KR102597794B1 - 상피세포 성장인자와 아로니아 열매 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents
상피세포 성장인자와 아로니아 열매 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아로니아 열매 추출물 및 상피세포 성장인자(epidermal grow factor)를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 상온에서 보관하여도 상피세포 성장인자, 나이아신아마이드 및 아데노신의 활성이 유지되고, 항산화, 콜라겐 생합성 증진 및 진피 섬유아세포 증식 활성이 우수하므로 피부 상태 개선용 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 아로니아 열매 추출물 및 상피세포 성장인자(epidermal grow factor)를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 아로니아 열매 추출물에 의해 상피세포 성장인자의 열 안정성이 개선된 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부 노화는 그 원인에 따라 크게 내적 노화와 외적 노화의 두 가지로 구분할 수 있다. 내적 노화(intrinsic aging)는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화 현상(aging process)이다. 외적 노화 (extrinsic aging)는 자외선(UV), 건조한 공기 (dry air), 활성 산소종(reactive oxygen species) 및 스트레스 등의 외적 요인에 의해 발생하는 노화 현상을 말한다. 이런 내외적 요인에 의해 피부의 노화가 진행되면, 가장 대표적으로 나타나는 증상이 바로 피부 표면의 주름 생성이다.
지금까지 알려진 피부 주름의 생성 경로는 다양하다. 예를 들어, 피부가 과다한 자외선에 노출되면 피부를 구성하는 주요 성분 중의 하나인 콜라겐(Collagen) 분해가 촉진되어 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성된다. 피부가 온도변화, 습도저하 또는 바람 등에 의해 건조해지면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 기능이 저하되어 주름이 생기게 된다. 나아가, 피부가 유해활성 산소종 또는 자유 라디칼에 노출되면 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되고 콜라겐 등의 피부 구성 단백질이 변형되어 주름이 생성될 수 있다. 진피에서는 섬유아세포(human skin fibroblast)가 노화되어 섬유질과 기질의 생성능력이 줄어들게 된다.
한편, 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 표피(Epidermis)나 외피(Epithelium) 세포들의 성장과 생존을 조절하는 성장인자로 알려져 있다. EGF는 그 기능에 따라 그동안 치유되기 힘든 궤양의 상처나 화상의 치료에 의학적으로 사용되어 왔고, 최근에는 피부 재생을 위한 화장품의 원료로도 많이 이용되고 있다. 하지만, EGF는 생합성이나 분리·정제에 많은 비용과 노력이 수반되고 활성이 유지되도록 보관하는 것이 쉽지 않다. 이에 화장품 제조 업계에서는 EGF의 안정성을 유지하기 위해 다양한 연구를 하고 있다.
본 발명자들은 상피세포 성장인자(EGF)와 같은 기능성 성분들의 열 안정성이 개선된 화장료 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 천연 물질인 아로니아 열매 추출물이 상피세포 성장인자, 나이아신아마이드 및 아데노신의 열 안정성을 개선하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아로니아 열매 추출물 및 상피세포 성장인자를 유효성분으로 포함하고, 상피세포 성장인자의 열 안정성이 개선된 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 아로니아 열매 추출물 및 상피세포 성장인자를 유효성분으로 포함하고, 상피세포 성장인자의 열 안정성이 개선된 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "피부 상태 개선용 조성물"이란 피부에 조성물을 적용하기 전과 비교하여 피부의 보습 상태, 피부결, 주름, 탄력, 노화, 피부 장벽, 염증 상태로 구성된 요소 중에서 하나 이상의 요소를 개선시키는 조성물을 의미한다.
본 발명에서, "아로니아(Aronia Melanocarpa)"는 장미목 장미과 아로니아속에 해당하는 관목과 그 열매의 총칭으로 초크베리(chokeberry), 킹스베리(King's berry)라고도 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 아로니아 열매 추출물을 사용하였으며, 본 명세서에서 아로니아 추출물은 아로니아 열매 추출물과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 추출 대상을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 농축 또는 여과시킨 제제를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조(crude) 정제물 또는 정제물일 수 있다.
