KR102594007B1 - Lactobacillus fermented product containing vitamin K2, and composition for preventing or treating inflammation containing same - Google Patents
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Abstract
비타민 K2 (메나퀴논; Menaquinones, MK4) 생산 기능을 가지는 유산균, 상기 유산균을 이용한 비타민 K1 (필라퀴논; Phylloquionone)을 포함하는 식물 원료의 발효물, 및 상기 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 발효물은 비타민 K1 및 비타민 K2를 포함하여, 우수한 염증 예방, 치료 또는 개선 효과를 가진다. Lactic acid bacteria having the function of producing vitamin K2 (menaquinones, MK4), a fermented product of plant raw materials containing vitamin K1 (phylloquionone) using the lactic acid bacteria, and a composition for preventing or treating inflammation comprising the fermented product and its manufacturing method. The fermented product contains vitamin K1 and vitamin K2 and has excellent inflammation prevention, treatment or improvement effects.
Description
비타민 K2 (메나퀴논; Menaquinones, MK4) 생산 기능을 가지는 유산균, 상기 유산균을 이용한 비타민 K1 (필라퀴논; Phylloquionone)을 포함하는 식물 원료의 발효물, 상기 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.Lactic acid bacteria with the function of producing vitamin K2 (menaquinones, MK4), a fermented product of plant raw materials containing vitamin K1 (phylloquionone) using the lactic acid bacteria, a composition for preventing or treating inflammation containing the fermented product, and its manufacturing method.
비타민은 정상적인 신진대사기능에 필요한 미량의 유기물질로 식물과 동물에 모두 함유되어 있으며 식물은 모든 비타민을 자체적으로 합성하지만 동물은 비타민을 합성할 수 있는 능력이 각기 다르다. 그러므로 인체 내에서 합성이 불가능한 것은 체내 신진대사에 필요한 만큼을 식품으로 공급해주지 않으면 부족하게 되어 결핍증이 생긴다. 비타민 종류는 현재 13종의 비타민이 국제적으로 승인되어 있고 용해성에 따라 4종의 지용성비타민 (fat-soluble vitamin; 비타민 A, D, E, K)와 9종의 수용성 비타민 (water-soluble vitamin; 비타민C, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12)으로 구분된다.Vitamins are trace amounts of organic substances required for normal metabolic functions and are contained in both plants and animals. Plants synthesize all vitamins on their own, but animals have different abilities to synthesize vitamins. Therefore, if the amount of something that cannot be synthesized in the human body is not supplied through food in the amount necessary for metabolism in the body, it will become insufficient and a deficiency will occur. Currently, 13 types of vitamins are internationally approved, and depending on solubility, there are 4 types of fat-soluble vitamins (vitamins A, D, E, K) and 9 types of water-soluble vitamins (vitamins). C, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12).
비타민 K (필라퀴논; Phylloquinone)는 염증완화, 혈액응고 및 골대사 기능을 가지며 체내에서 필요량이 적고 장내의 박테리아에 의해 합성되며 여러 식품에 분포되어 있어 결핍증이 거의 유발되지 않으나 지혈 관련 약물 치료를 받을 경우에 비타민 K 결핍증상이 발생한다. 비타민 K는 식물에서 주로 존재하는 비타민 K1 (필로퀴논; Phylloquionone)과 동물성인 고기와 계란, 우유 등의 식품에 존재하거나 미생물에 의해 합성되는 비타민 K2 (메나퀴논; Menaquinones)의 두 개 형태로 존재한다. 비타민 K2 인 메나퀴논 (MKs)은 옆 사슬의 길이에 따라 MK-n으로 표기하며, n은 옆사슬의 아이소프레노이드 (isoprenoid: 이소프렌 구성단위)의 수이며, 이에 따라 메나퀴논-4, 5, 7, 13 (menaquinone4, 5, 7, 13; MK-4, MK-5, MK-7, MK-13)등으로 구분되며 긴 사슬은 낫토, 청국장 등의 발효음식에서 확인된다 (Walther B., 2013). 비타민 K2 의 체내 이용은 비타민 K1 보다 더 높으며, 메나퀴논 MK-7, MK-9 등의 긴 사슬은 필로퀴논과 MK-4보다 반감기가 길어 체내에서의 흡수와 이용에 효율적이다 (Schurgers Ll., 2007). 메나퀴논의 MK-4, MK-7, MK-8과 MK-9은 심혈관계 질환을 예방하는 한편 뼈성장과 골절 및 뼈 내부의 미네랄 부족 방지 등의 기능이 알려져 있다 (Rees K., 2010; Fujita Y., 2012). 유산균 (Lactic acid bacteria; LAB)은 발효 식품에서 비타민을 생산자로서 중요한 열쇠이다. Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides는 MK-8, MK-9와 MK-10의 생산자로 알려져 있다 (morishita T 1999). Vitamin K (Phylloquinone) has inflammation-relieving, blood coagulation, and bone metabolism functions. The amount required in the body is small, and it is synthesized by bacteria in the intestines and is distributed in various foods, so deficiency rarely occurs, but when treated with drugs related to hemostasis, vitamin K Vitamin K deficiency symptoms occur. Vitamin K exists in two forms: Vitamin K1 (Phylloquionone), which is mainly found in plants, and Vitamin K2 (Menaquinones), which is present in animal foods such as meat, eggs, and milk, or synthesized by microorganisms. . Menaquinones (MKs), which are vitamin K2, are denoted as MK-n according to the length of the side chain, where n is the number of isoprenoids (isoprene units) in the side chain, and accordingly, menaquinone-4, 5, It is classified into 7, 13 (menaquinone4, 5, 7, 13; MK-4, MK-5, MK-7, MK-13), and long chains are found in fermented foods such as natto and cheonggukjang (Walther B., 2013). The body's utilization of vitamin K2 is higher than that of vitamin K1, and long chains such as menaquinones MK-7 and MK-9 have a longer half-life than phylloquinone and MK-4, making them more efficient for absorption and use in the body (Schurgers Ll., 2007). Menaquinones MK-4, MK-7, MK-8, and MK-9 are known to have functions such as preventing cardiovascular disease, bone growth, fractures, and mineral deficiency within bones (Rees K., 2010; Fujita Y., 2012). Lactic acid bacteria (LAB) are important producers of vitamins in fermented foods. Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, and Leuconostoc mesenteroides are known to be producers of MK-8, MK-9, and MK-10 (morishita T 1999).
비타민 K1은 식물내의 생화학 중간산물인 코리스믹산 (chorismic acid; chorismate; C10H10O6) 생합성 경로로, 비타민 K2는 박테리아 (유산균 포함)내의 중간산물인 코리스믹산 생합성 경로를 통해 생산된다 (Nowicka B., 2010). 코리스믹산은 펜토스 인산 경로 (pentose phosphate pathway)와 당화과정 (glycolysis)에서의 전구체를 제공하는 시킴산 (shikimic acid; shikimate) 경로에서 생산되는 중간대사체이다. 그러므로 이들 합성 경로에는 에너지 대사체 뿐만 아니라 탄소원 (carbon)이 식물과 박테리아내에서 비타민 K1과 비타민 K2 생산에 영향하는 것으로 알려져 있다 (Hermann KM., 1999). 또한 이들 비타민 K1과 비타민 K2 생산 경로에 관여한 생합성 효소 유전자가 관련되고 있으며 이들 유전자는 대장균 (Escherichia coli; E. coli)과 B. subtilis에서 클로닝 되었으며 몇몇의 유산균에서도 확인되었다 (Sharma V., 1992; Hill K., 1990). 코리스믹산을 필로퀴논과 메나퀴논으로 합성에 대한 확실한 연구 보고는 없지만 유사한 경로로 진행되는 것으로 생각되고 있다. 경로에 관련 된 유전자는 menF (siochorsmate synthase), mend (2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase), menE (O-succinylbenzoic acid-CoA ligase), menB (dihydroxynaphthoate synthase)와 menA (phytyl transferase), menC (DHNA thioesterase) 등이 알려져 있다. 최근 다양한 원료로부터 비타민 생산 기능을 가진 물질과 유산균을 탐색하여, 식품에 적용하려는 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 비타민 K1 함유 식물을 대상으로 GRAS (Generally recognized as safe)로 분리된 유산균 (Lactic acid bacteria, LAB) 발효에 의한 비타민 K1과 비타민 K2 복합 조성물 생산에 적용한 예는 없다. Vitamin K1 is produced through the biosynthesis pathway of chorismic acid (chorismate; C 10 H 10 O 6 ), a biochemical intermediate in plants, and vitamin K2 is produced through the chorismic acid biosynthesis pathway, an intermediate product in bacteria (including lactic acid bacteria) (Nowicka B., 2010). Chorismic acid is an intermediate metabolite produced in the pentose phosphate pathway and the shikimic acid (shikimate) pathway, which provides a precursor for glycolysis. Therefore, in these synthetic pathways, not only energy metabolites but also carbon sources are known to affect the production of vitamin K1 and vitamin K2 in plants and bacteria (Hermann KM., 1999). In addition, biosynthetic enzyme genes involved in the vitamin K1 and vitamin K2 production pathways have been implicated, and these genes have been cloned from Escherichia coli (E. coli) and B. subtilis and identified in several lactic acid bacteria (Sharma V., 1992 ; Hill K., 1990). Although there are no definitive research reports on the synthesis of chorismic acid into phylloquinone and menaquinone, it is thought to proceed through a similar route. Genes involved in the pathway are menF (siochorsmate synthase), mend (2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase), menE (O-succinylbenzoic acid-CoA ligase), and menB (dihydroxynaphthoate synthase). and menA (phytyl transferase) and menC (DHNA thioesterase) are known. Recently, research is being conducted to explore substances and lactic acid bacteria with vitamin production functions from various raw materials and apply them to foods. However, Lactic acid bacteria have still been isolated as GRAS (Generally recognized as safe) for plants containing vitamin K1. , LAB) There are no examples of application to the production of vitamin K1 and vitamin K2 complex compositions by fermentation.
이러한 배경하에서 본 발명자들은 비타민 K1 함유 시금치, 브로콜리, 또는 그 혼합물, 이의 착즙액 및/또는 이의 건조 분말을 포함하는 발효 원료 및 비타민 K2 생산에 적합한 효소를 가진 유산균을 이용한 배양을 통해 비타민 K2가 생성되거나 비타민 K2 생성이 증가함을 확인하고, 이와 같이 얻어진 발효물의 염증완화 효과를 확인하여, 이를 포함하는 기능성 조성물을 제공하고자 한다. Against this background, the present inventors produced vitamin K2 through fermentation raw materials containing vitamin K1-containing spinach, broccoli, or mixtures thereof, juice thereof, and/or dry powder thereof, and culture using lactic acid bacteria with enzymes suitable for producing vitamin K2. The purpose of this study is to confirm that vitamin K2 production is increased, confirm the inflammation-relieving effect of the fermented product thus obtained, and provide a functional composition containing it.
본 명세서는 시금치, 브로콜리 등의 비타민 K1을 함유하는 식물, 이의 착즙액 및/또는 건조 분말에 유산균을 이용한 바이오컨버젼 (bioconversion)기술을 응용하여, 비타민 K1에 더하여 염증 및/또는 염증성 질환 치료, 개선, 예방 등에 유용한 비타민 K2 생성을 유도하여 비타민 K2 효능이 부가된 식물 착즙 발효물 및 그 용도를 제공한다. 상기 식물 측즙 발효물은, 유산균 자체의 분해효소로 아미노산, 펩타이드화, 지방, 탄수화물 등을 분해하여 체내 흡수율과 기능성을 우수하다.This specification applies bioconversion technology using lactic acid bacteria to plants containing vitamin K1, such as spinach and broccoli, and their juice and/or dry powder, to treat and improve inflammation and/or inflammatory diseases in addition to vitamin K1. Provides fermented plant juice with added vitamin K2 efficacy by inducing the production of vitamin K2, which is useful for prevention, etc., and its uses. The fermented plant juice has excellent absorption rate and functionality in the body by decomposing amino acids, peptides, fats, carbohydrates, etc. with the decomposing enzymes of the lactic acid bacteria themselves.
상기 목적 달성을 위해 본 명세서는 비타민 K1이 포함된 시금치 및/또는 브로콜리 등의 발효 원료를 유산균 발효하여 제조된 발효물을 이용하여 염증 예방, 치료 또는 개선 용도가 제공된다.To achieve the above object, the present specification provides the use of fermented products produced by lactic acid bacteria fermentation of fermented raw materials such as spinach and/or broccoli containing vitamin K1 to prevent, treat, or improve inflammation.
일 예는 시금치 및 브로콜리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물; 상기 식물의 착즙액; 및 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 발효 원료를 유산균 발효하여 제조된 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식물은 전부 (전초) 또는 부분(잎, 줄기, 뿌리, 열매, 및/또는 꽃)으로 이용될 수 있다.One example is one or more plants selected from the group consisting of spinach and broccoli; Squeezed juice of the plant; And providing a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation or a food composition for preventing or improving inflammation, including a fermented product prepared by lactic acid bacteria fermentation of a fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of the plant or juice. do. The plant can be used whole (starter) or parts (leaves, stems, roots, fruits, and/or flowers).
다른 예는 시금치 및 브로콜리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물; 상기 식물의 착즙액; 및 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 발효 원료를 유산균 발효하는 단계를 포함하는, 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효물, 상기 유산균 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 염증 개선용 식품 조성물의 제조방법을 제공한다.Other examples include one or more plants selected from the group consisting of spinach and broccoli; Squeezed juice of the plant; And lactic acid fermentation of a fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of the plant or juice, a lactic acid bacteria fermented product containing vitamin K2, inflammation prevention comprising the lactic acid bacteria fermented product, or A method for manufacturing a pharmaceutical composition for treatment or a food composition for improving inflammation is provided.
다른 예는 수탁번호 KCCM 12759P를 가지는 Lactococcus lactis 유산균, 수탁번호 KCCM 12756P를 갖는 Leuconostoc mesenteroides 유산균을 제공한다.Other examples provide Lactococcus lactis lactic acid bacteria with accession number KCCM 12759P and Leuconostoc mesenteroides lactic acid bacteria with accession number KCCM 12756P.
다른 예는 비타민 K1을 포함하는 식물; 상기 식물의 착즙액; 및 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 발효 원료를 유산균 발효하는 단계를 포함하는, 비타민 K2를 생산하는 방법을 제공한다.Other examples include plants containing vitamin K1; Squeezed juice of the plant; and lactic acid fermentation of a fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of the plant or juice.
본 명세서는 비타민 K1이 포함된 시금치, 브로콜리 등의 발효 원료에 유산균을 발효시켜 제조된 발효물, 및 상기 발효물의 염증 예방, 치료 또는 개선 용도가 제공된다.The present specification provides a fermented product prepared by fermenting lactic acid bacteria on fermented raw materials such as spinach and broccoli containing vitamin K1, and the use of the fermented product to prevent, treat, or improve inflammation.
본 명세서에서 비타민 K1 (phylloquinone; C31H46O2)은 필로퀴논, phylloquinone으로 지칭할 수 있고, 비타민 K2 (menaquinone; C31H40O2)은 메나퀴논, menaquinone으로 지칭할 수 있고, menaquinone-4 (mk4)의 형태를 포함할 수 있다. 비타민 K1은 구조적으로 다환방향족 케톤으로 공기와 수분에는 비교적 안정하지만 햇빛에는 분해된다. 비타민 K2는 전구체인 DHNA (1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid)로 박테리아 호흡 사슬에서 전자 공여체로 기능한다. 비타민 K2의 생합성은 DHNA와 이소프레노이드 (isoprenoid) 합성의 두 개의 독립된 합성에 의해 진행된다. DHNA는 이소프리노이드 합체에 의해 메나퀴논으로 전환된다. 이론적으로 미생물 생산자로부터 생산된 DHAN 양은 그리셀알데하이드 삼 인산 (glyceraldehyde-3-phosphate)과 파이루베이트 (pyruvate)부터 생성되는 이소프리노이드 합성의 제한에 의해 증가할 수 있다. 본 명세서의 비타민 K1을 함유한 식물, 상기 식물의 착즙액, 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 배지로 하여 비타민 K2(메나퀴논) 합성 유전자를 가지는 유산균에 의해 비타민 K2를 생산함으로써, 염증 또는 염증성 질환 등에 대한 예방, 치료, 또는 개선용 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 활용될 수 있다.In the present specification, vitamin K1 (phylloquinone; C 31 H 46 O 2 ) may be referred to as phylloquinone, and vitamin K2 (menaquinone; C 31 H 40 O 2 ) may be referred to as menaquinone, menaquinone. It may contain the form -4 (mk4). Vitamin K1 is structurally a polycyclic aromatic ketone and is relatively stable in air and moisture, but decomposes in sunlight. Vitamin K2 has a precursor, DHNA (1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid), which functions as an electron donor in the bacterial respiratory chain. The biosynthesis of vitamin K2 proceeds by two independent syntheses: DHNA and isoprenoid synthesis. DHNA is converted to menaquinone by isoprinoid conjugation. Theoretically, the amount of DHAN produced from microbial producers could be increased by limiting isoprinoid synthesis from glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate. By producing vitamin K2 by lactic acid bacteria having a vitamin K2 (menaquinone) synthesis gene using the plant containing vitamin K1 of the present specification, the juice of the plant, and/or the dried powder of the plant or juice as a medium, It can be used as a pharmaceutical composition or food composition for preventing, treating, or improving inflammation or inflammatory diseases.
본 명세서에서, “염증” (inflammation)은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 원인은 기계적 상해작용, 온도, 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이며 이 중 세균에 의한 것이 가장 많다. 이러한 주요 원인 외에도, 여러 부수적 요인과 개체의 소인이나 면역 등에 의하여 그 발생은 복잡하다.In this specification, “inflammation” is one of the defense responses of living tissue to a certain stimulus and refers to a complex lesion that occurs together with three factors: tissue degeneration, circulatory failure and exudation, and tissue proliferation. The causes include physical factors such as mechanical injury, temperature and radiation, chemical factors such as poisons, and parasites such as bacterial infections, and among these, bacteria are the most common. In addition to these main causes, its occurrence is complicated by various secondary factors and the individual's predisposition or immunity.
본 명세서에서, “치료”는 질병 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 질환 범위의 감소, 질병 진행의 지연 또는 완화, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다. “예방”은 특정 질병을 갖지 않는 대상에게 작용하여 상기 특정 질병이 발병하지 않도록 하거나, 그 발병 시기를 늦추거나, 발병 빈도를 낮추는 모든 기작 및/또는 효과를 포함하는 의미로 사용된다. As used herein, “treatment” includes improvement, alleviation or stabilization of disease state or symptoms, partial or complete recovery, prolongation of survival, reduction of disease extent, delay or alleviation of disease progression, and other beneficial treatment results. It is used with meaning. “Prevention” is used to include all mechanisms and/or effects that act on subjects who do not have a specific disease to prevent the specific disease from developing, delay its onset, or reduce the frequency of its occurrence.
본 명세서에서, “약학적 조성물” 또는 “식품 조성물”은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 및 어류 등의 척추동물에서 선택된 대상에 다양한 경로로 투여될 수 있다.In this specification, “pharmaceutical composition” or “food composition” includes humans, primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, and rabbits, and other animals such as dogs, cats, cows, pigs, sheep, horses, goats, etc. It can be administered by various routes to subjects selected from vertebrates such as mammals, birds including chickens, ducks, geese, etc., reptiles including snakes, lizards, turtles, crocodiles, etc., amphibians, and fish.
본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물의 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 복막내 투여, 병변 부위 (예컨대, 염증 예방, 치료 또는 개선이 필요한 부분 등) 국소 투여 또는 복강 주사 같은 비경구 투여의 경로로 투여될 수 있다.The method of administration of the pharmaceutical composition provided herein may be any commonly used method, such as oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, lesion site (e.g., inflammation prevention, treatment (or areas requiring improvement, etc.) may be administered via parenteral routes such as local administration or intraperitoneal injection.
상기 약학적 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 약학 조성물의 1회 또는 1일 투여량은 유효성분 (식물 착즙액)의 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 10000㎎/kg, 구체적으로, 0.01 내지 10000㎎/kg, 0.01 내지 5000㎎/kg, 0.01 내지 3000㎎/kg, 0.01 내지 2500㎎/kg, 0.01 내지 2000㎎/kg, 0.01 내지 1800㎎/kg, 0.1 내지 10000㎎/kg, 0.1 내지 5000㎎/kg, 0.1 내지 3000㎎/kg, 0.1 내지 2500㎎/kg, 0.1 내지 2000㎎/kg, 0.1 내지 1800㎎/kg, 1 내지 10000㎎/kg, 1 내지 5000㎎/kg, 1 내지 3000㎎/kg, 1 내지 2500㎎/kg, 1 내지 2000㎎/kg, 1 내지 1800㎎/kg, 10 내지 10000㎎/kg, 10 내지 5000㎎/kg, 10 내지 3000㎎/kg, 10 내지 2500㎎/kg, 10 내지 2000㎎/kg, 10 내지 1800㎎/kg, 100 내지 10000㎎/kg, 100 내지 5000㎎/kg, 100 내지 3000㎎/kg, 100 내지 2500㎎/kg, 100 내지 2000㎎/kg, 또는 100 내지 1800㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 또는 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. The dosage of the pharmaceutical composition is prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration interval, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. It can be. The administered dose may vary depending on the patient's age, weight, gender, dosage form, health condition, and disease level, and may be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals, depending on the judgment of the doctor or pharmacist. For example, the once or daily dosage of the pharmaceutical composition is 0.001 to 10000 mg/kg, specifically 0.01 to 10000 mg/kg, 0.01 to 5000 mg/kg, 0.01 based on the solid weight of the active ingredient (plant juice). to 3000 mg/kg, 0.01 to 2500 mg/kg, 0.01 to 2000 mg/kg, 0.01 to 1800 mg/kg, 0.1 to 10000 mg/kg, 0.1 to 5000 mg/kg, 0.1 to 3000 mg/kg, 0.1 to 2500 mg/kg, 0.1 to 2000 mg/kg, 0.1 to 1800 mg/kg, 1 to 10000 mg/kg, 1 to 5000 mg/kg, 1 to 3000 mg/kg, 1 to 2500 mg/kg, 1 to 2000 ㎎/kg, 1 to 1800㎎/kg, 10 to 10000㎎/kg, 10 to 5000㎎/kg, 10 to 3000㎎/kg, 10 to 2500㎎/kg, 10 to 2000㎎/kg, 10 to 1800㎎ /kg, 100 to 10000 mg/kg, 100 to 5000 mg/kg, 100 to 3000 mg/kg, 100 to 2500 mg/kg, 100 to 2000 mg/kg, or 100 to 1800 mg/kg, but It is not limited. The single or daily dosage may be formulated as a single preparation in the form of a unit dose, formulated in appropriate portions, or manufactured by placing it in a multi-dose container. The above dosage is an example of an average case, and the dosage may be higher or lower depending on individual differences.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition can be formulated and used in oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., or parenteral dosage forms in the form of sterile injectable solutions, according to conventional methods. there is.
