KR102581542B1 - Novel streptococcus strain and hyaluronidase derived from the same - Google Patents

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KR102581542B1 KR1020210015121A KR20210015121A KR102581542B1 KR 102581542 B1 KR102581542 B1 KR 102581542B1 KR 1020210015121 A KR1020210015121 A KR 1020210015121A KR 20210015121 A KR20210015121 A KR 20210015121A KR 102581542 B1 KR102581542 B1 KR 102581542B1
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Abstract

본 발명은 히알루론산 분해 효소를 생산하는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptacoccus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP), 이로부터 수득한 히알루론산 분해 효소를 이용한 저분자 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주는 용혈 독성이 없고, 스트렙토코커스 속에 속하는 다른 종의 균주가 생산하는 히알루로니데이즈와 분자량이 상이한 신규한 히알루로니데이즈를 생산한다. 상기 효소는 히알루론산에 대해 높은 기질 특이성을 통해 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 분해시킨다. 따라서, 상기 균주로부터 생산된 히알루로니데이즈는 식품, 화장품, 의약품 등 여러 산업분야에 적용 가능한 저분자 히알루론산을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) that produces a hyaluronic acid-degrading enzyme, and the production of low-molecular-weight hyaluronic acid using the hyaluronic acid-degrading enzyme obtained therefrom. It's about method. The Streptococcus zooepidemicus BST909 strain of the present invention has no hemolytic toxicity and produces a novel hyaluronidase with a different molecular weight from the hyaluronidase produced by strains of other species belonging to the Streptococcus genus. The enzyme decomposes high molecular weight hyaluronic acid into low molecular weight hyaluronic acid through high substrate specificity for hyaluronic acid. Therefore, hyaluronidase produced from the above strain can be very useful in producing low-molecular-weight hyaluronic acid applicable to various industrial fields such as food, cosmetics, and pharmaceuticals.

Description

신규 미생물 스트렙토코커스 균주 및 이로부터 유래한 히알루로니데이즈{NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND HYALURONIDASE DERIVED FROM THE SAME}Novel microbial Streptococcus strain and hyaluronidase derived therefrom {NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND HYALURONIDASE DERIVED FROM THE SAME}

본 발명은 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주, 상기 균주가 생산하는 히알루로니데이즈 및 이를 이용한 저분자 히아루론산의 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel Streptococcus zooepidemicus strain, the hyaluronidase produced by the strain, and a method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid using the same.

히알루론산은 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)의 이당류 단위(disaccharide subunit)가 반복하여 이루어지는 다양한 길이의 다당류이다. 히알루론산은 동물의 피부에 많이 존재하며 높은 점성과 친수성의 특징을 가진다. 또한, 히알루론산은 피부 조직, 관절 연골 조직 등에서 중요한 구성 요소로 세포간의 연결, 지지에 도움을 준다. 뿐만 아니라, 히알루론산이 가지는 보습효과와 윤활효과로 인해, 의약품(관절윤활제), 식품(히알루론산 건강기능식품), 화장품(보습제, 성형외과 필러) 등 폭넓은 분야에서 응용되고 있다(KR10-1654810 B1).Hyaluronic acid is a polysaccharide of various lengths made up of repeating disaccharide subunits of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine. Hyaluronic acid exists in large quantities in animal skin and has the characteristics of high viscosity and hydrophilicity. In addition, hyaluronic acid is an important component in skin tissue, joint cartilage tissue, etc., and helps connect and support cells. In addition, due to the moisturizing and lubricating effects of hyaluronic acid, it is applied in a wide range of fields such as pharmaceuticals (joint lubricants), foods (hyaluronic acid health functional foods), and cosmetics (moisturizers, plastic surgery fillers) (KR10-1654810 B1).

히알루론산의 분자량은 백 Da에서 수백만 Da으로 다양하다. 또한, 히알루론산 수용액은 점성, 탄성 및 보습성을 가지며 이는 히알루론산의 분자량과 그 농도에 따라 정도가 달라진다. 고분자 히알루론산은 점도가 높고 피부 침투력이 낮아 제품 생산에 사용 시 그 기능성이 부족하다는 단점이 있다(신은지 등., 히알루론산나트륨의 분자량 크기에 따른 Collagen 합성, 항염증 및 피부 흡수에 미치는 영향., 대한화장품학회지., 2016, 105, 235-245). 이와 같은 이유로 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 분해하는 방법에 대한 다양한 연구들이 이루어지고 있다.The molecular weight of hyaluronic acid varies from one hundred Da to several million Da. In addition, the hyaluronic acid aqueous solution has viscosity, elasticity, and moisturizing properties, and the degree varies depending on the molecular weight of hyaluronic acid and its concentration. High molecular weight hyaluronic acid has the disadvantage of lacking functionality when used in product production due to its high viscosity and low skin penetration. Journal of the Korean Cosmetic Society., 2016, 105, 235-245). For this reason, various studies are being conducted on methods of decomposing high molecular hyaluronic acid into low molecular hyaluronic acid.

히알루론산을 분해하는 방법은 크게 고온가열, 초음파와 같은 물리적 분해, 산 가수분해와 같은 화학적 분해, 분해 효소와 같은 생물학적 분해로 나눌 수 있다. 그러나, 고온가열 분해 시, 고온으로 인한 변성가능성이 있으며, 강산을 이용한 산 가수분해나 초음파를 이용한 분해 시, 단당이 많이 생성되어 분자의 크기가 균일 하지 않다는 단점을 가진다. 반면, 분해 효소를 이용할 경우, 온도, 반응 시간과 같이 반응 조건을 조절하여 다양한 분자량의 히알루론산을 제조할 수 있으며, 강산, 강염기를 사용하지 않아 분해 시 위험성, 환경오염이 적다는 강점이 있다(KR10-1736790 B1). Methods for decomposing hyaluronic acid can be broadly divided into physical decomposition such as high temperature heating and ultrasound, chemical decomposition such as acid hydrolysis, and biological decomposition such as decomposition enzymes. However, when decomposed by high-temperature heating, there is a possibility of denaturation due to the high temperature, and when acid hydrolysis using strong acid or decomposition using ultrasound is performed, a large amount of monosaccharides are generated and the size of the molecules is not uniform. On the other hand, when using decomposition enzymes, hyaluronic acid of various molecular weights can be manufactured by controlling reaction conditions such as temperature and reaction time, and it has the advantage of reducing the risk of decomposition and environmental pollution by not using strong acids or bases. KR10-1736790 B1).

KRKR 10-165481010-1654810 B1B1 KRKR 10-173679010-1736790 B1B1

신은지 등., 히알루론산나트륨의 분자량 크기에 따른 Collagen 합성, 항염증 및 피부 흡수에 미치는 영향., 대한화장품학회지., 2016, 105, 235-245. Shin Eun-ji et al., Effects of molecular weight size of sodium hyaluronate on collagen synthesis, anti-inflammatory and skin absorption., Journal of the Korean Cosmetic Society., 2016, 105, 235-245.

이에, 본 연구자들은 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루론산 분해 효소(히알루로니데이즈, hyaluronidase)를 개발하기 위해 연구한 결과, 식품, 화장품, 의약품 등 여러 산업분야에 적용 가능한 저분자 히알루론산을 생산하는 히알루로니데이즈와 해당 효소를 생산할 수 있는 미생물을 동정하였고, 이로부터 수득한 히알루로니데이즈를 이용하여 저분자 히알루론산을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, these researchers studied to develop a hyaluronic acid-decomposing enzyme (hyaluronidase) that can decompose hyaluronic acid, and as a result, hyaluronic acid was developed to produce low-molecular-weight hyaluronic acid that can be applied to various industrial fields such as food, cosmetics, and pharmaceuticals. The present invention was completed by identifying a microorganism capable of producing ronidase and the corresponding enzyme, and confirming that low-molecular-weight hyaluronic acid can be produced using hyaluronidase obtained therefrom.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 제공한다. To achieve the above object, one aspect of the present invention provides Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (Accession number: KCTC 14238BP).

본 발명의 다른 측면은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a hyaluronic acid decomposing enzyme containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 또 다른 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계 및 배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는, 히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention includes culturing Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) and purifying hyaluronic acid decomposing enzyme from the culture medium, A method for producing hyaluronic acid decomposing enzyme is provided.

본 발명의 또 다른 측면은, 고분자 히알루론산에 상기 히알루론산 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는 저분자 히알루론산 제조 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid, comprising treating high-molecular-weight hyaluronic acid with the hyaluronic acid-decomposing enzyme.

본 발명은 히알루론산 분해 효소를 생산하는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptacoccus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP), 이로부터 수득한 히알루론산 분해 효소를 이용한 저분자 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주는 용혈 독성이 없고, 스트렙토코커스 속에 속하는 다른 종의 균주가 생산하는 히알루로니데이즈와 분자량이 상이한 신규한 히알루로니데이즈를 생산한다. 상기 효소는 히알루론산에 대해 높은 기질 특이성을 통해 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 분해시킨다. 따라서, 상기 균주로부터 생산된 히알루로니데이즈는 식품, 화장품, 의약품 등 여러 산업분야에 적용 가능한 저분자 히알루론산을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) that produces a hyaluronic acid-degrading enzyme, and the production of low-molecular-weight hyaluronic acid using the hyaluronic acid-degrading enzyme obtained therefrom. It's about method. The Streptococcus zooepidemicus BST909 strain of the present invention has no hemolytic toxicity and produces a novel hyaluronidase with a different molecular weight from the hyaluronidase produced by strains of other species belonging to the Streptococcus genus. The enzyme decomposes high molecular weight hyaluronic acid into low molecular weight hyaluronic acid through high substrate specificity for hyaluronic acid. Therefore, hyaluronidase produced from the above strain can be very useful in producing low-molecular-weight hyaluronic acid applicable to various industrial fields such as food, cosmetics, and pharmaceuticals.

