KR102564911B1 - Modified hydrogel - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개질된 하이드로겔에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면인 하이드로겔은 다중 작용기가 도입된 알긴산 폴리머 및 키토산 폴리머를 포함하여, 응집력, 수중 접착력을 포함한 접착력이 우수하다. 그 결과, 상기 하이드로겔은 수중 환경에서도 피부 접착력이 우수하고, 혈액 응고 효과와 피부 상처 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 겔화 시간이 빨라 신속한 지혈 효과를 기대할 수 있으며, 세포 독성이 없어 생체 적합성이 우수하다.The present invention relates to modified hydrogels. The hydrogel, which is one aspect of the present invention, includes an alginate polymer and a chitosan polymer into which a multi-functional group is introduced, and has excellent cohesive strength and adhesive strength including underwater adhesion. As a result, the hydrogel has excellent skin adhesion even in an aquatic environment, and has excellent blood coagulation and skin wound effects. In addition, the hydrogel of the present invention has a fast gelation time, so a rapid hemostatic effect can be expected, and it has excellent biocompatibility due to no cytotoxicity.

Description

개질된 하이드로겔{MODIFIED HYDROGEL}Modified hydrogel {MODIFIED HYDROGEL}

본 발명은 개질된 하이드로겔에 관한 것이다.The present invention relates to modified hydrogels.

과다 출혈은 일반적으로 인간이 생존할 수 있는 한계 이상으로 출혈이 발생하는 것을 의미한다. 과다 출혈은 전쟁터, 수술, 등 기타 응급 상황에서 사망의 주요 원인 중 하나로, 즉각적인 치료가 필요하다. 출혈을 멈추기 위해서는 수분 흡수와 혈소판 활성화가 필수 전제이다. 구체적으로, 수분 흡수를 통해 혈소판 및 피브린과 같은 혈액 응고 인자의 농도를 향상시켜서 지혈 작용을 촉진시킬 수 있다. 또한, 혈소판은 인체가 부상을 입었을 때 체내에서 가장 먼저 반응하는 혈액 구성 요소로, 가장 중요한 혈액응고 인자로 알려져 있으며, 혈소판의 지혈 기전은 다음과 같다. 먼저 손상된 혈관벽에 혈소판의 접착이 발생하고 혈소판들끼리 뭉쳐서 혈소판 플러그를 만들어 1차 지혈이 완성되며 이를 혈소판 활성화라고 한다. 활성화된 혈소판들은 피브린과 적혈구들을 끌어들여 빈 공간을 메우며 2차 지혈을 완성하게 되는데, 추가적으로 혈소판유도 성장 인자들을 방출하게 된다. 지혈 과정 후 상처 표면을 덮은 혈소판들은 혈소판 유도 성장 인자(Platelet-derived growth factors, PDGF)들의 방출을 통하여 염증, 증식, 리모델링과 같은 상처 치유 과정을 컨트롤한다.Excessive bleeding generally refers to bleeding beyond the limits of human survival. Excessive bleeding is one of the leading causes of death on the battlefield, in surgery, and in other emergencies, requiring immediate medical attention. In order to stop bleeding, water absorption and platelet activation are essential prerequisites. Specifically, hemostasis can be promoted by increasing the concentration of blood coagulation factors such as platelets and fibrin through water absorption. In addition, platelets are a blood component that reacts first in the body when the human body is injured, and is known as the most important blood coagulation factor. The hemostasis mechanism of platelets is as follows. First, platelets adhere to the damaged blood vessel wall, and platelets stick together to form a platelet plug, completing primary hemostasis, which is called platelet activation. Activated platelets complete secondary hemostasis by attracting fibrin and red blood cells to fill the empty space, and platelet-derived growth factors are additionally released. After hemostasis, platelets covering the wound surface control wound healing processes such as inflammation, proliferation, and remodeling through the release of platelet-derived growth factors (PDGF).

이러한 수분 흡수 및 혈소판 활성화 원리를 이용하여, 제올라이트, 키토산, 피브린과 같은 많은 천연 지혈제들이 개발 및 상품화되었다. 이들 대부분의 천연 지혈제들은 긴급 지혈 효과는 어느정도 있으나, 다음과 같은 심각한 문제점들을 안고 있다. 예를 들어 제올라이트 광물은 화상을 일으키기 쉬우며, 생체 적합성이 부족하고, 키토산은 물에 대한 용해도가 낮아 생체표면과의 수중접착 능력이 떨어진다. 또한, 피브린은 생체 적합성은 높은 반면, 생체 유래 추출물이기에 비용이 높으며 단백질 구조 및 트롬빈과 같은 효소를 필요로 하기 때문에 동결 보관 및 해동 사용이 제한적이다. Many natural hemostatic agents such as zeolite, chitosan, and fibrin have been developed and commercialized using the principle of water absorption and platelet activation. Most of these natural hemostatic agents have some degree of emergency hemostatic effect, but have the following serious problems. For example, zeolite minerals easily cause burns and lack biocompatibility, and chitosan has low solubility in water and has poor adhesion to biological surfaces. In addition, while fibrin has high biocompatibility, it is expensive because it is a bio-derived extract, and its use in frozen storage and thawing is limited because it requires protein structure and enzymes such as thrombin.

