KR102565700B1 - Nanoparticle complex for ophthalmic formulation with improved ocular permeability through surface modification using lipid - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안정성이 높고 생체적합성이 뛰어난 리피드 기반 물질로 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면을 개질함으로써, 상기 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 안약 제제용 나노입자 복합체에 대한 것이다.The present invention is a lipid-based material with high stability and excellent biocompatibility, and by modifying the surface of nanoparticles used for the treatment of eye diseases, nanoparticles for ophthalmic preparation can effectively deliver the nanoparticles used for the treatment of eye diseases to the retina of the eye. It's about the complex.

Description

지질을 이용한 표면 개질을 통해 조직 투과성을 향상시킨 안약 제제용 나노입자 복합체{Nanoparticle complex for ophthalmic formulation with improved ocular permeability through surface modification using lipid}Nanoparticle complex for ophthalmic formulation with improved ocular permeability through surface modification using lipid}

본 발명은 안정성이 높고 생체적합성이 뛰어난 리피드 기반 물질로 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면을 개질함으로써, 상기 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 안약 제제용 나노입자 복합체에 대한 것이다.The present invention is a lipid-based material with high stability and excellent biocompatibility, and by modifying the surface of nanoparticles used for the treatment of eye diseases, nanoparticles for ophthalmic preparation can effectively deliver the nanoparticles used for the treatment of eye diseases to the retina of the eye. It's about the complex.

안구로의 약물의 전달은 크게 침습적인 방법과 비 침습적인 방법이 이용되는데, 침습적인 방법으로 약물을 전달하는 대표적인 것이 유리체강 내 약물 주사이다. 유리체강 내 주사로 약물을 주입하는 경우, 유리체강 내에서 발생하는 왕성한 제거 기작으로 인해 전달된 약물의 짧은 반감기를 유지하기 위해서는 빈번한 주사가 요구되며, 이로 인해 망막 박리, 망막 출혈, 내안구염 등과 같은 부작용이 발생할 수 있다.For the delivery of drugs to the eye, both invasive and non-invasive methods are used. A typical example of invasive drug delivery is intravitreal drug injection. When injecting a drug by intravitreal injection, frequent injections are required to maintain a short half-life of the delivered drug due to a vigorous elimination mechanism occurring in the vitreous cavity, which causes retinal detachment, retinal hemorrhage, and endophthalmitis. Side effects may occur.

또한, 비 침습적인 방법의 가장 대표적인 방법으로 안약을 들 수 있는데, 안약의 사용은 편리함과 안정성이 뛰어나다는 장점이 있다. 그러나, 종래의 안약 투여 방법은 각막 표면에서 약물의 머무름 시간이 짧아 사용량에 비해 약효가 떨어지고, 각막의 표면에서 씻겨나간 약물이 눈물과 함께 전신으로 순환하여 부작용을 수반하게 된다. 따라서, 하기의 특허문헌처럼 약물을 알부민 나노입자에 담지하여 각막 표면에서 머무름 시간을 증대시켜 약물을 지속적으로 방출하여 약효시간을 늘릴 수 있고 약물이 전신으로 순환하는 양을 줄일 수 있는 안약 제제가 개발되고 있다.In addition, eye drops can be used as the most representative non-invasive method, and the use of eye drops has the advantage of excellent convenience and safety. However, in the conventional method of administering eye drops, the retention time of the drug on the surface of the cornea is short, compared to the amount used, and the drug washed out from the surface of the cornea circulates throughout the body along with tears, resulting in side effects. Therefore, as in the following patent document, an ophthalmic formulation capable of increasing the retention time on the corneal surface by carrying the drug in albumin nanoparticles to continuously release the drug to increase the drug effect time and reducing the amount of the drug circulating throughout the body has been developed. It is becoming.

<특허문헌><Patent Document>

특허공개공보 제10-2018-0045845호(2018. 05. 04. 공개) "녹내장 치료용 안약 제제"Patent Publication No. 10-2018-0045845 (published on May 4, 2018) "Ophthalmic preparation for glaucoma treatment"

하지만, 종래의 안약 제제를 이용하여도, 약물 통과 부위인 각막 상피(cornea epithelium) 자체의 침투성이 좋지 못해 약물이 망막에 거의 도달하지 못하고 치료 효과를 내기에는 미비한 양만이 전달되는 문제가 있다.However, even when using a conventional eyedrop formulation, the corneal epithelium itself, which is a drug passage site, has poor permeability, so that the drug hardly reaches the retina and only an insignificant amount to produce a therapeutic effect is delivered.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,The present invention has been made to solve the above problems,

본 발명은 안정성이 높고 생체적합성이 뛰어난 리피드 기반 물질로 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면을 개질함으로써, 상기 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 안약 제제용 나노입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention is a lipid-based material with high stability and excellent biocompatibility, and by modifying the surface of nanoparticles used for the treatment of eye diseases, nanoparticles for ophthalmic preparation can effectively deliver the nanoparticles used for the treatment of eye diseases to the retina of the eye. Its purpose is to provide a composite.

또한, 본 발명은 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면의 일 부분에 튜브 형태의 지질구조체를 형성하여, 세포 내 섭취 및 조직 투과 효율을 향상시켜 상기 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 안약 제제용 나노입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, the present invention is an eye medicine that can effectively deliver the nanoparticles to the retina of the eye by forming a tube-shaped lipid structure on a part of the surface of the nanoparticles used for the treatment of eye diseases to improve the efficiency of cellular uptake and tissue penetration. Its purpose is to provide a nanoparticle complex for formulation.

또한, 본 발명은 지질구조체를 나노입자에 직접 부착하지 않고 지질 기반의 지질체(버블, 리포좀 등)와 나노입자를 결합시킨 후 물질적인 힘을 가해 지질체가 파쇄되어 나노입자 표면에 지질구조체가 형성되도록 하는 Top-down 방식을 이용하므로 용이하게 대량 생산이 가능한 안약 제제용 나노입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, the present invention does not directly attach the lipid structure to the nanoparticle, but combines the lipid-based lipid body (bubble, liposome, etc.) with the nanoparticle, and then applies a physical force to crush the lipid body to form a lipid structure on the surface of the nanoparticle The purpose is to provide a nanoparticle complex for ophthalmic preparations that can be easily mass-produced by using a top-down method to ensure that

본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.The present invention is implemented by an embodiment having the following configuration in order to achieve the above object.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체는 안질환 치료에 이용되는 나노입자와, 상기 나노입자의 외표면 일부분에 결합하여 나노입자의 조직 투과 효율을 향상시키는 지질 기반의 지질구조체를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the present invention, the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention includes nanoparticles used for the treatment of eye diseases, and lipids that bind to a portion of the outer surface of the nanoparticles to improve tissue penetration efficiency of the nanoparticles. It is characterized in that it includes a geological structure based on.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체에 있어서 상기 나노입자는 안질환 치료용 약물을 담지하거나 안질환을 치료할 수 있는 물질로 이루어지는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention, the nanoparticles are characterized in that they contain a drug for treating eye diseases or are made of a material capable of treating eye diseases.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체에 있어서 상기 지질구조체는 안질환 치료에 사용되는 상기 나노입자의 안구 망막 내 전달 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention, the lipid structure is characterized in that it can improve the delivery efficiency of the nanoparticles used for the treatment of eye diseases in the retina of the eye. .

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체에 있어서 상기 지질구조체는 50 내지 300nm의 길이를 가지고 3 내지 20nm의 폭을 가지는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention, the lipid structure is characterized by having a length of 50 to 300 nm and a width of 3 to 20 nm.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체에 있어서 상기 지질구조체는 친수성을 띄는 지질 헤드가 외측면에 위치하고 내부에 소수성을 띄는 지질 꼬리가 위치하여 전체적으로 길이가 긴 튜브 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention, the lipid structure has a hydrophilic lipid head located on the outer surface and a hydrophobic lipid tail located inside, so that the overall length is long. It is characterized by having a tube shape.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체의 제조방법은 제1반응기가 존재하는 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 형성하는 나노입자형성단계와, 상기 제1반응기와 화학적으로 결합하는 제2반응기가 존재하는 인지질 기반의 마이크로 사이즈의 지질체를 형성하는 지질체형성단계와, 상기 나노입자와 지질체를 혼합하여 제1반응기와 제2반응기가 서로 결합하도록 하여 지질체의 외면에 나노입자가 결합한 지질체-나노입자 복합체를 형성하는 지질복합체형성단계와, 상기 지질복합체형성단계에서 형성된 지질체-나노입자 복합체에 기계적인 힘을 가해 지질체를 파쇄하여 나노입자의 외표면 일부분에 결합한 지질구조체를 형성하여 나노입자 복합체를 제조하는 파쇄형성단계를 포함하며, 상기 지질체는 버블 또는 리포좀이고, 상기 지질구조체는 나노입자의 조직 투과 효율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the method for producing a nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention includes the nanoparticle formation step of forming nanoparticles used for the treatment of eye diseases in which a first reactive group exists, and the first A lipid body formation step of forming a phospholipid-based micro-sized lipid body in which a second reactor chemically bonded to the reactor exists, and mixing the nanoparticles and the lipid body so that the first reactor and the second reactor are bonded to each other Lipid complex formation step of forming a lipid body-nanoparticle complex in which nanoparticles are bound to the outer surface of the lipid body, and mechanical force is applied to the lipid body-nanoparticle complex formed in the lipid complex formation step to break the lipid body to nanoparticles A crushing step of preparing a nanoparticle complex by forming a lipid structure bound to a portion of the outer surface of the lipid structure, characterized in that the lipid structure is a bubble or liposome, and the lipid structure improves the tissue penetration efficiency of the nanoparticles .

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 안약제제용 나노입자 복합체의 제조방법에 있어서 상기 파쇄형성단계에서는 지질체-나노입자 복합체에 기계적인 힘을 가하고 일정 시간 유지하여, 지질체가 파쇄되며 지질체를 이루는 인지질은 재조합이 일어나 나노입자에 결합한 튜브 형태의 지질구조체가 형성되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the manufacturing method of the nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to the present invention, in the crushing formation step, mechanical force is applied to the lipid body-nanoparticle complex and maintained for a certain period of time, so that the lipid body is crushed It is characterized in that the phospholipid constituting the lipid body undergoes recombination to form a tube-shaped lipid structure bound to the nanoparticle.

본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.The present invention can obtain the following effects by the above embodiment.

본 발명은 안정성이 높고 생체적합성이 뛰어난 리피드 기반 물질로 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면을 개질함으로써, 상기 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 효과가 있다.The present invention has the effect of effectively delivering the nanoparticles used for the treatment of eye diseases to the retina of the eye by modifying the surface of the nanoparticles used for the treatment of eye diseases with a lipid-based material having high stability and excellent biocompatibility.

