KR102579393B1 - Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof - Google Patents

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KR102579393B1
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Abstract

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 항-C-MPL 항체(2R13)는 고분자 물질로서 종래 치료 제제에 비해 긴 반감기를 가지며, 항체 제제로써 자가 항체 생성 및 면역원성 가능성이 낮다는 장점이 있다. 또한, 만성 또는 합병증으로 유도되는 면역 혈소판 감소증이 나타나는 환자의 혈소판 수치를 증가시켜, 혈소판 감소증의 치료 제제로 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel anti-C-MPL antibody and its use, and specifically to an anti-C-MPL antibody that has the effect of increasing platelet production and number through maturation of megakaryocytes in the bone marrow and its use. The novel anti-C-MPL antibody (2R13) of the present invention is a polymer material and has a long half-life compared to conventional therapeutic agents, and as an antibody agent, it has the advantage of low possibility of autoantibody production and immunogenicity. Additionally, it can be used as a treatment agent for thrombocytopenia by increasing the platelet count in patients suffering from chronic or complication-induced immune thrombocytopenia.

Description

신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도{Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof}Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof}

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel anti-C-MPL antibody and its use, and specifically to an anti-C-MPL antibody that has the effect of increasing platelet production and number through maturation of megakaryocytes in the bone marrow and its use.

면역 혈소판 감소증(ITP)은 가속화된 혈소판 파괴 및 혈소판 생성 장애로 인한 낮은 혈소판 수(분리된 말초 혈소판 수 100 × 109 L 미만)를 특징으로 한다. 병원성 자가반응 항체, 혈소판 항원에 대한 T 세포, 사이토카인 불균형 및 골수 틈새의 미세 환경은 말초 혈소판 수치 감소에 기여하여, 주로 만성 질환으로 이어진다. ITP 환자의 약 18%는 무증상이지만, 활동성 출혈은 ITP 환자의 주요 위험인자이며 비출혈을 포함하는 점상출혈, 자반병, 요로 점막출혈, 위장관 또는 구강 내 출혈 등 다양한 증상으로 나타날 수 있다. 따라서 충분한 지혈이 가능한 내구성 혈소판 수를 회복시키는 것이 ITP 환자의 주요한 치료 전략이 되었다.Immune thrombocytopenia (ITP) is characterized by low platelet count (isolated peripheral platelet count less than 100 × 109 L) due to accelerated platelet destruction and impaired platelet production. Pathogenic autoreactive antibodies, T cells against platelet antigens, cytokine imbalance and the microenvironment of the bone marrow niche contribute to a decrease in peripheral platelet count, mainly leading to chronic disease. Approximately 18% of ITP patients are asymptomatic, but active bleeding is a major risk factor for ITP patients and can manifest as a variety of symptoms, including epistaxis, petechiae, purpura, urinary mucosal hemorrhage, and bleeding in the gastrointestinal tract or oral cavity. Therefore, restoring a durable platelet count capable of sufficient hemostasis has become a major treatment strategy for ITP patients.

생리학적으로 혈전의 생성은 다양한 사이토카인에 의해 여러 단계에서 조절되며, 그 중 가장 중요한 것은 트롬보포이에틴(TPO)이다. TPO는 HSC에서 거핵구 계통을 결정하고 TPO 수용체인 c-MPL을 통해 골수 틈새에서 거핵구의 성숙을 자극한다. 이러한 과정은 순환하는 혈소판에 의한 TPO에 대한 결합 및 제거를 수반하는 음성 피드백 루프를 통해 혈장 TPO 수준에 의해 조절된다. 따라서, 감소된 혈소판 수는 순환 TPO 수준을 증가시키고, 이는 차례로 거대핵세포 생성을 촉진하여 혈소판 수를 정상화한다. 실제로 재생 불량성 빈혈에 의해 유발된 이차 유발성 혈소판 감소증 환자에서 TPO 수준의 상승이 나타났다. 그러나 ITP 환자에서 TPO 수치와 혈소판 회전율은 유의한 변화가 없었다. 오히려 건강한 피험자와 비교할 때 정상 또는 감소된 TPO 수준과 더 짧은 생존 시간을 가진 혈소판이 관찰되었다. 또한 일부 환자에서 거핵구의 수가 증가하였으나, 이러한 거핵구는 종종 미성숙하거나 형태학적 이상을 나타내면서 caspase-3가 활성화되어 혈소판 생산성을 저하시켰다. 이러한 임상 결과는 항상성에 도달하기 위해 내인성 TPO를 모방하는 치료제의 개발로 이어졌다.Physiologically, the formation of blood clots is regulated at several stages by various cytokines, the most important of which is thrombopoietin (TPO). TPO determines the megakaryocyte lineage in HSCs and stimulates the maturation of megakaryocytes in the bone marrow niche through the TPO receptor, c-MPL. This process is regulated by plasma TPO levels through a negative feedback loop involving binding to and clearance of TPO by circulating platelets. Therefore, a reduced platelet count increases circulating TPO levels, which in turn promotes megakaryocyte production and normalizes the platelet count. In fact, elevated TPO levels were observed in patients with secondary thrombocytopenia caused by aplastic anemia. However, there was no significant change in TPO levels and platelet turnover in ITP patients. Rather, platelets with normal or reduced TPO levels and shorter survival times were observed when compared to healthy subjects. In addition, although the number of megakaryocytes increased in some patients, these megakaryocytes were often immature or showed morphological abnormalities, and caspase-3 was activated, leading to decreased platelet productivity. These clinical findings have led to the development of therapeutics that mimic endogenous TPO to reach homeostasis.

현재까지 FDA에서 ITP 치료제로 승인한 TPO 모방체(TPO-RA)는 로미플로스팀(Romiplostim), 엘레트롬보팍(Eltrombopag) 및 아바트롬보팍(Avatrombopag)이다. 로미플로스팀이 세포외 분자에 작용하는 펩티바디인 반면, 나머지는 막횡단 부위에 결합하는 비 펩티드 분자이며, 임상 시험에서 혈소판 생성 및 지혈에 대한 이러한 제제들의 효능 및 내약성이 이미 검증되었다. 그럼에도 불구하고 로미플로스팀을 투여받는 일련의 1차 ITP 성인 환자의 경우, 피험자의 59.5%가 내인성 TPO와의 교차 반응성 없이 원치 않는 중화 항체로 인해 반응 상실을 나타냈으며, 엘레트롬보팍은 비특이성으로 보고되었다. 이러한 제제는 강력한 철 킬레이트제 역할을 하여 백혈병 세포주에 항증식 효과를 일으키고 일부 환자에서는 드물게 철 결핍을 유발한다. 또한 식이 제한 및 간독성과 같은 비교적 빈번한 부작용이 기술되었다. 아바트롬보팍은 기존 치료제 부족에 대한 대안으로 2018년 FDA 승인을 받았다. 이로써 기존 의약품(로미플로스팀, 엘레트롬보팍)의 문제점은 해결됐지만, 일일 투여 빈도가 요구되었다. 아바트롬보팍 및 그 대사체의 88%는 주로 대변으로 배설되며, 그 중 34%는 대사되지 않은 상태로 배설된다. 이러한 결과는 더 오래 지속되고 더 효과적인 치료법이 개발될 필요성이 있음을 의미한다.To date, the TPO mimetics (TPO-RAs) approved by the FDA for the treatment of ITP are Romiplostim, Eltrombopag, and Avatrombopag. While romiplostim is a peptibody that acts on extracellular molecules, the others are non-peptide molecules that bind to transmembrane sites, and clinical trials have already demonstrated the efficacy and tolerability of these agents on platelet production and hemostasis. Nevertheless, in a series of adult patients with primary ITP receiving romiplostim, 59.5% of subjects showed loss of response due to unwanted neutralizing antibodies without cross-reactivity with endogenous TPO, and eletrombopag was reported to be nonspecific. It has been done. These agents act as potent iron chelators, producing antiproliferative effects on leukemia cell lines and rarely causing iron deficiency in some patients. Additionally, relatively frequent side effects such as dietary restrictions and hepatotoxicity have been described. Avatrombopag was approved by the FDA in 2018 as an alternative to the lack of existing treatments. This solved the problems with existing drugs (Romiplostim, Eletrombopag), but required a daily administration frequency. 88% of avatrombopag and its metabolites are mainly excreted in the feces, of which 34% is excreted unmetabolized. These results mean there is a need to develop longer-lasting and more effective treatments.

