KR102576102B1

KR102576102B1 - Probe for detecting uch37 and uses thereof

Info

Publication number: KR102576102B1
Application number: KR1020210142123A
Authority: KR
Inventors: 반현승; 원미선; 이경; 공영대; 한태희; 한태수
Original assignee: 한국생명공학연구원; 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2023-09-11
Also published as: KR20230058258A

Abstract

본 발명은 신규한 UCH37 탐지용 프로브와 상기 프로브를 다양하게 이용하는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a novel UCH37 detection probe and a technology for using the probe in various ways.

Description

UCH37 탐지용 프로브 및 이의 용도{PROBE FOR DETECTING UCH37 AND USES THEREOF}Probe for detecting UCH37 and uses thereof {PROBE FOR DETECTING UCH37 AND USES THEREOF}

유비퀴틴 프로테아좀 시스템(ubiquitin proteasome system)은 세포의 성장과 분열, 세포 주기, 세포 내 신호전달, 세포 자살 등에서 중요한 조절 기작으로서, 이 조절 기작을 통하여 기질로 작용하는 단백질이 프로테아좀에 의해 분해된다. 즉, 다중 유비퀴틴 단백질 사슬이 기질에 공유 결합을 하고 이들은 20S CP(catalytic core particle)와 19S RP(regulatory particle)로 구성된 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 분해되는 과정에 의한다. The ubiquitin proteasome system is an important regulatory mechanism in cell growth and division, cell cycle, intracellular signaling, and apoptosis. Through this regulatory mechanism, proteins that act as substrates are degraded by the proteasome. do. In other words, multiple ubiquitin protein chains covalently bind to substrates, and these are recognized and decomposed by the 26S proteasome, which consists of 20S CP (catalytic core particle) and 19S RP (regulatory particle).

포유동물의 프로테아좀은 세 가지의 주요 탈유비퀴틴화 효소, 즉 RPN11, UCH37 및 USP14를 함유하는데, 이 중 UCH37(ubiquitin c-terminal hydrolase 37)은 20S CP(catalytic core particle)와 19S RP(regulatory particle)로 구성된 26S 프로테아좀에서 19S RP의 서브유닛 중 하나이며, UCHL5(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5) 또는 INO80R로도 알려져 있다. UCH37은 19S RP의 프로테아좀 분해에 대한 기질의 참여 전에 작용하며, C-말단의 Cys76과 Lys48 사이의 유사 펩타이드 결합을 분해하여 말단부에서 단백질이 부착된 폴리유비퀴틴 사슬을 분해하는데, 사슬들을 전체적으로 제거한다기보다는 이들을 짧게 한다. UCH37에 의한 사슬 트리밍(chain trimming)은 긴 멀티유비퀴틴 사슬과 짧은 멀티유비퀴틴 사슬 사이를 구별하는 프로테아좀의 능력을 증가시킨다. UCH37은 세포 주기의 진행, 분화, DNA 복제와 수리, 전사, 단백질 품질 관리, 면역 반응 그리고 세포 자멸사 등을 비롯한 몇몇의 과정과 관련이 있으며, 정상 조직에 비교했을 때 인간 자궁경부암 조직에서 상향 조절된다고 밝혀졌다.The mammalian proteasome contains three major deubiquitinating enzymes, RPN11, UCH37, and USP14, of which ubiquitin c-terminal hydrolase 37 (UCH37) binds the 20S catalytic core particle (CP) and the 19S RP (regulatory It is one of the subunits of 19S RP in the 26S proteasome composed of particles, and is also known as UCHL5 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5) or INO80R. UCH37 acts before the substrate participates in the proteasomal degradation of 19S RP, and degrades the polyubiquitin chain attached to the protein at the end by cleaving the similar peptide bond between Cys76 and Lys48 at the C-terminus, removing the chains entirely. Keep them short rather than multiple. Chain trimming by UCH37 increases the ability of the proteasome to distinguish between long and short multiubiquitin chains. UCH37 is involved in several processes, including cell cycle progression, differentiation, DNA replication and repair, transcription, protein quality control, immune response, and apoptosis, and is upregulated in human cervical cancer tissue compared to normal tissue. It turns out.

유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 여러 종류의 암, 신경 퇴화 질병, 신진 대사 장애, 바이러스성 질병, 심장 질환 그리고 노화 관련 질병 유발에 영향을 미치는 것으로 보고되고 프로테아좀 활성의 저해는 암세포의 자살과 암세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져, 항암제로서 프로테아좀 저해제에 대한 관심과 개발이 크게 증가하고 있다. 암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받은 20S 프로테아좀 억제제인 보르테조밉(Bortezomib)의 경우가 이러한 접근의 유효성을 검사할 수 있는 좋은 예이다. 많은 화학 물질이 UB-경로에서 효소를 대상으로 하지만, 유비스타틴(ubistatin)는 K48-결합 폴리유비퀴틴에 직접 결합함으로써 유비퀴틴과 단백질의 상호 작용을 차단하는 억제제로 확인되었다. 또한, 유비스타틴은 세포주기 성분의 프로테아좀-의존성 분해를 억제하여 세포주기의 진행을 막을 수 있음을 입증하고 있다. 그러나 유비스타틴의 세포막 비투과성은 치료제 및 세포 내 프로브를 포함하는 응용분야로의 개발에 큰 제약이 되고 있다. 이에, 상기 한계를 개선하는 유비퀴틴-경로 억제제의 개발이 여전히 요구되고 있다.The ubiquitin-proteasome system has been reported to play a role in causing several types of cancer, neurodegenerative diseases, metabolic disorders, viral diseases, heart diseases, and age-related diseases. Inhibition of proteasome activity leads to cancer cell suicide and cancer cell death. Known to inhibit the proliferation of , interest in and development of proteasome inhibitors as anticancer drugs is greatly increasing. Bortezomib, a 20S proteasome inhibitor approved by the US FDA as a cancer treatment, is a good example to test the effectiveness of this approach. Although many chemicals target enzymes in the UB-pathway, ubistatin has been identified as an inhibitor that blocks the interaction of ubiquitin with proteins by binding directly to K48-linked polyubiquitin. Additionally, it has been demonstrated that ubistatin can prevent cell cycle progression by inhibiting proteasome-dependent degradation of cell cycle components. However, ubistatin's impermeability to cell membranes is a major limitation in its development for applications including therapeutics and intracellular probes. Accordingly, the development of ubiquitin-pathway inhibitors that improve the above limitations is still required.

본 발명의 일 목적은 UCH37(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37)에 결합하는 신규 화합물을 제공하는데 있다.One object of the present invention is to provide a new compound that binds to UCH37 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37).

본 발명의 다른 일 목적은 상기 화합물을 포함하는 UCH37(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) 탐지용 프로브를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a probe for detecting UCH37 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) containing the above compound.

본 발명의 또 다른 일 목적은 상기 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above compound.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a new compound represented by the following formula (1).

[화학식 1][Formula 1]

본 발명의 다른 측면은 상기 화합물을 포함하는 UCH37(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) 탐지용 프로브를 제공한다. Another aspect of the present invention provides a probe for detecting UCH37 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) containing the above compound.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above compound.

본 발명의 화합물은 UCH37에 선택적으로 결합할 수 있으므로 UCH37을 탐지하는 용도로 사용될 수 있다.Since the compound of the present invention can selectively bind to UCH37, it can be used to detect UCH37.

또한, 본 발명의 화합물은 UCH37에 결합하여 19S RP의 탈유비퀴틴화 효소DUB(deubiquitinase) 활성을 억제함으로써 유비퀴틴화된 분해 대상 단백질들이 암 세포 내에 축적되고, 소포체 스트레스에 의해 암 세포가 사멸(apoptosis)되도록 하는 효과가 있다.In addition, the compound of the present invention binds to UCH37 and inhibits the deubiquitinase (DUB) activity of 19S RP, thereby causing ubiquitinated proteins subject to degradation to accumulate in cancer cells and cause cancer cell death (apoptosis) due to endoplasmic reticulum stress. It has the effect of making it possible.

나아가 본 발명의 화합물은 프로테아좀의 19S RP를 표적으로 하는 것이어서, 프로테아좀의 20S CP를 표적으로 하던 보르테조밉 등과 같은 기존의 약물과는 구체적인 표적 부위가 상이한 바, 20S CP를 표적으로 하던 기존의 약물들에 내성이 나타난 경우에 이를 극복하기 위한 대체 또는 병용 항암제로서 유용하게 이용될 수 있다.Furthermore, the compound of the present invention targets the 19S RP of the proteasome, and its specific target site is different from existing drugs such as bortezomib, which target the 20S CP of the proteasome. It can be useful as an alternative or combined anticancer agent to overcome resistance to existing drugs.