도 1은 용혈 독성이 없는 신규한 균주를 분리하기 위하여 채집한 균주를 혈청고체배지에 이식하여 배양한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 동정하기 위하여 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 동정하기 위하여 당 발효 및 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주(좌측)와 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(우측)의 용혈성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 비용혈성을 확인하기 위하여 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균체 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균체의 현탁액 및 상등액과 배양 배지, 생리식염수, NCN 버퍼, 1% 계면활성제(SDS)를 각각 적혈구와 반응시켜 용혈성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 온도별 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 pH별 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 금속염에 의한 효소 활성 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 효소 반응 속도 상수를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 N-말단 아미노산 서열분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 반응 시간에 따른 고분자 히알루론산의 분해 과정을 나타낸 도면이다.
도 13은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈에 의한 고분자 히알루론산의 최종 분해 산물을 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈에 의한 고분자 히알루론산의 최종 분해 산물을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.Figure 1 is a diagram showing the results of culturing a strain collected by transplanting it onto serum solid medium to isolate a new strain without hemolytic toxicity.
Figure 2 is a diagram showing the results of analyzing the 16s rRNA gene base sequence to identify the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 3 is a diagram showing the results of confirming sugar fermentation and enzyme activity to identify the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 4 is a diagram showing the results of comparing the hemolytic properties of Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain (left) and Streptococcus zooepidemicus BST909 strain (right).
Figure 5 shows the suspension and supernatant of Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 cells or Streptococcus zooepidemicus BST909 cells, culture medium, physiological saline, NCN buffer, 1 This shows the results of comparing hemolysis by reacting % surfactant (SDS) with red blood cells.
Figure 6 is a graph showing the enzyme activity of hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain by temperature.
Figure 7 is a graph showing the enzyme activity of hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain at different pH levels.
Figure 8 is a graph showing the degree of inhibition of enzyme activity by metal salts of hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 9 is a graph showing the results of analyzing the enzyme reaction rate constant of hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 10 shows hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus BST909 strain. This diagram shows the results of SDS-PAGE to confirm molecular weight.
Figure 11 is a diagram showing the results of N-terminal amino acid sequence analysis of hyaluronidase produced by Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 12 is a diagram showing the decomposition process of high molecular weight hyaluronic acid according to the reaction time of hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 13 is a diagram showing the results of MALDI-TOF analysis of the final decomposition product of high molecular weight hyaluronic acid by hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.
Figure 14 is a diagram showing the results of LC-MS analysis of the final decomposition product of high molecular weight hyaluronic acid by hyaluronidase produced by the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 제공한다. 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA를 포함하며, 비용혈성인 것을 특징으로 한다. One aspect of the present invention provides Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP). The strain contains 16s rRNA represented by SEQ ID NO: 1 and is characterized by being non-hemolytic.

스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스는 히알루론산을 생산하는 그람 양성 구균으로서, 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi)의 아종으로, 베타 용혈(β-hemolysis)을 일으킨다. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 종에 속하는 균주에는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079, CCUG 23256, LMG16030 등이 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "용혈"은 적혈구가 파괴되어 내용물(세포질)이 주변 액체(예:혈장) 안으로 용해되는 것을 말한다. 용혈성으로 균주들을 분류하기도 하는데, 알파, 베타 및 감마 용혈이 있다. 알파용혈은 적혈구의 헤모글로빈을 산화시켜 혈액한천배지에 녹색 얼룩을 만든다. 베타용혈을 일으키는 종은 주변의 혈액세포들을 파괴함으로써 혈액한천배지를 파열시켜 투명한 얼룩을 만든다. Streptococcus zooepidemicus is a gram-positive coccus that produces hyaluronic acid, is a subspecies of Streptococcus equi , and causes beta-hemolysis. Strains belonging to the Streptococcus zooepidemicus species include Streptococcus zooepidemicus ATCC43079, CCUG 23256, and LMG16030. As used herein, the term “hemolysis” refers to the destruction of red blood cells and the dissolution of their contents (cytoplasm) into the surrounding fluid (e.g. plasma). Strains are also classified by hemolysis, with alpha, beta, and gamma hemolysis. Alpha hemolysis oxidizes the hemoglobin in red blood cells, creating a green stain on blood agar plates. Species that cause beta hemolysis destroy surrounding blood cells, rupturing the blood agar medium and creating transparent stains.

본 발명자들은 용혈성이 없고 히알루론산 분해 효소를 생산하는 균주를 선별하여, 상기 균주가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1 내지 도 3). 신규 동정된 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주와 달리 용혈 독성을 나타내지 않는다(도 4 및 도 5). 본 발명자들은 상기 균주를 "스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909"로 명명하고, 상기 동일한 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 7월 14일자로 기탁번호 KCTC 14238BP로 기탁하였다.The present inventors selected a strain that was not hemolytic and produced a hyaluronic acid-decomposing enzyme, and confirmed that the strain was a novel strain belonging to Streptococcus zooepidemicus (FIGS. 1 to 3). The newly identified strain does not exhibit hemolytic toxicity, unlike the Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain (Figures 4 and 5). The present inventors named the strain as “Streptococcus zooepidemicus BST909” and deposited the same strain at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center under the accession number KCTC 14238BP on July 14, 2020.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 상기 히알루론산 분해 효소는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)로부터 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Another aspect of the present invention provides a hyaluronic acid decomposing enzyme containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 2. Specifically, in one embodiment of the present invention, the hyaluronic acid decomposing enzyme may be obtained from Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (Accession number: KCTC 14238BP), but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산(hyaluronic acid, 또는 히알루로난(hyaluronan), HA)"은 분자량이 50,000 Da 내지 13,000,000 Da에 이르는 아미노산과 우론산(uronic acid)으로 이루어진 복잡한 다당류의 하나로, 반복단위인 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 이루어진 고분자 화합물이다. As used herein, the term "hyaluronic acid (or hyaluronan, HA)" is a complex polysaccharide consisting of amino acids and uronic acid with a molecular weight ranging from 50,000 Da to 13,000,000 Da. It is a polymer compound made up of repeating units, glucuronic acid and N-acetylglucosamine, alternately bonded in (1-3) and (1-4).

히알루론산은 보습 효과, 물리적 마찰에 대한 윤활 효과 및 세균 침입에 대한 보호 효과 등의 다양한 효능과 우수한 물성을 가지고 있어 화장품 첨가제, 관절염치료제, 안과수술용 수술보조제 및 외과수술 후의 유착저해제 등의 화장품, 의약품 및 의약부외품의 소재, 식품 등에 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 생리 활성 물질들의 이동을 주관하며 세포와의 특이한 작용에 의해 세포의 분화 및 성장을 유도하는 중개자 역할뿐 만 아니라, 세포외 기질에서는 콜라겐, 엘라스틴, 황산콘드로이틴(chondroitin sulphate) 등의 조직을 지탱하는 단백질 및 당 단백질들의 지지체 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 히알루론산이 식물과 화장품에 사용될 경우, 분자량이 큰 히알루론산은 체내 흡수 및 피부 내로의 흡수가 용이하지 않은 단점이 있다. 이러한 히알루론산은 소의 안구, 닭벼슬, 동물의 완충조직, 태반, 암세포 및 피부 등에 다량 함유되어 있다.Hyaluronic acid has various effects and excellent physical properties, such as moisturizing effect, lubricating effect against physical friction, and protective effect against bacterial invasion, and is used in cosmetics such as cosmetic additives, arthritis treatments, surgical aids for ophthalmic surgery, and adhesion inhibitors after surgical operations. It is widely used in pharmaceuticals, quasi-drug materials, and food. In addition, it not only acts as an intermediary that controls the movement of biologically active substances and induces cell differentiation and growth through unique interactions with cells, but also supports tissues such as collagen, elastin, and chondroitin sulphate in the extracellular matrix. It is known to serve as a support for proteins and glycoproteins. However, when hyaluronic acid is used in plants and cosmetics, hyaluronic acid with a large molecular weight has the disadvantage of not being easily absorbed into the body and skin. This hyaluronic acid is contained in large quantities in cow's eyes, chicken combs, animal cushioning tissue, placenta, cancer cells, and skin.

본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산 분해 효소"는 히알루론산을 가수분해하는 효소이다. 상기 효소는 다양한 생물에서 발견되며 작용 기전에 따라 3종류로 나뉜다. 히알루로네이트 4-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.35)는 엔도-β-N-아세틸글루코스아미니다아제(hyaluronoglucosaminidase)로, β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하는 하이드롤라제(hydrolase)이다. 사당류(tetrasaccharide)를 주로 생성하며, 고환, 리소좀 및 벌독에 분포되어 있다. 히알루로네이트 3-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.36)는 엔도-β-글루쿠로니다제(hyaluronoglucuronidase)로서, β-1,3-글루코사이드 결합상에서 작용하는 하이드롤라제이다. 사당류를 주로 생성하며, 거머리 또는 구충에서 발견된다. 히알루로네이트 라이아제(hyaluronate lyase, EC 4.2.2.1)는 세균에 존재하는 히알루로니데이즈로서 β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하고, β-제거기전을 통해서 4,5-불포화된 이당류를 생성시킨다.As used herein, the term “hyaluronic acid degrading enzyme” is an enzyme that hydrolyzes hyaluronic acid. The enzymes are found in various organisms and are divided into three types according to their mechanism of action. Hyaluronate 4-glycanohydrolase (EC 3.2.1.35) is an endo-β-N-acetylglucosaminidase, a hydrolase that acts on β-1,4-glucoside bonds. am. It mainly produces tetrasaccharides and is distributed in testes, lysosomes, and bee venom. Hyaluronate 3-glycanohydrolase (EC 3.2.1.36) is an endo-β-glucuronidase, a hydrolase that acts on β-1,3-glucoside bonds. It mainly produces tetrasaccharides and is found in leeches or hookworms. Hyaluronate lyase (EC 4.2.2.1) is a bacterial hyaluronidase that acts on β-1,4-glucoside bonds and produces 4,5-unsaturated disaccharides through a β-elimination mechanism. I order it.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주에서 수득한 히알루로니데이즈의 분자량은 약 127 kDa임을 확인하였다(도 10). 또한, 상기 히알루로니데이즈는 서열번호 2의 N-말단 서열을 포함할 수 있다(도 11). 본 발명에서 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)에서 정제한 히알루로니데이즈는 "BST909 히알루로니데이즈"로 병용 기재될 수 있다. 또한, BST909 히알루로니데이즈는 히알루로니데이즈 전구체, 성숙형 히알루로니데이즈 및 활성을 갖는 이의 절단된 형태를 포함할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the The molecular weight of hyaluronidase obtained from the strain was confirmed to be approximately 127 kDa (Figure 10). Additionally, the hyaluronidase may include the N-terminal sequence of SEQ ID NO: 2 (FIG. 11). In the present invention, hyaluronidase purified from Streptococcus zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) may be collectively described as "BST909 hyaluronidase". Additionally, BST909 hyaluronidase may include hyaluronidase precursors, mature hyaluronidase, and active truncated forms thereof.