상기 약학 조성물은 앞서 설명한 유효성분 이외에도, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (Standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제와 혼합되어 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 담체일 수 있다. In addition to the active ingredients described above, the pharmaceutical composition is generally selected from the group consisting of pharmaceutically and/or physiologically acceptable carriers, excipients, and diluents selected in consideration of administration method and standard pharmaceutical practice. It can be administered in combination with one or more adjuvants. For example, the pharmaceutically and/or physiologically acceptable carriers include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, It may contain one or more selected from the group consisting of cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. However, it is not limited thereto, and may be any carrier commonly used in the pharmaceutical field.
상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 희석제 및/또는 부형제는 약학 조성물의 적절한 제제화에 통상적으로 사용되는 모든 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤할제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.The pharmaceutically and/or physiologically acceptable diluent and/or excipient is selected from the group consisting of all fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, etc. commonly used in the appropriate formulation of pharmaceutical compositions. There may be more than one type.
예컨대, 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등의 경구투여를 위한 고형 제제의 경우, 상기 부형제는 이러한 고형 제제의 제제화를 위한 적어도 1종 이상의 물질, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이외에도, 마그네슘 스티레이트 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 경구투여를 위한 액상제제의 제제화의 경우, 통상적으로 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있고, 이외에, 통상적으로 사용되는 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. For example, in the case of solid preparations for oral administration such as tablets, pills, powders, granules, or capsules, the excipient is at least one type of material for formulating such solid preparations, such as starch and calcium carbonate. It may be one or more types selected from the group consisting of , sucrose, lactose, gelatin, etc. In addition, lubricants such as magnesium styrate talc and the like may also be used. In addition, in the case of formulation of liquid preparations for oral administration such as suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, etc., one or more types selected from the group consisting of water, liquid paraffin, etc., which are commonly used simple diluents, may be used. , various commonly used excipients, such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and/or preservatives, may be included, but are not limited thereto.
예컨대, 상기 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 적절한 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (Witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (Apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the pharmaceutical composition may be administered orally, in the form of tablets containing starch or lactose, in the form of capsules containing appropriate excipients, or in the form of elixirs or suspensions containing flavoring or coloring chemicals. It may be administered intraorally or sublingually. These liquid preparations may contain suspending agents (e.g. methylcellulose, semi-synthetic glycerides such as Witepsol or a mixture of Apricot kernel oil and PEG-6 esters or PEG-8 and caprylic/capric It may be formulated with pharmaceutically acceptable additives such as a mixture of glycerides, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공되는 식품 조성물에서, 용어 "식품"은 영양소를 한 가지 이상 함유하고 있는 식용의 천연물 또는 가공품을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 일반 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제, 및 음료 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 용어 "식품 조성물"은 상기 식품을 제조하기 위한 재료의 조합을 의미할 수 있다. In the food composition provided herein, the term "food" refers to an edible natural product or processed product containing one or more nutrients, and in its usual sense, various general foods, health functional foods, beverages, food additives, and It can be used to mean one or more selected from the group consisting of beverage additives, etc. The term “food composition” may refer to a combination of ingredients for producing the food.
상기 식품 조성물 내의 상기 생약 성분의 함량은 식품사용 형태, 목적 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 예컨대, 고형분 중량 기준으로 0.00001 내지 99.9 중량%, 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.001 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The content of the herbal ingredient in the food composition can be appropriately adjusted depending on the type of food use, purpose, etc., for example, 0.00001 to 99.9% by weight, 0.0001 to 99.9% by weight, 0.001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 0.001% by weight based on the weight of solids. It may be 50% by weight, but is not limited thereto.
상기 건강기능식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료(이하, '기능성 원료')를 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선(완화)하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강기능식품은 통상의 각종 식품, 식품 보조제, 음료, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 건강기능식품은 고형, 반고형, 또는 액체 형태일 수 있으며, 구체적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등으로 제형화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The above-mentioned health functional foods are foods manufactured using nutrients that are easily deficient in daily diet or raw materials with functions useful to the human body (hereinafter referred to as ‘functional raw materials’), and are used to maintain health, prevent certain diseases or symptoms, and/or It refers to all foods that help improve (alleviate) food, and there are no special restrictions on the form of the final product. For example, the health functional food may be selected from the group consisting of various common foods, food supplements, beverages, food additives, etc., but is not limited thereto. The health functional food may be in solid, semi-solid, or liquid form, and may be specifically formulated as powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol, etc., but is not limited thereto.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.The health functional food includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic or natural flavoring agents, colorants, thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid or its salt, alginic acid or its salt, It may additionally contain one or more selected from the group consisting of organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, and carbonating agents used in carbonated beverages. The ratio of these additives is generally selected in the range of 0.001 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the total health functional food, but is not limited thereto.
일 예는, 비타민 K1을 함유하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 포함하는 발효 원료의 유산균 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.One example is a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation, or a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation, including a lactic acid bacteria fermentation product of a fermented raw material containing a plant containing vitamin K1, juice of the plant, and/or dry powder of the plant or juice. A food composition for improvement is provided.
일 예는, 시금치 및 브로콜리로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 착즙액의 건조 분말을 포함하는 발효 원료의 유산균 발효물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.One example is a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation comprising a lactic acid bacteria fermentation product of fermentation raw materials including one or more plants selected from the group consisting of spinach and broccoli, juice of the plant, and/or dry powder of the juice. Alternatively, a food composition for preventing or improving inflammation is provided.
상기 유산균 발효물은 비타민 K1, 비타민 K2 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The lactic acid bacteria fermentation product may include vitamin K1, vitamin K2, or a combination thereof, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 식물 착즙액 및/또는 상기 착즙액의 유산균 발효물은 염증완화 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 식물 착즙액 및/또는 상기 착즙액의 건조 분말은 물과 혼합한 액상 시료 형태로서 유산균 발효의 발효 원료 (배지)로 사용될 수 있다.The plant juice provided herein and/or the lactic acid bacteria fermentation product of the juice may have inflammation-relieving activity. The plant juice and/or the dried powder of the juice can be used as a fermentation raw material (medium) for lactic acid bacteria fermentation in the form of a liquid sample mixed with water.
본 명세서에서 제공하는 유산균 발효물에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바시러러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 락토바실러스 덱스트린쿠스 (Lactobacillus dextrinicus), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 웨이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 웨이셀라 파라메센테로이드 (Weissella paramesenteroides), 페디오코쿠스 에시디락틱시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the fermented lactic acid bacteria provided herein, the lactic acid bacteria include Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactics, Leuconostoc mesenteroides, and Lactobacillus sakei. sakei), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus graminis, Lactobacillus dextrinicus, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Leuconostoc citreum, Weissella hellenica, Weissella Weissella paramesenteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium infantis ( It may be one or more species selected from the group consisting of Bifidobacterium infantis, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공되는 유산균 발효물에 있어서, 상기 유산균은 수탁번호 KCCM 12299P를 갖는 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 수탁번호 KCCM 12759P를 갖는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics) 및 수탁번호 KCCM 12756P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유산균일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the lactic acid bacteria fermentation product provided herein, the lactic acid bacteria include Lactobacillus plantarum with accession number KCCM 12299P, Lactococcus lactics with accession number KCCM 12759P, and accession number KCCM 12756P. It may be one or more types of lactic acid bacteria selected from the group consisting of Leuconostoc mesenteroides, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공되는 발효 원료는 시금치 및 브로콜리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 상기 착즙액의 건조 분말을 포함할 수 있고, 이에 더하여, 그 외의 식물, 예컨대, 양배추, 미나리, 배추, 부추, 비름, 상추, 양상추, 순무잎, 쑥, 쑥갓, 아스파라거스, 물냉이, 오크라, 유채, 케일, 파슬리, 파, 피망, 고추, 호박잎, 갓, 고사리, 고비, 고수, 공심채, 근대, 키위, 청포도, 감, 아로니아, 산수유, 구기자, 포도, 귤, 사과, 피스타치오, 피칸, 호두, 호박씨, 해바라기 씨 등로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 식물, 상기 식물의 착즙액 또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 추가로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.Fermentation raw materials provided herein may include one or more plants selected from the group consisting of spinach and broccoli, the juice of the plant, and/or the dried powder of the plant or the juice, and in addition, other plants , such as cabbage, water parsley, Chinese cabbage, leek, amaranth, lettuce, lettuce, turnip greens, mugwort, mugwort, asparagus, watercress, okra, rapeseed, kale, parsley, green onion, bell pepper, red pepper, pumpkin leaf, mustard, fern, fern. , one or more plants selected from the group consisting of cilantro, gongsimchae, Swiss chard, kiwi, green grapes, persimmon, aronia, cornelian cherry, goji berry, grapes, tangerines, apples, pistachios, pecans, walnuts, pumpkin seeds, sunflower seeds, etc., the plants It may further include, but is not limited to, juice or dried powder of the plant or juice.
본 명세서에서 사용되는 착즙액은 시금치 및/또는 브로콜리의 단독 또는 혼합 착즙액일 수 있고, 양배추, 미나리, 배추, 부추, 비름, 상추, 양상추, 순무잎, 쑥, 쑥갓, 아스파라거스, 물냉이, 오크라, 유채, 케일, 파슬리, 파, 피망, 고추, 호박잎, 갓, 고사리, 고비, 고수, 공심채, 근대, 키위, 청포도, 감, 아로니아, 산수유, 구기자, 포도, 귤, 사과, 피스타치오, 피칸, 호두, 호박씨, 해바라기 씨로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 식물의 착즙액을 추가로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The juice used herein may be a single or mixed juice of spinach and/or broccoli, cabbage, water parsley, Chinese cabbage, chives, amaranth, lettuce, lettuce, turnip leaves, mugwort, mugwort, asparagus, watercress, okra, Rape, kale, parsley, green onion, bell pepper, red pepper, pumpkin leaf, mustard, fern, fern, coriander, gongsimchae, chard, kiwi, green grape, persimmon, aronia, cornelian cherry, goji berry, grape, tangerine, apple, pistachio, pecan, It may further include, but is not limited to, the juice of one or more plants selected from the group consisting of walnuts, pumpkin seeds, and sunflower seeds.
본 명세서에서 제공되는 착즙액 건조 분말은 물과 혼합하여 발효 원료로 사용할 수 있고, 상기 분말 1g당 물 10ml 내지 30ml, 물 10ml 내지 25ml, 물 10ml 내지 20ml, 물 10ml 내지 15ml, 물 15ml 내지 30ml, 물 15ml 내지 25ml, 물 15ml 내지 20ml, 물 20ml 내지 30ml 또는 물 20ml 내지 25ml를 혼합하여 발효 원료로 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 착즙액 건조 분말은 물과 25℃ 내지 30℃의 온도에서 혼합할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 볼텍스 또는 교반기 등을 이용해 혼합할 수 있다.The juice dried powder provided herein can be mixed with water and used as a fermentation raw material, and per gram of the powder, 10 ml to 30 ml of water, 10 ml to 25 ml of water, 10 ml to 20 ml of water, 10 ml to 15 ml of water, 15 ml to 30 ml of water, 15ml to 25ml of water, 15ml to 20ml of water, 20ml to 30ml of water, or 20ml to 25ml of water can be mixed and used as a fermentation raw material, but is not limited thereto. The juice dried powder can be mixed with water at a temperature of 25°C to 30°C, but is not limited thereto. Additionally, mixing can be done using a vortex or stirrer.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물 및 상기 식물의 용액 및/또는 시금치 착즙액 및/또는 브로콜리 착즙액의 발효물은, 상기 식물의 건조 분말 또는 상기 식물의 생체 착즙액을 발효 원료로 하여 제조되는 것일 수 있고, 비타민 K1 성분을 포함하는 식물 또는 그들의 혼합물일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. The plants containing spinach and/or broccoli and the fermented product of the solution of the plant and/or the spinach juice and/or the broccoli juice provided herein are fermented dried powder of the plant or the living juice of the plant. It may be manufactured from raw materials, may be a plant containing vitamin K1, or a mixture thereof, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 식품 조성물은 건강기능식품로 제공될 수 있고, 예를 들어, 프리바이오틱스, 포스트바이오틱스 또는 신바이오틱스로 제공될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신바이오틱스는 프로바이오틱스 (probiotics) 및 프리바이오틱스 (prebiotics)를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 프로바이오틱스는 유산균 속 균주의 균체를 포함하는 것일 수 있다.The food composition provided herein may be provided as a health functional food, for example, as prebiotics, postbiotics, or synbiotics, but is not limited thereto. The synbiotics may include probiotics and prebiotics, and the probiotics may include cells of the genus Lactobacillus.
일 예는 상기 식품 조성물은 시금치 및/또는 브로콜리 등을 포함하는 식물인 프리바이오틱스, 유산균 속 균주의 균체를 포함하는 프로바이오틱스, 이 둘을 포함하는 신바이오틱스 상태로 제공될 수 있고, 상기 신바이오틱스를 섭취하여 대사체인 비타민 K2를 포함하는 포스트바이오틱스를 섭취할 수 있다.For example, the food composition may be provided in the form of prebiotics, which are plants containing spinach and/or broccoli, probiotics, which are plants containing strains of the genus Lactobacillus, and synbiotics, which include both. You can consume postbiotics, including the metabolite vitamin K2, by consuming Tix.
일 예는 상기 식품 조성물에 포함되는 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물 및/또는 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 및/또는 착즙액의 건조 분말의 유산균 발효물의 제조 공정 중 발효 전 멸균 및/또는 살균 단계를 거치지 않는 경우, 유산균이 포함된 엑기스 및/또는 쥬스로 제공될 수 있다.One example is sterilization before fermentation during the production process of lactic acid bacteria fermented products of plants containing spinach and/or broccoli included in the food composition and/or juice of the plants and/or dried powder of the plants and/or juice. /Or, if it does not undergo a sterilization step, it can be provided as an extract and/or juice containing lactic acid bacteria.
다른 예는 상기 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물 및/또는 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 및/또는 착즙액의 건조 분말의 유산균 발효물의 제조 공정 중 멸균 단계를 수행하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물은 유산균이 포함되지 않는 엑기스 및/또는 쥬스로 제공될 수 있다. Another example is when a sterilization step is performed during the production process of a lactic acid bacteria fermentation product of a plant containing the spinach and/or broccoli and/or juice of the plant and/or dry powder of the plant and/or juice, the health The nutraceutical composition may be provided as an extract and/or juice that does not contain lactic acid bacteria.
상기 유산균이 포함된 엑기스 및/또는 쥬스는 유산균으로 인해 유통기한이 짧아 질 수 있으나 프로바이오틱스 (유산균), 프리바이오틱스 (시금치, 브로콜리, 및/또는 그 혼합물) 및 대사산물 (비타민 K1, 비타민 K2)과 함께 섭취 할 수 있어 포스트바이오틱스일 수 있다.Extracts and/or juices containing the above lactic acid bacteria may have a shorter shelf life due to the presence of lactic acid bacteria, but they contain probiotics (lactic acid bacteria), prebiotics (spinach, broccoli, and/or mixtures thereof) and metabolites (vitamin K1, vitamin K2). It may be a postbiotic because it can be consumed together with .
상기 멸균 단계는 본 발명이 제공하는 식품 조성물의 식미 특성을 유지하고, 유효 성분이 물리적 및/또는 화학적으로 손상되지 않는 범위에서 식품에 사용하기 위한 멸균 방법을 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들어, 저온 장시간 살균(low temperature long time, LTLT), 고온 단시간 살균 (high temperature short time, HTST) 방법이 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 고온 단시간 살균의 경우는 90 ℃에서 20분 이상, 100 ℃에서 20분 이상, 121 ℃에서 20분 이상일 경우 비타민 K1과 비타민 K2의 소실이 생길 수 있다. The sterilization step maintains the taste characteristics of the food composition provided by the present invention, and sterilization methods for use in food can be used without limitation as long as the active ingredients are not physically and/or chemically damaged, for example, Low temperature long time (LTLT) and high temperature short time (HTST) methods may be used, but are not limited thereto. In the case of high temperature and short-term sterilization, loss of vitamin K1 and vitamin K2 may occur if sterilization is performed at 90°C for more than 20 minutes, at 100°C for more than 20 minutes, or at 121°C for more than 20 minutes.
다른 예는,Another example is,
시금치 및 브로콜리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물; 상기 식물의 착즙액; 및 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 발효 원료를 유산균 발효하는 단계를 포함하는, 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효뮬의 제조방법을 제공한다.One or more plants selected from the group consisting of spinach and broccoli; Squeezed juice of the plant; And it provides a method for producing a lactic acid bacteria fermented mule containing vitamin K2, comprising the step of fermenting a fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of the plant or juice with lactic acid bacteria.
상기 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법에서 유산균을 접종하여 배양하는 단계 전, 상기 식물, 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 발효 원료를 멸균 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.Before the step of inoculating and culturing lactic acid bacteria in the method for producing a fermented lactic acid bacteria product containing vitamin K2, fermentation comprising at least one selected from the group consisting of the plant, the juice of the plant, and/or dried powder of the plant or juice. An additional step of sterilizing the raw materials may be included.
본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 시금치 및/또는 브로콜리 발효 원료는 상기 착즙액 상태 그대로를 사용할 수도 있다. 또는 생채 착즙액 그대로를 사용할 수 있다. 이외에서 양배추, 상추, 파슬리, 부추, 케일, 순무, 오이, 냉이, 녹차, 클로렐라, 대파 등의 식물들이 이용 될 수 있다.The spinach and/or broccoli fermentation raw material prepared by the above production method of the present invention may be used in its juice form. Alternatively, you can use the raw vegetable juice as is. In addition, plants such as cabbage, lettuce, parsley, chives, kale, turnip, cucumber, shepherd's purse, green tea, chlorella, and green onions can be used.
상기 멸균 전처리는 50℃ 내지 150℃, 50℃ 내지 125℃, 50℃ 내지 110℃, 50℃ 내지 105℃, 50℃ 내지 95℃, 50℃ 내지 85℃, 60℃ 내지 150℃, 60℃ 내지 125℃, 60℃ 내지 110℃, 60℃ 내지 105℃, 60℃ 내지 95℃, 60℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 150℃, 70℃ 내지 125℃, 70℃ 내지 110℃, 70℃ 내지 105℃, 70℃ 내지 95℃, 70℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 150℃, 75℃ 내지 125℃, 75℃ 내지 110℃, 75℃ 내지 105℃, 75℃ 내지 95℃ 또는 75℃ 내지 85℃의 온도에서 진행할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 멸균 전처리 시간은 1분 내지 30분, 1분 내지 25분, 1분 내지 15분, 1분 내지 5분, 3분 내지 30분, 3분 내지 25분, 3분 내지 15분 또는 3분 내지 5분일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The sterilization pretreatment is 50°C to 150°C, 50°C to 125°C, 50°C to 110°C, 50°C to 105°C, 50°C to 95°C, 50°C to 85°C, 60°C to 150°C, 60°C to 125°C. ℃, 60 ℃ to 110 ℃, 60 ℃ to 105 ℃, 60 ℃ to 95 ℃, 60 ℃ to 85 ℃, 70 ℃ to 150 ℃, 70 ℃ to 125 ℃, 70 ℃ to 110 ℃, 70 ℃ to 105 ℃, At a temperature of 70°C to 95°C, 70°C to 85°C, 75°C to 150°C, 75°C to 125°C, 75°C to 110°C, 75°C to 105°C, 75°C to 95°C or 75°C to 85°C. You can proceed, but you are not limited to this. The sterilization pretreatment time is 1 minute to 30 minutes, 1 minute to 25 minutes, 1 minute to 15 minutes, 1 minute to 5 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 25 minutes, 3 minutes to 15 minutes, or 3 minutes to 5 minutes. It may be one minute, but is not limited thereto.