도 1은 UCH37 Probe-1이 UCH37에 결합하고, 이러한 결합이 화합물 1과 유사한 구조를 갖는 화합물 3에 의해 억제됨을 보여주는 결과이다.
도 2는 UCH37 Probe-1이 농도 의존적으로 19S 프로테아좀의 탈유비퀴틴 활성(19S DUB activity)을 억제하는 것을 보여주는 결과이다.
도 3은 UCH37 Probe-1에 의해 농도 의존적으로 유비퀴틴된 단백질들이 세포 내에 축적되는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 UCH37 Probe-1에 의해 다양한 암세포에서 농도 의존적으로 소포체 스트레스가 유도되는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 UCH37 Probe-1에 의해 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 것을 보여주는 결과이다.
도 6의 (A)는 보르테조밉 내성 세포주에서 보르테조밉에 의해 세포의 증식이 억제되지 않는 것을 보여주는 결과이고, (B)는 UCH37 Probe-1이 보르테조밉 내성 세포주에서도 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 보여주는 결과이다.Figure 1 shows results showing that UCH37 Probe-1 binds to UCH37 and that this binding is inhibited by compound 3, which has a similar structure to compound 1.
Figure 2 is a result showing that UCH37 Probe-1 inhibits the deubiquitin activity (19S DUB activity) of the 19S proteasome in a concentration-dependent manner.
Figure 3 shows results showing that proteins ubiquitinated by UCH37 Probe-1 accumulate in cells in a concentration-dependent manner.
Figure 4 shows results showing that endoplasmic reticulum stress is induced in various cancer cells by UCH37 Probe-1 in a concentration-dependent manner.
Figure 5 is a result showing that the survival rate of cancer cells is reduced in a concentration-dependent manner by UCH37 Probe-1.
Figure 6 (A) is a result showing that cell proliferation is not inhibited by bortezomib in a bortezomib-resistant cell line, and (B) shows that UCH37 Probe-1 exhibits a cell proliferation inhibitory effect even in a bortezomib-resistant cell line. It is a result.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a new compound represented by the following formula (1).

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서 X는 할로겐 원자, 예컨대 F, Cl, Br 및 I로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 X는 F 및 Cl로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 X는 F 일 수 있다.In Formula 1, may be F.

상기 n 및 m은 각각 독립적으로 2 내지 4의 정수일 수 있다.The n and m may each independently be an integer of 2 to 4.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법은 아래와 같은 2단계 반응을 포함한다:The method for producing the compound represented by Formula 1 includes the following two-step reaction:

(a) 하기 화학식 5로 표시되는 2,3-다이클로로-6-할로퀴녹살린과, 하기 화학식 6으로 표시되는 4-아지도에티닐기 공여 시약을 소노가쉬라 반응(Sonogashira reaction)시켜 하기 화학식 7로 표시되는 4-아지도에티닐 화합물을 생성하는 단계; 및(a) 2,3-dichloro-6-haloquinoxaline represented by the following formula (5) and a 4-azidoethynyl group donating reagent represented by the formula (6) are subjected to Sonogashira reaction to obtain the formula below: Producing a 4-azidoethynyl compound represented by 7; and

(b) 하기 화학식 7로 표시되는 4-아지도에티닐 화합물을 하기 화학식 8로 표시되는 아미노에테르알코올 화합물과 염기의 존재 하에서 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 생성하는 단계.(b) producing a compound represented by Formula 1 by reacting the 4-azidoethynyl compound represented by Formula 7 below with an aminoether alcohol compound represented by Formula 8 below in the presence of a base.

상기 단계 (a)에서 화학식 6으로 표시되는 4-아지도페닐에티닐기 공여 시약은 상기 화학식 5로 표시되는 2,3-다이클로로-6-할로퀴녹살린에 대하여 1.0 내지 1.5 몰당량을 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 1.0 내지 1.1 몰당량을 사용하는 것이다. 또한, 상기 ‘소노가쉬라 반응(Sonogashira reaction)에서 요구되는 조건’은 통상적인 팔라듐 시약, 통상적인 리간드, 통상적인 구리시약, 통상적인 무기 염기 또는 유기 염기로 이루어진다. 상기 소노가쉬라 반응은 통상의 용매, 예를 들면 톨루엔, 테트라하이드로퓨란, 다이옥산, 다이메톡시에탄, 다이클로로메탄, 아세토나이트라일, 다이메틸포름아마이드, 물 등을 사용한다. 반응온도는 0 ℃ 내지 용매의 비점 범위, 바람직하게는 실온 내지 100 ℃ 범위를 유지하는 것이 좋고, 반응시간은 1 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 24시간 동안 반응시킨다. In step (a), the 4-azidophenylethynyl group donating reagent represented by Formula 6 is used in an amount of 1.0 to 1.5 molar equivalents relative to 2,3-dichloro-6-haloquinoxaline represented by Formula 5. is good, and preferably 1.0 to 1.1 molar equivalent is used. In addition, the ‘conditions required for the Sonogashira reaction’ include a typical palladium reagent, a typical ligand, a typical copper reagent, and a typical inorganic base or organic base. The Sonogashira reaction uses common solvents such as toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, dichloromethane, acetonitrile, dimethylformamide, and water. The reaction temperature is preferably maintained in the range of 0°C to the boiling point of the solvent, preferably in the range of room temperature to 100°C, and the reaction time is 1 to 48 hours, preferably 2 to 24 hours.

상기 단계 (b)는 통상의 유기용매, 예를 들면 테트라하이드로퓨란, 다이클로로메탄, 아세토니트릴, 다이메틸포름아마이드 등을 사용하여 수행한다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 용매의 비점 범위, 바람직하게는 실온 내지 100 ℃ 범위를 유지하는 것이 좋다. 반응시간은 1 내지 48시간, 바람직하게는 3 내지 24시간 동안 반응시킨다. 상기 화학식 9로 표시되는 화합물은 상기 화학식 8로 표시되는 화합물에 대해서 1.0 내지 1.5 몰당량을 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 1.0 내지 1.1 몰당량을 사용하는 것이다. 또한, 이 반응은 통상의 유기 또는 무기 염기 존재 하에서 수행하는 것이 바람직하며, 예를 들면 수소화나트륨, 수소화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 트라이에틸아민, 피리딘, DBU 등을 들 수 있다.Step (b) is performed using a common organic solvent, such as tetrahydrofuran, dichloromethane, acetonitrile, dimethylformamide, etc. The reaction temperature is preferably maintained in the range of 0°C to the boiling point of the solvent, preferably in the range of room temperature to 100°C. The reaction time is 1 to 48 hours, preferably 3 to 24 hours. The compound represented by Formula 9 is preferably used in an amount of 1.0 to 1.5 molar equivalents, preferably 1.0 to 1.1 molar equivalents, relative to the compound represented by Formula 8. Additionally, this reaction is preferably carried out in the presence of a common organic or inorganic base, for example, sodium hydride, potassium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, Triethylamine, pyridine, DBU, etc. can be mentioned.

상기 화학식 5로 표시되는 2,3-다이클로로-6-할로퀴녹살린은 하기 화학식 2로 표시되는 4-할로-2,3-페닐렌디아민과 옥살산을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 6-할로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온을 생성하는 단계; 및 6-할로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온을 티오닐클로라이드와 반응시켜 하기 화학식 5로 표시되는 2,3-디클로로-6-할로퀴녹살린을 생성하는 단계를 통해 수득할 수 있다.2,3-dichloro-6-haloquinoxaline represented by Formula 5 is obtained by reacting 4-halo-2,3-phenylenediamine represented by Formula 2 below with oxalic acid to obtain 6-halo- represented by Formula 4. Producing 1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione; and reacting 6-halo-1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione with thionyl chloride to produce 2,3-dichloro-6-haloquinoxaline represented by the following formula (5). can do.

상기 화학식 1의 화합물의 바람직한 예는 다음과 같으나, 이에 한정되지 않는다.Preferred examples of the compound of Formula 1 are as follows, but are not limited thereto.