상기 문제점을 해소할 수 있는 이상적인 지혈 소재로 하이드로겔이 주목을 받고 있다. 하이드로겔은 수많은 3차원 다공성 구조와, 수분 흡수 능력이 높아 세포 증식 및 상처 치유에 강점을 지닌 것으로 알려져 있다. 하이드로겔은 작용기를 도입함으로써, 스스로 뭉치는 응집(cohension) 및 다른 물질에 들러붙는 접착(adhesion)과 같은 주요 물성들을 조절할 수 있다. 특히 응집은 젤화 속도 및 젤의 기계적 안정성에 큰 영향을 미치고, 접착은 주변 바이오 분자들과의 상호 작용과 밀접한 관련성이 있다. Hydrogel is attracting attention as an ideal hemostatic material that can solve the above problems. Hydrogels are known to have strengths in cell proliferation and wound healing due to their numerous three-dimensional porous structures and high water absorption capacity. By introducing functional groups, hydrogels can control key physical properties such as self-aggregation (cohension) and adhesion to other materials. In particular, aggregation has a great influence on the gelation rate and mechanical stability of the gel, and adhesion is closely related to interactions with surrounding biomolecules.

최근 하이드로겔의 응집과 접착력을 조절하여 지혈용 하이드로겔을 개발하려는 다양한 시도가 있었으며 그 예는 다음과 같다. 다당류 기반에 소수성 알킬 체인을 기능화한 하이드로겔은 세포막의 인지질 이중막과의 상호 작용을 통하여 크로스링킹이 가능하였으며 더 나아가 혈액 세포와의 접착 및 응집으로 지혈제의 가능성을 보여주었다. 그러나, 이러한 하이드로겔은 혈액 속의 수많은 물분자들의 반데르발스 힘의 방해로 인한 수중 접착 능력이 저하되는 한계점을 보였다. 또한, 지혈용 하이드로겔의 수중 접착 능력을 향상시키기 위해 홍합 유래의 수중 접착 능력이 뛰어난 카테콜 작용기를 생체 적합성이 높은 히알루론산에 접목한 연구가 진행되었다. 그러나, 카테콜 단일 작용기만을 도입하였을 시 응집과 접착 사이의 효율성이 떨어지는 문제점을 보였고, 크로스링킹 시 세포독성 위험을 지닌 NaIO4의 사용을 필요로 하는 문제점이 발견되었다. Recently, various attempts have been made to develop hydrogels for hemostasis by controlling the aggregation and adhesive strength of the hydrogels, and examples thereof are as follows. The polysaccharide-based hydrogel functionalized with hydrophobic alkyl chains was capable of cross-linking through interaction with the phospholipid bilayer of the cell membrane, and further demonstrated the potential of hemostatic agents through adhesion and aggregation with blood cells. However, these hydrogels have a limitation in that the ability to adhere in water is reduced due to the interference of van der Waals forces of numerous water molecules in the blood. In addition, in order to improve the underwater adhesive ability of the hemostatic hydrogel, a study was conducted in which a mussel-derived catechol functional group with excellent underwater adhesive ability was grafted onto hyaluronic acid with high biocompatibility. However, when only a single catechol functional group was introduced, the efficiency between aggregation and adhesion was reduced, and a problem requiring the use of NaIO 4 having a risk of cytotoxicity during crosslinking was found.

이에, 우수한 생체 적합성 보유를 전제로, 응집력과 접착력이 우수하면서, 이들이 적절히 조화된 하이드로겔의 개발이 필요한 상황이다.Therefore, on the premise of maintaining excellent biocompatibility, it is necessary to develop a hydrogel in which cohesion and adhesion are excellent, and these are appropriately harmonized.