또한, 본 발명은 안질환 치료에 이용되는 나노입자 표면의 일 부분에 튜브 형태의 지질구조체를 형성하여, 세포 내 섭취 및 조직 투과 효율을 향상시켜 상기 나노입자를 안구의 망막까지 효과적으로 전달할 수 있는 효과가 있다.In addition, the present invention forms a tube-shaped lipid structure on a part of the surface of the nanoparticle used for the treatment of eye diseases, thereby improving the efficiency of intracellular uptake and tissue penetration, thereby effectively delivering the nanoparticle to the retina of the eye. there is

또한, 본 발명은 지질구조체를 나노입자에 직접 부착하지 않고 지질 기반의 지질체(버블, 리포좀 등)와 나노입자를 결합시킨 후 물질적인 힘을 가해 지질체가 파쇄되어 나노입자 표면에 지질구조체가 형성되도록 하는 Top-down 방식을 이용하므로 용이하게 대량 생산이 가능한 효과가 있다.In addition, the present invention does not directly attach the lipid structure to the nanoparticle, but combines the lipid-based lipid body (bubble, liposome, etc.) with the nanoparticle, and then applies a physical force to crush the lipid body to form a lipid structure on the surface of the nanoparticle Since the top-down method is used to make it possible, there is an effect that mass production can be easily performed.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 모식도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 TEM 이미지.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 Cryo-TEM 이미지.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체에 결합하는 지질구조체의 Cryo-TEM 이미지.
도 5는 인지질 비율을 달리하여 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 Cryo-TEM 이미지.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체에 사용되는 바이러스 나노입자의 TEM 이미지.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 Cryo-TEM 이미지.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 유세포 측정기(Flow cytometry)를 이용한 분석결과를 나타내는 도표.
도 9 및 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 12는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 13 및 14는 다양한 지질 및 작용기를 이용하여 제조된 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 유세포 측정기(Flow cytometry)를 이용한 분석결과를 나타내는 도표.
도 15는 Endocytosis Inhibitor를 처리한 후의 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 유세포 측정기(Flow cytometry)를 이용한 분석결과를 나타내는 도표.
도 16은 Endocytosis Inhibitor를 처리한 후, 인지질 비율을 달리하여 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 유세포 측정기(Flow cytometry)를 이용한 분석결과를 나타내는 도표.
도 17은 HA를 과량 처리한 후의 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 항암제 전달체로의 효능 확인하기 위한 cell viability assay 결과를 나타내는 도표.
도 19 및 20은 본 발명에 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 유전체 약물 전달체로의 효능을 확인하기 위한 gene silencing 결과를 나타내는 도면.
도 21 내지 22는 본 발명에 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 유전체 약물 전달체로의 효능을 확인하기 위한 gene silencing 결과를 나타내는 도면.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 스피로이드 종양 세포 모델에서의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 24는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 스피로이드 종양 세포 모델에서의 세포 섭취 효율을 확인하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 25 및 26은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 스페로이드 종량 세포 모델에서 유전체 약물 전달체로의 효능을 확인하기 위한 gene silencing 결과를 나타내는 도면.
도 27은 동물모델에서 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율 평가하기 위한 confocal microscope 이미지.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 복합체의 안구 내 망막 전달 효율을 평가하기 위한 confocal microscope 이미지.1 is a schematic diagram of a nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention.
2 is a TEM image of a nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention.
3 is a cryo-TEM image of a nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention.
4 is a cryo-TEM image of a lipid structure bound to a nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention.
5 is a cryo-TEM image of a nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention prepared by varying the phospholipid ratio.
6 is a TEM image of virus nanoparticles used in a nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention.
7 is a cryo-TEM image of a nanoparticle composite according to another embodiment of the present invention.
8 is a chart showing the analysis results using flow cytometry for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention.
9 and 10 are confocal microscope images for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention.
11 is a confocal microscope image for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention.
12 is a confocal microscope image for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention.
13 and 14 are charts showing analysis results using flow cytometry for confirming the cell uptake efficiency of nanoparticle complexes prepared using various lipids and functional groups.
15 is a chart showing analysis results using flow cytometry for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention after treatment with an Endocytosis Inhibitor.
16 is a chart showing analysis results using flow cytometry for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention prepared by varying the phospholipid ratio after treatment with an Endocytosis Inhibitor.
17 is a confocal microscope image for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention after excessive treatment with HA.
18 is a chart showing the results of a cell viability assay for confirming the efficacy of a nanoparticle complex as an anticancer drug delivery system according to an embodiment of the present invention.
19 and 20 are diagrams showing gene silencing results for confirming the efficacy of a nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention as a dielectric drug delivery system.
21 and 22 are diagrams showing gene silencing results for confirming the efficacy of a nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention as a dielectric drug delivery system.
23 is a confocal microscope image for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention in a spiroid tumor cell model.
24 is a confocal microscope image for confirming the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention in a spiroid tumor cell model.
25 and 26 are views showing gene silencing results for confirming the efficacy of a nanoparticle complex as a dielectric drug delivery system in a spheroid mass cell model according to another embodiment of the present invention.
27 is a confocal microscope image for evaluating cell uptake efficiency of a nanoparticle complex according to another embodiment of the present invention in an animal model.
28 is a confocal microscope image for evaluating intraocular retinal delivery efficiency of a nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention.

이하에서는 본 발명에 따른 지질을 이용한 표면 개질을 통해 조직 투과성을 향상시킨 안약 제제용 나노입자 복합체를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Hereinafter, the nanoparticle complex for ophthalmic preparation with improved tissue permeability through surface modification using lipids according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Unless there is a special definition, all terms in this specification are the same as the general meaning of the term understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs, and if it conflicts with the meaning of the term used in this specification, the present invention Follow the definitions used in the specification. In addition, detailed descriptions of well-known functions and configurations that may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention will be omitted. Throughout the specification, when a part "includes" a certain component, it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질을 이용한 표면 개질을 통해 조직 투과성을 향상시킨 안약 제제용 나노입자 복합체를 도 1 내지 28을 참조하여 설명하면, 상기 안약 제제용 나노입자 복합체는 안질환 치료에 사용되는 나노입자(1)와, 상기 나노입자(1)의 외표면 일부분에 결합하여 나노입자(1)의 조직 투과 효율을 향상시키는 지질 기반의 지질구조체(2) 등을 포함하여, 상기 안질환 치료에 사용되는 나노입자의 안구 망막 내 전달 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.Referring to the nanoparticle complex for ophthalmic preparation with improved tissue permeability through surface modification using lipids according to an embodiment of the present invention with reference to Figures 1 to 28, the nanoparticle complex for ophthalmic preparation is used for the treatment of eye diseases treatment of the eye disease, including nanoparticles (1), and lipid-based lipid structures (2) that bind to a portion of the outer surface of the nanoparticles (1) to improve tissue penetration efficiency of the nanoparticles (1) It is characterized in that it is possible to improve the delivery efficiency of the nanoparticles used in the eye retina.

상기 나노입자(1)는 안질환 치료에 이용되는 구성으로, 상기 나노입자(1)는 예컨대 약물을 담지하거나 안질환을 치료할 수 있는 물질로 이루어지게 되는데, 안약 형태로 안구에 점안되어 안질환의 치료에 이용되는 종래의 다양한 나노입자가 사용될 수 있으며, 예컨대, 안질환 치료에 이용되는, 안질환 치료용 약물을 담지한 알부민 나노입자, 핵산과 알부민으로 이루어진 나노입자, 생분해성 고분자 나노입자, 핵산 나노입자, 바이러스 입자 등을 예로 들 수 있다. 상기 나노입자는 예컨대 50 내지 500nm의 직경 및 구형의 형태 등을 가질 수 있다. 상기 나노입자는 지질구조체와 결합하는 화학 반응기(이하, '제1반응기'라 함)를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1반응기로는 싸이올기, 아민기, 아미노기, 카르복시기 등을 포함하는 화합물일 수 있다.The nanoparticles (1) are used for treating eye diseases, and the nanoparticles (1) are made of, for example, a substance capable of carrying a drug or treating eye diseases. Various conventional nanoparticles used for treatment can be used, for example, albumin nanoparticles carrying drugs for the treatment of eye diseases, nanoparticles composed of nucleic acids and albumin, biodegradable polymer nanoparticles, nucleic acids used for the treatment of eye diseases. Examples include nanoparticles, virus particles, and the like. The nanoparticles may have, for example, a diameter of 50 to 500 nm and a spherical shape. The nanoparticles may include a chemical reactor (hereinafter referred to as a 'first reactor') that binds to the lipid structure. For example, the first reactive group may be a compound including a thiol group, an amine group, an amino group, a carboxy group, and the like.

상기 지질구조체(2)는 안질환 치료에 이용되는 나노입자(1)의 외표면 일부분에 결합하여 나노입자(1)의 조직 투과 효율을 향상시키는 지질 기반의 구조체로, 상기 지질구조체는 예컨대 50 내지 300nm의 길이를 가지고 3 내지 20nm의 폭을 가질 수 있으며, 상기 나노입자의 외표면에 하나 이상이 결합될 수 있다. 또한, 상기 지질구조체는 나노입자의 제1반응기와 화학 결합하는 화학 반응기(이하, '제2반응기'라 함)를 포함할 수 있다. 예컨대, 제2반응기로는 싸이올기, 아민기, 아미노기, 카르복시기 등을 포함하는 화합물일 수 있다. 상기 지질구조체는 제2반응기가 결합된 지질과 제2반응기가 결합되지 않은 지질이 혼합된 혼합물로 이루어진 지질체의 재조합에 의해 형성되는데, 상기 지질구조체는 제2반응기가 결합한 지질과 제2반응기가 결합되지 않은 지질의 혼합 비율을 조절하여 지질구조체의 생성 및 형태(모양 및 길이 등) 제어할 수 있으며, 제2반응기가 결합한 지질과 제2반응기가 결합하지 않은 지질은 1:2.33 ~ 99의 몰비로 혼합되는 것이 바람직하다.The lipid structure (2) is a lipid-based structure that improves the tissue penetration efficiency of the nanoparticles (1) by binding to a portion of the outer surface of the nanoparticles (1) used for the treatment of eye diseases. It may have a length of 300 nm and a width of 3 to 20 nm, and one or more may be bonded to the outer surface of the nanoparticle. In addition, the lipid structure may include a chemical reactor (hereinafter referred to as a 'second reactor') that chemically bonds with the first reactor of the nanoparticle. For example, the second reactive group may be a compound including a thiol group, an amine group, an amino group, a carboxy group, and the like. The lipid structure is formed by recombination of a lipid body composed of a mixture of a mixture of a lipid to which the second reactive group is bound and a lipid to which the second reactive group is not bound. The formation and shape (shape and length, etc.) of the lipid structure can be controlled by adjusting the mixing ratio of unbound lipids, and the molar ratio between the lipid bound to the second reactor and the lipid to which the second reactor is not bound is 1:2.33 to 99. It is preferable to mix with.

상기 지질구조체는 예컨대 친수성을 띄는 지질 헤드(21)가 외측면에 위치하고 내부에 소수성을 띄는 지질 꼬리(22)가 위치하여 전체적으로 길이가 긴 튜브 형태를 가질 수 있으며, 튜브 형태의 지질구조체 일단에 위치하는 제2반응기기가 상기 나노입자의 제1반응기와 화학 결합하여 튜브 형태의 지질구조체가 상기 나노입자(1)의 외표면에 결합하게 된다. 예를 들어, 나노입자를 알부민 나노입자이고, 상기 지질구조체에 NHS(N-hydroxysuccinimide) 반응기를 형성하는 경우, NHS-amine 반응을 통해 상기 나노입자(1)와 지질구조체(2)를 결합시킬 수 있다. 본 발명은 안정성이 높고 생체적합성이 뛰어난 리피드 기반 물질로 나노입자 표면을 개질함으로써 안약 형태로 안구에 점안 시 조직 투과 효율을 향상시켜, 공막을 투과하여 안구의 망막까지 나노입자를 효과적으로 전달할 수 있게 된다.The lipid structure may have, for example, a long tube shape in which the hydrophilic lipid head 21 is located on the outer surface and the hydrophobic lipid tail 22 is located on the inside, and is located at one end of the tube-shaped lipid structure. The second reactive group is chemically bonded to the first reactive group of the nanoparticle, so that the tube-shaped lipid structure is bonded to the outer surface of the nanoparticle (1). For example, when the nanoparticles are albumin nanoparticles and an N-hydroxysuccinimide (NHS) reactive group is formed in the lipid structure, the nanoparticles (1) and the lipid structure (2) can be combined through an NHS-amine reaction. there is. In the present invention, by modifying the surface of nanoparticles with a lipid-based material with high stability and excellent biocompatibility, the efficiency of tissue penetration is improved when instilled into the eye in the form of an eye drop, and the nanoparticles can be effectively delivered to the retina of the eye through the sclera. .