실시예Example 화합물명Compound name 구조structure

1

One

UCH37 Probe-1

UCH37 Probe-1

2

2

UCH37 Probe-1-a

UCH37 Probe-1-a

3

3

UCH37 Probe-1-b

UCH37 Probe-1-b

4

4

UCH37 Probe-1-c

UCH37 Probe-1-c

5

5

UCH37 Probe-1-d

UCH37 Probe-1-d

6

6

UCH37 Probe-1-e

UCH37 Probe-1-e

7

7

UCH37 Probe-1-f

UCH37 Probe-1-f

8

8

UCH37 Probe-1-g

UCH37 Probe-1-g

상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 염에는 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기산; 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염을 들 수 있다.The compound of Formula 1 can form a pharmaceutically acceptable salt. These pharmaceutically acceptable salts are not particularly limited as long as they are acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions. For example, inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc.; Organic acids such as tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, etc.; Examples include acid addition salts formed with sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid.

상기 화학식 1의 화합물은 UCH37(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37)에 특이적으로 결합하는 활성을 가진다.The compound of Formula 1 has the activity of specifically binding to UCH37 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37).

본 발명의 구체적 실시예에서는, 상기 화학식 1의 화합물을 제조하고, 이를 이용하여 표적 분자를 동정한 결과, 상기 화합물이 UCH37과 선택적으로 결합하는 것을 확인하였다.In a specific example of the present invention, the compound of Formula 1 was prepared and a target molecule was identified using it, and it was confirmed that the compound selectively binds to UCH37.

따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 UCH37을 탐지하는 용도로 사용될 수 있다.Therefore, the compound of Formula 1 of the present invention can be used to detect UCH37.

이에, 본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 UCH37 탐지용 프로브 또는 이를 포함하는 UCH37 탐지용 조성물을 제공한다.Accordingly, another aspect of the present invention provides a probe for detecting UCH37 containing the compound of Formula 1 or a composition for detecting UCH37 containing the same.

상기 ‘UCH37’은 20S CP(catalytic core particle)와 19S RP(regulatory particle)로 구성된 프로테아좀에서 19S RP의 서브유닛 중 하나로, 유비퀴틴이 달린 기질이 프로테아좀 분해 시스템에 참여하기 전 단계에서 유비퀴틴을 분해하는 효소로 작용한다. 특히, UCH37은 세포가 정상적인 기능을 수행하는 데 있어 필수적이며, 세포 주기의 진행, 분화, DNA 복제와 수리, 전사, 단백질 품질 관리, 면역 반응 및 세포 자멸사 등에 관여한다.The 'UCH37' is one of the subunits of 19S RP in the proteasome composed of 20S CP (catalytic core particle) and 19S RP (regulatory particle). Ubiquitin is degraded at the stage before the ubiquitin-containing substrate participates in the proteasome degradation system. It acts as an enzyme that breaks down In particular, UCH37 is essential for cells to perform normal functions and is involved in cell cycle progression, differentiation, DNA replication and repair, transcription, protein quality control, immune response, and apoptosis.

상기 ‘프로브’는 특정물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질을 총칭하는 것으로, 예를 들면 전기영동에 의해 전개된 DNA나 RNA 단편에서 특정한 단편을 검출하는 올리고뉴클레오티드 DNA나 RNA 프로브나, 항원, 항체 반응의 특이적 결합을 이용하여 특정한 항원을 검출하는 항체 프로브 등이 있다.The 'probe' is a general term for substances that specifically detect a specific substance, site, state, etc., for example, an oligonucleotide DNA or RNA probe that detects a specific fragment from a DNA or RNA fragment developed by electrophoresis. , antigen, and antibody probes that detect specific antigens using specific binding of antibody reactions.

본 발명의 프로브는 상기 UCH37의 알로스테릭 자리(allosteric site) 또는 오르토스테릭 자리(orthosteric site)에 결합하는 것일 수 있다.The probe of the present invention may bind to the allosteric site or orthosteric site of UCH37.

상기 ‘알로스테릭 자리’란, 효소의 활성을 증가 또는 억제시키기 위하여 조절 분자가 결합하는(활성자리와 다른 위치의) 알로스테릭 효소상의 자리로, 여기서 ‘알로스테릭 효소’란, 조절 인자(modulator)의 결합에 따라 그 모양이나 구조가 바뀌는 효소를 말한다. 즉, 활성 부위 이외의 부위에 특이적인 대사물질이 비공유 결합하면서 촉매 활성이 조절된다.The 'allosteric site' refers to a site on an allosteric enzyme (at a different position from the active site) where a regulatory molecule binds to increase or inhibit the activity of the enzyme. Here, 'allosteric enzyme' refers to a regulatory factor. It refers to an enzyme whose shape or structure changes depending on the combination of a modulator. In other words, catalytic activity is regulated by non-covalent binding of specific metabolites to sites other than the active site.

상기 ‘오르토스테릭 자리’란, 효소의 활성을 증가 또는 억제시키기 위하여 내인성 리간드가 결합하는 활성 자리를 의미한다.The ‘orthosteric site’ refers to the active site where an endogenous ligand binds to increase or inhibit the activity of the enzyme.

상기 화학식 1의 화합물은 UCH37의 알로스테릭 자리 또는 오르토스테릭 자리에 결합하여 UCH37의 탈유비퀴틴 활성을 억제함으로써 19S 프로테아좀 활성을 억제하는 효과를 갖는 바, 19S 프로테아좀 활성 억제 효과가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.The compound of Formula 1 has the effect of inhibiting 19S proteasome activity by binding to the allosteric site or orthosteric site of UCH37 and inhibiting the deubiquitin activity of UCH37, so the 19S proteasome activity inhibitory effect is required. It can be used for a variety of purposes and uses.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the compound of Formula 1 above as an active ingredient.

상기 화학식 1의 화합물은 19S RP(regulatory particle)의 활성을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.The compound of Formula 1 may prevent or treat cancer by inhibiting the activity of 19S RP (regulatory particle).

상기 화학식 1의 화합물은 치료학적으로 유효한 양 유효량(therapeutically effective amount)으로 포함될 수 있다.The compound of Formula 1 may be included in a therapeutically effective amount.

상기 "치료학적 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.The "therapeutically effective amount" means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, etc. of the patient's disease. This may depend on factors including time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.

본 발명의 구체적인 실시예들에서는, 화학식 1의 화합물이 19S 탈유비퀴틴화효소(deubiquitinating enzyme, DUB)의 활성을 억제하는 것을 확인하였으며, 대장암 세포에서 세포 내 유비퀴틴화된 단백질을 축적시키는 것을 확인하였다. 또한, 대장암 세포에 화학식 1의 화합물을 처리하면 농도 의존적으로 암세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 나아가, 다양한 암세포에 화학식 1의 화합물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 소포체 스트레스가 유도됨을 확인하였다.In specific examples of the present invention, it was confirmed that the compound of Formula 1 inhibits the activity of 19S deubiquitinating enzyme (DUB) and accumulated intracellular ubiquitinated proteins in colon cancer cells. . In addition, it was confirmed that treatment of colon cancer cells with the compound of Formula 1 inhibits the proliferation of cancer cells in a concentration-dependent manner. Furthermore, it was confirmed that endoplasmic reticulum stress was induced in a concentration-dependent manner when various cancer cells were treated with the compound of Formula 1.

따라서, 상기 화학식 1의 화합물은 19S 프로테아좀의 활성을 억제함으로써 고분자량의 폴리유비퀴틴화된 단백질의 세포 내 축적을 유발하고, 폴딩되지 않은 단백질의 축적으로 소포체 스트레스를 유도함으로써 암 세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진시키는 활성을 가짐이 분명하므로, 상기 화학식 1의 화합물을 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.Therefore, the compound of Formula 1 inhibits the activity of the 19S proteasome, causing intracellular accumulation of high molecular weight polyubiquitinated proteins and inducing endoplasmic reticulum stress due to accumulation of unfolded proteins, thereby causing apoptosis of cancer cells. Since it clearly has the activity of promoting apoptosis, the compound of Formula 1 can be effectively used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.

상기 '암'은 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 증식에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 상기 암은 대장암, 직장암, 결장암, 폐암, 골수암, 자궁 두부 또는 경부암, 방광암, 뼈암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 설암, 피부암, 뇌종양, 담낭암, 구강암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term ‘cancer’ refers to a disease caused by excessive proliferation of cells. In some cases, these abnormal hyperproliferating cells invade surrounding tissues and organs, forming tumors, and destroying or deforming normal structures. This condition is called cancer. In general, a tumor refers to a lump that grows abnormally due to autonomous hyperproliferation of body tissue, and can be divided into a benign tumor and a malignant tumor. The above cancers include colon cancer, rectal cancer, colon cancer, lung cancer, bone marrow cancer, uterine head or neck cancer, bladder cancer, bone cancer, blood cancer, breast cancer, melanoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, throat cancer, larynx cancer, esophagus cancer, pancreatic cancer, tongue cancer, skin cancer, brain tumor, It may be any one selected from the group consisting of gallbladder cancer, oral cancer, anal cancer, central nervous system tumor, and liver cancer, but is not limited thereto.