TPO 작용제 미니바디, Fab 및 도메인 하위 분류 변환된 TPO 작용제 항체를 설정하려는 이전의 시도에도 불구하고, 항체 기반 TPO 작용제의 임상 연구는 아직 보고되지 않았다. 본 발명에서, 본 발명자들은 TPO 수용체 작용제 항체를 개발하였다. 이 작용제 ab는 인간 1차 세포에서 거핵 생성 및 혈소판 활성화를 자극하도록 구성되었으며, 동시에 혈소판 감소증 유발 마우스 모델에서 혈소판 수를 회복하여 천연 리간드 TPO의 생물학적 기능을 복제함을 입증하였다. 본 발명은 치료적 관점에서, 연장된 반감기와 효능 및 임상 안전성을 보장하는 우수한 TPO 모방체로서 제공될 수 있다.TPO agonist minibodies, Fabs and domain subclasses Despite previous attempts to establish converted TPO agonist antibodies, clinical studies of antibody-based TPO agonists have not yet been reported. In the present invention, the inventors developed a TPO receptor agonist antibody. This agonist ab was formulated to stimulate megakaryopoiesis and platelet activation in human primary cells, while demonstrating that it replicates the biological function of the natural ligand TPO by restoring platelet numbers in a thrombocytopenia-induced mouse model. From a therapeutic perspective, the present invention can serve as an excellent TPO mimetic with extended half-life and guaranteed efficacy and clinical safety.

국제특허공개공보 WO 2015-029074International Patent Publication WO 2015-029074

본 발명의 목적은 신규 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.The purpose of the present invention is to provide a novel anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof.

본 발명의 다른 목적은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof, a recombinant expression vector containing the nucleic acid molecule, and a cell transformed with the recombinant expression vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating thrombocytopenia comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. heavy chain variable region; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Provided is a c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.Additionally, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.Additionally, the present invention provides a recombinant expression vector containing the above nucleic acid molecule.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.Additionally, the present invention provides cells transformed with the above recombinant expression vector.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 대한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 항-C-MPL 항체(2R13)는 고분자 물질로서 종래 치료 제제에 비해 긴 반감기를 가지며, 항체 제제로써 자가 항체 생성 및 면역원성 가능성이 낮다는 장점이 있다. 또한, 만성 또는 합병증으로 유도되는 면역 혈소판 감소증이 나타나는 환자의 혈소판 수치를 증가시켜, 혈소판 감소증의 치료 제제로 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel anti-C-MPL antibody and its use, and specifically to an anti-C-MPL antibody that has the effect of increasing platelet production and number through maturation of megakaryocytes in the bone marrow and its use. The novel anti-C-MPL antibody (2R13) of the present invention is a polymer material and has a long half-life compared to conventional therapeutic agents, and as an antibody agent, it has the advantage of low possibility of autoantibody production and immunogenicity. Additionally, it can be used as a treatment agent for thrombocytopenia by increasing the platelet count in patients suffering from chronic or complication-induced immune thrombocytopenia.

도 1은 기능성 scFv-Fc 항체인 2R13이 TPOR에 특이적으로 결합함을 나타내는 것이다.
도 2는 2R13이 세포 성장을 촉진하고 BaF3/MPL 세포에서 JAK/STAT 신호 전달 경로를 자극함을 나타낸 것이다.
도 3 내지 도 5는 2R13이 PB CD34+ 세포의 거핵세포 분화를 유도함을 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 2R13이 PB-CD34+ 세포로부터 높은 배수성 거핵구 분화를 유도함을 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 2R13이 인간 혈소판에서 TPOR 신호 전달 경로를 자극함을 나타낸 것이다.
도 11은 WT 마우스 모델에서 혈소판 및 WBC에 대한 2R13의 효과 및 HSPC 유도 가능성을 나타낸 것이다.
도 12는 혈소판 감소증 모델에서 혈소판 및 WBC에 대한 2R13의 효과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows that 2R13, a functional scFv-Fc antibody, specifically binds to TPOR.
Figure 2 shows that 2R13 promotes cell growth and stimulates the JAK/STAT signaling pathway in BaF3/MPL cells.
Figures 3 to 5 show that 2R13 induces megakaryocyte differentiation of PB CD34+ cells.
Figures 6 to 8 show that 2R13 induces high ploidy megakaryocyte differentiation from PB-CD34+ cells.
Figures 9 and 10 show that 2R13 stimulates the TPOR signaling pathway in human platelets.
Figure 11 shows the effect of 2R13 on platelets and WBC and the possibility of inducing HSPC in a WT mouse model.
Figure 12 shows the effect of 2R13 on platelets and WBC in a thrombocytopenia model.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.The present invention provides a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Provided is a c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof.

한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 아래 표 1에 기재하였다.Meanwhile, CDRs consisting of amino acids represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 are listed in Table 1 below.

Antibody 2R13 CDR sequenceAntibody 2R13 CDR sequence VH CDR Seq.VH CDR Seq. CDR1CDR1 RDTFNTYGRDTFNTYG 서열번호 1SEQ ID NO: 1 CDR2CDR2 IIPIFGTAIIPIFGTA 서열번호 2SEQ ID NO: 2 CDR3CDR3 ARDRRAGGYDYARDRRAGGYDY 서열번호 3SEQ ID NO: 3 VL CDR Seq.VL CDR Seq. CDR1CDR1 QGLGRWQGLGRW 서열번호 4SEQ ID NO: 4 CDR2CDR2 AASAAS 서열번호 5SEQ ID NO: 5 CDR3CDR3 QQSNSFPWTQQSNSFPWT 서열번호 6SEQ ID NO: 6

본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.In the present invention, the term “antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, for example, a monoclonal antibody, It may include all clone antibodies, full-length antibodies, and antibody fragments. The term “antibody” may also include bivalent or dual-specific molecules (e.g., bispecific antibodies), diabodies, triabodies, or tetrabodies.

본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of single molecular composition obtained from a population of substantially identical antibodies, and unlike polyclonal antibodies, which can bind to multiple epitopes, these monoclonal antibodies have specific binding properties. It exhibits single binding and affinity for the epitope. In the present invention, the term “full-length antibody” is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond. The heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) types and is subclassed as gamma1 (γ1), gamma2 (γ2), and gamma3 (γ3). ), gamma 4 (γ4), alpha 1 (α1), and alpha 2 (α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types. IgG subtypes include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.