상기 유산균 배양 시간은 12시간 내지 96시간, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 60시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간, 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 36시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 60시간, 36시간 내지 48시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 72시간 또는 48시간 내지 60시간일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유산균 배양 온도는 20℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 35℃, 20℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 27℃, 23℃ 내지 40℃, 23℃ 내지 35℃, 23℃ 내지 30℃, 23℃ 내지 27℃, 25℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 35℃, 25℃ 내지 30℃ 또는 25℃ 내지 27℃일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The lactic acid bacteria culture time is 12 hours to 96 hours, 12 hours to 72 hours, 12 hours to 60 hours, 12 hours to 48 hours, 12 hours to 36 hours, 12 hours to 24 hours, 24 hours to 96 hours, 24 hours to 24 hours. 72 hours, 24 hours to 60 hours, 24 hours to 48 hours, 24 hours to 36 hours, 36 hours to 96 hours, 36 hours to 72 hours, 36 hours to 60 hours, 36 hours to 48 hours, 48 hours to 96 hours , may be 48 hours to 72 hours or 48 hours to 60 hours, but is not limited thereto. The lactic acid bacteria culture temperature is 20 ℃ to 40 ℃, 20 ℃ to 35 ℃, 20 ℃ to 30 ℃, 20 ℃ to 27 ℃, 23 ℃ to 40 ℃, 23 ℃ to 35 ℃, 23 ℃ to 30 ℃, 23 ℃ to It may be 27°C, 25°C to 40°C, 25°C to 35°C, 25°C to 30°C, or 25°C to 27°C, but is not limited thereto.
상기 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법에 있어서, 발효를 위한 유산균의 배양 온도가 상기 상한선 이상 또는 하한선 이하인 경우, 비타민 K2의 생산 수율이 감소하거나, 유산균 증식률이 낮거나 증식하지 않거나, 및/또는 유해 미생물이 증식할 위험이 있으므로, 배양 온도는 상기 범위로 할 수 있다. In the method for producing a fermented lactic acid bacteria product containing vitamin K2, when the culture temperature of lactic acid bacteria for fermentation is above the upper limit or below the lower limit, the production yield of vitamin K2 is reduced, the growth rate of lactic acid bacteria is low or does not grow, and/ Alternatively, because there is a risk of harmful microorganisms proliferating, the culture temperature may be within the above range.
상기 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법에 있어서, 유산균 배양에 사용되는 유산균은 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바시러러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 락토바실러스 덱스트린쿠스 (Lactobacillus dextrinicus), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 웨이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 웨이셀라 파라메센테로이드 (Weissella paramesenteroides), 페디오코쿠스 에시디락틱시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the method for producing a fermented lactic acid bacteria product containing vitamin K2, the lactic acid bacteria used for culturing lactic acid bacteria are Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactics, and Leuconostoc mesenteroides. , Lactobacillus sakei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus graminis, Lactobacillus Lactobacillus dextrinicus, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Leuconostoc citreum, Weissella helenica (Weissella hellenica), Weissella paramesenteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Bifidobacterium animalis and It may be one or more species selected from the group consisting of Bifidobacterium infantis, but is not limited thereto.
상기 비타민 K2를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법에 있어서, 유산균 배양에서 유산균은 수탁번호 KCCM 12299P를 갖는 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 수탁번호 KCCM 12759P를 갖는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics) 및 수탁번호 KCCM 12756P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유산균일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the method for producing a fermented lactic acid bacteria product containing vitamin K2, the lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria culture are Lactobacillus plantarum with accession number KCCM 12299P, Lactococcus lactics with accession number KCCM 12759P, and It may be one or more types of lactic acid bacteria selected from the group consisting of Leuconostoc mesenteroides with accession number KCCM 12756P, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리의 착즙액 또는 상기 착즙액의 동결 건조 분말을 포함하는 발효 원료 제조를 위한 유산균의 접종량은, 1x108 내지 1x1015 cfu/ml, 1x108 내지 1x1012 cfu/ml, 또는 1x108 내지 1x1010 cfu/ml 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발효 조건에 따라 적절히 변형하여 사용될 수 있고, 상기 유산균은, 유산균 발효를 위해 적절한 형태, 예를 들어, 정제된 유산균 또는 배양물로 첨가될 수 있다.The inoculum amount of lactic acid bacteria for producing fermentation raw materials including the juice of spinach and/or broccoli or freeze-dried powder of the juice provided herein is 1x10 8 to 1x10 15 cfu/ml, 1x10 8 to 1x10 12 cfu/ml. ml, or 1x10 8 to 1x10 10 cfu/ml, but is not limited thereto, and may be appropriately modified and used depending on fermentation conditions, and the lactic acid bacteria are in a form suitable for lactic acid fermentation, for example, purified lactic acid bacteria or Can be added to culture.
다른 예는, KCCM 12759P를 갖는, Lactococcus lactis 유산균 및 KCCM 12756P를 갖는, Leuconostoc mesenteroides 유산균을 제공한다.Other examples provide Lactococcus lactis, with KCCM 12759P, and Leuconostoc mesenteroides, with KCCM 12756P.
다른 예는, 상기 식물 착즙액 및/또는 상기 착즙액의 건조 분말 및 물을 혼합한 액상 시료의 유산균 발효 전 멸균, 살균등을 포함하는 멸균 전치리의 온도 및 시간에 따라 비타민 K1의 안정적 유지방법을 제공한다.Another example is a method of stably maintaining vitamin K1 according to the temperature and time of pre-sterilization, including sterilization, sterilization, etc. before lactic acid bacteria fermentation of the plant juice and/or a liquid sample mixed with dry powder of the juice and water. provides.
상기 비타민 K1의 안정적 유지를 위한 멸균 전처리는 50℃ 내지 150℃, 50℃ 내지 125℃, 50℃ 내지 110℃, 50℃ 내지 105℃, 50℃ 내지 95℃, 50℃ 내지 85℃, 60℃ 내지 150℃, 60℃ 내지 125℃, 60℃ 내지 110℃, 60℃ 내지 105℃, 60℃ 내지 95℃, 60℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 150℃, 70℃ 내지 125℃, 70℃ 내지 110℃, 70℃ 내지 105℃, 70℃ 내지 95℃, 70℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 150℃, 75℃ 내지 125℃, 75℃ 내지 110℃, 75℃ 내지 105℃, 75℃ 내지 95℃ 또는 75℃ 내지 85℃의 온도에서 진행할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 멸균 전처리 시간은 1분 내지 30분, 1분 내지 25분, 1분 내지 15분, 1분 내지 5분, 3분 내지 30분, 3분 내지 25분, 3분 내지 15분 또는 3분 내지 5분일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.Sterilization pretreatment for stable maintenance of vitamin K1 is 50°C to 150°C, 50°C to 125°C, 50°C to 110°C, 50°C to 105°C, 50°C to 95°C, 50°C to 85°C, 60°C to 150°C, 60°C to 125°C, 60°C to 110°C, 60°C to 105°C, 60°C to 95°C, 60°C to 85°C, 70°C to 150°C, 70°C to 125°C, 70°C to 110°C , 70°C to 105°C, 70°C to 95°C, 70°C to 85°C, 75°C to 150°C, 75°C to 125°C, 75°C to 110°C, 75°C to 105°C, 75°C to 95°C or 75°C. It can be carried out at a temperature of ℃ to 85℃, but is not limited thereto. The sterilization pretreatment time is 1 minute to 30 minutes, 1 minute to 25 minutes, 1 minute to 15 minutes, 1 minute to 5 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 25 minutes, 3 minutes to 15 minutes, or 3 minutes to 5 minutes. It may be one minute, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 착즙액 건조 분말은 동결건조, 마이크로웨이브 또는 열풍건조의 방법으로 제조되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The juice dried powder provided herein may be manufactured by freeze-drying, microwave or hot air drying, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리는 흐르는 물에 수세, 물기 제거 후 분쇄형 스큐류 착즙기를 이용해 착즙하여 착즙액을 제조하여 바로 발효에 사용하거나 착즙액을 동결건조 또는 열풍건조의 방법으로 착즙액 건조 분말상태로 4℃ 이하에서 2 ~ 6개월 저장하여 사용할 수 있다. The spinach and/or broccoli provided in this specification are washed in running water, dried, and then squeezed using a crushing screw juicer to prepare the juice and use it immediately for fermentation, or the juice is extracted by freeze-drying or hot air drying. It can be used in liquid-dried powder form by storing it at 4℃ or lower for 2 to 6 months.
상기 유산균 발효물 제조를 위한, 식물 용액은, 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물이며 또는 이들의 혼합물, 이의 건조물 또는 분쇄물을 물에 용해하여 제조된 것이다. 상기 용해액의 제조에 사용되는 식물은, 각 식물을 열풍건조, 마이크로웨이브, 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄기로 분말화한 분말일 수 있다. 이때 분말의 입자 크기에 대한 제한은 없으며, 일반 분쇄기 또는 식품용 믹서기로 1분간 강한 열이 발생하지 않도록 처리하여 제조한 분말일 수 있다. 상기 시금치 및/또는 브로콜리를 동결한 후, 물과 함께 파쇄한 분말을 사용할 수 있다. 상기 제조한 분말을 물과 혼합하여 바로 사용할 수도 있고, -20℃ 내지 -70℃ 조건에서 6개월 내지 1년간 보관하여 그 이후에 분말을 사용할 수 있다. 또는, 상기 채소를 건조하지 않고 -70℃ 에서 냉동 보관한 후, 물을 넣고 분쇄한 생체를 사용할 수도 있다.For producing the lactic acid bacteria fermentation product, the plant solution is a plant containing spinach and/or broccoli, or a mixture thereof, or a dried product or pulverized product thereof, prepared by dissolving it in water. The plants used to prepare the solution may be powder obtained by drying each plant using methods such as hot air drying, microwave, freeze drying, etc. and then pulverizing it with a grinder. At this time, there is no limitation on the particle size of the powder, and the powder may be manufactured by processing with a general grinder or food blender for 1 minute without generating strong heat. After freezing the spinach and/or broccoli, the powder can be used by crushing it with water. The prepared powder can be mixed with water and used immediately, or the powder can be stored at -20°C to -70°C for 6 months to 1 year and used thereafter. Alternatively, the vegetables may be frozen and stored at -70°C without drying, then added with water and pulverized.
상기 유산균들은 한국생명공학연구원의 생물자원센터 또는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양 받아 이용할 수 있다. 일 구체예에서, 락토코쿠스 락틱스 (Lactococcus lactis) (KCCM 12759P), 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum) (KCCM 12299P), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCCM 12756P)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균 균주를 사용할 수 있다.The above lactic acid bacteria can be purchased and used from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology's Biological Resources Center or the American Type Culture Collection (ATCC). In one embodiment, from the group consisting of Lactococcus lactis (KCCM 12759P), Lactobacillus plantarum (KCCM 12299P), and Leuconostoc mesenteroides (KCCM 12756P) One or more selected lactic acid bacteria strains may be used.
상기 락토코쿠스 락틱스 균주는, 서열번호 3의 염기서열과 99% 이상, 99.5%이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성 (sequence identity)을 가지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 2020년 7월 03일자로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM 12759P 균주일 수 있다.The Lactococcus lactics strain may be a strain containing a 16S rRNA gene having a sequence identity of more than 99%, more than 99.5%, or more than 99.9% with the base sequence of SEQ ID NO: 3, 7, 2020 It may be a strain with accession number KCCM 12759P deposited at the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) as of March 03.
상기 락토바실러스 플란터룸 균주는, 서열번호 4의 염기서열과 99% 이상, 99.5%이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성 (sequence identity)을 가지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12299P 균주일 수 있다.The Lactobacillus planterum strain may be a strain containing a 16S rRNA gene having a sequence identity of more than 99%, more than 99.5%, or more than 99.9% with the base sequence of SEQ ID NO: 4, as of August 2018 It may be a strain with accession number KCCM12299P deposited at the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) on the 10th.
상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주는, 서열번호 5의 염기서열과 99% 이상, 99.5%이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성(sequence identity)을 가지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 2020년 07월 03일자로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12756P 균주일 수 있다.The Leuconostoc mesenteroides strain may be a strain containing a 16S rRNA gene having a sequence identity of more than 99%, more than 99.5%, or more than 99.9% with the base sequence of SEQ ID NO: 5, and in 2020 It may be a strain with accession number KCCM12756P deposited at the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) on July 3.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리 착즙액 또는 상기 착즙액의 건조 분말 및/또는 이들의 혼합물을 물과 혼합하여 제조한 액상 시료를 멸균 또는 살균 등 후처리 공정을 처리하여 유산균 발효 원료로 사용될 수 있다.The liquid sample prepared by mixing the spinach and/or broccoli juice provided herein or the dried powder of the juice and/or a mixture thereof with water can be used as a raw material for lactic acid bacteria fermentation by subjecting it to a post-treatment process such as sterilization or sterilization. You can.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말은 50℃ 내지 150℃, 50℃ 내지 125℃, 50℃ 내지 110℃, 50℃ 내지 105℃, 50℃ 내지 95℃, 50℃ 내지 85℃, 60℃ 내지 150℃, 60℃ 내지 125℃, 60℃ 내지 110℃, 60℃ 내지 105℃, 60℃ 내지 95℃, 60℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 150℃, 70℃ 내지 125℃, 70℃ 내지 110℃, 70℃ 내지 105℃, 70℃ 내지 95℃, 70℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 150℃, 75℃ 내지 125℃, 75℃ 내지 110℃, 75℃ 내지 105℃, 75℃ 내지 95℃ 또는 75℃ 내지 85℃의 온도에서 멸균 또는 살균하여 기타 미생물을 제거할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. The plants including spinach and/or broccoli provided herein, the juice of the plant, and/or the dry powder of the plant or juice are stored at a temperature of 50°C to 150°C, 50°C to 125°C, 50°C to 110°C, 50℃ to 105℃, 50℃ to 95℃, 50℃ to 85℃, 60℃ to 150℃, 60℃ to 125℃, 60℃ to 110℃, 60℃ to 105℃, 60℃ to 95℃, 60℃ to 85°C, 70°C to 150°C, 70°C to 125°C, 70°C to 110°C, 70°C to 105°C, 70°C to 95°C, 70°C to 85°C, 75°C to 150°C, 75°C to 125°C Other microorganisms can be removed by sterilizing or sterilizing at a temperature of ℃, 75℃ to 110℃, 75℃ to 105℃, 75℃ to 95℃ or 75℃ to 85℃, but are not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말의 유산균 발효물은 비타민 K1 (phylloquinone)과 비타민 K2 (menaquinone)을 포함한다. 상기 비타민 K1 (phylloquinone)은 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 물과 혼합하여 제조한 액상 시료에 포함되어 있고, 비타민 K2 (menaquinone)는 유산균 발효에 의한 바이오컨버젼으로 인해 합성된 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. Plants including spinach and/or broccoli provided herein, the juice of the plant, and/or the lactic acid bacteria fermentation product of the dried powder of the plant or juice include vitamin K1 (phylloquinone) and vitamin K2 (menaquinone). . The vitamin K1 (phylloquinone) is contained in a liquid sample prepared by mixing a plant containing spinach and/or broccoli, the juice of the plant, and/or the dry powder of the plant or the juice, and vitamin K2 ( menaquinone) may be synthesized through bioconversion by lactic acid bacteria fermentation, but is not limited thereto.
일 실시예에서, 유산균 첨가 과정을 거치지 않은 식물인 시금치, 양배추의 브로콜리 착즙액에 대한 비타민 K1 함량을 TLC와 HPLC로 확인 한 결과 시금치에서 가장 많은 비타민 K1이 정성적, 정량적으로 확인하였다.In one example, the vitamin K1 content of spinach and broccoli juice from cabbage, which were plants that did not undergo the process of adding lactic acid bacteria, was confirmed by TLC and HPLC, and it was confirmed qualitatively and quantitatively that spinach contained the most vitamin K1.
일 실시예에서, 유산균을 이용한 식물인 시금치, 양배추의 브로콜리 착즙액발효물에 대한 비타민 K1과 비타민 K2 함량을 TLC와 HPLC로 비교한 결과, 유산균을 첨가하여 발효 숙성을 거친 시료에서 비타민 K2의 함량이 증가하였음을 정성적, 정량적으로 확인하였다.In one example, the vitamin K1 and vitamin K2 contents of the fermented juice of spinach and broccoli cabbage, which are plants using lactic acid bacteria, were compared by TLC and HPLC. As a result, the content of vitamin K2 in the sample that underwent fermentation and maturation with the addition of lactic acid bacteria was found. This increase was confirmed qualitatively and quantitatively.
일 실시예에서, 마우스 대식세포에 비타민 K1을 처리하는 경우 일산화탄소 (NO)의 생성 농도가 1.2배 내지 10배, 1.2배 내지 9배, 1.2배 내지 0.85배, 1.23배 내지 10배, 1.23배 내지 9배, 1.23배 내지 0.85배, 1.25배 내지 10배, 1.25배 내지 9배 또는 1.25배 내지 0.85배 감소할 수 있다.In one embodiment, when mouse macrophages are treated with vitamin K1, the production concentration of carbon monoxide (NO) is 1.2-fold to 10-fold, 1.2-fold to 9-fold, 1.2-fold to 0.85-fold, 1.23-fold to 10-fold, and 1.23-fold to It may be reduced by 9 times, 1.23 times to 0.85 times, 1.25 times to 10 times, 1.25 times to 9 times, or 1.25 times to 0.85 times.
일 실시예에서, 마우스 대식세포에 비타민 K2를 처리하는 경우 NO의 생성 농도가 1.3배 내지 8배, 1.3배 내지 7배, 1.3배 내지 6배, 1.35배 내지 8배, 1.35배 내지 7배, 1.35배 내지 6배, 1.38배 내지 8배, 1.38배 내지 7배 또는 1.38배 내지 6배 감소할 수 있다.In one embodiment, when mouse macrophages are treated with vitamin K2, the production concentration of NO is 1.3 to 8 times, 1.3 to 7 times, 1.3 to 6 times, 1.35 to 8 times, 1.35 to 7 times, It may be reduced by 1.35 times to 6 times, 1.38 times to 8 times, 1.38 times to 7 times, or 1.38 times to 6 times.
일 실시예에서, 마우스 대식세포에 상기 시금치 발효 시료에 L. lactis 유산균으로 발효한 발효액을 처리하는 경우 NO의 생성 농도가 1.2배 내지 1.7배, 1.2배 내지 1.65배, 1.2배 내지 1.62배, 1.21배 내지 1.7배, 1.21배 내지 1.65배, 1.21배 내지 1.62배, 1.22배 내지 1.7배, 1.22배 내지 1.65배 또는 1.22배 내지 1.62배 감소할 수 있다.In one embodiment, when mouse macrophages are treated with a fermentation broth obtained by fermenting the spinach fermentation sample with L. lactis lactic acid bacteria, the production concentration of NO is 1.2 to 1.7 times, 1.2 to 1.65 times, 1.2 to 1.62 times, and 1.21 times. It may be reduced by 1 to 1.7 times, 1.21 to 1.65 times, 1.21 to 1.62 times, 1.22 to 1.7 times, 1.22 to 1.65 times, or 1.22 to 1.62 times.
일 실시예에서, 마우스 대식세포에 상기 시금치 발효 시료에 L. lactis 유산균으로 발효한 발효액을 처리하는 경우 IL-6 (interleukin-6)의 분비량이 1.1배 내지 1.5배, 1.1배 내지 1.3배, 1.1배 내지 1.2배, 1.11배 내지 1.5배, 1.11배 내지 1.3배, 1.11배 내지 1.2배, 1.12배 내지 1.5배, 1.12배 내지 1.3배 또는 1.1배 내지 1.2배 감소할 수 있다.In one embodiment, when mouse macrophages are treated with a fermentation broth obtained by fermenting the spinach fermentation sample with L. lactis lactic acid bacteria, the secretion amount of IL-6 (interleukin-6) is 1.1 to 1.5 times, 1.1 to 1.3 times, and 1.1 times. It may be reduced by 1 to 1.2 times, 1.11 to 1.5 times, 1.11 to 1.3 times, 1.11 to 1.2 times, 1.12 to 1.5 times, 1.12 to 1.3 times, or 1.1 to 1.2 times.
본 명세서에서 제공하는 시금치, 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말의 유산균 발효물을 포함하는 건강기능식품 조성물은, 식품, 사료, 식품 첨가물, 및/또는 사료 첨가물로 활용되기 적절한 염도, 당도 및 pH를 가져 식품으로서의 활용도가 우수하다.The health functional food composition containing plants including spinach and/or broccoli, the juice of the plants, and/or the lactic acid bacteria fermentation product of the dried powder of the plants or juices provided herein is food, feed, food, etc. It has excellent usability as a food as it has appropriate salinity, sugar content, and pH to be used as an additive and/or feed additive.
본 명세서는 시금치, 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 비타민 K2의 제조 방법, 및 상기 방법으로 얻어진 비타민 K1과 비타민 K2 혼합 조성물을 제공한다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 배양물로부터 비타민 K2를 통상의 방법으로 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The present specification provides vitamin K2, comprising the step of inoculating and culturing lactic acid bacteria on a plant containing spinach and/or broccoli, a juice of the plant, and/or a fermentation raw material containing dry powder of the plant or juice. A manufacturing method and a mixed composition of vitamin K1 and vitamin K2 obtained by the method are provided. The method may further include the step of isolating and/or purifying vitamin K2 from the culture by a conventional method after the culturing step.
