KR102572039B1 - 슈도모나스 외독소 A를 포함하는 c-Kit 표적 면역접합체 - Google Patents

슈도모나스 외독소 A를 포함하는 c-Kit 표적 면역접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 외독소 A (PE; Pseudomonas exotoxin A)를 포함하는 면역접합체에 관한 것으로, 구체적으로 c-Kit의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 항-c-Kit 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드, 및 슈도모나스 외독소 A를 포함하는 면역접합체, 및 상기 면역접합체를 유효성분으로 포함하는 c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역접합체는 c-Kit의 특정 영역에 특이적으로 결합하고 세포 내 단백질 합성을 억제하여 c-Kit 양성 세포에 대한 세포 독성을 나타내어 뛰어난 항암 활성을 갖는다.

Description

슈도모나스 외독소 A를 포함하는 c-Kit 표적 면역접합체 {c-Kit targeting Immunoconjugate comprising Pseudomonas exotoxin A}
본 발명은 슈도모나스 외독소 A (PE; Pseudomonas exotoxin A)를 포함하는 c-Kit 표적 면역접합체에 관한 것으로, 구체적으로 c-Kit의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 항-c-Kit 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드, 및 슈도모나스 외독소 A를 포함하는 면역접합체, 및 상기 면역접합체를 유효성분으로 포함하는 c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate)는 암세포가 발현하는 세포 표면 항원을 표적으로 하는 항체, 세포 독성 페이로드, 및 페이로드를 항체에 부착하는 링커의 세 구성요소로 이루어져 있다. ADC는 정상 조직에 대한 페이로드의 부정적인 영향을 최소화하며, 표적 항원과 복합체를 형성하여 리소좀으로 내재화된다. 그 다음, 단백질 분해 효소에 의해 세포 독성 페이로드가 방출되고 세포질로 들어가 세포 독성 및 암세포 세포 사멸을 유도한다.
다양한 종양 유형의 환자를 성공적으로 치료하기 위해서는 세포 독성 페이로드의 선택이 중요하다. 현재 DNA 알킬화제, RNA 중합효소 억제제, DNA 토포이소머라제 억제제, 미세소관 억제제, RNA 스플라이싱 억제제 등을 포함하는 다양한 작용 기전을 가진 페이로드가 ADC 개발에 사용되고 있다. 부적절한 페이로드 선택은 암 환자에게 효능이 부족하거나 심각한 부작용을 유발할 수 있으므로, 페이로드를 선택할 때는 작용 기전, 효능, 방관자 효과, 다약제 내성 등의 요인을 고려해야 한다. 마일로타그, 아드세트리스, 카드실라, 베스폰사 및 엔허투 등을 포함하는 ADC가 암 환자 치료용으로 승인되었으며 현재 150개 이상의 ADC가 임상 시험 중이다.
한편, 줄기세포 인자 (Stem Cell Factor, SCF)는 비만세포와 멜라닌 세포의 발달을 자극하고 기능을 조절할 뿐만 아니라 조혈 및 생식세포 발달에 중요한 역할을 한다. SCF는 18-kDa 가용성 형태 또는 막 통과 세그먼트의 엑손 6이 다른 31-kDa 막 결합 분자로 존재할 수 있다. SCF 수용체인 c-Kit은 혈소판 유래 성장인자 (PDGFR), 대식세포 콜로니 자극 인자 1 및 FMS 유사 TK-3/배아 간 키나아제-2 (FLT-3/FLT-2) 수용체를 포함하는 클래스 III 서브패밀리의 티로신 키나아제 수용체이다. SCF 결합 시, c-Kit은 여러 티로신 잔기의 인산화에 의해 활성화되어 세포 증식, 생존, 분화 및 주화성을 유도한다. SCF/c-Kit 신호는 음성 피드백 조절을 받는다. 이는 세포 표면에서 수용체의 세포 내 흡수, 클라트린 매개 내재화, 유비퀴틴화 및 프로테아좀 매개 분해에 의해 하향 조절된다. 정상적인 상황에서 c-Kit 활성화는 엄격하게 조절되며 급성 골수성 백혈병 (AML), 위장관 기질 종양 (GIST), 흑색종 및 비만 세포 종양과 같은 악성 종양의 발달과 관련이 있다.
이전 연구에서 DM1을 포함하는 ADC가 c-Kit 양성 소세포 폐암 및 백혈병을 이식한 마우스 이종 이식 모델에서 종양 성장을 효율적으로 방해한다는 것이 보고된 바 있다 (Mol Oncol 16(6): 1290-1308, 2022). 그러나 일부 종양은 c-Kit 표적 ADC에 효율적으로 반응하지 않았다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 c-Kit 양성 암을 효과적으로 치료할 수 있는 신규 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명의 면역접합체가 c-Kit 양성 암에서 우수한 항암 효과를 갖는다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Mol Oncol 16(6): 1290-1308, 2022
본 발명의 하나의 목적은, 항-c-Kit 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 슈도모나스 외독소 A를 포함하는 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
I. 면역접합체 (immunoconjugate)
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 하기 화학식 1 로 표시되는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식 1]
Ab-(L-D)p
상기 식에서,
Ab는 c-Kit 중 서열번호 20의 D113부터 P206의 부위에 특이적으로 결합하는 항-c-Kit 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드 (Fc-binding peptide)이고;
D는 슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A)이고; 및
p는 1 내지 10의 정수이다.
