KR102590905B1 - Exosome expressing COVID-19 Antigen protein and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로는 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀, 이의 제조방법, 코로나19 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물 또는 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법에 관한 것으로, 이와 관련된 백신, 치료제 또는 진단 등의 COVID-19 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다. The present invention relates to exosomes expressing COVID-19 antigen proteins and their uses. Specifically, it relates to exosomes expressing COVID-19 antigen proteins, methods for producing them, compositions for quantifying exosomes expressing COVID-19 proteins, or methods for providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes, and related vaccines, treatments, or diagnostics. It can be useful in research and development and commercialization related to COVID-19.

Description

코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 및 이의 용도{Exosome expressing COVID-19 Antigen protein and use thereof}Exosome expressing COVID-19 antigen protein and use thereof {Exosome expressing COVID-19 Antigen protein and use thereof}

본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to exosomes expressing COVID-19 antigen proteins and their uses.

신종 코로나 바이러스는 전례 없는 전파율로 전 세계 누적 확진자 300만 명, 피해국가 200개국을 넘어서고 있으며, 감염병 위기 경보의 최고 단계인 팬데믹이 선언되었다. 신종 코로나 바이러스인 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome corona-virus 2, SRAS-CoV-2)에 감염되면 면역 과잉 반응인 사이토카인 폭풍(cytokine storm)이 발생하는 등 생명을 위협하는 심각한 증상에 대한 보고가 잇따르고 있어 안전한 백신제 치료제 개발이 필요하다. The new coronavirus has an unprecedented spread rate, exceeding 3 million confirmed cases worldwide and over 200 affected countries, and a pandemic has been declared, the highest level of infectious disease crisis warning. Infection with the new coronavirus, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SRAS-CoV-2), can cause a life-threatening immune response, such as a cytokine storm. As reports of serious symptoms continue to emerge, the development of safe vaccine treatments is necessary.

현재 항염증 치료제로는 스테로이드 계열의 글루코코르티코이드 및 비스테로이드성 항염증제가 주로 사용되는데 자가면역질환 치료제로 사용되는 TNF 차단제 및 말라리아 치료제인 클로로퀸 또는 염증반응을 억제하는 효과가 있다. 하지만 그 자체로 세포 흡수되는 비율이 매우 낮아 제한적인 효과를 보이며 이러한 항염증 치료제의 적절한 전달체가 필요한 상황이다. Currently, anti-inflammatory treatments include steroid-type glucocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs, which are effective in suppressing inflammatory responses such as TNF blockers and chloroquine, a malaria treatment. However, the rate of cellular absorption by itself is very low, showing limited effectiveness, and an appropriate delivery system for these anti-inflammatory treatments is needed.

현재 신종 코로나 바이러스의 백신제 또는 치료제를 개발하기 위하여는 고위험군으로 속하는 SARS-CoV-2 배양체가 연구에 활용되기 때문에 생물안전 3등급 연구시설(Biological Safety Level 3, BSL 3) 이상의 시설이 필요하고, 제한적인 연구 시설에서만 연구가 가능하여, 속한 백신 또는 치료제 개발이 불가능한 상황이다. 따라서 코로나19의 백신제 또는 치료제 개발의 가속화를 위한, in vitro / in vivo assay 개발을 위한 안전한 바이러스 대체제가 필요하다. Currently, in order to develop a vaccine or treatment for the new coronavirus, a biosafety level 3 research facility (Biological Safety Level 3, BSL 3) or higher is required because SARS-CoV-2 cultures, which belong to a high-risk group, are used for research. Research is only possible in limited research facilities, making it impossible to develop a vaccine or treatment. Therefore, a safe virus alternative is needed for the development of in vitro / in vivo assays to accelerate the development of vaccines or treatments for COVID-19.

엑소좀은 세포가 외부로 분비하는 30-200nm 크기의 이중막 구조체로 단백질, 지질, 핵산, 대사물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질을 포함하고 있다. 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지는 확실히 밝혀진 바가 없으나, B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 줄기세포 및 종양세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다.Exosomes are double-membrane structures with a size of 30-200 nm that cells secrete to the outside and contain a variety of biologically active substances such as proteins, lipids, nucleic acids, and metabolites. Although it is not clear by what molecular mechanism exosomes are created, various types of immune cells, including B-lymphocytes, T-lymphocytes, dendritic cells, megakaryocytes, and macrophages, as well as stem cells and It is known that tumor cells also produce and secrete exosomes while alive.

엑소좀에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합 (fusion) 혹은 내포작용(endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 또한 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들을 분석하여 특정 질환의 진단에 이용될 수도 있다.Exosomes contain various proteins, DNA, and RNA within cells. Substances contained in these exosomes and secreted out of the cell are re-introduced into other cells through fusion or endocytosis with the cell membrane and serve as intercellular communicators. In addition, the substances contained in these exosomes and secreted outside the cells can be analyzed and used to diagnose specific diseases.

또한 엑소좀을 활용하여 바이러스 유래 단백질 및 핵산을 전달하게 되면 바이러스 유사체(Virus Like Particle, VLP)형태로 안전하게 감염의 위험이 없이 치료제 개발을 위한 연구가 가능하다. 하지만 엑소좀은 바이러스와 유사한 사이즈로 현재 기술로는 정확한 정량 및 정성 분석의 어려움이 있다. 신종 코로나 바이러스의 백신제 또는 치료제 개발을 위한, 필수적인 효능 평가 및 제품 품질 평가를 위하여는 엑소좀의 정확한 정량, 정성 분석이 필수적이며 신뢰성 있는 엑소좀 분석 기술 확보가 요구된다. In addition, by using exosomes to deliver virus-derived proteins and nucleic acids, research to develop treatments is possible safely without the risk of infection in the form of virus-like particles (VLP). However, exosomes are similar in size to viruses, making accurate quantitative and qualitative analysis difficult with current technology. For the development of vaccines or treatments for the new coronavirus, accurate quantitative and qualitative analysis of exosomes is essential for essential efficacy evaluation and product quality evaluation, and securing reliable exosome analysis technology is required.

1. Jessica A Plante et al.　Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness.　Nature.　2020. Oct 26.1. Jessica A Plante et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature. 2020. Oct 26.

이에 본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 제공하는 것을 목적으로 한다. Accordingly, the purpose of the present invention is to provide exosomes expressing COVID-19 antigen proteins.

더욱 구체적으로는 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터로, 양 LTR (Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로, RRE-CPP/CTS - CMV 프로모터 - 엑소좀 마커 유전자 - 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자-형광단백질 유전자 - WPRE;를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 엑소좀 생산 세포 및 상기 엑소좀 생산 세포에서 추출된 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제공하는 것을 목적으로 한다. More specifically, it is a recombinant expression vector for expressing a fusion protein of an exosome expression protein and a COVID-19 antigen protein, in order from 5' to 3' between both LTRs (long terminal repeats), RRE-CPP/CTS - CMV promoter - Exo A recombinant expression vector containing a small marker gene - a COVID-19 antigen protein coding gene - a fluorescent protein gene - WPRE; an exosome-producing cell transformed with the recombinant expression vector; and a COVID-19 antigen protein extracted from the exosome-producing cell. The purpose is to provide expressing exosomes.

또한 본 발명은 상기 엑소좀을 포함하는 코로나19 항원 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. Another object of the present invention is to provide a composition for quantifying exosomes expressing COVID-19 antigen protein, including the exosomes.

또한 본 발명은 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Additionally, the present invention aims to provide a method for providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes.

또한 본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Additionally, the present invention aims to provide a method for producing exosomes expressing COVID-19 antigen proteins.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터로서, 양 LTR (Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로,A recombinant expression vector for expressing a fusion protein of an exosome expression protein and a COVID-19 antigen protein, in order from 5' to 3' between both LTRs (long terminal repeats),