특히, 본 발명에서 상기 암은 항암제 내성암일 수 있고, 구체적으로 20S CP(catalytic core particle) 억제제 내성암일 수 있다.In particular, in the present invention, the cancer may be anticancer drug-resistant cancer, and specifically may be 20S CP (catalytic core particle) inhibitor-resistant cancer.

상기 '항암제'는 암의 증식 및 전이를 막는 화합물을 의미하고, 상기 '항암제 내성암'은 항암제를 사용한 치료에 대해 내성을 갖는 암을 의미하며, 이때 항암제를 사용한 치료에 내성을 가지는 세포는 항암제와 접촉하였을 때 그 성장 또는 증식이 상당히 감소하지 않는 세포를 의미한다.The 'anticancer agent' refers to a compound that prevents the proliferation and metastasis of cancer, and the 'anticancer drug-resistant cancer' refers to a cancer that is resistant to treatment with an anticancer drug. In this case, cells that are resistant to treatment with an anticancer drug are treated with an anticancer drug. refers to cells whose growth or proliferation is not significantly reduced when contacted with

상기 '20S CP 억제제'는 20S CP(catalytic core particle)과 19S RP(regulatory particle)로 구성된 프로테아좀에서 20S CP의 활성을 억제하는 제제를 의미하며, 예를 들어, 보르테조밉(bortezomib), 카르필조밉(carfilzomib), 마리조밉(marizomib), 익사조밉(ixazomib), 오프로조밉(oprozomib) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The '20S CP inhibitor' refers to an agent that inhibits the activity of 20S CP in the proteasome composed of 20S CP (catalytic core particle) and 19S RP (regulatory particle), for example, bortezomib, car It may be carfilzomib, marizomib, ixazomib, oprozomib, etc., but is not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 20S CP 억제제 내성암에서 암 치료 효과를 확인하기 위하여, 보르테조밉에 내성을 나타내는 세포주를 구축하였으며, 상기 보르테조밉 내성 세포주에 화학식 1의 화합물을 처리하였을 때 세포 증식이 억제됨을 확인하였다.In a specific example of the present invention, in order to confirm the cancer treatment effect in 20S CP inhibitor-resistant cancer, a cell line showing resistance to bortezomib was constructed, and when the bortezomib-resistant cell line was treated with the compound of Formula 1, cell proliferation was inhibited. was confirmed.

상기 "예방"은 본 발명에 따른 UCH37을 억제하는 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함한다.The “prevention” includes all actions that inhibit or delay the onset of cancer by administering a composition containing a compound that inhibits UCH37 according to the present invention.

상기 "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 UCH37을 억제하는 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다.The term “treatment” refers to clinical intervention to alter the natural processes of the individual or cell being treated, which may be performed during or to prevent the development of a clinical pathology. The desired therapeutic effects include preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, and alleviating the disease state. Or it includes temporary relief, remission, or improvement of prognosis. Preferably, the present invention includes all actions to improve the course of cancer by administering a composition containing a compound that inhibits UCH37.

상기 약학적 조성물에는 화학식 1의 화합물에 더하여, 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.In addition to the compound of Formula 1, the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutically acceptable carriers are commonly used in formulations and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Includes, but is not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally according to the desired method, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc.

상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and is usually A skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for desired treatment or prevention.

상기 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.0001~100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~30 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다.The daily dosage of the pharmaceutical composition is 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.001 to 30 mg/kg, once or several times a day. In addition, the administration period may be 1 day to 2 months, but may be administered without limitation until the disease prevention or treatment effect appears.

상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the invention pertains. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples and experimental examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples and experimental examples are only for illustrating the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.

[실시예 1][Example 1]

UCH37 Probe-1 (2-(2-((3-((4-아지도페닐)에티닐)-6-플루오로퀴녹살린-2-일)옥시)에톡시)-N,N-디메틸에텐-1-아민)의 합성UCH37 Probe-1 (2-(2-((3-((4-azidophenyl)ethynyl)-6-fluoroquinoxalin-2-yl)oxy)ethoxy)-N,N-dimethylethene -1-amine) synthesis

표적 분자인 UCH37과의 결합을 확인하기 위하여 19S 프로테아좀 억제 활성에는 영향이 없는 위치에 형광물질과 반응 할 수 있는 아자이드 (azide, N₃)를 도입한 프로브 화합물을 합성하였다.To confirm binding to the target molecule, UCH37, a probe compound was synthesized in which azide (N ₃ ), which can react with a fluorescent substance, was introduced at a position that does not affect the 19S proteasome inhibitory activity.

단계 1: 6-플루오로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온의 합성Step 1: Synthesis of 6-fluoro-1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione

4-플루오로-1,2-페닐렌디아민(2)(8.1 g, 65.3 mmol)과 옥살산(3) (5.9 g, 65.3 mmol), 3당량의 HCl (200 ml)를 차례로 넣고 하루 동안 환류 시켰다. 상온에서 식힌 후, 침전물을 여과시키고, 차가운 물로 씻어준 후, 건조 시켜 6-플루오로-1,4-디하이드로-2,3-디온(4)을 88% (10.4 g)의 수율로 수득하였다. 4-Fluoro-1,2-phenylenediamine (2) (8.1 g, 65.3 mmol), oxalic acid (3) (5.9 g, 65.3 mmol), and 3 equivalents of HCl (200 ml) were sequentially added and refluxed for one day. . After cooling at room temperature, the precipitate was filtered, washed with cold water, and dried to obtain 6-fluoro-1,4-dihydro-2,3-dione (4) with a yield of 88% (10.4 g). .

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) σ 6.87-7.08 (m, 1H), 7.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 11.54 (s, 2H). ^1H NMR (500 MHz, DMSO- d 6) σ 6.87-7.08 (m, 1H), 7.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 11.54 (s, 2H).

단계 2: 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린의 합성Step 2: Synthesis of 2,3-dichloro-6-fluoroquinoxaline

6-플루오로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온(4) (10.4 g, 57.9 mmol)을 클로로포름 (200 ml)에 녹이고, 티오닐클로리드 (20.7 g, 173.7 mmol)와 디메틸포름아미드 (1 ml)을 넣고 하루 동안 환류 시켰다. 상온에서 식힌 후, 감압 증발시킨 다음, 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린(5)을 81% (10.2 g)의 수율을 수득하였다. 6-Fluoro-1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione (4) (10.4 g, 57.9 mmol) was dissolved in chloroform (200 ml), thionyl chloride (20.7 g, 173.7 mmol) and Dimethylformamide (1 ml) was added and refluxed for one day. After cooling at room temperature and evaporation under reduced pressure, 2,3-dichloro-6-fluoroquinoxaline (5) was obtained in a yield of 81% (10.2 g).

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) σ 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.08 (dd, J = 8.4, 0.5 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 1.9 Hz, 1H). ^1H NMR (500 MHz, DMSO- d 6) σ 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.08 (dd, J = 8.4, 0.5 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 1.9 Hz, 1H).

단계 3: 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로노퀴녹살린의 합성Step 3: Synthesis of 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoronoquinoxaline

2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린(5) (4.0 g, 18.5 mmol)을 디메틸슬폭사이드 (2 ml)에 녹인 후, 4-아지도페닐아세틸렌(6) (2.3 ml, 21.3 mmol), 트리에틸아민 (18.0 ml, 129.6 mmol), 팔라듐(II)아세테이트 (290 mg, 1.3 mmol), 요드화동(I)(437 mg, 1.7 mmol) 및 트리페닐포스핀 (388 mg, 2.0 mmol)을 첨가 한 후, 이 혼합물을 80 ^oC로 2시간 동안 가열시켰다. 상온에서 식힌 후, 감압 증발시킨 다음, 물과 EtOAc를 사용하여 추출하였다. 이 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/hexane, 1:1 v/v)로 정제하여 (2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린)(7)을 58% (3.5 g, regioisomer mixture 83:17 = 5A:5B)의 수율로 수득하였다. 2,3-dichloro-6-fluoroquinoxaline (5) (4.0 g, 18.5 mmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide (2 ml), then 4-azidophenylacetylene (6) (2.3 ml, 21.3 mmol), triethylamine (18.0 ml, 129.6 mmol), and palladium(II) acetate (290). mg, 1.3 mmol), copper(I) iodide (437 mg, 1.7 mmol) and triphenylphosphine (388 mg, 2.0 mmol) were added and the mixture was heated to 80 ^o C for 2 hours. After cooling to room temperature, it was evaporated under reduced pressure and extracted using water and EtOAc. This organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ and purified by column chromatography (EtOAc/hexane, 1:1 v/v) to produce (2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoro. Quinoxaline) (7) was obtained with a yield of 58% (3.5 g, regioisomer mixture 83:17 = 5A:5B).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 7.50 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 8.75 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 9.0 Hz, 1H). ¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 7.50 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 8.75 Hz, 1H) ), 8.04 (d, J = 9.0 Hz, 1H).

