. 형질도입 3일 후에, 각각의 배양물로부터의 상청액을 수집하고 나서, sFLT-1 ELISA 키트를 이용하여 각각의 상청액 샘플 중의 sFLT-1의 농도를 분석하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 카세트 11(C11)로 형질도입된 HEK293 세포에서 가장 높은 발현이 관찰되었다. 형질도입된 HEK293 세포에서 카세트 11로부터의 sFLT-1의 발현은 대조군 CMV-sFLT1 카세트로부터의 sFLT-1 발현보다 대략 50× 더 높았다(33661pg/㎖를 718pg/㎖와 비교). 도 9의 우측에 나타낸 데이터는 C11 형질도입된 세포로부터의 상청액은 분석의 표준 곡선 범위에서 샘플을 갖도록 추가로 희석되어야 한다는 것을 나타낸다.
실시예 8
형질도입된 돼지 망막 외식편에서 sFLT-1의 발현
sFLT-1 망막 조직의 발현을 비교하기 위해, 돼지 망막 외식편을 도 9에 나타낸 각각의 재조합 AAV 벡터로 형질도입하였다. 실험을 3회 중복하여 실행하고 나서, 각각의 외식편을 4 × 104의 MOI로 형질도입하였다. 형질도입 후에, 배지를 3일마다 바꾸었다. 2주 후에, 3일된 배지를 각각의 외식편 배양물로부터 수집하였고, 각각의 배양물로부터의 배지에서 sFLT-1의 양을 sFLT-1 ELISA 키트를 이용하여 평가하였다. 추가로, 망막 외식편을 용해시키고, 조직 용해물을 세포 내에서 sFLT-1 발현에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 카세트 11의 제어 하에 sFLT-1을 암호화하는 AAV2.7m8(7m8-C11-CO.sFLT)로 형질도입된 외식편으로부터의 상청액 중의 sFLT-1의 양은 CMV 카세트의 제어 하에 sFLT-1을 암호화하는 AAV2.7m8(7m8-CMV-sFLT1)로 형질도입된 외식편의 상청액 중의 sFLT-1의 양보다 평균적으로 대략 60× 더 높다. 다양한 외식편 배양물로부터의 상청액 중의 sFLT-1 양의 상대적 차이는 세포 내에서 발견되는 sFLT-1 단백질 양의 상대적 차이와 상관관계가 있었으며(도 10; 조직 용해물), 이는 도 9 및 도 10에 나타내는 바와 같이 시험한 7m8-CMV-sFLT1 제어 카세트 및 다른 sFLT-1-암호화 카세트로 형질도입된 세포에서 그리고 주변에서(즉, 이의 세포외 환경에서) 관찰된 sFLT-1의 수준에 비해, 카세트 11이 포유류 세포에서 sFLT-1의 더 높은 발현을 촉진시키고, 이에 의해 형질도입된 세포 외부에서 더 고수준의 단백질 분비를 용이하게 한다는 것을 나타낸다.
실시예 9
형질도입된 게르빌루스쥐 눈에서 애플리버셉트의 발현
추가 연구에서, 카세트 C7, C11, C12, C13, C14에 의해 유도된 애플리버셉트의 발현을 게르빌루스쥐에서 생체내에서 비교하였다. AAV 벡터를 실시예 4에 기재한 바와 같이 조립하였다. 추가로, 코돈-최적화된 애플리버셉트를 발현시키는 MNTC 발현 카세트를 함유하는 AAV7m8 캡시드를 조립하였다. 8마리 동물의 그룹은 2×1010개의 vg/눈으로 비히클, AAV.7m8-C7-Co-애플리버셉트, AAV.7m8-C11-Co-애플리버셉트, AAV.7m8-C12-Co-애플리버셉트, AAV.7m8-C13-Co-애플리버셉트, 또는 AAV.7m8-C14-Co-애플리버셉트 중 하나의 양쪽 유리체내(IVT) 주사를 받았다. 주사 후 8주 및 16주에, 4마리의 동물을 희생시키고, (i) 망막, (ii) 유리체, (iii) 망막/맥락막, 및 (iv) 홍채/모양체로 해부하고 나서, 각각의 눈에서의 애플리버셉트 발현을 분석하였다(총 8개의 눈/그룹/시점).
변형된 샌드위치형 ELISA를 이용하여 조직 샘플에서 유리 애플리버셉트 발현을 측정하였다. 구체적으로, 재조합 인간 VEGF 단백질로 마이크로타이터 플레이트를 코팅하였다. 단백질 샘플을 각각의 웰에서 인큐베이션시켰고, 이를 후속적으로 세척하였다. 세척 후에, 겨자무과산화효소(HRP) 접합된 항-인간 IgG 단클론성 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 항체를 애플리버셉트 단백질의 Fc 도메인에 결합시키고, 그 자체를 웰 표면에 결합된 VEGF에 의해 포획하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 세척하고 나서, 루니놀의 첨가에 의해 결합된 효소 활성을 결정한 후에 466㎚에서 광 방출을 측정하였다.
8주와 16주 시점 둘 다에서 시험한 각각의 조직 샘플에서 각각의 작제물로부터 발현을 검출하였고, 시점 둘 다에서 각각의 작제물에 대해 유리체에서 가장 높았다.