RRE-CPP/CTS - CMV 프로모터 - 엑소좀 마커 유전자 - 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자-형광단백질 유전자 - WPRE;를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터에서 RRE는 Rev-response element이며, CPP/CTS는 Central polypurine tract/central termination sequence이고, WPRE는 Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element이다. It provides a recombinant expression vector containing RRE-CPP/CTS - CMV promoter - exosome marker gene - COVID-19 antigen protein coding gene - fluorescent protein gene - WPRE. In the recombinant expression vector, RRE is a Rev-response element, CPP/CTS is a Central polypurine tract/central termination sequence, and WPRE is a Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 코로나 19 항원 단백질 코딩 유전자는 스파이크(Spike, S) 유전자 또는 상기 스파이크 돌연변이 유전자 일 수 있다. In one example of the present invention, the COVID-19 antigen protein coding gene may be the Spike (S) gene or the spike mutant gene.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 엑소좀 마커 유전자는 CD9, CD63 또는 CD81로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. In one example of the present invention, the exosome marker gene may be any one or more selected from the group consisting of CD9, CD63, or CD81.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 형광 단백질 유전자는 루시퍼라아제(Luciferase, Luc), 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, 노랑형광단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 노랑형광단백질(enhanced Yellow fluorescent protein, EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, 청색형광단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced Cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, PS-CFP2, 빨강 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, 파랑형광단백질(Blue fluorescent protein, BFP), mTag BFP, mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein), 노랑녹색형광단백질(Yellow-green fluorescent protein, mNeongreen), 밝은 형광단백질(Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i), 엠플럼(mplum), 엠체리(monomeric cherry fluorescent protein, mcherry), PAmcherry, 엠스트로베리(mStrawberry), 엠오렌지(mOrange), PSmOrange, 엠라 지베리(mRasberry), 엠케이트(mKate), mKate2, 엠티에프피(mTFP), 엠넵튠(mNeptune), 엠루비(mRubby), mRubby2, 엠바나나(mBanana), 디에스레드, 엠시트린(mCitrine), 에메랄드(Emerald), 티-사파이어(T-Sapphire), 엠에플(mApple), 엠그레이프(mgrape), 비너스(Venus), 토페즈(Topaz), 제이-레드(J-Red), 티디토마토 (tdTomato), mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede , KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow 및 세루리안(Cerulean)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있다. In one example of the present invention, the fluorescent protein gene is luciferase (Luc), green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Yellow fluorescent protein (YFP), enhanced Yellow fluorescent protein (EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, blue fluorescent protein (Cyan fluorescent protein, CFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, PS-CFP2, Red fluorescent protein (RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, Blue fluorescent protein (BFP), mTag BFP, mBFP (metagenome-derived blue fluorescent protein), Yellow-green fluorescent protein (mNeongreen), Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i, plum, monomeric cherry fluorescent protein, mcherry, PAmcherry, mStrawberry, mOrange, PSmOrange, mRasberry, M mKate, mKate2, mTFP, mNeptune, mRubby, mRubby2, mBanana, DSthread, mCitrine, Emerald, T- T-Sapphire, mApple, mgrape, Venus, Topaz, J-Red, tdTomato, mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. It may be one or more types selected from the group consisting of IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede, KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow, and Cerulean.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 엑소좀 생산 세포를 제공한다. The present invention also provides exosome-producing cells transformed with the above recombinant expression vector.

또한 본 발명은 상기 엑소좀 생산 세포에서 추출된 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제공한다. Additionally, the present invention provides exosomes expressing the COVID-19 antigen protein extracted from the exosome-producing cells.

또한 본 발명은 상기 엑소좀을 포함하는 코로나19 항원 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물을 제공한다. Additionally, the present invention provides a composition for quantifying exosomes expressing COVID-19 antigen protein, including the exosomes.

또한 본 발명은 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법으로서,In addition, the present invention is a method of providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes,

1) COVID-19 관련 시료와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커를 발현하는 엑소좀을 단일 입자로 추출하는 단계; 1) Extracting exosomes expressing CD9, CD63, and CD81 exosome markers from COVID-19-related samples and the composition for quantifying exosomes into single particles;

2) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 단일입자의 엑소좀 표면에서 발현되는 코로나19 항원 단백질 발현 및 엑소좀 개수를 측정하는 단계; 및 2) measuring the expression of COVID-19 antigen protein and the number of exosomes expressed on the surface of exosomes of single particles separated from the COVID-19 related sample of step 1) and the composition for quantifying exosomes; and

3) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료에서 분리된 엑소좀 단일 입자수와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 엑소좀 단일 입자수를 비교하는 단계;3) Comparing the number of exosome single particles isolated from the COVID-19 related sample in step 1) with the number of exosome single particles separated from the composition for quantifying exosomes;

를 포함하는 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법을 제공한다. Provides a method of providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes, including.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 2) 단계는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 실시간 형광이미징 방법 (Real time Fluorescence Imaging Method), 유세포 분석기(FACS, Flow Cytometry) 및 단백질칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 수행될 수 있다. In one example of the present invention, step 2) is performed using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, real-time fluorescence imaging method, and flow cytometry (FACS). It can be performed with any one selected from the group consisting of flow cytometry and protein chip.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 2) 단계의 측정은 엑소좀의 단일 입자에 결합된 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 형광표지로 수행하는 것일 수 있다.In one example of the present invention, the measurement in step 2) may be performed using fluorescent labels of CD9, CD63, and CD81 exosome markers bound to single particles of exosomes.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 2)단계는 상기 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 신호 강도를 이용하여 엑소좀의 입자크기 또는 크기분포를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. In one example of the present invention, step 2) may further include measuring the particle size or size distribution of exosomes using the signal intensities of the CD9, CD63, and CD81 exosome markers.

또한 본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제조 방법으로서In addition, the present invention provides a method for producing exosomes expressing COVID-19 antigen proteins.

a) 엑소좀 생산 세포에 엑소좀 마커 유전자와 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 엑소좀 생산 세포에 형질 전환하는 단계;a) Transforming the exosome-producing cell with a recombinant expression vector containing an exosome marker gene and a COVID-19 antigen protein coding gene;

b) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 코로나19 항원 단백질을 발현하는 단계; 및b) culturing the transformed cells to express COVID-19 antigen protein; and

c) 상기 b) 단계의 배양된 세포에서 엑소좀을 추출하는 단계;c) extracting exosomes from the cultured cells in step b);

를 포함하는 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조 방법을 제공한다. Provides a method for producing exosomes expressing a COVID-19 antigen protein comprising.

본 발명의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀은 신종 코로나 바이러스의 백신제 또는 치료제 개발을 위한 필수적인 효능 평가 및 제품 품질 평가 또는 전임상 시험 성능평가 물질로 유용하게 사용할 수 있다. Exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of the present invention can be usefully used as an essential efficacy evaluation, product quality evaluation, or preclinical test performance evaluation material for the development of a vaccine or treatment for the novel coronavirus.

또한 본 발명의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 제조방법은 복잡한 과정 없이 신속하고 효율적으로 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 고순도 또는 고효율로 수득할 수 있다. In addition, the method for producing exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of the present invention can quickly and efficiently obtain exosomes expressing the COVID-19 antigen protein with high purity or high efficiency without complicated processes.

또한 본 발명의 코로나19 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물은 SARS-CoV-2 엑소좀 정성 및 정량 분석이 가능하여, 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용될 수 있다. In addition, the composition for quantifying COVID-19 protein-expressing exosomes of the present invention is capable of qualitative and quantitative analysis of SARS-CoV-2 exosomes, and can be usefully used for related research and development and commercialization.

또한 본 발명의 정보의 제공방법은 COVID-19 관련 시료에서 증가된 엑소좀을 효과적으로 측정 또는 정량이 가능하므로 SARS-CoV-2 진단 또는 SARS-CoV-2 관련 질환 진단에도 유용하게 사용이 가능하다. In addition, the information provision method of the present invention can effectively measure or quantify exosomes increased in COVID-19-related samples, so it can be usefully used for SARS-CoV-2 diagnosis or SARS-CoV-2-related disease diagnosis.

도 1은 본 발명의 실시예 1-1의 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터에 있어, 상기 엑소좀 발현 단백질을 코딩하는 엑소좀 마커 유전자이며, 엑소좀 발현 유전자인 CD63 유전자가 렌티바이러스 벡터에 삽입된 것을 PCR 후 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제조하는 절차를 도시화 한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 면역형광법 또는 유세포 분석기에 사용된 엑소좀 마커 형광 표지인자에 대해 도시화한 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 형광법을 이용한 이미징 기반으로 분석인 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 유세포 분석기(FACS)기반 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 5A는 FACS에서 입자나 세포의 크기를 비례하는 FSC(Forward scatter)와 FACS에서 세포내 과립의 수나 핵의 접혀진 정도에 비례하는 SSC(Side scatter) 산란광(light scatter)에 따른 형광표지에 대한 신호를 도트 플랏(Dot plot) 그래프로 나타낸 것이며, 도 5B는 엑소좀의 유무를 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 형광표지 개수를 정량화하여 막대그래프 나타낸 것이다.Figure 1 is an exosome marker gene encoding the exosome expression protein in a recombinant expression vector expressing a fusion protein of the exosome expression protein and COVID-19 antigen protein of Example 1-1 of the present invention, and exosome expression This shows the results of confirming that the CD63 gene was inserted into the lentiviral vector by PCR followed by electrophoresis.
Figure 2 shows an illustration of the procedure for producing exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 of the present invention.
Figure 3 illustrates exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 of the present invention with respect to the exosome marker fluorescent marker used in immunofluorescence or flow cytometry.
Figure 4 shows the results of confirming exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 of the present invention using a confocal microscope, which is an analysis based on imaging using a fluorescence method.
Figure 5 shows the results of confirming exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 of the present invention by quantitative analysis of SARS-CoV-2 exosomes based on flow cytometry (FACS). Specifically, Figure 5A shows fluorescence labeling according to forward scatter (FSC), which is proportional to the size of particles or cells in FACS, and side scatter (SSC) light scatter, which is proportional to the number of intracellular granules or the degree of folding of the nucleus in FACS. The signal for is shown in a dot plot graph, and Figure 5B is a bar graph showing the presence or absence of exosomes by quantifying the number of fluorescent labels of CD9, CD63, and CD81 exosome markers.

이하에서 본 발명에 대해 내용을 구체적으로 설명한다Below, the present invention will be described in detail.