본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.In the present invention, the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain and fragments thereof including a variable region VH and three constant regions CH1, CH2, and CH3, including an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. All can be included. Additionally, in the present invention, the term “light chain” may include both a full-length light chain including a variable region VL and a constant region CL containing an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, as well as fragments thereof. there is.

본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the terms “fragment,” “antibody fragment,” and “antigen-binding fragment” are used interchangeably to refer to any fragment of the antibody of the present invention that retains the antigen-binding function of the antibody. Exemplary antigen binding fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, and Fv.

본 발명에서 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다.In the present invention, the term "CDR" refers to a hypervariable region, which is a region within the heavy and light chain variable regions of an antibody that has a different amino acid sequence for each antibody, and a region that binds to an antigen.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GFRAL에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include not only the sequence of the antibody described herein, but also its biological equivalent, to the extent that it can exhibit the ability to specifically bind to GFRAL. For example, additional changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. So, based on the benefits, arginine, lacine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.Additionally, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof.

본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.As used herein, the term “nucleic acid molecule” is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include not only natural nucleotides but also sugar or base sites. Also includes modified analogues. The sequences of nucleic acid molecules encoding the heavy and light chain variable regions of the invention may be modified, including additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.Additionally, the present invention provides a recombinant expression vector containing the above nucleic acid molecule.

본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.In the present invention, “vector” refers to a self-replicating DNA molecule used to transport a clonal gene (or other fragment of clonal DNA).

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.In the present invention, “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule containing a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing the operably linked coding sequence in a specific host organism. The expression vector may preferably contain one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence that has characteristics that can be generally selected by chemical methods, and includes all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include, but are limited to, antibiotic resistance genes such as Ampicillin, Kanamycin, Geneticin (G418), Bleomycin, Hygromycin, and Chloramphenicol. This does not mean that it is possible, and can be appropriately selected by a person skilled in the art.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.To express the DNA sequence of the present invention, any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector. Examples of useful expression control sequences include, for example, SV40 or adenovirus early and late promoters, CMV promoters and enhancers, retroviral LTR, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters. , the main operator and promoter regions of phage lambda, the regulatory region of the fd code protein, the promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters of the above phosphatases, such as Pho5, of the yeast alpha-mating system. Promoters and other sequences of composition and induction known to regulate the expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses, as well as various combinations thereof, may be included.

본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.The vector expressing the antibody of the present invention can be either a vector system in which the light and heavy chains are simultaneously expressed in one vector, or a system in which the light and heavy chains are expressed in separate vectors. In the latter case, the two vectors are introduced into the host cell through co-transformation and targeted transformation. Simultaneous transformation is a method of simultaneously introducing vector DNA encoding light and heavy chains into a host cell and then selecting cells that express both light and heavy chains. Targeted transformation selects cells transformed with a vector containing a light chain (or heavy chain) and transforms the selected cells expressing the light chain again with a vector containing a heavy chain (or light chain) to express both light and heavy chains. This is the final method of selecting cells.

또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. Additionally, the present invention provides cells transformed with a recombinant expression vector.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may be any host cell known in the art, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringen. Strains of the genus Bacillus, such as cis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida), Proteus mirabilis or Staphylococcus (e.g. Examples include, but are not limited to, prokaryotic host cells such as Staphylocus carnosus.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.In the method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof, the transformed cells can be cultured according to appropriate media and culture conditions known in the related art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art according to the selected strain. Cell culture is divided into suspension culture and adherent culture depending on the growth method of the cells, and batch, fed-batch, and continuous culture depending on the culture method. The medium used for culture must appropriately meet the requirements of the specific strain.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

상세하게는, 상기 약학조성물은 거대핵세포 생성, 혈소판 활성화 및 혈소판 수 증가를 유도할 수 있다.In detail, the pharmaceutical composition can induce megakaryocyte production, platelet activation, and increase in platelet count.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulations, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch. , acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, stear. Includes, but is not limited to, magnesium acid and mineral oil. The composition for preventing or treating cancer metastasis of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. It can be administered. When administered orally, proteins or peptides are digested, so oral compositions can be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach, and the composition of the present invention can be used in any device through which the active agent can move to target cells. It can be administered by.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and is usually A skilled doctor can easily determine and prescribe an effective dosage for desired treatment or prevention.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the present invention pertains. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.The health functional food composition may be provided in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrup, beverage, or pills, and the health food composition is used with other foods or food additives in addition to the composition according to the present invention, which is an active ingredient, and is commonly used It can be used appropriately according to the method. The mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on its purpose of use, for example, prevention, health, or therapeutic treatment.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.The effective dose of the antibody or antigen-binding fragment thereof contained in the health functional food composition may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but in case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control It may be below the above range, and since the active ingredient has no safety issues, it is certain that it can be used in amounts above the above range.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.There are no particular restrictions on the types of health foods, and examples include meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, Examples include drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples to aid understanding. However, the following examples only illustrate the content of the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples. Examples of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<실험예><Experimental example>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.The following experimental examples are intended to provide experimental examples commonly applied to each embodiment according to the present invention.

1. 세포주 및 세포 배양1. Cell lines and cell culture

Arthur J. Sykowski (Beth Israel Deaconedd Medical Center, Boston, MA)로부터 얻은 뮤린 pre-B 세포주 BaF3 세포를 10% 소태아혈청(FBS) 및 5% WEHI-3B 세포 조건 배지(WEHI-CM, 즉 인터루킨-3 (IL-3)의 공급원)를 함유하는 RPMI-1640(Lonza)에서 유지했다. 인간 트롬보포이에틴 수용체(hTPOR, 유전자명 MPL)를 발현하는 BaF3/MPL 세포주를 확립하기 위해 BaF3 세포를 pCMV-hMPL 플라스미드(Origene)로 안정적으로 형질감염 시켰다. hTPOR의 표면 발현은 CD110-APC(MiltenyiBiotech)를 사용한 유세포 분석에 의해 확인되었다. 급성 거핵모구성 백혈병 세포주 MO7e는 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에서 구입하여 10% FBS 및 10ng/mL IL-3가 보충된 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)에서 유지했다. 고신대학교 복음병원(KUGH) 혈액은행에서 유통기한 1~2일 이내의 정상 인간 혈소판을 채취했다. 인간 유래 샘플(혈소판 및 말초혈액, PB)을 사용한 본 발명의 연구는 KUGH의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다.BaF3 cells, a murine pre-B cell line obtained from Arthur J. Sykowski (Beth Israel Deaconedd Medical Center, Boston, MA), were cultured in 10% fetal bovine serum (FBS) and 5% WEHI-3B cell conditioned medium (WEHI-CM, i.e. interleukin- 3 (source of IL-3)) was maintained in RPMI-1640 (Lonza). To establish the BaF3/MPL cell line expressing human thrombopoietin receptor (hTPOR, gene name MPL), BaF3 cells were stably transfected with pCMV-hMPL plasmid (Origene). Surface expression of hTPOR was confirmed by flow cytometry using CD110-APC (MiltenyiBiotech). The acute megakaryoblastic leukemia cell line MO7e was purchased from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) and maintained in Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) supplemented with 10% FBS and 10 ng/mL IL-3. Normal human platelets within 1 to 2 days of expiration date were collected from the Kosin University Gospel Hospital (KUGH) blood bank. Our study using human derived samples (platelets and peripheral blood, PB) was approved by the Institutional Review Board of KUGH.