본 발명의 일 실시예에 따르면, BST909 히알루로니데이즈는 15℃ 내지 45℃에서 분해 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는 40℃일 수 있다. 히알루로니데이즈의 반응 온도가 40℃까지 상승할수록 효소의 분해 활성이 높아졌으며, 45℃에서 활성이 급격히 감소하였다. 이를 통해, BST909 히알루로니데이즈의 최적반응온도가 40℃임을 확인하였다(도 6).According to one embodiment of the present invention, BST909 hyaluronidase may exhibit decomposition activity at 15°C to 45°C. Preferably it may be 40°C. As the reaction temperature of hyaluronidase increased to 40°C, the decomposition activity of the enzyme increased, and the activity rapidly decreased at 45°C. Through this, it was confirmed that the optimal reaction temperature of BST909 hyaluronidase was 40°C (Figure 6).

본 발명의 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 pH 4.0 내지 pH 9.0에서 분해 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, pH 7.0일 수 있다(도 7).In one embodiment of the present invention, BST909 hyaluronidase may exhibit decomposition activity at pH 4.0 to pH 9.0. Preferably, the pH may be 7.0 (Figure 7).

본 발명의 일 실시예에 따르면, BST909 히알루로니데이즈는 Ag2+, Ni2+, Fe2+, Zn2+ 및 Cu2+ 로부터 선택되는 어느 하나에 의해 분해 활성이 저해될 수 있다. 구체적으로, 상기 효소를 Ag2+, Ni2+, Fe2+, Ba2+, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mg2+, K+, Na+ 또는 EDTA를 포함하는 완충용액을 사용하여 고분자 히알루론산과 반응시킨 결과, Ag2+, Ni2+, Fe2+, Zn2+ 또는 Cu2+와 반응시킨 효소의 분해 활성이 크게 감소하였다. 이를 통해, Ag2+, Ni2+, Fe2+, Zn2+ 및 Cu2+는 BST909 히알루로니데이즈 활성을 억제시킴을 확인하였다(도 8).According to one embodiment of the present invention, the decomposition activity of BST909 hyaluronidase may be inhibited by any one selected from Ag 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ and Cu 2+ . Specifically, the enzyme Ag 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ , Ba 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ , K + , Na + or EDTA. As a result of reaction with high molecular weight hyaluronic acid using a buffer solution containing Ag 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ or Cu 2+ , the decomposition activity of the enzyme reacted with it was significantly reduced. Through this, it was confirmed that Ag 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ and Cu 2+ inhibit BST909 hyaluronidase activity (FIG. 8).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 히알루론산을 특이적으로 분해할 수 있다. 구체적으로, 상기 효소를 히알루론산, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate) A, 콘드로이친 설페이트 C, 더마탄 설페이트(dermatan sulgate), 잔탄(xanthan) 또는 아가로즈(agarose) 등의 다당류 기질 용액과 반응시켜 다당류의 분해 정도를 비교하였다. 그 결과, 히알루론산만을 특이적으로 분해하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, BST909 히알루로니데이즈는 히알루론산에 대해 기질 특이성을 나타내는 것을 알 수 있다(표 1). In another embodiment of the present invention, BST909 hyaluronidase can specifically decompose hyaluronic acid. Specifically, the enzyme is reacted with a polysaccharide substrate solution such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C, dermatan sulgate, xanthan, or agarose to decompose polysaccharides. The degrees were compared. As a result, it was confirmed that only hyaluronic acid was specifically decomposed. Through this, it can be seen that BST909 hyaluronidase exhibits substrate specificity for hyaluronic acid (Table 1).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 약 0.0015 mM의 미하엘리스 반응속도상수(Km)와 약 50 mM/분의 최대반응속도(Vmax)를 갖는다. 구체적으로, 상기 효소를 농도별 고분자 히알루론산 기질용액과 35℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 반응시킨 후, 232 nm에서 흡광도를 측정한 값을 다당류 히아루론산의 단위체인 N-아세틸-D-글루코사민을 농도별로 232 nm에서 흡광도를 측정한 값과 비교하여 시간당 분해속도를 계산하였다. 그 결과, Km 값이 약 0.0015 mM로서 기질에 대한 친화성이 높으며, Vmax 값이 약 50 mM/분으로 반응속도가 높은 것을 확인하였다(도 9).In another embodiment of the present invention, BST909 hyaluronidase has a Michaelis reaction rate constant (Km) of about 0.0015mM and a maximum reaction rate (Vmax) of about 50mM/min. Specifically, the enzyme was reacted with high molecular weight hyaluronic acid substrate solution at each concentration under conditions of 35°C, 150 rpm, 1 hour, and the absorbance was measured at 232 nm. The decomposition rate per hour was calculated by comparing the absorbance measured at 232 nm for each concentration. As a result, it was confirmed that the Km value was about 0.0015mM, showing high affinity for the substrate, and the Vmax value was about 50mM/min, showing a high reaction rate (FIG. 9).

본 발명의 또 다른 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계 및 배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is a hyaluronidase comprising culturing Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) and purifying hyaluronic acid decomposing enzyme from the culture medium. A method for producing ronate decomposing enzyme is provided.

본 발명의 또 다른 측면은, 고분자 히알루론산에 상기 히알루론산 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는 저분자 히알루론산 제조 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid, comprising treating high-molecular-weight hyaluronic acid with the hyaluronic acid-decomposing enzyme.

상기 고분자 히알루론산은 통상의 방법에 따라 생물조직으로부터의 추출 또는 미생물로부터의 발효에 의해 제조될 수 있으며, 상업적으로 판매하고 있는 고분자 히알루론산일 수 있다. 고분자 히알루론산은 12,00 kDa 내지 2,600 kDa 크기일 수 있으며, 바람직하게는 1,200 kDa 내지 2,200 kDa일 수 있다. 하지만 이에 제한되지 않는다.The polymer hyaluronic acid may be manufactured by extraction from biological tissue or fermentation from microorganisms according to a conventional method, and may be commercially available polymer hyaluronic acid. High molecular weight hyaluronic acid may have a size of 12,00 kDa to 2,600 kDa, preferably 1,200 kDa to 2,200 kDa. But it is not limited to this.

또한 본 명세서에서 히알루론산은 히알루로네이트를 포함할 수 있다. 상기 "히알루로네이트"는 히알루론산의 염의 형태로서, 히알루론산에서 지질, 단백질 및 핵산 등를 제거하여 생산되므로 분자 크기가 히알루론산보다 작다. 예를 들어, 히알루로산의 나트륨염, 칼륨염, 마크네슘염, 칼슘염 및 아연염이 있으나, 이에 제한되지 않는다. Additionally, hyaluronic acid herein may include hyaluronate. The “hyaluronate” is a salt form of hyaluronic acid and is produced by removing lipids, proteins, and nucleic acids from hyaluronic acid, so its molecular size is smaller than that of hyaluronic acid. Examples include, but are not limited to, sodium, potassium, magnesium, calcium, and zinc salts of hyaluronic acid.

구체적으로, 저분자 히알루론산 제조 방법에 있어서 상기 BST909 히알루로니데이즈의 처리는 고분자 히알루론산에 3.5 unit/mL의 BST909 히알루로니데이즈를 30℃, 200 rpm, pH 7.0의 10 mM 인산염 완충용액에서 0.5시간 내지 3시간 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Specifically, in the method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid, the treatment of BST909 hyaluronidase involves adding 3.5 unit/mL of BST909 hyaluronidase to high-molecular-weight hyaluronic acid in a 10 mM phosphate buffer solution at 30°C, 200 rpm, pH 7.0 for 0.5 hours. It can be processed for 3 hours, but is not limited to this.

또한, 상기 저분자 히알루론산은 300 Da 내지 100 kDa 일 수 있다. 또는 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 50,000 Da일 수 있다. 또는, 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 10,000 Da일 수 있다. 또는, 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 5,000 Da일 수 있다. 바람직하게는 생산된 저분자 히알루론산은 약 760 Da의 사당류일 수 있다. 또한, 생산된 저분자 히알루론산은 약 380 Da 내지 400 Da의 이당류일 수 있다.Additionally, the low molecular weight hyaluronic acid may be 300 Da to 100 kDa. Alternatively, the low molecular weight hyaluronic acid may be 380 Da to 50,000 Da. Alternatively, the low molecular weight hyaluronic acid may be 380 Da to 10,000 Da. Alternatively, the low molecular weight hyaluronic acid may be 380 Da to 5,000 Da. Preferably, the low molecular weight hyaluronic acid produced may be a tetrasaccharide of about 760 Da. Additionally, the produced low molecular weight hyaluronic acid may be a disaccharide of about 380 Da to 400 Da.

구체적으로, 본 명세서의 일 실시예에서 상기 조건으로 BST909 히알루로니데이즈를 처리한 결과, 3시간 반응 시 고분자 히알루론산이 이당류 히알루론산으로 분해되었음을 확인하였다(도 12 내지 도 14).Specifically, as a result of treating BST909 hyaluronidase under the above conditions in one example of the present specification, it was confirmed that polymeric hyaluronic acid was decomposed into disaccharide hyaluronic acid after 3 hours of reaction (FIGS. 12 to 14).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be explained in more detail by the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these only.

실시예 1. 비용혈성 균주 탐색 및 동정Example 1. Discovery and identification of non-hemolytic strains

비용혈성 균주를 분리하기 위하여 모래, 풀 등 자연 물질을 THB(todd hewitt broth) 액체배지에 접종하여 35℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 그 후, THB 고체배지에 배양액을 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 각 콜로니를 혈청고체배지(blood agar plate, BAP, 아산제약)에 이식하여 35℃에서 배양한 뒤, 이식된 콜로니 주위에 투명환을 생성하지 않는, 용혈성이 없는 균을 분리하였다(도 1). THB는 BD Difco의 제품을 사용하였으며, 고체배지 제작 시 한천(BD Difco)을 15 g/L의 농도로 혼합하여 멸균 후 20 mL씩 페트리디쉬에 분주하여 굳힌 것을 사용하였다.To isolate non-hemolytic strains, natural materials such as sand and grass were inoculated into THB (Todd Hewitt Broth) liquid medium and cultured at 35°C and 150 rpm. Afterwards, the culture was spread on THB solid medium to obtain colonies. Each colony was transplanted onto a serum solid medium (blood agar plate, BAP, Asan Pharmaceutical) and cultured at 35°C. Then, non-hemolytic bacteria that did not form a transparent ring around the transplanted colony were isolated (Figure 1). THB was a product from BD Difco, and when producing solid media, agar (BD Difco) was mixed at a concentration of 15 g/L, sterilized, and then dispensed into Petri dishes in 20 mL portions and solidified.

