KR102599088B1 - 말초신경조직의 탈세포화 방법, 이에 의해 제조된 바이오잉크, 프린팅 미디엄, 및 스캐폴드 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
말초신경조직을 소정의 크기로 자르는 세절 단계, 상기 말초신경조직에 포함된 지질 성분을 제거하는 지질 처리 단계, 세포 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에 포함된 세포를 파괴하는 세포 제거 단계, 상기 말초신경조직을 2배 이상 응축된 인산완충식염수(2X phosphate buffered saline, 2XPBS)로 처리하는 2XPBS 처리 단계, DNA 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에서 DNA를 제거하는 DNA 제거 단계, 소독 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 살균 소독하는 소독 단계, 및 상기 말초신경조직에서 수분을 제거하는 동결 건조 단계를 포함하는 말초신경조직의 탈세포화 방법, 이에 의해 제조된 탈세포화 물질을 이용하여 제조된 바이오잉크, 프린팅 미디엄 제조 방법, 및 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식 제조 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 말초신경조직의 탈세포화 방법, 이에 의해 제조된 바이오잉크, 프린팅 미디엄, 및 스캐폴드 제조 방법에 관한 것이다.
말초신경 손상은 신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 손상 유형이다. 현재 3cm 이상으로 절개된 말초신경을 회복하기 위해서는 자가신경을 이식하는 것 말고는 대안이 없다고 할 수 있다. 합성 고분자와 생체유래 고분자를 이용한 신경 이식 도관(nerve graft conduit)이 개발되었지만 높은 가격과 낮은 재생능으로 인하여 임상에서 자가신경이식을 대체할 수는 없다.
한편, 인체 조직을 구성하는 다양한 세포들의 활성은 각 조직의 특수한 세포외 기질에 영향을 받는다. 이에 따라 최근 세포가 원래 존재하던 세포외 기질과 유사한 환경을 제공할 수 있는 탈세포화 세포외 기질 기반의 바이오잉크가 각광받고 있다.
그러나, 종래의 탈세포화 방법에서 사용하는 화학처리공정은 신경세포의 활성과 관련된 세포외 기질을 손상시킬 가능성이 높다.
Choi J, et al., "Decellularized sciatic nerve matrix as a biodegradable conduit for peripheral nerve regeneration", Neural Regen Research, Oct. 13, 2018.
전술한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 말초신경조직을 효과적으로 탈세포화 하는 방법, 이를 이용한 바이오잉크, 낮은 점도의 하이드로젤을 마이크로미터 수준의 굵기로 프린팅 할 수 있는 프린트 미디엄, 및 환자 맞춤형 크기를 갖는 3차원 프린트된 스캐폴드를 제공하는 것이다.
다만, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양하게 확장될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 말초신경조직의 탈세포화 방법은 말초신경조직을 소정의 크기로 자르는 세절 단계, 상기 말초신경조직에 포함된 지질 성분을 제거하는 지질 처리 단계, 세포 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에 포함된 세포를 파괴하는 세포 제거 단계, 상기 말초신경조직을 2배 이상 응축된 인산완충식염수(2X phosphate buffered saline, 2XPBS)로 처리하는 2XPBS 처리 단계, DNA 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에서 DNA를 제거하는 DNA 제거 단계, 소독 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 살균 소독하는 소독 단계, 및 상기 말초신경조직에서 수분을 제거하는 동결 건조 단계를 포함한다.
일 측면에 따르면, 상기 지질 처리 단계는 아이소프로판올(isopropanol, IPA)을 이용하여 상기 지질 성분을 제거하고, 16시간 이상 수행될 수 있다.
일 측면에 따르면, 상기 DNA 제거 용액은 100U/ml 이상의 DNA 분해효소(Dnase)와 25mM 이상의 염화마그네슘(MgCl2)을 포함할 수 있다.
일 측면에 따르면, 상기 DNA 제거 단계는 30℃이상 40℃이하의 온도에서 3일 이상 수행될 수 있다.