이하 첨부된 도면들을 포함한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples including the attached drawings. However, the following examples are only a reference for explaining the present invention in detail, and the present invention is not limited thereto, and may be implemented in various forms.

또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. Additionally, unless otherwise defined, all technical and scientific terms have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. The terminology used in the description herein is merely to effectively describe specific embodiments and is not intended to limit the invention.

또한 명세서 및 첨부된 특허 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. Additionally, as used in the specification and appended claims, the singular forms “a,” “an,” and “the” are intended to also include the plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.

본 발명에서 용어 '엑소좀(Exosome)'이란 세포밖 소포체로, 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 세포 밖으로 분비되는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 의미하기도 한다. 상기 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합(fusion) 혹은 내포작용(endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 여러 종류의 microRNA가 포함되어 있으며, 항원을 포함하기도 한다. 한편, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에서는 다낭체를 포함해 막구조를 가지는 세포 내 구획에서 항원 펩티드가 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 II 분자에 선적되기 때문에 이로부터 기원되는 엑소좀도 항원 펩티드-MHC 클래스 II 컴플렉스를 가지고 있다. 따라서, 엑소좀은 면역원(immunogen)의 수송체로서 CD4+ T 림프구에 항원 펩티드를 제시할 수 있고, 그에 따라 림프구의 증식과 같은 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 엑소좀에는 MHC 클래스 I, 열 충격 단백질(HSPs; heat-shock proteins) 등 면역 반응을 자극시킬 수 있는 능력을 가진 분자들이 농축되어 있다.In the present invention, the term 'exosome' refers to an extracellular vesicle that contains various proteins, DNA, RNA, etc. within the cell. It also refers to small vesicles with a membrane structure of 50 - 200 nm in size that are secreted outside the cell. Substances contained in the exosomes and secreted outside the cell are re-introduced into other cells through fusion or endocytosis with the cell membrane and serve as intercellular communicators. It contains several types of microRNA and also contains antigens. Meanwhile, in antigen presenting cells (APC), antigen peptides are loaded onto MHC (major histocompatibility complex) class II molecules in intracellular compartments with membrane structures including multicystic bodies, so exosomes originating from them also contain antigens. Contains a peptide-MHC class II complex. Therefore, exosomes, as transporters of immunogen, can present antigen peptides to CD4+ T lymphocytes, thereby inducing an immune response such as proliferation of lymphocytes. Additionally, exosomes are concentrated in molecules with the ability to stimulate immune responses, such as MHC class I and heat-shock proteins (HSPs).

이와 같이 엑소좀은 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질로 이루어져 있으며 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행하여 식품의약품안정처에서도 세포밖 소포체를 이용한 치료제 품질, 비임상 및 임상 평가 가이드라인을 제시한바 있다. As such, exosomes are made up of various substances that exhibit biological activity and perform various physiological and pathological functions, so the Ministry of Food and Drug Safety has proposed guidelines for the quality, non-clinical and clinical evaluation of treatments using extracellular vesicles.

본 발명에서의 엑소좀은 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터를 상기 엑소좀을 생산할 수 있는 엑소좀 생산 세포에 형질주입(Transfection) 후 배양 한 다음 분리 및 정제한 바이러스 유사체 기반 엑소좀을 의미할 수 있다. 또한 본 발명의 엑소좀에는 코로나19 항원 단백질이 엑소좀 표면에 발현 또는 포함되어 있으며, 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 의미하기도 한다. 또한 본 발명에서 상기 엑소좀은 SARS-CoV-2 엑소좀과 동일한 의미로 사용할 수 있다. The exosome in the present invention is a recombinant expression vector for expressing a fusion protein of an exosome expression protein and a COVID-19 antigen protein. It may refer to exosomes based on virus analogs that are cultured after transfection into exosome-producing cells capable of producing the exosomes, and then isolated and purified. In addition, the exosome of the present invention expresses or contains the COVID-19 antigen protein on the surface of the exosome, and also refers to an exosome expressing the COVID-19 antigen protein. Additionally, in the present invention, the exosome can be used in the same sense as SARS-CoV-2 exosome.

본 발명에서 용어 '엑소좀 마커 유전자'는 엑소좀을 발현 단백질을 코딩하는 유전자 또는 엑소좀 발현 유전자를 의미하며, CD9, CD63 또는 CD81로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다. In the present invention, the term 'exosome marker gene' refers to a gene encoding an exosome expression protein or an exosome expression gene, and may be any one or more selected from the group consisting of CD9, CD63, or CD81.

상기 엑소좀 마커는, 엑소좀을 발현하는 단백질 또는 엑소좀의 막에 풍부하게 존재하는 단백질을 의미한다. 4개의 막통과(transmembrane) 영역과 두 개의 세포 외 고리(extracellular loop)를 가지는 테트라스파닌(Tetraspanin, TSPAN) 계열(Familiy)의 단백질을 의미하기도 한다. The exosome marker refers to a protein expressing exosomes or a protein abundantly present in the membrane of exosomes. It also refers to a protein of the Tetraspanin (TSPAN) family that has four transmembrane domains and two extracellular loops.

본 발명에서 '코로나19 항원 단백질' 이란 코로나19 바이러스, SARS-CoV-2의 바이러스의 구조 단백질인, 스파이크(Spike, S) 단백질을 의미할 수 있다. 상기 코로나19 항원 단백질은 코로나19 바이러스 항원 단백질과 동일의미로 사용될 수 있다. SARS-CoV-2의 유전체는 9,860개의 아미노산을 암호화하는 29,891개의 뉴클레오타이드의 +ssRNA로서 양쪽 끝이 5'-capping structure 및 3'-poly-A tail로 구성된다. Spike(S) 단백질의 S1 부분의 Receptor binding domain (RBD)과 숙주 세포의 ACE2(Angiotensin converting enzyme 2)와 결합해 숙주 세포의 세포질 내로 들어간다. ACE2는 구강과 비강 점막, 비인두, 폐, 위, 소장, 대장 등에 많이 분포하고 있으며, SARS-CoV-2 바이러스성 폐렴의 시료에서 대다수에서 관찰되어 SARS-CoV-2의 백신 또는 치료제에 있어 중요하다. 또한 상기 스파이크 단백질에는 항원 결정기 프로파일이 존재한다. In the present invention, 'COVID-19 antigen protein' may refer to the Spike (S) protein, which is a structural protein of the COVID-19 virus and SARS-CoV-2 virus. The COVID-19 antigen protein may be used in the same sense as the COVID-19 virus antigen protein. The SARS-CoV-2 genome is a +ssRNA of 29,891 nucleotides that encodes 9,860 amino acids, and consists of a 5'-capping structure and a 3'-poly-A tail at both ends. It combines with the Receptor binding domain (RBD) of the S1 part of the Spike (S) protein and ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2) of the host cell and enters the cytoplasm of the host cell. ACE2 is widely distributed in the oral and nasal mucosa, nasopharynx, lungs, stomach, small intestine, and large intestine, and is observed in the majority of SARS-CoV-2 viral pneumonia samples, making it important for vaccines or treatments for SARS-CoV-2. do. Additionally, the spike protein has an antigenic determinant profile.

더욱 구체적으로 상기 스파이크 유전자는 수용체 결합을 형성하는 두개의 서브 유닛인 S1과 S2로 구성되며, 상기 S1은 S1A, S1B 및 S1C로 구성된다. More specifically, the spike gene is composed of two subunits, S1 and S2, which form receptor binding, and S1 is composed of S1A, S1B, and S1C.

또한 상기 '코로나19 항원 단백질'은 돌연변이 유전자를 발현하는 단백질 또는 스파이크 단백질 돌연변이를 의미를 추가적으로 포함할 수 있다. In addition, the 'COVID-19 antigen protein' may additionally mean a protein expressing a mutant gene or a spike protein mutation.

본 발명에서 '코로나19 항원 단백질 코딩 유전자'는 스파이크(Spike, S) 유전자 또는 상기 스파이크 돌연변이 유전자 일 수 있다. In the present invention, the 'COVID-19 antigen protein coding gene' may be the Spike (S) gene or the spike mutant gene.

상기 스파이크 유전자는 참조서열(Reference sequence) 스파이크 유전자 또는 참조 서열 기준 돌연변이가 일어나지 않은 스파이크 유전자를 의미할 수 있다.The spike gene may refer to a reference sequence spike gene or a spike gene in which no mutation has occurred based on the reference sequence.

상기 스파이크 돌연변이 유전자는 참조서열의 스파이크(spike, S) 유전자에서 염기서열이 치환 결실 또는 삽입된 유전자를 의미하기도 하며, 상기 참조서열은 일 예로 QHD43416.1 또는 MN 908947 일 수 있으며, 2019년 초기에 확인된 SARS-CoV-2 유전체 서열 일 수 있다. The spike mutant gene also refers to a gene in which a nucleotide sequence is substituted, deleted, or inserted in the spike (S) gene of the reference sequence, and the reference sequence may be, for example, QHD43416.1 or MN 908947, in early 2019. It may be a confirmed SARS-CoV-2 genome sequence.