본 명세서에서 비타민 K1을 포함하는 시금치, 브로콜리, 양배추, 미나리, 배추, 부추, 비름, 상추, 양상추, 순무잎, 쑥, 쑥갓, 아스파라거스, 물냉이, 오크라, 유채, 케일, 파슬리, 파, 피망, 고추, 호박잎, 갓, 고사리, 고비, 고수, 공심채, 근대, 키위, 청포도, 감, 아로니아, 산수유, 구기자, 포도, 귤, 사과, 피스타치오, 피칸, 호두, 호박씨, 해바라기 씨로 이루어진 군에서 1 이상의 식물, 예컨대, 시금치 및/또는 브로콜리를 포함하는 식물, 상기 식물의 착즙액, 및/또는 상기 식물 또는 착즙액의 건조 분말을 포함하는 발효 원료를유산균 발효하여 비타민 K2를 제조할 수 있다.In the present specification, spinach, broccoli, cabbage, water parsley, Chinese cabbage, chives, amaranth, lettuce, lettuce, turnip greens, mugwort, mugwort, asparagus, watercress, okra, rapeseed, kale, parsley, green onion, green pepper, 1 from the group consisting of peppers, pumpkin leaves, mustard leaves, ferns, ferns, coriander, Gongsimchae, Swiss chard, kiwi, green grapes, persimmons, aronia, Cornus officinalis, goji berries, grapes, tangerines, apples, pistachios, pecans, walnuts, pumpkin seeds, and sunflower seeds. Vitamin K2 can be produced by lactic acid bacteria fermentation of fermentation raw materials including plants including the above plants, such as spinach and/or broccoli, juice of the plants, and/or dry powder of the plants or juice.
상기 유산균은 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바시러러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 락토바실러스 덱스트린쿠스 (Lactobacillus dextrinicus), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 웨이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 웨이셀라 파라메센테로이드 (Weissella paramesenteroides), 페디오코쿠스 에시디락틱시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The lactic acid bacteria include Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactics, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sakei, and Lactobacillus fermentum. , Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus graminis, Lactobacillus dextrinicus, Lactococcus garvieae, Entero Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Leuconostoc citreum, Weissella hellenica, Weissella paramesenteroides, Pediococcus One or more species selected from the group consisting of Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium infantis It can be done, but is not limited to this.
상기 유산균은 수탁번호 KCCM 12299P를 갖는 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus plantarum), 수탁번호 KCCM 12759P를 갖는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics) 및 수탁번호 KCCM 12756P를 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유산균일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The lactic acid bacteria include Lactobacillus plantarum with accession number KCCM 12299P, Lactococcus lactics with accession number KCCM 12759P, and Leuconostoc mesenteroides with accession number KCCM 12756P. It may be one or more types of lactic acid bacteria selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 명세서에서 제공하는 비타민 K2 제조 방법은, 비타민 K1 를 함유하는 시금치, 브로콜리, 등의 활용도가 높은 식물의 유산균 발효로부터 비타민 K1과 비타민 K2를 얻을 수 있어, 의약, 식품, 건강기능식품, 및/또는 식품 조성물로서의 활용도가 높다. 상기 비타민 K1과 비타민 K2 혼합 조성물은 염증을 완화할 수 있어, 염증 예방, 치료 또는 개선용으로 활용할 수 있다.The method for producing vitamin K2 provided in this specification can obtain vitamin K1 and vitamin K2 from lactic acid bacteria fermentation of plants with high utilization, such as spinach and broccoli, which contain vitamin K1, and can be used in medicine, food, health functional food, and/or Alternatively, it has high utility as a food composition. The mixed composition of vitamin K1 and vitamin K2 can relieve inflammation and can be used to prevent, treat, or improve inflammation.
본 명세서는 비타민 K1을 포함하는 시금치, 및/또는 브로콜리 등의 식물 착즙액 또는 상기 착즙액의 건조 분말을 포함하는 발효 원료의 유산균 발효물을 포함하는 조성물로, 염증 예방, 치료 또는 개선용 약학 또는 식품 조성물을 제공한다.The present specification is a composition containing a lactic acid bacteria fermentation product of a fermentation raw material containing plant juice such as spinach and/or broccoli containing vitamin K1, or dried powder of the juice, and is used as a pharmaceutical or A food composition is provided.
도 1은 시금치, 양배추, 브로콜리 등의 착즙액에서의 3종의 유산균 발효시 각각의 유산균 생균수 (LAB Counts, log cfu/ml)를 24, 48, 72시간 측정한 결과 그래프이다. MRS는 대조군인 DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) agar 배지, Ll은 L. lactis, Lp는 L. plantarum, Lm은 L. mesenteroides를 의미한다.
도 2는 양배추 (Ca), 시금치 (Sp), 등의 착즙액에서의 L.lactis 유산균 48시간 발효 후 각 식물 발효물에서 비타민 K2 (K2) 생성능과 비타민 K1 (K1)의 유무를 확인한 얇은막 크로마토그래피 (TLC) 결과이다. ProB는 프로바이오틱스 (유산균), PreB는 프리바이오틱스 (착즙액), ND는 L.lactis 발효시키지 않은 착즙액, CaLl, SpLl에서 Ll은 L.lactis 발효시킨 착즙액을 의미한다.
도 3은 양배추, 시금치, 브로콜리 등의 착즙액에서의 L.lactis 유산균 48시간 발효 후 식물 발효물에서 비타민 K1과 비타민 K2의 함량을 분석한 HPLC 결과 그래프이다. LAB는 Lactic Acid Bacteria를 의미하고, L. lactis (Ll), L. plantarum (Lp), 및 L. mesenteroides (Lm) 3종을 포함하는 유산균을 의미한다.
도 4는 시금치 착즙액에서 L. lactis (Ll), L. plantarum (Lp), 및 L. mesenteroides (Lm) 3종의 유산균을 48시간 발효 후, 발효물에서 비타민 K2 생성능과 비타민 K1의 유무를 확인한 얇은막 크로마토그래피 (TLC) 결과이다. ProB는 프로바이오틱스 (유산균), PreB는 프리바이오틱스 (착즙액), No는 시금치 착즙액의 미발효물, Lm은 시금치 착즙액의 L. mesenterodes 발효물, Ll은 L.lactis 발효물, Lp는 L.plantarum 발효물을 의미한다.
도 5는 시금치 착즙액 (Sp)에서 L. lactis (Ll), L. plantarum (Lp), 및 L. mesenteroides (Lm) 3종의 유산균을 48시간 발효 후, 발효물에서 비타민 K1과 비타민 K2의 함량을 분석한 HPLC 결과 그래프이다.
도 6은 시금치 착즙액에서 L.lactis (Ll) 유산균 단일 배양 또는 L. lactis, L. plantarum 또는 L. mesenteroides 2종 공접종 또는 상기의 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 각 24, 48, 72시간 발효 시간에 따른 비타민 K1과 비타민 K2의 함량의 변화를 확인한 TLC 결과이다. S는 시금치 착즙액, M은 MRS 배지, LlLp는 L. lactis 및 L. plantarum, LlLm은 L. lactis 및 L. mesenteroides, LpLm은 L. plantarum 및 L. mesenteroides의 2종 공접종을 의미하고, LlLpLm은 L. lactis, L. plantarum 및 L. mesenteroides의 3종 공접종을 의미한다.
도 7은 시금치 착즙액에서 L.lactis 유산균 단일 배양 또는 L. lactis와 L. plantarum, L. mesenteroides 2종 공접종 또는 상기의 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 각 24, 48, 72시간 발효 시간에 따른 비타민 K1과 비타민 K2의 함량을 분석한 HPLC 결과 그래프이다. LlLp는 L. lactis 및 L. plantarum, LlLm은 L. lactis 및 L. mesenteroides, LpLm은 L. plantarum 및 L. mesenteroides의 2종 공접종을 의미하고, LlLpLm은 L. lactis, L. plantarum 및 L. mesenteroides의 3종 공접종을 의미한다.
도 8은 비타민 K1, 비타민 K2를 포함하는 시금치 착즙액의 L.lactis 발효물의 산 또는 알칼리(pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) 용액 내에서 안정성에 대한 얇은막 크로마토그래피 (TLC) 결과이다. SpLl은 시금치 착즙액에 L. lactis를 48시간동안 배양한 배양물을 의미한다.
도 9는 마우스 대식세포 (Raw 264.7 cell)에 LPS로 염증 유도 후, 표준품 비타민 K1과 비타민 K2 처리에 따른 NO (Nitric oxide) 생성 농도를 측정한 결과이다. NC는 LPS, 비타민을 처리하지 않은 것을, LPS는 비타민 처리를 하지 않은 것을 의미한다.
도 10은 마우스 대식세포 (Raw 264.7 cell) LPS로 염증 유도 후, L.lactis의 시금치 착즙 발효액 (24시간) 처리에 따른 NO(Nitric oxide) 생성 농도를 측정한 결과이다. NC는 LPS, 비타민을 처리하지 않은 것을, LPS는 비타민 처리를 하지 않은 것, Sp/Ll은 시금치 착즙액에 L. lactis를 배양한 것을 의미한다.
도 11은 마우스 대식세포 (Raw 264.7 cell)에 LPS로 염증 유도 후, L.lactis의 시금치 착즙 발효액 (24시간), 대조군으로 표준품 비타민 K1과 비타민 K2 처리에 따른 염증반응에 관여하는 COX-2 발현억제 효능의 Western blot의 결과이다.
도 12은 마우스 대식세포 (Raw 264.7 cell)에 LPS로 염증 유도 후, 시금치 착즙액과 L.lactis의 착즙 발효액 (24시간) 처리에 따른 IL-6(interleukin 6)생성을 ELISA로 분석한 결과이다. NC는 LPS, 시료 등을 아무 처리도 하지 않은 것을 의미하고, LPS는 착즙액 및 착즙 발효액을 처리하지 않고 LPS 처리만 한 것을 의미하고, Sp/Ll은 L. lactis를 처리한 시금치 착즙액을 의미한다.Figure 1 is a graph showing the results of measuring the number of viable lactic acid bacteria (LAB Counts, log cfu/ml) for 24, 48, and 72 hours during the fermentation of three types of lactic acid bacteria in the juice of spinach, cabbage, and broccoli. MRS refers to the control DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) agar medium, Ll refers to L. lactis , Lp refers to L. plantarum , and Lm refers to L. mesenteroides .
Figure 2 is a thin film confirming the production ability of vitamin K2 (K2) and the presence or absence of vitamin K1 (K1) in each plant fermentation product after 48 hours of fermentation of L. lactis lactic acid bacteria in the juice of cabbage (Ca), spinach (Sp), etc. This is the result of chromatography (TLC). ProB is probiotic (lactic acid bacteria), PreB is Prebiotics (squeezed juice), ND refers to the unfermented L. lactis juice, and in CaLl and SpLl, Ll refers to the L. lactis fermented juice.
Figure 3 is a graph of HPLC results analyzing the contents of vitamin K1 and vitamin K2 in plant fermentation after 48 hours of fermentation of L. lactis lactic acid bacteria in the juice of cabbage, spinach, broccoli, etc. LAB stands for Lactic Acid Bacteria, which includes three species: L. lactis ( Ll), L. plantarum (Lp), and L. mesenteroides (Lm).
Figure 4 shows the vitamin K2 production ability and the presence or absence of vitamin K1 in the fermented product after fermenting three types of lactic acid bacteria , L. lactis ( Ll), L. plantarum (Lp), and L. mesenteroides (Lm), in spinach juice for 48 hours. This is the confirmed thin layer chromatography (TLC) result. ProB is probiotic (lactic acid bacteria), PreB is Prebiotics (squeezed juice), No refers to the unfermented product of spinach juice, Lm refers to the L. mesenterodes fermented product of spinach juice, Ll refers to the L. lactis fermented product, and Lp refers to the L. plantarum fermented product.
Figure 5 shows the content of vitamin K1 and vitamin K2 in the fermented product after fermenting three types of lactic acid bacteria, L. lactis (Ll), L. plantarum (Lp), and L. mesenteroides (Lm), in spinach juice (Sp) for 48 hours. This is a graph of the HPLC results analyzing the content.
Figure 6 shows a single culture of L. lactis (Ll) lactic acid bacteria in spinach juice, or co-inoculation of two types of L. lactis , L. plantarum , or L. mesenteroides , or co-inoculation of the three types of lactic acid bacteria above, respectively 24, 48, This is the TLC result confirming the change in the content of vitamin K1 and vitamin K2 according to the 72-hour fermentation time. S is spinach juice, M is MRS medium, LlLp means L. lactis and L. plantarum , LlLm means L. lactis and L. mesenteroides , LpLm means two types of co-inoculation: L. plantarum and L. mesenteroides , LlLpLm refers to three types of inoculation: L. lactis , L. plantarum , and L. mesenteroides .
Figure 7 shows fermentation for 24, 48, and 72 hours, respectively, prepared by single culture of L. lactis lactic acid bacteria in spinach juice, co-inoculation of two types of L. lactis , L. plantarum , and L. mesenteroides , or co-inoculation of the three types of lactic acid bacteria above. This is a graph of HPLC results analyzing the content of vitamin K1 and vitamin K2 over time. LlLp refers to L. lactis and L. plantarum , LlLm refers to L. lactis and L. mesenteroides , LpLm refers to the two-species co-inoculation of L. plantarum and L. mesenteroides , and LlLpLm refers to L. lactis , L. plantarum and L. It refers to the three types of mesenteroides .
Figure 8 is a thin layer chromatography of the stability of the L. lactis fermentation product of spinach juice containing vitamin K1 and vitamin K2 in acid or alkali (pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) solutions. This is the graph (TLC) result. SpLl refers to a culture of L. lactis grown in spinach juice for 48 hours.
Figure 9 shows the results of measuring NO (Nitric oxide) production concentration according to standard vitamin K1 and vitamin K2 treatment after inducing inflammation in mouse macrophages (Raw 264.7 cells) with LPS. NC means LPS, not treated with vitamins, LPS means not treated with vitamins.
Figure 10 shows the results of measuring NO (Nitric oxide) production concentration according to treatment of L. lactis spinach juice fermentation broth (24 hours) after inducing inflammation with LPS in mouse macrophages (Raw 264.7 cells). NC means LPS, not treated with vitamins, LPS means not treated with vitamins, Sp/Ll means L. lactis cultured in spinach juice.
Figure 11 shows the expression of COX-2, which is involved in the inflammatory response, after inducing inflammation with LPS in mouse macrophages (Raw 264.7 cells), followed by treatment with fermented spinach juice of L. lactis (24 hours) and standard vitamin K1 and vitamin K2 as a control group. This is the result of Western blot of inhibitory efficacy.
Figure 12 shows the results of ELISA analysis of IL-6 (interleukin 6) production following treatment of spinach juice and L. lactis juice and fermentation broth (24 hours) after inducing inflammation in mouse macrophages (Raw 264.7 cells) with LPS. . NC means no treatment of LPS, sample, etc., LPS means only LPS treatment without treatment of juice or juice fermentation, and Sp/Ll means spinach juice treated with L. lactis . do.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and do not limit the scope of the present invention.
실시예 1. 발효 원료의 제조Example 1. Preparation of fermentation raw materials
실시예 1-1. 시금치, 브로콜리, 양배추 착즙액의 제조Example 1-1. Manufacturing of spinach, broccoli, and cabbage juice
시금치, 브로콜리, 양배추를 흐르는 물에 씻어 외부의 먼지를 제거하여 깨끗하게 준비하였다. 상기 준비된 식물을 20 ~ 30분 정도 채반을 이용하여 가볍게 물기를 제거하여 건조하고, 식품용 스큐류 착즙기를 사용해 액상으로 제조하였다. 구체적으로, 식품 스큐류 사용에 의한 식물 내의 수분을 착즙하고 나머지 남는 섬유질 부분은 제거하여, 시금치 착즙액, 브로콜리 착즙액, 및 양배추 착즙액을 제조하였다.Spinach, broccoli, and cabbage were washed in running water to remove external dust and prepared cleanly. The prepared plant was dried by gently removing moisture using a strainer for about 20 to 30 minutes, and then prepared into a liquid form using a food screw juicer. Specifically, spinach juice, broccoli juice, and cabbage juice were prepared by squeezing out moisture from the plant using food skewers and removing the remaining fibrous portion.
실시예 1-2. 시금치, 브로콜리, 양배추 액상 시료의 제조와 비타민 손실 및 외부 미생물 오염 여부 측정Example 1-2. Preparation of spinach, broccoli, and cabbage liquid samples and measurement of vitamin loss and external microbial contamination
상기 제조된 시금치 착즙액, 브로콜리 착즙액, 및 양배추 착즙액은 70℃에서 보관 후 실험에 이용하였다.The prepared spinach juice, broccoli juice, and cabbage juice were stored at 70°C and then used in experiments.
비타민 K1 및 K2의 안정성 확인을 위해 표준품 비타민 K1과 비타민 K2를 80℃, 90℃, 100℃ 또는 121℃의 온도에서 5분, 10분 또는 20분의 시간 동안 두어 비타민 손실 여부를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.To confirm the stability of vitamin K1 and K2, standard vitamin K1 and vitamin K2 were placed at a temperature of 80°C, 90°C, 100°C, or 121°C for 5, 10, or 20 minutes to measure vitamin loss. The results are shown in Table 1 below.
(표 1에서 +는 검출된 것을, -는 검출되지 않은 것을 의미한다)(In Table 1, + means detected, - means not detected)
상기 시금치 착즙액을 멸균 전처리 (autoclave WAC-P47; 121 ℃, 20분)하여 시금치의 액상 시료를 준비하였다. 이와 같이 얻어진 액상 시료를 하기 실시예에서 유산균 발효물 (발효 원료)로 사용하였다.The spinach juice was pre-sterilized (autoclave WAC-P47; 121°C, 20 minutes) to prepare a liquid sample of spinach. The liquid sample obtained in this way was used as a lactic acid bacteria fermentation product (fermentation raw material) in the following examples.
구체적으로, 상기 착즙액에 대하여 80℃, 90℃, 100℃ 또는 121℃의 온도에서 5분, 10분 또는 20분의 시간 동안 멸균 전처리를 진행하였고, 30℃ 온도에서 24시간 또는 48시간동안 처리하였다. 리스테리아 (Listeria), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 (Bacillus), 비브리오 (Vibrio), 슈도모나스 균 (Pseudomonas), 효모 (Yeast), 곰팡이 (Fungi) 등의 외부 미생물이 멸균되어 검출되는지 확인하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 상기 외부 미생물은 60 내지 70℃, 70 내지 80℃, 80 내지 90℃, 90 내지 100℃ 또는 100 내지 121℃에서 5 내지 10분간 멸균 전처리하고, 0.01g/ml가 되도록 물에 희석하여 1% (w/v)의 균질용액 시료를 제조하였다. 상기 시료 1mL를 리스테리아(Environmental Listeria), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus), 효모(yeast) 및 곰팡이(Fungi), 대장균(Escherichia coli, E.coli) 측정용 petrifilmTM (3M, USA)에 접종하고 30℃에서 24시간, 48시간 동안 배양한 후, 형성된 콜로니의 개수를 확인하였다. 전형적인 집락을 보이는 균주는 균주 X 희석배수로 계산하는 방법으로 확인하였다. 대조군으로 멸균 처리 하지 않은 착즙액을 30℃에서 24시간 또는 48시간 처리한 시료를 준비하였다.Specifically, the juice was pre-treated for sterilization at a temperature of 80°C, 90°C, 100°C, or 121°C for 5, 10, or 20 minutes, and treated at a temperature of 30°C for 24 or 48 hours. did. External microorganisms such as Listeria, Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Bacillus, Vibrio , Pseudomonas , yeast, and fungi are sterilized. It was confirmed whether it was detected, and the results are shown in Table 2. The external microorganisms are pretreated for sterilization at 60 to 70°C, 70 to 80°C, 80 to 90°C, 90 to 100°C, or 100 to 121°C for 5 to 10 minutes, and diluted in water to 0.01 g/ml to contain 1% ( w/v) homogeneous solution samples were prepared. 1 mL of the sample was spread on petrifilmTM (3M, USA) for measuring Listeria, Staphylococcus aureus (S. aureus), yeast and fungi, and Escherichia coli (E.coli). After inoculation and culturing at 30°C for 24 and 48 hours, the number of colonies formed was confirmed. Strains showing typical colonies were identified by calculating the strain As a control, samples of unsterilized juice treated at 30°C for 24 or 48 hours were prepared.
(표 2에서 +는 검출된 것을, -는 검출되지 않은 것을 의미하고, 비교예 2-1 및 2-2의 멸균 후 처리 시간의 경우 30℃에 액상시료를 실험예 2와 같이 처리한 시간이다)(In Table 2, + means detected, - means not detected, and the processing time after sterilization in Comparative Examples 2-1 and 2-2 is the time when the liquid sample was treated as in Experimental Example 2 at 30°C. )
상기 멸균 후, 각 액상 시료에 L. lactis, L. plantarum 또는 L. mesenteroides 등을 포함하는 Lactic Acid Bacteria (LAB)를 30℃의 온도로 24시간 또는 48시간 동안 발효시켰고, LAB 검출여부를 확인하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 대조군으로 멸균 전처리 및 유산균 발효를 시키지 않은 상기 시금치 착즙액, 브로콜리 착즙액, 양배추 착즙액을 30℃의 온도에서 24시간 또는 48시간동안 처리하여 준비하였다.After the above sterilization, each liquid sample was fermented with Lactic Acid Bacteria (LAB), including L. lactis , L. plantarum , or L. mesenteroides , at a temperature of 30°C for 24 or 48 hours, and the detection of LAB was confirmed. , the results are shown in Table 3. As a control, the spinach juice, broccoli juice, and cabbage juice without sterilization pretreatment or lactic acid bacteria fermentation were prepared by treating them at a temperature of 30°C for 24 or 48 hours.