일 측면에 따르면, 상기 말초신경조직의 탈세포화 방법은 상기 세절 단계 이후에, 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 제1 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에 포함된 불순물을 제거하는 1차 세척 단계, 상기 2XPBS 처리 단계 이후에, 증류수를 포함하는 제2 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 세척하는 2차 세척 단계, 상기 DNA 처리 단계 이후에, 상기 2XPBS를 포함하는 제3 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 세척하는 3차 세척 단계, 및 상기 소독 단계 이후에, 상기 말초신경조직을 인산완충식염수를 이용하여 60분 이상 세척한 뒤 증류수를 이용하여 15분 이상 세척한 뒤 증류수를 이용하여 16시간 이상 세척하는 4차 세척 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크는 상기 말초신경조직의 탈세포화 방법에 의하여 제조된 탈세포화 물질의 세포외 기질을 액화하여 제조된다.
일 측면에 따르면, 상기 세포외 기질의 액화는 0.5M 이상의 아세트산 용액(acetic acid solution) 및 상기 탈세포화 물질 대비 10% 이상의 무게를 갖는 펩신(pepsin)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄 제조 방법은 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(PVA), 알지네이트(alginate), 염화칼슘(CaCl2), 및 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 혼합하는 1차 혼합 단계, 상기 1차 혼합 단계의 혼합물을 고온에서 가압증기로 처리하는 고압멸균 단계, 상기 혼합물에 포함된 염화칼슘의 농도가 소정값이 되도록 염화칼슘 용액을 첨가하는 염화칼슘 첨가 단계, 혼합 수단을 이용하여 상기 혼합물을 혼합하는 2차 혼합 단계, 오븐을 이용하여 상기 혼합물을 소정 온도로 가열하는 오븐 처리 단계, 및 상기 혼합물을 원심분리하는 원심분리 단계를 포함한다.
일 측면에 따르면, 상기 1차 혼합 단계에서, 상기 젤라틴의 농도는 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하이고, 상기 폴리비닐알코올의 농도는 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하이고, 상기 알지네이트의 농도는 3%(w/v) 이상이고, 상기 염화칼슘의 농도는 20mM 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 프린팅 미디엄 및 하이드로젤 바이오잉크를 이용한 3차원 프린트된 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법은 0.5%(w/v) 이상 3%(w/v) 이하의 상기 하이드로젤 바이오잉크를 15℃이하의 온도로 유지하는 단계, 상기 프린팅 미디엄을 25℃내지 37℃의 온도로 유지하는 단계, 상기 1%(w/v) 이상의 하이드로젤 바이오잉크를 22G 내지 32G 노즐을 이용하여 프린팅하는 단계, 상기 1%(w/v) 이상의 하이드로젤 바이오잉크를 30kPa 내지 40kPa의 압력으로 토출하는 단계를 포함한다.
일 측면에 따르면, 상기 하이드로젤 바이오잉크는 말초신경조직 세포외 기질(PNSdECM) 바이오잉크이고, 상기 스캐폴드는 PNSdECM 신경 이식(nerve graft)일 수 있다.
개시된 기술은 다음의 효과를 가질 수 있다. 다만, 특정 실시예가 다음의 효과를 전부 포함하여야 한다거나 다음의 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 개시된 기술의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크를 이용하면 생체 외에서 말초신경조직을 제작할 수 있고, 재생의학 분야에서 신경조직을 재생하는 데 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 인체치유능력으로 재생이 불가능한 신경 재건에 사용되는 신경재생관 제작에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하면 낮은 점도의 하이드로젤을 마이크로미터 수준의 굵기로 프린팅 할 수 있으며, 이러한 프린팅 방법에 의하면 마이크로 섬유 내부의 나노 섬유들 또한 프린팅 방향으로 정렬되는 효과를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄은 칼슘과 같은 2가 양이온 처리를 통하여 젤레이션이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하면 중성 pH(예: pH7 ~ pH7.4)에서 마이크로미터 단위의 크기로 3차원 프린트된 말초신경조직 탈세포화 세포외 기질 신경 이식(3D printed PNSdECM nerve graft) 및 신경 이식 도관(nerve graft conduit)을 제작할 수 있으며, PNSdECM을 낮은 농도로 희석하여 구조체를 제작하기 때문에 종래기술보다 더 적은 양의 PNSdECM을 사용하고, 3차원 프린팅을 통해 낮은 공극률(void fraction)을 구현할 수 있고, 따라서 단순히 탈세포화된 조직을 사용하는 것보다 저렴하면서 효과가 좋은 신경치료기기로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 말초신경조직의 탈세포화 방법의 순서도이다.