단계 4: 2-(N,N-디메틸)아미노에톡시-에틸레닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린의 합성Step 4: Synthesis of 2-(N,N-dimethyl)aminoethoxy-ethylenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline

2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) (52 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린(7) (0.1 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1)을 61% (92 mg) 수율로 수득하였다. After dissolving 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8) (52 mg, 0.39 mmol) in tetrahydrofuran (6 ml), 60% sodium hydride (17.2 mg, 0.42 mmol) was added at 0 ^o C. ) and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline (7) (0.1 g, 0.36 mmol) was added to tetrahydrofuran (5 ml). It was dissolved, added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain 61% (92 mg) of the target compound (UCH37 Probe-1). ) was obtained in high yield.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (m, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H)/ MS (ESI, m/z) 421 ([M+H]⁺) ¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (m, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71 -8.04 (m, 4H)/ MS (ESI, m/z) 421 ([M+H] ⁺ )

[실시예 2][Example 2]

UCH37 Probe-1-a (2-(N,N-디메틸)아미노프로페녹시-에티레닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-a (2-(N,N-dimethyl)aminopropenoxy-ethyrenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline)

실시예 1의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)에탄올(8-1)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-a를 합성하였다.In step 4 of Example 1, except that 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)ethanol ( 8-1 ) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8). UCH37 Probe-1-a was synthesized in the same manner as Example 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)에탄올(8-1) (57.3 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린(7) (0.1 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-a)을 58% (91 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)ethanol (8-1) (57.3 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml) and then dissolved in 60% sodium hydride at 0 ^o C. (17.2 mg, 0.42 mmol) was added and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline (7) (0.1 g, 0.36 mmol) was added to tetrahydro. It was dissolved in furan (5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-a) at 58% ( 91 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz) , 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H)

[실시예 3][Example 3]

UCH37 Probe-1-b (2-(N,N-디메틸)아미노에톡시-프로페닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-b (2-(N,N-dimethyl)aminoethoxy-propenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline)

실시예 1의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)프로판올(8-2)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-b를 합성하였다.Example except that 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)propanol (8-2) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8) in step 4 of Example 1. UCH37 Probe-1-b was synthesized in the same manner as in 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)프로판올(8-2) (57.3 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린(7) (0.1 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-b)을 59% (92 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)propanol (8-2) (57.3 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml) and then dissolved in ⁶⁰ % sodium hydride ( 17.2 mg, 0.42 mmol) and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline (7) (0.1 g, 0.36 mmol) was added in tetrahydrofuran. It was dissolved in (5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-b) at 59% ( 92 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.04 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.04 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz) , 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H)

[실시예 4][Example 4]

UCH37 Probe-1-c (2-(N,N-디메틸)아미노프로페녹시-프로페닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-c (2-(N,N-dimethyl)aminopropenoxy-propenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline)

실시예 1의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)프로판올(8-3)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-c를 합성하였다.In step 4 of Example 1, except that 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)propanol (8-3) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8). UCH37 Probe-1-c was synthesized in the same manner as Example 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)프로판올(8-3) (62.8 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-플루오로퀴녹살린(7) (0.1 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-c)을 56% (90 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)propanol (8-3) (62.8 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml) and then dissolved in 60% sodium hydride at 0 ^o C. (17.2 mg, 0.42 mmol) was added and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-fluoroquinoxaline (7) (0.1 g, 0.36 mmol) was added to tetrahydro. It was dissolved in furan (5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-c) at 56% ( 90 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 1.2 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.72-7.90 (m, 4H). ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 1.2 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz) , 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H) , 7.72-7.90 (m, 4H).

[실시예 5][Example 5]

UCH37 Probe-1-d (2-(2-((3-((4-아지도페닐)에티닐)-6-클로로퀴녹살린-2-일)옥시)에톡시)-N,N-디메틸에텐-1-아민)의 합성UCH37 Probe-1-d (2-(2-((3-((4-azidophenyl)ethynyl)-6-chloroquinoxalin-2-yl)oxy)ethoxy)-N,N-dimethyl Synthesis of then-1-amine)

단계 1: 6-클로로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온의 합성Step 1: Synthesis of 6-chloro-1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione

4-클로로-1,2-페닐렌디아민(9)(9.3 g, 65.3 mmol)과 옥살산(3) (5.9 g, 65.3 mmol), 3당량의 HCl (200 ml)를 차례로 넣고 하루 동안 환류 시켰다. 상온에서 식힌 후, 침전물을 여과시키고, 차가운 물로 씻어준 후, 건조시켜 6-클로로-1,4-디하이드로-2,3-디온(10)을 89% (11.4 g)의 수율로 수득하였다. 4-Chloro-1,2-phenylenediamine (9) (9.3 g, 65.3 mmol), oxalic acid (3) (5.9 g, 65.3 mmol), and 3 equivalents of HCl (200 ml) were sequentially added and refluxed for one day. After cooling at room temperature, the precipitate was filtered, washed with cold water, and dried to obtain 6-chloro-1,4-dihydro-2,3-dione (10) with a yield of 89% (11.4 g).

단계 2: 2,3-디클로로-6-클로로퀴녹살린의 합성Step 2: Synthesis of 2,3-dichloro-6-chloroquinoxaline

6-클로로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온(4) (11.3 g, 57.9 mmol)을 클로로포름 (200 ml)에 녹이고, 티오닐클로리드 (20.7 g, 173.7 mmol)와 디메틸포름아미드 (1 ml)을 넣고 하루 동안 환류 시켰다. 상온에서 식힌 후, 감압 증발시킨 다음, 2,3-디클로로-6-클로로퀴녹살린(11)을 83% (11.2 g)의 수율을 수득하였다. 6-Chloro-1,4-dihydroquinoxaline-2,3-dione (4) (11.3 g, 57.9 mmol) was dissolved in chloroform (200 ml), thionyl chloride (20.7 g, 173.7 mmol) and dimethyl Formamide (1 ml) was added and refluxed for one day. After cooling at room temperature and evaporation under reduced pressure, 2,3-dichloro-6-chloroquinoxaline (11) was obtained in a yield of 83% (11.2 g).

단계 3: 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로노퀴녹살린의 합성Step 3: Synthesis of 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloronoquinoxaline

2,3-디클로로-6-클로로퀴녹살린(5) (4.3 g, 18.5 mmol)을 디메틸슬폭사이드 (2 ml)에 녹인 후, 4-아지도페닐아세틸렌(6) (2.3 ml, 21.3 mmol), 트리에틸아민 (18.0 ml, 129.6 mmol), 팔라듐(II)아세테이트 (290 mg, 1.3 mmol), 요드화동(I)(437 mg, 1.7 mmol) 및 트리페닐포스핀 (388 mg, 2.0 mmol)을 첨가 한 후, 이 혼합물을 80 ^oC로 2시간 동안 가열시켰다. 상온에서 식힌 후, 감압 증발시킨 다음, 물과 EtOAc를 사용하여 추출하였다. 이 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/hexane, 1:1 v/v)로 정제하여 (2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린)(12)을 55% (3.4 g, regioisomer mixture 83:17 = 5A:5B)의 수율로 수득하였다. 2,3-dichloro-6-chloroquinoxaline (5) (4.3 g, 18.5 mmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide (2 ml), then 4-azidophenylacetylene (6) (2.3 ml, 21.3 mmol), triethylamine (18.0 ml, 129.6 mmol), and palladium(II) acetate (290). mg, 1.3 mmol), copper(I) iodide (437 mg, 1.7 mmol) and triphenylphosphine (388 mg, 2.0 mmol) were added and the mixture was heated to 80 ^o C for 2 hours. After cooling to room temperature, it was evaporated under reduced pressure and extracted using water and EtOAc. This organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ and purified by column chromatography (EtOAc/hexane, 1:1 v/v) to produce (2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinox. Saline) (12) was obtained with a yield of 55% (3.4 g, regioisomer mixture 83:17 = 5A:5B).