(표 3에서 +는 검출된 것을, -는 검출되지 않은 것을 의미하고, 비교예 3-1 및 3-2의 멸균 후 배양 시간의 경우 30℃에 멸균하지 않은 액상 시료를 실험예 2와 같이 처리한 시간이다)(In Table 3, + means detected, - means not detected, and in the case of incubation time after sterilization in Comparative Examples 3-1 and 3-2, liquid samples that were not sterilized at 30°C were treated as in Experimental Example 2. one hour)
실시예 2. 유산균 발효 조건 확립Example 2. Establishment of lactic acid bacteria fermentation conditions
실시예 2-1. 유산균의 분리Example 2-1. Isolation of lactic acid bacteria
상기 시금치, 브로콜리, 양배추 착즙액을 발효 원료로 사용하여 유산균 발효물을 제조하기 위해, 해수에서 분리 및 동정 된 락토코쿠스 락틱스 (Lactococcus lactis, Ll), 락토바실러스 플란터룸 (Lactobacillus. plantarum, Lp), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides; Lm)를 이용하였다. 상기 락토코쿠스 락틱스 (Lactococcus lactis, Ll)와 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides;Lm)는 2018년 6월 경북수산자원연구원의 양식장 해수에서, 락토바실러스 플란터룸(L. plantarum, Lp)은 2015년 11월부터 12월까지 울릉도 태하, 저동 및 현포에서 취수된 해양심층수 (표층으로부터 수심 200m의 바닷물)로부터 분리하였다. 상기 해수 및 해양심층수를 0.1%(v/v) bromocresol purple (BCP)가 첨가된 DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) agar 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하였다. 이후 BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니의 선별을 반복하여 단일 종을 분리하였다. In order to produce lactic acid bacteria fermentation products using the spinach, broccoli, and cabbage juice as fermentation raw materials, Lactococcus lactis (Ll), Lactobacillus. plantarum , Lp, isolated and identified from seawater ), Leuconostoc mesenteroides (Lm) was used. The Lactococcus lactis (Ll) and Leuconostoc mesenteroides (Lm) were found in the seawater of the fish farm of the Gyeongbuk Fisheries Research Institute in June 2018, and Lactobacillus plantarum ( L. plantarum , Lp) was isolated from deep ocean water (seawater from the surface to a depth of 200 m) collected from Taeha, Jeodong, and Hyeonpo in Ulleungdo from November to December 2015. The seawater and deep ocean water were spread on DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) agar medium supplemented with 0.1% (v/v) bromocresol purple (BCP) and cultured at 37°C for 1 day. Afterwards, selection of yellow colonies formed by reaction with BCP was repeated to isolate a single species.
상기 분리된 3종의 균주는 MRS 액체 배지에서 배양하여 50%(v/v) 글리세롤을 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 25%가 되도록 한 후, -70℃에서 보관하였다.The three isolated strains were cultured in MRS liquid medium, mixed with 50% (v/v) glycerol to achieve a final glycerol concentration of 25%, and then stored at -70°C.
2-2. 유산균의 동정2-2. Identification of lactic acid bacteria
상기 분리된 각 유산균 균주는 16S rRNA의 염기서열 분석을 이용하여 동정되었다. 상기 3종의 균주를 동정하기 위해, 우선 mini genomic DNA extraction kit (Promega)를 이용하여 각 균주의 유전체 DNA (genomic DNA)를 분리하였다.Each of the isolated lactic acid bacteria strains was identified using 16S rRNA base sequence analysis. To identify the three strains, first, the genomic DNA of each strain was isolated using a mini genomic DNA extraction kit (Promega).
상기 분리된 유전체 DNA를 주형으로, 하기의 27F (서열번호 1) 및 1492R 프라이머 (서열번호 2) 세트 및 AccPower PCR premix kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler(Japan)으로 상기 균주 3종의 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였고, 상기 프라이머 세트의 정보를 하기 표 4에 나타내었다.Using the isolated genomic DNA as a template, the following set of 27F (SEQ ID NO: 1) and 1492R primers (SEQ ID NO: 2) and AccPower PCR premix kit (Bioneer, Korea) were used to purify strain 3 using TaKaRa PCR Thermal Cycler (Japan). The 16S rRNA gene region of the species was amplified, and information of the primer set is shown in Table 4 below.
상기 PCR 산물은 PCR clean-up Gel extraction (Macherey Nagel, USA)으로 정제하여 ABI3730 DNA analyzer (Applied Bioxyxtems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 본 발명에서 분리된 락토코쿠스 락틱스 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 3에 락토바실러스 플란터룸 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 4에, 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 5에 나타내었고 그 정보를 하기 표 5에 나타내었다.The PCR product was purified by PCR clean-up gel extraction (Macherey Nagel, USA), and the gene sequence was analyzed using an ABI3730 DNA analyzer (Applied Bioxyxtems, USA). The 16S rRNA sequence of the Lactococcus lactics strain isolated in the present invention is SEQ ID NO: 3, the 16S rRNA sequence of the Lactobacillus planterum strain is SEQ ID NO: 4, and the 16S rRNA sequence of the Leuconostoc mesenteroides strain is SEQ ID NO: 5. and the information is shown in Table 5 below.
상기 분리된 락토코쿠스 락틱스 균주, 락토바실러스 플란터룸 균주, 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 16s rRNA 서열정보를 이용하여 16S rRNA 서열 유사도 분석을 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 해수로부터 분리된 유산균 3종의 16S rRNA 분석 결과 락토코쿠스 락틱스 균주 (Accession No. GenBank accession no. MG754653.1), 락토바실러스 플란터룸 균주 (Accession No. GenBank accession no. KR184825.1), 류코노스톡 메센테로이데스 균주 (Accession No. GenBank accession no. MT544830.1)와 99%의 서열 유사도를 보여 각각 락토코쿠스 락틱스, 락토바실러스 플란터룸 및 류코노스톡 메센테로이데스로 명명하였다.16S rRNA sequence similarity analysis was performed using the 16s rRNA sequence information of the isolated Lactococcus lactics strain, Lactobacillus plantarum strain, and Leuconostoc mesenteroides strain, and the results are shown in Table 6 below. As shown in Table 6 below, as a result of 16S rRNA analysis of three types of lactic acid bacteria isolated from seawater, Lactococcus lactics strain (Accession No. GenBank accession no. MG754653.1), Lactobacillus planterum strain (Accession No. GenBank accession) no. KR184825.1) and Leuconostoc mesenteroides strain (Accession No. GenBank accession no. MT544830.1), showing 99% sequence similarity to Lactococcus lactics, Lactobacillus planterum, and Leuconostoc mesene, respectively. It was named Theroides.
(서열번호 3의 16s rRNA) Lactococcus lactis TS95
(16s rRNA of SEQ ID NO: 3)
MG754653.1
(서열번호 6) Lactococcus lactis
MG754653.1
(SEQ ID NO: 6)
(서열번호 4의 16s rRNA) Lactobacillus plantarum DSW#2-4
(16s rRNA of SEQ ID NO: 4)
KR184825.1
(서열번호 7) Lactobacillus plantarum
KR184825.1
(SEQ ID NO: 7)
MT544830.1
(서열번호 8) Leuconostoc mesenteroides
MT544830.1
(SEQ ID NO: 8)
상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주는 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2018년 8월 10일자로 기탁되었으며, Lactobacillus plantarum DSW #2-4 수탁번호는 KCCM12299P이다. 상기 락토코쿠스 락틱스 균주와 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2020년 7월 3일자로 기탁되었으며, Lactococcus lactis TS95와 Leuconostoc mesenteroides TS49 수탁번호는 각각 KCCM 12759P와 KCCM 12756P이다.The isolated Lactobacillus plantarum strain was deposited at the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) on August 10, 2018, and the accession number of Lactobacillus plantarum DSW #2-4 is KCCM12299P. The Lactococcus lactis strain and Leuconostoc mesenteroides strain were deposited at the Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) on July 3, 2020, and the accession numbers of Lactococcus lactis TS95 and Leuconostoc mesenteroides TS49 are KCCM 12759P and KCCM 12756P, respectively. am.
2-3. 유산균 발효 조건 최적화2-3. Optimization of lactic acid bacteria fermentation conditions
실시예 1에서의 시금치, 브로콜리, 양배추를 포함한 발효 원료의 발효 조건 최적화를 위해, 유산균 발효를 효과적으로 일어나게 할 수 있는 최적조건의 확인하기 위한 실험을 수행하였다.In order to optimize the fermentation conditions of fermentation raw materials including spinach, broccoli, and cabbage in Example 1, an experiment was performed to confirm the optimal conditions that can effectively cause lactic acid bacteria fermentation.
유산균 배양액으로는 실시예 1에서 제조된 시금치, 브로콜리 및 양배추 착즙액을 제조하여 실험군으로 사용하였고, 대조군으로는 유산균 배양에 일반적으로 이용되는 MRS 배지를 이용하였다.As the lactic acid bacteria culture medium, the spinach, broccoli, and cabbage juice prepared in Example 1 was prepared and used as an experimental group, and MRS medium, which is generally used for culturing lactic acid bacteria, was used as a control group.
상기 제조된 각각의 발효 원료에 L.lactis (KCCM 12759P), L.plantarum (KCCM12299P), L.mesenteroides (KCCM 12756P)을 각각 1x108 cfu/ml 농도로 0.2 mL (1%; v/v)씩 접종하고 26℃에서 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 24시간 후의 LAB (Lactic Acid Bacteria) Counts (log cfu/ml)를 측정하여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였다. 이때 발효온도 26℃에서 실험을 진행하였다.To each fermentation raw material prepared above, 0.2 mL (1%; v/v) of L. lactis (KCCM 12759P), L. plantarum (KCCM 12299P), and L. mesenteroides (KCCM 12756P) were added at a concentration of 1x10 8 cfu/ml. Inoculated and cultured at 26°C for 24, 48, and 72 hours. The optimal fermentation culture conditions were confirmed by measuring LAB (Lactic Acid Bacteria) Counts (log cfu/ml) after 24 hours. At this time, the experiment was conducted at a fermentation temperature of 26°C.
상기 LAB Counts는 각 배양액에 아가로스 (BD Difco, USA)를 첨가하여 제작한 고체 배지에 배양물을 1%(v/v)로 희석하여 1 ml을 LAB 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 측정하여 수행하였다. 각 배양액에서의 유산균 배양 후 LAB Counts 측정결과를 도 1 및 하기 표 7에 나타냈다.The LAB Counts were obtained by diluting the culture to 1% (v/v) in a solid medium prepared by adding agarose (BD Difco, USA) to each culture, spreading 1 ml onto the LAB plate, and culturing at 30°C for 24 hours. This was performed by measuring the number of colonies formed. The LAB Counts measurement results after culturing lactic acid bacteria in each culture medium are shown in Figure 1 and Table 7 below.
MRS 배지에 L.lactis KCCM12759P, L.plantarum KCCM12299P, L.mesenterodes KCCM12756P를 각각 접종한 경우, 24시간동안 배양한 후 LAB Counts가 1.94x1011/ml(1.94E+11), 6.26x1010/ml(6.26E+10), 2.27x1010/ml(2.27E+10)로 측정되었고, 48시간 동안 배양한 후 LAB Counts는 1.13x1011/ml(1.13E+11), 3.27x109/ml(3.27E+09), 1.85x109/ml(1.85E+09)로 측정되었고, 72시간동안 배양한 후의 LAB Counts는 7.30x1010/ml(7.30E+10), 2.27x109/ml(2.27E+09), 2.75x108/ml(2.75E+08)로 측정되었다 (도 1). When L.lactis KCCM12759P, L.plantarum KCCM12299P, and L.mesenterodes KCCM12756P were inoculated into MRS medium, LAB Counts were 1.94x10 11 /ml (1.94E+11), 6.26x10 10 /ml ( 6.26E+10), 2.27x10 10 /ml(2.27E+10), and after culturing for 48 hours, LAB Counts were 1.13x10 11 /ml(1.13E+11), 3.27x10 9 /ml(3.27E) +09), 1.85x10 9 /ml (1.85E+09), and LAB Counts after culturing for 72 hours were 7.30x10 10 /ml (7.30E+10), 2.27x10 9 /ml (2.27E+09) ), was measured as 2.75x10 8 /ml (2.75E+08) (Figure 1).
도 1에서 확인한 바와 같이, L. lactis를 시금치 착즙액 배지에 접종하고 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 2.10x1011/ml(2.10E+11), 3.50x1010/ml(3.5E+10), 3.74x1010/ml(3.74E+10)으로 증식이 활발히 일어났다. 브로콜리 착즙액 배지에서 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 5.40x1010/ml(5.40E+10), 3.30x1009/ml(3.30E+09), 4.20x1008/ml(4.20E+08)이었고, 양배추 착즙액 배지의 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 4.50x1010/ml(4.50E+10), 4.40x1008/ml(4.40E+08), 3.00x1007/ml(3.00E+07)이었다. L. lactis는 시금치, 브로콜리, 양배추 착즙액 배지 모두 24시간 배양에 있어 유산균 성장이 가장 활발하였으며, 특히 시금치 착즙액이 경우가 가장 높았다.As confirmed in Figure 1, the number of lactic acid bacteria in the culture in which L. lactis was inoculated into the spinach juice medium and cultured for 24, 48, and 72 hours was 2.10x10 11 /ml (2.10E+11) and 3.50x10 10 /ml, respectively. (3.5E+10), proliferation occurred actively at 3.74x10 10 /ml (3.74E+10). The number of lactic acid bacteria in cultures cultured in broccoli juice medium for 24, 48, and 72 hours was 5.40x10 10 /ml (5.40E+10), 3.30x10 09 / ml (3.30E+09), 4.20x10 08 /ml ( 4.20E+08), and the number of lactic acid bacteria in the cabbage juice medium cultured for 24, 48, and 72 hours was 4.50x10 10 /ml (4.50E+10) and 4.40x10 08 /ml (4.40E+08), respectively. , 3.00x10 07 /ml (3.00E+07). L. lactis showed the most active lactic acid bacteria growth in spinach, broccoli, and cabbage juice medium when cultured for 24 hours, especially in spinach juice medium.
L. plantarum 의 경우는 시금치 착즙액 배지에 24, 48, 72 시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 1.76x1009/ml(1.76E+09), 1.69x1009/ml(1.69E+09), 2.00x1009/ml(2.00E+09)으로 증식이 거의 비슷하게 일어났다. 브로콜리 착즙액 배지에서 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 5.59x1010/ml(5.59E+10), 3.68x1009/ml(3.68E+09), 7.70x1008/ml(7.70E+08)이었고, 양배추 착즙액 배지의 24, 48, 72 시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 7.80x1010/ml(7.80E+10), 3.06x1009/ml(3.06E+09), 8.50x1008/ml(8.50E+08)이었다. L. plantarum은 시금치보다는 브로콜리, 양배추 착즙액 배지의 24시간 배양에 있어 유산균 성장이 가장 활발하고 48, 72시간에서 감소하였다. In the case of L. plantarum , the number of lactic acid bacteria in the culture cultured in spinach juice medium for 24, 48, and 72 hours was 1.76x10 09 /ml (1.76E+09), 1.69x10 09 /ml (1.69E+09), respectively. The proliferation was almost similar at 2.00x10 09 /ml (2.00E+09). The number of lactic acid bacteria in cultures cultured in broccoli juice medium for 24, 48, and 72 hours was 5.59x10 10 /ml (5.59E+10), 3.68x10 09 /ml (3.68E+09), and 7.70x10 08 /ml ( 7.70E+08), and the number of lactic acid bacteria in the cabbage juice medium cultured for 24, 48, and 72 hours was 7.80x10 10 /ml (7.80E+10) and 3.06x10 09 /ml (3.06E+09), respectively. , was 8.50x10 08 /ml (8.50E+08). L. plantarum is Lactic acid bacteria growth was most active in 24-hour culture on broccoli and cabbage juice medium rather than spinach, and decreased at 48 and 72 hours.
L. mesenteroides의 경우는 L. plantarum에서처럼 시금치보다는 브로콜리, 양배추 착즙액 배지의 24시간 배양에 있어 유산균 성장이 가장 활발하였다. 시금치 착즙액 배지에 24, 48, 72 시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 3.30x1009/ml(3.30E+09), 1.43x1008/ml(1.43E+08), 3.74x1007/ml(3.74E+07)으로 증식이 시간경과에 따라 감소하였다. 브로콜리 착즙액 배지에서도 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 2.40x1010/ml(2.40E+10), 3.00x1009/ml(3.00E+09), 3.90x1008/ml(3.90E+08)이었고, 양배추 착즙액 배지의 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각 9.70x1010/ml(9.70E+10), 5.70x1008/ml(5.70E+08), 1.00x1006/ml(1.00E+06)이었다. L. mesneteroides 역시 시금치보다는 브로콜리, 양배추 착즙액 배지의 24시간 배양에 있어 유산균 성장이 가장 활발하고 48, 72시간에서 감소하였다. 이에, 시금치, 브로콜리, 양배추에서의 유산균 발효한 경우, 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스의 탄소원 또는 이스트(yeast) 소고기 추출물(meat extract) 등의 첨가 없이도 26℃에서 24시간 동안 유산균 증식이 더 활발하여 유산균 배양에 적절함을 확인할 수 있었다.In the case of L. mesenteroides , as in L. plantarum , lactic acid bacteria growth was most active when cultured for 24 hours on broccoli and cabbage juice media rather than spinach. The number of lactic acid bacteria in cultures cultured in spinach juice medium for 24, 48, and 72 hours was 3.30x10 09 /ml(3.30E+09), 1.43x10 08 /ml(1.43E+08), and 3.74x10 07 /ml( 3.74E+07), the proliferation decreased over time. The number of lactic acid bacteria in cultures cultured for 24, 48, and 72 hours in broccoli juice medium was 2.40x10 10 /ml (2.40E+10), 3.00x10 09 /ml (3.00E+09), 3.90x10 08 /ml ( 3.90E+08), and the number of lactic acid bacteria in the cabbage juice medium cultured for 24, 48, and 72 hours was 9.70x10 10 /ml (9.70E+10) and 5.70x10 08 /ml (5.70E+08), respectively. , 1.00x10 06 /ml(1.00E+06). L. mesneteroides also showed the most active growth of lactic acid bacteria when cultured on broccoli and cabbage juice medium rather than spinach for 24 hours, and decreased at 48 and 72 hours. Accordingly, in the case of lactic acid bacteria fermentation in spinach, broccoli, and cabbage, the growth of lactic acid bacteria was more active at 26°C for 24 hours without the addition of carbon sources such as dextrose, starch, sucrose, and maltose or yeast meat extract. Thus, it was confirmed that it was suitable for culturing lactic acid bacteria.
실시예 3. Example 3. L. lactisL. lactis 유산균 발효에 의한 비타민 K2 생성능과 비타민 K1 유무 확인 Confirmation of vitamin K2 production ability and presence of vitamin K1 by lactic acid bacteria fermentation
3-1. 야채 유산균 발효물의 비타민 K2 생성능 및 비타민 K1 확인3-1. Confirmation of vitamin K2 production ability and vitamin K1 of fermented vegetable lactic acid bacteria
양배추 (Cabbage, Ca), 시금치 (Spinach, Sp) 착즙액에 L. lactis (KCCM 12759P) 유산균을 배양하여 제조한 발효물에서의 비타민 K2 (Menaquinone-4; MK4)의 생성 여부를 확인하기 위해, 얇은막 크로마토그래피 (Thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다.To determine whether vitamin K2 (Menaquinone-4; MK4) is produced in fermented product produced by culturing L. lactis (KCCM 12759P) lactic acid bacteria in cabbage (Ca) and spinach (Spinach, Sp) juice. Thin layer chromatography (TLC) analysis was performed.
구체적으로, 각 배양액으로는 실시예 2-3에서 사용된 양배추, 시금치 착즙액에 각각 L. lactis (KCCM 12759P)를 접종한 24시간 배양액 (200 mL)을 사용하였고, 비교군으로 L.lactis를 접종하지 않은 양배추 및 시금치 착즙액을 사용하였으며, TLC 수행시 양성 대조군으로는 비타민 K1 (Sigma USA; V3051)과 비타민 K2 (MK-4; V042; Sigma USA) 각 5 ug/mL(0.05%; w/v)을 이용하였다.Specifically, as each culture medium, a 24-hour culture medium (200 mL) inoculated with L. lactis (KCCM 12759P) was used in the cabbage and spinach juice used in Example 2-3, respectively, and L. lactis was used as a comparison group. Uninoculated cabbage and spinach juice was used, and 5 ug/mL (0.05%; w) of vitamin K1 (Sigma USA; V3051) and vitamin K2 (MK-4; V042; Sigma USA) were used as positive controls when performing TLC. /v) was used.
상기 L. lactis (KCCM 12759P)를 접종하여 26℃에서 호기 상태로 24시간 동안 유산균을 배양 (발효)한 배양액의 24시간의 유산균 배양 완료 후 유산균을 3,000rpm으로 10-15분 원심분리 하여 TLC 시료로 이용하였다. 비교군의 경우 L.lactis를 접종하지 않은 착즙액을 TLC 시료로 이용하였다.After inoculating the L. lactis (KCCM 12759P) and culturing (fermenting) the lactic acid bacteria for 24 hours in aerobic conditions at 26°C, the lactic acid bacteria were centrifuged at 3,000 rpm for 10-15 minutes to collect the TLC sample. It was used as. For the comparison group, juice that was not inoculated with L. lactis was used as a TLC sample.