도 2는 DNA 제거 용액에 포함된 DNA 분해효소(DNase)와 염화마그네슘(MgCl2)의 조성 및 용액 처리 기간에 따른 잔존 DNA량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 H&E 스테이닝을 통해 탈세포화 전후의 말초신경조직을 비교한 것을 나타낸다.
도 4는 탈세포화 전후 말초신경조직에 포함된 성분을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 제조 방법의 순서도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 전단율(shear rate)에 따른 점도(viscosity)를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 교화 운동학(gelation kinetics)을 4℃에서 37℃로 증가시켰을 때 복소 탄성률(complex modulus)의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크를 액체 상태로 37℃에서 30분간 배양했을 때 저장 탄성률(storage modulus)과 손실 탄성률(loss modulus)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 제조 방법의 순서도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하여 제작된 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식을 나타낸 것이다.
도 10은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식의 마이크로 섬유 내부의 나노 섬유가 정렬된 것을 나타낸 것이다.
도 11은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식 도관을 나타낸 것이다.
도 2는 DNA 제거 용액에 포함된 DNA 분해효소(DNase)와 염화마그네슘(MgCl2)의 조성 및 용액 처리 기간에 따른 잔존 DNA량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 H&E 스테이닝을 통해 탈세포화 전후의 말초신경조직을 비교한 것을 나타낸다.
도 4는 탈세포화 전후 말초신경조직에 포함된 성분을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 제조 방법의 순서도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 전단율(shear rate)에 따른 점도(viscosity)를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 교화 운동학(gelation kinetics)을 4℃에서 37℃로 증가시켰을 때 복소 탄성률(complex modulus)의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크를 액체 상태로 37℃에서 30분간 배양했을 때 저장 탄성률(storage modulus)과 손실 탄성률(loss modulus)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 제조 방법의 순서도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하여 제작된 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식을 나타낸 것이다.
도 10은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식의 마이크로 섬유 내부의 나노 섬유가 정렬된 것을 나타낸 것이다.
도 11은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식 도관을 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다.
그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람이 본 발명을 쉽게 실시할 수 있도록 명확하고 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 말초신경조직의 탈세포화 방법의 순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 말초신경조직의 탈세포화 방법은 세절 단계(S101), 1차 세척 단계(S103), 지질 처리 단계(S105), 세포 제거 단계(S107), 2XPBS 처리 단계(S109), 2차 세척 단계(S111), DNA 처리 단계(S113), 3차 세척 단계(S115), 소독 단계(S117), 4차 세척 단계(S119), 및 동결 건조 단계(S121)를 포함할 수 있다.
세절 단계(S101)에서는 말초신경조직을 소정의 크기로 자른다. 예를 들어, 후술할 단계들의 수율 및 효율을 높일 수 있도록 말초신경조직을 3mm × 3mm의 크기로 자를 수 있다.
1차 세척 단계(S103)에서는 말초신경조직에 포함되어 있는 불순물을 제거한다. 예를 들어, 1차 세척 단계(S103)는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 포함하는 세척 용액을 이용하여 실온(room temperature)에서 약 2시간 동안 수행될 수 있다. 1차 세척 단계(S103)에서 말초신경조직이 세척됨에 따라 불필요한 물질(예컨대, 조직 내에 포함되어 있는 혈액 등)이 제거될 수 있다.