본 발명에서 스파이크 돌연변이 유전자는 스파이크 단백질 돌연변이 유전자를 의미 하며, 일 예로 상기 스파이크 유전자의 S1의 수용체 결합 부분(319~541 aa)에서, 돌연변이 부분 유전자, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I, N437S, I468T, D614G, S721V Q, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, S12F, C15F, R21T, T22I, T29I, G35V, T30I, S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S247R, D253G, S254F, S255F, S256P, W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, N501Y, H519Q, P521S, A522V, P621S, T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G 또는 D1163G 일 수 있다. 바람직하게는 D614G, N501Y 또는 S477N의 병원성 돌연변이 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실시예에서는 D614G 스파이크 돌연변이 유전자를 사용하였다. In the present invention, the spike mutant gene refers to a spike protein mutant gene, for example, in the receptor binding portion (319-541 aa) of S1 of the spike gene, the mutant partial gene, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I, N437S, I468T, D614G, S721V Q, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, S1 2F, C15F, R21T, T22I, T29I, G35V , T30I, S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S2 47R, D253G, S254F, S255F , S256P, W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, N501Y, H519Q, P521S, A522V , P621S, T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G or D1163G. Preferably, it may be a pathogenic mutation of D614G, N501Y or S477N, but is not limited thereto. In the examples, the D614G spike mutant gene was used.

본 발명에서 '벡터'는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물인 재조합 발현 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 통상적인 플라스미드 벡터 일 수 있으며, 프로모터 등과 같은 발현 조절 요소들을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 상기 렌티바이러스는 상기 렌티바이러스와 유사한 레트로바이러스와 달리, 그 자체로 비독성이며 일생의 감염 과정 동안 다양한 속도로 지속적으로 복제가 가능하다. In the present invention, 'vector' refers to a recombinant expression vector, which is a gene construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. The vector may be a conventional plasmid vector and may contain expression control elements such as a promoter. More specifically, it refers to a lentiviral vector. Unlike retroviruses similar to the lentivirus, the lentivirus is non-virulent in itself and is capable of continuously replicating at various rates during the course of a lifetime infection.

본 발명은 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터로서, 양 LTR(Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로,The present invention is a recombinant expression vector for expressing a fusion protein of an exosome expression protein and a COVID-19 antigen protein, in order from 5' to 3' between both long terminal repeats (LTRs),

RRE-CPP/CTS - CMV 프로모터 - 엑소좀 마커 유전자 - 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자-형광단백질 유전자 - WPRE;를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. It provides a recombinant expression vector containing RRE-CPP/CTS - CMV promoter - exosome marker gene - COVID-19 antigen protein coding gene - fluorescent protein gene - WPRE.

상기 RRE는 Rev-response element, Rev 응답요소이고, 상기 CPP/CTS는 Central polypurine tract/central termination sequence, CPP/CTS 서열이며, 상기 WPRE는 Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, 바이러스 전사 후 조절요소이다. The RRE is a Rev-response element, a Rev response element, the CPP/CTS is a Central polypurine tract/central termination sequence, a CPP/CTS sequence, and the WPRE is a Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, a viral post-transcriptional regulatory element. .

상기 LTR은 긴 말단 반복부위(Long terminal repeat)로, 구체적으로는 렌티 바이러스의 유전자의 발현 (예를 들어, 촉진, 개시 및 유전자 전사물의 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. 상기 LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 시그날 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함한 다수의 조절 시그날을 함유한다. 양 LTR은 5'의 5'LTR과 3'의 3'LTR 를 의미하며, 상기 5'LTR은 바이러스 유사체의 바이러스 팩키징과 전사에 필요한 요소이며, 상기 3'LTR(3′ Long terminal repeat)은 역전사에 필요한 요소이다. The LTR is a long terminal repeat, and specifically provides basic functions for lentiviral gene expression (eg, promotion, initiation, and polyadenylation of gene transcripts) and virus replication. The LTR contains a number of regulatory signals, including transcriptional regulatory elements, polyadenylation signals, and sequences required for replication and integration of the viral genome. Both LTRs refer to the 5'LTR of the 5' and the 3'LTR of the 3', where the 5'LTR is an element required for viral packaging and transcription of the viral analogue, and the 3'LTR (3' long terminal repeat) is a reverse transcription It is a necessary element.

상기 재조합 발현 벡터에 있어, 상기 RRE(Rev-response element)는 스플라이싱(splicing) 과정을 거치지 않은 viral RNA (unspliced virus RNA)의 핵 외로의 이동을 증가시켜 바이러스 유전자를 발현할 수 있도록 한다. 상기 CPP/CTS (Central polypurine tract/central termination sequence)는 viral genome이 핵 내로 유입 되는 것을 촉진시켜 vector의 완성(integration), 핵 전위 증가 (nuclear translocation) 형질주입 효율을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 WPRE(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)는 viral genomic RNA에 작용하여 vector packaging 효율을 높일 수 있으며 이는 본 발명에 있어서는 SARS-CoV-2의 바이러스 유사체 기반 엑소좀 생성 효율을 높일 수 있다. In the recombinant expression vector, the RRE (Rev-response element) increases the movement of unspliced viral RNA out of the nucleus, allowing expression of viral genes. The CPP/CTS (Central polypurine tract/central termination sequence) can promote the entry of the viral genome into the nucleus, thereby increasing vector integration, nuclear translocation, and transfection efficiency. In addition, the WPRE (Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element) can increase vector packaging efficiency by acting on viral genomic RNA, which can increase the efficiency of exosome production based on viral analogs of SARS-CoV-2 in the present invention.

상기 재조합 발현 벡터에 있어, 상기 CMV 프로모터는 COVID-19 바이러스, SARS-CoV-2의 유전자인 SARS-CoV-2의 스파이크 유전자 또는 상기 스파이크 돌연변이 유전자를 엑소좀 생산 세포에서 특이적으로 발현시킬 수 있다. In the recombinant expression vector, the CMV promoter can specifically express the COVID-19 virus, the spike gene of SARS-CoV-2, which is the gene of SARS-CoV-2, or the spike mutant gene in exosome-producing cells. .

상기 재조합 발현 벡터에 있어, 상기 형광 단백질 유전자는 루시퍼라아제(Luciferase, Luc), 녹색형광단백질 (Green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, 노랑형광단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 노랑형광단백질(enhanced Yellow fluorescent protein, EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, 청색형광단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced Cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, PS-CFP2, 빨강 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, 파랑형광단백질(Blue fluorescent protein, BFP), mTag BFP, mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein), 노랑녹색형광단백질(Yellow-green fluorescent protein, mNeongreen), 밝은 형광단 백질(Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i), 엠플럼(mplum), 엠체리(monomeric cherry fluorescentprotein, mcherry), PAmcherry, 엠스트로베리(mStrawberry), 엠오렌지(mOrange), PSmOrange, 엠라 지베리(mRasberry), 엠케이트(mKate), mKate2, 엠티에프피(mTFP), 엠넵튠(mNeptune), 엠루비(mRubby), mRubby2, 엠바나나(mBanana), 디에스레드, 엠시트린(mCitrine), 에메랄드(Emerald), 티-사파이어(T-Sapphire), 엠에플(mApple), 엠그레이프(mgrape), 비너스(Venus), 토페즈(Topaz), 제이-레드(J-Red), 티디토마토 (tdTomato), mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede , KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow 및 세루리안(Cerulean)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 실시예에서는 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)이다. In the recombinant expression vector, the fluorescent protein gene is luciferase (Luc), green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Yellow fluorescent protein (YFP), enhanced Yellow fluorescent protein (EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, blue fluorescent protein ( Cyan fluorescent protein (CFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, PS-CFP2, Red fluorescent protein (RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP , RFP693, tdRFP, Blue fluorescent protein (BFP), mTag BFP, mBFP (metagenome-derived blue fluorescent protein), Yellow-green fluorescent protein (mNeongreen), Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i, plum, monomeric cherry fluorescentprotein, mcherry, PAmcherry, mStrawberry, mOrange, PSmOrange, mRasberry, MKate (mKate), mKate2, mTFP, mNeptune, mRubby, mRubby2, mBanana, DSred, mCitrine, Emerald, T-Sapphire (T-Sapphire), mApple, mgrape, Venus, Topaz, J-Red, tdTomato, mTurquoise, mTurquosie2, mKO , mKO2, mUKG. It may be one or more selected from the group consisting of IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede, KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow, and Cerulean, but is not limited thereto. , In the example, it is green fluorescent protein (GFP).

본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 퓨로마이신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 바람직하게는 암피실린 일 수 있다.The recombinant vector of the present invention may contain an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, puromycin, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, and geneti. There are genes for resistance to acid, neomycin, and tetracycline. Preferably it may be ampicillin.