상기 아로니아 열매 추출물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 추출용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 6의 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 건조된 아로니아 열매를 증류수를 용매로 사용하여 추출한 뒤 여과, 감압 농축 및 건조시켜 추출물을 제조하였다. 이러한 아로니아 추출물은 조성물의 총 중량 기준으로 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상피세포 성장인자(epidermal grow factor, EGF)는 상피세포의 생장을 촉진하는 인자로서 세포막에 있는 EGF 수용체(epidermal grow factor receptor, EGFR)를 통해 신호를 전달하고, 세포의 분열을 유도하여 상피세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. EGF는 1) 상피세포 및 진피세포의 증식 촉진, 2) 진피 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포증식 촉진, 3) 피부 손상부위의 혈관 신생촉진 및 기타 재생촉진인자의 분비유도, 4) 피부 조직이 질서 있게 방향을 잡으며, 망을 형성하게 하는 물질인 피브로넥틴(Fibronectin)의 합성촉진, 5) 상처부위 흉터의 최소화 등 피부 재생에 핵심적 역할을 담당한다.
EGF는 미국 화장품협회(CTFA)의 국제 화장품 원료집(ICID)에 등재되었을 뿐 아니라 식품 의약품 안전청에서도 최근 EGF를 화장품 원료로 승인함으로써 국내외에서 공식적으로 화장품의 원료로서 사용할 수 있게 되었다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 상피세포 성장인자는 에스에이치-올리고펩타이드-1 (sh-oligopepetide-1) 및 알에이치-올리고펩타이드-1 (rh-oligopeptide-1)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 에스에이치-올리고펩타이드-1이 사용될 수 있다.
에스에이치-올리고펩타이드-1은 단일사슬 인간 재조합펩타이드로 대장균으로부터 생산한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 상피세포 성장인자는 조성물의 총 중량 기준으로 0.0001 내지 1 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.0005 내지 0.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.0005 내지 0.002 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명자들은 아로니아 열매의 증류수 추출물과 기능성 성분으로 상피세포 성장인자, 나이아신아마이드 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 제조하였고, 해당 화장료 조성물은 상온에서 장기간 보관하더라도 상피세포 성장인자의 활성이 유지되고, 나이아신아마이드 및 아데노신 또한 안정한 상태를 유지하는 것을 확인하였다 (도 3 내지 5, 표 3).
따라서, 본 발명의 피부 상태 개선용 조성물은 나이아신아마이드 및 아데노신을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 화장료 조성물이 진피 섬유아세포 증식 활성 콜라겐 생합성 증진 활성 및 항산화 활성이 우수하여 피부 재생, 주름 개선 및 탄력 개선 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 다른 양상은 피부 상태 개선용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 기재하였듯이 본 발명자들은 아로니아 열매의 증류수 추출물과 기능성 성분으로 상피세포 성장인자, 나이아신아마이드 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물이 우수한 항산화 활성, 콜라겐 생합성 증진 활성 및 진피 섬유아세포 증식 활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 앰플, 세럼, 로션, 크림, 팩, 젤 또는 세정제 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 아로니아 추출물 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정할 수 있다.
본 발명의 피부 상태 개선용 조성물은 상온에서 보관하여도 상피세포 성장인자, 나이아신아마이드 및 아데노신의 활성이 유지되고, 항산화 및 진피 섬유아세포 증식 및 콜라겐 생합성 증진 활성이 우수하므로 피부 상태 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아로니아 열매 증류수 추출물의 항산화 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 화장료 조성물에 첨가되는 기능성 물질인 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 3은 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자를 함유하는 완충용액과 아로니아 열매 추출물을 추가로 포함하는 완충용액을 4℃와 상온에서 15일 동안 보관한 후, 각 물질을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 4는 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자를 함유하는 화장료 조성물과 아로니아 열매 추출물을 추가로 포함하는 화장료 조성물을 4℃와 상온에서 15일 동안 보관한 후, 각 물질을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 5는 보관 조성 및 보관 조건에 따른 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자의 수준을 확인한 결과이다.