2. 세포 증식 분석2. Cell proliferation assay

TPOR 작용제의 활성을 결정하기 위해 BaF3/MPL의 경우 1 × 104 cells/㎖ 또는 Mo7e의 경우 5 × 105 cells/㎖를 사용하여 세포 증식 분석을 수행했다. 10% FBS가 포함된 RPMI의 BaF3/MPL 세포 및 10% FBS가 포함된 IMDM의 MO7e 세포(IL-3 보충 없음)는 다양한 농도의 TPOR 작용제의 존재 또는 부재 하에 96웰 플레이트에서 48시간 동안 배양되었다. 세포 증식은 제조사의 지침에 따라 Cell Titer-Glo 발광 세포 생존력 분석 키트(Promega)에 의해 평가되었고 발광 신호는 Victor 3 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer)에서 측정되었다.To determine the activity of TPOR agonists, cell proliferation assays were performed using 1 × 10 4 cells/ml for BaF3/MPL or 5 × 10 5 cells/ml for Mo7e. BaF3/MPL cells in RPMI with 10% FBS and MO7e cells in IMDM with 10% FBS (without IL-3 supplementation) were cultured for 48 h in 96-well plates in the presence or absence of various concentrations of TPOR agonist. . Cell proliferation was assessed by the Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega) according to the manufacturer's instructions, and luminescence signals were measured on a Victor 3 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer).

3. 신호 변환 실험3. Signal conversion experiment

BaF3/MPL 세포(4 × 105 cells/㎖) 또는 인간 혈소판을 PBS로 세척하고 0.5% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 각각 밤새 또는 3시간 동안 혈청-고갈시켰다. 지정된 시간 동안 표시된 농도의 TPOR 작용제로 세포 또는 혈소판을 자극했다. 세포는 프로테아제 억제제 칵테일(Calbiochem) 및 단백질 포스파타제 억제제 칵테일(Calbiochem)이 보충된 RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay) 완충액(Elpis Biotech)으로 용해하였다. BCA 분석 키트(Pierce)를 사용하여 용해물을 정량화하고 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 샘플 완충액에서 95℃에서 5분 동안 가열했다. 샘플(10μg/웰)을 SDS-PAGE 겔(Bio-Rad)에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Millipore)으로 옮겼다. 1차 및 2차 항체와 순차적으로 배양한 후 Thermo ECL 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 화학발광 신호를 검출한 후 Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences)으로 시각화했다. Janus 계열의 티로신 키나제(Jak2), p-Jak2, 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT5), p-STAT5(Y925), STAT3, p-STAT3(Y705), AKT, p-AKT(S473)에 대한 1차 항체, ERK 및 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)는 Cell Signaling Technology에서 구입하였으며 베타 액틴에 대한 항체는 Novus Biological에서 구입했다.BaF3/MPL cells (4 × 10 5 cells/ml) or human platelets were washed with PBS and serum-starved in RPMI-1640 medium containing 0.5% FBS overnight or for 3 hours, respectively. Cells or platelets were stimulated with the indicated concentrations of TPOR agonist for the indicated times. Cells were lysed with Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer (Elpis Biotech) supplemented with protease inhibitor cocktail (Calbiochem) and protein phosphatase inhibitor cocktail (Calbiochem). Lysates were quantified using the BCA assay kit (Pierce) and heated at 95°C for 5 min in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample buffer. Samples (10 μg/well) were separated on SDS-PAGE gels (Bio-Rad) and transferred to nitrocellulose membranes (Millipore). After sequential incubation with primary and secondary antibodies, chemiluminescence signals were detected using the Thermo ECL kit (Thermo Fisher Scientific) and visualized with an Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences). 1 for Janus family tyrosine kinase (Jak2), p-Jak2, signal transducer and activator of transcription (STAT5), p-STAT5 (Y925), STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473) Primary antibodies, ERK and p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), were purchased from Cell Signaling Technology, and antibodies against beta-actin were purchased from Novus Biological.

4. PB-CD34+ 세포의 분리4. Isolation of PB-CD34+ cells

G-CSF가 동원된 인간 성분채집 샘플의 분취량은 서면 동의를 얻은 후 KUGH에서 조혈 전구 세포 성분채집을 위한 표준 절차의 가이드 내에서 건강한 기증자로부터 얻었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficolle-Hypaque(sigma)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되었고 제조업체의 지침에 따라 MACS CD34 MicroBead 키트 UltraPure(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 PB-CD34+ 세포의 면역선택을 거쳤다. PB-CD34+ 세포 순도는 CD34-PE를 사용한 유동 분석에 의해 통상적으로 95%보다 높았다.Aliquots of G-CSF-mobilized human apheresis samples were obtained from healthy donors within the guide of standard procedures for hematopoietic progenitor cell apheresis at KUGH after obtaining written consent. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated by density gradient centrifugation using Ficolle-Hypaque (sigma) and PB-CD34+ using the MACS CD34 MicroBead kit UltraPure (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) according to the manufacturer's instructions. Cells were subjected to immunoselection. PB-CD34+ cell purity was typically greater than 95% by flow analysis using CD34-PE.

5. 5. 유세포flow cell 분석을 이용한 using analysis 거핵megakaryorrhea 생성 분석 generative analysis

PB-CD34+ 세포(4×104/㎖)는 25ng/㎖ rhSCF(PeproTech), 10ng/㎖ rhIL6(PeproTech), 10ng/㎖ rhIL9(PeproTech), 25μg/㎖ LDL(Stem Cell Technologies) 및 다양한 농도의 TPOR 작용제가 보충된 무혈청 확장 배지(SFEM, Stem Cell Technologies)에서 최대 14일 동안 배양되었다. 배양 배지의 절반을 3-4일마다 새로운 배지와 사이토카인으로 교체하였다. 거대핵생성은 유세포분석에 의해 거핵세포에 특이적인 분화 마커를 검출함으로써 평가되었다. 표시된 각각의 시점에서 세포를 수확하여 차가운 PBS로 세척하고 CD41a-FITC(Miltenyi Biotec), CD42b-PE(Miltenyi Biotec) 및 7-AAD(eBioscience)로 30분 동안 4℃ 암실에서 표지하였다. 세척 후 세포는 CytoFlex 유세포분석기(Beckman Coulter Inc.)를 사용하여 분석하였다.PB-CD34+ cells (4×10 4 /ml) were incubated with 25 ng/ml rhSCF (PeproTech), 10 ng/ml rhIL6 (PeproTech), 10 ng/ml rhIL9 (PeproTech), 25 μg/ml LDL (Stem Cell Technologies) and various concentrations. Cultured for up to 14 days in serum-free expansion medium (SFEM, Stem Cell Technologies) supplemented with TPOR agonist. Half of the culture medium was replaced with fresh medium and cytokines every 3-4 days. Megakaryopoiesis was assessed by detecting differentiation markers specific for megakaryocytes by flow cytometry. At each indicated time point, cells were harvested, washed with cold PBS, and labeled with CD41a-FITC (Miltenyi Biotec), CD42b-PE (Miltenyi Biotec), and 7-AAD (eBioscience) for 30 min at 4°C in the dark. After washing, cells were analyzed using a CytoFlex flow cytometer (Beckman Coulter Inc.).