구체적으로 상기 시료에서 배양된 유산균을 1 x PBS 버퍼 (phosphate buffered saline)로 2번 정도 세정하고 lysozume (10 mg/mL; Roche, USA)을 포함하는 6mL의 PBS를 넣고 37℃에서 1시간 동안 방치한 후, 볼텍스 또는 혼합기를 이용하여 10-30분동안 충분히 섞어준다. 다음으로 24mL 추출버퍼 (n-hexane: isopropanol = 2:1; v/v)를 더하고 30초 동안 볼텍스로 혼합한 후, 3,000rpm에서 10-15분 동안 원심분리하여 상청액은 버리고 아래층에 n-hexane을 동량의 24mL을 첨가하여 진공 농축 (ratary)하고 2 mL의 iso-propanol에 용해하여 제조하였으며, 상기 용매를 3ul씩 TLC 플레이트에 점적하여 사용하였다. 대조군으로는 비타민 K1 (Sigma USA; V3051) 및 비타민 K2 (MK-4; V042; Sigma USA) 각 5 ug/mL(0.05%) 표준 용액을 Merck TLC silica GEL (TLC silica gel 60 RP F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 비타민 K1과 비타민 K2의 유무를 확인하였다. 상기 TLC에서 분리에 사용된 용매는 메탄올 (methanol): 아세톤 (acetone) 비율이 1:1의 부피비가 되도록 혼합하여 이용하였다. Specifically, the lactic acid bacteria cultured in the sample were washed twice with 1 Then, mix thoroughly for 10-30 minutes using a vortex or mixer. Next, add 24mL extraction buffer (n-hexane: isopropanol = 2:1; v/v), mix by vortex for 30 seconds, centrifuge at 3,000rpm for 10-15 minutes, discard the supernatant, and add n-hexane to the lower layer. It was prepared by adding an equal amount of 24 mL, vacuum-concentrating (ratary), and dissolving in 2 mL of iso-propanol, and 3 ul of the solvent was used by dropping it on a TLC plate. As a control, 5 ug/mL (0.05%) standard solutions of vitamin K1 (Sigma USA; V3051) and vitamin K2 (MK-4; V042; Sigma USA) were used using Merck TLC silica GEL (TLC silica gel 60 RP F254, Merck). After dropping 3 ul each, the sample was separated with a solvent to confirm the presence or absence of vitamin K1 and vitamin K2 in each sample. The solvent used for separation in the TLC was methanol:acetone mixed at a volume ratio of 1:1.
용매 분리 후 결과는 UV램프로 발색하여 확인하였으며, 도 2에 발색 결과 사진을 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 착즙액의 경우 시금치 착즙액에서만 비타민 K1이 확인되었으며 L. lactis 착즙액 배양액의 경우 시금치 배양액에서 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)가 더 뚜렷하게 확인되었으나, 양배추 착즙액과 배양액 시료에서 비타민 K1 및 비타민 K2가 확인되지 않았다.After solvent separation, the result was confirmed by color development with a UV lamp, and a photo of the color development result is shown in Figure 2. As can be seen in Figure 2, in the case of the juice, vitamin K1 was confirmed only in the spinach juice, and in the case of the L. lactis juice culture, vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were more clearly confirmed in the spinach culture, but in the cabbage juice. Vitamin K1 and vitamin K2 were not identified in the culture fluid samples.
3-2. 3-2. L. lactisL. lactis 유산균 발효에 의한 비타민 K2 생성능과 비타민 K1 정량분석 Quantitative analysis of vitamin K2 production ability and vitamin K1 by lactic acid bacteria fermentation
상기 실시예 3-1에서 사용된 시금치, 브로콜리, 양배추 착즙액 및 각 착즙액에 L.lactis 유산균을 배양한 발효물에 대해 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용해 비타민 K1과 비타민 K2의 정량 분석을 실시하였다. 이때 실시예 2-3의 대조군으로 사용된 MRS 배지 시료를 음성 대조군으로 사용하였다 (도 3).Quantitative analysis of vitamin K1 and vitamin K2 was performed using HPLC (high performance liquid chromatography) on the spinach, broccoli, and cabbage juices used in Example 3-1 and the fermented product obtained by culturing L. lactis lactic acid bacteria in each juice. It was carried out. At this time, the MRS medium sample used as the control in Example 2-3 was used as a negative control (FIG. 3).
먼저, 비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 얻었다. 실험군으로는, 실시예 2-3에서 제조된 양배추 착즙액, 시금치 착즙액, 브로콜리 착즙액 200 mL에 각 1x108 cfu/ml 농도로 L. lactis 유산균을 0.2mL씩 접종한 후 26℃에서 호기적인 조건으로 24시간 배양 (시료1, 시료2, 시료3)과 배양하지 않은 양배추, 시금치, 브로콜리 착즙액 (비교시료1, 비교시료2, 비교시료3)을 제조하였다. 24시간의 유산균 배양 완료 후 유산균을 3,000으로 10 ~ 15분 원심분리 하여 수집한 후 HPLC 시료로 이용하였다. 비교시료의 경우 유산균 배양을 하지 않은 착즙액을 HPLC 시료로 이용하였다.First, standard lines for vitamin K1 and vitamin K2 were obtained using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA). As an experimental group, 0.2 mL of L. lactis lactic acid bacteria were inoculated at a concentration of 1x10 8 cfu/ml each into 200 mL of cabbage juice, spinach juice, and broccoli juice prepared in Example 2-3, and then aerobically incubated at 26°C. Under these conditions, 24-hour cultured (sample 1, sample 2, sample 3) and uncultured cabbage, spinach, and broccoli juice (comparative sample 1, comparative sample 2, and comparative sample 3) were prepared. After completing 24 hours of lactic acid bacteria culture, the lactic acid bacteria were collected by centrifugation at 3,000 for 10 to 15 minutes and used as HPLC samples. For comparative samples, juice without lactic acid bacteria culture was used as an HPLC sample.
구체적으로 상기 시료에서 배양된 유산균을 1 x PBS 버퍼 (phosphate buffered saline)로 2번 정도 세정하고 lysozume (10 mg/mL; Roche, USA)을 포함하는 6 mL의 PBS를 넣고 37℃에서 1시간 동안 방치한 후, 볼텍스 또는 혼합기를 이용하여 10 ~ 30분동안 충분히 섞어준다. 다음으로 24 mL 추출버퍼 (n-hexane: isopropanol = 2:1;부피비)를 더하고 30초 동안 볼텍스로 혼합한 후, 3,000rpm에서 10 ~ 15분 동안 원심분리하여 상청액은 버리고 아래층에 n-hexane을 동량의 24mL을 첨가하여 진공 농축 (ratary)하고 3 mL의 iso-propanol에 용해하여 제조하여 사용하였다.Specifically, the lactic acid bacteria cultured in the sample were washed twice with 1 After leaving, mix thoroughly for 10 to 30 minutes using a vortex or mixer. Next, add 24 mL extraction buffer (n-hexane: isopropanol = 2:1; volume ratio), mix by vortex for 30 seconds, centrifuge at 3,000 rpm for 10 to 15 minutes, discard the supernatant, and add n-hexane to the lower layer. It was prepared and used by adding an equal amount of 24 mL, vacuum-concentrating (ratary), and dissolving in 3 mL of iso-propanol.
HPLC용 컬럼은 Agilent HC-C18(4.6 x 150 mm, 5 um; Agilent Tech, USA)를 사용하였고 이동상 용액의 경우 이동상 A 용액인 메탄올(methanol)과 이동상 B 용액인 이소프로파놀 (isoprophanol: hexane = 1:1)을 1:1 부피비로 혼합하여 사용하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지시켰으며 유속은 0.4 ml/min으로 하였고, 시료 주입량과 검출파장은 각각 50 ul와 254 nm로 하였다. 도 3에 비타민 K1과 비타민 K2의 HPLC 결과 그래프를, 하기 표 8에 각 조건별 비타민 K1과 비타민 K2 함량을 나타내었다.The HPLC column used was Agilent HC-C18 (4.6 1:1) was used mixed in a 1:1 volume ratio. The temperature of the column was maintained at 40°C, the flow rate was 0.4 ml/min, and the sample injection amount and detection wavelength were 50 ul and 254 nm, respectively. Figure 3 shows a graph of the HPLC results of vitamin K1 and vitamin K2, and Table 8 below shows the vitamin K1 and vitamin K2 contents for each condition.
비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 작성하고 시료의 값을 대비하여 얻었다. 음성대조군인 MRS배지 (음성 대조시료1)와 MRS배지에 L.lactis를 접종하여 얻어진 유산균 (음성대조시료2)에서는 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)가 정량 되지 않았다. 양배추 착즙액 (비교시료1)과 착즙액 발효액 (시료1)에서는 비타민 K1은 각 0.35 ng/mL과 0.12 ng/mL 이었으나 비타민 K2는 확인되지 않았다. 반면 시금치 착즙액 (비교시료2)과 시금치 착즙액 발효액 (시료2)에는 비타민 K1은 각 1.75 ug/mL과 1.77 ug/mL가 관찰되었고, 비타민 K2는 각 0.04 ug/mL과 1.89 ug/mL 가 관찰되어 L.lactis 배양에 따라 비타민 K2 (MK4)가 생성됨을 확인하였다. 브로콜리 착즙액 (비교시료3)과 브로콜리 착즙액 발효액 (시료3) 비타민 K1은 각 0.98 ug/mL과 1.06 ug/mL 관찰되었고, 비타민 K2는 각 0.02 ug/mL과 0.40 ug/mL 가 관찰되어, L. lactis 배양에 따라 비타민 K2 (MK4)가 약하지만 생성됨을 확인하였다. Standard lines for each vitamin K1 and vitamin K2 were prepared using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA) and obtained by comparing the values of the samples. Vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were not quantified in the negative control MRS medium (negative control sample 1) and the lactic acid bacteria obtained by inoculating the MRS medium with L. lactis (negative control sample 2). In cabbage juice (comparative sample 1) and fermented juice (sample 1), vitamin K1 was 0.35 ng/mL and 0.12 ng/mL, respectively, but vitamin K2 was not confirmed. On the other hand, 1.75 ug/mL and 1.77 ug/mL of vitamin K1 were observed in the spinach juice (comparative sample 2) and the fermented spinach juice juice (sample 2), respectively, and 0.04 ug/mL and 1.89 ug/mL of vitamin K2, respectively. It was observed that vitamin K2 (MK4) was produced according to L. lactis culture. In broccoli juice (comparative sample 3) and broccoli juice fermentation (sample 3), vitamin K1 was observed at 0.98 ug/mL and 1.06 ug/mL, and vitamin K2 was observed at 0.02 ug/mL and 0.40 ug/mL, respectively. It was confirmed that vitamin K2 (MK4) was produced, albeit weakly, by culturing L. lactis .
따라서 시금치와 브로콜리 착즙액의 L. lactis 발효물 (Sp/Ll, Br/Ll)에 있어 비타민 K2 (MK4)의 생산이 유도되며, 특히 시금치 착즙액 발효물 (Sp/Ll)은 보다 높은 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4) 함량을 보여 비타민 K 복합물 생산에 있어서는 시금치의 L. lactis (KCCM12759P) 발효물의 효율이 보다 높음을 확인하였다 (도 3).Therefore, the production of vitamin K2 (MK4) is induced in the L. lactis fermentation products (Sp/Ll, Br/Ll) of spinach and broccoli juice juice, and in particular, the spinach juice fermentation product (Sp/Ll) produces higher vitamin K1. and vitamin K2 (MK4) content, confirming that the efficiency of fermented spinach L. lactis (KCCM12759P) was higher in producing vitamin K complex (Figure 3).
3-3. 유산균 배양에 따른 비타민 K2 생성능 및 비타민 K1의 확인3-3. Confirmation of vitamin K2 production ability and vitamin K1 according to lactic acid bacteria culture
다음으로, 시금치 착즙액에 3종의 유산균을 각각 접종하여 발효 배양한 발효물 내에서 발효 (24시간)에 따른 비타민 K2 생성량과 비타민 K1 유무를 TLC 분석으로 확인하였다.Next, the spinach juice was inoculated with three types of lactic acid bacteria, and the amount of vitamin K2 produced and the presence or absence of vitamin K1 according to fermentation (24 hours) in the fermented product were confirmed by TLC analysis.
상기 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액에 대해 L. lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P), L. mesenteroides (KCCM12756P)를 각각 접종 후 배양하여, 발효물을 제조한 후, 각 발효물 내에서의 비타민 K2 생성 여부 및 비타민 K1 유무를 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)를 이용해 확인하였다.The spinach juice prepared in Example 2-3 was inoculated with L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P), respectively, and cultured to produce a fermented product, followed by each fermentation. The production of vitamin K2 and the presence of vitamin K1 in water were confirmed using thin layer chromatography (TLC).
구체적으로, 상기 시금치 착즙액 및 건조분말 물 배합물에 각각 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P) 및 L. mesenteroides (KCCM12756P)를 개별적으로 접종하여 26℃에서 호기 상태로 24시간 동안 배양해 발효물을 제조하였다.Specifically, L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P) were individually inoculated into the spinach juice and dried powder water mixture and cultured for 24 hours in aerobic conditions at 26°C. Fermented product was prepared.
상기 발효물은 TLC 분석을 위해 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 TLC 분석용 시료를 제조하였으며, 대조군으로는 비타민 K1(Sigma USA; V3051)과 비타민 K2(MK-4; V042; Sigma USA) 각 5 ug/mL(0.05%; w/v) 표준 용액을 사용하였다. 각 시료와 대조군은 Merck TLC silica GEL(TLC silica gel RP 60 F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)의 유무를 확인하였다. TLC 분석 방법은 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.The fermented product was prepared as a sample for TLC analysis in substantially the same manner as Example 3-1, and as a control group, vitamin K1 (Sigma USA; V3051) and vitamin K2 (MK-4; V042; Sigma) were used. USA) each 5 ug/mL (0.05%; w/v) standard solution was used. 3 ul of each sample and control were dropped onto Merck TLC silica GEL (TLC silica gel RP 60 F254, Merck) and then separated with a solvent to confirm the presence or absence of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) in each sample. The TLC analysis method was performed in substantially the same way as Example 3-1.
도 4에 UV 램프로 발색 확인한 TLC 결과를 나타내었다. 시금치 착즙액의 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P) 및 L. mesenteroides (KCCM12756P) 각각의 발효물에서 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)가 확인되었으나, 시금치 착즙액의 미발효물에서는 비타민 K1은 확인되었으나 비타민 K2 (MK4)는 확인되지 않았다.Figure 4 shows the TLC results of color development confirmed using a UV lamp. Vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were confirmed in the fermented products of L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P), but in the unfermented products of spinach juice, vitamin K1 was confirmed, but vitamin K2 (MK4) was not.
3-4. 3종의 유산균 배양에 따른 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)의 정량3-4. Quantification of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) according to three types of lactic acid bacteria culture
다음으로, 시금치 착즙액에 3종의 유산균을 각각 접종하여 발효 배양한 발효물 내에서 발효 24, 48시간에 따른 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)정량을 HPLC 분석으로 확인하였다.Next, the spinach juice was inoculated with three types of lactic acid bacteria, and the quantity of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) in the fermented product was confirmed by HPLC analysis at 24 and 48 hours of fermentation.
구체적으로 상기 실시예 3-2와 실직적으로 동일하게 비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 얻었다. 실험군으로는, 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액 200 mL에 각 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P) 및 L. mesenteroides (KCCM12756P) 1x108 cfu/ml 농도로 0.2mL씩 접종한 후 26℃에서 호기적인 조건으로 24, 48시간 배양과 배양하지 않은 시금치 착즙액 (비교시료2)을 제조하였다. 24시간, 48시간의 유산균 배양 완료 후 각 시간별 유산균을 3,000 ~ 5,000 rpm으로 10 ~ 15분 원심분리 하여 유산균만을 수집한 후 HPLC 시료로 이용하였다.Specifically, standard lines for vitamin K1 and vitamin K2 were obtained using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA) in substantially the same manner as in Example 3-2. As an experimental group, 0.2 mL of each L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P) at a concentration of 1x10 8 cfu/ml was inoculated into 200 mL of the spinach juice prepared in Example 2-3. After that, spinach juice without culture (comparative sample 2) was prepared under aerobic conditions at 26°C for 24 and 48 hours. After completing the lactic acid bacteria culture for 24 hours and 48 hours, the lactic acid bacteria at each time were centrifuged at 3,000 to 5,000 rpm for 10 to 15 minutes to collect only the lactic acid bacteria and use them as HPLC samples.
HPLC용 컬럼은 Agilent HC-C18 (4.6 x 150 mm, 5 um; Agilent Tech, USA)를 사용하였고 이동상 용액의 경우 이동상 A 용액인 메탄올(methanol)과 이동상 B 용액인 이소프로파놀 (isoprophanol: hexane = 1:1)을 1:1 부피비로 혼합하여 사용하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지시켰으며 유속은 0.4 ml/min으로 하였고, 시료 주입량과 검출파장은 각각 50 ul와 254 nm로 하였다. 하기 표 9와 도 5에 각 조건별 비타민 K1과 비타민 K2 함량을 나타내었다. The HPLC column used was Agilent HC-C18 (4.6 1:1) was used mixed in a 1:1 volume ratio. The temperature of the column was maintained at 40°C, the flow rate was 0.4 ml/min, and the sample injection amount and detection wavelength were 50 ul and 254 nm, respectively. Table 9 and Figure 5 below show the vitamin K1 and vitamin K2 contents for each condition.
24hSp/Lp
24h
비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 작성하고 시료의 값을 대비하여 얻었다. 대조시료인 시금치 착즙액에 L. lactis를 무접종한 비교시료2에서 비타민 K1은 1.418 ug/mL과, 비타민 K2 (MK4)는 0.040 ug/mL으로 측정되었다. 시금치 착즙액 L.lactis (KCCM12759P)의 24시간 발효액 (시료2-1)과 착즙액 48시간 발효액 (시료2-2)에서는 비타민 K1은 각 1.012 ug/mL과 1.052 ug/mL, 비타민 K2 (MK4)는 각 0.784 ug/mL과 1.117 ug/mL로 측정되어, 비타민 K2는 배양 시간 경과에 따라 증가하였다. 시금치 착즙액 L.plantarum (KCCM12299P)의 24시간 발효액 (시료2-3)과 착즙액 48시간 발효액 (시료2-4)에서는 비타민 K1은 각 1.270 ug/mL과 1.201 ug/mL, 비타민 K2는 각 0.692 ug/mL과 0.923 ug/mL로 측정되어, 비타민 K1은 유지되었고 비타민 K2 (MK4)는 배양 시간 경과에 따라 증가하였으나 L.lactis 보다는 생성능이 낮았다. 반면 시금치 착즙액 L.mesenteroides (KCCM12756P)의 24시간 발효액 (시료2-5)과 착즙액 48시간 발효액 (시료2-6)에서는 비타민 K1은 각 1.060 ug/mL과 0.852 ug/mL, 비타민 K2 (MK4)는 각 0.844 ug/mL과 0.586 ug/mL로 측정되어, 비타민 K1과 비타민 K2 모두 배양 시간 경과에 따라 감소하였다. 이에 결과에 따라 시금치 착즙액의 L. lactis 발효 (Sp/Ll) 시간 경과에 따라 비타민 K2 (MK4)의 생산이 유도되며, 특히 시금치 착즙액 발효물 (Sp/Ll)은 L.plantarum (KCCM12299P)과 L.mesenteroides (KCCM12756P) 배양보다 보다 높은 비타민 K2 (MK4) 생성능을 보여 비타민 K2 (MK4) 생산에 있어서는 시금치의 L. lactis (KCCM12759P)의 활용이 높음을 확인하였다 (도 5).Standard lines for each vitamin K1 and vitamin K2 were prepared using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA) and obtained by comparing the values of the samples. In comparative sample 2, in which spinach juice was not inoculated with L. lactis, vitamin K1 was measured at 1.418 ug/mL, and vitamin K2 (MK4) was measured at 0.040 ug/mL. In the 24-hour fermentation broth (sample 2-1) and the 48-hour fermentation broth (sample 2-2) of spinach juice L.lactis (KCCM12759P), vitamin K1 was 1.012 ug/mL and 1.052 ug/mL, respectively, and vitamin K2 (MK4). ) were measured at 0.784 ug/mL and 1.117 ug/mL, respectively, and vitamin K2 increased with the passage of culture time. In the 24-hour fermentation broth (sample 2-3) and the 48-hour fermentation broth (sample 2-4) of spinach juice L. plantarum (KCCM12299P), vitamin K1 was 1.270 ug/mL and 1.201 ug/mL, respectively, and vitamin K2 was each. Measured at 0.692 ug/mL and 0.923 ug/mL, vitamin K1 was maintained and vitamin K2 (MK4) increased over culture time, but the production capacity was lower than that of L. lactis. On the other hand, in the 24-hour fermentation broth (sample 2-5) and the 48-hour fermentation broth (sample 2-6) of spinach juice L.mesenteroides (KCCM12756P), vitamin K1 was 1.060 ug/mL and 0.852 ug/mL, respectively, and vitamin K2 ( MK4) was measured at 0.844 ug/mL and 0.586 ug/mL, respectively, and both vitamin K1 and vitamin K2 decreased with the passage of culture time. According to the results, the production of vitamin K2 (MK4) is induced over time in the L. lactis fermentation (Sp/Ll) of the spinach juice. In particular, the fermentation of the spinach juice (Sp/Ll) is induced by L. plantarum (KCCM12299P). It was confirmed that spinach's L. lactis (KCCM12759P) is highly useful for producing vitamin K2 (MK4), showing a higher vitamin K2 (MK4) production ability than that of L. mesenteroides (KCCM12756P) culture (Figure 5).
3-5. 유산균 공배양에 따른 비타민 K2 생성능 및 비타민 K1의 확인3-5. Confirmation of vitamin K2 production ability and vitamin K1 according to lactic acid bacteria co-culture
다음으로, 시금치 착즙액에 3종의 유산균을 각각 2종 또는 3종 공접종하여 발효 배양한 발효물 내에서 발효시간의 경과 (24시간, 48시간 및 72시간)에 따른 비타민 K2 생성량과 비타민 K1 유무를 TLC 분석으로 확인하였다.Next, the amount of vitamin K2 produced and vitamin K1 according to the passage of fermentation time (24 hours, 48 hours, and 72 hours) in the fermented product by co-inoculating spinach juice with two or three types of lactic acid bacteria, respectively. The presence or absence was confirmed by TLC analysis.