도 6는 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 섬유아세포에 처리하여 세포 증식 정도를 현미경(A)과 MTS assay(B)로 분석한 결과이다.
도 7은 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 섬유아세포에 처리하여 콜라겐의 생합성 정도를 분석한 결과이다.
도 8은 기능성 물질로 아로니아 열매 추출물만 함유하는 기본 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 이를 섬유아세포에 처리하여 항산화 활성의 유지 여부를 분석한 결과이다.
도 2는 화장료 조성물에 첨가되는 기능성 물질인 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 3은 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자를 함유하는 완충용액과 아로니아 열매 추출물을 추가로 포함하는 완충용액을 4℃와 상온에서 15일 동안 보관한 후, 각 물질을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 4는 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자를 함유하는 화장료 조성물과 아로니아 열매 추출물을 추가로 포함하는 화장료 조성물을 4℃와 상온에서 15일 동안 보관한 후, 각 물질을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 5는 보관 조성 및 보관 조건에 따른 나이아신아마이드, 아데노신 및 사람 상피세포 성장인자의 수준을 확인한 결과이다.
도 6는 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 섬유아세포에 처리하여 세포 증식 정도를 현미경(A)과 MTS assay(B)로 분석한 결과이다.
도 7은 나이아신아마이드, 아데노신, 사람 상피세포 성장인자 및 아로니아 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 섬유아세포에 처리하여 콜라겐의 생합성 정도를 분석한 결과이다.
도 8은 기능성 물질로 아로니아 열매 추출물만 함유하는 기본 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 이를 섬유아세포에 처리하여 항산화 활성의 유지 여부를 분석한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 아로니아 열매 추출물 제조 및 항산화 활성 평가
1-1. 아로니아 열매 추출물 제조
동결 및 건조된 아로니아 열매 분말(㈜산마을, 충청북도) 210 g에 증류수 4,200 ㎖을 첨가하고, 37℃에서 200 rpm으로 8 내지 12시간 동안 교반하여 1차 용출시킨 후 초음파 파쇄기 출력 50%로 3분 동안 초음파를 처리하였다.
초음파 처리된 각각의 추출물을 8,000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 상층액(1차 추출물)만 수거하고, 남은 아로니아 침전물에는 증류수 4,200 ㎖를 추가로 첨가하여 위에 기술한 방법과 동일한 방법으로 추가 추출을 수행하였다. 추가 추출을 1회 더 수행한 후 1차 추출물과 추가 추출물을 혼합하여 Whatman GF/F (pore size 0.75 ㎛) 필터로 여과하였다. 여과물을 감압회전증류기로 농축시킨 후 동결건조하여 아로니아 열매 추출물(증류수 추출물) 분말 139.8g을 제조하였다.
1-2. 항산화 활성 평가
상기 아로니아 열매 추출물 분말을 100 ㎎/㎖ 농도로 생리식염수에 녹이고, 추출물의 항산화 활성을 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 분석법으로 확인하였다. 항산화 활성의 표준물질로는 아스코르브산 (ascorbic acid)을 사용하였다.
분석 결과, 표준물질인 아스코르브산(40 mM)은 72.6%의 활성산소 소거활성을 보였고, 아로니아 증류수 추출물은 250 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 아스코르브산보다 우수한 활성산소 소거활성을 보였다 (도 1).
실시예 2: 화장료 조성물 제조 및 사용감 평가
2-1. 아로니아 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물
하기 표 1에 기재된 함량으로 화장료 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 70℃ 정제수에 글리세린, 소듐하이루로네이트, 부틸렌글라이콜, 1,2-핵산다이올, 판테놀, 카보머, 잔탄검, 알지닌, 베타인, 알란토인, 소듐클로라이드, 소듐포스페이트를 용해하여 혼합시키고, 30℃로 냉각시켰다. 냉각된 용해물에 나머지 원료를 첨가하고, 혼합 및 용해시켜 표 1의 조성물 A, B, C를 제조하였다.