6. 거핵구 배수성 분석6. Megakaryocyte ploidy analysis

13일 동안 배양된 PB-CD34+ 세포를 4℃에서 30분 동안 CD41a-FITC로 표지하고 차가운 PBS로 세척하였다. 표지된 세포를 실온에서 15분 동안 1% 파라포름알데히드와 함께 인큐베이션하여 고정시켰다. 세포를 -20℃에서 1시간 동안 70% 메탄올로 투과화시켰다. 투과화 후 세포를 10 ㎍/㎖ RNase(Roche)로 처리하고 10 ㎍/㎖ propidium iodide(sigma)로 실온에서 30분간 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.PB-CD34+ cells cultured for 13 days were labeled with CD41a-FITC for 30 minutes at 4°C and washed with cold PBS. Labeled cells were fixed by incubation with 1% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature. Cells were permeabilized with 70% methanol for 1 hour at -20°C. After permeabilization, cells were treated with 10 μg/ml RNase (Roche), stained with 10 μg/ml propidium iodide (Sigma) for 30 minutes at room temperature, and analyzed using a flow cytometer.

7. 생체 내(in 7. In vivo vivovivo ) 실험) Experiment

혈소판 및 백혈구(WBC)에 대한 2R13의 효과는 야생형(WT) 및 5-플루오로우라실(5-FU)로 유도된 혈소판 감소증 마우스 모델에서 확인하였다. 8-10주령 BALB/c 야생형 암컷 마우스(나라바이오텍, 서울, 한국)에 2R13, 재조합 인간 TPO(rHuTPO)를 피하 주사하였다. 5, 50, 100, 500 μg/kg 농도의 1회 주입용 2R13을 주입하였다. 7일 동안 양성 대조군으로 2.5㎍/kg/day의 rHuTPO 주사를, 음성 대조군으로 BSA를 함유하는 PBS(PBS-BSA)를 사용하였다. 혈소판 감소증 모델을 확립하기 위해 2R13 및 rHuTPO를 주사하기 1시간 전에 5-FU(Sigma, USA)를 150 mg/kg의 용량으로 각 그룹의 마우스에 복강내 주사하였다. 1회 주입된 2R13의 농도는 0.5 및 1mg/kg으로 증가되었다. rHuTPO 및 PBS-BSA를 동일한 농도로 7일 동안 주입하였다. 각 마우스에 케타민(90 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취하고, 14일 동안 격일로 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 모세관(Marienfeld, Germany)을 사용하여 안와후동에서 50 μl의 혈액 샘플을 채취했다 (주사 전 0일, 치료 후 4, 7, 11 및 14일). 혈액을 450㎕의 2.5mM EDTA 완충액으로 미리 채워진 EDTA 튜브에 옮겼다. 혈소판과 백혈구는 EONE 연구소(한국 인천)에서 계산하였으며, 동물 실험은 University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(2020-022)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다.The effects of 2R13 on platelets and white blood cells (WBC) were confirmed in wild type (WT) and 5-fluorouracil (5-FU) induced thrombocytopenia mouse models. 8-10 week old BALB/c wild type female mice (Nara Biotech, Seoul, Korea) were injected subcutaneously with 2R13, recombinant human TPO (rHuTPO). 2R13 for single injection was administered at concentrations of 5, 50, 100, and 500 μg/kg. Injection of rHuTPO at 2.5 μg/kg/day for 7 days was used as a positive control, and PBS containing BSA (PBS-BSA) was used as a negative control. To establish the thrombocytopenia model, 5-FU (Sigma, USA) was injected intraperitoneally into each group of mice at a dose of 150 mg/kg 1 hour before injection of 2R13 and rHuTPO. The concentration of 2R13 administered once was increased to 0.5 and 1 mg/kg. rHuTPO and PBS-BSA were injected at the same concentration for 7 days. Each mouse was anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (90 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), and incubated for 50 min in the retroorbital sinus using ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) capillaries (Marienfeld, Germany) every other day for 14 days. μl blood samples were collected (day 0 before injection and days 4, 7, 11 and 14 after treatment). Blood was transferred to EDTA tubes prefilled with 450 μl of 2.5mM EDTA buffer. Platelets and leukocytes were counted at the EONE Laboratory (Incheon, Korea), and animal experiments were performed according to the guidelines approved by the University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (2020-022).

8. 8. 유세포flow cell 분석 analyze

1일 동안 2R13(0.5, 1mg/kg/일), 7일 동안 rHuTPO(2.5㎍/kg/일) 및 PBS-BSA를 마우스에 주사하였다. 7일째에, 마우스를 희생시킨 후, 수집된 골수 세포(BM)를 PBS로 대퇴골 및 경골로부터 세척하였다. BM 적혈구(RBC)를 실온에서 1분 동안 용해 완충액으로 용해시켰다. LSK 세포의 비율을 조사하기 위해, BM 세포를 PBS에 현탁시키고 PerCP-Cy5.5-표지된 계통 항체, FITC-접합된 항-Sca-1 및 APC-접합된 항-c-Kit 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양했다(미국 BD). FACS CantoII 유세포 분석기와 FlowJo 소프트웨어(BD, USA)를 사용하여 형광을 분석했다.Mice were injected with 2R13 (0.5 and 1 mg/kg/day) for 1 day, rHuTPO (2.5 μg/kg/day) and PBS-BSA for 7 days. On day 7, mice were sacrificed and then collected bone marrow cells (BM) were washed from femurs and tibias with PBS. BM red blood cells (RBCs) were lysed with lysis buffer for 1 min at room temperature. To examine the proportion of LSK cells, BM cells were suspended in PBS and incubated with PerCP-Cy5.5-labeled lineage antibodies, FITC-conjugated anti-Sca-1 and APC-conjugated anti-c-Kit antibodies. Incubated for 30 minutes at °C (BD, USA). Fluorescence was analyzed using a FACS CantoII flow cytometer and FlowJo software (BD, USA).

<< 실시예Example 1> 1> TPOR을TPOR 특이적으로 specifically 활성화시키는activating 기능성 항체 개발 Development of functional antibodies

나이브한 인간 조합 Ab 파지 라이브러리(다양성:

Figure 112021119886921-pat00001
109)에서 c-MPL에 대한 결합 후보를 찾기 위해 도 1A과 같이 솔루션 패닝을 수행했다. 3 라운드의 패닝 후, TPOR 결합 클론이 명확하게 풍부하고 TPOR에 양성 결합을 갖는 6개의 클론을 선택했음을 확인했다(도 1B, 도 1C). 다음으로, 이들 클론 사이에 잠재적인 작용제 항체가 있는지 평가했다. 선별된 클론을 scFv-Fc 융합 형태로 전환한 후 키메라 세포(BaF3/MPL)의 TPO 의존적 성장을 통해 기능적 활성을 조사하였다. 6개의 클론 중 2R13이 낮은 농도에서 가장 높은 활성을 나타내어 최종 후보로 선정하였다(도 1D). 2R13의 결합 친화도를 특성화하기 위해 항체 ELISA를 수행하였다(도 1E). 2R13의 EC50은 55.27ng/ml였다. 또한, 2R13은 농도 의존적 방식으로 BaF3/MPL에 대해 염색된 반면, 모 BaF3 세포에서는 염색되지 않았으며, 이는 TPOR에 대한 특이적 결합을 나타냄을 알 수 있다(도 1F). Naive human combinatorial Ab phage library (diversity:
Figure 112021119886921-pat00001
10 9 ), solution panning was performed as shown in Figure 1A to find binding candidates for c-MPL. After three rounds of panning, we confirmed that TPOR binding clones were clearly enriched and six clones with positive binding to TPOR were selected (Figure 1B, Figure 1C). Next, we assessed the presence of potential agonist antibodies among these clones. Selected clones were converted to scFv-Fc fusion form and their functional activity was examined through TPO-dependent growth of chimeric cells (BaF3/MPL). Among the six clones, 2R13 showed the highest activity at low concentrations and was selected as a final candidate (Figure 1D). An antibody ELISA was performed to characterize the binding affinity of 2R13 (Figure 1E). The EC50 of 2R13 was 55.27ng/ml. Additionally, 2R13 stained for BaF3/MPL in a concentration-dependent manner, whereas it did not stain parental BaF3 cells, indicating specific binding to TPOR (Figure 1F).