상기 방법을 통해 분리된 균을 "BST909"로 명하고, (주)바이오닉스에 상기 균의 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정을 의뢰하였다. 그 결과, 1순위 동정 결과가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC43079)임을 확인함으로써, BST909가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주에 속하는 균임을 알 수 있었다(도 2).The bacterium isolated through the above method was named "BST909", and Bionics Co., Ltd. was requested to identify the bacterium through 16s rRNA gene sequence analysis. As a result, it was confirmed that the first identification result was Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 ( Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC43079), confirming that BST909 belongs to the Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain (Figure 2).

또한 상기 균주를 API STREP20 키트(Biomerieux) 및 API ZYM 키트(Biomerieux)를 이용하여 해당 균주의 특성을 확인하였다. API STREP20 키트를 이용하여 분석한 결과, 99.6%ID로 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)로 동정되었다(99.6%ID, T Index 0.31)(도 3). 이때, % ID는 상대적 근접성을 나타내며, 이 수치가 높을수록 동정결과에 대한 신뢰성이 높다. 또한, T Index는 생화학 특성에 대한 근접성을 나타내며, 이 수치가 1에 가까울수록 전형적인 균임을 의미한다.Additionally, the characteristics of the strain were confirmed using the API STREP20 kit (Biomerieux) and the API ZYM kit (Biomerieux). As a result of analysis using the API STREP20 kit, it was identified as Streptococcus equi subsp. zooepidemicus with an ID of 99.6% (99.6%ID, T Index 0.31) (FIG. 3). At this time, % ID indicates relative proximity, and the higher this number, the higher the reliability of the identification result. Additionally, the T Index indicates proximity to biochemical characteristics, and the closer this value is to 1, the more typical the bacteria are.

실시예 2. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 비용혈성 확인 Example 2. Confirmation of non-hemolytic nature of Streptococcus zooepidemicus BST909 strain

상기 실시예 1을 통해 동정된 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)는 비용혈성을 갖는 것을 특징으로 한다. 하지만 상기 균주가 속한 종인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주는 베타-용혈성을 갖는 균주이다. 따라서, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079와 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 용혈성 차이를 실험을 통해 다시 확인하였다. The Streptococcus zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP) identified through Example 1 is characterized by non-hemorrhage. However, Streptococcus zooepidemicus ATCC43079, the species to which the above strain belongs, is a strain with beta-hemolytic properties. Therefore, the difference in hemolysis between Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 and Streptococcus zooepidemicus BST909 strains was confirmed again through experiments.

먼저, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 각 콜로니를 혈청배지(아산제약)에 이식하여 35℃에서 배양한 후, 이식된 콜로니 주위에 투명환 생성을 확인하였다. 그 결과, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주의 콜로니에는 투명환이 생성된 반면, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 콜로니에는 투명환이 생성되지 않은 것을 확인하였다(도 4).First, each colony of the Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain or the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain was transplanted into serum medium (Asan Pharmaceutical) and cultured at 35°C, and then the formation of a transparent ring around the transplanted colony was confirmed. . As a result, it was confirmed that a transparent ring was generated in the colony of the Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain, while a transparent ring was not generated in the colony of the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain (FIG. 4).

또한, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 각각 THB(BD Difco)에 배양하여 배양액의 원심분리 후 얻은 균체 현탁액(cell), 상등액(sup.)과 배양 배지(THB), 생리식염수(saline,0.89% NaCl 수용액), NCN 완충용액(3 mM sodium citrate, 0.9% NaCl, pH 6.8)를 1% 적혈구 용액과 함께 35℃에서 18시간 반응시켰다. 이때, 1% 적혈구 용액은 Innovative research에서 구입한 10% 양적혈구(sheep red blood cells) 용액을 NCN 완충용액에 희석하여 제조하였다. In addition, Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain or Streptococcus zooepidemicus BST909 strain were cultured in THB (BD Difco), respectively, and the bacterial suspension (cell), supernatant (sup.) and culture medium ( THB), saline (0.89% NaCl aqueous solution), and NCN buffer solution (3 mM sodium citrate, 0.9% NaCl, pH 6.8) were reacted with 1% red blood cell solution at 35°C for 18 hours. At this time, the 1% red blood cell solution was prepared by diluting a 10% sheep red blood cell solution purchased from Innovative Research in NCN buffer solution.

반응 종료 후, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 반응액의 색상(상단) 및 540 nm에서 흡광도(하단)를 측정하여 적혈구의 용혈 정도를 비교하였다. 1% 적혈구 용액은 음성 대조군으로서, 어떤 용액과도 반응시키지 않은 적혈구 용액이며, 0.1% SDS(계면활성제)를 이용하여 적혈구 용액을 완전 용해시킨 용액을 양성 대조군으로 하여 실험군 용액과 비교하였다. 구체적인 시험법은 "Purification and characterization of hemolysin from Porphyromonas gingivalis A7436"(FEMS Microbiol Lett., 176, 387-394)을 참조하였다.After completion of the reaction, the supernatant was separated by centrifugation, and the color of the reaction solution (top) and absorbance at 540 nm (bottom) were measured to compare the degree of hemolysis of red blood cells. The 1% red blood cell solution was a negative control, which was a red blood cell solution that did not react with any solution, and a solution in which the red blood cells were completely dissolved using 0.1% SDS (surfactant) was used as a positive control, and was compared with the experimental group solution. For specific test methods, refer to "Purification and characterization of hemolysin from Porphyromonas gingivalis A7436" (FEMS Microbiol Lett., 176, 387-394).

그 결과, 양성 대조군인 0.1% SDS 용액 반응물이 가장 붉고, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 배양액 반응물이 짙은 붉은색을 나타냈다. 그에 비하여, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주 배양액 또는 일반 시험용액(일반 생리식염수, NCN 완충용액, 배양 배지) 반응물의 색상은 비교적 붉지 않은 것을 확인하였다(도 5, 상단). 반응물의 흡광도 비교시, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079의 반응물이 약 50% 용혈을 일으킨 반면, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 반응물은 일반 생리식염수, NCN 완충용액, 배양 배지와 유사한 정도의 용혈이 관찰되었다. 또한, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 반응물은 반응에 사용한 1% 적혈구 용액 자체 보다도 낮은 540 nm 흡광도를 가지는 것을 확인하였다(도 5, 하단).As a result, the positive control 0.1% SDS solution reaction product was the most red, and the Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 culture solution reaction product was dark red. In comparison, it was confirmed that the color of the reaction product of Streptococcus zooepidemicus BST909 strain culture medium or general test solution (normal saline solution, NCN buffer solution, culture medium) was relatively not red (Figure 5, top). When comparing the absorbance of the reactants, the reactant of Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 caused about 50% hemolysis, while the reactant of Streptococcus zooepidemicus BST909 strain caused hemolysis to a similar degree to normal saline, NCN buffer solution, and culture medium. This was observed. In addition, it was confirmed that the reaction product of the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain had an absorbance of 540 nm, which was lower than that of the 1% red blood cell solution itself used in the reaction (Figure 5, bottom).

따라서, 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주는 일반 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주와 다르게 용혈성이 없는 새로운 특성을 가진 균주임을 알 수 있었다.Therefore, it was found that the novel Streptococcus zooepidemicus BST909 strain is a strain with a new characteristic of not being hemolytic, unlike the general Streptococcus zooepidemicus ATCC43079 strain.

실시예 3. 신규한 히알루로니데이즈 제조Example 3. Preparation of novel hyaluronidase

실시예 3.1. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주 배양 Example 3.1. Streptococcus zooepidemicus BST909 strain culture

멸균된 THB 액체배지(BD Difco) 20 mL에 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 접종하여 35℃, 150 rpm, 6시간의 조건으로 배양하였다. 상기 조건으로 배양된 균 배양액의 약 20 mL를 멸균된 THB 액체배지 200 mL에 접종하여 35℃, 150 rpm, 12시간의 조건으로 배양하였다. 상기 조건으로 배양된 배양액 200 mL 중 약 150 mL를 3.5 L의 멸균된 히알루로니데이즈 생산배지에 접종하였다. 히알루로니데이즈 생산배지의 1 L당 조성은 트립톤 13.5 g, 효모 추출물 7.0 g, 소이톤 6.5 g, K2SO4 1.4 g, Na2HPO4 6.5 g, 안티폼 1.0 g, MgSO4 2.5 g, 글루코스 72.0 g이다.Streptococcus zooepidemicus BST909 in 20 mL of sterilized THB broth (BD Difco). The strain was inoculated and cultured at 35°C, 150 rpm, and 6 hours. Approximately 20 mL of the bacterial culture cultured under the above conditions was inoculated into 200 mL of sterilized THB liquid medium and cultured at 35°C, 150 rpm, and 12 hours. About 150 mL of the 200 mL of culture cultured under the above conditions was inoculated into 3.5 L of sterilized hyaluronidase production medium. The composition per 1 L of hyaluronidase production medium is 13.5 g of tryptone, 7.0 g of yeast extract, 6.5 g of soytone, 1.4 g of K 2 SO 4 , 6.5 g of Na 2 HPO 4 , 1.0 g of Antiform, 2.5 g of MgSO 4 , It is 72.0 g of glucose.

히알루로니데이즈 생산배지의 접종 후, 발효기를 이용하여 배양 조건을 35℃, pH 7.0(5 M NaOH 투입하여 조절), 300 rpm, 공기 유량 1.5 L/분(lpm)로 조절하여 12-14시간 배양 후 종료하였다.After inoculation of the hyaluronidase production medium, culture conditions were adjusted to 35°C, pH 7.0 (adjusted by adding 5 M NaOH), 300 rpm, and air flow rate of 1.5 L/min (lpm) using a fermenter, and cultured for 12-14 hours. It ended after that.