| 원료명 | A | B | C |
| 정제수 | 잔량 (to 100%) | 잔량 (to 100%) | 잔량 (to 100%) |
| 글리세린 | 41 % | 41 % | 41 % |
| 부틸렌글라이콜 | 5 % | 5 % | 3 % |
| 1,2-헥산다이올 | 2 % | 2 % | 2 % |
| 나이아신아마이드 | 2 % | 2 % | 2 % |
| 판테놀 | 0.3 % | 0.3 % | 0.3 % |
| 카보머 | 0.25 % | 0.25 % | 0.15 % |
| 잔탄검 | 0.25 % | 0.15 % | 0.15 % |
| 알지닌 | 0.22 % | 0.22 % | 0.22 % |
| 베타인 | 0.2 % | 0.2 % | 0.2 % |
| 알란토인 | 0.1 % | 0.1 % | 0.1 % |
| 아데노신 | 0.04 % | 0.04 % | 0.04 % |
| 소듐하이알루로네이트(분말) | 0.015 % | 0.015 % | 0.015 % |
| 소듐클로라이드 | 0.1169 % | 0.1169 % | 0.1169 % |
| 소듐포스페이트 | 0.2839 % | 0.2839 % | 0.2839 % |
| 아로니아열매 추출물 | 0.2% | 0.2% | 0.2% |
| 에스에이치-올리고펩타이드-1 | 0.001% | 0.001% | 0.001% |
2-2. 화장료 조성물의 사용감 평가
여성 46명을 대상으로 표 1에서 제조한 화장료 조성물 A, B, C에 대한 사용 감성을 평가하였다. 평가 대상자는 20대 4명, 30대 8명, 40대 14명, 50대 8명, 60대 6명, 70대 1명이고, 평가 대상 항목은 처음 바를 때 사용감, 흡수력, 사용 후 끈적임, 사용 후 촉촉함이다. 평가 대상자가 각 문항에 대하여 "매우 그렇다(매우 만족)"를 5점, "그렇다(만족)"를 4점, "보통이다(평균)"를 3점, "그렇지 않다(불만족)"를 2점, "전혀 그렇지 않다(매우 불만족)"를 1점으로 평가한 점수를 문항별로 합산하고 평가 대상자 수로 나눈 평균값과 각각 문항별 평균값을 합산한 평균값을 사용 감성 평균 값으로 표 2에 나타냈다.
| 구분 | A | B | C |
| 처음 바를 때 사용감 | 4.61 | 4.52 | 4.48 |
| 흡수력 | 4.69 | 3.85 | 4.16 |
| 사용 후 끈적임 | 4.44 | 3.95 | 3.96 |
| 사용 후 촉촉함 | 4.38 | 4.12 | 4.08 |
| 사용 감성 평균 | 4.53 | 4.11 | 4.22 |
표 2의 설문평가 결과에서 점증제로 카보머와 잔탄검의 함량이 높은 A 조성물이 다른 조성물과 비교하여 사용감, 흡수력, 끈적임, 촉촉함에 대한 감성평가가 우수하였으므로 조성물 A를 화장료 조성물로 선정하였다.
실시예 3: 화장료 조성물 기능성 성분의 안정성 분석
화장료 조성물에 함유된 에스에이치-올리고펩타이드-1 (상피세포 성장인자, 이하, EGF로 기재함)과 다른 기능성 성분의 상호작용 및 열 안정성을 확인하였다.
먼저, 화장료 조성물 A에서 기능성 성분인 나이아신아마이드, 아데노신, EGF 및 아로니아 열매 추출물이 제외된 기본 조성물, 20 mM NaCl이 첨가된 20 mM Sodium phosphate buffer (pH5.8)를 제조하였다. 이 기본 조성물과 완충용액에 하기 성분들을 각각 첨가하여 분석 시료를 만들었다: i) EGF(200 ㎍/㎖) 단독 (EGF); ii) EGF(200 ㎍/㎖)+나이아신아마이드(1 ㎎/㎖)+ 아데노신(1 ㎎/㎖) (EGF-Extract); 및 iii) 상기 ii)+아로니아 추출물(2 ㎎/㎖) (EGF all). 상기 iii)은 화장료 조성물 A에 해당한다.