<< 실시예Example 2> 세포 증식을 촉진하고 2> Promote cell proliferation BaF3BaF3 // MPLMPL 세포에서 in the cell TPORTPOR 신호 전달 경로를 자극하는 2R13 2R13 stimulates signaling pathways

2R13의 증식 능력을 조사하기 위해, BaF3/MPL 세포를 다양한 농도의 2R13 또는 rhTPO의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 2R13과 rhTPO는 모두 농도 의존적 방식으로 BaF3/MPL 세포의 성장을 촉진했다(도 2A). 상대 세포 증식은 100ng/ml rhTPO의 최대 증식 능력으로 계산되었다. 그 결과, 2R13과 rhTPO의 EC50s는 각각 53.4ng/ml와 1.3ng/ml이었다. hMPL을 발현하지 않는 모 BaF3 세포에서, 세포 증식은 mIL-3를 함유하는 WEHI-CM을 처리한 경우에만 증가했지만, 2R13 또는 rhTPO를 처리한 경우에는 증가하지 않았으며(도 2B), 이는 도 1A에 표시된 증가된 세포 증식이 TPOR에 특이적임을 입증한다. 2R13과 rhTPO는 또한 내인성 수준의 TPOR을 발현하는 것으로 알려진 MO7e 세포의 증식을 촉진했다(도 2C). TPO는 TPOR에 결합하고 JAK/STAT 경로를 포함한 세포 내 신호 전달을 유발한다. 2R13이 BaF3/MPL 세포에서 세포 증식을 촉진하는 메커니즘을 확인하기 위해 JAK2, STAT5, STAT3, AKT 및 ERK의 인산화를 조사했다. rhTPO의 결과와 유사하게 2R13은 농도 의존적으로 JAK2, STAT5, STAT3, AKT 및 ERK의 인산화를 증가시켰다(도 2D). 또한 STAT5 활성화에 의해 매개되는 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 통해 2R13 신호 전달을 검증했다(도 2E). 따라서, 2R13은 TPOR에 결합하여 AKT 및 ERK 경로와 함께 JAK/STAT 경로의 인산화를 자극하여 세포 증식을 증가시킴을 알 수 있다.To investigate the proliferative ability of 2R13, BaF3/MPL cells were cultured in the presence or absence of various concentrations of 2R13 or rhTPO. Both 2R13 and rhTPO promoted the growth of BaF3/MPL cells in a concentration-dependent manner (Figure 2A). Relative cell proliferation was calculated as the maximum proliferative capacity of 100 ng/ml rhTPO. As a result, the EC50s of 2R13 and rhTPO were 53.4ng/ml and 1.3ng/ml, respectively. In parental BaF3 cells that do not express hMPL, cell proliferation increased only upon treatment with WEHI-CM containing mIL-3, but not upon treatment with 2R13 or rhTPO (Figure 2B), which was consistent with Figure 1A We demonstrate that the increased cell proliferation shown is specific for TPOR. 2R13 and rhTPO also promoted proliferation of MO7e cells, which are known to express endogenous levels of TPOR (Figure 2C). TPO binds to TPOR and triggers intracellular signaling including the JAK/STAT pathway. To determine the mechanism by which 2R13 promotes cell proliferation in BaF3/MPL cells, we examined the phosphorylation of JAK2, STAT5, STAT3, AKT, and ERK. Similar to the results of rhTPO, 2R13 increased phosphorylation of JAK2, STAT5, STAT3, AKT, and ERK in a concentration-dependent manner (Figure 2D). We also verified 2R13 signaling through expression of a luciferase reporter gene mediated by STAT5 activation ( Figure 2E ). Therefore, it can be seen that 2R13 binds to TPOR and stimulates phosphorylation of the JAK/STAT pathway along with the AKT and ERK pathways, thereby increasing cell proliferation.

<< 실시예Example 3> 3> PBP.B. -CD34+ 세포의 -of CD34+ cells 거대핵생성을formation of macronucleus 촉진하는 promoting 2R132R13

다음으로, 2R13이 정상 기증자로부터 분리된 PB-CD34+ 세포에서 거핵구 형성을 자극할 수 있는지 여부를 조사하였다. PB-CD34+ 세포를 2R13(50,300 및 1000ng/ml) 또는 50ng/ml rhTPO의 부재 또는 존재 하에 거핵세포 분화 배지에서 14일 동안 배양하였다. 4, 7, 11 및 14일에 CD41a 및 CD42b의 발현에 대해 유세포 분석으로 전체 및 성숙한 거핵구의 백분율을 분석했다(도 3A). 배양 11일째에(대표적인 유세포 분석 플롯은 도 3B에 표시됨), 전체 및 거핵 세포 수는 모든 조건에서 최대였으며, CD41a+ 세포의 백분율은 50ng/ml에서 56.4%, 300 ng/ml에서 59.2% 및 1000ng/ml 2R13에서 59.6% 였으며, 50ng/ml rhTPO에서 62.1% 였다(도 3C). 성숙한 거핵구(CD41a+CD42b+ 이중 양성) 세포의 백분율은 50ng/ml에서 43.4%, 300ng/ml에서 44.7%, 1000ng/ml 2R13에서 43.1%, 50/ml rhTPO에서 45.2%였다. 2R13과 rhTPO 사이에 %CD41a+ 및 %CD41a+CD42b+에는 유의한 차이가 없었지만, 총 세포 수는 2R13 처리보다 rhTPO 처리에서 더 컸다. 따라서 CD41a+ 세포의 수는 대조군과 비교하여 50ng/ml에서 5.7배, 300ng/ml에서 6.9배, 1000ng/ml 2R13에서 7.9배, 50ng/ml rhTPO에서 11.7배 증가했다. CD41a+CD42b+ 세포의 수는 대조군과 비교하여 50ng/ml에서 6.5배, 300ng/ml에서 7.7배, 1000ng/ml에서 8.4배, 50ng/ml rhTPO에서 12.5배 증가했다. 추가 기증자의 PB-CD34+ 세포를 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다(도 4 및 도 5).Next, we investigated whether 2R13 could stimulate megakaryocyte formation in PB-CD34+ cells isolated from normal donors. PB-CD34+ cells were cultured in megakaryocyte differentiation medium in the absence or presence of 2R13 (50,300 and 1000 ng/ml) or 50 ng/ml rhTPO for 14 days. The percentage of total and mature megakaryocytes was analyzed by flow cytometry for the expression of CD41a and CD42b on days 4, 7, 11, and 14 (Figure 3A). At day 11 of culture (representative flow cytometry plots are shown in Figure 3B), total and megakaryocyte numbers were maximal in all conditions, and the percentage of CD41a+ cells was 56.4% at 50 ng/ml, 59.2% at 300 ng/ml, and 1000 ng/ml. It was 59.6% at ml 2R13 and 62.1% at 50ng/ml rhTPO (Figure 3C). The percentage of mature megakaryocyte (CD41a+CD42b+ double positive) cells was 43.4% at 50 ng/ml, 44.7% at 300 ng/ml, 43.1% at 1000 ng/ml 2R13, and 45.2% at 50/ml rhTPO. There were no significant differences in %CD41a+ and %CD41a+CD42b+ between 2R13 and rhTPO, but total cell numbers were greater in rhTPO treatment than in 2R13 treatment. Therefore, the number of CD41a+ cells increased 5.7-fold at 50ng/ml, 6.9-fold at 300ng/ml, 7.9-fold at 1000ng/ml 2R13, and 11.7-fold at 50ng/ml rhTPO compared to the control group. The number of CD41a+CD42b+ cells increased 6.5-fold at 50ng/ml, 7.7-fold at 300ng/ml, 8.4-fold at 1000ng/ml, and 12.5-fold at 50ng/ml rhTPO compared to the control group. Similar results were obtained when PB-CD34+ cells from additional donors were treated with 2R13 or TPO (Figures 4 and 5).