본 발명의 다른 실시예에 따른 안약제제용 나노입자 복합체의 제조방법을 설명하면, 상기 안약제제용 나노입자 복합체의 제조방법은 제1반응기가 존재하는 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 형성하는 나노입자형성단계와, 상기 제1반응기와 화학적으로 결합하는 제2반응기가 존재하는 지질 기반의 마이크로 사이즈의 지질체(버블, 리포좀 등)를 형성하는 지질체형성단계와, 상기 나노입자와 지질체를 혼합하여 제1반응기와 제2반응기가 서로 결합하도록 하여 지질체의 외면에 나노입자가 결합한 지질체-나노입자 복합체를 형성하는 지질복합체형성단계와, 상기 지질복합체형성단계에서 형성된 지질체-나노입자 복합체에 기계적인 힘(mechanical force)을 가해 지질체를 파쇄하여 나노입자의 외표면 일부분에 결합한 지질구조체를 형성하는 파쇄형성단계 등을 포함한다.Describing a method for producing a nanoparticle complex for ophthalmic preparation according to another embodiment of the present invention, the method for preparing a nanoparticle complex for ophthalmic preparation is a nanoparticle forming nanoparticle used for treatment of an eye disease in which a first reactive group exists. A particle formation step, a lipid body formation step of forming a lipid-based micro-sized lipid body (bubble, liposome, etc.) in which a second reactor chemically bonded to the first reactor exists, and the nanoparticle and the lipid body Lipid complex formation step of mixing to form a lipid body-nanoparticle complex in which nanoparticles are bonded to the outer surface of the lipid body by mixing so that the first reactor and the second reactor are bonded to each other, and the lipid body formed in the lipid complex formation step-nanoparticles A crushing step of crushing the lipid body by applying mechanical force to the composite to form a lipid structure coupled to a portion of the outer surface of the nanoparticle.

상기 나노입자형성단계는 안질환 치료에 이용되는 나노입자가 제1반응기를 포함하도록 상기 나노입자를 형성하는 단계로, 종래의 다양한 나노입자를 제조하는 방법이 사용될 수 있으며, 예컨대 안질환 치료용 약물을 담지한 알부민 나노입자의 경우 알부민에 아민기가 존재하여 제1반응기로 이용될 수 있으며, 알질환을 발생시키는 특정 단백질의 발현을 억제하는 siRNA 나노입자의 경우 siRNA 나노입자에 아민이 붙어 있는 히알루론산을 코팅하여 siRNA 나노입자에 제1반응기를 형성할 수 있다.The nanoparticle formation step is a step of forming the nanoparticles to include a first reactive group, which is used for treating eye diseases, and various conventional methods for preparing nanoparticles may be used, such as drugs for treating eye diseases. In the case of albumin nanoparticles carrying an amine group present in albumin, it can be used as a first reactor, and in the case of siRNA nanoparticles that suppress the expression of a specific protein that causes egg disease, hyaluronic acid with amine attached to siRNA nanoparticles may be coated to form a first reactive group on the siRNA nanoparticle.

상기 지질체형성단계는 상기 제1반응기와 화학적으로 결합하는 제2반응기가 존재하는 지질 기반의 마이크로 사이즈의 지질체(버블, 리포좀 등)를 형성하는 단계로, 예컨대 버블은 지질(예컨대, 인지질)로 형성되고 내부에 가스가 충진되어 있으며 상기 버블에 제2반응기가 위치하게 된다. 내부에 가스를 가지고 지질로 이루어진 리포좀 형태의 마이크로 사이즈의 버블은 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 예컨대 제2반응기가 결합한 지질과 제2반응기가 결합하지 않은 지질을 유기용매에 일정 비율로 혼합하여 지질필름을 형성하고, 상기 지질필름을 용매에 녹이고 가스를 주입하여 형성할 수 있다. 상기 제2반응기가 결합한 지질과 제2반응기가 결합하지 않은 지질의 혼합 비율을 조절하여 지질구조체의 생성 및 형태(모양 및 길이 등)을 제어할 수 있으며, 제2반응기가 결합한 지질과 제2반응기가 결합하지 않은 지질은 1:2.33 ~ 99의 몰비로 혼합되는 것이 바람직하다.The lipid body formation step is a step of forming a lipid-based micro-sized lipid body (bubbles, liposomes, etc.) in which a second reactor chemically bonded to the first reactor exists. For example, the bubble is a lipid (eg, phospholipid) It is formed and filled with gas inside, and the second reactor is located in the bubble. Micro-sized bubbles in the form of liposomes with gas inside and composed of lipids can be prepared by a conventional manufacturing method. It can be formed by mixing to form a lipid film, dissolving the lipid film in a solvent and injecting a gas. The formation and shape (shape and length, etc.) of the lipid structure can be controlled by adjusting the mixing ratio of the lipid to which the second reactor is bound and the lipid to which the second reactor is not bound, and the lipid to which the second reactor is bound and the second reactor Lipids to which is not bound are preferably mixed in a molar ratio of 1:2.33 to 99.

상기 지질복합체형성단계는 상기 나노입자와 지질체를 혼합하여 제1반응기와 제2반응기가 서로 결합하도록 하여 지질의 외면에 나노입자가 결합한 지질체-나노입자 복합체를 형성하는 단계이다.The lipid complex formation step is a step of forming a lipid body-nanoparticle complex in which the nanoparticles are bonded to the outer surface of the lipid by mixing the nanoparticle and the lipid body so that the first reactor and the second reactor are bonded to each other.

상기 파쇄형성단계는 상기 지질복합체형성단계에서 형성된 지질체-나노입자 복합체에 기계적인 힘(mechanical force)을 가해 지질체를 파쇄하여 나노입자의 외표면 일부분에 결합한 지질구조체를 형성하는 단계이다. 지질체-나노입자 복합체에 초음파 기기 등을 이용하여 기계적인 힘을 가하고 일정 시간 유지하는 경우, 지질체가 파쇄되며 지질체를 이루는 지질은 재조합이 일어나 나노입자에 결합한 튜브 형태의 지질구조체가 형성되게 된다. 구체적으로, 지질체-나노입자 복합체에 기계적인 힘을 가하면 지질체가 파쇄되며, 제2반응기를 가지고 있는 일부 지질이 우선적으로 나노입자에 결합하고(제1반응기와 제2반응기가 화학 결합함), 이를 시적점으로 하여 나머지 지질들이 자기조립으로 지질구조체를 형성하게 된다.The crushing formation step is a step of forming a lipid structure bonded to a portion of the outer surface of the nanoparticle by applying a mechanical force to the lipid body-nanoparticle complex formed in the lipid complex formation step to crush the lipid body. When mechanical force is applied to the lipid body-nanoparticle complex using an ultrasonic device and maintained for a certain period of time, the lipid body is broken and the lipids constituting the lipid body recombine to form a tube-shaped lipid structure bound to the nanoparticles. . Specifically, when mechanical force is applied to the lipid body-nanoparticle complex, the lipid body is broken, and some lipids having a second reactive group preferentially bind to the nanoparticle (the first and second reactors are chemically bonded), Using this as the starting point, the remaining lipids form a lipid structure by self-assembly.

본 발명은 지질구조체를 나노입자에 직접 부착하지 않고 지질 기반의 지질체와 나노입자를 결합시킨 후 기계적인 힘을 가해 지질체가 파쇄되어 나노입자 표면에 지질구조체가 형성되도록 하는 Top-down 방식을 이용하므로 용이하게 대량 생산이 가능하도록 할 수 있다.The present invention does not directly attach the lipid structure to the nanoparticle, but after combining the lipid-based lipid body and the nanoparticle, mechanical force is applied to crush the lipid body to form a lipid structure on the surface of the nanoparticle. Using a top-down method Therefore, it can be easily mass-produced.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these are only for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1> 알부민 나노입자 복합체의 제조<Example 1> Preparation of albumin nanoparticle complex

1. 알부민 나노입자(NPs)의 준비1. Preparation of albumin nanoparticles (NPs)

알부민(Human serum albumin)을 증류수에 20mg/mL의 농도로 녹여 준 후, 0.2M NaOH를 이용하여 pH를 8로 조절하여 알부민 용액을 준비하고, 100% 에탄올을 1mL/min의 속도로 상기 알부민 용액에 적정하였다. 이후, 4%의 glutaraldehyde 10μL를 첨가하고 차광 하에 에탄올을 하룻밤 동안 날려주고, 13200rpm, 10min 조건으로 원심분리를 진행한 후 입자화되지 않은 알부민을 피펫을 이용해 제거해주고 PBS로 재분산하여 3000rpm, 5min 조건으로 원심분리를 진행한 후 micropellet을 제외한 상층액(나노입자(NPs))를 피펫으로 얻었다(한편, 형광 실험을 진행할 시에는, 필요에 따른 형광 dye와 나노입자를 하룻밤 동안 상온에서 반응시킨 후, 13200rpm, 10min 조건으로 원심분리를 진행한 후 반응하지 않은 형광 dye를 피펫을 이용하여 제거한 후 PBS로 재분산하여 사용함).After dissolving albumin (Human serum albumin) in distilled water at a concentration of 20 mg/mL, preparing an albumin solution by adjusting the pH to 8 using 0.2M NaOH, and adding 100% ethanol at a rate of 1 mL/min to the albumin solution. was titrated to. Thereafter, 10 μL of 4% glutaraldehyde was added, ethanol was blown overnight under shade, centrifugation was performed at 13200 rpm, 10 min, and non-granularized albumin was removed using a pipette, redispersed in PBS, and centrifuged at 3000 rpm, 5 min. After centrifugation, the supernatant (nanoparticles (NPs)) except for the micropellet was obtained with a pipette (on the other hand, when conducting a fluorescence experiment, after reacting the necessary fluorescent dye and nanoparticles overnight at room temperature, 13200 rpm , After centrifugation was performed under the condition of 10 min, unreacted fluorescent dye was removed using a pipette, and then redispersed in PBS before use).

2. 지질체(리포좀)의 준비2. Preparation of lipid bodies (liposomes)

지질 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DSPE-PEG-NHS2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-polyethylene glycol succinimidyl ester)을 9.25:0.75의 몰비로 혼합하여 Chloroform에 10mg/ml의 농도로 녹인 후 1mg/ml이 되도록 lc vial에 100ul씩 넣어준 후, 질소가스를 이용하여 chloroform을 날려준 후, desiccator를 이용하여 진공을 잡아 1시간 이상 말려 지질박막(lipid film)을 형성하였다. lipid film vial에 auto PBS를 1ml 넣어 지질 용액을 형성하고, 55℃ 이상의 온도를 가지는 물에 지질 용액이 들어 있는 HPLC vial을 넣어 지질 용액의 온도가 55℃ 이상이 되도록 하고 bath sonic에서 15초 정도 sonication을 실시하여(이때, 뜨거운 물에 담그는 과정과 sonication 실시 과정을 3번 정도 반복함), 리포좀을 형성하였다.The lipids DSPC (1,2-distearoyl -sn -glycero-3-phosphocholine) and DSPE-PEG-NHS2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-polyethylene glycol succinimidyl ester) were mixed at a ratio of 9.25:0.75. After mixing in a molar ratio and dissolving in Chloroform at a concentration of 10mg/ml, put 100ul each in an lc vial to reach 1mg/ml, blow off the chloroform using nitrogen gas, and dry it for more than 1 hour using a vacuum using a desiccator. A lipid film was formed. Put 1ml of auto PBS into the lipid film vial to form a lipid solution, put the HPLC vial containing the lipid solution in water with a temperature of 55℃ or higher to make the temperature of the lipid solution reach 55℃ or higher, and sonicate for 15 seconds in a bath sonic. (At this time, the process of soaking in hot water and sonication were repeated about 3 times) to form liposomes.

3. 지질체(지질을 이용한 버블)의 준비3. Preparation of lipid bodies (lipid-based bubbles)

실시예 1의 2의 과정을 거쳐 얻은 결과물에, C3F8 gas를 30초간 vial에 채워, Vial Mixer를 이용하여 45초간 mixing 시켜 NHS 반응기를 포함하는 지질 기반의 마이크로 버블을 형성하였다.In the result obtained through the process of Example 1, 2, C 3 F 8 gas was filled in the vial for 30 seconds and mixed for 45 seconds using a Vial Mixer to form lipid-based microbubbles containing NHS reactors.