실시예 3.2. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주로부터 히알루로니데이즈 수득Example 3.2. Obtaining hyaluronic acid from Streptococcus zooepidemicus BST909 strain

상기 실시예 3.1에서 수득한 배양액을 4℃, 8000 rpm, 30분 조건으로 원심분리하여 가라앉은 균체는 제거하고 상등액만 회수하였다. 회수한 상등액에서 황산암모늄을 이용하여 단백질을 침전시키고, 이온교환칼럼을 통해 단백질을 정제하여 최종적으로 히알루로니데이즈를 획득하였다(이하, BST909 히알루로니데이즈라고 한다). The culture medium obtained in Example 3.1 was centrifuged at 4°C, 8000 rpm, 30 minutes to remove settled cells, and only the supernatant was recovered. From the recovered supernatant, the protein was precipitated using ammonium sulfate, and the protein was purified through an ion exchange column to finally obtain hyaluronidase (hereinafter referred to as BST909 hyaluronidase).

구체적으로, 원심분리를 이용하여 상등액에 황산암모늄 최종 농도를 포화 60%(g/L)로 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 황산암모늄 60% 포화 용액을 4℃, 8000 rpm, 30분의 조건으로 원심분리하여 침전된 단백질을 회수하였다. 회수한 침전 단백질을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 현탁한 후, 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 약 24시간 투석하였다.Specifically, proteins were precipitated by adding ammonium sulfate to a final concentration of 60% (g/L) of saturation in the supernatant using centrifugation. The precipitated protein was recovered by centrifuging the 60% saturated ammonium sulfate solution at 4°C, 8000 rpm, and 30 minutes. The recovered precipitated protein was suspended in 10mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution and then dialyzed for about 24 hours using a 12-14 kDa membrane.

투석하여 얻은 단백질 용액을 Hi Prep DEAE FF 16/10 column(GE), AKTA pure FPLC(Cytiva) 기기를 사용하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 NaCl 0 M에서 1 M까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다. The protein solution obtained by dialysis was mixed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution using a Hi Prep DEAE FF 16/10 column (GE) and AKTA pure FPLC (Cytiva) equipment along a linear concentration gradient from 0 M to 1 M NaCl. It was eluted using this method.

유속 2 mL/분으로 용출하면서 농도별 용출용액의 히알루론산(HA) 분해 활성과 단백질 함량을 비교하였다. 히알루론산 분해 활성이 높은 구간의 용출용액을 모아 NaCl 성분을 제거하기 위하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액, 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 투석을 진행하였다. While eluting at a flow rate of 2 mL/min, the hyaluronic acid (HA) decomposition activity and protein content of the elution solution at each concentration were compared. The elution solution from the section with high hyaluronic acid decomposition activity was collected and dialyzed using a 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution and a 12-14 kDa membrane to remove the NaCl component.

상기 정제 및 투석 과정으로 얻어진 히알루론산 분해 활성을 나타내는 용액을 상기 FPLC 기기와 Hi Trap Butyl FF column(GE)를 통해 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 황산암모늄 40%(g/L)에서 0%(g/L)까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다. 유속 1.5 mL/분으로 용출하면서 농도별 용출용액의 히알루론산 분해 활성과 단백질 함량을 비교하였다. 히알루론산 분해 활성이 높은 구간의 용출용액을 모아 황산암모늄 성분을 제거하기 위하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에서 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 투석을 진행하였다. 정제과정 중에는 SDS-PAGE를 이용하여 진행과정을 확인하였다.The solution showing hyaluronic acid decomposition activity obtained through the purification and dialysis process was passed through the FPLC device and Hi Trap Butyl FF column (GE) to 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution and 40% (g/L) ammonium sulfate. It was eluted using a linear concentration gradient method from to 0% (g/L). While eluting at a flow rate of 1.5 mL/min, the hyaluronic acid decomposition activity and protein content of the elution solution at each concentration were compared. The elution solution from the section with high hyaluronic acid decomposition activity was collected and dialyzed using a 12-14 kDa membrane in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution to remove the ammonium sulfate component. During the purification process, the progress was confirmed using SDS-PAGE.

실시예 4. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 최적 활성 조건 확인Example 4. Confirmation of optimal activity conditions for hyaluronidase produced by Streptococcus zooepidemicus BST909 strain

상기 실시예 3의 방법으로 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909에서 수득된 히알루로니데이즈(이하, BST909 히알루로니데이즈라고 함)의 최적 반응시간, 최적 반응 온도, 기질의 pH에 따른 활성 차이, 금속염에 의한 활성 저해, 다당류 분해능, 반응속도상수, 분자량을 확인하였다. 실험에 사용하는 히알루론산 용액은 고분자 히알루론산(sodium hyaluronate, Kewpie, HA-LQH)을 1% 농도로 10 mM SPB(sodium phosphate buffer, pH 7.0, 3% NaCl 함유)에 용해한 것을 기질용액으로 사용하였다.The optimal reaction time, optimal reaction temperature, activity difference depending on the pH of the substrate, and metal salt of hyaluronidase (hereinafter referred to as BST909 hyaluronidase) obtained from Streptococcus zooepidemicus BST909 by the method of Example 3. Activity inhibition, polysaccharide decomposition ability, reaction rate constant, and molecular weight were confirmed. The hyaluronic acid solution used in the experiment was a 1% concentration of high molecular hyaluronic acid (sodium hyaluronate, Kewpie, HA-LQH) dissolved in 10 mM SPB (sodium phosphate buffer, pH 7.0, containing 3% NaCl) as a substrate solution. .

실시예 4.1. BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 온도 확인Example 4.1. Confirmation of optimal reaction temperature of BST909 Hyaluronidase

BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 온도를 확인하기 위하여, BST909 히알루로니데이즈 용액을 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 기질용액과 함께 항온 수조를 이용하여 각 온도별 환경에서 1시간 동안 반응시킨 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다. In order to confirm the optimal reaction temperature of BST909 hyaluronidase, the BST909 hyaluronidase solution was reacted with a 1% high molecular weight hyaluronic acid (Kewpie, HA-LQH) substrate solution for 1 hour at each temperature using a constant temperature water bath. Afterwards, the degree of decomposition of hyaluronic acid was compared by measuring the absorbance at 232 nm.

그 결과, 40℃까지 반응 온도가 상승할수록 효소의 분해 활성이 증가하였으나, 45℃에서 활성이 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 본 효소의 최적 반응 온도가 40℃임을 알 수 있었다.As a result, it was confirmed that the decomposition activity of the enzyme increased as the reaction temperature increased to 40°C, but the activity rapidly decreased at 45°C (Figure 6). Therefore, it was found that the optimal reaction temperature for this enzyme was 40°C.

실시예 4.2. BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 pH 확인Example 4.2. Confirmation of optimal reaction pH of BST909 hyaluronidase

BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 pH를 확인하기 위하여, 기질로 사용할 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 용액을 pH 별로 제조된 완충용액을 이용하여 pH 별로 제조하여, 효소 용액과 함께 35℃, 150 rpm, 1시간의 동일 조건으로 반응시켰다. 각 pH에 따른 기질용액은 10 mM sodium acetate, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0 완충용액, 10 mM SPB(sodium phosphate buffer), pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0 또는 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, pH 9.0 완충용액을 사용하여 제조하였다. 반응이 끝난 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다.In order to confirm the optimal reaction pH of BST909 hyaluronidase, a 1% polymer hyaluronic acid (Kewpie, HA-LQH) solution to be used as a substrate was prepared according to pH using buffer solutions prepared according to pH, and stored at 35°C together with the enzyme solution. The reaction was performed under the same conditions of 150 rpm and 1 hour. The substrate solution according to each pH is 10 mM sodium acetate, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0 buffer solution, 10 mM SPB (sodium phosphate buffer), pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0 or 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, It was prepared using a pH 9.0 buffer solution. After the reaction was completed, the absorbance at 232 nm was measured to compare the degree of decomposition of hyaluronic acid.

그 결과, BST909 히알루로니데이즈는 10 mM SPB(pH 7.0)을 이용하여 제작한 1% 고분자 히알루론산 용액과 반응 활성이 가장 높은 것을 확인하였다(도 7). 따라서, 본 효소의 최적 pH는 7.0임을 알 수 있었다.As a result, it was confirmed that BST909 hyaluronidase had the highest reaction activity with a 1% polymer hyaluronic acid solution prepared using 10 mM SPB (pH 7.0) (Figure 7). Therefore, it was found that the optimal pH of this enzyme was 7.0.

실시예 4.3. 금속염에 의한 BST909 히알루로니데이즈의 활성 저해 비교Example 4.3. Comparison of inhibition of BST909 hyaluronidase activity by metal salts

금속염에 의한 BST909 히알루로니데이즈의 활성 저해 정도를 비교하기 위하여, 효소 용액을 각 금속염 5 mM 용액과 1:1의 비율로 혼합하여 30℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 반응시켰다. 그 후, 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 용액과 30℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 추가 반응시킨 후, 80℃의 항온 수조에서 20분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 그 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다.To compare the degree of inhibition of BST909 hyaluronidase activity by metal salts, the enzyme solution was mixed with a 5 mM solution of each metal salt in a 1:1 ratio and reacted at 30°C, 150 rpm, and 1 hour. Afterwards, it was further reacted with a 1% polymer hyaluronic acid (Kewpie, HA-LQH) solution at 30°C, 150 rpm, 1 hour, and then heated in a constant temperature water bath at 80°C for 20 minutes to stop the reaction. Afterwards, the absorbance at 232 nm was measured to compare the degree of decomposition of hyaluronic acid.

그 결과, 바륨(Ba2+), 칼슘(Ca2+), 망간(Mn2+), 마그네슘(Mg2+), 칼륨(K+), 나트륨(Na+)과 같은 금속염 및 EDTA와 반응 시에는 히알루론산 분해 활성 정도가 유사하였으나, 은(Ag2+), 니켈(Ni2+), 철(Fe2+), 아연(Zn2+) 및 구리(Cu2+)와 같은 금속염 및 SDS와 반응한 효소는 그 분해 활성이 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 8).As a result, upon reaction with EDTA and metal salts such as barium (Ba 2+ ), calcium (Ca 2+ ), manganese (Mn 2+ ), magnesium (Mg 2+ ), potassium (K + ), and sodium (Na + ). The degree of hyaluronic acid decomposition activity was similar, but metal salts such as silver (Ag 2+ ), nickel (Ni 2+ ), iron (Fe 2+ ), zinc (Zn 2+ ), and copper (Cu 2+ ) and SDS It was confirmed that the decomposition activity of the reacted enzyme was greatly reduced (Figure 8).