지질 처리 단계(S105)에서는 말초신경조직에 포함되어 있는 지질 성분을 제거한다. 예를 들어, 지질 처리 단계(S105)는 아이소프로판올(isopropanol, IPA)을 이용하여 약 16시간 동안 수행될 수 있다. 말초신경조직의 경우 지질 성분을 많이 포함하고 있으며, 이러한 지질 성분은 세포 부착능을 감소시키기 때문에 세포 활성에 부정적인 영향을 미친다. 따라서 탈세포화 과정에서 지질 성분을 효과적으로 제거할 필요가 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 말초신경조직의 탈세포화 방법에서는 효과적인 지질 제거를 위해 IPA를 사용하였다.
세포 제거 단계(S107)에서는 계면활성제와 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 세포 제거 용액을 이용하여 말초신경조직에 포함된 세포를 파괴한다. 예를 들어, 세포 제거 용액은 약 0.5%의 도데실황산나트륨(sodium dodecylsulfate, SDS)과 약 25mM의 에틸렌디아민테트라아세트산 PBS(EDTA PBS)를 포함할 수 있다. 세포 제거 단계(S107)는 세포 제거 용액을 이용하여 약 7시간 동안 수행될 수 있다. 세포 제거 단계(S107)는 세포 및 세포외 기질에 포함되어 있는 다양한 단백질, 당단백질, 및 클리고사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화하면서 말초신경조직에 포함된 세포를 파괴하도록 수행될 수 있다.
세포 제거 단계(S107)에서 말초신경조직은 약 3%의 트리톤 X-100과 약 25mM의 EDTA PBS에 의해 추가적으로 약 24시간 동안 처리될 수 있다.
2XPBS 처리 단계(S109)에서는 말초신경조직이 2배 응축된 농도의 PBS(2XPBS)로 처리된다. 예를 들어, 2XPBS는 약 274mM의 NaCl, 약 5.4mM의 KCl, 약 16mM의 Na2HPO4, 및 약 4mM의 KH2PO4를 포함할 수 있다. 말초신경조직을 2XPBS로 처리함으로써 주변 환경에 민감한 신경세포를 배양할 수 있는 하이드로젤 바이오잉크를 제조할 수 있으며, 후술할 DNA 처리 단계(S113)의 효율을 향상시킬 수 있다.
2차 세척 단계(S111)에서는 2XPBS 처리를 완료한 말초신경조직을 세척한다. 예를 들어, 2차 세척 단계(S111)는 증류수를 이용하여 약 30분 동안 수행될 수 있으며, PBS를 이용하여 약 1시간동안 추가적으로 수행될 수 있다.
DNA 처리 단계(S113)에서는 DNA 제거 용액을 이용하여 말초신경조직에서 DNA를 제거한다. DNA 제거 용액은 DNA 분해효소(DNase) 및 염화마그네슘(MgCl2)을 포함한다. 이때, DNA 분해효소(DNase)가 효과적으로 활성을 나타낼 수 있도록 DNA 분해효소(DNase)와 염화마그네슘(MgCl2)의 조성 및 DNA 제거 용액 처리 시간을 적절하게 설정해야 한다. 예를 들어, DNA 제거 용액은 약 100U/ml의 DNA 분해효소(DNase)와 약 25mM의 염화마그네슘(MgCl2)의 조성을 가질 수 있으며, DNA 처리 단계(S113)는 30℃이상 40℃이하의 온도, 바람직하게는, 약 37℃에서 약 3일 동안 수행될 수 있다.
3차 세척 단계(S115)에서는 단계 S113에서 처리된 DNA 및 DNA 제거 용액을 제거하기 위해 말초신경조직을 세척한다. 예를 들어, 3차 세척 단계(S115)는 2XPBS를 이용하여 약 15분 동안 수행될 수 있다.
소독 단계(S117)에서는 소독 용액을 이용하여 말초신경조직을 살균 소독한다. 소독 용액은 미생물의 세포막을 파괴할 수 있는 과초산(peracetic acid)과 에탄올(ethanol)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 소독 용액으로는 증류수에 약 0.1%의 과초산과 약 10%의 에탄올이 포함된 용액이 사용될 수 있다. 소독 단계(S117)는 실온에서 약 2시간 동안 수행될 수 있다.