본 발명에서, 용어 "면역접합체"는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물-링커 접합체가 연결된 복합체를 의미한다. 본 발명에서, 용어 "약물-링커 접합체"는 면역접합체의 제조를 위한 물질로서 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 연결되지 않은 것을 의미하며, 목적하는 바에 따라 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합하여 면역접합체로 사용될 수 있다. 상기 면역접합체는 생체 내 투여될 경우 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 표적하는 항원에 결합한 후 약물을 방출함으로써 표적 세포 및/또는 주변세포들에 약물이 작용할 수 있도록 하여, 표적 약물로서 우수한 약효와 감소된 부작용을 기대할 수 있다. 특히, 본 발명의 면역접합체는 c-Kit의 특정 영역에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드 (Fc-binding peptide) 및 슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A)가 결합된 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체 (whole) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 및 이가 (bivalent) 또는 이중특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형 (subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중쇄"는 중쇄 가변영역 (Variable Region)과 중쇄 불변영역 (Constant Region)을 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 의미한다. 중쇄에는 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 형이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "경쇄"는 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 의미한다. 경쇄에는 카파 (κ) 및 람다 (λ) 형이 있다.
본 발명에서 항체는 전장 항체이거나 또는 항원 결합능을 갖는 항체 단편이며, 중쇄는 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 또는 엡실론 (ε)형 중 어느 하나일 수 있고 경쇄는 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 형일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "c-Kit"은 수용체 티로신 키나아제 (Receptor Tyrosine Kinase, RTK)의 class III에 속하며, SCF의 수용체로도 알려져 있다. 리간드 결합 시 c-Kit은 리간드 매개 이량체화를 통한 자가 인산화에 의해 활성화된다. 결과적으로 Src, PI3K, STAT1 및 JAK2를 포함한 신호 전달 매개체가 모집되어 증식, 생존 및 운동성과 같은 다양한 세포 특이적 반응을 조절한다. 또한, RTK의 과발현은 리간드 독립적인 방식으로 세포 성장을 유도하기 위해 자발적으로 활성화되는 것으로 알려져 있다. c-Kit의 과발현 및 활성화는 GBM, 성상세포종, 생식 세포 및 SCLC를 포함한 다양한 암에서 보고되며 불량한 예후와 상관관계가 있다.
본 발명에서 용어 "항-c-Kit 항체"는 c-Kit에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭하며, 특히 본 발명의 항-c-Kit 항체는 c-Kit 중 도메인 II, 구체적으로 서열번호 20의 특정 에피토프 D113부터 P206의 부위에 특이적으로 결합하여 이에 따라 c-Kit의 활성 또는 활성화를 억제 또는 중화시킬 수 있는 특징을 갖는다. 여기서 서열번호 20에 기재된 서열은 에피토프를 특정하기 위한 레퍼런스 서열로 의미를 가지며, 본 발명의 항체와 동일 에피토프에 결합하는 항체라면, 표적 대상이 되는 c-Kit의 서열이 돌연변이 등에 의해 서열번호 20과 일부 상이하더라도 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 또한, 서열번호 20의 D113부터 P206의 부위로부터 일부 서열이 부가, 치환, 결손된 경우에도 본 발명의 항체와 유사한 활성을 갖는 한 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
이에 제한되는 것은 아니나, 일례로, 상기 항체는 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 기준 항체 (reference antibody)와 인간 c-Kit에 대해 상호 경쟁적으로 결합하는 것일 수 있다. 다른 일례로, 상기 항체는 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 CDR 내의 일부 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 것이라도 동일 에피토프에 결합하는 한 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일례로, 상기 항체는 서열번호 4로 표시되는 경쇄가변영역, 및 서열번호 10으로 표시되는 중쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 항-c-Kit 항체는 인간 IgG1 유래 불변영역을 포함할 수 있으며, 인간 항-c-Kit 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및/또는 CDR 영역이 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변영역을 갖는 항체를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명에서 인간 항체는 인간 유래 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 상기 인간 항체는 전장 항체 형태 또는 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태일 수 있다. 상기 인간 항체의 모든 구성요소는 인간으로부터 유래된 바, 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비하여 인간에게 투여시 면역 반응이 일어날 확률이 적다. 따라서, 인간을 대상으로 하는 치료용 항체로서 유리한 이점을 갖는다.
본 발명에서 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 말한다. 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드의 연속 (contiguous) 아미노산들 (선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나, 또는 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 둘 이상의 비-연속 영역들이 합쳐진 것 (입체형태적, 비-선형, 불연속, 또는 비-연속 에피토프)일 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그렇지는 않지만 전형적으로 변성 용매에 노출시 보유되고, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합된 것을 결정하는 방법 (즉 에피토프 맵핑)이 당업계에 잘 공지되어 있고, 이것은 예를 들어 면역블롯팅 및 면역침전 분석을 포함하며, 중첩 또는 연속 펩타이드 (예를 들어 c-Kit 도메인 2 및 3)가 주어진 항체 (예를 들어 항-c-Kit 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본 명세서에 개시된 것들을 포함하며, 예를 들어 엑스선 결정학, 2-차원 핵자기공명 및 HDX-MS를 포함한다 (G. E. Morris, Ed., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, 1996).