상기 분석 시료를 4℃ 또는 상온 (24 ~ 30℃)에서 5일 또는 15일 동안 보관한 후, XBridge BEH C18 컬럼 (4.6 x 50 ㎜; Waters, 미국)을 사용한 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.
활성이 있는 EGF (native form)의 비율은 HPLC로 분석한 각 기능성 성분들의 피크 면적을 화장료 조성물의 최초 제조일에 확인한 각 성분들의 피크 면적에 대한 백분율로 계산하였다.
개별 기능성 물질에 대한 머무름 시간(retention time)을 확인한 결과, 나이아신아마이드, 아데노신 및 EGF의 머무름 시간은 각각 0.907, 2.455, 9.152분이었다. 아로니아 열매 추출물은 많은 피크(peak)들이 존재하였다 (도 2). 각 피크의 면적으로 분석한 순도는 나이아신아마이드와 아데노신이 약 98 ~ 100%였고, 활성이 있는 EGF의 순도는 97.5 ~ 100%로 평균 98.71%인 것으로 분석되었다.
또한, 도 3 및 도 4에는 각 분석 시료를 보관한 후 활성이 있는 EGF의 비율을 HPLC 크로마토그램에 순도로 표기하였다.
완충용액에 EGF만 함유된 시료를 상온에서 5일 동안 보관하면 활성이 있는 EGF는 4.68%만 존재하고 나머지는 활성이 없는 구조로 전환되었으나, 항산화 활성이 우수한 아로니아 열매 추출물이 같이 함유된 경우에는 보관 온도와 무관하게 활성이 있는 EGF의 비율이 유지되었다 (표 3 및 도 3). 이는 아로니아 열매 추출물이 EGF의 안정화제로서 탁월한 활성이 있음을 의미한다.
한편, EGF만 포함하는 기본 조성물을 상온에서 15일 동안 보관하면 활성이 있는 EGF 비율이 93.52%로 약 5%가 감소하여 완충용액에서 보관할 때 보다 EGF가 약 90% 이상 더 안정화되었다 (표 3 및 도 4).
또한 완충용액에 함유된 나이아신아마이드와 아데노신은 온도 변화에 민감하게 구조가 변성되나, 화장품 조성물 A에서는 100% 안정화되는 것으로 나타났다 (표 3 및 도 5).
| 구분 | 제조일 | 완충용액, 5일 후 | 조성물 A, 14일 후 | |||
| 분석 그룹 | 분석시료 | 4℃ | 상온 | 4℃ | 상온 | |
| EGF | EGF | 98.13 | 91.35 | 4.68 | 97.69 | 93.52 |
| EGF - Extract | EGF | 97.95 | 100.00 | 52.15 | 100.00 | 95.93 |
| Niacinamide | 100.00 | 100.00 | 89.50 | 100.00 | 100.00 | |
| Adenosine | 100.00 | 21.71 | 0.29 | 100.00 | 100.00 | |
| EGF all | EGF | 99.65 | 100.00 | 100.00 | 98.38 | 100.00 |
| Niacinamide | 100.00 | 100.00 | 79.16 | 100.00 | 100.00 | |
| Adenosine | 100.00 | 6.56 | 1.76 | 100.00 | 100.00 | |
실시예 4: 화장료 조성물의 사람 진피 섬유아세포 증식 활성 분석
사람 EGF, 아로니아 열매 추출물, 나이아신아마이드 및 아데노신이 각각 200 ㎍/㎖, 2 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖ 농도로 함유된 화장료 기본 조성물 A1, 다른 기능성 성분 없이 아로니아 열매 추출물만 400 ㎎/㎖ 농도로 함유된 화장료 기본 조성물 A2를 상온에서 15일 동안 보관하였다.
이 화장료 기본 조성물 A1를 사람 EGF가 200 ng/㎖ 되도록 PBS에 희석하였다. 대조군에는 열 안정성 분석에 사용한 것과 동일한 사람 EGF를 PBS로 200 ng/㎖ 농도로 희석하여 사용하였다.