4. 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)의 형성4. Formation of nanoparticle composites (Directional LT-NPs)

(1) 실시예 1의 1에서 형성된 나노입자를 리포좀 용액(실시예 1의 2에서 형성된 리포좀이 PBS에 1mg/ml의 농도로 혼합되어 형성)에 넣어준 후, NHS-amine 반응을 유도하기 위해 RT에서 2시간 이상 반응시킨 후(이때, 리포좀-나노입자 복합체(Liposome-NPs)가 형성됨), 초음파 기기를 이용하여 2W, 1MHZ, duty cycle 100% 조건으로 5분 이상 mechanical force를 가하였다. 이후, 파쇄된 리포좀이 지질구조체를 충분히 형성할 수 있도록, 1시간 이상 RT에서 incubation하여 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)를 형성하였다.(1) After putting the nanoparticles formed in 1 of Example 1 into a liposome solution (formed by mixing the liposomes formed in 2 of Example 1 with PBS at a concentration of 1 mg/ml), to induce an NHS-amine reaction After reacting at RT for more than 2 hours (at this time, liposome-nanoparticle complexes (Liposome-NPs) are formed), mechanical force was applied for more than 5 minutes under 2W, 1MHZ, duty cycle 100% conditions using an ultrasonic device. Thereafter, the disrupted liposomes were incubated at RT for at least 1 hour to sufficiently form a lipid structure to form a nanoparticle complex (Directional LT-NPs) in which the lipid structure was bound to a portion of the outer surface of the nanoparticle.

(2) 리포좀 대신에 실시예 1의 3에서 형성된 마이크로 버블을 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 4의 (1)과 동일하게 하여 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)를 형성하였다.(2) Except for using the microbubbles formed in Example 1-3 instead of liposomes, other conditions are the same as in Example 1-4 (1) Nanoparticles in which a lipid structure is bound to a portion of the outer surface of the nanoparticles A complex (Directional LT-NPs) was formed.

(3) DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000의 혼합 비율을 달리하거나, DSPE-PEG-NHS2000 대신에 DSPE-PEG를 사용한 것을 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 4의 (2)와 동일하게 하여 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)를 형성하였다. DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000의 혼합 비율은 각각 9.75:0.25, 9.5:0.5, 9:1, 8:2, 7:3로 하였고, DSPE-PEG-NHS2000 대신에 DSPE-PEG를 사용하여 제조된 나노입자 복합체는 하기의 도면들에서 NHS X로 표기하였다.(3) The mixing ratio of DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 was changed, or the other conditions were the same as in Example 4 (2) of Example 1, except that DSPE-PEG was used instead of DSPE-PEG-NHS2000. A nanoparticle complex (Directional LT-NPs) in which a lipid structure is bound to a part of the outer surface of the nanoparticle was formed. The mixing ratios of DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 were 9.75:0.25, 9.5:0.5, 9:1, 8:2, and 7:3, respectively, and DSPE-PEG was used instead of DSPE-PEG-NHS2000. The particle composite is designated NHS X in the figures below.

<실시예 2> 바이러스 나노입자 복합체의 제조<Example 2> Preparation of virus nanoparticle complex

1. 바이러스 나노입자의 준비1. Preparation of viral nanoparticles

바이러스 나노입자로 AAV2-GFP(vector Biolabs, 1x1013GC/ml, 20ul) 입자(AAV)를 이용하였다.AAV2-GFP (vector Biolabs, 1x10 13 GC/ml, 20ul) particles (AAV) were used as virus nanoparticles.

2. 지질체(지질을 이용한 버블)의 준비2. Preparation of lipid bodies (lipid-based bubbles)

지질 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DSPE-PEG2k(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[succinyl(polyethylene glycol)-2000])를 9.5:0.5의 몰비로 혼합한 후, 1mg/vial이 되도록 Chloroform에 녹이고, 질소가스를 이용하여 chloroform을 증발시켰다. 이후, 건조된 phospholipid의 농도가 1mg/ml이 되게 PBS를 넣고, 55℃ 이상의 D.W에 5초간 담근 후, bath sonicator를 이용하여 30초 동안 건조된 phospholipid를 수용액 상으로 분산시켰다. 위 과정을 3회정도 반복하여 phospholipid를 수용액 상으로 완전히 분산시킨 후, C3F8 가스를 vial에 가득 채우고 vial mixer를 이용하여 45초간 흔들어 지질 기반의 마이크로 버블을 형성하였다. The lipids DSPC (1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) and DSPE-PEG2k (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[succinyl(polyethylene glycol)-2000]) were prepared at 9.5 : After mixing at a molar ratio of 0.5, it was dissolved in chloroform to 1 mg/vial, and chloroform was evaporated using nitrogen gas. Thereafter, PBS was added so that the concentration of the dried phospholipid was 1 mg/ml, immersed in DW at 55° C. or higher for 5 seconds, and then the dried phospholipid was dispersed into an aqueous solution using a bath sonicator for 30 seconds. After the above process was repeated three times to completely disperse the phospholipid in the aqueous phase, the vial was filled with C 3 F 8 gas and shaken for 45 seconds using a vial mixer to form lipid-based microbubbles.

3. 나노입자 복합체(Directional LT-AAV)의 형성3. Formation of nanoparticle composite (Directional LT-AAV)

실시예 2의 1에서 준비된 바이러스 나노입자와 실시예 2의 2에서 준비된 마이크로 버블을 혼합하고 3시간 이상 상온에서 반응시킨 후, 초음파(2.0W/cm2)를 이용하여 30초 동안 mechanical force를 가하였다. 이후, 파쇄된 마이크로 버블이 지질구조체를 충분히 형성될 수 있도록 1시간 이상 상온에서 반응시켜, 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Directional LT-AAV)를 형성하였다.After mixing the virus nanoparticles prepared in Example 2-1 and the microbubbles prepared in Example 2-2 and reacting at room temperature for more than 3 hours, mechanical force was applied for 30 seconds using ultrasonic waves (2.0W/cm 2 ) did Thereafter, the crushed microbubbles were reacted at room temperature for more than 1 hour to sufficiently form the lipid structure to form a nanoparticle complex (Directional LT-AAV) in which the lipid structure was bound to a portion of the outer surface of the nanoparticle.

<실시예 3> 알부민과 RNA로 이루어진 나노입자 복합체의 제조<Example 3> Preparation of nanoparticle complexes composed of albumin and RNA

1. 알부민과 RNA로 이루어진 나노입자(siRNA NPs)의 준비1. Preparation of nanoparticles (siRNA NPs) composed of albumin and RNA

알부민(Human serum albumin)을 0.1mM HEPES with 0.01mM EDTA에 40mg/mL의 농도로 녹여 준 후, thiol-modify VEGF siRNA duplex(5‘ modified)를 넣고, 알부민과 siRNA가 혼합된 용액이 탁해질 때까지 100% 에탄올을 1mL/min의 속도로 적정 후, 차광 하에 에탄올을 하룻밤 동안 날려주고, 13200rpm, 10min 조건으로 원심분리를 진행한 후 입자화되지 않은 물질을 피펫을 이용해 제거해주고 PBS로 재분산하여 3000rpm, 5min 조건으로 원심분리를 진행한 후 micropellet을 제외한 상층액(siRNA와 알부민으로 이루어진 나노입자(siRNA NPs))를 피펫으로 얻었다. 상기 thiol-modify VEGF siRNA duplex의 sense는 5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3'(서열번호:1)이고 antisense는 5'-thiol-UUCUUUGGUCUGCAUUCACAUTT-3'(서열번호:2)이다.After dissolving albumin (Human serum albumin) in 0.1mM HEPES with 0.01mM EDTA at a concentration of 40mg/mL, add thiol-modify VEGF siRNA duplex (5' modified), and when the solution of albumin and siRNA becomes cloudy After titrating with 100% ethanol at a rate of 1mL/min, blowing off the ethanol overnight under shade, centrifuging at 13200rpm for 10min, removing non-particulate matter with a pipette, redispersing with PBS, and centrifuging at 3000rpm. , After centrifugation was performed under the condition of 5 min, the supernatant (siRNA and albumin nanoparticles (siRNA NPs)) except for the micropellet was obtained with a pipette. The sense of the thiol-modifying VEGF siRNA duplex is 5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3' (SEQ ID NO: 1) and the antisense is 5'-thiol-UUCUUUGGUCUGCAUUCACAUTT-3' (SEQ ID NO: 2).

2. 나노입자 복합체(Directional siRNA LT-NPs)의 형성2. Formation of nanoparticle complexes (Directional siRNA LT-NPs)

실시예 3의 1에서 형성된 RNA와 알부민으로 이루어진 나노입자를 버블 용액(실시예 1의 3에서 형성된 버블이 PBS에 1mg/ml의 농도로 혼합되어 형성)에 넣어준 후, RT에서 2시간 이상 반응시킨 후, 초음파 기기를 이용하여 2W, 1MHZ, duty cycle 100% 조건으로 5분 이상 mechanical force를 가하였다. 이후, 파쇄된 버블이 지질구조체를 충분히 형성할 수 있도록, 1시간 이상 RT에서 incubation하여 siRNA와 알부민으로 이루어진 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Directional siRNA LT-NPs)를 형성하였다.After putting the nanoparticles composed of RNA and albumin formed in Example 3-1 into a bubble solution (formed by mixing the bubbles formed in Example 1-3 with PBS at a concentration of 1 mg/ml), reacted at RT for 2 hours or more After that, mechanical force was applied for more than 5 minutes under the conditions of 2W, 1MHZ, duty cycle 100% using an ultrasonic device. Then, incubation at RT for 1 hour or more so that the crushed bubbles can sufficiently form the lipid structure, and the nanoparticle complex (Directional siRNA LT-NPs) in which the lipid structure is bound to a part of the outer surface of the nanoparticles composed of siRNA and albumin Formation did

<실시예 4> 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자 복합체의 제조<Example 4> Preparation of RNA nanoparticle complex coated with cationic polymer and hyaluronic acid sequentially

1. 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자(siRNA NPs)의 준비1. Preparation of RNA nanoparticles (siRNA NPs) coated with cationic polymer and hyaluronic acid sequentially

쥐의 혈관내피 성장 인자(vascular endothelial growth factoer A (VEGF-A))의 센스는 5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3'(서열번호:1)이고, 안티센스는 5'-UUCUUUGGUCUGCAUUCA CAUTT-3'(서열번호:2)이다. 상기 센스 및 안티센스를 인코딩한 긴 선형 단일가닥 DNA를 제조하였다. Ligase된 원형 DNA 템플릿을 T7 RNA 폴리머레이즈와 같이 37℃에서 20 시간 동안 반응버퍼(8mM Tris-HCl, 0.4mM spermidine, 1.2mM MgCl2, and 2mM dithiothreitol)에서 배양하였다. 생성된 용액을 여러 번 피펫하고 5분 동안 초음파처리해서 입자를 분해하였다. 용액을 4℃ 조건하 13,200rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 후 RNase-free water를 첨가해 입자를 세척하였다. 용액을 1분 동안 다시 초음파처리하고 원심 분리하였다. 세척단계를 세 번 더 반복해서 RCT 시약을 제거하여 RNA-microsponge(anti-VEGF siRNA hydrogel)를 수득하였다. 상기 siRNA hydrogel을 bath sonicator에 1분 이상 넣고 뭉친 것이 없게 잘 풀어준 후 mini centrifuge로 벽면에 튄 것이 down될 정도로 몇 초만 돌려준 후, siRNA hydrogel 3μl와 nuclease free water 12μl을 혼합하여 제1용액을 형성하고, 1mg/ml bPEI 1μl과 nuclease free water 9μl를 혼합하여 제2용액을 형성한 후, 제1용액과 제2용액을 10분간 상온에서 반응시키고, 1mg/ml hyaluronic acid-amine을 5μl를 천천히 넣은 후, 10분 동안 상온에서 반응시킨 후, sonication으로 뭉친 입자를 풀어주어 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자(siRNA NPs)를 얻었다. 상기 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자의 제조는 본 발명자의 선행 특허(KR10-1880790)를 참조하였다.The sense of mouse vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) is 5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3' (SEQ ID NO: 1), and the antisense is 5'-UUCUUUGGUCUGCAUUCA CAUTT-3' (SEQ ID NO: 2) is. Long linear single-stranded DNAs encoding the sense and antisense were prepared. The ligated circular DNA template was incubated in reaction buffer (8mM Tris-HCl, 0.4mM spermidine, 1.2mM MgCl 2 , and 2mM dithiothreitol) at 37°C for 20 hours as with T7 RNA polymerase. The resulting solution was pipetted several times and sonicated for 5 minutes to break up the particles. The solution was centrifuged at 13,200 rpm for 20 minutes at 4°C and the supernatant was removed. Then, RNase-free water was added to wash the particles. The solution was sonicated again for 1 minute and centrifuged. The washing step was repeated three more times to remove the RCT reagent to obtain an RNA-microsponge (anti-VEGF siRNA hydrogel). After putting the siRNA hydrogel in a bath sonicator for more than 1 minute and loosening it well so that there are no clumps, return it for a few seconds so that the splashes on the wall are down with a mini centrifuge, and then mix 3μl of siRNA hydrogel and 12μl of nuclease free water to form the first solution 1μl of 1mg/ml bPEI and 9μl of nuclease free water were mixed to form a second solution, the first solution and the second solution were reacted at room temperature for 10 minutes, and 5μl of 1mg/ml hyaluronic acid-amine was slowly added. Then, after reacting at room temperature for 10 minutes, the agglomerated particles were released by sonication to obtain RNA nanoparticles (siRNA NPs) coated with cationic polymer and hyaluronic acid in sequence. Preparation of RNA nanoparticles coated with the cationic polymer and hyaluronic acid in turn was referred to the prior patent (KR10-1880790) of the present inventors.