카세트 11에 대해 예시한 바와 같이, AAV로부터의 반전 말단 반복부(ITR) 서열을 AAV 게놈에 대한 카세트의 후속적 전달을 위해 임의의 카세트 주변의 측접 위치에 위치시킬 수 있다. 코작(Kozak) 서열(예를 들어, GCCACC)은 암호화 서열의 개시 코돈의 5'에서 일어날 수 있다. CMV 기준 대조군 카세트는 관심 대상의 임의의 이식유전자를 포함할 수 있다. 표 5는 하나의 예시적 환경을 나타내되, 이식유전자는 sFLT-1을 암호화한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ADVERUM BIOTECHNOLOGIES, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENE EXPRESSION
<130> IPA191065-US
<150> US 62/472,892
<151> 2017-03-17
<160> 97
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 293
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 1
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta cca 293
<210> 2
<211> 659
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 2
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataacc 659
<210> 3
<211> 171
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 60
agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 120
ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt c 171
<210> 4
<211> 220
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 4
tgctgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 60
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 120
actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 180
ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 220
<210> 5
<211> 923
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 60
ccttgaatta cttccacctg gctccagtac gtgattcttg atcccgagct ggagccaggg 120
gcgggccttg cgctttagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 180
gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 240
agtctctagc catttaaaat ttttgatgac gtgctgcgac gctttttttc tggcaagata 300
gtcttgtaaa tgcgggccag gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg cccgcggccg 360
gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 420
caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 480
cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 540
gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctccaggggg ctcaaaatgg aggacgcggc 600
gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 660
ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 720
ggagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 780
cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 840
tggaatttgg cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 900
aaagtttttt tcttccattt cag 923
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
acacccaagc tgtctagagc cgccacc 27
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
<210> 8
<211> 589
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis virus
<400> 8
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcctctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 9
<211> 251
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 9
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 60
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 120
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aatacaatag 180
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtacccag gtgctgaaga attgacccgg 240
ttcctcctgg g 251
<210> 10
<211> 127
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 10
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttcc 127
<210> 11
<211> 318
<212> DNA
<213> Human adenovirus 2
<400> 11
ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tgggctcgcg gttgaggaca 60
aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtac 120
tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc tctcgagaaa 180
ggcgtctaac cagtcacagt cgcaaggtag gctgagcacc gtggcgggcg gcagcgggtg 240
gcggtcgggg ttgtttctgg cggaggtgct gctgatgatg taattaaagt aggcggtctt 300
gagacggcgg atggtcga 318
<210> 12
<211> 102
<212> DNA
<213> Human adenovirus 2
<400> 12
ccagctgttg gggtgagtac tccctctcaa aagcgggcat tacttctgcg ctaagattgt 60
cagtttccaa aaacgaggag gatttgatat tcacctggcc cg 102
<210> 13
<211> 810
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 810
<210> 14
<211> 202
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 60
actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 120
gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg 180
ggaagaaacc tgtagggcct gc 202
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus 2
<400> 15
gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 60
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 120
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 145
<210> 16
<211> 155
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ggcatgcttc tatattattt tctaaaagat ttaaagtttt gccttctcca tttagactta 60
taattcactg gaattttttt gtgtgtatgg tatgacatat gggttccctt ttatttttta 120
catataaata tatttccctg tttttctaaa aaaga 155
<210> 17
<211> 726
<212> DNA
<213> Human hepatitis B virus
<400> 17
ataacaggcc tattgattgg aaagtttgtc aacgaattgt gggtcttttg gggtttgctg 60
ccccttttac gcaatgtgga tatcctgctt taatgccttt atatgcatgt atacaagcaa 120
aacaggcttt tactttctcg ccaacttaca aggcctttct cagtaaacag tatatgaccc 180
tttaccccgt tgctcggcaa cggcctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 240
ctggttgggg cttggccata ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg tctcctctgc 300
cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaacc 360
tcatcgggac cgacaattct gtcgtactct cccgcaagta tacatcgttt ccatggctgc 420
taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc 480
tgaatcccgc ggacgacccc tcccggggcc gcttggggct ctaccgcccg cttctccgtc 540
tgccgtaccg tccgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt 600
ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg aggccaccgt 660
gaacgcccac cggaacctgc ccaaggtctt gcataagagg actcttggac tttcagcaat 720
gtcatc 726
<210> 18
<211> 170
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 18
gtaagtctgt tgacatgtat gtgatgtata ctaacctgca tgggacgtgg atttacttgt 60
gtatgtcaga tagagtaaag attaactctt gcatgtgagc ggggcatcga gatagcgata 120
aatgagtcag gaggacggat acttatatgt gttgttatcc tcctctacag 170
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
agcttgcttg ttctttttgc agaagctcag aataaacgct caactttggc 50
<210> 20
<211> 387
<212> DNA
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 20
tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 60
actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 120
gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 180
tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 240
ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 300
attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 360
agctgtccct cttctcttat ggagatc 387
<210> 21
<211> 83
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 21
ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 60
ctcgtttagt gaaccgtcag atc 83
<210> 22
<211> 133
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 22
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60
cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120
tttctctcca cag 133
<210> 23
<211> 197
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 23
ggggctcggg tgcagcggcc agcgggcgcc tggcggcgag gattacccgg ggaagtggtt 60
gtctcctggc tggagccgcg agacgggcgc tcagggcgcg gggccggcgg cggcgaacga 120
gaggacggac tctggcggcc gggtctttgg ccgcggggag cgcgggcacc gggcgagcag 180
gccgcgtcgc gctcacc 197
<210> 24
<211> 2064
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120
cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180
tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240
tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300
cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360
gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420
gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480
acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540
ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600
gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660
ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720
aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780
agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840
cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900
atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960
tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020
cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080
gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140
gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200
gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260
actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac 1320
ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct 1380
caacctacaa tcaagtggtt ctggcacccc tgtaaccata atcattccga agcaaggtgt 1440
gacttttgtt ccaataatga agagtccttt atcctggatg ctgacagcaa catgggaaac 1500
agaattgaga gcatcactca gcgcatggca ataatagaag gaaagaataa gatggctagc 1560
accttggttg tggctgactc tagaatttct ggaatctaca tttgcatagc ttccaataaa 1620
gttgggactg tgggaagaaa cataagcttt tatatcacag atgtgccaaa tgggtttcat 1680
gttaacttgg aaaaaatgcc gacggaagga gaggacctga aactgtcttg cacagttaac 1740
aagttcttat acagagacgt tacttggatt ttactgcgga cagttaataa cagaacaatg 1800
cactacagta ttagcaagca aaaaatggcc atcactaagg agcactccat cactcttaat 1860
cttaccatca tgaatgtttc cctgcaagat tcaggcacct atgcctgcag agccaggaat 1920
gtatacacag gggaagaaat cctccagaag aaagaaatta caatcagagg tgagcactgc 1980
aacaaaaagg ctgttttctc tcggatctcc aaatttaaaa gcacaaggaa tgattgtacc 2040
acacaaagta atgtaaaaca ttaa 2064
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Human cytomegalovirus
<400> 25
aggactcatt aaaaagtaac 20
<210> 26
<211> 222
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 26
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222
<210> 27
<211> 1075
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 1 full 5'
<400> 27
ctctggagac gcaacctttg gagctaagcc agcaatggta gagggaagat tctgcacgtc 60
ccttccaggc ggcctccccg tcaccacccc ccccaacccg ccccgaccgg agctgagagt 120
aattcataca aaaggactcg cccctgcctt ggggaatccc agggaccgtc gttaaactcc 180
cactaacgta gaacccagag atcgctgcgt tcccgccccc tcacccgccc gctctcgtca 240
tcactgaggt ggagaatagc atgcgtgagg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 300
atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaacgg gtgcctagag 360
aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 420
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 480
gtttgccgcc agaacacagc gtctcagggg agatctcgtt tagtgaaccg tcagatcctc 540
actctcttcc gcatcgctgt ctgcgagggc cagctgttgg gctcgcggtt gaggacaaac 600
tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtactcc 660
gccaccgagg gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc 720
gtctaaccag tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggtggcg 780
gtcggggttg tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag 840
acggcggatg gtcgaggtga ggtgtggcag gcttgagatc cagctgttgg ggtgagtact 900
ccctctcaaa agcgggcatt acttctgcgc taagattgtc agtttccaaa aacgaggagg 960
atttgatatt cacctggccc gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg 1020
cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaagttta aacgccgcca ccatg 1075
<210> 28
<211> 1768
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 1 full 3'
<400> 28
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta cctaggaaaa ctgtcttcat aacaggccta 840
ttgattggaa agtttgtcaa cgaattgtgg gtcttttggg gtttgctgcc ccttttacgc 900
aatgtggata tcctgcttta atgcctttat atgcatgtat acaagcaaaa caggctttta 960
ctttctcgcc aacttacaag gcctttctca gtaaacagta tatgaccctt taccccgttg 1020
ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggct 1080
tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtgtc tcctctgccg atccatactg 1140
cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca gcaggtctgg agcaaacctc atcgggaccg 1200
acaattctgt cgtactctcc cgcaagtata catcgtttcc atggctgcta ggctgtgctg 1260
ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg aatcccgcgg 1320
acgacccctc ccggggccgc ttggggctct accgcccgct tctccgtctg ccgtaccgtc 1380
cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc tgtgccttct catctgccgg 1440
accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag gccaccgtga acgcccaccg 1500
gaacctgccc aaggtcttgc ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt catcctgccc 1560
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 1620
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 1680
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcccaa gttgggaaga 1740
aacctgtagg gcctgcgaag acagtcag 1768
<210> 29
<211> 1193
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 2 full 5'
<400> 29
ctctggagac ggcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg ggaggggtcg gcaattgaac 60
cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg 120
cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct 180
ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc 240
tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccacct ggctccagta 300
cgtgattctt gatcccgagc tggagccagg ggcgggcctt gcgctttagg agccccttcg 360
cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg 420
caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga 480
cgtgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca ggatctgcac 540
actggtattt cggtttttgg gcccgcggcc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca 600
tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa 660
gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg 720
gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct 780
gctccagggg gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc 840
acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac 900
cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tggagctttt ggagtacgtc gtctttaggt 960
tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt 1020
aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg gcctttttga gtttggatct 1080
tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg 1140
tgaacacgtc tcaggggaga tctacaccca agctgtctag agccgccacc atg 1193
<210> 30
<211> 984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 2 full 3'
<400> 30
tgaggcatgc ttctatatta ttttctaaaa gatttaaagt tttgccttct ccatttagac 60
ttataattca ctggaatttt tttgtgtgta tggtatgaca tatgggttcc cttttatttt 120
ttacatataa atatatttcc ctgtttttct aaaaaagacc taggaaaact gtcttcataa 180
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 240
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 300
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 360
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 420
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 480
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 540
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 600
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 660
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcctcttcg 720
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc ctgcccgggt 780
ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc 840
ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct 900
ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg ggaagaaacc 960
tgtagggcct gcgaagacag tcag 984
<210> 31
<211> 1481
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 3 full 5'
<400> 31
ctctggagac gcaacctttg gagctaagcc agcaatggta gagggaagat tctgcacgtc 60
ccttccaggc ggcctccccg tcaccacccc ccccaacccg ccccgaccgg agctgagagt 120
aattcataca aaaggactcg cccctgcctt ggggaatccc agggaccgtc gttaaactcc 180
cactaacgta gaacccagag atcgctgcgt tcccgccccc tcacccgccc gctctcgtca 240
tcactgaggt ggagaatagc atgcgtgagg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 300
atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaacgg gtgcctagag 360
aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 420
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 480
gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 540
gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctccagtacg tgattcttga 600
tcccgagctg gagccagggg cgggccttgc gctttaggag ccccttcgcc tcgtgcttga 660
gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc 720
tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt tttgatgacg tgctgcgacg 780
ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac tggtatttcg 840
gtttttgggc ccgcggccgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg 900
cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt agtctcaagc tggccggcct 960
gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc 1020
cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tccagggggc 1080
tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa 1140
agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc 1200
aggcacctcg attagttctg gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg 1260
ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg 1320
cacttgatgt aattctcctt ggaatttggc ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc 1380
aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc aggtgtcgtg aacacgtctc 1440
aggggagatc tacacccaag ctgtctagag ccgccaccat g 1481
<210> 32
<211> 581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 3 full 3'
<400> 32
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
cctaggaaaa ctgtcttctt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 360
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 420
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 480
ggattgggaa tacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg gtacccaggt 540
gctgaagaat tgacccggtt cctcctgggg aagacagtca g 581
<210> 33
<211> 1511
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 4 full 5'
<400> 33
ctctggagac gcaacctttg gagctaagcc agcaatggta gagggaagat tctgcacgtc 60
ccttccaggc ggcctccccg tcaccacccc ccccaacccg ccccgaccgg agctgagagt 120
aattcataca aaaggactcg cccctgcctt ggggaatccc agggaccgtc gttaaactcc 180
cactaacgta gaacccagag atcgctgcgt tcccgccccc tcacccgccc gctctcgtca 240
tcactgaggt ggagaatagc atgcgtgagg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 300
atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaacgg gtgcctagag 360
aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 420
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 480
gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 540
gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctccagtacg tgattcttga 600
tcccgagctg gagccagggg cgggccttgc gctttaggag ccccttcgcc tcgtgcttga 660
gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc 720
tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt tttgatgacg tgctgcgacg 780
ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac tggtatttcg 840
gtttttgggc ccgcggccgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg 900
cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt agtctcaagc tggccggcct 960
gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc 1020
cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tccagggggc 1080
tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa 1140
agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc 1200
aggcacctcg attagttctg gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg 1260
ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg 1320
cacttgatgt aattctcctt ggaatttggc ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc 1380
aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc aggtgtcgtg aacacgtctc 1440
aggggagatc tagcttgctt gttctttttg cagaagctca gaataaacgc tcaactttgg 1500
ccgccaccat g 1511
<210> 34
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 4 full 3'
<400> 34
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
cctaggaaaa ctgtcttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg 360
gaattttttg tgtctctcac tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt taaaacatca 420
gaatgagtat ttggtttaga gtttggcaac atatgcccat atgctggctg ccatgaacaa 480
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ccatagaaaa gccttgactt gaggttagat tttttttata ttttgttttg tgttattttt 600
ttctttaaca tccctaaaat tttccttaca tgttttacta gccagatttt tcctcctctc 660
ctgactactc ccagtcatag ctgtccctct tctcttatgg agatcgaaga cagtcag 717
<210> 35
<211> 928
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 5 full 5'
<400> 35
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
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<210> 36
<211> 1268
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 5 full 3'
<400> 36
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
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tgtcatta 1268
<210> 37
<211> 1427
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 6 full 5'
<400> 37
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
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<210> 38
<211> 1169
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 6 full 3'
<400> 38
tgaggcatgc ttctatatta ttttctaaaa gatttaaagt tttgccttct ccatttagac 60
ttataattca ctggaatttt tttgtgtgta tggtatgaca tatgggttcc cttttatttt 120
ttacatataa atatatttcc ctgtttttct aaaaaagacc taggaaaact gtcttcataa 180
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<210> 39
<211> 1755
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 7 full 5'
<400> 39
ctctggagac gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 60
ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 120
cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 180
tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 240
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ttggccgcca ccatg 1755
<210> 40
<211> 1165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 7 full 3'
<400> 40
tgaggcatgc ttctatatta ttttctaaaa gatttaaagt tttgccttct ccatttagac 60
ttataattca ctggaatttt tttgtgtgta tggtatgaca tatgggttcc cttttatttt 120
ttacatataa atatatttcc ctgtttttct aaaaaagacc taggaaaact gtcttcataa 180
caggcctatt gattggaaag tttgtcaacg aattgtgggt cttttggggt ttgctgcccc 240
ttttacgcaa tgtggatatc ctgctttaat gcctttatat gcatgtatac aagcaaaaca 300
ggcttttact ttctcgccaa cttacaaggc ctttctcagt aaacagtata tgacccttta 360
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ggttcctcct ggggaagaca gtcag 1165
<210> 41
<211> 1159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 8 full 5'
<400> 41
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
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cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 420
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<210> 42
<211> 572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 8 full 3'
<400> 42
ggcatgcttc tatattattt tctaaaagat ttaaagtttt gccttctcca tttagactta 60
taattcactg gaattttttt gtgtgtatgg tatgacatat gggttccctt ttatttttta 120
catataaata tatttccctg tttttctaaa aaagacctag gaaaactgtc ttctggctaa 180
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aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 300
gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 360
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tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 480
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cctcttctct tatggagatc gaagacagtc ag 572
<210> 43
<211> 1519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 9 full 5'
<400> 43
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accagcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt 360
gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt 420
tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt 480
cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc 540
ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct ccagtacgtg 600
attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc 660
gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc 720
ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacgtg 780
ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaggat ctgcacactg 840
gtatttcggt ttttgggccc gcggccggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt 900
cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg 960
gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa 1020
ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc 1080
cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac 1140
aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg 1200
cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg 1260
gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc 1320
cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttggcct ttttgagttt ggatcttggt 1380
tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcctgaa 1440
cacgtctcag gggagatcta gcttgcttgt tctttttgca gaagctcaga ataaacgctc 1500
aactttggcc gccaccatg 1519
<210> 44
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 9 full 3'
<400> 44
ggcatgcttc tatattattt tctaaaagat ttaaagtttt gccttctcca tttagactta 60
taattcactg gaattttttt gtgtgtatgg tatgacatat gggttccctt ttatttttta 120
catataaata tatttccctg tttttctaaa aaagacctag gaaaactgtc ttcctgcccg 180
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 240
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 300
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcccaag ttgggaagaa 360
acctgtaggg cctgcgaaga cagtcag 387
<210> 45
<211> 1489
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 10 full 5'
<400> 45
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accagcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt 360
gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt 420
tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt 480
cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc 540
ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct ccagtacgtg 600
attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc 660
gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc 720
ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacgtg 780
ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaggat ctgcacactg 840
gtatttcggt ttttgggccc gcggccggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt 900
cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg 960
gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa 1020
ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc 1080
cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac 1140
aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg 1200
cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg 1260
gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc 1320
cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttggcct ttttgagttt ggatcttggt 1380
tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcctgaa 1440
cacgtctcag gggagatcta cacccaagct gtctagagcc gccaccatg 1489
<210> 46
<211> 1180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 10 full 3'
<400> 46
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
cctaggaaaa ctgtcttcat ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac 360
tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt 420
gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt 480
gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt 540
gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg 600
gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg 660
ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc 720
atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt 780
ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc 840
tctgcggcct cttccgcctc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc 900
cgcctccccg catcatcttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 960
accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 1020
tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 1080
gattgggaat acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg tacccaggtg 1140
ctgaagaatt gacccggttc ctcctgggga agacagtcag 1180
<210> 47
<211> 1172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 11 full 5'
<400> 47
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatgctga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420
cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 540
ggccatccac gctgttttga cctccatagt ggacaccggg accgatccag cctccgcgtc 600
tcaggggaga tctcgtttag tgaaccgtca gatcctcact ctcttccgca tcgctgtctg 660
cgagggccag ctgttgggct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtactc 720
ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtactccgcc accgagggac ctgagcgagt 780
ccgcatcgac cggatcggaa aacctctcga gaaaggcgtc taaccagtca cagtcgcaag 840
gtaggctgag caccgtggcg ggcggcagcg ggtggcggtc ggggttgttt ctggcggagg 900
tgctgctgat gatgtaatta aagtaggcgg tcttgagacg gcggatggtc gaggtgaggt 960
gtggcaggct tgagatccag ctgttggggt gagtactccc tctcaaaagc gggcattact 1020
tctgcgctaa gattgtcagt ttccaaaaac gaggaggatt tgatattcac ctggcccgat 1080
ctggccatac acttgagtga caatgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 1140
tcccaggtcc aagtttaaac gccgccacca tg 1172
<210> 48
<211> 1043
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 11 full 3'
<400> 48
actgttctca tcacatcata tcaaggttat ataccatcaa tattgccaca gatgttactt 60
agccttttaa tatttctcta atttagtgta tatgcaatga tagttctctg atttctgaga 120
ttgagtttct catgtgtaat gattatttag agtttctctt tcatctgttc aaatttttgt 180
ctagttttat tttttactga tttgtaagac ttctttttat aatctgcata ttacaattct 240
ctttactggg gtgttgcaaa tattttctgt cattctatgg cctgactttt cttaatggtt 300
ttttaatttt aaaaataagt cttaatattc atgcaatcta attaacaatc ttttctttgt 360
ggttaggact ttgagtcata agaaattttt ctctacactg aagtcatgat ggcatgcttc 420
tatattattt tctaaaagat ttaaagtttt gccttctcca tttagactta taattcactg 480
gaattttttt gtgtgtatgg tatgacatat gggttccctt ttatttttta catataaata 540
tatttccctg tttttctaaa aaagaaaaag atcatcattt tcccattgta aaatgccata 600
tttttttcat aggtcactta catatatcaa tgggtctgtt tctgagctct actctatttt 660
atcagcctca ctgtctatcc ccacacatct catgctttgc tctaaatctt gatatttagt 720
ggaacattct ttcccatttt gttctacaag aatatttttg ttattgtctt tgggctttct 780
atatacattt tgaaatgagg ttgacaagtt acctaggaaa actgtcttcc tgcccgggtg 840
gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc 900
caccagcctt gtcctaataa aattaagttg catcattttg tctgactagg tgtccttcta 960
taatattatg gggtggaggg gggtggtatg gagcaagggg cccaagttgg gaagaaacct 1020
gtagggcctg cgaagacagt cag 1043
<210> 49
<211> 1172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 12 full 5'
<400> 49
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatgctga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420
cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 540
ggccatccac gctgttttga cctccatagt ggacaccggg accgatccag cctccgcgtc 600
tcaggggaga tctcgtttag tgaaccgtca gatcctcact ctcttccgca tcgctgtctg 660
cgagggccag ctgttgggct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtactc 720
ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtactccgcc accgagggac ctgagcgagt 780
ccgcatcgac cggatcggaa aacctctcga gaaaggcgtc taaccagtca cagtcgcaag 840
gtaggctgag caccgtggcg ggcggcagcg ggtggcggtc ggggttgttt ctggcggagg 900
tgctgctgat gatgtaatta aagtaggcgg tcttgagacg gcggatggtc gaggtgaggt 960
gtggcaggct tgagatccag ctgttggggt gagtactccc tctcaaaagc gggcattact 1020
tctgcgctaa gattgtcagt ttccaaaaac gaggaggatt tgatattcac ctggcccgat 1080
ctggccatac acttgagtga caatgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 1140
tcccaggtcc aagtttaaac gccgccacca tg 1172
<210> 50
<211> 1165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 12 full 3'
<400> 50
tgaggcatgc ttctatatta ttttctaaaa gatttaaagt tttgccttct ccatttagac 60
ttataattca ctggaatttt tttgtgtgta tggtatgaca tatgggttcc cttttatttt 120
ttacatataa atatatttcc ctgtttttct aaaaaagacc taggaaaact gtcttcataa 180
caggcctatt gattggaaag tttgtcaacg aattgtgggt cttttggggt ttgctgcccc 240
ttttacgcaa tgtggatatc ctgctttaat gcctttatat gcatgtatac aagcaaaaca 300
ggcttttact ttctcgccaa cttacaaggc ctttctcagt aaacagtata tgacccttta 360
ccccgttgct cggcaacggc ctggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg 420
ttggggcttg gccataggcc atcagcgcat gcgtggaacc tttgtgtctc ctctgccgat 480
ccatactgcg gaactcctag ccgcttgttt tgctcgcagc aggtctggag caaacctcat 540
cgggaccgac aattctgtcg tactctcccg caagtataca tcgtttccat ggctgctagg 600
ctgtgctgcc aactggatcc tgcgcgggac gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa 660
tcccgcggac gacccctccc ggggccgctt ggggctctac cgcccgcttc tccgtctgcc 720
gtaccgtccg accacggggc gcacctctct ttacgcggac tccccgtctg tgccttctca 780
tctgccggac cgtgtgcact tcgcttcacc tctgcacgtc gcatggaggc caccgtgaac 840
gcccaccgga acctgcccaa ggtcttgcat aagaggactc ttggactttc agcaatgtca 900
tcttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 960
actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 1020
cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaatacaat 1080
agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atgggtaccc aggtgctgaa gaattgaccc 1140
ggttcctcct ggggaagaca gtcag 1165
<210> 51
<211> 820
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 13 full 5'
<400> 51
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 360
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 420
ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 480
ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 540
cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cggcgtctca ggggagatct 600
ggtgaggtgt ggcaggcttg agatccagct gttggggtga gtactccctc tcaaaagcgg 660
gcattacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct 720
ggcccgatct ggccatacac ttgagtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag 780
gtgtccactc ccaggtccaa gtttaaacgc cgccaccatg 820
<210> 52
<211> 1443
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 13 full 3'
<400> 52
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
cctaggaaaa ctgtcttcat aacaggccta ttgattggaa agtttgtcaa cgaattgtgg 360
gtcttttggg gtttgctgcc ccttttacgc aatgtggata tcctgcttta atgcctttat 420
atgcatgtat acaagcaaaa caggctttta ctttctcgcc aacttacaag gcctttctca 480
gtaaacagta tatgaccctt taccccgttg ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt 540
ttgctgacgc aacccccact ggttggggct tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa 600
cctttgtgtc tcctctgccg atccatactg cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca 660
gcaggtctgg agcaaacctc atcgggaccg acaattctgt cgtactctcc cgcaagtata 720
catcgtttcc atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg 780
tttacgtccc gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccctc ccggggccgc ttggggctct 840
accgcccgct tctccgtctg ccgtaccgtc cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg 900
actccccgtc tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg 960
tcgcatggag gccaccgtga acgcccaccg gaacctgccc aaggtcttgc ataagaggac 1020
tcttggactt tcagcaatgt catctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 1080
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa 1140
acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat 1200
gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc 1260
cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt 1320
atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct 1380
cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat cgaagacagt 1440
cag 1443
<210> 53
<211> 920
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 14 full 5'
<400> 53
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatgctga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420
cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 540
ggccatccac gctgttttga cctccatagt ggacaccggg accgatccag cctccgcggc 600
cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgaccctgg cagaactcgg 660
taagtctgtt gacatgtatg tgatgtatac taacctgcat gggacgtgga tttacttgtg 720
tatgtcagat agagtaaaga ttaactcttg catgtgagcg gggcatcgag atagcgataa 780
atgagtcagg aggacggata cttatatgtg ttgttatcct cctctacagt caaacagatt 840
aagcgtctca ggggagatct agcttgcttg ttctttttgc agaagctcag aataaacgct 900
caactttggc cgccaccatg 920
<210> 54
<211> 1821
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 14 full 3'
<400> 54
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta cctaggaaaa ctgtcttcat aatcaacctc 840
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 900
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 960
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 1020
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 1080
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 1140
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 1200
acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg 1260
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 1320
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcctctt cgccttcgcc 1380
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tctggctaat aaaggaaatt 1440
tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg 1500
gagggcaaat catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc 1560
ccatatgctg gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca 1620
gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt 1680
tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt 1740
actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 1800
atggagatcg aagacagtca g 1821
<210> 55
<211> 643
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 15 full 5'
<400> 55
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatgctga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420
cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 540
ggccatccac gctgttttga cctccatagt ggacaccggg accgatccag cctccgcgtc 600
tcaggggaga tctacaccca agctgtctag agccgccacc atg 643
<210> 56
<211> 1953
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 15 full 3'
<400> 56
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta cctaggaaaa ctgtcttcat aacaggccta 840
ttgattggaa agtttgtcaa cgaattgtgg gtcttttggg gtttgctgcc ccttttacgc 900
aatgtggata tcctgcttta atgcctttat atgcatgtat acaagcaaaa caggctttta 960
ctttctcgcc aacttacaag gcctttctca gtaaacagta tatgaccctt taccccgttg 1020
ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggct 1080
tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtgtc tcctctgccg atccatactg 1140
cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca gcaggtctgg agcaaacctc atcgggaccg 1200
acaattctgt cgtactctcc cgcaagtata catcgtttcc atggctgcta ggctgtgctg 1260
ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg aatcccgcgg 1320
acgacccctc ccggggccgc ttggggctct accgcccgct tctccgtctg ccgtaccgtc 1380
cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc tgtgccttct catctgccgg 1440
accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag gccaccgtga acgcccaccg 1500
gaacctgccc aaggtcttgc ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt catctggcta 1560
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 1620
aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt 1680
ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca 1740
gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg 1800
ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc 1860
cttacatgtt ttactagcca gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt 1920
ccctcttctc ttatggagat cgaagacagt cag 1953
<210> 57
<211> 673
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 16 full 5'
<400> 57
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatgctga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 420
cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 480
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 540
ggccatccac gctgttttga cctccatagt ggacaccggg accgatccag cctccgcgtc 600
tcaggggaga tctagcttgc ttgttctttt tgcagaagct cagaataaac gctcaacttt 660
ggccgccacc atg 673
<210> 58
<211> 1690
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 16 full 3'
<400> 58
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta cctaggaaaa ctgtcttcat ataatcaacc 840
tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 900
gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 960
cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 1020
tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 1080
cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 1140
ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 1200
tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 1260
tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 1320
ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcctc ttcgccttcg 1380
ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcatcttg ccagccatct 1440
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 1500
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 1560