둘 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합한다"는 주어진 방법에 의해 결정되었을 때 항체들이 아미노산 잔기의 동일한 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 항체들이 본 명세서에 제시된 항체와 "c-Kit 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지의 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 엑스선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분광법 (HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항체와 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체의 결합을 모니터링하며, 여기서 항원 서열 내에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실이 주로 에피토프 성분의 표시로서 간주된다. 이에 더하여, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법이 또한 사용될 수 있다. 이들 방법은 조합 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 특정한 짧은 펩타이드를 친화성 분리할 수 있는 관심 항체의 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR 서열을 가진 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적과의 결합에 대해 다른 항체와 상호 경쟁적으로 결합하는" 항체는 나머지 항체와 표적의 결합을 (부분적으로 또는 완전히) 저해하는 항체를 말한다. 두 항체가 표적과의 결합에 대해 서로 경합하는지의 여부, 즉 하나의 항체가 나머지 항체와 표적의 결합을 저해하는지의 여부와 저해하는 정도는 공지된 경합 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 다른 항체와 표적의 결합에서 경쟁하며 이 결합을 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 100 %까지 저해한다. 저해 또는 경쟁의 수준은 항체가 "차단 항체" (즉, 표적과 먼저 인큐베이션된 저온 항체)인지에 따라 상이할 수 있다. 경쟁 분석은, 예를 들어 E.d. Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 E.d. Harlow and David Lane에 의한 "Using Antibodies" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999)의 제11장에 제시된 대로 수행될 수 있다. 경합 항체는 (예를 들어 입체 장애에 의해) 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프에 결합한다.
용어 "기준 항체 (reference antibody)"는 상기 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프에 결합하는 경합 항체의 분석의 기준이 되는 항체를 의미하며, 상기 경합 항체와 에피토프와의 결합에서 상호 경쟁 (cross-compete)한다.
다른 경합 결합 분석은 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소면역분석 (EIA), 샌드위치 경합 분석 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) 참조); 고체상 직접 표지화 분석, 고체상 직접 표지화 샌드위치 분석 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA (Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990) 참조); 및 직접 표지화 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990) 참조)를 포함한다.
본 발명에서 용어 "항원 결합 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭한다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1 도메인)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv (variable fragment)는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv (dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv (scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 Fc 위치선택적 결합 펩티드 (FcIII)는 인간유래 항체의 Fc 도메인의 CH3-CH2 인터페이스 영역 (interface region)에 위치특이적으로 결합하는 펩티드를 말한다. 상기 펩티드는 두 개의 시스테인이 서로 이황화 결합을 형성하고 있어 U자 구조를 나타낸다. 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 "광반응성 아미노산"을 포함하는 특징을 갖는다.
본 발명에서, "광반응성 아미노산"은 광조사시 특정 파장의 빛을 흡수하여 인접한 반응성 작용기와 공유결합을 형성할 수 있는 작용기를 말한다. 본 발명의 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 항체와 혼합하였을 때, 내재적 특성인 특이성에 의해 항체의 Fc 도메인에 인접 또는 결합한다. 이후, 상기 혼합물에 빛을 조사하면 특정 파장의 빛을 흡수하여 광반응성 아미노산을 통해 이와 인접한 항체 Fc 도메인 상의 반응성 작용기와 공유결합을 형성할 수 있다. 즉, 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 광조사시 상기 광반응성 아미노산을 통해 Fc 도메인의 특정 작용기에 공유결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광반응성 아미노산은 예를 들어 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 아지도페닐알라닌, 아지도호모알라닌, 호모프로파길글리신, 호모알릴글리신, p-아세틸-페닐알라닌, p-프로파길옥시-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌 또는 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 13일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일례로 본 발명에서 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열에서 10 번째 아미노산 위치가 광반응성 작용기를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A; PE)는 건강한 사람을 거의 감염시키지 않는 그람 음성 박테리아인 녹농균의 독성 인자이다. 모노-ADP-리보실 트랜스퍼라제 계열에 속하는 PE는 NAD+-디프타미드-ADP-리보실 트랜스퍼라제로서 단백질 합성을 위한 신장 인자-2 (EF-2)를 비활성화하여 세포 독성을 발휘한다. PE는 638개의 아미노산 (aa) 길이를 가진 단백질로 발현되며 여러 구조적 및 기능적 영역으로 나눌 수 있다. 일반적으로 PE는 효소 활성을 가진 A 도메인과 세포 결합 서브유닛인 B 도메인으로 구성된 2 성분 AB 독소 계열에 속한다. 구체적으로, PE는 분비 중에 제거되는 N-말단에 25 aa의 매우 소수성인 리더 펩타이드를 포함한다. 리더 서열 뒤에는 평행하지 않은 β-시트로 구성된 수용체 결합 도메인 Ia (aa 1-252)가 이어진다. 6 개의 연속적인 α-나선을 가진 도메인 II (aa 253-364)는 독소가 세포막을 가로질러 이동할 수 있도록 한다. 도메인 Ib의 마지막 네 개의 잔기 (aa 400-404)는 도메인 III (aa 405-613)과 함께 ADP-리보실전달효소 활성을 가진 독소의 촉매 서브유닛을 형성한다. PE는 ADP-리보실화를 통해 단백질 합성 과정에 필수 물질인 진핵세포 신장 인자 2 (eEF-2)의 불활성화를 촉매하여 단백질 합성 저해를 통한 세포 사멸을 유도한다.