2. 나노입자 복합체(Lipid-siRNA NPs(siRNA LT-NPs))의 형성2. Formation of nanoparticle complexes (Lipid-siRNA NPs (siRNA LT-NPs))

실시예 4의 1에서 형성된 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자를 버블 용액(실시예 1의 3에서 형성된 버블이 PBS에 1mg/ml의 농도로 혼합되어 형성)에 넣어준 후, RT에서 2시간 이상 반응시킨 후, 초음파 기기를 이용하여 2W, 1MHZ, duty cycle 100% 조건으로 5분 이상 mechanical force를 가하였다. 이후, 파쇄된 버블이 지질구조체를 충분히 형성할 수 있도록, 1시간 이상 RT에서 incubation하여 양이온성 고분자와 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체(Lipid-siRNA NPs(siRNA LT-NPs))를 형성하였다.RNA nanoparticles coated with the cationic polymer formed in 1 of Example 4 and hyaluronic acid in turn were put into a bubble solution (formed by mixing the bubbles formed in 3 of Example 1 with PBS at a concentration of 1 mg / ml), After reacting at RT for more than 2 hours, mechanical force was applied for more than 5 minutes under the condition of 2W, 1MHZ, duty cycle 100% using an ultrasonic device. Then, the nanoparticle complex (Lipid- siRNA NPs (siRNA LT-NPs)) were formed.

<실시예 5> 여러 종류의 지질과 작용기를 이용하여 나노입자 복합체의 제조<Example 5> Preparation of nanoparticle composites using various types of lipids and functional groups

1. DSPC 대신에 DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), cis-PC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 사용하고, 제2반응기가 결합되지 않은 지질(DSPC, DPPC, DOPE, cis-PC)와 제2반응기가 결합된 지질(DSPE-PEG-NHS2000)의 혼합 비율을 9.5:0.5의 몰비로 한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 4의 (2)와 동일하게 하여 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체를 형성하였다.1. Instead of DSPC, DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), cis-PC (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-phosphocholine) was used, and the mixing ratio of lipids (DSPC, DPPC, DOPE, cis-PC) to which the second reactive group was not bound and lipids (DSPE-PEG-NHS2000) to which the second reactive group was bound was 9.5 : Except for the molar ratio of 0.5, the other conditions were the same as in Example 4 (2) of Example 1 to form a nanoparticle complex in which the lipid structure was bound to a portion of the outer surface of the nanoparticle.

2. DSPE-PEG-NHS2000 대신에 DSPE-PEG2000-SH, DSPE-PEG2000-Amine을 사용하고, 제2반응기가 결합되지 않은 지질(DSPC)와 제2반응기가 결합된 지질(DSPE-PEG-NHS2000, DSPE-PEG2000-SH, DSPE-PEG2000-Amine)의 혼합 비율을 9.5:0.5의 몰비로 한 것을 제외하고는, 다른 조건을 실시예 1의 4의 (2)와 동일하게 하여 나노입자의 외표면 일부분에 지질구조체가 결합한 나노입자 복합체를 형성하였다.2. Instead of DSPE-PEG-NHS2000, DSPE-PEG2000-SH and DSPE-PEG2000-Amine were used, and lipids without a second reactive group (DSPC) and lipids with a second reactive group (DSPE-PEG-NHS2000, DSPE-PEG2000-SH, DSPE-PEG2000-Amine), except that the mixing ratio was 9.5: 0.5, and the other conditions were the same as in Example 1, 4 (2), and a part of the outer surface of the nanoparticles A nanoparticle complex to which the lipid structure is bound was formed.

<실시예 6> 나노입자 복합체의 특성 확인<Example 6> Confirmation of characteristics of nanoparticle composites

1. 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (2)에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)를 TEM으로 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었고, 실시예 1의 4의 (2)에서 형성한 나노입자 복합체 및 지질구조체를 Cryo-TEM으로 측정하여 그 결과를 각각 도 3 및 4에 나타내었으며, 실시예 1의 4의 (3)에서 형성한 나노입자 복합체를 Cryo-TEM으로 측정하여 그 결과를 각각 도 5에 나타내었고(단, DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000의 혼합 비율은 각각 9.75:0.25, 9.5:0.5, 9:1, 8:2인 나노입자 복합체에 대해서만 측정함), 실시예 2의 1에서 준비한 바이러스 나노입자를 TEM으로 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었으며, 실시예 2의 3에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-AAV)를 Cryo-TEM으로 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.1. The nanoparticles (NPs) formed in Example 1-1 and the nanoparticle complex (Directional LT-NPs) formed in Example 1-4 (2) were measured by TEM, and the results are shown in FIG. , The nanoparticle complex and lipid structure formed in 4 (2) of Example 1 were measured by Cryo-TEM, and the results are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. The nanoparticle composite was measured by Cryo-TEM, and the results are shown in Figure 5, respectively (however, the mixing ratio of DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 was 9.75: 0.25, 9.5: 0.5, 9: 1, 8: 2, respectively). Measured only for the nanoparticle complex), the virus nanoparticles prepared in Example 2-1 were measured by TEM, and the results are shown in FIG. 6, and the nanoparticle complex formed in Example 2-3 (Directional LT-AAV) was measured by Cryo-TEM and the results are shown in FIG. 7 .

2. 도 2를 보면, 알부민 나노입자의 경우 표면이 매끈한 것을 확인할 수 있는데 반해, 알부민 나노입자 복합체는 지질구조체가 나노입자의 표면에 붙어 있어 표면이 매끈하지 않은 것을 알 수 있다. 또한, 도 3을 보면 나노입자의 표면에 튜브 형태의 지질구조체가 붙어 있음을 알 수 있고, 도 4를 보면 상기 지질구조체는 튜브 형태를 가짐을 더욱 명확히 할 수 있다. 또한, 도 3 및 4를 보면, 상기 지질구조체는 50 내지 300nm의 길이를 가지고 3 내지 20nm의 폭을 가짐을 알 수 있고, 상기 지질구조체는 상기 나노입자의 외표면에 하나 이상이 결합될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 도 3 및 5를 보면, DSPC와 DSPE-PEG-NHS의 비율에 따라 지질구조체 형성 양상이 달라지는 것을 확인한 수 있고, DSPE-PEG-NHS의 비율이 증가할수록 지질구조체의 길이가 짧아지고 나노입자에도 지질구조체가 덜 형성되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 6을 보면 바이러스 나노입자의 경우 표면이 매끈한 것을 확인할 수 있는데 반해, 도 7을 보면 바이러스 나노입자의 표면에 튜브 형태의 지질구조체가 붙어 있음을 알 수 있다.2. Referring to FIG. 2, it can be seen that the albumin nanoparticles have a smooth surface, whereas the albumin nanoparticle complex has a lipid structure attached to the surface of the nanoparticles, so that the surface is not smooth. In addition, it can be seen from Figure 3 that a tube-shaped lipid structure is attached to the surface of the nanoparticle, and from Figure 4, it can be further clarified that the lipid structure has a tube shape. In addition, looking at Figures 3 and 4, it can be seen that the lipid structure has a length of 50 to 300 nm and a width of 3 to 20 nm, and the lipid structure can be bonded to one or more on the outer surface of the nanoparticle can know In addition, looking at Figures 3 and 5, it can be confirmed that the lipid structure formation pattern varies depending on the ratio of DSPC and DSPE-PEG-NHS, and as the ratio of DSPE-PEG-NHS increases, the length of the lipid structure becomes shorter and the nanoparticles It can be confirmed that less geological structures are formed even in In addition, in the case of FIG. 6, it can be confirmed that the surface of the virus nanoparticles is smooth, whereas in FIG. 7, it can be seen that a tube-shaped lipid structure is attached to the surface of the virus nanoparticles.

<실시예 7> 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율 평가<Example 7> Evaluation of cell uptake efficiency of nanoparticle complexes

1. 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (2) 및 (3)에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)에 대한 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 유세포 측정기(Flow cytometry)를 이용한 분석 결과를 도 8에 나타내었고 이를 정량화한 결과를 표 1에 나타내었으며, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 유세포 측정기를 이용한 분석은 A549 세포(1×104)에 Alexa 488 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였고, 공초점 현미경을 이용한 분석은 DAPI를 이용하여 핵이 염색되고 Phalloidin을 이용하여 세포 골격(cytoskeleton)이 염색된 A549 세포(1×105)에 Cy5.5 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였다.1. To evaluate the cell uptake efficiency of nanoparticles (NPs) formed in Example 1-1 and nanoparticle composites (Directional LT-NPs) formed in Example 1-4 (2) and (3) , The analysis results using flow cytometry are shown in FIG. 8, the quantification results are shown in Table 1, and the results of imaging using a confocal microscope are shown in FIG. 9. Analysis using a flow cytometer was performed by treating A549 cells (1×10 4 ) with Alexa 488 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes, and analysis using a confocal microscope was performed by staining nuclei using DAPI and Phalloidin It was performed by treating A549 cells (1×10 5 ) whose cytoskeleton was stained using Cy5.5 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes.

CTRLCTRL NPsNPs 9.75:0.259.75:0.25 9.5:0.59.5:0.5 9.25:0.759.25:0.75 9:19:1 8:28:2 7:37:3 NHS XNHS X Alexa 488+Alexa 488+ 0.430.43 18.3018.30 95.9195.91 92.5192.51 77.2377.23 78.1778.17 20.9020.90 10.9710.97 22.2722.27 STDSTD 0.190.19 0.240.24 0.240.24 0.110.11 0.260.26 0.370.37 0.360.36 0.050.05 0.170.17

2. 또한, 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (1)에서 형성한 리포좀-나노입자 복합체(Liposome-NPs), 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)에 대한 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 공초점 현미경을 이용한 분석은 DAPI를 이용하여 핵이 염색된 A549 세포(1×105)에 Alexa 555 형광 dye가 표지된 나노입자, 리포좀-나노입자 복합체 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였다.2. In addition, the nanoparticles (NPs) formed in Example 1-1 and the liposome-nanoparticle complexes (Liposome-NPs) and nanoparticle complexes (Directional LT-NPs) formed in Example 1-4 (1) In order to evaluate the cell uptake efficiency for , imaged using a confocal microscope and the results are shown in FIG. 10 . Analysis using a confocal microscope was performed by treating A549 cells (1×10 5 ) whose nuclei were stained with DAPI with Alexa 555 fluorescent dye-labeled nanoparticles, liposome-nanoparticle complexes, and nanoparticle complexes.