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaat acaatagcag gcatgctggg 1620
gatgcggtgg gctctatggg tacccaggtg ctgaagaatt gacccggttc ctcctgggga 1680
agacagtcag 1690
<210> 59
<211> 1126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 17 full 5'
<400> 59
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accaatgacg tcgaggagaa gttccccaac tttcccgcct ctcagccttt gaaagaaaga 360
aaggggaggg ggcaggccgc gtgcagccgc gagcggtgct gggctccggc tccaattccc 420
catctcagtc gttcccaaag tcctcctgtt tcatccaagc gtgtaagggt ccccgtcctt 480
gactccctag tgtcctgctg cccacagtcc agtcctggga accagcaccg atcacctccc 540
atcgggccaa tctcagtccc ttccccccta cgtcggggcc cacacgctcg gtgcgtgccc 600
agttgaacca ggcggctgcg gaaaaaaaaa agcggggaga aagtagggcc cggctactag 660
cggttttacg ggcgcacgta gctcaggcct caagaccttg ggctgggact ggctgagcct 720
ggcgggaggc ggggtccgag tcaccgcctg ccgccgcgcc cccggtttct ataaattgag 780
cccgcagcct cccgcttcgc tctctgctcc tcctgttcga cagtcagccg catcttcttt 840
tgcgtcgcca gcctggcaga actcggtaag tctgttgaca tgtatgtgat gtatactaac 900
ctgcatggga cgtggattta cttgtgtatg tcagatagag taaagattaa ctcttgcatg 960
tgagcggggc atcgagatag cgataaatga gtcaggagga cggatactta tatgtgttgt 1020
tatcctcctc tacagtcaaa cagattaagc gtctcagggg agatctagct tgcttgttct 1080
ttttgcagaa gctcagaata aacgctcaac tttggccgcc accatg 1126
<210> 60
<211> 1126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 17 full 3'
<400> 60
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga 60
tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat ttttttcata ggtcacttac atatatcaat 120
gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc 180
atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg gaacattctt tcccattttg ttctacaaga 240
atatttttgt tattgtcttt gggctttcta tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 300
cctaggaaaa ctgtcttcat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 360
gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 420
atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 480
tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 540
ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 600
ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 660
gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 720
cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 780
gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 840
tgcggcctct tccgcctctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 900
cctccccgca tcctgcccgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc 960
ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt 1020
ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag 1080
gggcccaagt tgggaagaaa cctgtagggc ctgcgaagac agtcag 1126
<210> 61
<211> 820
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 18 full 5'
<400> 61
ctctggagac gacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180
ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240
tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 360
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 420
ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 480
ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 540
cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cggcgtctca ggggagatct 600
ggtgaggtgt ggcaggcttg agatccagct gttggggtga gtactccctc tcaaaagcgg 660
gcattacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct 720
ggcccgatct ggccatacac ttgagtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag 780
gtgtccactc ccaggtccaa gtttaaacgc cgccaccatg 820
<210> 62
<211> 1091
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Polynucleotide cassette 18 full 3'
<400> 62
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta cctaggaaaa ctgtcttctt gccagccatc 840
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 900
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 960
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa tacaatagca ggcatgctgg 1020
ggatgcggtg ggctctatgg gtacccaggt gctgaagaat tgacccggtt cctcctgggg 1080
aagacagtca g 1091
<210> 63
<400> 63
000
<210> 64
<211> 151
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 Enhancer Promoter Junction
<400> 64
gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 60
ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct 120
ccccatctcc cccccctccc cacccccaat t 151
<210> 65
<211> 151
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 Promoter Intro Junction
<400> 65
tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg 60
cgcggcgggc gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct 120
cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg c 151
<210> 66
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 Intron 5' UTR Junction
<400> 66
agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattcggct 60
tgatcgaagc cgtctcaggg gagatc 86
<210> 67
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 UTR Kozak junction
<400> 67
tttttgcaga agctcagaat aaacgctcaa ctttggccgc c 41
<210> 68
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 Enhancer RNA Export Junction
<400> 68
ccctgttttt ctaaaaaaga cctaggaaaa ctgtcttcat aacaggccta ttgattggaa 60
agtttgtcaa cgaattgtgg gtcttttggg 90
<210> 69
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 7 RNA Export PolyA Junction
<400> 69
ccctgttttt ctaaaaaaga cctaggaaaa ctgtcttcat aacaggccta ttgattggaa 60
agtttgtcaa cgaattgtgg gtcttttggg 90
<210> 70
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 Enhancer Promoter Junction
<400> 70
cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac cagcacatcg 60
cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt 100
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 Promoter Intron Junction
<400> 71
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 60
gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 120
<210> 72
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 Intron UTR
<400> 72
gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcc tgaacacgtc tcagg 55
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 UTR Kozak junction
<400> 73
agctgtctag agccg 15
<210> 74
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 Enhancer RNA Export Junction
<400> 74
gtctttgggc tttctatata cattttgaaa tgaggttgac aagttaccta ggaaaactgt 60
cttcatataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 120
atgttgctcc ttttacgcta tgtgga 146
<210> 75
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 10 RNA Export PolyA Junction
<400> 75
cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcatca tcttgccagc 60
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgacc 98
<210> 76
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 11 TPL Enhancer junction
<400> 76
aggcggtctt gagacggcgg atggtcgagg tgaggtgtgg caggcttgag atccagctgt 60
tggggtga 68
<210> 77
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 11 Promoter TPL Junction
<400> 77
cgctgttttg acctccatag tggacaccgg gaccgatcca gcctccgcgt ctcaggggag 60
atctcgttta gtgaaccgtc agatcctcac tctcttccgc atcgctgtct gcgagggcca 120
gctgttggg 129
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 11 Promoter Intron Junction
<400> 78
ttgatattca cctggcccga tctggccata cacttg 36
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 11 UTR Kozak junction
<400> 79
cccaggtcca agtttaaacg cc 22
<210> 80
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 11 Enhancer PolyA Junction
<400> 80
tctttgggct ttctatatac attttgaaat gaggttgaca agttacctag gaaaactgtc 60
ttcctgcccg ggtggca 77
<210> 81
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 Promoter TPL Junction
<400> 81
tcagatcgcc tggagaggcc atccacgctg ttttgacctc catagtggac accgggaccg 60
atccagcctc cgcgtctcag gggagatctc gtttagtgaa ccgtcagatc ctcactctct 120
tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctg 149
<210> 82
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 TPL Enhancer Junction
<400> 82
gatgtaatta aagtaggcgg tcttgagacg gcggatggtc gaggtgaggt gtggcaggct 60
tgagatccag ctgttggggt gagtactccc tctca 95
<210> 83
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 Enhancer Intro Junction
<400> 83