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 엑소좀 생산 세포를 제공한다. 본 발명에서 '형질 전환'과 '형질 주입'은 상호 교환적으로 사용된다. 상기 형질전환 또는 형질주입 하기 위한 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator), G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 주입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 숙주 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 당 분야에 인식된 다양한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.The present invention provides exosome-producing cells transformed with the above recombinant expression vector. In the present invention, 'transformation' and 'transfection' are used interchangeably. Methods for the transformation or injection include various conventionally known methods, for example, microinjection, electroporation, particle bombardment, and sperm-mediated gene method. transfer), viral infection, direct muscle injection, insulator, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin , cationic phospholipid nanoparticles, cationic polymers, cationic micelles, cationic emulsions, or liposomes can be injected into cells together with delivery reagents, or conjugated with biocompatible polymers such as polyethylene glycol to increase absorption into host cells. However, it is not limited to this. Additionally, it can be appropriately selected and applied from among various techniques recognized in the art.

본 발명에서 용어 '엑소좀 생산 세포'란 상기 엑소좀을 생산할 수 있는 숙주세포(host cell)를 의미힌다. 본 발명에 있어서 엑소좀 생산 세포는 제한되지 않으나, 예를 들면 B 림프구, T 림프구, 수지상세포, 거대핵세포, 대식세포, CHO(Chinese hamster ovary) 세포주 NS0(mouse myeloma), BHK(baby hamster kidney)와 같은 동물세포주 또는 HEK 293T와 같은 인간세포주 일 수 있으나, 바람직하게는 인간 신장 세포주이며, 불멸화세포주(Immortalized cell line)의 일종인 HEK 293T 이다. 상기 HEK 293T 세포 일 경우, 293세포에 SV40 Large T-antigen가 들어갔으며 이것은 SV40 origin of replication이 들어 있는 plasmid의 복제를 가능하여, 재조합 단백질 또는 코로나 19 항원 단백질과 엑소좀을 고효율로 고발현 시킬 수 있다. 또한 상기 재조합 벡터가 렌티바이러스 벡터이며, 양 LTR' 안에 RRE(Rev-response element), CPP/CTS(Central polypurine tract/central termination sequence), CMV 프로모터 또는 WPRE(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)가 포함되어 있어 상기 엑소좀 생산 세포에 형질 주입하였을 때 SARS-CoV-2의 실제 시료와 유사하면서 안전한 바이러스 유사체(VLP, Virus Like Particle), 엑소좀 기반 SARS-CoV-2의 바이러스 유사체 또는 안전한 SARS-CoV-2의 바이러스 대체제가 형성될 수 있으며, 이로 인해 SARS-CoV-2의 바이러스 유사체 기반 엑소좀 생성 효율을 높일 수 있다. In the present invention, the term 'exosome producing cell' refers to a host cell capable of producing the exosome. In the present invention, exosome-producing cells are not limited, but include, for example, B lymphocytes, T lymphocytes, dendritic cells, megakaryocytes, macrophages, CHO (Chinese hamster ovary) cell line NS0 (mouse myeloma), and BHK (baby hamster kidney). It may be an animal cell line such as ) or a human cell line such as HEK 293T, but is preferably a human kidney cell line and HEK 293T, a type of immortalized cell line. In the case of the HEK 293T cells, SV40 Large T-antigen was entered into the 293 cells, which enables replication of the plasmid containing the SV40 origin of replication, allowing high efficiency and high expression of recombinant proteins or COVID-19 antigen proteins and exosomes. there is. In addition, the recombinant vector is a lentiviral vector, and an RRE (Rev-response element), CPP/CTS (Central polypurine tract/central termination sequence), CMV promoter, or WPRE (Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element) are contained within both LTRs. It contains a safe virus analogue (VLP, Virus Like Particle) that is similar to the actual sample of SARS-CoV-2 when transfected into the exosome-producing cells, an exosome-based virus analogue of SARS-CoV-2, or a safe SARS-CoV-2 virus analogue. Viral substitutes for CoV-2 can be formed, which can increase the efficiency of exosome production based on viral analogs of SARS-CoV-2.

본 발명은 상기 엑소좀 생산 세포에서 추출된 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제공한다. 상기 엑소좀 생산 세포에서 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 추출은 초원심분리기(Ultracentrifuge)기반, 폴리머(polymer) 등이 포함된 침전 시약 및 0.22μm 진공 필터를 이용한 엑소좀 분리 방법을 이용하여 수득될 수 있으며, 상기 방법을 이용할 경우 순도를 향상 시킨 엑소좀 추출 및 수득이 가능하고, 1시간 이내의 빠른 시간 내로 단일 입자 엑소좀 추출이 가능하다. The present invention provides exosomes expressing the COVID-19 antigen protein extracted from the exosome-producing cells. Exosome extraction expressing the COVID-19 antigen protein from the exosome-producing cells was obtained using an ultracentrifuge-based exosome separation method using a precipitation reagent containing polymer, etc., and a 0.22μm vacuum filter. When using the above method, it is possible to extract and obtain exosomes with improved purity, and single particle exosome extraction is possible within 1 hour.

본 발명은 상기 엑소좀을 포함하는 코로나19 항원 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물을 제공한다. 상기 엑소좀 정량용 조성물은 상기 엑소좀을 측정할 수 있다고 알려진 어떠한 물질도 포함될 수 있다. 상기 조성물에는 검출시약을 더 포함 할 수 있다. 상기 검출시약은 형광물질로 표지된 접합체 일 수 있다. 상기 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 검출시약은 추가로 상기 검출시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 서술한 바와 같은 검출시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.The present invention provides a composition for quantifying exosomes expressing COVID-19 antigen protein, including the exosomes. The composition for quantifying exosomes may include any substance known to be capable of measuring the exosomes. The composition may further include a detection reagent. The detection reagent may be a conjugate labeled with a fluorescent substance. The fluorescent substances include fluorescein carboxylic acid (FCA), fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein thiourea (FTH), Cy3, Cy5, and poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC). ), rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), PE (Phycoerythrin), or rhodamine, but is not limited thereto. The detection reagent may further include a ligand capable of specifically binding to the detection reagent. The ligand may be a streptavidin or avidin-treated ligand. In addition to the detection reagents described above, the composition of the present invention may contain distilled water or a buffer solution to keep their structures stable.

본 발명은 1) COVID-19 관련 시료와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커를 발현하는 엑소좀을 단일 입자로 추출하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 단일입자의 엑소좀 표면에서 발현되는 코로나19 항원 단백질 발현 및 엑소좀 개수를 측정하는 단계; 및 3) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료에서 분리된 엑소좀 단일 입자수와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 엑소좀 단일 입자수를 비교하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법을 제공한다. The present invention includes the steps of 1) extracting exosomes expressing CD9, CD63, and CD81 exosome markers from COVID-19-related samples and the composition for quantifying exosomes into single particles; 2) measuring the expression of COVID-19 antigen protein and the number of exosomes expressed on the surface of exosomes of single particles separated from the COVID-19 related sample of step 1) and the composition for quantifying exosomes; And 3) comparing the number of exosome single particles isolated from the COVID-19 related sample in step 1) with the number of exosome single particles isolated from the composition for quantifying exosomes; SARS-CoV-2 exo comprising; Provides a method of providing quantitative information.

상기 COVID-19 관련 시료는 엑소좀을 포함하는 COVID-19 관련 시료가 모두 해당되며, 예를 들면 엑소좀이 포함된 COVID-19 관련 세포, 세포 배양액, 혈액 소변 침 일, 엑소좀이 포함된 COVID-19 전임상 또는 임상 시료 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The COVID-19-related samples include all COVID-19-related samples containing exosomes, such as COVID-19-related cells containing exosomes, cell culture fluid, blood, urine and saliva, and COVID-19-related samples containing exosomes. -19 Can be, but is not limited to, preclinical or clinical samples.

상기 정보의 제공방법에 있어, 상기 2) 단계는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 실시간 형광이미징 방법(Real time Fluorescence Imaging Method), 유세포 분석기(Flow Cytometry, FACS) 및 단백질칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 실시간 형광이미징 방법(Real time Fluorescence Imaging Method) 또는 유세포 분석기 (FACS, Flow Cytometry) 일 수 있다. 상기 실시간 형광 이미징 방법은 면역 형광법을 이용하여 공초좀 현미경으로 확인하는 방법 일 수 있으며 상기 방법을 사용할 경우 SARS-CoV-2 엑소좀의 검출 또는 정성 분석이 가능하고 엑소좀 내의 코로나19 항원 단백질의 위치가 확인 가능하다. 또한 상기 실시간 형광 이미징 방법으로 코로나19 항원 단백질 발현 확인 또는 비교가 가능하다. 또한 상기 유세포 분석기를 사용할 경우 COVID-19 엑소좀 정량 분석이 가능하다. In the method of providing the information, step 2) includes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, real-time fluorescence imaging method, and flow cytometry. , FACS) and protein chip, but is not limited thereto. Preferably, it may be a real time fluorescence imaging method or a flow cytometry (FACS) method. The real-time fluorescence imaging method may be a method of confirmation by confocal microscopy using immunofluorescence. When using the method, detection or qualitative analysis of SARS-CoV-2 exosomes is possible and the location of the COVID-19 antigen protein in the exosome is possible. can be checked. Additionally, it is possible to confirm or compare COVID-19 antigen protein expression using the real-time fluorescence imaging method. Additionally, quantitative analysis of COVID-19 exosomes is possible when using the flow cytometer.