4차 세척 단계(S119)에서는 소독이 완료된 말초신경조직을 세척한다. 예를 들어, 4차 세척 단계(S119)는 말초신경조직을 PBS를 이용하여 약 60분 동안 세척한 뒤 증류수를 이용하여 약 15분 동안 세척하고 다시 증류수를 이용하여 약 16시간 동안 세척함으로써 수행될 수 있다.
동결 건조 단계(S121)에서는 살균 소독이 이루어진 말초신경조직의 탈세포화 물질에서 수분을 제거한다. 탈세포화 공정을 거친 물질은 물질 내에 포함되어 있는 수분을 제거하여야 추후 바이오잉크로 사용하기에 적합한 상태가 될 수 있다. 동결 건조 단계(S121)는 소정의 용기에 담긴 탈세포화 물질을 동결 건조기에 적재함으로써 수행될 수 있다.
상술한 단계들(S101 ~ S121)을 거쳐 탈세포화된 말초신경조직, 즉 말초신경조직 탈세포화 세포외 기질(peripheral nervous system decellularized extracellular matrix, PNSdECM)을 얻을 수 있다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법에 의해 생성된 PNSdECM의 특성을 설명하기 위한 것이다.
도 2는 DNA 제거 용액에 포함된 DNA 분해효소와 염화마그네슘의 조성 및 용액 처리 기간에 따른 잔존 DNA량을 나타낸 그래프이다.
도 2를 참조하면, 30U/ml의 DNA 분해효소와 10mM의 염화마그네슘을 처리한 경우 및 50U/ml의 DNA 분해효소와 15mM의 염화마그네슘을 처리한 경우보다 100U/ml의 DNA 분해효소와 25mM의 염화마그네슘을 처리한 경우에서 DNA가 더 효과적으로 제거되는 것을 확인할 수 있다. 또한 100U/ml의 DNA 분해효소와 25mM의 염화마그네슘을 2일간 처리한 경우보다 3일간 처리한 경우에서 DNA가 더 효과적으로 제거되는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 H&E 스테이닝을 통해 탈세포화 전후의 말초신경조직을 비교한 것을 나타낸다.
도 3을 참조하면, 탈세포화 전(a)과 비교하여 탈세포화 후(b) 말초신경조직에서 핵이 성공적으로 제거되었음을 확인할 수 있다.
도 4는 탈세포화 전후 말초신경조직에 포함된 성분을 비교한 그래프이다.
도 4를 참조하면, 탈세포화 전(검정색 막대)과 비교하여 탈세포화 후(회색 막대) DNA, 글리코사미노글리칸(GAG), 콜라젠이 각각 4.9%, 31%, 164%만큼 잔류하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 제조 방법의 순서도이다.
도 5를 참조하면, 도 1의 단계 S121 이후 세포외 기질 액화 단계(S501)를 거쳐 PNSdECM 바이오잉크를 제조할 수 있다.
세포외 기질 액화 단계(S501)에서는 아세트산 용액(acetic acid solution)과 펩신(pepsin)을 이용하여 PNSdECM을 액화시킨다. 예를 들어, 약 0.5M의 아세트산 용액과 PNSdECM 대비 약 10% 무게의 펩신을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크를 이용하면 생체 외에서 말초신경조직을 제작할 수 있고, 재생의학 분야에서 신경조직을 재생하는 데 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 인체치유능력으로 재생이 불가능한 신경 재건에 사용되는 신경재생관 제작에 유용하게 사용될 수 있다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 유동학적(rheological) 특성을 나타낸 그래프이다. 바이오잉크는 압출 기반의 3차원 셀 프린팅 시스템과의 호환성 및 조직 유사체에 기계적 물성을 제공하는 데 필수적인 전단 박리 거동과 열가교(thermal crosslinking) 능력이 있어야 한다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 전단율(shear rate)에 따른 점도(viscosity)를 나타낸 그래프이다. 도 6a에서 온도는 4℃로 설정하였다.