gatttgatat tcacctggcc cgatctggcc atacacttga g 41
<210> 84
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 UTR Kozak junction
<400> 84
tgtccactcc caggtccaag tttaaacgc 29
<210> 85
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 Enhancer RNA Export Junction
<400> 85
tgtttttcta aaaaagacct aggaaaactg tcttcataac aggcctattg attggaaagt 60
ttgtcaacga attgtg 76
<210> 86
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 12 RNA Export PolyA Junction
<400> 86
aaggtcttgc ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt catcttgcca gccatctgtt 60
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 110
<210> 87
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 13 Promoter Enhancer Junction
<400> 87
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcggcgtct caggggagat ctggtgaggt 60
gtggcaggct tgagatccag ctgttggggt gagtactccc tctcaaaagc 110
<210> 88
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 13 Enhancer Intron Junction
<400> 88
ggaggatttg atattcacct ggcccgatct ggccatacac ttga 44
<210> 89
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 13 Intron Kozak Junction
<400> 89
cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaagttta aacgccgcc 49
<210> 90
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 13 Enhancer RNA Export Junction
<400> 90
attgtctttg ggctttctat atacattttg aaatgaggtt gacaagttac ctaggaaaac 60
tgtcttcata acaggcctat tgattggaaa gtttgtcaac gaattgtggg tcttttgggg 120
tttgctgcc 129
<210> 91
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 13 RNA Export PolyA Junction
<400> 91
cctgcccaag gtcttgcata agaggactct tggactttca gcaatgtcat ctggctaata 60
aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 110
<210> 92
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 14 Promoter Intron Junction
<400> 92
cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacc ctggcagaac tcggtaagtc 60
tgttgacatg tatgtgatgt atactaacct gcat 94
<210> 93
<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 14 Intron Kozak junction
<400> 93
acttatatgt gttgttatcc tcctctacag tcaaacagat taagcgtctc aggggagatc 60
tagcttgctt gttctttttg cagaagctca gaataaacgc tcaactttgg cc 112
<210> 94
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 14 Enhancer RNA Export Junction
<400> 94
gctttctata tacattttga aatgaggttg acaagttacc taggaaaact gtcttcataa 60
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactgg 99
<210> 95
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - Cassette 14 RNA Export PolyA Junction
<400> 95
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatctggct 60
aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 100
<210> 96
<211> 280
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 96
tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc 60
caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 280
<210> 97
<211> 973
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 97
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 120
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 180
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240
cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300
ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360
gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420
gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 480
cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 540
tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600
ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 660
cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 720
gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 780
cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 840
gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 900
gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 960
gaccggcggc tct 973
Claims (30)
- 폴리뉴클레오타이드 카세트로서, 5'에서 3' 순서로,
(a) 서열번호 1로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 인핸서 영역;
(b) 서열번호 4로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프로모터 영역;
(c) 5'에서 3' 순서로, 서열번호 11로 이루어진 TPL 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열, 및 서열번호 12로 이루어진 eMLP 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5'UTR 영역;
(d) 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열로서, 상기 프로모터 영역에 작동 가능하게 연결된, 암호화 서열;
(e) 서열번호 13으로 이루어진 완전한 EES 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 인핸서 영역; 및
(f) 서열번호 14로 이루어진 HGH 폴리아데닐화 부위 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열
을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트. - 제1항에 있어서, 서열번호 76 내지 80의 각각을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트.
- 폴리뉴클레오타이드 카세트로서, 5'에서 3' 순서로,
(a) 서열번호 1로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 인핸서 영역;
(b) 서열번호 3으로 이루어진 EF1α 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프로모터 영역;
(c) 서열번호 5로 이루어진 EF1α 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 인트론 영역;
(d) 서열번호 6으로 이루어진 UTR2 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5'UTR 영역;
(e) 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열로서, 상기 프로모터 영역에 작동 가능하게 연결된, 암호화 서열;
(f) 서열번호 7로 이루어진 511-810 EES 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 인핸서 영역;
(g) 서열번호 8로 이루어진 WPRE RNA 방출 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열; 및
(h) 서열번호 9로 이루어진 BGH 폴리아데닐화 부위 또는 이에 대해 적어도 적어도 95% 동일성을 갖는 서열
을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트. - 제3항에 있어서, 서열번호 70 내지 75의 각각을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트.
- 폴리뉴클레오타이드 카세트로서, 5'에서 3' 순서로,
(a) 서열번호 1로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 인핸서 영역;
(b) 서열번호 4로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프로모터 영역;
(c) 5'에서 3' 순서로, 각각 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 TPL 및 eMLP 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5'UTR 영역;
(e) 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열;
(f) 서열번호 16으로 이루어진 410-564 EES 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 인핸서 영역;
(g) 서열번호 17로 이루어진 HPRE RNA 방출 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열; 및
(h) 서열번호 9로 이루어진 BGH 폴리아데닐화 부위 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열
을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트. - 제5항에 있어서,서열번호 81 내지 86의 각각을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트.
- 폴리뉴클레오타이드 카세트로서, 5'에서 3' 순서로,
(a) 서열번호 1로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 인핸서 영역;
(b) 서열번호 4로 이루어진 CMV 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프로모터 영역;
(c) 서열번호 18로 이루어진 CMVc 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 인트론 영역;
(d) 서열번호 19로 이루어진 UTR1 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5'UTR 영역;
(e) 분비 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열;
(f) 서열번호 13으로 이루어진 완전한 EES 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 인핸서 영역;
(g) 서열번호 8로 이루어진 WPRE RNA 방출 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열; 및
(h) 서열번호 20으로 이루어진 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 부위 또는 이에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열
을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트. - 제7항에 있어서, 서열번호 92 내지 95의 각각을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 카세트.
- 재조합 바이러스로서,
a) 캡시드 단백질, 및
b) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 카세트를 포함하는, 재조합 바이러스. - 제9항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스인, 재조합 바이러스.
- 제10항에 있어서, 캡시드 단백질은 AAV 변이체 7m8 캡시드 단백질이거나 또는 AAV 변이체 7m8 캡시드 단백질로부터 유래된, 재조합 바이러스.
- 제9항의 재조합 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 안질환의 치료 또는 예방이 필요한 포유류에서의 안질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 카세트로 형질감염되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포.
- 삭제
- 삭제
- 제12항에 있어서, 상기 안질환이 눈의 신생혈관과 관련되거나 또는 이에 의해 야기되는 안질환이고 상기 약제학적 조성물은 상기 포유류의 눈에 투여되는, 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 안구내 주사 또는 유리체내 주사를 통해 포유류의 눈에 투여되는, 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 안질환은 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization) 및 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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