<< 실시예Example 4> 거핵구의 높은 배수성을 증가시키는 4> Increases the high ploidy of megakaryocytes 2R132R13

2R13(50,300 및 1000ng/ml) 또는 50ng/ml rhTPO의 부재 또는 존재 하에 거핵구 분화 배지에서 13일 동안 배양된 PB-CD34+ 세포의 DNA 배수성을 분석하여 이들 세포가 성숙한 거핵구인지 확인하고자 하였다. 2N 거핵구의 비율은 50ng/ml에서 40.5%, 300ng/ml에서 43.9%, 1000ng/ml 2R13에서 47.92%, 50ng/ml rhTPO에서 54.6%였다(도 6A). 대표적인 히스토그램은 도 6B에 나타내었다. 2R13을 처리한 세포는 rhTPO를 처리한 세포보다 8N 이상의 거핵구 비율이 더 높았다(도 6C). 따라서, 2R13 처리된 세포는 rhTPO보다 2N 거핵구의 비율이 낮고 배수성이 높았다. 그 다음 높은 배수성 세포의 수는 높은 배수성을 갖는 세포의 수가 50ng/ml에서 2.2개, 300ng/ml에서 2.3개, 1000ng/ml 2R13에서 2.8개, 및 50ng/ml rhTPO에서 4.9개임을 나타내는 높은 배수성(≥8N) CD41a+ 세포의 비율과 총 세포 수를 곱하여 계산되었다(도 6D). 따라서, 2R13은 rhTPO만큼 총 세포 수를 증가시키지 않았지만, rhTPO보다 더 높은 배수성 거핵 세포 비율을 유도하였다. 추가 기증자의 PB-CD34+ 세포를 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 나타났다(도 7 및 도 8).We sought to determine whether these cells were mature megakaryocytes by analyzing the DNA ploidy of PB-CD34+ cells cultured for 13 days in megakaryocyte differentiation medium in the absence or presence of 2R13 (50,300 and 1000 ng/ml) or 50 ng/ml rhTPO. The proportion of 2N megakaryocytes was 40.5% at 50 ng/ml, 43.9% at 300 ng/ml, 47.92% at 1000 ng/ml 2R13, and 54.6% at 50 ng/ml rhTPO (Figure 6A). A representative histogram is shown in Figure 6B. Cells treated with 2R13 had a higher proportion of megakaryocytes over 8N than cells treated with rhTPO (Figure 6C). Therefore, 2R13 treated cells had a lower proportion of 2N megakaryocytes and higher ploidy than rhTPO. The number of cells with high ploidy was then classified as high ploidy ( ≥8N) was calculated by multiplying the percentage of CD41a+ cells by the total number of cells (Figure 6D). Therefore, 2R13 did not increase total cell number as much as rhTPO, but induced a higher rate of polyploid megakaryocytes than rhTPO. Similar results were seen when PB-CD34+ cells from additional donors were treated with 2R13 or TPO (Figures 7 and 8).

<< 실시예Example 5> 5> 인간 혈소판에서 From human platelets TPORTPOR 신호 전달 경로를 자극하는 stimulating signaling pathways 2R132R13

상기와 같이, 2R13은 TPOR의 이소성 발현과 함께 BaF3/MPL 세포에서 세포내 신호전달 경로 및 세포 증식을 자극하였다. 2R13이 1차 인간 혈소판에서 신호 전달 경로를 자극하는지 여부를 추가로 확인했다. 인간 혈소판을 3시간 동안 혈청 결핍시키고 50, 300 및 1000ng/ml 2R13 또는 50ng/ml rhTPO로 처리했다. 2R13에 의해 유도된 신호 전달은 rhTPO에 의해 유도된 신호 전달보다 약했지만, 2R13은 농도 의존적으로 JAK2, STAT5 및 AKT를 명확하게 인산화시켰다(도 9A). 또한, 혈소판은 최대 18시간 동안 표시된 시간 동안 300ng/ml 2R13 및 50ng/ml rhTPO로 처리되었다. 2R13 및 rhTPO 처리는 장기간(0.25-18시간, 도 9B) 높은 수준의 인산화를 유지했다. 추가 개인의 혈소판을 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다(도 10).As above, 2R13 together with ectopic expression of TPOR stimulated intracellular signaling pathways and cell proliferation in BaF3/MPL cells. We further determined whether 2R13 stimulates signaling pathways in primary human platelets. Human platelets were serum starved for 3 hours and treated with 50, 300 and 1000 ng/ml 2R13 or 50 ng/ml rhTPO. Although signaling induced by 2R13 was weaker than that induced by rhTPO, 2R13 clearly phosphorylated JAK2, STAT5, and AKT in a concentration-dependent manner (Figure 9A). Additionally, platelets were treated with 300 ng/ml 2R13 and 50 ng/ml rhTPO for the indicated times, up to 18 hours. 2R13 and rhTPO treatment maintained high levels of phosphorylation for a long period of time (0.25–18 h, Figure 9B). Similar results were obtained when platelets from additional individuals were treated with 2R13 or TPO (Figure 10).

<< 실시예Example 6> 6> 1회 주입으로 WT 마우스 모델에서 혈소판 수를 증가시킬 수 있는 2R132R13 can increase platelet count in a WT mouse model after a single injection

WT 마우스 모델에서 1일 치료 기간 중 및 치료 기간 후 마우스에서 14일 동안 혈소판 및 WBC 수준을 모니터링하여 2R13의 효과를 평가하였다(도 11A). 마우스는 PBS-BSA를 음성 대조군으로, rHuTPO를 양성 대조군으로 받았다. 혈소판 수와 백혈구 수는 일주일에 두 번 수행되었다. 2R13을 주사한 마우스의 혈소판은 4일째부터 용량 의존적으로 점차 증가하여 7일째에 정점에 도달함을 발견하였다(도 11B). 각 시점에서 rHuTPO 7일 주사에 비해 1회 주사한 2R13의 혈소판 수가 상대적으로 많았다. 모든 처리군에서 11일째부터 혈소판 수가 점차 감소하였고, 5㎍/kg의 2R13은 14일째에 주사 전 수준으로 회복되었다. 백혈구 수는 혈소판 수와 다른 것으로 나타났다 (도 11C). 2R13을 주사한 마우스의 백혈구 수에는 유의한 변화가 없었다. 주사 4일째에는 고농도의 2R13을 제외하고는 다른 처리군의 백혈구수가 정상치보다 낮았고, 7일째에는 정상치로 돌아왔다. 위의 결과에 따르면 WT 마우스 모델에서 2R13의 효과는 혈소판에 특이적일 가능성이 높지만 WBC에는 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.The effect of 2R13 was assessed in the WT mouse model by monitoring platelet and WBC levels during a 1-day treatment period and for 14 days in mice after the treatment period (Figure 11A). Mice received PBS-BSA as a negative control and rHuTPO as a positive control. Platelet counts and white blood cell counts were performed twice a week. It was found that platelets in mice injected with 2R13 gradually increased in a dose-dependent manner starting from day 4 and reached the peak on day 7 (Figure 11B). At each time point, the platelet count of 2R13 injected once was relatively higher compared to 7-day injection of rHuTPO. In all treatment groups, the platelet count gradually decreased from day 11, and 5 μg/kg of 2R13 recovered to the pre-injection level on day 14. The white blood cell count was found to be different from the platelet count (Figure 11C). There was no significant change in the white blood cell count of mice injected with 2R13. On the 4th day of injection, the white blood cell count of the other treatment groups was lower than normal except for the high concentration of 2R13, and returned to normal on the 7th day. According to the above results, the effect of 2R13 in the WT mouse model is likely to be specific for platelets, but has little effect on WBC.