실시예 5. BST909 히알루로니데이즈의 다당류에 대한 분해능 확인Example 5. Confirmation of resolution of polysaccharide of BST909 hyaluronidase

BST909 히알루로니데이즈의 타 다당류에 대한 분해능을 확인하기 위하여, 먼저 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH)과 콘드로이틴 설페이트 A/C, 더마탄 설페이트, 잔탄, 아가로즈와 같은 다당류를 1% 농도로 259 mM SPB(pH 7.0)에 용해시켜 다당류 기질용액을 제작하였다. 제작한 다당류 기질용액 100 ㎕, 증류수 600 ㎕, 259 mM SPB(pH 7.0) 200 ㎕, 효소용액 100 ㎕를 혼합하여 37℃, 150 rpm, 16시간 조건으로 반응시킨 후, 100℃의 항온수조에서 10분, 냉수에서 10분간 반응시켜 효소반응을 중지시켰다. 상기 반응액을 4℃, 15000 g, 15분 조건으로 원심분리 한 후, 상등액을 회수하여 232 nm에서 흡광도를 측정하여 다당류의 분해 정도를 비교하였다. To confirm the decomposition ability of BST909 hyaluronidase for other polysaccharides, first, polysaccharides such as high molecular weight hyaluronic acid (Kewpie, HA-LQH), chondroitin sulfate A/C, dermatan sulfate, xanthan, and agarose were dissolved at a concentration of 1%. A polysaccharide substrate solution was prepared by dissolving in mM SPB (pH 7.0). 100 ㎕ of the prepared polysaccharide substrate solution, 600 ㎕ of distilled water, 200 ㎕ of 259mM SPB (pH 7.0), and 100 ㎕ of enzyme solution were mixed and reacted at 37℃, 150 rpm, 16 hours, and then reacted in a constant temperature water bath at 100℃ for 10 minutes. The enzyme reaction was stopped by reacting in cold water for 10 minutes. After centrifuging the reaction solution at 4°C, 15,000 g, and 15 minutes, the supernatant was recovered and the absorbance was measured at 232 nm to compare the degree of polysaccharide decomposition.

그 결과, BST909 히알루로니데이즈는 소듐 히알루론산에만 분해능을 가지고 그 외의 다당류에는 분해 활성이 없는 것을 확인하였다(표 1).As a result, it was confirmed that BST909 hyaluronidase has decomposition activity only for sodium hyaluronic acid and no decomposition activity for other polysaccharides (Table 1).

기질temperament RA(%)RA(%) 1One sodium hyaluronate sodium hyaluronate 100.00 100.00 22 chondroitin sulfate A chondroitin sulfate A 0.812 0.812 33 chondroitin sulfate C chondroitin sulfate C 1.753 1.753 44 dermatan sulfate dermatan sulfate 1.596 1.596 55 xanthan xanthan -1.070 -1.070 66 agarose agarose -3.859 -3.859

실시예 6. BST909 히알루로니데이즈의 반응속도상수 분석Example 6. Analysis of reaction rate constants of BST909 hyaluronidase

BST909 히알루로니데이즈의 반응속도상수를 확인하기 위하여, 0% 내지 1%의 농도로 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH)을 10 mM SPB(pH 7.0, 3% NaCl)에 용해하여 사용하였다. To confirm the reaction rate constant of BST909 hyaluronidase, polymeric hyaluronic acid (Kewpie, HA-LQH) was used at a concentration of 0% to 1% dissolved in 10 mM SPB (pH 7.0, 3% NaCl).

각 농도별 고분자 히알루론산 기질용액을 BST909 히알루로니데이즈와 함께 35℃, 150 rpm, 1시간의 조건으로 반응시켰다. 232 nm에서 흡광도를 측정한 값을 다당류 히아루론산의 단위체인 N-아세틸-D-글루코사민을 농도별로 232 nm에서 흡광도를 측정한 값과 비교하여 시간당 분해 속도를 계산하였다.The polymer hyaluronic acid substrate solution at each concentration was reacted with BST909 hyaluronidase at 35°C, 150 rpm, and 1 hour. The decomposition rate per hour was calculated by comparing the absorbance measured at 232 nm with the absorbance measured at 232 nm for each concentration of N-acetyl-D-glucosamine, a monomer of the polysaccharide hyaluronic acid.

상기 반응을 통해 얻어진 기질(고분자 히알루론산) 농도와 이에 대한 분해 반응속도값을 이용하여 라인위버-버크 방정식을 작성하고, 미하엘리스 반응속도상수(Km) 및 최대반응속도(Vmax) 값을 계산하였다. 그 결과, Km 값이 0.0015 mM로서 기질에 대한 친화성이 높으며, Vmax 값이 50 mM/분으로 반응속도가 높은 것을 확인하였다(도 9).Using the concentration of the substrate (polymeric hyaluronic acid) obtained through the above reaction and its decomposition reaction rate, the Rheinweaver-Burke equation was created, and the Michaelis reaction rate constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) were calculated. . As a result, it was confirmed that the Km value was 0.0015mM, showing high affinity for the substrate, and the Vmax value was 50mM/min, indicating a high reaction rate (FIG. 9).

실시예 7. BST909 히알루로니데이즈의 분자량 확인Example 7. Confirmation of molecular weight of BST909 hyaluronidase

BST909 히알루로니데이즈의 분자량을 확인하기 위하여 상기 실시예 3.2에서 수득한 BST909 히알루로니데이즈를 SDS-PAGE를 통해 분자량을 대략적으로 확인하였다. 그 결과, BST909 히알루로니데이즈의 분자량은 약 127 kDa으로 확인되었다(도 10).In order to confirm the molecular weight of BST909 hyaluronidase, the molecular weight of BST909 hyaluronidase obtained in Example 3.2 was approximately confirmed through SDS-PAGE. As a result, the molecular weight of BST909 hyaluronidase was confirmed to be about 127 kDa (Figure 10).

상기 SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 경기바이오센터에 의뢰하여 N-말단 서열 분석을 진행하였다. 그 결과, 히알루로네이트 리이아제 전구체 HylB(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus SzAM60)와 86.5%의 유사성을 갖는 것을 확인하였다(도 11). 또한, 상기 N-말단 서열을 NCBI BLAST를 이용하여 검색 시, N-말단의 LWLSPMATGTEKK 서열(서열번호 3)이 히알루로네이트 리이아제 전구체 HylB를 포함한 다양한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주의 히알루로네이트 리이아제의 아미노산 서열에 존재하는 것을 확인하였다. 하지만, 스트렙토코커스 속에 속하는 여러 종의 균이 가지는 히알루로니데이즈의 분자량은 116 kDa(Streptococcus Agalactiae, Streptococcus Dysglactiae), 54 kDa(Streptococcus Uberis), 55 kDa(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) 등으로 다양하나 BST909 히알루로니데이즈와는 차이가 있다.The protein separated through SDS-PAGE was sent to Gyeonggi Bio Center for N-terminal sequence analysis. As a result, it was confirmed to have 86.5% similarity to the hyaluronate lyase precursor HylB ( Streptococcus equi subsp. zooepidemicus SzAM60) (FIG. 11). In addition, when the N-terminal sequence was searched using NCBI BLAST, the N-terminal LWLSPMATGTEKK sequence (SEQ ID NO: 3) was hyaluronate lyase of various Streptococcus zooepidemicus strains, including the hyaluronate lyase precursor HylB. It was confirmed that it exists in the amino acid sequence of the enzyme. However, the molecular weight of hyaluronidase in various species of bacteria belonging to the Streptococcus genus varies, such as 116 kDa ( Streptococcus Agalactiae , Streptococcus Dysglactiae ), 54 kDa ( Streptococcus Uberis ), and 55 kDa ( Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ), but BST909 Hyaluronic Acid It is different from Ronnie Days.

이를 통해, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주에서 분리한 BST909 히알루로니데이즈가 일반 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주의 히알루로니데이즈와는 다른 신규한 효소임을 확인하였다.Through this, it was confirmed that BST909 hyaluronidase isolated from the Streptococcus zooepidemicus BST909 strain is a novel enzyme different from the hyaluronidase of the general Streptococcus zooepidemicus strain.

실시예 8. BST909 히알루로니데이즈를 이용하여 저분자 히알루론산의 제조 방법Example 8. Method for producing low molecular weight hyaluronic acid using BST909 hyaluronidase

상기 실시예 3.2에서 수득된 BST909 히알루로니데니즈를 35 unit/mL로 제조하여 사용하였으며, 효소 반응은 기질량의 10%(v/v)의 효소액을 첨가(효소의 최종 역가는 3.5 unit/mL)하여 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 수행하였다. HPLC 분석은 YMC-Pack Polyamine II(PB12S05-2546WT, YMC)컬럼을 사용하여 자외선 흡광도 210 nm에서 수행하였고, 이동상은 1 M NaH2PO4를 사용하였으며, 5 mM에서 1 M까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다. The BST909 hyaluronidenase obtained in Example 3.2 was prepared and used at 35 units/mL, and the enzyme reaction was performed by adding 10% (v/v) of the substrate amount of enzyme solution (the final titer of the enzyme was 3.5 unit/mL). ) was carried out at 30°C while stirring at 200 rpm. HPLC analysis was performed at an ultraviolet absorbance of 210 nm using a YMC-Pack Polyamine II (PB12S05-2546WT, YMC) column, and 1 M NaH 2 PO 4 was used as the mobile phase, using a linear concentration gradient from 5 mM to 1 M. It eluted.

또한, 유속은 1.0 mL/분에서 측정하였다. BST909 히알루로니데이즈 반응시간에 따른 고분자 히알루론산의 분해 과정을 도 12에 나타내었고, 경기바이오센터에 의뢰하여 MALDI-TOF와 LC-MS로 최종 분해 산물을 분석한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. Additionally, the flow rate was measured at 1.0 mL/min. The decomposition process of high molecular weight hyaluronic acid according to the BST909 hyaluronidase reaction time is shown in Figure 12, and the results of analyzing the final decomposition product by MALDI-TOF and LC-MS at Gyeonggi Bio Center are shown in Figures 13 and 14. It was.

그 결과, 도 12 내지 도 14에 나타난 바와 같이, BST909 히알루로니데이즈와 3시간 반응시 1,200 kDa 내지 2,200 kDa의 고분자 히알루론산이 약 380 Da ~ 400 Da의 이당류 및 약 760 Da의 사당류로 분해되었음을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 12 to 14, upon reaction with BST909 hyaluronidase for 3 hours, high molecular weight hyaluronic acid of 1,200 kDa to 2,200 kDa was decomposed into disaccharides of about 380 Da to 400 Da and tetrasaccharides of about 760 Da. Confirmed.