본 발명에서 "슈도모나스 외독소 A (PE)"는 면역원성을 감소시키거나 제거하기 위해 천연 단백질로부터 변경된 PE를 포함한다. 이러한 변경은 도메인 Ia의 제거, 도메인 Ib, II 및 III에서의 다양한 아미노산 결실, 단일 아미노산 치환 및 카복실 말단에서의 하나 이상의 서열의 추가를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 변경된 PE는 천연 야생형 PE의 세포독성 단편일 수 있다. PE의 세포독성 단편은 표적 세포에서 후속 단백질분해 또는 다른 프로세싱을 받거나 받지 않고 (예를 들면, 단백질 또는 전구-단백질로서) 세포독성을 나타내는 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, PE의 세포독성 단편은 천연 PE의 세포독성의 약 20 % 이상, 바람직하게는 약 40 % 이상, 보다 바람직하게는 약 50 %, 훨씬 더 바람직하게는 75 %, 보다 바람직하게는 약 90 % 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95 %의 세포독성을 보유한다. 더 구체적으로, 상기 세포독성 단편은 적어도 천연 PE의 세포독성을 갖고, 경우에 따라서 천연 PE에 비해 증가된 세포독성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 변경된 PE는 예를 들면, PE4E, PE24, PE25, PE35, PE38, PE38QQR, PE38KDEL, PE40, 또는 PE-LR일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 하나의 양태로서, 상기 PE는 PE24일 수 있고, PE24는 예를 들어 서열번호 15로 표시되는 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 광반응성 아미노산을 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 슈도모나스 외독소 A는 직접 연결된 것일 수 있고, 또는 펩티드 링커 등을 통해 간접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역접합체는 평균 약물/항체 비 (Drug-to-antibody ratio, DAR)가 1 내지 10 인 것일 수 있고, 구체적으로 1 내지 5, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 2 인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "약학적으로 허용 가능한 염"은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
II. 약학적 조성물
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 면역접합체의 치료학적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 개체 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, c-Kit 양성 암의 치료 또는 예방 방법이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 면역접합체의 c-Kit 양성 암 예방 또는 치료 용도이다. 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 약학적 조성물의 제조를 위한 상기 면역접합체의 용도이다.
본 발명의 면역접합체에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명의 면역접합체는 c-Kit에 특이적으로 결합하고 세포 내 단백질 합성을 억제하여 세포 사멸을 유도하므로, c-Kit 양성 암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c-Kit 양성 암은 c-Kit 유전자와 관련된 모든 암을 포함하며, 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 가성점액종, 간내담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비만세포종, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장기질종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로 비만세포종양 또는 위장기질종양일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 c-Kit 양성 암 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 c-Kit 양성 암 질환 발전의 억제, 암 질환의 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 암의 치료 또는 예방에 유효한 상기 면역접합체의 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 병용 시 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 투여 용량은 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 면역접합체는 c-Kit의 특정 영역에 특이적으로 결합하고 세포 내 단백질 합성을 억제하여 c-Kit 양성 세포에 대한 세포 독성을 나타내어 뛰어난 항암 활성을 갖는다.
도 1은 2G4 항체의 c-KIT 친화도를 확인하기 위한 SPR 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 2G4 항체의 c-KIT 결합 도메인을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비환원 및 환원 조건에서 2G4-PE 면역접합체의 단일 접합체 또는 이중 접합체에 대하여 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
도 4는 2G4, 2G4-PE 단일 면역접합체 또는 2G4-PE 이중 면역접합체의 c-Kit 결합 친화도를 ELISA로 확인한 비교실험 결과이다. 모든 결과는 적어도 3 번 이상의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 5는 2G4, 2G4-PE 단일 면역접합체 또는 2G4-PE 이중 면역접합체의 c-Kit 결합 친화도를 유세포 분석으로 확인한 비교실험 결과이다. 모든 결과는 적어도 3 번 이상의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 6은 c-Kit 양성인 HMC-1.2 및 GIST-48 세포에서 2G4-PE 단일 면역접합체, 2G4-PE 이중 면역접합체 또는 2G4-DM1의 세포독성을 용량 의존적 방법으로 분석한 결과이다. 결과는 적어도 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 7은 c-Kit 음성인 MDA-MB-453 세포에서 2G4-PE 면역접합체의 세포독성을 용량 의존적 방법으로 분석한 결과이다. 결과는 적어도 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 8은 HMC-1.2, GIST-48 및 MDA-MB-453 세포에 2G4, PE24 또는 2G4-PE 면역접합체를 처리하고 단백질 합성 억제를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다. 양성 대조군으로 사이클로헥시미드를 사용하였고 GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 9는 HMC-1.2 세포를 이식한 마우스 모델에서 비히클 또는 2G4 면역 접합체를 정맥 투여, 또는 이매티닙을 경구 투여하여 종양 부피 변화를 측정한 그래프이다. 종양 부피를 약물 투여 후 일수에 따라 플롯하였고, 녹색 화살표는 비히클 또는 2G4-PE 면역접합체의 투여를 나타낸다.
도 10은 GIST-48 세포를 이식한 마우스 모델에서 비히클 또는 2G4 면역 접합체를 정맥 투여, 또는 이매티닙을 경구 투여하여 종양 부피 변화를 측정한 그래프이다. 종양 부피를 약물 투여 후 일수에 따라 플롯하였고, 녹색 화살표는 비히클 또는 2G4-PE 면역접합체의 투여를 나타낸다. 결과는 적어도 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였으며, unpaired Student's two-sided t-test를 사용하여 비교하였다 (대조군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 이매티닙과 비교; # p < 0.05, ## p < 0.001, 2G4-PE 0.5 mg/kg과 비교; ‡ p < 0.01).