다음으로 2R13이 생체 내 조혈에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 1일 동안 2R13(0.5, 1mg/kg/day), 7일 동안 rHuTPO(2.5μg/kg/day) 및 PBS-BSA를 주입했다. 그 결과 2R13 처리군의 BM의 LSK 세포가 대조군에 비해 증가하였다(도 11D). 이는 2R13이 HSPC를 유도할 수 있음을 나타낸다. 위의 WT 마우스 모델 실험을 통해, 2R13의 1회 주입으로 얻은 혈소판 수가 rHuTPO 주입 7일보다 우수하고 조혈 기능이 있으며 WBC에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.Next, we confirmed whether 2R13 affects hematopoiesis in vivo. For this purpose, 2R13 (0.5, 1 mg/kg/day) for 1 day, rHuTPO (2.5 μg/kg/day) and PBS-BSA for 7 days were injected. As a result, the number of LSK cells in the BM of the 2R13 treatment group increased compared to the control group (Figure 11D). This indicates that 2R13 can induce HSPC. Through the above WT mouse model experiment, it can be seen that the platelet count obtained with a single injection of 2R13 is superior to that of 7 days of rHuTPO injection, has hematopoietic function, and does not affect WBC.

<< 실시예Example 7> 7> 혈소판 감소증 마우스 모델에서 혈소판 감소를 예방할 수 있는 2R132R13 can prevent thrombocytopenia in a mouse model of thrombocytopenia

5-FU로 유도된 혈소판 감소증 모델 후 혈소판의 회복 여부를 확인하였다. 5-FU 150 mg/kg을 복강내 주사하기 1시간 전에 마우스에 2R13(0.5, 1 mg/kg)을 1회, rHuTPO(2.5 μg/kg/day) 및 PBS-BSA를 7일 동안 피하 주사하였다 (도 12A). 다른 그룹의 마우스는 5-FU 치료를 받지 않았지만 여전히 PBS-BSA 주사를 받았다. 대조군을 제외하고 0.5 mg/kg의 2R13을 주사한 마우스의 혈소판은 가장 낮은 수치를 보였고, 1 mg/kg을 주사한 마우스의 혈소판은 양성대조군과 정상군보다 높았다(도 12B). 7일째부터 모든 처리군의 혈소판이 증가하였고, 특히 0.5mg/kg의 2R13 주사는 10일째에 정점에 도달하였다. 1mg/kg/day를 주사한 쥐의 혈소판은 7일째에 증가했지만, 혈소판 수는 0.5mg/kg을 주사한 2R13과 매우 유사하였다. 10일째 혈소판 수는 0.5 mg/kg의 2R13보다 낮았다. 2R13에서 혈소판 수가 용량 의존적으로 증가하지 않는 것을 찾는 것은 어렵지 않지만, rHuTPO에 비해 혈소판 증가의 효과는 명확히 확인되었다. 이를 통해 WBC 수를 확인하였으며(도 12C), 2R13은 여전히 백혈구에 영향을 미치지 않으므로, 생체 내 2R13의 효과는 혈소판에 특이적으로 적용되지만 백혈구에는 변화가 없음을 명확하게 확인하였다. 혈소판 감소증 모델에서 또한 2R13이 정상보다 초기 단계에서 혈소판 감소를 예방하고 혈소판 회복이 rHuTPO보다 우수함을 확인하였다.The recovery of platelets was confirmed after the 5-FU-induced thrombocytopenia model. One hour before intraperitoneal injection of 150 mg/kg of 5-FU, mice were injected once with 2R13 (0.5, 1 mg/kg), rHuTPO (2.5 μg/kg/day), and PBS-BSA subcutaneously for 7 days. (Figure 12A). Another group of mice did not receive 5-FU treatment but still received injections of PBS-BSA. Excluding the control group, the platelets of mice injected with 0.5 mg/kg of 2R13 showed the lowest level, and the platelets of mice injected with 1 mg/kg were higher than those of the positive control and normal groups (Figure 12B). From the 7th day, platelets increased in all treatment groups, and in particular, 0.5 mg/kg 2R13 injection reached the peak on the 10th day. The platelets of mice injected at 1 mg/kg/day increased on day 7, but the platelet count was very similar to that of 2R13 injected at 0.5 mg/kg. The platelet count at day 10 was lower than 2R13 at 0.5 mg/kg. It is not difficult to find that the platelet count does not increase in a dose-dependent manner in 2R13, but the effect of increasing platelets compared to rHuTPO is clearly confirmed. Through this, the WBC count was confirmed (Figure 12C), and since 2R13 still had no effect on white blood cells, it was clearly confirmed that the effect of 2R13 in vivo was specific to platelets, but there was no change in white blood cells. In the thrombocytopenia model, it was also confirmed that 2R13 prevents thrombocytopenia at an earlier stage than normal and that platelet recovery is superior to rHuTPO.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical idea or essential features. In this regard, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the patent claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the equivalent concept thereof are included in the scope of the present invention.

<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology KOSIN UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMY COOPERATION Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof <130> ADP-2021-0461 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Arg Asp Thr Phe Asn Thr Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Asp Arg Arg Ala Gly Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Gln Gly Leu Gly Arg Trp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Asn Ser Phe Pro Trp Thr 1 5 <110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology KOSIN UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMY COOPERATION Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof <130> ADP-2021-0461 <160> 6 <170>CopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Arg Asp Thr Phe Asn Thr Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Asp Arg Arg Ala Gly Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Gln Gly Leu Gly Arg Trp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser One <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Asn Ser Phe Pro Trp Thr 1 5

Claims (7)

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.A nucleic acid molecule encoding an anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1. 제2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.A recombinant expression vector containing the nucleic acid molecule of claim 2. 제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.Cells transformed with the recombinant expression vector of claim 3. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia, comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 as an active ingredient. 제5항에 있어서, 상기 약학조성물은 거대핵세포 생성, 혈소판 활성화 및 혈소판 수 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia according to claim 5, wherein the pharmaceutical composition induces megakaryocyte production, platelet activation, and increased platelet count. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.A health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia, comprising the anti-c-MPL antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 as an active ingredient.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP6590694B2 (en) * 2012-08-31 2019-10-16 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Methods and compositions for regulators of eukaryotic cells
EP3041511B1 (en) 2013-09-02 2021-06-02 Hetero Research Foundation Compositions of eltrombopag

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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