도 6a를 참조하면, 전단율이 증가할수록 PNSdECM 바이오잉크의 점도가 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크가 전단 박리 동작을 보인다는 것을 확인할 수 있으며, 따라서 소직경 노즐을 통과할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크의 교화 운동학(gelation kinetics)을 4℃에서 37℃로 증가시켰을 때 복소 탄성률(complex modulus)의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크를 액체 상태로 37℃에서 30분간 배양했을 때 저장 탄성률(storage modulus)과 손실 탄성률(loss modulus)을 나타낸 그래프이다.
도 6b를 참조하면, PNSdECM 바이오잉크의 복소 탄성률은 37℃에 도달한 후 약 10분간 급격히 증가하다가 이후 증가 속도가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 도 6c를 참조하면, 액체 상태의 PNSdECM 바이오잉크를 37℃에서 약 30분간 배양했을 때 저장 탄성률이 손실 탄성률보다 높은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 PNSdECM 바이오잉크가 37℃에서 열가교 거동을 보인다는 것을 알 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 제조 방법의 순서도이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 제조 방법은 1차 혼합 단계(S701), 고압멸균 단계(S703), 염화칼슘 첨가 단계(S705), 2차 혼합 단계(S707), 오븐 처리 단계(S709), 및 원심분리 단계(S711)을 포함할 수 있다.
1차 혼합 단계(S701)에서는 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(PVA), 알지네이트(alginate), 염화칼슘(CaCl2), 및 인산완충식염수(1XPBS)를 혼합한다. 예를 들어, 혼합물은 약 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하의 젤라틴, 약 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하의 폴리비닐알코올, 약 3%(w/v)의 알지네이트(고점도), 및 약 20mM 이상의 염화칼슘을 포함할 수 있다.
고압멸균 단계(S703)에서는 단계 S701의 혼합물을 고온에서 가압증기로 처리한다. 예를 들어, 고압멸균 단계(S703)는 약 121℃의 온도에서 15psi의 가압증기로 약 15~20분동안 수행될 수 있다. 고압멸균 단계(S703)에서 혼합물의 용질이 용매에 녹을 수 있다.
염화칼슘 첨가 단계(S705)에서는 고압멸균이 완료된 혼합물에 포함된 염화칼슘의 농도가 소정값이 되도록 염화칼슘 용액을 첨가한다. 예를 들어, 염화칼슘 첨가 단계(S705)는 혼합물에 포함된 염화칼슘의 농도가 약 30mM이 되도록 염화칼슘 용액을 첨가할 수 있다.
2차 혼합 단계(S707)에서는 혼합 수단을 이용하여 단계 S705의 혼합물을 혼합한다. 예를 들어, 2차 혼합 단계(S707)은 약 22000rpm의 블렌더를 이용하여 약 1분동안 수행될 수 있다.
오븐 처리 단계(S709)에서는 단계 S707의 혼합물을 오븐에 넣어 가열한다. 예를 들어, 오븐 처리 단계(S709)는 약 60도의 오븐을 이용하여 약 12시간동안 수행될 수 있다.