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포주 및 배양 조건
GIST 세포주 (GIST-48)는 Dr. Sebastian Bauer (University of Duisburg- Essen, Germany)로부터 제공받았다. 인간 비만세포 종양 세포주인 HMC-1.2는 Millipore (MA, USA)로부터 구입했다. 유방암 세포주인 MDA-MB-453은 American Type Culture Collection (MA, USA)로부터 구입하였다. GIST-48 세포는 소태아혈청 (FBS; Hyclone, UT, USA) 15 %와 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone, UT, USA) 1 %를 포함하는 IMDM (Welgene, Daegu, Korea)에서 배양하고, HMC-1.2 세포는 10 % FBS, 1 % P/S 및 50 μM 2-메르캅토에탄올 (sigma, MO, USA)을 포함하는 IMDM에서 배양하고, MDA-MB-453 세포는 10 % FBS 및 1 % P/S를 포함하는 RPMI-1640 (Hyclone, UT, USA)에서 배양하였다. 모든 세포주는 가습된 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 유지되었다.
실시예 2: 2G4 항체 생성
2G4 항체의 가변영역을 인간 Fc 아미노산 서열에 그래프팅하고, pCHO 벡터 (Life Technologies, CA, USA) 내에 클로닝하였다. 경쇄 가변영역은 인간 카파 불변영역에 대한 프레임 내에 융합시키고, 중쇄 가변영역은 인간 IgG1 불변영역에 대한 프레임 내에 융합시켰다. 전장 IgG1 항체의 배지 내 분비를 위한 리더 펩타이드 서열을 두 유전자에 첨가하여 유전자를 합성한 후, 서열분석을 통해 다시 한 번 검증하였다. CHO 세포 내 발현 시험을 위해 3 개의 클론을 선택하였다. 3 개의 클론에 대한 글리세롤 스톡을 제조하고, 엔도톡신이 없는 플라스미드를 CHO 세포 내 발현 시험을 위해 제조하였다.
상기 플라스미드 DNA를 CHO-S 세포 내에 형질감염시켰다. 형질감염 1 주일 전 CHO-S 세포 (Invitrogen, CA, USA)를 DMEM 보충 혈청 내 단층 배양물 내로 옮겼다. 그리고 형질감염 1 일 전 세포를 분주한 후, 형질감염 시료에 대해 핵산-리포펙타민 복합체를 준비하여 밤새 5 % CO2 인큐베이터에서, 37 ℃로 인큐베이션하였다. 배지를 2 내지 3 일에 한 번씩 첨가하면서 1 주일 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 회수하여 Protein A/G agarose (invitrogen, CA, USA)에 결합시키고, PBS로 세척하였다. 이어서, 0.1 M 글리신 (pH 2.8)으로 용출한 후, 1 M Tris-HCl (pH 8.0)로 중화시켰다. PBS로 투석한 후 -70 ℃에서 보관하였다.
2G4 항체의 아미노산 및 핵산 서열은 다음과 같다.
경쇄 CDR1 QSLLHSNGYN Y (서열번호 1)
CDR2 LGS (서열번호 2)
CDR3 MQALQTIT (서열번호 3)
경쇄가변영역 DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI K (서열번호 4)
경쇄 전체 METDTLLLWV LLLWVPGSTG DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (서열번호 5)
atggaaacag acacactcct cctctgggtc ctcctcctct gggtcccagg cagcacagga gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactatc accttcggcc aagggacacg actggagatt aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga (서열번호 6)
중쇄 CDR1 GFTFSRYG (서열번호 7)
CDR2 IWYDGTNK (서열번호 8)
CDR3 AREDWAEAFD M (서열번호 9)
중쇄가변영역 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS RYGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGTNKDY TDSVRGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARED WAEAFDMWGQ GTTVTVSS (서열번호 10)
중쇄 전체 METDTLLLWV LLLWVPGSTG QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS RYGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGTNKDY TDSVRGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARED WAEAFDMWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (서열번호 11)
atggaaacag acacactcct cctctgggtc ctcctcctct gggtcccagg cagcacagga caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt cgctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaactaa taaagactat acagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagat tgggctgagg cttttgatat gtggggccaa gggacaacgg tcaccgtctc ttcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tcagcaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga (서열번호 12)
실시예 3: FcIII-PE24 구조의 발현 및 정제
FcIII에 앰버 코돈 (amber codon)이 하나 있는 서열번호 18로 표시되는 FcIII-PE24 구조를 코딩하는 플라스미드 (pSPEL571, pSPEL572, pSPEL524 또는 pSPEL573)를 다른 두 플라스미드인 pSPEL155 및 pSPEL168과 함께 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다. 후자는 대장균 프롤릴-tRNA 합성효소 (EcProRS)를 과발현시켜 단백질의 프롤린 위치에 p-벤조일-L-페닐알라닌 (pBPA)이 오편입되는 것을 억제하는 데 사용되었다. 단일 콜로니를 선별하여 2 x YT 배지 1 mL에 접종했다. 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 배양액을 2 x YT로 100 배 희석하고 광학 밀도 (OD)(600 nm)가 0.5가 될 때까지 37 ℃에서 세포를 배양했다. 0.2 % L-아라비노스 및 50 nM 무수 테트라사이클린을 각각 첨가하여 BpaRS 및 EcProRS의 발현을 유도했다. OD (600 nm)가 1.0에 도달하면 1 mM 이소프로필 ß-D-1-티오갈락토피라노사이드 및 1 mM pBPA (Alfa Aesar, USA)를 배지에 첨가하고 25 ℃에서 16 시간 동안 단백질을 발현시켰다. 주변세포질 분획 후, 제조업체의 권장 사항에 따라 Ni++-고정 수지 (Clonetech Laboratories, USA)를 사용하여 FcIII V10BPA-PE24 단백질 (서열번호 19)을 정제하였다. 단백질 용액을 원심 분리기 (MWCO: 10 kDa, Merck, USA)를 사용하여 150 mM NaCl을 함유한 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.4)에 교환시켰다.