3. 또한, 실시예 2의 1에서 준비한 나노입자(AAV)와 실시예 2의 3에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-AAV)에 대한 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 공초점 현미경을 이용한 분석은 DAPI를 이용하여 핵이 염색된 ARPE19 세포(1×105)에 바이러스 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였다.3. In addition, in order to evaluate the cell uptake efficiency of the nanoparticles (AAV) prepared in Example 2-1 and the nanoparticle complex (Directional LT-AAV) formed in Example 2-3, using a confocal microscope It was imaged and the results are shown in FIG. 11 . Analysis using a confocal microscope was performed by treating ARPE19 cells (1×10 5 ) whose nuclei were stained with DAPI with viral nanoparticles and nanoparticle complexes.

4. 또한, 실시예 4의 1에서 준비한 나노입자(siRNA NPs)와 실시예 4의 2에서 형성한 나노입자 복합체(siRNA LT-NPs)에 대한 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 공초점 현미경을 이용한 분석은 DAPI를 이용하여 핵이 염색되고 FITC를 이용하여 세포골격이 염색된 MCF-7 세포(1×105)에 Cy3 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였다.4. In addition, to evaluate the cell uptake efficiency of the nanoparticles (siRNA NPs) prepared in Example 4-1 and the nanoparticle complex (siRNA LT-NPs) formed in Example 4-2, confocal microscopy was used. and imaged, and the results are shown in FIG. 12. Analysis using a confocal microscope was performed by treating Cy3 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes to MCF-7 cells (1×10 5 ) whose nuclei were stained using DAPI and whose cytoskeleton was stained using FITC. performed.

5. 또한, A549 세포(1×105)에 Alexa 647 형광 dye가 표지된 실시예 5의 1 및 2에서 형성한 나노입자 복합체를 도입한 후, 형광 세기를 측정하여 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다. 도 13에서 DSPC로 표기된 것은 DSPC가 사용되어 제조된 나노입자 복합체의 결과를 의미하며, 도 14에서 Thiol로 표기된 것은 DSPE-PEG2000-SH가 사용되어 제조된 나노입자 복합체의 결과를 의미한다.5. In addition, after introducing the nanoparticle complexes formed in 1 and 2 of Example 5 labeled with Alexa 647 fluorescent dye into A549 cells (1×10 5 ), the fluorescence intensity was measured and the results are shown in FIGS. 13 and 14 shown in In FIG. 13, indicated as DSPC means the result of the nanoparticle composite prepared using DSPC, and in FIG. 14, indicated as Thiol means the result of the nanoparticle composite prepared using DSPE-PEG2000-SH.

6. 도 8 및 표 1을 보면, 나노입자 복합체가 나노입자에 비해서 세포 섭취 효능이 월등히 뛰어남을 알 수 있고, DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000의 비율이 9:1 이상일 때, Alexa 488 positive 세포(염색된 나노입자를 uptake한 세포)의 비율이 control 대비 78% 이상임을 확인할 수 있고, DSPE-PEG-NHS2000의 비율이 이보다 많아지는 경우 세포 내 uptake 효율이 현저하게 떨어짐을 확인할 수 있어, 지질구조체가 나노입자 표면에 충분한 길이 및 모양으로 형성되는 않는 경우 나노입자의 세포 섭취 효율이 떨어지는 것을 알 수 있다. 또한, 도 9를 보면 형광 이미지를 이용한 실험에서도 도 8 및 표 1와 같은 결과를 확인할 수 있다. 또한, 도 10을 보면, 나노입자 복합체가 나노입자나 리포좀-나노입자 복합체에 비해서 세포 섭취 효능이 월등히 뛰어남을 확인할 수 있어, 나노입자에 지질구조체가 형성된 경우 나노입자에 리포좀이 단순히 결합한 것에 비해 섭취 효율이 뛰어남을 알 수 있고, 지질로 이루어진 버블 뿐만 아니라 리포좀 혹은 다른 지질 구형체로도 나노입자 복합체가 형성될 수 있음을 알 수 있다.6. Referring to Figure 8 and Table 1, it can be seen that the nanoparticle complex has a much higher cell uptake efficacy than the nanoparticles, and when the ratio of DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 is 9: 1 or more, Alexa 488 positive cells ( It can be confirmed that the ratio of cells uptaking the dyed nanoparticles) is 78% or more compared to the control, and when the ratio of DSPE-PEG-NHS2000 is higher than this, it can be confirmed that the uptake efficiency in the cells is significantly reduced. It can be seen that when the nanoparticles are not formed in a sufficient length and shape on the surface of the nanoparticles, the cell uptake efficiency of the nanoparticles is reduced. In addition, referring to FIG. 9 , the results shown in FIG. 8 and Table 1 can be confirmed even in experiments using fluorescence images. In addition, looking at Figure 10, it can be seen that the nanoparticle complex is significantly superior in cell uptake efficacy compared to nanoparticles or liposome-nanoparticle complexes. It can be seen that the efficiency is excellent, and it can be seen that the nanoparticle complex can be formed not only with lipid bubbles but also with liposomes or other lipid spheres.

7. 또한, AAV(Adeno associate Virus)는 망막조직 내로 치료용 유전자 또는 약물을 전달하는 벡터로 이용되며 다른 벡터에 비해 좋은 효율을 보이나, RPE(retinal pigment epithelium)까지는 전달되지 않는데, 도 11을 보면 나노입자 복합체가 나노입자에 비해 섭취 효율이 현저하게 뛰어난 것을 알 수 있어, 지질구조체가 바이러스와 세포수용체 간의 특이적 반응을 감소시켜 바이러스 transfection률이 증가되고 RPE층으로의 전달율이 증가될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 도 12를 보면 고분자와 히알루론산이 코팅된 RNA 나노입자에서도 나노입자 복합체가 나노입자에 비해서 세포 섭취 효능이 월등히 뛰어남을 알 수 있고, 도 13 및 도 14를 보면 다양한 종류의 지질과 다양한 작용기를 이용하여 나노입자 복합체를 제조하여도 나노입자 복합체가 나노입자에 비해서 세포 섭취 효능이 월등히 뛰어남을 알 수 있다.7. In addition, AAV (Adeno associate Virus) is used as a vector for delivering therapeutic genes or drugs into retinal tissue, and shows good efficiency compared to other vectors, but does not reach retinal pigment epithelium (RPE). Referring to FIG. 11 It can be seen that the nanoparticle complex has significantly better uptake efficiency than the nanoparticle, and the lipid structure can reduce the specific reaction between the virus and the cell receptor, thereby increasing the virus transfection rate and increasing the delivery rate to the RPE layer. Able to know. In addition, looking at FIG. 12, it can be seen that even in RNA nanoparticles coated with polymers and hyaluronic acid, the nanoparticle complex has a much better cell uptake efficacy than the nanoparticles. Referring to FIGS. 13 and 14, various types of lipids and various functional groups Even when a nanoparticle complex is prepared using the nanoparticle complex, it can be seen that the cell uptake efficiency of the nanoparticle complex is far superior to that of the nanoparticle.

<실시예 8> 나노입자 복합체가 direct penetration으로 세포 내에 uptake 되는 것의 확인<Example 8> Confirmation that nanoparticle complexes are uptaken in cells by direct penetration

1. Endocytosis Inhibitor를 처리한 후의 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율 평가1. Evaluation of cell uptake efficiency of nanoparticle complexes after treatment with Endocytosis Inhibitor

(1) Endocytosis Inhibitor를 처리한 세포에 대하여, 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (2)에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)의 세포 섭취 효율을 평가하였다. 200nm 사이즈의 나노입자는 크게 macropinocytosis, clarthrin-independent endocytosis, clarthrin-dependent endocytosis의 총 세 가지 기작에 세포 내 섭취가 이루어진다고 알려져 있으므로, 이를 inhibition하는 inhibitor를 선정하여 먼저 A549 세포(1×104)를 각각 또는 동시에 1시간 처리한 후, Alexa 488 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 3시간 처리하고 유세포 측정기를 이용하여 측정하였다. 측정 결과에 대해 나노입자를 기준으로 normalize하여 도 15에 나타내었다. Macropinocytosis inhibitor로는 EIPA(5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride)를 선정(25ug/ml의 농도)하여 Na+/H+ exchange 기작을 방해하고, Clathrin-dependent endocytosis inhibitor로는 CPZ(chlorpromazine) 선정(20ug/ml의 농도)하여 inhibits clathrin-coated pit formation을 방해하고, Clathrin-independent endocytosis inhibitor로는 MβCD(methyl-β-cyclodextrin)을 선정(3mg/ml의 농도)하여 cholesterol-dependent endocytic process를 방해하였다. 또한, 위와 같이, Macropinocytosis inhibitor, Clathrin-dependent endocytosis inhibitor, Clathrin-independent endocytosis inhibitor를 모두 처리한 A549 세포(1×104)에 Alexa 488 형광 dye가 표지된 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (2) 및 (3)에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)를 도입한 후, 형광 세기를 측정하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.(1) For cells treated with Endocytosis Inhibitor, cell uptake of nanoparticles (NPs) formed in Example 1-1 and nanoparticle complexes (Directional LT-NPs) formed in Example 1-4 (2) Efficiency was evaluated. Since nanoparticles of 200 nm size are known to be ingested into cells by three mechanisms: macropinocytosis, clarthrin-independent endocytosis, and clarthrin-dependent endocytosis, inhibitors that inhibit this are selected and first A549 cells (1×10 4 ) are selected. After each or simultaneous treatment for 1 hour, Alexa 488 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes were treated for 3 hours and measured using a flow cytometer. The measurement results were normalized based on nanoparticles and shown in FIG. 15 . EIPA (5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride) was selected as a macropinocytosis inhibitor (concentration of 25ug/ml) to interfere with the Na+/H+ exchange mechanism, and CPZ (chlorpromazine) was selected as a clathrin-dependent endocytosis inhibitor (20ug /ml concentration) inhibits clathrin-coated pit formation, and as a clathrin-independent endocytosis inhibitor, MβCD (methyl-β-cyclodextrin) was selected (3 mg/ml concentration) to interfere with the cholesterol-dependent endocytic process. In addition, as above, nanoparticles formed in Example 1-1 labeled with Alexa 488 fluorescent dye in A549 cells (1×10 4 ) treated with Macropinocytosis inhibitor, Clathrin-dependent endocytosis inhibitor, and Clathrin-independent endocytosis inhibitor ( NPs) and nanoparticle complexes (Directional LT-NPs) formed in 4 (2) and (3) of Example 1 were introduced, and then fluorescence intensity was measured and the results are shown in FIG. 16 .

(2) 도 15를 보면, 나노입자의 경우(NPs), CPZ, EIPA inhibitor로 인해 세포 섭취 효능이 크게 감소함을 확인할 수 있고, 세 가지 종류의 inhibitor를 모두 처리하여 endocytosis 기작을 모두 방해하였을 때 나노입자의 세포 섭취가 거의 이루어지지 않음을 알 수 있으며, 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)의 경우 세포 섭취 효능이 나노입자와 비교했을 때 350% 정도 더 뛰어난 것을 확인할 수 있고, 세 가지 종류의 inhibitor로 endocytosis 기작을 모두 방해하였을 때도 나노입자보다 세포 섭취 효능이 뛰어난 것을 관찰할 수 있다. 이를 통해, 나노입자 복합체는 endocytosis뿐만 아니라, 세포막을 direct penetration을 통해 직접적으로 통과한다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 16을 보면, DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000을 8:2, 7:3의 비율로 혼합하여 제조된 나노입자 복합체의 경우 세 가지의 inhibitor들을 모두 처리하게 되면 세포 uptake 효능이 현저하게 떨어짐을 알 수 있는데 반해, DSPC와 DSPE-PEG-NHS2000을 9:1 이상의 비율로 혼합하여 제조된 나노입자 복합체의 경우 세 개의 inhibitor들을 모두 처리하여 endocytosis 기작을 모두 방해하였음에도 세포 uptake 효능이 뛰어남을 확인할 수 있어, 지질구조체가 나노입자에 충분한 길이와 개수로 형성된 경우 나노입자가 endocytosis 기작이 아닌 translocation 등의 direct penetration으로 세포 내에 uptake 되는 것을 알 수 있다.(2) Referring to FIG. 15, in the case of nanoparticles (NPs), CPZ, and EIPA inhibitors, it can be seen that the cell uptake efficacy is greatly reduced, and all three types of inhibitors are treated to interfere with all endocytosis mechanisms. It can be seen that the cellular uptake of the nanoparticles is almost not achieved, and in the case of the nanoparticle composite (Directional LT-NPs), the cell uptake efficiency is about 350% higher than that of the nanoparticles. Even when all endocytosis mechanisms are disrupted with inhibitors, it can be observed that the cell uptake efficacy is superior to that of nanoparticles. Through this, it can be confirmed that the nanoparticle complex directly passes through the cell membrane through direct penetration as well as through endocytosis. In addition, as shown in FIG. 16, in the case of the nanoparticle complex prepared by mixing DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 at a ratio of 8:2 and 7:3, the cell uptake efficacy significantly decreased when all three inhibitors were treated. On the other hand, in the case of the nanoparticle complex prepared by mixing DSPC and DSPE-PEG-NHS2000 at a ratio of 9:1 or higher, all three inhibitors were treated and the cell uptake efficacy was excellent even though all three inhibitors interfered with the endocytosis mechanism. Therefore, it can be seen that when the lipid structure is formed with a sufficient length and number of nanoparticles, the nanoparticles are uptaken into cells by direct penetration such as translocation rather than by endocytosis.