따라서, BST909 히알루로니데이즈는 고분자 히알루론산을 분해하여 저분자 히알루론산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, it was found that BST909 hyaluronidase can produce low-molecular-weight hyaluronic acid by decomposing high-molecular-weight hyaluronic acid.

한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC14238BPKCTC14238BP 2020071420200714

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tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag 720 cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgctg agtgctaggt gttaggccct ttccggggct 840 tagtgccgga gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gatgctattc ttagagataa gaagttactt 1020 cggtacattg gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca acccttattg ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta 1140 gcgagactgc cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg 1260 gcaagctaat ctctgaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320 aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380 gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaaccgt 1440 taaggagcca gccgcctaag gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa cagggtaacc 1500 gta 1503 <210> 2 <211> 1059 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BST909 hyaluronidase N-terminal sequence <400> 2 Met Lys Gln Arg Lys Lys Leu Ser Ser Ser Val Cys Ser Ser Ile Ile 1 5 10 15 Leu Ala Cys Leu Phe Arg Ala Pro Thr Val Leu Ala Glu Glu Lys Thr 20 25 30 Ala Ala Lys Ala Ile Ser Lys Glu Leu Gln Arg Val Lys Lys Ala Pro 35 40 45 Leu Lys Thr Glu Glu Ala Ser Gln Glu Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp 50 55 60 Ala Ser Ser Val Ala Thr Glu Ser Ser Leu Gly Glu Gln Leu Ile Leu 65 70 75 80 Thr Gly Asp Asn Leu Leu Lys Asn Pro Gln Phe Asp Gln Thr Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Glu His Gln Ser Thr Ser Leu Trp Ser Lys Glu Ser Ala Asn 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Tyr Lys Asp Ala Ser Lys Ser Gln Gly Cys Pro Lys 115 120 125 Ile Ala Val Ser Asp Asn Lys Leu Thr Met Thr Ser Asp Gly Asn Gln 130 135 140 Arg Phe Arg Gly Cys Val His Gln Thr Val Ala Ile Asn Pro Asp Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Leu Leu Thr Glu Asp Ile Glu Thr Lys Asp Lys Thr Gly Gln 165 170 175 Ala Phe Ala Arg Ile Ile Glu Glu Ile Lys Gln Gly Ser Gly Ala Ala 180 185 190 Lys Glu Gln Arg Leu Trp Leu Ser Pro Met Ala Thr Gly Thr Glu Lys 195 200 205 Lys His Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Pro Lys Leu Lys Val Asn Gln Ile 210 215 220 Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Ala Gly His Gly Gln Val Val Phe Asp 225 230 235 240 Asn Leu Ser Leu Arg Glu Ala Gly Asp Lys Pro Ser Asp Asp Ile Lys 245 250 255 Ile Ala Ser His Tyr Leu Glu Glu Gln Ile Val Leu Pro Leu Asn Lys 260 265 270 His Tyr Leu Met Glu Met Ala Asp Tyr His Tyr Gln Ile Ala Ala Glu 275 280 285 Ser Ser Asn Ile Val Arg Val Glu Asn Gly Leu Leu Ile Pro Leu Ala 290 295 300 Gln Gly Lys Thr Leu Leu Glu Val Leu Asp Gln Glu Gly Gln Arg Val 305 310 315 320 Val Thr Val Pro Val Glu Ile Leu Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Thr 325 330 335 Ser Leu Ile Thr Lys Trp Cys Glu Val Ile Leu Gly Ala Glu Asn Phe 340 345 350 Asp Arg Ser Ser Pro Ala Met Val Ala Leu Asn Gln Lys Leu Asp Asp 355 360 365 Ser Val Thr Lys Asn Leu Ala Val Leu Thr Lys Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Tyr Leu Trp Ser Asp Leu Ala Asp Leu His Gln Ser Ser His Met Thr 385 390 395 400 Ala Thr Cys Arg Arg Leu Glu Glu Met Ala Lys Gln Val Ser Ser Leu 405 410 415 Ala Ser Arg Tyr Tyr Gln Asp Lys Glu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Asp 420 425 430 Lys Leu Ala Trp Leu Thr Leu Asn Tyr Tyr His Pro Gln Lys Asp Ile 435 440 445 Glu Gly Lys Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu Ile Gly Thr Pro Arg Ala 450 455 460 Ile Val Asn Thr Leu Ala Phe Ile Tyr Pro Tyr Val Thr Gln Glu Glu 465 470 475 480 Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Gly Ile Ser His Phe Val Pro Asn Pro Arg 485 490 495 Gln Phe Arg Ser Thr Leu Val Asn Pro Phe Lys Ala Ile Gly Gly Asn 500 505 510 Leu Val Asp Met Gly Arg Ile Lys Ile Ile Glu Ala Leu Leu Lys His 515 520 525 Asp Lys Lys Ala Leu Gln Asp Ser Ile Ala Ala Leu Asp Thr Leu Phe 530 535 540 Ala Phe Gln Pro Arg Gly Ser Lys Gly Glu Gly Phe Tyr Glu Asp Gly 545 550 555 560 Ser Tyr Ile Asp His Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn 565 570 575 Val Leu Ile Asp Gly Leu Ser Gln Leu Val Pro Leu Ile Gln Gln Ser 580 585 590 Ala Ala Ser Leu Asp Gln Lys Lys Leu Glu Ala Met Thr His Trp Ile 595 600 605 Glu Gln Ala Phe Leu Pro Leu Met Val His Gly Glu Leu Met Asp Met 610 615 620 Asn Arg Gly Arg Ser Ile Ser Arg Glu Asn Ala Ser Ser Arg Gln Ala 625 630 635 640 Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gly Met Leu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Pro 645 650 655 Glu Gln Ala Lys Ile Arg Ile Lys Ala Val Leu Ala Phe His Asn Gln 660 665 670 Glu Ala Ile Leu Glu Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr Asp Met Lys Leu Phe 675 680 685 Lys Glu Leu Leu Glu Asp Thr Ala Ile Gln Ala Ser Pro Val Lys Ser 690 695 700 Tyr Leu Ser Leu Phe Asn Gln Met Asp Lys Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala 705 710 715 720 Glu Lys Asp Phe Ala Phe Ala Leu Ser Leu His Ser Asn Lys Thr Leu 725 730 735 Asn Phe Glu Ala Met Asn Asn Glu Asn Thr Arg Gly Trp Tyr Thr Gly 740 745 750 Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp Leu Gly His Tyr Ser Asp 755 760 765 Arg Phe Trp Pro Thr Val Asn Pro Leu Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu 770 775 780 Ala Glu Val His Arg Glu Asp Val Thr Val Ala Tyr Leu Lys Lys Leu 785 790 795 800 Thr Asn Asp Tyr Lys Glu Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gly Met Ser Thr 805 810 815 Gln Gln Ser Ser Phe Val Gly Ala Ile Lys Ala Gly Asp Lys Thr Ala 820 825 830 Leu Ala Val Met Asp Phe Gln Asn Trp Asp Arg Thr Val Thr Ala Lys 835 840 845 Lys Ser Trp Thr Ile Leu Asp Asp Gln Ile Val Phe Leu Gly Thr Ala 850 855 860 Ile Thr Ser Gln Thr His Gln Ala Val Ser Thr Thr Ile Asp Gln Arg 865 870 875 880 Lys Glu Asn Pro Asp Asn Ser Tyr Thr Leu Phe Ile Asn Gly Gln Glu 885 890 895 Thr Ala Leu Thr Glu Glu Val Leu His Arg Asp Asp Val Thr Ser Leu 900 905 910 Leu Leu Leu Ser Lys Asp Gly Gln Ala Asn Ile Gly Tyr Leu Phe Ala 915 920 925 Lys Pro Thr Ser Leu Ala Leu Ser Arg Lys Val Gln Ser Gly Arg Trp 930 935 940 Ser Glu Ile Asn Thr Asn Ser Lys Asn Glu Asp Leu Ile Ser Gln Ser 945 950 955 960 Phe Ile Thr Ile Ser Gln Ala His Ser Gln Ala Ser Asp Ser Tyr Ala 965 970 975 Tyr Thr Leu Leu Pro Asn Ile Ser Lys Ala Asp Phe Asp Lys Val Cys 980 985 990 Ser Glu Ala Arg Ile Glu Val Leu Gln Asn Asp Ser Lys Leu Gln Leu 995 1000 1005 Ile His Asp Lys Lys Gln Gly Leu Leu Ala Val Val Lys Tyr Asn Gln 1010 1015 1020 Ala Lys Glu Val Val Asn Gly Gln Leu Ser Leu Glu Lys Ser Gly Leu 1025 1030 1035 1040 Tyr Leu Tyr Gln Lys Val Gly Asn Asp Phe Lys Gln Leu Ser Phe Lys 1045 1050 1055 Ala Leu Ser <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyaluronidase fragment sequence <400> 3 Leu Trp Leu Ser Pro Met Ala Thr Gly Thr Glu Lys Lys 1 5 10 <110> Biostream Technologies Co., Ltd. <120> NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND HYALURONIDASE DERIVED FROM THE SAME <130>SPD20-149BST <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1503 <212> RNA <213> Streptococcus equi <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt ggaacgcaca gatgatacgt 60 agcttgctac aattatctgt gagtcgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctagctt 120 atagcggggg ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataaaagtgg ttgacccatg 180 ttaactattt aaaaggagca acagctccac tatgagatgg acctgcgttg tattagctag 240 ttggtagggt aaaggcctac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgaacggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg 360 caatgggggg aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa 420 agctctgttg ttagagaaga acagtgatgg gagtggaaag tccatcatgt gacggtaact 480 aaccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg 540 ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tgataagtct gaagttaaag 600 gcagtggctt aaccattgta tgctttggaa actgttaaac ttgagtgcag aagggggagag 660 tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag 720 cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgctg agtgctaggt gttaggccct ttccggggct 840 tagtgccgga gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gatgctattc ttagagataa gaagttactt 1020 cggtacattg gagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca acccttattg ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta 1140 gcgagactgc cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg 1260 gcaagctaat ctctgaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320 aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380 gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaaccgt 1440 taaggagcca gccgcctaag gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa cagggtaacc 1500 gta 1503 <210> 2 <211> 1059 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BST909 hyaluronidase N-terminal sequence <400> 2 Met Lys Gln Arg Lys Lys Leu Ser Ser Ser Val Cys Ser Ser Ile Ile 1 5 10 15 Leu Ala Cys Leu Phe Arg Ala Pro Thr Val Leu Ala Glu Glu Lys Thr 20 25 30 Ala Ala Lys Ala Ile Ser Lys Glu Leu Gln Arg Val Lys Lys Ala Pro 35 40 45 Leu Lys Thr Glu Glu Ala Ser Gln Glu Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp 50 55 60 Ala Ser Ser Val Ala Thr Glu Ser Ser Leu Gly Glu Gln Leu Ile Leu 65 70 75 80 Thr Gly Asp Asn Leu Leu Lys Asn Pro Gln Phe Asp Gln Thr Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Glu His Gln Ser Thr Ser Leu Trp Ser Lys Glu Ser Ala Asn 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Tyr Lys Asp Ala Ser Lys Ser Gln Gly Cys Pro Lys 115 120 125 Ile Ala Val Ser Asp Asn Lys Leu Thr Met Thr Ser Asp Gly Asn Gln 130 135 140 Arg Phe Arg Gly Cys Val His Gln Thr Val Ala Ile Asn Pro Asp Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Leu Leu Thr Glu Asp Ile Glu Thr Lys Asp Lys Thr Gly Gln 165 170 175 Ala Phe Ala Arg Ile Ile Glu Glu Ile Lys Gln Gly Ser Gly Ala Ala 180 185 190 Lys Glu Gln Arg Leu Trp Leu Ser Pro Met Ala Thr Gly Thr Glu Lys 195 200 205 Lys His Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Pro Lys Leu Lys Val Asn Gln Ile 210 215 220 Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Ala Gly His Gly Gln Val Val Phe Asp 225 230 235 240 Asn Leu Ser Leu Arg Glu Ala Gly Asp Lys Pro Ser Asp Asp Ile Lys 245 250 255 Ile Ala Ser His Tyr Leu Glu Glu Gln Ile Val Leu Pro Leu Asn Lys 260 265 270 His Tyr Leu Met Glu Met Ala Asp Tyr His Tyr Gln Ile Ala Ala Glu 275 280 285 Ser Ser Asn Ile Val Arg Val Glu Asn Gly Leu Leu Ile Pro Leu Ala 290 295 300 Gln Gly Lys Thr Leu Leu Glu Val Leu Asp Gln Glu Gly Gln Arg Val 305 310 315 320 Val Thr Val Pro Val Glu Ile Leu Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Thr 325 330 335 Ser Leu Ile Thr Lys Trp Cys Glu Val Ile Leu Gly Ala Glu Asn Phe 340 345 350 Asp Arg Ser Ser Pro Ala Met Val Ala Leu Asn Gln Lys Leu Asp Asp 355 360 365 Ser Val Thr Lys Asn Leu Ala Val Leu Thr Lys Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Tyr Leu Trp Ser Asp Leu Ala Asp Leu His Gln Ser Ser His Met Thr 385 390 395 400 Ala Thr Cys Arg Arg Leu Glu Glu Met Ala Lys Gln Val Ser Ser Leu 405 410 415 Ala Ser Arg Tyr Tyr Gln Asp Lys Glu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Asp 420 425 430 Lys Leu Ala Trp Leu Thr Leu Asn Tyr Tyr His Pro Gln Lys Asp Ile 435 440 445 Glu Gly Lys Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu Ile Gly Thr Pro Arg Ala 450 455 460 Ile Val Asn Thr Leu Ala Phe Ile Tyr Pro Tyr Val Thr Gln Glu Glu 465 470 475 480 Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Gly Ile Ser His Phe Val Pro Asn Pro Arg 485 490 495 Gln Phe Arg Ser Thr Leu Val Asn Pro Phe Lys Ala Ile Gly Gly Asn 500 505 510 Leu Val Asp Met Gly Arg Ile Lys Ile Ile Glu Ala Leu Leu Lys His 515 520 525 Asp Lys Lys Ala Leu Gln Asp Ser Ile Ala Ala Leu Asp Thr Leu Phe 530 535 540 Ala Phe Gln Pro Arg Gly Ser Lys Gly Glu Gly Phe Tyr Glu Asp Gly 545 550 555 560 Ser Tyr Ile Asp His Thr Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn 565 570 575 Val Leu Ile Asp Gly Leu Ser Gln Leu Val Pro Leu Ile Gln Gln Ser 580 585 590 Ala Ala Ser Leu Asp Gln Lys Lys Leu Glu Ala Met Thr His Trp Ile 595 600 605 Glu Gln Ala Phe Leu Pro Leu Met Val His Gly Glu Leu Met Asp Met 610 615 620 Asn Arg Gly Arg Ser Ile Ser Arg Glu Asn Ala Ser Ser Arg Gln Ala 625 630 635 640 Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gly Met Leu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Pro 645 650 655 Glu Gln Ala Lys Ile Arg Ile Lys Ala Val Leu Ala Phe His Asn Gln 660 665 670 Glu Ala Ile Leu Glu Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr Asp Met Lys Leu Phe 675 680 685 Lys Glu Leu Leu Glu Asp Thr Ala Ile Gln Ala Ser Pro Val Lys Ser 690 695 700 Tyr Leu Ser Leu Phe Asn Gln Met Asp Lys Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala 705 710 715 720 Glu Lys Asp Phe Ala Phe Ala Leu Ser Leu His Ser Asn Lys Thr Leu 725 730 735 Asn Phe Glu Ala Met Asn Asn Glu Asn Thr Arg Gly Trp Tyr Thr Gly 740 745 750 Asp Gly Met Phe Tyr Leu Tyr Asn Ser Asp Leu Gly His Tyr Ser Asp 755 760 765 Arg Phe Trp Pro Thr Val Asn Pro Leu Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu 770 775 780 Ala Glu Val His Arg Glu Asp Val Thr Val Ala Tyr Leu Lys Lys Leu 785 790 795 800 Thr Asn Asp Tyr Lys Glu Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gly Met Ser Thr 805 810 815 Gln Gln Ser Ser Phe Val Gly Ala Ile Lys Ala Gly Asp Lys Thr Ala 820 825 830 Leu Ala Val Met Asp Phe Gln Asn Trp Asp Arg Thr Val Thr Ala Lys 835 840 845 Lys Ser Trp Thr Ile Leu Asp Asp Gln Ile Val Phe Leu Gly Thr Ala 850 855 860 Ile Thr Ser Gln Thr His Gln Ala Val Ser Thr Thr Ile Asp Gln Arg 865 870 875 880 Lys Glu Asn Pro Asp Asn Ser Tyr Thr Leu Phe Ile Asn Gly Gln Glu 885 890 895 Thr Ala Leu Thr Glu Glu Val Leu His Arg Asp Asp Val Thr Ser Leu 900 905 910 Leu Leu Leu Ser Lys Asp Gly Gln Ala Asn Ile Gly Tyr Leu Phe Ala 915 920 925 Lys Pro Thr Ser Leu Ala Leu Ser Arg Lys Val Gln Ser Gly Arg Trp 930 935 940 Ser Glu Ile Asn Thr Asn Ser Lys Asn Glu Asp Leu Ile Ser Gln Ser 945 950 955 960 Phe Ile Thr Ile Ser Gln Ala His Ser Gln Ala Ser Asp Ser Tyr Ala 965 970 975 Tyr Thr Leu Leu Pro Asn Ile Ser Lys Ala Asp Phe Asp Lys Val Cys 980 985 990 Ser Glu Ala Arg Ile Glu Val Leu Gln Asn Asp Ser Lys Leu Gln Leu 995 1000 1005 Ile His Asp Lys Lys Gln Gly Leu Leu Ala Val Val Lys Tyr Asn Gln 1010 1015 1020 Ala Lys Glu Val Val Asn Gly Gln Leu Ser Leu Glu Lys Ser Gly Leu 1025 1030 1035 1040 Tyr Leu Tyr Gln Lys Val Gly Asn Asp Phe Lys Gln Leu Ser Phe Lys 1045 1050 1055 Ala Leu Ser <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyaluronidase fragment sequence <400> 3 Leu Trp Leu Ser Pro Met Ala Thr Gly Thr Glu Lys Lys 1 5 10