실시예 4: 2G4-PE 면역접합체 제조
2G4 항체 10 μM과 FcIII V10BPA-PE24 30 μg을 24-웰 플레이트에서 1 x PBS (pH 7.4)와 혼합하고, 암실 4 ℃에서 2 시간 동안 UV 램프 (모델: U01-133-194, Lklab, Korea)를 사용하여 상기 혼합물에 365 nm 자외선을 조사하였다.
자외선 조사 후 완충액 A (20 mM 인산염, pH 7.9)로 평형화시킨 Mono-Q 컬럼 (GE Healthcare Life Science, USA)에서 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 2G4-PE24 접합체를 정제하였다. 2G4-PE24 접합체는 완충액 A 및 B (20 mM 인산염, 1 M NaCl, pH 7.9)의 농도 구배로 용출되었다 (단일접합의 경우 10 내지 20 % B, 이중접합의 경우 20 내지 30 % B).
실시예 5: 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)
2G4 및 2G4-PE의 결합 친화도를 비교하기 위해 20 ng 재조합 인간 CD117/c-Kit 단백질 (Sino Biological, Beijing, China)을 포함하는 1 x 인산 완충 식염수 (pH 7.2)를 4 ℃에서 밤새 96-웰 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 코팅하였다. 각 웰을 실온에서 1.5 시간 동안 5 % BSA를 함유하는 1 x PBS로 차단시켰다. 그런 다음, 2G4 또는 2G4-PE의 4 배 연차 희석액을 최종 농도 800 pM로 실온에서 1 시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 웰을 0.1 % Tween-20을 포함하는 1 x PBS로 세척했다. 그 다음, HRP (horseradish peroxidase)-접합 염소 항-인간 IgG 2 차 항체 (1:2000, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 실온에서 1 시간 동안 첨가하였다. 그 후, 다시 세척하고 TMB-효소결합 면역흡착분석 (ELISA) 용액 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 실온에서 5 분 동안 첨가하였다. 반응은 1 M H2SO4를 사용하여 종료시켰다. 흡광도는 SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
실시예 6: 유세포 분석
세포를 아이스에 넣고 5 % BSA를 포함하는 1 x DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 1 시간 동안 차단시켰다. 그 다음, 세포 (2 x 105)를 아이스에 넣고 1 시간 동안 2G4 또는 2G4-PE (5 nM)로 처리하였다. 세포를 2 % BSA를 포함하는 1 x DPBS로 3 번 세척하였다. 그 다음, 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합 염소 항-인간 IgG 2 차 항체 (0.3 μg/mL; Invitrogen, CA, USA)로 염색하고 1 시간 동안 아이스 상에 두었다. 세 번 세척한 후, 세포를 0.1 % BSA를 포함하는 1 x DPBS로 재현탁하였다. 형광 신호는 Cy-Flow Cube 6 (Sysmex Partec, Goerlitz, Germany)을 사용하여 분석하였다.
실시예 7: 시험관 내 세포독성 분석
GIST-48 (8 x 103 세포/웰), HMC-1.2 (5 x 103 세포/웰) 및 MDA-MB-453 세포 (5 x 103 세포/웰)를 96-웰 플레이트 (Greiner Bio-One, Alphen aan den Rijn, Netherlands)에 시딩하고 2G4 또는 2G4-PE와 함께 5 % CO2 인큐베이터 37 ℃에서 제시된 농도로 4 일 동안 인큐베이션하였다. 또한, 2G4-DM1과의 비교실험을 위해 DM1과 항체를 SMCC (N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 통해 접합하여 2G4-DM1 면역접합체를 제조하고 GIST-48 (8 x 103 세포/웰) 및 HMC-1.2 (5 x 103 세포/웰)에 상기와 같은 방법으로 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 Hoechst 33342 (10 μM; Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 염색하고 Celigo Imaging Cytometer (Nexcelom Bioscience, MA, USA)를 사용하여 총 세포를 계수하였다.