단계 4: 2-(N,N-디메틸)아미노에톡시-에틸레닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린의 합성Step 4: Synthesis of 2-(N,N-dimethyl)aminoethoxy-ethylenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline

2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) (57.3 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린(12) (0.12 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간 동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-d)을 62% (100.0 mg) 수율로 수득하였다. 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8) (57.3 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml), and then dissolved in 60% sodium hydride (17.2 mg, 0.42 mmol) at 0 ^o C. ) and stirred for 20 minutes, then dissolve 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline (12) (0.12 g, 0.36 mmol) in tetrahydrofuran (5 ml). It was added dropwise and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-d) at 62% ( 100.0 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H)

[실시예 6][Example 6]

UCH37 Probe-1-e (2-(N,N-디메틸)아미노프로페녹시-에틸레닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-e (2-(N,N-dimethyl)aminopropenoxy-ethylenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline)

실시예 5의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)에탄올(8-1)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-e를 합성하였다.In step 4 of Example 5, except that 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)ethanol ( 8-1 ) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8). UCH37 Probe-1-e was synthesized in the same manner as Example 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)프로페녹시)에탄올(8-1) (52 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린(12) (0.12 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-e)을 64% (100.5 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)propenoxy)ethanol (8-1) (52 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml), then dissolved in 60% sodium hydride at 0 ^o C. (17.2 mg, 0.42 mmol) was added and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline (12) (0.12 g, 0.36 mmol) was added to tetrahydrofuran. It was dissolved in (5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-e) at 64% ( 100.5 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz) , 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz) , 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H)

[실시예 7][Example 7]

UCH37 Probe-1-f (2-(N,N-디메틸)아미노에톡시-프로페닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-f (2-(N,N-dimethyl)aminoethoxy-propenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline)

실시예 5의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)프로판올(8-2)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-f 를 합성하였다.Example, except that 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)propanol (8-2) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8 ) in step 4 of Example 5. UCH37 Probe-1-f was synthesized in the same manner as in 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)프로판올(8-2) (57.3 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린(12) (0.12 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-f)을 64% (100.4 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)propanol (8-2) (57.3 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml) and then dissolved in ⁶⁰ % sodium hydride ( 17.2 mg, 0.42 mmol) and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline (12) (0.12 g, 0.36 mmol) was added in tetrahydrofuran ( 5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-f) at 64% ( 100.4 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.06 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.06 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz) , 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz) , 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H)

[실시예 8][Example 8]

UCH37 Probe-1-g (2-(N,N-디메틸)아미노에톡시-프로페닐옥시-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린)의 합성Synthesis of UCH37 Probe-1-g (2-(N,N-dimethyl)aminoethoxy-propenyloxy-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline)

실시예 5의 단계 4에서 2-(2-(디메틸아미노)에톡시)에탄올(8) 대신 2-(2-(디메틸아미노)프로페닐옥시)프로판올(8-3)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 UCH37 Probe-1-g 를 합성하였다.In step 4 of Example 5, except that 2-(2-(dimethylamino)propenyloxy)propanol (8-3) was used instead of 2-(2-(dimethylamino)ethoxy)ethanol (8 ). UCH37 Probe-1-g was synthesized in the same manner as Example 1.

구체적으로, 2-(2-(디메틸아미노)프로페닐옥시)프로판올(8-3) (62.8 mg, 0.39 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (6 ml)에 녹인 후, 0 ^oC에서 60% 소디움하이라이드(17.2 mg, 0.42 mmol)을 넣고 20분간 교반 시킨 다음, 2-클로로-3-(4-아지도페닐에티닐)-6-클로로퀴녹살린(12) (0.12 g, 0.36 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 ml)에 녹여 적가 시키고 6시간동안 상온에서 교반 하였다. 이 혼합물을 감압증발 시킨 다음, 물과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조 시키고, 여과한 후 감압 증발시켜 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOH, 10:1 v/v)로 분리하여 목적화합물(UCH37 Probe-1-g)을 60% (100.2 mg) 수율로 수득하였다. Specifically, 2-(2-(dimethylamino)propenyloxy)propanol (8-3) (62.8 mg, 0.39 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (6 ml) and then dissolved in 60% sodium hydride at 0 ^o C. (17.2 mg, 0.42 mmol) was added and stirred for 20 minutes, then 2-chloro-3-(4-azidophenylethynyl)-6-chloroquinoxaline (12) (0.12 g, 0.36 mmol) was added to tetrahydrofuran. It was dissolved in (5 ml), added dropwise, and stirred at room temperature for 6 hours. This mixture was evaporated under reduced pressure and then extracted using water and ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, evaporated under reduced pressure, and separated by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ /EtOH, 10:1 v/v) to obtain the target compound (UCH37 Probe-1-g) at 60% ( 100.2 mg) was obtained.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.37-7.53 (m, 3H), 7.79 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz) , 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.37-7.53 (m, 3H), 7.79 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.79 ( d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H)

상기 실시예에 따른 제조방법으로 합성된 화합물들의 구조와 분석 데이타를 다음 표 1에 정리하였다.The structures and analysis data of the compounds synthesized by the manufacturing method according to the above example are summarized in Table 1 below.

상기 실시예 1 내지 8의 화합물들의 생성여부를 확인하기 위하여 다중 컬럼크로마토그래피 장비(Quad³⁺; 미국 Biotage사 제품)로 분리 정제하였으며, NMR 및 Mass 스펙트럼으로 구조를 분석하였다. ¹H NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 500 MHz에 기록되었고 화학적 시프트(δ)는 내부 표준으로써 TMS와 관계 있는 ppm 으로 기록되었다. 모든 표본은 다른 방법으로 명시되지 않았다면 DMSO-d ₆ 및 CDCl₃에서 용해되었다. MS 데이터는 Agilent사의 6460 Triple Quad LC/MS 모델에서 기록되었다.In order to confirm whether the compounds of Examples 1 to 8 were produced, they were separated and purified using multi-column chromatography equipment (Quad ³⁺ ; manufactured by Biotage, USA), and their structures were analyzed using NMR and mass spectra. ^1H NMR spectra were recorded on a Bruker Avance 500 MHz and chemical shifts ( δ ) were reported in ppm relative to TMS as an internal standard. All samples were dissolved in DMSO _- d6 and _CDCl3 unless otherwise specified. MS data were recorded on an Agilent 6460 Triple Quad LC/MS model.

화합물명Compound name XX O-(CH₂)n-OO-(CH ₂ )nO O-(CH₂)n-NO-(CH ₂ )nN ¹H NMR ^1H NMR MSM.S. UCH37 Probe-1UCH37 Probe-1 FF 22 22 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) 421[M+H]⁺ 421[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-aUCH37 Probe-1-a FF 22 33 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz) , 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) 435[M+H]⁺ 435[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-bUCH37 Probe-1-b FF 33 22 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.04 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.04 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz) , 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.41-7.54 (m, 3H), 7.71-8.04 (m, 4H) 435[M+H]⁺ 435[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-cUCH37 Probe-1-c FF 33 33 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 1.2 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.72-7.90 (m, 4H). ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 1.2 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz) , 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H) , 7.72-7.90 (m, 4H). 449[M+H]⁺ 449[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-dUCH37 Probe-1-d ClCl 22 22 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.29 (s, 6H), 2.82 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.53-3.65 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) 438[M+H]⁺ 438[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-eUCH37 Probe-1-e ClCl 22 33 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz) , 2H), 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz) , 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H) 452[M+H]⁺ 452[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-fUCH37 Probe-1-f ClCl 33 22 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 2.06 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 2.06 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.81 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 4.3 Hz) , 2H), 3.57 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz) , 1H), 7.78 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H) 452[M+H]⁺ 452[M+H] ⁺ UCH37 Probe-1-gUCH37 Probe-1-g ClCl 33 33 ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.37-7.53 (m, 3H), 7.79 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H) ^1H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) σ 1.86 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.55 (t, J = 2.7 Hz) , 2H), 3.24-3.39 (m, 4H), 4.16 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 7.37-7.53 (m, 3H), 7.79 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 2H), 7.79 ( d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H) 466[M+H]⁺ 466[M+H] ⁺

[화합물 3의 준비][Preparation of Compound 3]

본 발명의 UCH37 Probe-1과 구조가 유사하지만, 아자이드기 대신 아민기를 포함하는 하기 화합물 3를 동국대학교로부터 제공받아 본 발명의 신규한 화합물들과의 경쟁 반응을 확인하였다.The following compound 3, which is similar in structure to UCH37 Probe-1 of the present invention but contains an amine group instead of an azide group, was provided by Dongguk University and competition reaction with the novel compounds of the present invention was confirmed.