상기 정보의 제공방법에 있어, 상기 2) 단계의 엑소좀 개수를 측정은 엑소좀의 단일 입자에 결합된 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 형광 표지로 수행하는 것일 수 있다. In the method of providing the above information, the number of exosomes in step 2) may be measured using fluorescent labels of CD9, CD63, and CD81 exosome markers bound to single particles of exosomes.

상기 정보의 제공방법에 있어, 상기 2)단계는 상기 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 형광 표지 강도를 이용하여 엑소좀의 입자크기 또는 크기 분포를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. In the method of providing the information, step 2) may further include measuring the particle size or size distribution of exosomes using the fluorescence labeling intensity of the CD9, CD63, and CD81 exosome markers.

상기 정보의 제공방법은 코로나19 항원 단백질인 스파이크 단백질 또는 스파이크 단백질 돌연변이를 발현하는 엑소좀이므로, SARS-CoV-2 돌연변이에 대하여 참조서열 기준 돌연변이가 일어나지 않은 스파이크 단백질 발현 정도 비교 또는 상기 참조서열 기준 돌연변이가 일어나지 않은 스파이크 단백질을 발현하는 엑소좀 단일 입자수와 정량 비교를 통하여, SARS-CoV-2 돌연변이의 정량에 대한 정보를 제공할 수 있어, SARS-CoV-2 진단 검출에 있어 유용하게 활용될 수도 있다. The method of providing the above information is exosomes expressing spike protein or spike protein mutation, which is a COVID-19 antigen protein, so comparing the expression level of spike protein without mutation based on the reference sequence for SARS-CoV-2 mutations or mutation based on the reference sequence. Through quantitative comparison with the number of exosome single particles expressing the spike protein that did not occur, information on the quantification of SARS-CoV-2 mutations can be provided, which may be useful in SARS-CoV-2 diagnostic detection. there is.

상기 엑소좀 형광 표지는 일 예로, FITC, Alexa Fluor 488, Fluo-3, PE, ECD, PI, PE-texas Red, PE-efluor 610, PE-Alexa 610, PE-CF594, PE-Dazzle, PC5, PC5.5. PerCP-cy5.5, 7-AAD, Cy5, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC-Alexa 700, APC-H7, APC-cy7, APC-alexa 750, Pacific Blue, BV421, BV480, V450, Pacific Orange, Kromo Orange, BV510 또는 OC515 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. Examples of the exosome fluorescent label include FITC, Alexa Fluor 488, Fluo-3, PE, ECD, PI, PE-texas Red, PE-efluor 610, PE-Alexa 610, PE-CF594, PE-Dazzle, PC5, PC5.5. PerCP-cy5.5, 7-AAD, Cy5, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC-Alexa 700, APC-H7, APC-cy7, APC-alexa 750, Pacific Blue, BV421, BV480, V450, Pacific Orange, It may be, but is not limited to, Kromo Orange, BV510 or OC515.

본 발명은 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조 방법으로서 a)엑소좀 생산 세포에 엑소좀 마커 유전자와 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 엑소좀 생산 세포에 형질 전환하는 단계; b)상기 형질전환된 세포를 배양하여 코로나19 항원 단백질을 발현하는 단계; 및 c)상기 b) 단계의 배양된 세포에서 엑소좀을 추출하는 단계;를 포함하는 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조방법일 경우 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀에 있어, 코로나19 항원 단백질과 엑소좀을 고순도 또는 고효율로 제조할 수 있는 장점이 있다. The present invention is a method for producing exosomes expressing COVID-19 antigen proteins, comprising the steps of: a) transforming exosome-producing cells with a recombinant expression vector containing an exosome marker gene and a COVID-19 antigen protein coding gene; ; b) culturing the transformed cells to express COVID-19 antigen protein; and c) extracting exosomes from the cultured cells in step b) above. The above manufacturing method has the advantage of producing exosomes expressing COVID-19 antigen proteins with high purity or high efficiency.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are merely illustrative of the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1 : 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터 제작Example 1: Construction of a recombinant expression vector for expression of fusion protein of exosome expression protein and COVID-19 antigen protein

실시예 1-1: 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질, 스파이크 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터 제작Example 1-1: Construction of a recombinant expression vector for expression of fusion protein of exosome expression protein, COVID-19 antigen protein, and spike protein

코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)의 스파이크(Spike, S) 유전자(wild type)와 형광 단백질 유전자인 GFP 유전자가 포함된 렌티바이러스 벡터인 COVID-19-spike 벡터를 사용하여, 양 LTR (Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로, 5'LTR-RRE-CPP/CTS-CMV 프로모터- 엑소좀 발현 유전자인, CD63 유전자-코로나19 SARS-CoV-2의 spike 유전자-형광 단백질 유전자인 GFP-WPRE-3'LTR의 구성을 포함하는 재조합 발현 벡터를 디자인 하였고, 이를 위해 하기 표1과 같이 프라이머 서열을 디자인하여 상기 재조합 발현 벡터 제작에 사용하였다. Using the COVID-19-spike vector, a lentiviral vector containing the spike (S) gene (wild type) of the COVID-19 virus (SARS-CoV-2) and the GFP gene, a fluorescent protein gene, positive LTR (Long type) terminal repeat), in order from 5' to 3', 5'LTR-RRE-CPP/CTS-CMV promoter-exosome expression gene, CD63 gene-COVID-19 spike gene of SARS-CoV-2-fluorescent protein gene A recombinant expression vector containing the composition of GFP-WPRE-3'LTR was designed, and for this purpose, primer sequences were designed as shown in Table 1 below and used to construct the recombinant expression vector.

프라이머primer 서열order COVID-19-CD63delTM4-Forward primer(서열번호 1)COVID-19-CD63delTM4-Forward primer (SEQ ID NO: 1) TAATACGACTCACTATAGGGCGGCCGGGAATTCatggcggtggaaggaggaatgaaaTAATACGACTCACTATAGGGCGGCCGGGAATTCatggcggtggaaggaggaatgaaa COVID-19-CD63delTM4-Reverse primer(서열번호 2)COVID-19-CD63delTM4-Reverse primer (SEQ ID NO: 2) CAGCAGCACCAGGAACACAAACATGGTACCATTTTTCCTCAGCCAGCCCCCAATCAGCAGCACCAGGAACACAAACATGGTACCATTTTTCCTCAGCCAGCCCCCAAT

상기 재조합 발현 벡터를 EcoRI 제한효소와 KpnI 제한효소를 사용하여 절단한 다음, 엑소좀 발현 단백질 유전자인, CD63 삽입 유전자 insert를 얻기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 약 700bp정도 크기의 CD63 insert를 확보하였고 agarose gel 전기영동을 통해 확인하였다. AMPure XP PCR 추출 bead를 이용하여 insert를 정제한 후, 절단된 벡터와 함께 섞어 In Fusion PCR 클로닝(Cloning)을 진행하였다. 도 1과 같이 상기 엑소좀 발현 유전자인 CD63 유전자가 상기 COVID-19-spike 벡터에 삽입 된 것을 확인하였다. 이와 같이 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질, 스파이크 단백질의 융합 단백질의 발현용 재조합 발현 벡터를 제작하였다.The recombinant expression vector was cut using EcoRI and KpnI restriction enzymes, and then the size of about 700bp was obtained through polymerase chain reaction (PCR) to obtain the CD63 insertion gene, which is an exosome expression protein gene. The CD63 insert was secured and confirmed through agarose gel electrophoresis. After purifying the insert using AMPure XP PCR extraction beads, it was mixed with the cut vector and In Fusion PCR cloning was performed. As shown in Figure 1, it was confirmed that the exosome expression gene, CD63 gene, was inserted into the COVID-19-spike vector. In this way, a recombinant expression vector was created for expression of a fusion protein of exosome expression protein, COVID-19 antigen protein, and spike protein.

실시예 1-2: 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질, 스파이크 단백질 돌연변이 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터 제작Example 1-2: Construction of a recombinant expression vector for expressing exosome-expressed protein, COVID-19 antigen protein, and spike protein mutant fusion protein

코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)의 스파이크 돌연변이 유전자(참조서열 스파이크 유전자의 S1 부분, 23403번째 염기서열이 A에서 G로 치환된, D614G 유전자)와 GFP 유전자가 포함된 렌티바이러스 벡터인 COVID-19-spike 벡터를 사용하여, 양 LTR (Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로, 5'LTR-RRE-CPP/CTS-CMV 프로모터- 엑소좀 발현 유전자인, CD63 유전자-코로나19 SARS-CoV-2의 spike mutation 유전자-형광 단백질 유전자인 GFP-WPRE-3'LTR의 구성을 포함하는 재조합 발현 벡터를 디자인 하였다. EcoRI 제한효소와 KpnI 제한효소를 사용하여 절단한 다음, 엑소좀 발현 단백질 유전자인, CD63 삽입 유전자 insert를 얻기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 약 700bp정도 크기의 CD63 insert를 확보하였고 agarose gel 전기영동을 통해 확인하였다. AMPure XP PCR 추출 bead를 이용하여 insert를 정제한 후, 절단된 벡터와 함께 섞어 In Fusion PCR 클로닝(Cloning)을 진행하였다. 이와 같이 클로닝하여 엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질, 스파이크 단백질 돌연변이의 융합 단백질의 발현용 재조합 발현 벡터를 제작하였다.COVID-19, a lentiviral vector containing the spike mutant gene of the COVID-19 virus (SARS-CoV-2) (S1 part of the spike gene in the reference sequence, the D614G gene in which base sequence 23403 is substituted from A to G) and the GFP gene. Using a 19-spike vector, in order from 5' to 3' between both LTRs (long terminal repeats), 5'LTR-RRE-CPP/CTS-CMV promoter - exosome expression gene, CD63 gene - COVID-19 SARS -We designed a recombinant expression vector containing the spike mutation gene of CoV-2 and the fluorescent protein gene GFP-WPRE-3'LTR. After cutting using EcoRI and KpnI restriction enzymes, obtain a CD63 insert of about 700bp in size through polymerase chain reaction (PCR) to obtain the CD63 insert gene, which is an exosome expression protein gene. and was confirmed through agarose gel electrophoresis. After purifying the insert using AMPure XP PCR extraction beads, it was mixed with the cut vector and In Fusion PCR cloning was performed. By cloning in this way, a recombinant expression vector was created for expression of the fusion protein of the exosome expression protein, COVID-19 antigen protein, and spike protein mutation.