2. HA blocking 후의 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율 평가2. Evaluation of cell uptake efficiency of nanoparticle complexes after HA blocking

(1) 실시예 4의 1에서 형성된 나노입자(siRNA NPs)는 최 외각이 HA로 코팅되어 있어 CD44 receptor를 이용하여 세포 내에 들어가므로, 미리 MCF-7 세포에 HA를 과량으로 처리하여 CD44 receptor를 모두 block 한 뒤, 실시예 4의 1에서 형성한 나노입자(siRNA NPs)와 실시예 4의 2에서 형성한 나노입자 복합체(siRNA LT-NPs)를처리한 후, 공초점 현미경을 이용하여 분석하여 그 결과를 17에 나타내었다. 공초점 현미경을 이용한 분석은 DAPI를 이용하여 핵이 염색되고 FITC를 이용하여 세포골격이 염색된 MCF-7 세포(1×105)에 대하여 HA를 과량 처리한 후, Cy3 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하여 수행하였다.(1) The nanoparticles (siRNA NPs) formed in Example 4-1 are coated with HA on the outermost layer and enter cells using the CD44 receptor. After blocking all of them, the nanoparticles (siRNA NPs) formed in Example 4-1 and the nanoparticle complex (siRNA LT-NPs) formed in Example 4-2 were treated, and then analyzed using a confocal microscope The results are shown in 17. Analysis using a confocal microscope was performed with an excess of HA for MCF-7 cells (1×10 5 ) whose nuclei were stained using DAPI and whose cytoskeleton was stained using FITC, and then nanoparticles labeled with Cy3 fluorescent dye. This was done by treating the particle and nanoparticle composites.

(2) 도 17을 보면, 세포를 HA로 block을 하였기에, 나노입자의 경우 낮은 효율로 섭취되었으나, 나노입자 복합체의 경우 CD44 receptor가 block 되었음에도 세포 내의 섭취 효율이 뛰어난 것을 알 수 있어, 나노입자 복합체가 endocytosis나 receptor binding 외에도 direct penetration을 통해 세포 내로 섭취되는 것을 알 수 있다.(2) Referring to FIG. 17, since the cells were blocked with HA, the nanoparticles were ingested at low efficiency, but in the case of the nanoparticle complex, even though the CD44 receptor was blocked, it was found that the uptake efficiency in the cells was excellent, and the nanoparticle complex In addition to endocytosis and receptor binding, it can be seen that is taken into cells through direct penetration.

<실시예 9> 나노입자 복합체의 약물 전달체로의 효능 평가<Example 9> Efficacy evaluation of nanoparticle complex as a drug delivery system

1. 알부민 용액에 독소루비신(doxorubicin)이 혼합된 용액을 첨가하여 반응시킨 후 혼합 용액이 탁해질 때까지 에탄올 적정을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1의 1 및 실시예 1의 4의 (2)와 동일하게 하여, 독소루비신 함유 나노입자, 독소루비신 함유 나노입자 복합체를 형성하고, 항암 저항성을 가진 유방암 세포주인 MCF-7/ADR을 well plates에 시드하고, 각각 독소루비신(100mM, DOX), 독소루비신 함유 나노입자(100mM의 독소루비신 포함)와 독소루비신 함유 나노입자 복합체(100mM의 독소루비신 포함)을 포함하는 배지를 가지고 37℃에서 6시간 배양한 후, 상기 세포주를 노멀 배지(normal media)를 가지고 48시간 동안 배양하여 Cell vialbilty를 수행하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. Cell viability는 MTT assay와 trypan blue dye exclusion method를 이용하는데, Cell viability는 0.4% trypan blue dye를 가진 세포를 배양하고 Neubauer hemocytometer로 카운팅하는 것에 의해 결정된다. MTT assay에서 96-well plates와 1.5mg/ml MTT reagent(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 사용되며, 15ul의 MTT reagent를 가지고 2시간 배양한 후 200μl의 DMSO가 각 well에 추가되고, Resulting culture plates는 plate reader(Bio Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA)로 570nm에서 측정하였다1. Example 1-1 and Example 1-4 (2), except that a mixed solution of doxorubicin was added to the albumin solution, reacted, and then titrated with ethanol until the mixed solution became turbid. In the same way, doxorubicin-containing nanoparticles and doxorubicin-containing nanoparticle complexes were formed, and MCF-7/ADR, a breast cancer cell line with anticancer resistance, was seeded on well plates, respectively, doxorubicin (100 mM, DOX), doxorubicin-containing nanoparticles (including 100mM doxorubicin) and doxorubicin-containing nanoparticle complex (including 100mM doxorubicin) in a medium at 37°C for 6 hours, and then culturing the cell line in normal media for 48 hours. Vialbilty was performed and the results are shown in FIG. 18 . Cell viability is determined by incubating cells with 0.4% trypan blue dye and counting with a Neubauer hemocytometer. In the MTT assay, 96-well plates and 1.5mg/ml MTT reagent (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) are used. After culturing for 2 hours with 15ul of MTT reagent, 200μl of DMSO was added to each well, and the resulting culture plates were measured at 570 nm with a plate reader (Bio Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA).

2. 도 18을 보면, 같은 농도의 독소루비신을 유방암 세포에 처리하였을 때, 나노입자 복합체를 이용할 경우 일반 암세포뿐만 아리라, 항암제 대한 항암저항성을 가진 세포에서도 항암제에 의한 세포 사멸 효과를 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.2. Referring to FIG. 18, when breast cancer cells are treated with the same concentration of doxorubicin, the use of nanoparticle complexes can increase the apoptosis effect of anticancer agents even in cells with anticancer resistance to anticancer agents, as well as in normal cancer cells. Able to know.

<실시예 10> 나노입자 복합체의 유전체 약물 전달체로의 평가<Example 10> Evaluation of nanoparticle composites as dielectric drug delivery systems

1. 실시예 3의 1 및 2에서 형성된 나노입자(siRNA NPs) 및 나노입자 복합체(Directional siRNA LT-NPs)에 대한 Gene silencing을 확인하여 도 19 및 20에 나타내었다. 또한, 실시예 4의 1 및 2에서 형성된 나노입자(siRNA NPs) 및 나노입자 복합체(siRNA LT-NPs)에 대한 Gene silencing을 확인하여 도 21 및 22에 나타내었다. Gene silencring의 확인은 MCF-7 세포(1×105)에 나노입자, 나노입자 복합체를 각각 3시간 동안 처리한 후, 24시간 배양한 후에 mRNA를 추출하였으며, 같은 방법으로 세포에 대한 PCR을 수행하였다. PCR gel retardation assay에서 유전자 밴드(gene bands)는 GelRed Nucleic Acid stain으로 염색되고, Gel Doc imaging device에 의해 시각화된다. 도 20 및 22의 경우, gene band의 intensity를 ImagePro를 이용하여 상대적으로 정량화한 값을 나타내었다.1. Gene silencing of the nanoparticles (siRNA NPs) and nanoparticle complexes (Directional siRNA LT-NPs) formed in Examples 1 and 2 of Example 3 was confirmed and shown in FIGS. 19 and 20 . In addition, gene silencing of the nanoparticles (siRNA NPs) and nanoparticle complexes (siRNA LT-NPs) formed in Examples 1 and 2 of Example 4 was confirmed and shown in FIGS. 21 and 22 . To confirm gene silencoding, MCF-7 cells (1×10 5 ) were treated with nanoparticles and nanoparticle complexes for 3 hours, respectively, and mRNA was extracted after culturing for 24 hours, and PCR was performed on the cells in the same way. did In PCR gel retardation assay, gene bands are stained with GelRed Nucleic Acid stain and visualized by Gel Doc imaging device. In the case of FIGS. 20 and 22, the relative quantification of the intensity of the gene band using ImagePro is shown.

2. 도 19 및 20을 보면, 알부민과 RNA로 이루어진 나노입자 보다 나노입자 복합체를 사용하였을 때 gene silencing 효율이 훨씬 우수한 것을 확인할 수 있어, 나노입자 복합체가 유전체 약물 전달체로 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 도 21 및 22를 보면, 고분자 및 히알루론산이 차례로 코팅된 RNA 나노입자에 있어도 위와 같은 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.2. Referring to FIGS. 19 and 20, it can be seen that the gene silencing efficiency is much better when the nanoparticle complex is used than the nanoparticle composed of albumin and RNA. Therefore, it can be seen that the nanoparticle complex can be effectively used as a dielectric drug delivery system there is. 21 and 22, it can be seen that the above results can be obtained even in RNA nanoparticles coated with a polymer and hyaluronic acid sequentially.

<실시예 11> Tumor cell spheroid에서의 효능 평가<Example 11> Evaluation of efficacy in tumor cell spheroid

1. Tumor cell spheroid는 일반적인 adherent 암세포와 달리 3D culture를 이용하여 증식하며, 이러한 spheroid는 암세포가 배지상에서 floating되서 자라기 때문에 암 세포들이 뭉쳐서 자라게 된다. 뭉쳐서 자라는 형태가 암 조직의 Extracellular matrix(ECM)을 mimic한다는 연구 결과가 있기 때문에 지질 표면 개질에 따른 tissue penetration 여부를 in vitro에서 확인하기 위해 이 모델에서 실험을 진행하였다.1. Unlike general adherent cancer cells, tumor cell spheroid proliferates using 3D culture, and these spheroids grow by floating cancer cells on the medium, so cancer cells grow together. Since there is a research result that the form that grows together mimics the extracellular matrix (ECM) of cancer tissue, an experiment was conducted in this model to confirm tissue penetration in vitro due to lipid surface modification.

2. Spheroid 세포 형성2. Spheroid cell formation

Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) 10g을 100% pure ethanol 1L에 첨가하여 60℃에서 녹인 후, 녹인 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)를 100phi 기준 3.3ml을 plate 전체에 골고루 분산시켜서 24시간 동안 건조시켜서 coating을 수행하고, 위에서 준비된 plate에 MCF7 세포를 시드하고 5일 동안 유지하여 spheroid를 형성한 세포를 얻었다.After adding 10g of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) to 1L of 100% pure ethanol and melting it at 60℃, 3.3ml of the melted Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) based on 100phi was evenly distributed over the entire plate and dried for 24 hours to coat the coating. After that, MCF7 cells were seeded on the plate prepared above and maintained for 5 days to obtain cells forming spheroids.