실시예 8: ADP-리보실화 활성 분석
PE의 ADP-리보실화 활성은 공개된 방법 (Proc Natl Acad Sci USA 109 (18): 6898-6903, 2012)에 따라 비오틴이 부착된 NAD+에서 EF-2로의 ADP-리보오스의 이동을 측정하여 결정하였다. 1 mM EDTA 및 1 mM DTT가 포함된 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)에 PE24 또는 2G4-PE24를 넣고 50 nM 비오틴이 부착된 NAD+ (CPC Scientific, USA)의 존재 하에 밀 배아 추출물 (Promega, USA)과 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴이 부착된 EF-2는 스트렙트아비딘 HRP-접합 2 차 항체 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
실시예 9: 단백질 합성 억제 분석
2G4-PE24에 의한 단백질 합성 억제를 평가하기 위해 BONCAT (bioorthogonal noncanonical amino acid tagging) 기술을 사용하였다. HMC-1.2, GIST-48 (c-Kit 양성) 및 MDA-MB-453 (c-Kit 음성) 세포를 6-웰 플레이트에 5 x 104 세포/웰의 밀도로 시딩하고 37 ℃, 가습된 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 0.1 nM 2G4, PE24 또는 2G4-PE24를 웰에 첨가하고 세포를 37 ℃에서 20 시간 동안 다시 인큐베이션하였다. 그 다음, 4 mM 아지도호모알라닌 (AHA; Click Chemistry Tools, USA)을 각 웰에 2 시간 동안 첨가했다. 세포를 1 mM MgCl2 및 0.1 mM CaCl2를 함유하는 냉각한 PBS로 세척하고 트립신화하였다. 또한, 1 % SDS (w/v)를 사용하여 세포를 용해하고 세포 용해물을 SDS-PAGE 실행하였다. 웨스턴 블롯을 위해 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인에 옮기고 Cu(I) 촉매 클릭 반응을 통해 비오틴-PEG4-알킨 (Click Chemistry Tools, USA)과 반응하도록 하였다. 비오틴이 부착된 단백질은 스트렙타비딘 HRP-접합 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
실시예 10: 생체 내 실험
이종 이식 분석을 위해, HMC-1.2 세포 (1 x 106 / 100 μL / 마우스)를 50 % 마트리겔 (Corning, NY, USA)과 함께 5 주령 암컷 C.B-17 SCID 마우스 (Charles River Laboratories, Yokohama, Japan)에 피하 이식하였다. GIST-48 (5 x 106 / 100 μL / 마우스) 세포는 NMRI-nu 마우스 (Janvier Laboratories, Saint-Berthevin Cedex, France)에 이식하였다. 종양이 생성된 마우스는 효능 연구를 위해 치료 그룹으로 무작위 배정되었다. 생체 내 효능 연구는 종양 부피가 약 200 mm3에 도달했을 때 시작되었다.
이매티닙 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)은 증류수에 용해하여 마우스에 30 일 동안 매일 1 회 경구 투여하였다 (100 mg/kg). 2G4-PE는 제시된 농도로 30 일 동안 3 번 정맥 투여하였다. 종양의 크기는 매주 2 회 측정했으며, 종양의 부피는 다음 공식을 사용하여 계산하였다:
종양 부피 = (4/3) Х π Х (길이/2) Х (넓이/2) Х (깊이/2).
모든 데이터는 GraphPad Prism 9.0 소프트웨어 (La Jolla, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시하였다. 통계적 유의성은 그룹 간 차이를 비교하기 위해 unpaired Student's t-test 또는 튜키 테스트 (Tukey's test)를 사용한 일원 배치 분산 분석 (one-way ANOVA)을 사용하여 계산하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05 로 설정하였다.
실험예 1: 2G4 항체의 결합 친화도 확인
2G4 항체의 c-KIT에 대한 결합능을 확인하기 위하여 SPR (Surface Plasmon Resonance)을 수행하였다. SR7500DC (Reichert, USA)를 이용하여, 항체 제작을 위해 사용된 인간 c-KIT (서열번호 20; Elabscience, USA) 20 μg, 마우스 c-KIT (SB, Lot#LC05DE2304) 20 μg, 래트 c-KIT (SB, Lot#LC06SE1787) 20 μg을 PEG (Reichert, USA) chip에 고정시켰다. 그 후, 2G4 항체를 농도별로 흘려준 후 c-KIT에 대한 친화도인 KD 값을 Scrubber2 프로그램 이용하여 분석하였다.
KD 값은 kd를 ka로 나눈 값으로, 수치가 낮을수록 해당 타겟에 대한 결합능이 크다는 것을 의미한다.
그 결과는 도 1에 나타내었다. 2G4 항체는 인간 c-KIT에 대한 KD 값이 약 2.8237 (±0.9) x 10-12 M으로서 강한 친화도를 나타내었다. 인간에 대한 친화력이 가장 높고, 그 다음으로 마우스, 래트 순으로 나타났다.
실험예 2: 도메인 맵핑
인간 c-Kit 유전자 (서열번호 20; NM_000222)의 결실 변이체 (Q26-P520, D113-P520 △domain I, A207-P520 △domain I - II, K310-P520 △domain I-III)를 c-말단에 FLAG을 태깅하여 HEK293에 형질감염시켰다. 그 후, 배양액으로 분비시킨 후 FLAG 항체 비드 (Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 정제하였다. 이어서, ELISA를 실시하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 2G4 항체는 도메인 II가 결실되었을 때 c-Kit을 인식하지 못하였으며, 이로부터 2G4 항체의 c-Kit에 대한 구체적인 결합 부위는 도메인 II라는 점이 입증되었다.
실험예 3: 2G4-PE 면역접합체 (2G4-PE)의 생성 및 특성화
Fc-결합 펩타이드 (FcBP)-유래 광교차 결합 반응을 사용하여 2G4-PE를 생성하였다. FcBP는 IgG1의 CH3-CH2 인터페이스 영역 (interface region)에 높은 친화도 (KD ~ 10 nM)로 결합할 수 있으므로 FcBP의 10 번째 아미노산인 발린을 비천연 광반응성 아미노산인 pBPA로 치환하였다. tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소 직교 쌍 (orthogonal pair)을 사용하여 대장균에서 광반응성 FcBP-PE 융합 단백질을 생산하였다. 그 다음, 365 nm에서 광접합을 이용한 공유 결합 형성을 통해 단일 접합체 또는 이중 접합체 2G4-PE를 생성하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 2G4 항체와 FcBP-PE 접합에서 크기 이동이 나타난 것을 확인하였다 (도 3).