실시예 2: 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 제조Example 2: Preparation of exosomes expressing COVID-19 antigen protein

코로나19 항원 단백질이 엑소좀 표면에 발현하는 엑소좀을 수득 하기 위하여, 도 2의에 도시된 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제조하는 절차와 같이 HEK 293T세포를 사용하였다. 먼저 37°C, 5% CO2 세포 배양기에서, 10% FBS, 20mM L-Glutamine, 1% penicillin(100 U/ml)-streptomycin (100μg/ml) (P/S, Sigma)이 포함된 DMEM에서 24시간 동안 배양되고 안정화된 HEK 293T세포에 상기 실시예 1-1의 재조합 발현 벡터를 형질주입(Transfection) 하였다. 그 다음, 48시간 동안 배양한 다음, 초원심분리기(Ultracentrifuge)기반, 폴리머(polymer) 등이 포함된 침전 시약 및 0.22μm 진공 필터를 이용한 단일 엑소좀 분리 방법을 이용하여 엑소좀을 쉽고 1시간 이내로 빠르게 단일 입자 엑소좀을 추출하여 수득하였다. 이와 같이 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 제조하였고, 상기 엑소좀을 상기 엑소좀 분리 방법을 이용하여 단일 입자로 추출하였다. To obtain exosomes in which the COVID-19 antigen protein is expressed on the surface of the exosome, HEK 293T cells were used as in the procedure for producing exosomes expressing the COVID-19 antigen protein shown in Figure 2. First, in a 37°C, 5% CO2 cell incubator, cells were cultured in DMEM containing 10% FBS, 20mM L-Glutamine, and 1% penicillin (100 U/ml)-streptomycin (100μg/ml) (P/S, Sigma) for 24 days. The recombinant expression vector of Example 1-1 was transfected into HEK 293T cells that were cultured and stabilized for a period of time. Then, after culturing for 48 hours, exosomes are easily isolated within 1 hour using a single exosome isolation method using an ultracentrifuge-based precipitation reagent containing polymers and a 0.22μm vacuum filter. Single particle exosomes were quickly extracted and obtained. In this way, exosomes expressing the COVID-19 antigen protein were prepared, and the exosomes were extracted into single particles using the exosome isolation method.

실시예 3: 면역 형광법을 이용한 이미징 기반 SARS-CoV-2 엑소좀 검출Example 3: Imaging-based SARS-CoV-2 exosome detection using immunofluorescence

면역 형광법을 이용하여 공초좀 현미경(Confocal Microsope)으로 상기 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 이미징 기반 코로나19 엑소좀 분석을 하였다. 상기 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 도 3에 기재된 바와 같이, 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE) 항체(Monoclonal Anti-CD9-PE antibody), 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE)항체(Monoclonal Anti-CD63-PE antibody) 및 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE)항체(Monoclonal Anti-CD81-PE antibody)를 실온에서 반응시킨 후, 유리슬라이드(Glass slide)에 상기 실시예 2의 엑소좀이 포함된 반응액을 1ul를 떨어뜨린 다음, 커버 글라스를 덮은 다음, 상기 면역 형광법을 이용한 이미징 기반 공초점 현미경으로 SARS-CoV-2 엑소좀을 분석하였다. 공초점 현미경으로 SARS-CoV-2 엑소좀을 분석에는 도 4와 같이 코로나19 항원 단백질인 Spike 단백질이 엑소좀 내에 잘 위치하고 발현하는 것을 확인하였다. Imaging-based COVID-19 exosome analysis was performed on exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 using a confocal microscope using immunofluorescence. As shown in Figure 3, exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 were incubated with monoclonal anti-CD9-PE antibody and monoclonal anti-CD9-phycoerythrin (PE) antibody. After reaction with phycoerythrin (PE) antibody (Monoclonal Anti-CD63-PE antibody) and monoclonal anti-CD9-phycoerythrin (PE) antibody (Monoclonal Anti-CD81-PE antibody) at room temperature, glass slide ( 1 ul of the reaction solution containing the exosomes of Example 2 was dropped on a glass slide, covered with a cover glass, and SARS-CoV-2 exosomes were analyzed using an imaging-based confocal microscope using the immunofluorescence method. . When analyzing SARS-CoV-2 exosomes with a confocal microscope, it was confirmed that Spike protein, a COVID-19 antigen protein, was well located and expressed within the exosomes, as shown in Figure 4.

실시예 4: 유세포 분석기 기반 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 분석 Example 4: Quantitative analysis of SARS-CoV-2 exosomes based on flow cytometry

비드(Bead), 면역 침전을 이용하여 유세포 분석기(Flow Cytometry, FACS)로 코로나 19 엑소좀을 정량하였다. 상기 실시예 2의 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀을 도 3에 도시된 바와 같이, 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE) 항체(Monoclonal Anti-CD9-PE antibody), 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE) 항체 (Monoclonal Anti-CD63-PE antibody) 및 단클론 항CD9-피코에리트린(phycoerythrin, PE) 항체 (Monoclonal Anti-CD81-PE antibody)를 실온에서 반응시킨 후, 유세포 분석기(Flow Cytometry, FACS)로 분석하였다. 도 5는 상기 유세포 분석기 결과를 나타낸 것으로 도 5A는 FACS에서 입자나 세포의 크기를 비례하는 FSC(Forward scatter)와 FACS에서 세포내 과립의 수나 핵의 접혀진 정도에 비례하는 SSC(Side scatter) 산란광(light scatter)에 따른 형광표지 신호의 도트 플랏(Dot plot)으로 나타낸 것이며, 도 5B는 엑소좀의 유무를 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 신호 표지계산 값을 전체 모집단 개수 대비 상기 각각의 엑소좀 마커 형광 표지 개수를 %로 정량화하여 나타낸 것이다. 도 5B에서 SARS-CoV-2 엑소좀이 포함되지 않는 대조군에서는 코로나 19 항원 단백질 발현 엑소좀이 확인되지 않았으나 상기 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커에서는 엑소좀을 상기 엑소좀 단일 입자가 정량적으로 확인되었다. COVID-19 exosomes were quantified using beads and immunoprecipitation using flow cytometry (FACS). As shown in Figure 3, exosomes expressing the COVID-19 antigen protein of Example 2 were monoclonal anti-CD9-phycoerythrin (PE) antibody (Monoclonal Anti-CD9-PE antibody), monoclonal anti-CD9- After reacting phycoerythrin (PE) antibody (Monoclonal Anti-CD63-PE antibody) and monoclonal anti-CD9-phycoerythrin (PE) antibody (Monoclonal Anti-CD81-PE antibody) at room temperature, flow cytometer It was analyzed by Flow Cytometry (FACS). Figure 5 shows the results of the flow cytometer, and Figure 5A shows forward scatter (FSC), which is proportional to the size of particles or cells in FACS, and side scatter (SSC) scattered light, which is proportional to the number of intracellular granules or the degree of folding of the nucleus in FACS. It is shown as a dot plot of the fluorescent label signal according to light scatter), and Figure 5B shows the presence or absence of exosomes by calculating the labeling values of CD9, CD63, and CD81 exosome marker signals for each of the exosome markers above compared to the total population number. The number of fluorescent labels is quantified as a percentage. In Figure 5B, in the control group that did not contain SARS-CoV-2 exosomes, exosomes expressing COVID-19 antigen proteins were not identified, but exosomes and single exosome particles were quantitatively confirmed in the CD9, CD63, and CD81 exosome markers. .