사람 진피 섬유아세포 (neonatal Human Dermal Fibroblast; HDFn)를 2 x 104 cells/㎖ 농도로 희석하여 48-웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ㎖씩 분주한 후 18시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 제거하고 1 ㎖ PBS로 각 웰을 세척하였다. 세척된 각 웰에 0.1% FBS가 함유된 DMEM 배지를 첨가하고, 실험군 (EGF/Com.A)의 각 웰에 화장료 기본 조성물 A2 (아로니아 열매 추출물의 최종 처리 농도 2 ㎎/㎖) 및 화장료 기본 조성물 A1 (EGF 최종 처리 농도 0.5, 1, 2 및 4 ng/㎖)을 첨가하였다. 대조군에는 서로 다른 농도의 사람 EGF를 포함하는 PBS(EGF/PBS)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 현미경으로 관찰하였다. 배양된 세포에 MTS 용액 (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) 50 ㎕를 첨가하여 2~4시간 동안 배양한 후, 배양액 200 ㎕를 96-웰의 각 웰에 옮기고 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 증식률을 분석하였다.
현미경 관찰 결과, 사람 진피 섬유아세포에 상온에서 15일 동안 보관한 화장료 조성물 A1과 A2를 처리한 실험군에서 화장료 조성물 A1에 함유된 EGF의 처리 농도에 따라 농도 의존적 세포 증식이 촉진된 것을 알 수 있었다 (도 6A).
또한, MTS 실험에서도 유사한 결과를 확인하였으며, 대조군(EGF/PBS)과 비교하여 화장료 기본 조성물 A1과 A2를 처리한 실험군(EGF/Com.A)에서 세포 증식률이 더 우수한 것을 알 수 있었다 (도 6B).
본 실시예의 결과를 통해 본 발명의 화장료 조성물 A는 기능성 성분의 열 안정성이 우수하여 기능성 성분의 활성이 상온에서 오래 유지되고, 결과적으로 EGF에 의한 세포 증식이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 5: 화장료 조성물의 콜라겐 생합성 활성 분석
사람 EGF, 아로니아 열매 추출물, 나이아신아마이드, 아데노신이 각각 200 ㎍/㎖, 2 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 농도로 함유된 화장품 조성물 A를 상온에서 15일 동안 보관하였다. 이 화장료 조성물을 사람 EGF 농도가 200 ng/㎖이 되도록 PBS에 희석하여 콜라겐 생합성 활성 평가에 사용하였다. 콜라겐 (procollagen) 생합성량은 Procollagen ELISA kit (Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit, Takara)를 사용하여 제조사의 권장방법에 따라 측정하였다.
HDF 세포를 2 x 104 cells/㎖ 농도로 희석하고 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 ㎖씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 제거하고 1 ㎖ PBS로 세척하였다. 세척된 각 웰에 0.1% FBS가 함유된 DMEM 배양배지 1 ㎖을 첨가하고, PBS로 희석한 화장료 조성물 A (EGF 농도 1, 2, 4 ng/㎖)를 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 이후 HDFn 세포 상층액 0.5 ㎖을 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 이후, 제조사의 방법에 따라 ELISA assay를 수행하고 450 ㎚에서 흡광도로 측정하여 PIP 정량값을 음성대조군 PBS에 대한 상대적인 콜라겐 생합성량으로 분석하였다.
분석 결과, 사람 진피 섬유아세포에 상온에서 15일 동안 보관한 화장료 조성물 A를 처리하여도 EGF 농도 의존적으로 콜라겐 생합성이 증가하는 것을 알 수 있었으며, 콜라겐 생합성은 33까지 증가하였다 (도 7).
도 6 및 도 7의 결과로부터 본 발명의 화장료 조성물 A는 사람 상피세포 성장인자의 활성을 상온에서 장기간 보존하므로 사람 진피 섬유아세포에서 콜라겐 생합성 증가와 세포의 증식 및 재생을 촉진하여 주름개선에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 화장료 조성물의 항산화 활성 분석
기본 조성물에 아로니아 열매 추출물만 첨가한 조성물을 상온에서 15일 동안 보관한 후, 이 조성물이 HDFn 세포에서 과산화수소 (H2O2)로 유도된 세포독성을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.
10% FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM low glucose 배양액에서 배양된 세포를 4 X 104 cells/㎖로 희석한 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕씩 분주하여 18시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 아로니아 열매 추출물의 처리 농도가 2 ㎎/㎖ 또는 1 ㎎/㎖가 되도록 상기 조성물을 전처리하고, 대조군에는 PBS를 처리하였다. 이후 과산화수소를 농도별로 각 웰에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 현미경으로 관찰하고, 각 웰에서 배양액 200 ㎕를 제거한 후 MTS 시약 30 ㎕를 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후, 배양액 100 ㎕에 대해 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도 대비 실험군의 흡광도를 조성물 A에 함유된 아로니아 열매 추출물의 항산화 활성으로 평가하였다.
확인 결과, 기본 조성물 (아로니아 열매 추출물 2 ㎎/㎖)를 처리한 HDFn 세포는 세포 증식이 약 9% 증가하였다. 과산화수소를 400 uM로 처리한 세포에서는 77.7%의 세포독성이 유도되었으나, 기본 조성물 (아로니아 열매 추출물 2 ㎎/㎖)를 전처리한 후 과산화수소를 400 uM을 처리한 세포에서는 세포독성이 24.6%로 억제되었다 (도 8).
이 결과를 통해, 본 발명의 화장료 조성물이 과산화수소로 유도된 세포독성을 감소시키는 우수한 항산화 활성이 있음을 밝혔다.
Claims (11)
- 아로니아 열매 추출물 및 상피세포 성장인자를 유효성분으로 포함하고,
상피세포 성장인자의 열 안정성이 개선된 피부 상태 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아로니아 열매 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출된 것인, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 아로니아 열매 추출물은 물 추출물 또는 30% 에탄올 추출물인, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아로니아 열매 추출물은 조성물의 총 중량 기준으로 0.05 내지 20 중량%로 포함되는, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자는 에스에이치-올리고펩타이드-1 (sh-oligopepetide-1) 및 알에이치-올리고펩타이드-1 (rh-oligopeptide-1)로 이루어진 군에서 선택되는, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 에스에이치-올리고펩타이드-1는 조성물의 총 중량 기준으로 0.0001 내지 1 중량%로 포함되는 것인, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 나이아신아마이드 및 아데노신을 추가로 포함하는, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물은 상온에서 상피세포 성장인자, 나이아신아마미드 및 아데노신의 안정성이 개선된 것인, 피부 상태 개선용 조성물.
- 제1항에 따른 피부 상태 개선용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 조성물은 피부 재생, 노화 방지 항산화, 진피 섬유아세포 증식, 주름 및 탄력 개선 활성을 갖는, 화장료 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 앰플, 세럼, 로션, 크림, 팩, 젤 또는 세정제의 제형인, 화장료 조성물.
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| KR102096347B1 (ko) | 2018-12-20 | 2020-05-27 | 주식회사 네이처센스 농업회사법인 | 효능과 열안정성이 강화된 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물 |
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| KR20180060701A (ko) * | 2016-11-29 | 2018-06-07 | 주식회사 엔씨엘바이오 | 표피 생장 인자를 함유하는 피부 상태 개선용 조성물 |
| KR102101920B1 (ko) * | 2018-04-05 | 2020-05-18 | 주식회사 메타랩스 | 사람 상피세포 성장인자, 펩타이드 및 기능성 소재를 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 |
| KR20180053601A (ko) * | 2018-04-27 | 2018-05-23 | 경상대학교산학협력단 | 성장인자와 사이토카인을 포함하는 조성물 |
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2021
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Patent Citations (2)
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| KR101833018B1 (ko) | 2016-12-23 | 2018-02-27 | 정윤주 | 아로니아 추출물을 함유하는 비타민 c 안정화용 화장료 조성물 |
| KR102096347B1 (ko) | 2018-12-20 | 2020-05-27 | 주식회사 네이처센스 농업회사법인 | 효능과 열안정성이 강화된 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물 |
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