구체적으로, 상기 시금치 착즙액에 L.lactis (KCCM12759P) (Ll), L.lactis (KCCM12759P)와 L.plantarum (KCCM12299P) (LlLp), L.lactis (KCCM12759P)와 L. mesenteroides (KCCM12756P) (LlLm), L.plantarum (KCCM12299P)과 L. mesenteroides(KCCM12756P) (LpLm) 각 2종을 공배양 또는 상기의 3종 (LlLpLm)을 공배양 접종하여 26℃에서 호기 상태로 배양해 발효물을 제조하였다.Specifically, the spinach juice was mixed with L. lactis (KCCM12759P) (Ll), L. lactis (KCCM12759P) and L. plantarum (KCCM12299P) (LlLp), L. lactis (KCCM12759P) and L. mesenteroides (KCCM12756P) (LlLm). ), L. plantarum (KCCM12299P) and L. mesenteroides (KCCM12756P) (LpLm) were co-cultured or The above three species (LlLpLm) were co-inoculated and cultured under aerobic conditions at 26°C to prepare a fermented product.
상기 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액에 대해 L. lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P), L.mesenteroides (KCCM12756P)를 2종 또는 3종 모두 접종 배양하여, 발효물을 제조한 후, 각 발효물 내에서의 비타민 K2 생성 여부 및 비타민 K1 유무를 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)를 이용해 발효시간이 24시간, 48시간 및 72시간 경과하였을 때 확인하였다.The spinach juice prepared in Example 2-3 was inoculated with two or all three types of L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P) to prepare a fermented product. Afterwards, the production of vitamin K2 and the presence of vitamin K1 in each fermented product were confirmed after 24, 48, and 72 hours of fermentation time using thin layer chromatography (TLC).
상기 발효물은 TLC 분석을 위해 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 TLC 분석용 시료를 제조하였으며, 대조군으로는 비타민 K1 (Sigma USA; V3051)과 비타민 K2 (MK-4; V042; Sigma USA) 각 5 ug/mL(0.05%; w/v) 표준 용액을 사용하였다. 각 시료와 대조군은 Merck TLC silica GEL (TLC silica gel RP 60 F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)의 유무를 확인하였다. TLC 분석 방법은 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다 (도 6).The fermented product was prepared as a sample for TLC analysis in substantially the same manner as Example 3-1, and as a control group, vitamin K1 (Sigma USA; V3051) and vitamin K2 (MK-4; V042; Sigma) were used. USA) each 5 ug/mL (0.05%; w/v) standard solution was used. 3 ul of each sample and control were dropped onto Merck TLC silica GEL (TLC silica gel RP 60 F254, Merck) and then separated with a solvent to confirm the presence or absence of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) in each sample. The TLC analysis method was performed in substantially the same manner as Example 3-1 (FIG. 6).
도 6에 UV 램프로 발색 확인한 TLC 결과를 나타내었다. 시금치 착즙액의 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P) 및 L. mesenteroides (KCCM12756P) 각각의 2종 및 3종 발효물의 발효시간 24시간, 48시간, 72시간에서 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)가 확인되었으나, 시금치 착즙액 미발효물에서는 비타민 K1만 확인되었고 비타민 K2 (MK4)는 확인되지 않았으며 MRS배지에서는 전혀 확인되지 않았다. Figure 6 shows the TLC results of color development confirmed using a UV lamp. Vitamin K1 and vitamin K2 ( MK4) was confirmed, but only vitamin K1 was confirmed in the unfermented spinach juice, vitamin K2 (MK4) was not confirmed, and it was not confirmed at all in the MRS medium.
3-6. 유산균 공배양에 따른 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)의 정량3-6. Quantification of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) according to lactic acid bacteria co-culture
다음으로 시금치 착즙액에 3종의 유산균을 각각 2종 또는 3종 공접종하여 발효 배양한 발효물 내에서 발효 시간의 경과 (24시간, 48시간, 및 72시간)에 따른 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4) 생성량을 HPLC 분석으로 확인하였다.Next, vitamin K1 and vitamin K2 ( The amount of MK4) produced was confirmed by HPLC analysis.
구체적으로, 상기 3-5의 시료와 동일하게 L.lactis (KCCM12759P) 1종과, 상기 3종 중 각 2종 공배양 또는 상기의 3종을 공배양 접종하여 26℃에서 호기 상태로 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양해 발효물을 얻었다.Specifically, in the same manner as the sample in 3-5 above, co-culture with one type of L. lactis (KCCM12759P) and two types of each of the three types above, or The above three species were co-cultured and cultured at 26°C under aerobic conditions for 24, 48, and 72 hours to obtain a fermented product.
구체적으로 상기 실시예 3-2와 같이 비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 얻었다. 실험군으로는, 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액 200 mL에 각 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P) 및 L. mesenteroides (KCCM12756P) 1x108 cfu/ml 농도로 2종의 경우는 0.1mL씩 0.2mL이 되도록 접종하였고 3종의 경우는 0.67mL씩 0.2mL이 되도록 접종 후 26℃에서 호기적인 조건으로 24시간, 48시간, 72 시간 배양과 배양하지 않은 시금치 착즙액 (대조시료)을 제조하였다. 24시간, 48시간, 72시간의 유산균 배양 완료 후 각 시간별 유산균을 3,000-5,000 rpm으로 10 - 15분 원심분리 하여 유산균만을 수집한 후 HPLC 시료로 이용하였다.Specifically, as in Example 3-2, standard lines for vitamin K1 and vitamin K2 were obtained using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA). As an experimental group, 2 species of L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P) were added to 200 mL of the spinach juice prepared in Example 2-3 at a concentration of 1x10 8 cfu/ml. were inoculated at 0.1 mL each to 0.2 mL, and for the three types, 0.67 mL each at 0.2 mL. After inoculation, cultured under aerobic conditions at 26°C for 24 hours, 48 hours, and 72 hours, and uncultured spinach juice (control sample) ) was prepared. After completing the lactic acid bacteria culture for 24 hours, 48 hours, and 72 hours, the lactic acid bacteria at each time were centrifuged at 3,000-5,000 rpm for 10 - 15 minutes to collect only the lactic acid bacteria and use them as HPLC samples.
HPLC용 컬럼은 Agilent HC-C18(4.6 x 150 mm, 5 um; Agilent Tech, USA)를 사용하였고 이동상 용액의 경우 이동상 A 용액인 메탄올(methanol)과 이동상 B 용액인 이소프로파놀 (isoprophanol: hexane = 1:1)을 1:1 부피비로 혼합하여 사용하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지시켰으며 유속은 0.4 ml/min으로 하였고, 시료 주입량과 검출파장은 각각 50 ul와 254 nm로 하였다. 도 3에 비타민 K1과 비타민 K2의 HPLC 결과 그래프를, 하기 표 10과 도 7에 각 조건별 비타민 K1과 비타민 K2 함량을 나타내었다.The HPLC column used was Agilent HC-C18 (4.6 1:1) was used mixed in a 1:1 volume ratio. The temperature of the column was maintained at 40°C, the flow rate was 0.4 ml/min, and the sample injection amount and detection wavelength were 50 ul and 254 nm, respectively. Figure 3 shows a graph of the HPLC results of vitamin K1 and vitamin K2, and Table 10 and Figure 7 below show the vitamin K1 and vitamin K2 contents for each condition.
착즙액spinach
Juice
Lm (KCCM12756P) Ll (KCCM12759P)
Lm (KCCM12756P)
착즙액spinach
Juice
Lp (KCCM12299P)Ll (KCCM12759P)
LP (KCCM12299P)
착즙액spinach
Juice
Lm (KCCM12756P) LP (KCCM12299P)
Lm (KCCM12756P)
착즙액spinach
Juice
Lp (KCCM12299P)
Lm (KCCM12756P)Ll (KCCM12759P)
LP (KCCM12299P)
Lm (KCCM12756P)
착즙액spinach
Juice
비타민 K1과 비타민 K2 (sigma, USA) 표준물질을 이용해 각각의 비타민 K1과 비타민 K2의 표준선을 작성하고 시료의 값을 대비하여 얻었다. 대조시료인 시금치 착즙액에 무접종한 대조시료에서 비타민 K1가 1.05 ug/mL, 비타민 K2 (MK4)가 0.0 ug/mL으로 측정되었다. 시금치 착즙액 L.lactis (KCCM12759P)의 24시간 발효액 (시료3-1), 48시간 발효액 (시료3-2), 72시간 발효액 (시료3-3)에서 비타민 K1은 각 0.93 ug/mL, 1.09 ug/mL과 1.19 ug/mL가 관찰되었고, 비타민 K2 (MK4)는 각 0.68 ug/mL, 0.99 ug/mL과 1.35 ug/mL가 관찰되어, 비타민 K2는 72시간 배양 경과에 따라 증가하였다. 시금치 착즙액 L.lactis (KCCM12759P)과 L.mesenteroides (KCCM12756P) 공배양의 24시간 발효액 (시료4-1)과 착즙액 48시간 발효액 (시료4-2), 72시간 발효액 (시료4-3)에서 비타민 K1은 각 1.09 ug/mL, 1.25 ug/mL과 1.05 ug/mL가 관찰되었고, 비타민 K2는 각 1.39 ug/mL, 1.01 ug/mL과 1.21 ug/mL가 관찰되어, 공배양 24 시간 (시료4-1)에 비타민 K2 (MK4)양이 높게 확인되었다. 또한 시금치 착즙액 L.lactis (KCCM12759P)와 L.plantarum (KCCM12299P)의 공배양의 24시간 발효액 (시료5-1)과 착즙액 48시간 발효액 (시료5-2), 72시간 발효액 (시료5-3)에서 비타민 K1은 각 1.05 ug/mL, 1.04 ug/mL과 0.78 ug/mL가 관찰되었고, 비타민 K2는 각 1.41 ug/mL, 1.20 ug/mL과 1.22 ug/mL가 관찰되어, 시료4의 경우에서처럼 공배양 24시간 (시료5-1)에 비타민 K2 (MK4)양이 높게 확인되었다. 또한 시금치 착즙액 L.plantarum (KCCM12299P)과 L.mesenteroides (KCCM12756P)의 공배양의 24시간 발효액 (시료6-1)과 착즙액 48시간 발효액 (시료6-2), 72시간 발효액 (시료6-3)에서 비타민 K1은 각 1.02 ug/mL, 0.91 ug/mL과 1.06 ug/mL 가 관찰되었고, 비타민 K2는 각 1.27 ug/mL, 0.90 ug/mL과 0.84 ug/mL가 관찰되어, 시료4 및 5의 경우에서처럼 공배양 24시간 (시료6-1)에 비타민 K2 (MK4)양이 높게 확인되었으나 시료4 및 5보다는 조금 낮았다. 다음으로 시금치 착즙액 L.lactis (KCCM12759P), L.plantarum (KCCM12299P)과 L.mesenteroides (KCCM12756P)의 3종의 공배양의 24시간 발효액 (시료7-1)과 착즙액 48시간 발효액 (시료7-2), 72시간 발효액 (시료7-3)에서 비타민 K1은 각 1.02 ug/mL, 1.06 ug/mL과 0.91 ug/mL가 관찰되었고, 비타민 K2는 각 1.32 ug/mL, 1.28 ug/mL과 1.48 ug/mL가 관찰되어, 공배양 2시간 경과에 따라 비타민 K2 (MK4)양이 증가되는 것이 확인되었다. 상기 결과에 따라 시금치 착즙액의 L.lactis 발효(Sp/Ll) 단일균주의 배양보다 Sp/LlLm, Sp/LlLp 또는 Sp/LmLp의 2종의 공배양 시에 비타민 K2 생성을 위한 배양시간을 24시간으로 단축할 수 있으며. 특히 시금치 착즙액 3종 발효물 (Sp/LlLpLm)은 2종의 공배양이 48시간 및 72시간에 비타민 K2 생성능이 감소하는 것에 반해 발효 시간 경과에 따라 보다 높은 비타민 K2 (MK4) 생성능을 보여 비타민 K2 (MK4) 생산에 있어서는 시금치의 L. lactis (KCCM12759P)의 단일 배양보다 공배양의 경우 공정시간을 단축을 위해 활용할 수 있다 (도 7).Standard lines for each vitamin K1 and vitamin K2 were prepared using standard substances of vitamin K1 and vitamin K2 (Sigma, USA) and obtained by comparing the values of the samples. In the control sample, which was not inoculated with spinach juice, vitamin K1 was measured at 1.05 ug/mL and vitamin K2 (MK4) was measured at 0.0 ug/mL. Vitamin K1 in the 24-hour fermentation broth (sample 3-1), 48-hour fermentation broth (sample 3-2), and 72-hour fermentation broth (sample 3-3) of spinach juice L. lactis (KCCM12759P) was 0.93 ug/mL and 1.09 ug/mL, respectively. ug/mL and 1.19 ug/mL were observed, and vitamin K2 (MK4) was observed at 0.68 ug/mL, 0.99 ug/mL, and 1.35 ug/mL, respectively, and vitamin K2 increased over 72 hours of culture. Spinach juice, 24-hour fermentation broth of L.lactis (KCCM12759P) and L.mesenteroides (KCCM12756P) co-culture (sample 4-1), 48-hour fermentation broth (sample 4-2), and 72-hour fermentation broth (sample 4-3) Vitamin K1 was observed at 1.09 ug/mL, 1.25 ug/mL, and 1.05 ug/mL, and vitamin K2 was observed at 1.39 ug/mL, 1.01 ug/mL, and 1.21 ug/mL, respectively, after 24 hours of co-culture ( A high amount of vitamin K2 (MK4) was confirmed in sample 4-1). In addition, 24-hour fermentation broth (sample 5-1), 48-hour fermentation broth (sample 5-2), and 72-hour fermentation broth (sample 5-1) of co-culture of spinach juice L. lactis (KCCM12759P) and L. plantarum (KCCM12299P) In 3), vitamin K1 was observed at 1.05 ug/mL, 1.04 ug/mL, and 0.78 ug/mL, and vitamin K2 was observed at 1.41 ug/mL, 1.20 ug/mL, and 1.22 ug/mL, respectively, in sample 4. As in the case, high levels of vitamin K2 (MK4) were confirmed at 24 hours of co-culture (sample 5-1). In addition, 24-hour fermentation broth (sample 6-1), 48-hour fermentation broth (sample 6-2), and 72-hour fermentation broth (sample 6-1) of co-culture of spinach juice L.plantarum (KCCM12299P) and L.mesenteroides (KCCM12756P) In 3), vitamin K1 was observed at 1.02 ug/mL, 0.91 ug/mL, and 1.06 ug/mL, and vitamin K2 was observed at 1.27 ug/mL, 0.90 ug/mL, and 0.84 ug/mL, respectively, in samples 4 and As in case 5, the amount of vitamin K2 (MK4) was confirmed to be high at 24 hours of co-culture (sample 6-1), but it was slightly lower than that of samples 4 and 5. Next, 24-hour fermentation broth (sample 7-1) and 48-hour fermentation broth (sample 7) of three co-cultures of spinach juice, L. lactis (KCCM12759P), L. plantarum (KCCM12299P), and L. mesenteroides (KCCM12756P). -2), In the 72-hour fermentation broth (sample 7-3), vitamin K1 was observed at 1.02 ug/mL, 1.06 ug/mL, and 0.91 ug/mL, and vitamin K2 was observed at 1.32 ug/mL, 1.28 ug/mL, and 1.48 ug/mL was observed, confirming that the amount of vitamin K2 (MK4) increased after 2 hours of co-culture. According to the above results, the incubation time for vitamin K2 production when co-culturing two types of Sp/LlLm, Sp/LlLp or Sp/LmLp was 24 hours longer than when culturing a single strain of L. lactis fermentation (Sp/Ll) from spinach juice. It can be shortened by time. In particular, the fermented product of three types of spinach juice (Sp/LlLpLm) showed a higher vitamin K2 (MK4) production capacity over fermentation time, while the two types of co-culture showed a decrease in vitamin K2 production capacity at 48 and 72 hours. For K2 (MK4) production, co-culture of spinach L. lactis (KCCM12759P) can be used to shorten the process time rather than mono-culture (Figure 7).
3-7. L.lactis 시금치 착즙액 배양물내의 비타민 K1과 비타민 K2의 산 안정성 3-7. Acid stability of vitamin K1 and vitamin K2 in L.lactis spinach juice cultures.
다음으로, 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액에 L. lactis (KCCM12759P) 유산균을 접종하여 발효 배양한 발효물 (48시간)의 비타민 K1과 비타민 K2의 pH에 따른 안정성을 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)를 이용해 확인하였다.Next, the stability of vitamin K1 and vitamin K2 according to pH of the fermented product (48 hours) inoculated with L. lactis (KCCM12759P) lactic acid bacteria in the spinach juice prepared in Example 2-3 was examined by thin layer chromatography. It was confirmed using (TLC).
구체적으로, 상기 실시예 2-3에서 제조된 시금치 착즙액에 대해 L. lactis (KCCM12759P)를 접종 배양하여, 발효물을 제조한 후, pH 2 (Sodium citric buffer), pH 3 (Sodium citric buffer), pH 4 (Sodium acetate buffer), pH 5 (Sodium acetate buffer), pH 6 (Sodium phosphate buffer), pH 7 (Sodium phosphate buffer), pH 8 (Tris buffer) 또는 pH 9 (Tris buffer) 버퍼와 각각 1:1로 섞어 비타민 K1과 비타민 K2의 pH 안정성을 얇은 막 크로마토그래피 (TLC)를 이용해 확인하였다. 또한 표준품 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)도 상기의 pH 버퍼와 1:1로 혼합한 후 같은 방법으로 TLC로 안정성을 확인하였다. Specifically, the spinach juice prepared in Example 2-3 was inoculated with L. lactis (KCCM12759P) to prepare a fermented product, then adjusted to pH 2 (Sodium citric buffer) and pH 3 (Sodium citric buffer). , pH 4 (Sodium acetate buffer), pH 5 (Sodium acetate buffer), pH 6 (Sodium phosphate buffer), pH 7 (Sodium phosphate buffer), pH 8 (Tris buffer) or pH 9 (Tris buffer) buffer and 1 each. :1 and the pH stability of vitamin K1 and vitamin K2 was confirmed using thin layer chromatography (TLC). In addition, the standard vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were mixed 1:1 with the above pH buffer and their stability was confirmed by TLC in the same manner.
상기 발효물은 TLC 분석을 위해 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 TLC 분석용 시료를 제조하였으며, 대조군으로는 비타민 K1(Sigma USA; V3051)과 비타민 K2(MK-4; V042; Sigma USA) 각 5 ug/mL(0.05%; w/v) 표준 용액을 사용하였다. 각 시료와 대조군은 Merck TLC silica GEL (TLC silica gel RP 60 F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)의 유무를 확인하였다. TLC 분석 방법은 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다 (도 8).The fermented product was prepared as a sample for TLC analysis in substantially the same manner as Example 3-1, and as a control group, vitamin K1 (Sigma USA; V3051) and vitamin K2 (MK-4; V042; Sigma) were used. USA) each 5 ug/mL (0.05%; w/v) standard solution was used. 3 ul of each sample and control were dropped onto Merck TLC silica GEL (TLC silica gel RP 60 F254, Merck) and then separated with a solvent to confirm the presence or absence of vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) in each sample. The TLC analysis method was performed in substantially the same manner as Example 3-1 (FIG. 8).
도 8에 UV 램프로 발색 확인한 TLC 결과를 나타내었다. 대조시료인 표준품 비타민 K1과 비타민 K2는 pH 2-9 에서 모두 안정한 것으로 확인되었다 (도8). 반면 시금치 착즙액의 Sp/Ll 48시간 배양물은 pH 2-8의 버퍼 내에서는 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)가 안정한 것으로 확인되었으나, pH 9에서는 비타민 K1만이 약하게 확인되었다 (도 8). Figure 8 shows the TLC results of color development confirmed using a UV lamp. The control samples, standard vitamin K1 and vitamin K2, were confirmed to be stable at pH 2-9 (Figure 8). On the other hand, in the Sp/Ll 48-hour culture of spinach juice, vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were confirmed to be stable in a buffer of pH 2-8, but only vitamin K1 was confirmed to be weak at pH 9 (FIG. 8).
실시예 4. 시금치 착즙액 발효물의 염증 완화 효능 분석Example 4. Analysis of inflammation relief efficacy of fermented spinach juice
4-1. 일산화질소(NO) 생성 억제 효능 4-1. Nitric oxide (NO) production inhibition effect
마우스 대식세포 (mouse macrophage cell) Raw 264.7 (ATCC TIB-71)는 본 발명의 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)를 함유하는 시금치 발효물의 염증반응에 관여하는 일산화 질소 (Nitric oxide; NO) 생성 억제 효능, COX2 박현 억제, TNF-a 및 IL-6 제어 기능을 확인하기 위해 사용하였다.Mouse macrophage cell Raw 264.7 (ATCC TIB-71) has an inhibitory effect on the production of nitric oxide (NO), which is involved in the inflammatory response of the fermented spinach product containing vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) of the present invention. , was used to confirm the functions of COX2 inhibition, TNF-a, and IL-6 control.