도 5와 같이, 엑소좀 마커인 CD9, CD63 및 CD81의 엑소좀 마커 형광 표지를 이용한동시 염색을 이용하여 상기 CD9, CD63 및 CD81 엑소좀 마커 형광 표지의 계산이 가능함으로써 코로나19 항원 단백질인, SARS-CoV-2의 스파이크(Spike, S) 단백질을 포함하는 엑소좀의 개수를 정량적으로 정확하게 확인 할 수 있다.As shown in Figure 5, it is possible to calculate the exosome marker fluorescence labels of CD9, CD63, and CD81 using simultaneous staining using the exosome marker fluorescence labels of CD9, CD63, and CD81, thereby showing the presence of SARS, a COVID-19 antigen protein. -The number of exosomes containing the Spike (S) protein of CoV-2 can be accurately and quantitatively confirmed.

이제까지 본 발명에 바람직한 실시예 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들을 한정적인 관점이 아니라, 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, we have focused on preferred embodiments of the present invention. A person skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a restrictive perspective. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope should be construed as being included in the present invention.

<110> KRISS <120> Exosome expressing COVID-19 Antigen protein and use thereof <130> P20120251533 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19-CD63delTM4-Forward primer <400> 1 taatacgact cactataggg cggccgggaa ttcatggcgg tggaaggagg aatgaaa 57 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19-CD63delTM4-Reverse primer <400> 2 cagcagcacc aggaacacaa acatggtacc atttttcctc agccagcccc caat 54 <110> KRISS <120> Exosome expressing COVID-19 Antigen protein and use thereof <130> P20120251533 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19-CD63delTM4-Forward primer <400> 1 taatacgact cactataggg cggccgggaa ttcatggcgg tggaagggagg aatgaaa 57 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19-CD63delTM4-Reverse primer <400> 2 cagcagcacc aggaacacaa acatggtacc atttttcctc agccagcccc caat 54

Claims (12)

엑소좀 발현 단백질과 코로나19 항원 단백질의 융합 단백질 발현용 재조합 발현 벡터로서, 양 LTR (Long terminal repeat) 사이에 5'부터 3' 순으로,
RRE-CPP/CTS - CMV 프로모터 - 엑소좀 마커 유전자 - 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자-형광단백질 유전자 - WPRE;를 포함하고,
상기 엑소좀 마커 유전자는 CD9, CD63 및 CD81로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 재조합 발현 벡터.
RRE: Rev-response element
CPP/CTS: Central polypurine tract/central termination sequence
WPRE: Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory elementA recombinant expression vector for expressing a fusion protein of an exosome expression protein and a COVID-19 antigen protein, in order from 5' to 3' between both LTRs (long terminal repeats),
RRE-CPP/CTS - CMV promoter - exosome marker gene - COVID-19 antigen protein coding gene - fluorescent protein gene - WPRE;
The exosome marker gene is at least one selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81, a recombinant expression vector.
RRE: Rev-response element
CPP/CTS: Central polypurine tract/central termination sequence
WPRE: Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element 제1항에 있어서,
상기 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자는 스파이크(Spike, S) 유전자 또는 상기 스파이크의 병원성 돌연변이 유전자인, 재조합 발현 벡터. According to paragraph 1,
The COVID-19 antigen protein coding gene is a spike (Spike, S) gene or a pathogenic mutant gene of the spike, a recombinant expression vector. 삭제delete 제1항에 있어서
상기 형광 단백질 유전자는 루시퍼라아제(Luciferase, Luc), 녹색형광단백질 (Green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, 노랑형광단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 노랑형광단백질 (enhanced Yellow fluorescent protein, EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, 청색형광단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질 (enhanced Cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, PS-CFP2, 빨강 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, 파랑형광단백질(Blue fluorescent protein, BFP), mTag BFP, mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein), 노랑녹색형광단백질(Yellow-green fluorescent protein, mNeongreen), 밝은 형광단 백질(Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i), 엠플럼(mplum), 엠체리(monomeric cherry fluorescentprotein, mcherry), PAmcherry, 엠스트로베리(mStrawberry), 엠오렌지(mOrange), PSmOrange, 엠라 지베리(mRasberry), 엠케이트(mKate), mKate2, 엠티에프피(mTFP), 엠넵튠(mNeptune), 엠루비(mRubby), mRubby2, 엠바나나(mBanana), 디에스레드, 엠시트린(mCitrine), 에메랄드(Emerald), 티-사파이어(T-Sapphire), 엠에플(mApple), 엠그레이프(mgrape), 비너스(Venus), 토페즈(Topaz), 제이-레드(J-Red), 티디토마토 (tdTomato), mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede , KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow 및 세루리안(Cerulean)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 재조합 발현 벡터.In paragraph 1
The fluorescent protein genes include luciferase (Luc), green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Yellow fluorescent protein (YFP), enhanced Yellow fluorescent protein (EYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, Cyan fluorescent protein (CFP), Enhanced Cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, PS-CFP2, Red fluorescent protein (RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, blue fluorescence Protein (Blue fluorescent protein, BFP), mTag BFP, mBFP (metagenome-derived blue fluorescent protein), Yellow-green fluorescent protein (mNeongreen), Bright monomeric fluorescent protein (Scarlet-i) , mplum, mcherry (monomeric cherry fluorescentprotein, mcherry), PAmcherry, mStrawberry, mOrange, PSmOrange, mRasberry, mKate, mKate2, MT mTFP, mNeptune, mRubby, mRubby2, mBanana, DSthread, mCitrine, Emerald, T-Sapphire, M mApple, mgrape, Venus, Topaz, J-Red, tdTomato, mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. A recombinant expression vector selected from the group consisting of IFP1.4, mEos2, mEos4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede, KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow, and Cerulean. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 엑소좀 생산 세포. An exosome-producing cell transformed with the recombinant expression vector of any one of claims 1, 2, and 4. 제5항의 엑소좀 생산 세포에서 추출된 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀. Exosomes expressing the COVID-19 antigen protein extracted from the exosome-producing cells of claim 5. 제6항의 엑소좀을 포함하는 코로나19 항원 단백질 발현 엑소좀 정량용 조성물. A composition for quantifying exosomes expressing COVID-19 antigen protein, comprising the exosome of claim 6. SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법으로서,
1) COVID-19 관련 시료와 제7항의 엑소좀 정량용 조성물로부터 CD9, CD63 및 CD81로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 마커를 발현하는 엑소좀을 단일 입자로 추출하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 단일입자의 엑소좀 표면에서 발현되는 코로나19 항원 단백질 발현 및 엑소좀 개수를 측정하는 단계; 및
3) 상기 1) 단계의 COVID-19 관련 시료에서 분리된 엑소좀 단일 입자수와 상기 엑소좀 정량용 조성물로부터 분리된 엑소좀 단일 입자수를 비교하는 단계;
를 포함하는 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법.As a method of providing SARS-CoV-2 exosome quantitative information,
1) Extracting exosomes expressing one or more exosome markers selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81 from the COVID-19 related sample and the composition for exosome quantification of paragraph 7 as single particles;
2) measuring the expression of COVID-19 antigen protein and the number of exosomes expressed on the surface of exosomes of single particles separated from the COVID-19 related sample of step 1) and the composition for quantifying exosomes; and
3) Comparing the number of exosome single particles isolated from the COVID-19 related sample in step 1) with the number of exosome single particles separated from the composition for quantifying exosomes;
Method for providing SARS-CoV-2 exosome quantitative information including. 제8항에 있어서,
상기 2) 단계는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 실시간 형광 이미징 방법 (Real time Fluorescence Imaging Method), 유세포 분석기(FACS, Flow Cytometry) 및 단백질칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 수행하는 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법. According to clause 8,
Step 2) includes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, real-time fluorescence imaging method, flow cytometry (FACS), and protein chip. A method of providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes performed with any one selected from the group consisting of (chip). 제8항에 있어서,
상기 2) 단계의 측정은 엑소좀의 단일 입자에 결합된 CD9, CD63 및 CD81로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 마커 형광표지로 수행하는 것인 SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법. According to clause 8,
Method for providing quantitative information on SARS-CoV-2 exosomes, wherein the measurement in step 2) is performed with a fluorescent label of at least one exosome marker selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81 bound to a single particle of exosome. . 제8항에 있어서,
상기 2)단계는 상기 CD9, CD63 및 CD81로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 마커 형광 표지 강도를 이용하여 엑소좀의 입자크기 또는 크기분포를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 엑소좀 정량 정보의 제공방법. According to clause 8,
Step 2) further includes measuring the particle size or size distribution of exosomes using the fluorescence labeling intensity of one or more exosome markers selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81, SARS-CoV -2 Method of providing exosome quantitative information. 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 제조 방법으로서,
a) 엑소좀 생산 세포를 CD9, CD63 및 CD81로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 마커 유전자와 코로나19 항원 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환하는 단계;
b) 상기 형질 전환된 세포를 배양하여 코로나19 항원 단백질을 발현하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 배양된 세포에서 엑소좀을 추출하는 단계;
를 포함하는 코로나19 항원 단백질을 발현하는 엑소좀 제조 방법.A method for producing exosomes expressing COVID-19 antigen proteins,
a) transforming exosome-producing cells with a recombinant expression vector containing at least one exosome marker gene selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81 and a COVID-19 antigen protein coding gene;
b) culturing the transformed cells to express COVID-19 antigen protein; and
c) extracting exosomes from the cultured cells in step b);
Method for producing exosomes expressing COVID-19 antigen protein comprising.
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