원심분리 단계(S711)에서는 단계 S709의 혼합물을 원심분리 한다. 예를 들어, 원심분리 단계(S711)는 약 1000rpm으로 약 30분동안 수행될 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄의 전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 8을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄 내에는 약 1㎛ 직경의 알지네이트 마이크로젤이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄은 4℃에서 보관할 수 있으며, 바이오 프린팅을 진행하는 경우 약 37℃의 프린팅 미디엄에서 프린팅 할 수 있다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하면 낮은 점도의 하이드로젤 바이오잉크를 마이크로미터 수준의 굵기로 프린팅 할 수 있으며, 이러한 프린팅 방법에 의하면 마이크로 섬유 내부의 나노 섬유들 또한 프린팅 방향으로 정렬되는 효과를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄은 칼슘과 같은 2가 양이온 처리를 통하여 젤레이션이 가능하다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄을 이용하여 제작된 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식을 나타낸 것이고, 도 10은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식의 마이크로 섬유 내부의 나노 섬유가 정렬된 것을 나타낸 것이고, 도 11은 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식 도관을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 미디엄 및 하이드로젤 바이오잉크를 이용하면 중성 pH(예: pH7 ~ pH7.4)에서 마이크로미터 단위의 크기로 3차원 프린트된 스캐폴드(scaffold)를 제작할 수 있다. 예를 들어, 하이드로젤 바이오잉크는 dECM 바이오잉크, PNSdECM 바이오잉크, CNSdECM 바이오잉크, 콜라젠 등일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시예들에 따른 프린팅 미디엄 및 PNSdECM 바이오잉크를 이용하여 3차원 프린트된 말초신경조직 탈세포화 세포외 기질 신경 이식(3D printed PNSdECM nerve graft) 및 신경 이식 도관(nerve graft conduit)을 제작할 수 있다.
예를 들어,
1) 약 0.5%(w/v) 이상 3%(w/v) 이하의 PNSdECM 바이오잉크를 약 15℃ 이하의 온도로 유지하고,
2) 프린팅 미디엄을 약 25℃ ~ 37℃의 온도로 유지하고,
3) 1%(w/v)의 PNSdECM 바이오잉크를 22G ~ 32G 노즐을 이용하여 프린팅하고,
4) 1%(w/v)의 PNSdECM 바이오잉크를 약 30 ~ 40kPa의 압력으로 토출하는
과정을 통해 신경 이식을 제작할 수 있으며, 이때 피드 레이트(feed rate)를 약 2000mm/min으로 하면, 도 9에서 확인할 수 있는 것과 같이, 약 30㎛ 수준의 섬유를 프린팅 할 수 있다.
이와 같이 마이크로미터 단위의 크기로 얇게 섬유를 프린팅 하면, 도 10에서 확인할 수 있는 것과 같이, 섬유 내부에 나노 스케일의 세포외 기질 섬유들도 정렬되는 효과를 갖는다.
한편, 프린팅 된 신경 이식을 튜브 타입의 PCL 도관에 삽입하면, 도 11에서 확인할 수 있는 것과 같이, 신경재생용 신경 이식 도관을 제작할 수 있다. 이때 튜브 타입의 PCL 도관은 딥 몰딩(dip molding), 동축 프린팅(coaxial printing) 등의 방법으로 제작될 수 있다.
상술한 방법에 의해 의하면 환자 맞춤형 크기를 갖는 3차원 프린트된 PNSdECM 신경 이식 도관을 제작할 수 있고, PNSdECM을 낮은 농도로 희석하여 구조체를 제작하기 때문에 종래기술보다 더 적은 양의 PNSdECM을 사용하고, 3차원 프린팅을 통해 낮은 공극률(void fraction)을 구현할 수 있고, 따라서 단순히 탈세포화된 조직을 사용하는 것보다 저렴하면서 효과가 좋은 신경치료기기로 이용될 수 있다.