다음으로, 항체에 링커-페이로드를 접합하게 되면 표적 결합 친화도에 영향을 미치는 형태 변화를 유도할 수 있으므로, 본 발명자들은 2G4 항체의 c-Kit 결합 친화도를 2G4-PE의 결합 친화도와 비교하였다. ELISA (도 4) 및 유세포 분석 (도 5) 결과, 2G4 항체와 2G4-PE 접합체의 c-Kit 결합 친화도는 유사한 것으로 나타났다.
실험예 4: 시험관 내 세포독성 분석
이전 연구에서 2G4-DM1은 c-Kit에 SCF와 경쟁적으로 결합하여 SCF 매개 c-Kit 신호 전달을 억제하고, 소세포 폐암, 백혈병을 포함하는 다양한 c-Kit 양성 암세포에서 G2/M 단계의 세포 주기를 정지시키고 암세포 사멸을 효율적으로 유도했으나, 천천히 성장하는 c-Kit 양성 위장관기질종양 (GIST-48) 또는 자가 활성화 c-Kit 돌연변이 비만세포종양 (HMC-1.2)과 같은 DM1 내성 세포에서는 2G4-DM1에 반응하지 않았다 (Mol Oncol 16(6): 1290-1308, 2022). 따라서, 본 발명자들은 GIST-48 및 HMC-1.2 세포주를 이용하여 2G4-PE와 2G4-DM1의 시험관 내 세포독성을 비교하였다.
이전 결과들과 일관되게, HMC-1.2 세포에서 2G4-DM1의 IC50은 10.23 nM이었으나, GIST-48 세포에서는 IC50 값을 결정할 수 없었다. 또한, 세포 수용체 결합 도메인이 결손된 결실 돌연변이체 PE24는 고농도에서도 효율적인 세포 사멸을 유도하지 못했다. 대조적으로, 2G4-PE는 HMC-1.2 및 GIST-48 세포 모두에서 IC50 50 pM 이하로 세포 사멸을 효율적으로 유도하였다 (도 6). 그러나 2G4-PE는 고농도에서도 c-Kit 음성 유방암 세포주인 MDA-MB-453에서는 세포 사멸을 유도하지 않았다 (도 7).
다음으로, PE24에 의한 단백질 합성 억제가 암세포 세포사멸을 유도하는 주요 기전이므로, 2G4-PE 처리 후 단백질 합성을 BONCAT 방법을 사용하여 평가하였다. 세포주를 메티오닌 대체물인 AHA와 함께 인큐베이션하고, 신규 합성 단백질에 존재하는 AHA를 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 2G4 항체 또는 PE24를 단독 처리한 경우에는 단백질 합성을 억제하지 않았다. 그러나, 2G4-PE는 c-Kit 양성 HMC-1.2 및 GIST-48 세포에서 신규 단백질 합성을 효율적으로 억제하였고 c-Kit 음성 MDA-MB-453 세포에서는 억제하지 않았다 (도 8). 이는 2G4-PE가 c-Kit 양성 암세포에서만 단백질 합성을 특이적으로 억제한다는 것을 시사한다.
실험예 5: 생체 내 항 종양 활성 분석
2G4-PE의 생체내 효능은 HMC-1.2 및 GIST-48 세포주를 이종이식한 마우스 모델을 사용하여 평가하였다. HMC-1.2 모델에서 2G4-PE의 이중 접합체는 3 mg/kg에서 50 %의 종양 성장 억제율을 보였으며, 종양 무게는 50 % 감소했다 (도 9). GIST-48 모델에서, 이매티닙과 2G4-PE 단일 면역접합체는 모두 약 56 일 동안 종양 성장 정체를 유의하게 촉진하였으나, 2G4-PE만이 비히클 대조군과 비교했을 때 모든 실험군에서 종양 무게를 유의하게 감소시켰다 (도 10, 좌측). 또한 2G4-PE 이중 면역접합체는 0.5 mg/kg에서 56 일 동안 종양 정체를 촉진하는 한편, 1.5 mg/kg 및 3 mg/kg에서 시작점의 종양 부피 이하로 종양 성장을 억제했으며, 모든 실험군에서 운반체 대조군과 비교했을 때 종양 무게가 감소했다 (도 10, 우측). 한편, 모든 실험군에서 체중 감소가 관찰되지 않았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서,
    Ab는 c-Kit 중 서열번호 20의 D113부터 P206의 부위에 특이적으로 결합하는 항-c-Kit 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 서열번호 13의 Fc 결합 펩티드에서 10 번째 아미노산 위치가 광반응성 아미노산으로 치환된 Fc 위치선택적 결합 펩티드 (Fc-binding peptide)이고;
    상기 광반응성 아미노산은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 아지도페닐알라닌, 아지도호모알라닌, 호모프로파길글리신, 호모알릴글리신, p-아세틸-페닐알라닌, p-프로파길옥시-페닐알라닌, 또는 p-벤조일-L-페닐알라닌이고;
    D는 슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A)이고; 및
    p는 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-c-Kit 항체는 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항-c-Kit 항체는 서열번호 4의 경쇄가변영역, 및 서열번호 10의 중쇄가변영역을 포함하는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항-c-Kit 항체는 인간 IgG1 유래 불변영역을 포함하는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 광반응성 아미노산은 p-벤조일-L-페닐알라닌 (pBPA)인, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A)는 PE4E, PE24, PE25, PE35, PE38, PE38QQR, PE38KDEL, PE40 및 PE-LR로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 c-Kit 양성 암은 비만세포종양 또는 위장관기질종양인, c-Kit 양성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020230049928A 2022-04-18 2023-04-17 슈도모나스 외독소 A를 포함하는 c-Kit 표적 면역접합체 KR102572039B1 (ko)

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