Claims (11)

비용혈성이고, 히알루론산 분해효소를 생산하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP).Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (Accession number: KCTC 14238BP), which is non-hemolytic and is characterized by producing hyaluronic acid decomposing enzyme. 제1항에 있어서,
상기 균주의 16s rRNA가 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP).According to paragraph 1,
Streptococcus juepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP), characterized in that the 16s rRNA of the strain includes SEQ ID NO: 1. 삭제delete 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소. Hyaluronic acid decomposing enzyme containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 2. 제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)로부터 수득되는 것인, 히알루론산 분해 효소.According to paragraph 4,
The hyaluronic acid-decomposing enzyme is obtained from Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP). 제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 15℃ 내지 45℃에서 고분자 히알루론산 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.According to paragraph 4,
A hyaluronic acid decomposing enzyme, characterized in that the hyaluronic acid decomposing enzyme exhibits high molecular weight hyaluronic acid decomposing activity at 15°C to 45°C. 제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 pH 4.0 내지 pH 9.0에서 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.According to paragraph 4,
A hyaluronic acid-decomposing enzyme, characterized in that the hyaluronic acid-decomposing enzyme exhibits decomposition activity at pH 4.0 to pH 9.0. 제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 Ag2+, Ni2+, Fe2+, Zn2+ 및 Cu2+ 로부터 선택되는 어느 하나에 의해 분해 활성이 저해되는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.According to paragraph 4,
A hyaluronic acid-decomposing enzyme, characterized in that the decomposition activity of the hyaluronic acid-decomposing enzyme is inhibited by any one selected from Ag 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ and Cu 2+ . 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계;
배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는
히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법.Culturing Streptococcus equi subsp. zooepidemicus BST909 strain (accession number: KCTC 14238BP);
Comprising the step of purifying hyaluronic acid decomposing enzyme from the culture medium
Method for producing hyaluronic acid decomposing enzyme. 고분자 히알루론산에 제4항의 히알루론산 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는 저분자 히알루론산 제조 방법.A method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid, comprising the step of treating high-molecular-weight hyaluronic acid with the hyaluronic acid-decomposing enzyme of claim 4. 제10항에서,
상기 저분자 히알루론산은 크기가 380 Da 내지 100 kDa인 것인, 저분자 히알루론산의 제조 방법.


In paragraph 10:
The low molecular weight hyaluronic acid has a size of A method for producing low molecular weight hyaluronic acid, which is 380 Da to 100 kDa.
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