이상에서 도면 및 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 보호범위가 상기 도면 또는 실시예에 의해 한정되는 것을 의미하지는 않으며 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (13)
- 말초신경조직을 소정의 크기로 자르는 세절 단계;
상기 말초신경조직에 포함된 지질 성분을 제거하는 지질 처리 단계;
세포 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에 포함된 세포를 파괴하는 세포 제거 단계;
상기 말초신경조직을 2배 이상 응축된 인산완충식염수(2X phosphate buffered saline, 2XPBS)로 처리하는 2XPBS 처리 단계;
DNA 제거 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에서 DNA를 제거하는 DNA 제거 단계;
소독 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 살균 소독하는 소독 단계; 및
상기 말초신경조직에서 수분을 제거하는 동결 건조 단계를 포함하고,
상기 DNA 제거 용액은 100U/ml 이상의 DNA 분해효소(Dnase)와 25mM 이상의 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하는, 말초신경조직의 탈세포화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 지질 처리 단계는 아이소프로판올(isopropanol, IPA)을 이용하여 상기 지질 성분을 제거하고, 16시간 이상 수행되는, 말초신경조직의 탈세포화 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 DNA 제거 단계는 30℃이상 40℃이하의 온도에서 3일 이상 수행되는, 말초신경조직의 탈세포화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 세절 단계 이후에, 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 제1 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직에 포함된 불순물을 제거하는 1차 세척 단계;
상기 2XPBS 처리 단계 이후에, 증류수를 포함하는 제2 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 세척하는 2차 세척 단계;
상기 DNA 제거 단계 이후에, 상기 2XPBS를 포함하는 제3 세척 용액을 이용하여 상기 말초신경조직을 세척하는 3차 세척 단계; 및
상기 소독 단계 이후에, 상기 말초신경조직을 인산완충식염수를 이용하여 60분 이상 세척한 뒤 증류수를 이용하여 15분 이상 세척한 뒤 증류수를 이용하여 16시간 이상 세척하는 4차 세척 단계를 더 포함하는, 말초신경조직의 탈세포화 방법. - 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 탈세포화 물질의 세포외 기질을 액화하여 제조되는, 바이오잉크.
- 제6항에 있어서,
상기 세포외 기질의 액화는 0.5M 이상의 아세트산 용액(acetic acid solution) 및 상기 탈세포화 물질 대비 10% 이상의 무게를 갖는 펩신(pepsin)에 의해 수행되는, 바이오잉크. - 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(PVA), 알지네이트(alginate), 염화칼슘(CaCl2), 및 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 혼합하는 1차 혼합 단계;
상기 1차 혼합 단계의 혼합물을 고온에서 가압증기로 처리하는 고압멸균 단계;
상기 혼합물에 포함된 염화칼슘의 농도가 소정값이 되도록 염화칼슘 용액을 첨가하는 염화칼슘 첨가 단계;
혼합 수단을 이용하여 상기 혼합물을 혼합하는 2차 혼합 단계;
오븐을 이용하여 상기 혼합물을 소정 온도로 가열하는 오븐 처리 단계; 및
상기 혼합물을 원심분리하는 원심분리 단계를 포함하는, 프린팅 미디엄 제조 방법. - 제8항에 있어서,
상기 1차 혼합 단계에서, 상기 젤라틴의 농도는 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하이고, 상기 폴리비닐알코올의 농도는 3%(w/v) 이상 10%(w/v) 이하이고, 상기 알지네이트의 농도는 3%(w/v) 이상이고, 상기 염화칼슘의 농도는 20mM 이상인, 프린팅 미디엄 제조 방법. - 제8항 또는 제9항의 방법에 의하여 제조된, 프린팅 미디엄.
- 제8항 또는 제9항의 방법에 의하여 제조된 프린팅 미디엄 및 하이드로젤 바이오잉크를 이용한 3차원 프린트된 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법으로서,
0.5%(w/v) 이상 3%(w/v) 이하의 상기 하이드로젤 바이오잉크를 15℃이하의 온도로 유지하는 단계;
상기 프린팅 미디엄을 25℃내지 37℃의 온도로 유지하는 단계;
상기 1%(w/v) 이상의 하이드로젤 바이오잉크를 22G 내지 32G 노즐을 이용하여 프린팅하는 단계;
상기 1%(w/v) 이상의 하이드로젤 바이오잉크를 30kPa 내지 40kPa의 압력으로 토출하는 단계를 포함하는, 3차원 프린트된 스캐폴드의 제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 하이드로젤 바이오잉크는 말초신경조직 세포외 기질(PNSdECM) 바이오잉크이고,
상기 스캐폴드는 PNSdECM 신경 이식(nerve graft)인, 3차원 프린트된 스캐폴드의 제조 방법. - 제11항의 방법에 의하여 제조된 3차원 프린트된 스캐폴드.
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