[실험예 1][Experimental Example 1]

UCH37 Probe-1의 UCH37과의 결합 활성 확인 Confirmation of binding activity of UCH37 Probe-1 with UCH37

UCH37 단백질과 UCH37 Probe-1의 결합 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다. UCH37 단백질은 RnD system사의 recombinant human UCH-L5/UCH37 protein을 구입하여 사용하였다.To confirm whether UCH37 protein binds to UCH37 Probe-1, an experiment was performed as follows. UCH37 protein was used by purchasing recombinant human UCH-L5/UCH37 protein from RnD system.

구체적으로, recombinant human UCH37 단백질 (2 μg)에 UCH37 Probe-1(10 μM)을 넣고 화합물 3 (100 μM 또는 200 μM)를 넣거나 또는 넣지 않은 상황에서 10 분간 배양한 후 아세틸렌 Cy3 형광제와 클릭반응 (click reaction)을 수행하고, 클릭반응 후 용매(methanol:chloroform:water=60:15:40 v/v)를 순차적으로 넣고 단백질 침전을 수확하였다. 단백질 SDS-PAGE 후 Typhoon 9410 이미지 시스템으로 형광을 탐지하였다.Specifically, UCH37 Probe-1 (10 μM) was added to recombinant human UCH37 protein (2 μg) and incubated for 10 minutes with or without compound 3 (100 μM or 200 μM), followed by a click reaction with acetylene Cy3 fluorophore. (click reaction) was performed, and after the click reaction, solvent (methanol:chloroform:water=60:15:40 v/v) was sequentially added and protein precipitate was harvested. After protein SDS-PAGE, fluorescence was detected with a Typhoon 9410 imaging system.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, UCH37 Probe-1과 UCH37의 결합을 확인하였으며, 나아가, 화합물 3(10~20배)를 넣어 UCH37 Probe-1과 UCH37의 경쟁 실험 수행 시, UCH37 Probe-1과 UCH37의 결합이 약해지는 것을 확인하였고, 이를 통해 UCH37 Probe-1과 UCH37 결합이 특이적인 결합임을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 1, the binding between UCH37 Probe-1 and UCH37 was confirmed. Furthermore, when performing a competition experiment between UCH37 Probe-1 and UCH37 by adding compound 3 (10 to 20 times), UCH37 Probe-1 It was confirmed that the binding between UCH37 and UCH37 was weakened, and through this, it was confirmed that the binding between UCH37 Probe-1 and UCH37 was a specific binding.

[실험예 2][Experimental Example 2]

UCH37 Probe-1의 19S 프로테아좀 활성 억제 효과 및 유비퀴틴 단백질 축적 효과 확인Confirmation of the 19S proteasome activity inhibition effect and ubiquitin protein accumulation effect of UCH37 Probe-1

<2-1>. 19S 프로테아좀 활성 억제 효과 <2-1>. 19S proteasome activity inhibition effect

프로브가 UCH37에 결합하여 19S 프로테아좀의 탈유비퀴틴 활성에 어떤 작용을 하는지 확인하였다.The effect of the probe on the deubiquitin activity of the 19S proteasome was confirmed by binding to UCH37.

구체적으로, 재조합 19S 프로테아좀 단백질 10 ng/10 μl에 UCH37 Probe-1을 각각 최종 1.25, 2.5, 5, 10 μM 또는 비교 약물인 NEM이 최종 100 μM이 되게 하여 실온에서 30분간 반응 한 뒤 RnD사의 Ub-AML(Ub-Aminoluciferin)이 최종 1 μM이 되게 하여 실온에서 30분간 반응하였다. 이 후 각각의 반응액에서 10 μl를 half-well white plate로 옮겼고, promega 사의 Luciferin detection reagent를 각 well에 20 μl를 넣어 반응시킨 뒤 발광을 측정하였다.Specifically, 10 ng/10 μl of recombinant 19S proteasome protein was reacted at room temperature for 30 minutes with UCH37 Probe-1 at a final concentration of 1.25, 2.5, 5, 10 μM or the comparative drug NEM at a final concentration of 100 μM, respectively, and then RnD. The company's Ub-AML (Ub-Aminoluciferin) was adjusted to a final concentration of 1 μM and reacted at room temperature for 30 minutes. Afterwards, 10 μl of each reaction solution was transferred to a half-well white plate, and 20 μl of Luciferin detection reagent from Promega was added to each well for reaction, and luminescence was measured.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, UCH37 Probe-1은 농도 의존적으로 19S 프로테아좀의 탈유비퀴틴 활성(19S DUB activity)을 억제하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 2, UCH37 Probe-1 was confirmed to inhibit the deubiquitin activity (19S DUB activity) of the 19S proteasome in a concentration-dependent manner.

<2-2>. 유비퀴틴 단백질 축적 효과 <2-2>. Ubiquitin protein accumulation effect

UCH37 Probe-1이 UCH37에 결합하여 유비퀴틴 단백질의 축적에 어떤 작용을 하는지 확인하였다.We confirmed how UCH37 Probe-1 binds to UCH37 and affects the accumulation of ubiquitin protein.

구체적으로, 인간 대장암 세포주 HCT116에 UCH37 Probe-1을 5%의 소태아혈청농도의 DMEM배지에 최종 0.2, 0.5, 1, 2, 5 μM이 되도록 녹인 후 6시간을 처리하였다. 이 후 RIPA lysis buffer를 이용해 세포를 용해시켜 단백질을 추출한 뒤 동량의 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법으로 분리하였다. 분리된 단백질을 플루오르화 폴리비닐리덴 멤브레인으로 옮긴 후 5% 농도의 탈지 우유로 비특이적 결합을 차단하였다. 유비퀴틴 항체를 이용해 멤브레인을 4℃ 냉장고에서 밤새 교반시켰고, 다음 날 멤브레인에 1차 항체의 추출 종인 토끼 종의 2차 항체를 실온에서 1시간 교반한 뒤, Merck 사의 Luminata Immobilon Crescendo Western HRP substrate 시약을 이용해 탐지하였다.Specifically, UCH37 Probe-1 was dissolved in human colon cancer cell line HCT116 to a final concentration of 0.2, 0.5, 1, 2, and 5 μM in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum concentration, and then treated for 6 hours. Afterwards, cells were lysed using RIPA lysis buffer to extract proteins, and an equal amount of proteins were separated using polyacrylamide gel electrophoresis. The separated proteins were transferred to a fluorinated polyvinylidene membrane and non-specific binding was blocked with 5% concentration of skim milk. The membrane was stirred overnight in a refrigerator at 4°C using a ubiquitin antibody, and the next day, the secondary antibody from rabbit, the species from which the primary antibody was extracted, was stirred on the membrane for 1 hour at room temperature, using Merck's Luminata Immobilon Crescendo Western HRP substrate reagent. Detected.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, UCH37 Probe-1에 의해 농도 의존적으로 유비퀴틴된 단백질들이 축적되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 3, it was confirmed that ubiquitinated proteins were accumulated by UCH37 Probe-1 in a concentration-dependent manner.

[실험예 3][Experimental Example 3]

다양한 암종의 세포주에서 프로브 화합물의 소포체 스트레스 유도 효과Endoplasmic reticulum stress-inducing effects of probe compounds in cell lines of various carcinomas

UCH37 Probe-1이 UCH37에 결합함으로써 소포체 스트레스를 유발하는지 확인하였다.It was confirmed whether UCH37 Probe-1 causes endoplasmic reticulum stress by binding to UCH37.

구체적으로, 인간 대장암 세포주 HCT116, 인간 위암 세포주 HT29, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa, 인간 폐암 세포주 H1703에 소포체 스트레스에 반응하여 luciferase를 발현할 수 있는 바이러스를 안정 발현시켰다. 이 후 각각의 세포에 UCH37 Probe-1을 5%의 소태아혈청농도의 DMEM배지에 최종 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μM이 되도록 녹인 후 각 세포들에 12시간을 처리하였다. 이 후 Promega사의 Dual luciferase Reporter assay system을 이용하여 발광을 측정하였다.Specifically, a virus capable of expressing luciferase in response to endoplasmic reticulum stress was stably expressed in human colon cancer cell line HCT116, human stomach cancer cell line HT29, human cervical cancer cell line HeLa, and human lung cancer cell line H1703. Afterwards, UCH37 Probe-1 was dissolved in DMEM medium containing 5% fetal calf serum to a final concentration of 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, and 10 μM, and each cell was treated for 12 hours. Afterwards, luminescence was measured using Promega's Dual luciferase Reporter assay system.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 모든 세포에서 농도 의존적으로 소포체 스트레스가 유도되는 것을 확인하였다.As a result, it was confirmed that endoplasmic reticulum stress was induced in a concentration-dependent manner in all cells, as shown in Figure 4.