Raw 264.7 (ATCC TIB-71) 세포주는 10 % fetal bovine serum (FBS), 1% (w/v) antimycotics (GIBOCO, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO2 배양조건에서 5회 계대 배양하여 실험에서 사용하였다. 또한 Raw 264.7 (ATCC TIB-71) 세포주 독성은 Cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo)을 이용하여 측정하여 안정성을 확인한 후 다음 염증 완화 실험에 사용하였다.Raw 264.7 (ATCC TIB-71) cell line was grown in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% (w/v) antimycotics (GIBOCO, USA) at 37°C and 5% CO. It was subcultured 5 times under 2 culture conditions and used in the experiment. In addition, the toxicity of the Raw 264.7 (ATCC TIB-71) cell line was measured using Cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo) to confirm stability, and then used in the next inflammation alleviation experiment.
Raw 264.7 (ATCC TIB-71) 세포는 Phenol red가 없는 10% 우태아 혈청을 포함한 DMEM 배지로 2 x 105 cell/well로 현탁 시켜, 48-well plate에 400μL로 분주하여 24시간 배양하였다. 상기 세포의 비타민 유무에 따른 NO 생성 억제 효능을 확인하기 위해, 상기 세포에 LPS처리를 하고 표준품 비타민 K1과 비타민 K2 (MK4)를 농도 (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml)로 각각 전처리 및 비교군으로 LPS처리 후 비타민 전처리를 하지 않은 것 (비교시료a) 및 대조군으로 LPS, 비타민 처리를 하지 않은 것 (대조시료a)를 준비하였다.Raw 264.7 (ATCC TIB-71) cells were suspended at 2 x 10 5 cells/well in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum without phenol red, distributed at 400 μL in a 48-well plate, and cultured for 24 hours. In order to confirm the effect of suppressing NO production depending on the presence or absence of vitamins in the cells, the cells were treated with LPS and standard vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were added at concentrations (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml). As a pretreatment and comparison group, LPS treatment but no vitamin pretreatment (comparison sample a) was prepared, and as a control group, no LPS or vitamin treatment (control sample a) was prepared.
상기 세포에 상기 실시예 3-4의 시금치 착즙액 발효물 (시료2-2)을 400 μg/ml의 농도로 전처리한 다음 1시간 뒤 세균성 염증 유발 성분인 리포다당류 (Lipopolysaccharide, LPS)를 1 μg/mL로 처리하여 24시간을 배양하였고, 비교군으로 상기 발효물을 전처리하지 않고 LPS 처리한 것 (비교시료b) 및 대조군으로 LPS 및 발효물 처리를 하지 않은 것 (대조시료b)을 준비하였다. 24시간후, 상등액을 취하여 Greiss reagent (0.2% N-(1-naphthyl)ethylene diamine용액:0.2% sulfanilamide 용액 = 1:1)을 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량선 작성을 위해 nitrite ion stardard solution(0, 5,10,15,20,30,50 μM) 100 uL씩을 동량의 Griess reagent를 혼합하여 상온에서 호일로 차공하고 15분간 반응한 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료처리 후에 NO 농도는 nitrite ion stardard solution에서 얻어진 standard curve를 이용하여 산출하였다.The cells were pretreated with the fermented spinach juice of Example 3-4 (sample 2-2) at a concentration of 400 μg/ml, and then 1 hour later, 1 μg of lipopolysaccharide (LPS), a component that causes bacterial inflammation, was added to the cells. /mL and cultured for 24 hours. As a comparison group, the fermented product was treated with LPS without pretreatment (comparative sample b), and as a control group, the fermented product was treated without LPS and fermented product (control sample b). . After 24 hours, the supernatant was taken and the absorbance was measured at 540 nm using Greiss reagent (0.2% N-(1-naphthyl)ethylene diamine solution:0.2% sulfanilamide solution = 1:1). To prepare a calibration curve, mix 100 uL of nitrite ion stardard solution (0, 5, 10, 15, 20, 30, 50 μM) with an equal amount of Griess reagent, cover with foil at room temperature, react for 15 minutes, and measure absorbance at 540 nm. Measured. After sample processing, NO concentration was calculated using the standard curve obtained from nitrite ion stardard solution.
표 11 및 도 9에서 보여준 것처럼 비타민 K1 처리 및 LPS처리된 Raw 264.7(ATCC TIB-71) 세포는 농도 의존적으로 감소하여 100 ug/mL의 경우는 0.06으로 NO의 생성을 비교시료보다 8.8배 정도 감소하였다. 비타민 K2 처리 및 LPS처리 된 Raw 264.7(ATCC TIB-71) 세포는 100 ug/mL에서는 마이너스 값으로 LPS 무처리에서처럼 NO 가 측정되지 않았다. As shown in Table 11 and Figure 9, Vitamin K1-treated and LPS-treated Raw 264.7 (ATCC TIB-71) cells decreased in a concentration-dependent manner, and in the case of 100 ug/mL, NO production was reduced to 0.06, an 8.8-fold decrease compared to the comparative sample. did. Vitamin K2-treated and LPS-treated Raw 264.7 (ATCC TIB-71) cells showed negative values at 100 ug/mL, and NO was not measured as in the case without LPS treatment.
(표 11에서 NO 농도가 마이너스 값으로 측정되었다는 것은 NO 생성이 없었다는 것을 의미한다)(In Table 11, the fact that the NO concentration was measured as a negative value means that there was no NO production)
표 12 및 도 10에서 보여준 것처럼 시금치 착즙액 발효물 (시료2-2)을 전처리 후, LPS처리 된 Raw 264.7 (ATCC TIB-71)의 경우 농도의존적으로 400 ug/mL 에서 NO 생성이 줄었으며 이는 LPS만 처리 된 세포구에 비해 1.6배 정도 감소하였다. As shown in Table 12 and Figure 10, after pretreatment of the fermented spinach juice juice (sample 2-2), NO production was reduced concentration-dependently at 400 ug/mL in the case of LPS-treated Raw 264.7 (ATCC TIB-71), which is It decreased by about 1.6 times compared to cells treated with only LPS.
(표 12에서 NCb는 Negative Control b로 무처리군을, PCb는 Positive Control b로 LPS처리군을 의미한다)(In Table 12, NCb refers to the untreated group as Negative Control b, and PCb refers to the LPS-treated group as Positive Control b.)
4-2. 사이클로옥시제나제2(Cyclooxygenase2,COX2) 단백질 생성 저해 효능 4-2. Cyclooxygenase 2 (COX2) protein production inhibition effect
실시예 4-1에서처럼 마우스 대식세포 (mouse macrophage cell) Raw 264.7 (ATCC TIB-71)을 48-well plate에 400μL (2 x 105 cell/well)로 분주하여 24시간 배양하였다. 표준품 비타민 K1 과 비타민 K2 (MK4)를 50 μg/ml 또는 100 μg/ml의 농도로 전처리, 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)을 200 μg/ml 또는 400 μg/ml의 농도로 전처리한 다음 1시간 뒤 음성대조군 (무처리군)을 제외하고 세균성 염증 유발 성분인 리포다당류 (Lipopolysaccharide, LPS)를 1 μg/mL로 처리하여 24시간을 배양하였다. 24시간 후, 세포를 수집하여 PBS 버퍼로 2회 세정하여 cell lysate를 얻었다. 단백질 정량은 BCA kit (Bio-RAD, USA)를 이용하여 정량하여 12% SDS-Polyacrylamaide gel (SDS-PAGE)에 전기영동하고, Poly vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 옮긴 후, TBS-T (0.1% Tween20 in Tris buffered saline)로 5-10분간 2-3회 세척하고 5% skim milk (in TBST)에 넣어 상온에서 1시간 동안 Blocking하였다. 다음으로 membrane은 TBST buffer로 5-10분간 2-3회 세척한 다음 1차 항체 (COX2, BD Biosciences, USA)를 1:5,000 정도로 5% skim milk(in TBST)에 희석용액내에 방치하였다. 이후 membrane은 TBST buffer로 5-10분간 2-3회 세척하고 2차항체 (HRP-conjugated secondary antibody)를 1:5,000 정도로 5% skim milk (in TBST)에 희석하여 상온에서 1시간 방치하고 이를 TBST buffer로 3-5회 세척한 후 ECL wester blotting detection reagent (ThermoFisher, USA)로 처리하여 생성된 lminescence를 X-ray film (KODAC, Japan)에 감광해 확인하였다. 이때 정상적인 Raw 264.7 세포 단백질을 확인하기 위한 1차 항체로 세포내의 단백질의 하나인 β-actin antibody (1:10K, Sigma, USA)를 사용하였다. As in Example 4-1, mouse macrophage cells Raw 264.7 (ATCC TIB-71) were dispensed at 400 μL (2 x 10 5 cells/well) in a 48-well plate and cultured for 24 hours. Standard vitamin K1 and vitamin K2 (MK4) were pretreated at a concentration of 50 μg/ml or 100 μg/ml, and spinach juice L. lactis fermentation broth (sample 2-2) was treated at a concentration of 200 μg/ml or 400 μg/ml. One hour after pretreatment, excluding the negative control group (untreated group), the cells were treated with 1 μg/mL of lipopolysaccharide (LPS), a component that causes bacterial inflammation, and cultured for 24 hours. After 24 hours, cells were collected and washed twice with PBS buffer to obtain cell lysate. Protein was quantified using a BCA kit (Bio-RAD, USA), electrophoresed on a 12% SDS-Polyacrylamaide gel (SDS-PAGE), transferred to a Poly vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA), and then washed with TBS. -T (0.1% Tween20 in Tris buffered saline) was washed 2-3 times for 5-10 minutes and blocked in 5% skim milk (in TBST) at room temperature for 1 hour. Next, the membrane was washed 2-3 times with TBST buffer for 5-10 minutes, and then the primary antibody (COX2, BD Biosciences, USA) was diluted in 5% skim milk (in TBST) at a ratio of 1:5,000. Afterwards, the membrane was washed 2-3 times with TBST buffer for 5-10 minutes, and the secondary antibody (HRP-conjugated secondary antibody) was diluted about 1:5,000 in 5% skim milk (in TBST), left at room temperature for 1 hour, and incubated in TBST. After washing with buffer 3-5 times, treatment with ECL Wester blotting detection reagent (ThermoFisher, USA), the resulting lminescence was confirmed by exposure to X-ray film (KODAC, Japan). At this time, β-actin antibody (1:10K, Sigma, USA), one of the intracellular proteins, was used as the primary antibody to identify normal Raw 264.7 cell protein.
도 11에서 확인한 것처럼 표준품 비타민 K1과 비타민 K2를 처리한 Raw 264.7 세포에서 COX-2 단백질이 농도의존적으로 감소하는 것이 확인되었다. 또한 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)이 처리 된 세포에서도 농도의존적으로 COX-2 단백질이 감소되는 것을 확인하였다.As shown in Figure 11, it was confirmed that COX-2 protein decreased in a concentration-dependent manner in Raw 264.7 cells treated with standard vitamin K1 and vitamin K2. In addition, it was confirmed that COX-2 protein was decreased in a concentration-dependent manner in cells treated with spinach juice L. lactis fermentation broth (sample 2-2).
4-3. 사이토카인 IL-6 억제 효능4-3. Cytokine IL-6 inhibition efficacy
상기 실시예 4-1에서처럼 마우스 대식세포 Raw 264.7 (ATCC TIB-71)을 48-well plate에 400ml (2 x 105 cell/well)로 분주하여 24시간 배양하였다. 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)을 400 μg/ml의 농도로 전처리한 다음 1시간 뒤 세균성 염증 유발 성분인 리포다당류 (Lipopolysaccharide, LPS)를 1 μg/mL로 처리하여 24시간을 배양하였고, 비교군으로 상기 발효물을 전처리하지 않고 LPS 처리한 것 (비교시료c) 및 대조군으로 LPS 및 발효물 처리를 하지 않은 것 (대조시료c)을 준비하였다. 24시간 후, 세포 상청액을 모아 항염증과 재생에 관여하는 인자로 알려진 인터류킨-6 (Interleukin-6; IL-6) ELISA kit (IL-6; R&D Systems, USA)로 각 농도를 측정하였다. 96 well 마이크로플레이트에 100 uL 의 포획항체 (capture antibody)를 분주해 4℃에서 하룻밤동안 정치하여 다음날 PBS로 3회 정도 세척하였다. 1 x assay buffer 200 uL씩 분주하여 1시간 동안 blocking하고 3회 1 x PBS로 세정하였다. 플레이트에 시금치 착즙액 (비교시료2)와 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)의 배양 상층액을 100 μL씩 분주하고 1-2시간 뒤에 1 x PBS 버퍼로 3-5회 세척 후, 검출항체(IL-6)와 HRP-conjugated Avidin을 100 μL씩 분주 후에 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 1 x PBS 버퍼로 3-5회 세척한 다음 substrate 용액을 100 μL씩 처리하고 상온에서 10분간 암반응 한 후, stop solution을 50 μL씩 분주하여 반응을 종결하였다. 종결 된 각 반응물은 ELISA reader(BioTek, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. As in Example 4-1, mouse macrophages Raw 264.7 (ATCC TIB-71) were dispensed at 400 ml (2 x 10 5 cells/well) in a 48-well plate and cultured for 24 hours. Spinach juice L. lactis fermentation broth (sample 2-2) was pretreated at a concentration of 400 μg/ml, and then 1 hour later, lipopolysaccharide (LPS), a component that causes bacterial inflammation, was treated at 1 μg/mL and treated for 24 hours. The fermented product was cultured, and as a comparison group, the fermented product was treated with LPS without pretreatment (comparative sample c), and as a control group, the fermented product was not treated with LPS or fermented product (control sample c). After 24 hours, the cell supernatant was collected and the concentration was measured using an ELISA kit (IL-6; R&D Systems, USA) for Interleukin-6 (IL-6), a known factor involved in anti-inflammation and regeneration. 100 uL of capture antibody was dispensed into a 96 well microplate, left overnight at 4°C, and washed three times with PBS the next day. 200 uL of 1 x assay buffer was dispensed, blocked for 1 hour, and washed 3 times with 1 x PBS. Dispense 100 μL of the culture supernatant of spinach juice (comparative sample 2) and spinach juice L. lactis fermentation broth (sample 2-2) onto the plate, and after 1-2 hours, wash 3-5 times with 1 x PBS buffer. , 100 μL of detection antibody (IL-6) and HRP-conjugated Avidin were dispensed and reacted at room temperature for 1 hour. After washing again 3-5 times with 1 The absorbance of each completed reaction was measured at 450 nm using an ELISA reader (BioTek, USA).
표 13 및 도 12에서 확인한 것처럼 Raw 264.7 세포에서 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)이 처리된 세포에서의 염증성 사이토카인 IL-6 분비량을 조사한 결과, 시금치 착즙액 L.lactis 발효액 (시료2-2)은 LPS 처리만으로 염증이 유도 된 세포보다 1.13 배 낮았다.As confirmed in Table 13 and Figure 12, as a result of examining the secretion amount of inflammatory cytokine IL-6 in cells treated with the spinach juice L. lactis fermentation broth (sample 2-2) in Raw 264.7 cells, the spinach juice L. lactis fermentation broth ( Sample 2-2) had 1.13 times lower inflammation than cells in which inflammation was induced only by LPS treatment.
(1ug/mL)LPS processing
(1ug/mL)
(ug/mL)Sample treatment concentration
(ug/mL)
IL-6 concentration (uM)
(표 13에서 NCc는 Negative Control c로 무처리군을, PCc는 Positive Control c로 LPS처리군을 의미한다)(In Table 13, NCc refers to the untreated group with Negative Control c, and PCc refers to the LPS-treated group with Positive Control c.)
<110> Marine Industry Research institute for East sea rim (MIRE) KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE young cheon insecte industria co., ltd. <120> Lactobacillus fermented product containing vitamin K2, and composition for preventing or treating inflammation containing same <130> DPP20204392KR <160> 8 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactococcus lactis TS95 <400> 3 accagggacc ggctagcact atacatgcag ttgagcgctg aaggttggta cttgtaccga 60 ctggatgagc agcgaacggg tgagtaacgc gtggggaatc tgcctttgag cgggggacaa 120 catttggaaa cgaatgctaa taccgcataa aaactttaaa cacaagtttt aagtttgaaa 180 gatgcaattg catcactcaa agatgatccc gcgttgtatt agctagttgg tgaggtaaag 240 gctcaccaag gcgatgatac atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttgggactga 300 gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat ggacgaaagt 360 ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttggtag 420 agaagaacgt tggtgagagt ggaaagctca tcaagtgacg gtaactaccc agaaagggac 480 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat 540 tgggcgtaaa gcgagcgcag gtggtttatt aagtctggtg taaaaggcag tggctcaacc 600 attgtatgca ttggaaactg gtagacttga gtgcaggaga ggagagtgga attccatgtg 660 tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggcct 720 gtaactgaca ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgagtg ctagatgtag ggagctataa gttctctgta tcgcagctaa 840 cgcaataagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900 ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960 aggtcttgac atactcgtgc tattcctaga gataggaagt tccttcggga cacgggatac 1020 aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080 gcgcaacccc tattgttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaacgag actgccggtg 1140 ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200 acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt cgcgagacag tgatgtttag ctaatctctt 1260 aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta 1320 gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccacgg gagttgggag tacccgaagt aggttgccta accgcaagga gggcgctccg 1440 gaatgaagat cccggcgatt cgaa 1464 <210> 4 <211> 1342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum DSW #2-4 <400> 4 cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60 atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120 gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180 gtccgagctt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240 agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420 aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt 480 taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540 gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600 gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660 agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720 ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840 ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc 1020 ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140 tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200 ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca aatggatggt acaaccgagt tgcgaactcg 1260 cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc tcaggttcgg 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cagcctatac atgcagttga gcgctgaagg ttggtacttg taccgactgg 60 atgagcagcg aacgggtgag taacgcgtgg ggaatctgcc tttgagcggg ggacaacatt 120 tggaaacgaa tgctaatacc gcataaaaac tttaaacaca agttttaagt ttgaaagatg 180 caattgcatc actcaaagat gatcccgcgt tgtattagct agttggtgag gtaaaggctc 240 accaaggcga tgatacatag ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg gactgagaca 300 cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga 360 ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tggtagagaa 420 gaacgttggt gagagtggaa agctcatcaa gtgacggtaa ctacccagaa agggacggct 480 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtcccgag cgttgtccgg atttattggg 540 cgtaaagcga gcgcaggtgg tttattaagt ctggtgtaaa aggcagtggc tcaaccattg 600 tatgcattgg aaactggtag acttgagtgc aggagaggag agtggaattc catgtgtagc 660 ggtgaaatgc gtagatatat ggaggaacac cggtggcgaa agcggctctc tggcctgtaa 720 ctgacactga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780 ccgtaaacga tgagtgctag atgtagggag ctataagttc tctgtatcgc agctaacgca 840 ataagcactc cgcctgggga gtacgaccgc 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cagatgggca ctctagcgag actgccggtg 1140 acaaaccgga ggaaggcggg gacgacgtca gatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200 acacgtgcta caatggcgta tacaacgagt tgccaacccg cgagggtgag ctaatctctt 1260 aaagtacgtc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact acatgaagtc ggaatcgcta 1320 gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccatgg gagtttgtaa tgcccaaagc cggtggccta accttttagg aaggagccgt 1440 ctaagcagaa cattgg 1456 <110> Marine Industry Research institute for East sea rim (MIRE) KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE young cheon insecte industry co., ltd. <120> Lactobacillus fermented product containing vitamin K2, and composition for preventing or treating inflammation containing same <130> DPP20204392KR <160> 8 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactococcus lactis TS95 <400> 3 accagggacc ggctagcact atacatgcag ttgagcgctg aaggttggta cttgtaccga 60 ctggatgagc agcgaacggg tgagtaacgc gtggggaatc tgcctttgag cgggggacaa 120 catttggaaa cgaatgctaa taccgcataa aaactttaaa cacaagtttt aagtttgaaa 180 gatgcaattg catcactcaa agatgatccc gcgttgtatt agctagttgg tgaggtaaag 240 gctcaccaag gcgatgatac atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttgggactga 300 gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat ggacgaaagt 360 ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttggtag 420 agaagaacgt tggtgagagt ggaaagctca tcaagtgacg gtaactaccc agaaagggac 480 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat 540 tgggcgtaaa gcgagcgcag gtggtttat aagtctggtg taaaaggcag tggctcaacc 600 attgtatgca ttggaaactg gtagacttga gtgcaggaga ggagagtgga attccatgtg 660 tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggcct 720 gtaactgaca ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgagtg ctagatgtag 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tgtacacacc gcccgtcaca 1380 ccacgggagt tgggagtacc cgaagtaggt tgcctaaccg caaggagggc gctcctaagt 1440 agcccagtgt 1450 <210> 7 <211> 1508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum KR184825.1 <400> 7 tttttttttt tttcttcaga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacga 60 actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg 120 agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca cctgggaaaca gatgctaata 180 ccgcataaca acttggaccg catggtccga gcttgaaaga tggcttcggc tatcactttt 240 ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac 300 gtagccgacc tgagagggta atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac 360 gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt 420 gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt 480 aactgttcag gtattgacgg tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 540 cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600 cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg 660 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Claims (19)
상기 유산균은 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics)인, 염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.spinach; Juice of the spinach; and a lactic acid bacteria fermentation product of fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of spinach or spinach juice,
A pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation, wherein the lactic acid bacteria are Lactococcus lactics.
상기 유산균은 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactics)인, 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.spinach; Juice of the spinach; and a lactic acid bacteria fermentation product of fermentation raw material containing at least one selected from the group consisting of dried powder of spinach or spinach juice,
A food composition for preventing or improving inflammation, wherein the lactic acid bacteria are Lactococcus lactics.
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