3. Spheroid 세포에 나노입자 복합체의 처리3. Treatment of nanoparticle complexes on spheroid cells

(1) 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(NPs)와 실시예 1의 4의 (2)에서 형성한 나노입자 복합체(Directional LT-NPs)에 대한 Spheroid 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 23에 나타내었다. DAPI를 이용하여 핵이 염색된 실시예 11의 2에서 형성된 Spheroid 형태 MCF-7 세포(1×105)에 Alexa 555 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리한 후 3시간이 지닌 시점에 공초점 현미경을 이용하여 측정하였다.(1) In order to evaluate the spheroid cell uptake efficiency of the nanoparticles (NPs) formed in Example 1-1 and the nanoparticle complex (Directional LT-NPs) formed in Example 1-4 (2), It was imaged using a focusing microscope and the results are shown in FIG. 23 . The spheroid-type MCF-7 cells (1×10 5 ) formed in Example 11-2 in which the nuclei were stained using DAPI were treated with Alexa 555 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes, a time point of 3 hours. was measured using a confocal microscope.

(2) 또한, 실시예 4의 1에서 형성한 나노입자(siRNA NPs)와 실시예 4의 2에서 형성한 나노입자 복합체(Lipid siRNA NPs)에 대한 Spheroid 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 24에 나타내었다. DAPI를 이용하여 핵이 염색되고 Alexa 488을 이용하여 세포골격이 염색된 실시예 11의 2에서 형성된 Spheroid 형태 MCF-7 세포(1×105)에 Cy3 형광 dye가 표지된 나노입자 및 나노입자 복합체를 처리하고 3, 6시간이 지닌 시점에 공초점 현미경을 이용하여 측정하였다.(2) In addition, in order to evaluate the spheroid cell uptake efficiency of the nanoparticles (siRNA NPs) formed in Example 4-1 and the nanoparticle complex (Lipid siRNA NPs) formed in Example 4-2, confocal microscopy Imaged using , and the results are shown in FIG. 24 . Cy3 fluorescent dye-labeled nanoparticles and nanoparticle complexes in spheroid-type MCF-7 cells (1×10 5 ) formed in Example 11-2 in which the nucleus was stained using DAPI and the cytoskeleton was stained using Alexa 488. was treated and measured using a confocal microscope at the time points of 3 and 6 hours.

(3) 또한, 실시예 4의 1에서 형성한 나노입자(siRNA NPs)와 실시예 4의 2에서 형성한 나노입자 복합체(Lipid-siRNA NP)에 대한 Spheroid 세포 Gene silencing을 확인하여, 도 25 및 도 26에 나타내었다. Gene silencing의 확인은 Spheroid 형태 MCF-7 세포(1×105)에 나노입자, 나노입자 복합체를 각각 3시간 동안 처리한 후, 24시간 배양한 후에 mRNA를 추출하였으며, 같은 방법으로 세포에 대한 PCR을 수행하였다. PCR gel retardation assay에서 유전자 밴드(gene bands)는 GelRed Nucleic Acid stain으로 염색되고, Gel Doc imaging device에 의해 시각화된다. 도 26의 경우, gene band의 intensity를 ImagePro를 이용하여 상대적으로 정량화한 값을 나타내었다.(3) In addition, Spheroid cell Gene silencing was confirmed for the nanoparticles (siRNA NPs) formed in Example 4-1 and the nanoparticle complex (Lipid-siRNA NP) formed in Example 4-2, FIG. 25 and 26. Gene silencing was confirmed by treating spheroid type MCF-7 cells (1×10 5 ) with nanoparticles and nanoparticle complexes for 3 hours, respectively, incubating for 24 hours, and then extracting mRNA. was performed. In PCR gel retardation assay, gene bands are stained with GelRed Nucleic Acid stain and visualized by Gel Doc imaging device. In the case of FIG. 26, the relative quantification of the intensity of the gene band using ImagePro is shown.

(4) 도 23 내지 제26을 보면, 나노입자 복합체가 나노입자에 비해 세포 섭취 효율이 뛰어남을 확인할 수 있어, 이를 통해, 단순 in vitro 환경에서 뿐만 아니라, in vivo를 mimic한 환경에서도 나노입자 복합체의 섭취 효율이 우수함을 확인할 수 있어, 나노입자 복합체는 조직에서의 뛰어난 페네트레이션 효율을 가짐을 알 수 있다.(4) Looking at FIGS. 23 to 26, it can be confirmed that the nanoparticle complex has superior cell uptake efficiency compared to the nanoparticle, and through this, the nanoparticle complex is not only in a simple in vitro environment but also in an in vivo mimic environment. It can be confirmed that the uptake efficiency of is excellent, and it can be seen that the nanoparticle composite has excellent penetration efficiency in tissues.

<실시예 12> 동물모델에서 나노입자 복합체의 세포 섭취 효율 평가<Example 12> Evaluation of cell uptake efficiency of nanoparticle complexes in animal models

1. 실시예 4의 1에서 형성한 나노입자(siRNA NPs)와 실시예 4의 2에서 형성한 나노입자 복합체(Lipid siRNA NPs)에 대한 동물 모델에서 세포 섭취 효율을 평가하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 27에 나타내었다. 상기 동물 모델 실험은 Cy5 형광 dye가 표지된 나노입자와 나노입자 복합체를 각각 포함하는 안약제제 5ul 준비하고, 상기 안약제제를 Brown Norway Rat의 안구에 유리체강내 주사로 전달하였다. 약물을 주입하고 30일이 지난 후 안구를 적출하고 4%PFA로 고정한 후 20% 수크로오스에 30분 동안 담근 후, 안구를 수크로오스에서 꺼내어 O.C.T compound에 버무려 주고 cryomolld에 O.C.T compound를 부어 얼린 후, 안구 조직을 cryomolld에서 떼어 내고 cryosection기로 썰어 구김이 없게 잘 펴주고 DAPI solution을 5분동안 반응시켜 조직의 핵을 염색한 후, 공초점 현미경을 이용하여 측정하였다.1. In order to evaluate the cell uptake efficiency in an animal model for the nanoparticles (siRNA NPs) formed in Example 4-1 and the nanoparticle complex (Lipid siRNA NPs) formed in Example 4-2, confocal microscopy was used. It was imaged using and the results are shown in FIG. 27 . In the animal model experiment, 5 ul of ophthalmic preparations containing nanoparticles and nanoparticle complexes labeled with Cy5 fluorescent dye were prepared, and the ophthalmic preparations were delivered by intravitreal injection into the eyes of Brown Norway Rats. After 30 days of drug injection, the eyeball was extracted, fixed with 4% PFA, and immersed in 20% sucrose for 30 minutes. Then, the eyeball was taken out of sucrose, mixed with O.C.T compound, poured with O.C.T compound in cryomolld, and frozen. was removed from the cryomolld, cut with a cryosection machine, spread well without wrinkles, reacted with DAPI solution for 5 minutes to stain tissue nuclei, and measured using a confocal microscope.

2. 도 27을 보면, 나노입자 복합체가 나노입자보다 오랫동안 안구 조직에 체류하는 것을 것을 알 수 있어, 나노입자 복합체는 세포 섭취 효율이 뛰어남을 알 수 있다.2. Referring to FIG. 27 , it can be seen that the nanoparticle complex stays in the ocular tissue for a longer period of time than the nanoparticle, indicating that the nanoparticle complex has excellent cell uptake efficiency.

<실시예 13> 나노입자 복합체의 망막 전달 효율 평가<Example 13> Evaluation of retinal delivery efficiency of nanoparticle complexes

1. 실시예 1의 1에서 형성한 나노입자(HSA NPs)와 실시예 1의 4의 (2)에서 형성한 나노입자 복합체(Lipid-HSA NPs)에 대한 망막 전달 효율 평가 하기 위해, 공초점 현미경을 이용하여 이미지화하여 그 결과를 도 28에 나타내었다. 상기 망막 전달 효율 평가 실험은 Cy5.5 형광 dye(Alexa 647)가 표지된 나노입자와 나노입자 복합체를 각각 포함하는 안약 제제 5ul 준비하고, 상기 안약 제제를 Brown Norway Rat의 안구에 점안하였다. 안약 제제를 주입하고 하루가 지난 후 안구를 적출하고 4%PFA로 고정한 후 20% 수크로오스에 30분 동안 담근 후, 안구를 수크로오스에서 꺼내어 O.C.T compound에 버무려 주고 cryomolld에 O.C.T compound를 부어 얼린 후, 안구 조직을 cryomolld에서 떼어 내고 cryosection기로 썰어 구김이 없게 잘 펴주고 DAPI solution을 5분동안 반응시켜 조직의 핵을 염색한 후, 공초점 현미경을 이용하여 측정하였다.1. To evaluate the retinal delivery efficiency of the nanoparticles (HSA NPs) formed in Example 1-1 and the nanoparticle complex (Lipid-HSA NPs) formed in Example 1-4 (2), confocal microscopy Imaged using , and the results are shown in FIG. 28 . In the retinal delivery efficiency evaluation experiment, 5 ul of eye drop formulations each containing nanoparticles and nanoparticle complexes labeled with Cy5.5 fluorescent dye (Alexa 647) were prepared, and the eye drop formulations were instilled into the eyes of Brown Norway Rats. One day after injecting the eye drop preparation, the eyeball was extracted, fixed with 4% PFA, and immersed in 20% sucrose for 30 minutes. was removed from the cryomolld, cut with a cryosection machine, spread well without wrinkles, reacted with DAPI solution for 5 minutes to stain tissue nuclei, and measured using a confocal microscope.

2. 도 28을 보면, 나노입자 복합체가 나노입자에 비하여 안구 내 망막까지 현저하게 전달되는 것을 확인할 수 있어, 종래에 안질환 치료에 이용되는 나노입자를 상기 지질구조체를 이용하여 개질하는 경우 상기 나노입자를 안구 내 망막까지 효과적으로 전달하여 안질환 치료 효과를 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.2. Referring to FIG. 28, it can be confirmed that the nanoparticle complex is significantly delivered to the retina in the eye compared to the nanoparticle, so when modifying nanoparticles conventionally used for the treatment of eye diseases using the lipid structure, the nano It can be seen that the effect of treating eye diseases can be improved by effectively delivering the particles to the retina in the eyeball.

이상에서, 출원인은 본 발명의 다양한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며, 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.In the above, the applicant has described various embodiments of the present invention, but such embodiments are only one embodiment for implementing the technical idea of the present invention, and any changes or modifications are made according to the present invention as long as the technical idea of the present invention is implemented. should be construed as falling within the scope of

1: 나노입자 2: 지질구조체
21: 지질 헤드 22: 지질 꼬리1: nanoparticle 2: lipid structure
21: lipid head 22: lipid tail

Claims (7)

안질환 치료에 이용되는 알부민 나노입자와, 상기 알부민 나노입자의 외표면 일부분에 결합하여 알부민 나노입자의 조직 투과 효율을 향상시키는 지질 기반의 지질구조체를 포함하며,
상기 지질구조체는 친수성을 띄는 지질 헤드가 외측면에 위치하고 내부에 소수성을 띄는 지질 꼬리가 위치하여 전체적으로 길이가 긴 튜브 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 안약제제용 나노입자 복합체.It includes albumin nanoparticles used for the treatment of eye diseases, and a lipid-based lipid structure that binds to a portion of the outer surface of the albumin nanoparticles to improve tissue penetration efficiency of the albumin nanoparticles,
The lipid structure is a nanoparticle complex for ophthalmic preparations, characterized in that the hydrophilic lipid head is located on the outer surface and the hydrophobic lipid tail is located on the inside to have a long tube shape as a whole. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 지질구조체는 안질환 치료에 사용되는 상기 알부민 나노입자의 안구 망막 내 전달 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 안약제제용 나노입자 복합체.According to claim 1,
The lipid structure is a nanoparticle complex for ophthalmic preparations, characterized in that capable of improving the delivery efficiency of the albumin nanoparticles used in the treatment of eye diseases in the retina of the eye. 제1항에 있어서,
상기 지질구조체는 50 내지 300nm의 길이를 가지고 3 내지 20nm의 폭을 가지는 것을 특징으로 하는 안약제제용 나노입자 복합체.According to claim 1,
The lipid structure is a nanoparticle complex for ophthalmic preparations, characterized in that having a length of 50 to 300nm and a width of 3 to 20nm. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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