[실험예 4][Experimental Example 4]

UCH37 Probe-1에 의한 대장암 세포 생존율 감소 효과Effect of reducing colon cancer cell survival rate by UCH37 Probe-1

UCH37 Probe-1이 UCH37에 결합함으로써 대장암 세포의 생존율을 감소하는 효과가 있는지 확인하였다.It was confirmed whether UCH37 Probe-1 has the effect of reducing the survival rate of colon cancer cells by binding to UCH37.

구체적으로, 인간 대장암 세포주 HCT116에 UCH37 Probe-1을 5%의 소태아혈청농도의 DMEM배지에 최종 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2 μM이 되도록 녹인 후 각 세포들에 72시간을 처리하였다. 이 후 10%의 포르말린을 이용해 세포를 고정하고, 메틸렌블루용액을 이용해 핵을 염색하였다. 그리고 0.5% 염산용액을 사용해 염색한 것을 녹여 흡광도를 측정하였다.Specifically, UCH37 Probe-1 was dissolved in the human colon cancer cell line HCT116 to a final concentration of 0.13, 0.25, 0.5, 1, and 2 μM in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum concentration, and then each cell was treated for 72 hours. Afterwards, the cells were fixed using 10% formalin, and the nuclei were stained using methylene blue solution. Then, the dye was dissolved using 0.5% hydrochloric acid solution and the absorbance was measured.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, UCH37 Probe-1에 의해 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 효과가 확인되었다.As a result, as shown in Figure 5, it was confirmed that UCH37 Probe-1 reduced the survival rate of cancer cells in a concentration-dependent manner.

[실험예 5][Experimental Example 5]

UCH37 Probe-1에 의한 보르테조밉 내성 극복 효과Effect of overcoming bortezomib resistance by UCH37 Probe-1

<5-1> 보르테조밉 내성 세포주 구축 <5-1> Construction of bortezomib-resistant cell lines

UCH37 Probe-1이 보르테조밉 내성암에도 치료 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 먼저, 보르테조밉 내성 세포주를 구축하였다. To confirm whether UCH37 Probe-1 has a therapeutic effect on bortezomib-resistant cancer, first, a bortezomib-resistant cell line was constructed.

구체적으로, 인간 대장암 세포주 HCT116에 보르테조밉을 점진적으로 높아지는 농도로 주 2회 처리하였고, 계대배양시 2개의 세포배양 그릇으로 나누어 한 개는 농도 유지 및 세포생존유지, 한 개는 농도를 높여 처리하는 방식으로 장기간 처리하였다.Specifically, the human colon cancer cell line HCT116 was treated with bortezomib twice a week at gradually increasing concentrations, and during subculture, it was divided into two cell culture dishes, one to maintain the concentration and maintain cell survival, and one to increase the concentration. It was treated for a long period of time in this way.

그 결과, 도 6의 (A)에 나타낸 바와 같이 야생형 HCT116에서는 보르테조밉이 세포의 증식을 억제하는 반면, 위와 같이 구축된 보르테조밉 내성 세포주에서는 더 이상 보르테조밉에 의해 세포의 증식이 억제되지 않는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6 (A), while bortezomib inhibits cell proliferation in wild-type HCT116, cell proliferation is no longer inhibited by bortezomib in the bortezomib-resistant cell line constructed as above. Confirmed.

<5-2> 보르테조밉 내성 세포주에서 세포 증식 억제 효과 <5-2> Cell proliferation inhibitory effect in bortezomib-resistant cell lines

UCH37 Probe-1이 보르테조밉 내성암에서도 치료 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 보르테조밉 내성 세포주에 프로브 화합물을 처리한 후 세포 증식 억제 효과를 확인하였다.To confirm whether UCH37 Probe-1 has a therapeutic effect in bortezomib-resistant cancer, the cell proliferation inhibitory effect was confirmed after treating the probe compound in a bortezomib-resistant cell line.

구체적으로, 인간 대장암 세포주 HCT116 야생형과 보르테조밉 내성세포에 보르테조밉을 5%의 소태아혈청농도의 DMEM배지에 최종 1 μM부터 0.0039 μM이 될 때까지 2배 연속 희석하였고, UCH37 Probe-1을 5%의 소태아혈청농도의 DMEM배지체 최종 2 μM 부터 0.0078 μM이 될 때까지 희석하여 72시간 동안 처리하였다. 이 후 10%의 포르말린을 이용해 세포를 고정하고, 메틸렌블루용액을 이용해 핵을 염색하였다. 그리고 0.5% 염산용액을 사용해 염색한 것을 녹여 흡광도를 측정하였다Specifically, bortezomib was serially diluted two-fold in human colon cancer cell line HCT116 wild type and bortezomib-resistant cells from a final 1 μM to 0.0039 μM in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum concentration, and UCH37 Probe-1 DMEM medium containing 5% fetal bovine serum concentration was diluted from the final 2 μM to 0.0078 μM and treated for 72 hours. Afterwards, the cells were fixed using 10% formalin, and the nuclei were stained using methylene blue solution. Then, the dye was dissolved using 0.5% hydrochloric acid solution and the absorbance was measured.

그 결과, 도 6의 (B)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UCH37 Probe-1을 처리하였을 때 야생형 HCT116뿐만 아니라 보르테조밉 내성 세포주에서도 세포 증식 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6 (B), it was confirmed that treatment with UCH37 Probe-1 of the present invention had a cell proliferation inhibitory effect not only on wild-type HCT116 but also on bortezomib-resistant cell lines.

이로부터, 본 발명의 UCH37 Probe-1을 보르테조밉에 내성을 나타내는 암의 치료에 이용할 수 있음을 알 수 있다.From this, it can be seen that UCH37 Probe-1 of the present invention can be used for the treatment of cancer resistant to bortezomib.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

상기 식에서,
X는 할로겐 원자이고,
n 및 m은 각각 독립적으로 2 내지 4의 정수임.
Compound represented by Formula 1:
[Formula 1]

In the above equation,
X is a halogen atom,
n and m are each independently integers of 2 to 4.

하기 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물:

A compound selected from the group consisting of:

하기 단계들을 포함하는, 청구항 1의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
하기 화학식 5로 표시되는 2,3-다이클로로-6-할로퀴녹살린과, 하기 화학식 6으로 표시되는 에티닐기 공여 시약을 소노가쉬라 반응(Sonogashira reaction)시켜 하기 화학식 7로 표시되는 에티닐 화합물을 생성하는 단계; 및

하기 화학식 7로 표시되는 에티닐 화합물을 하기 화학식 8로 표시되는 알코올아민 화합물과 염기의 존재 하에서 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 생성하는 단계
.A method for producing a compound represented by formula 1 of claim 1, comprising the following steps:
2,3-dichloro-6-haloquinoxaline represented by Formula 5 below and an ethynyl group donating reagent represented by Formula 6 below are subjected to Sonogashira reaction to produce an ethynyl compound represented by Formula 7 below. generating step; and

Producing a compound represented by Formula 1 by reacting an ethynyl compound represented by Formula 7 below with an alcoholamine compound represented by Formula 8 below in the presence of a base.
.

청구항 1 또는 청구항 2의 화합물을 포함하는 UCH37(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) 탐지용 프로브.
A probe for detecting UCH37 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37) containing the compound of claim 1 or claim 2.

청구항 4에 있어서,
상기 프로브는 UCH37의 알로스테릭 자리(allosteric site) 또는 오르토스테릭 자리(orthosteric site)에 결합하는 것인 UCH37 탐지용 프로브.
In claim 4,
The probe is a probe for detecting UCH37 that binds to an allosteric site or an orthosteric site of UCH37.

청구항 1 또는 청구항 2의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the compound of claim 1 or 2 as an active ingredient.

청구항 6에 있어서,
상기 화합물은 19S RP(regulatory particle)의 활성을 억제하는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
In claim 6,
The compound is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer that inhibits the activity of 19S RP (regulatory particle).

청구항 6에 있어서,
상기 암은 20S CP(catalytic core particle) 억제제 내성암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
In claim 6,
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the cancer is 20S CP (catalytic core particle) inhibitor resistant cancer.

청구항 8에 있어서,
상기 20S CP 억제제는 보르테조밉(bortezomib), 카르필조밉(carfilzomib), 마리조밉(marizomib), 익사조밉(ixazomib) 및 오프로조밉(oprozomib)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.In claim 8,
The 20S CP inhibitor is any one selected from the group consisting of bortezomib, carfilzomib, marizomib, ixazomib, and oprozomib, for the prevention of cancer or Pharmaceutical composition for therapeutic use.