KR 10-2020-0101818 AKR 10-2020-0101818 A

일 측면에서, 본 발명의 목적은 생체 적합성이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hydrogel having excellent biocompatibility.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 피부 접착성이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hydrogel having excellent skin adhesion.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 수중 접착력이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hydrogel having excellent adhesion in water.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 하이드로겔의 수분 흡수 능력을 개선하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to improve the water absorption capacity of a hydrogel.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 하이드로겔 조성물의 겔화 속도를 개선하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to improve the gelation rate of a hydrogel composition.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 즉각적인 지혈 효과가 있는 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hydrogel with an immediate hemostatic effect.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 지혈 및 피부 재생 효과가 우수한 하이드로겔을 제공하는 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hydrogel excellent in hemostatic and skin regeneration effects.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 보관성이 우수하고 사용이 편리한 지혈·상처 치료제를 제공하는 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide a hemostatic/wound treatment that is excellent in storage and convenient to use.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 생체 유래 물질인 피브린과 비교하여 경제적인 상처 치유제를 제공하는 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide an economical wound healing agent compared to fibrin, which is a bio-derived material.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서, 하이드로겔로서, 상기 하이드로겔은, 키토산 유도체; 및 알긴산 유도체를 포함하고, 상기 키토산 유도체는, 키토산의 관능기가 갈릭산(gallic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하고, 상기 알긴산 유도체는, 알긴산의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔을 제공한다.In order to achieve the above object, in one aspect, the present invention is a hydrogel, wherein the hydrogel is a chitosan derivative; and an alginic acid derivative, wherein the chitosan derivative includes one in which the functional group of chitosan is modified with at least one selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol. The derivative provides a hydrogel comprising a functional group of alginic acid modified with at least one selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol.

본 발명의 일 측면인 하이드로겔은 다중 작용기가 도입된 알긴산 폴리머 및 키토산 폴리머를 포함하여, 응집력, 수중 접착력을 포함한 접착력이 우수하다. 그 결과, 상기 하이드로겔은 수중 환경에서도 피부 접착력이 우수하고, 혈액 응고 효과와 피부 상처 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 겔화 시간이 빨라 신속한 지혈 효과를 기대할 수 있으며, 세포 독성이 없어 생체 적합성이 우수하다.The hydrogel, which is one aspect of the present invention, includes an alginate polymer and a chitosan polymer into which a multi-functional group is introduced, and has excellent cohesive strength and adhesive strength including underwater adhesion. As a result, the hydrogel has excellent skin adhesion even in an aquatic environment, and has excellent blood coagulation and skin wound effects. In addition, the hydrogel of the present invention has a fast gelation time, so a rapid hemostatic effect can be expected, and it has excellent biocompatibility due to no cytotoxicity.

도 1 내지 도 8에서 AC는 알긴산 유도체 및 키토산 유도체 함유 하이드로겔를 의미하고, ACa는 알긴산 유도체 및 칼슘 함유 하이드로겔을 의미하며, ACCa는 본 발명의 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 Ca 함유 하이드로겔을 의미한다.
도 1은 본 발명의 하이드로겔의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 하이드로겔의 응집력과 부착력의 메커니즘을 보이는 도이다.
도 3a는 본 발명의 키토산 유도체의 NMR(nuclear magnetic resonance) 결과를 보이는 도이다.
도 3b는 본 발명의 알긴산 유도체의 NMR 결과를 보이는 도이다.
도 4a는 본 발명의 하이드로겔의 겔화 시간을 측정한 도이다.
도 4b는 AC 하이드로겔, ACa 하이드로겔, 및 ACCa 하이드로겔의 점도를 측정한 결과이다.
도 4c는 AC 하이드로겔의 SEM(scanning electron microscope) 이미지이다.
도 4d는 ACa 하이드로겔의 SEM 이미지이다.
도 4e는 ACCa 하이드로겔의 SEM 이미지이다.
도 4f는 AC 하이드로겔, ACa 하이드로겔, 및 ACCa 하이드로겔의 팽윤비(swelling ratio)를 관찰한 결과이다.
도 5a는 혈소판과 하이드로겔의 반응성을 확인한 결과로, 혈액과 하이드로겔을 반응시킨 후 혈액 내 존재하는 혈소판의 수 측정 결과이다(Alginate-Chitosan_Ca Hydrogel은 개질되지 않은 알긴산과 키토산 및 Ca를 포함하는 하이드로겔을 의미함).
도 5b는 혈액과 하이드로겔을 반응시킨 후 혈액 내 혈소판 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)의 발현양을 측정한 결과이다(N: 음성 대조군, P: 양성 대조군).
도 5c는 혈소판과 하이드로겔의 반응성을 확인한 결과로, 혈소판과 하이드로겔 반응 시간 경과에 따른 하이드로겔 표면 상의 혈소판 결합 정도를 SEM 을 통해 확인한 결과이다.
도 5d는 본 발명의 하이드로겔이 세포 증식에 적합한 환경인지 여부를 확인하기 위해 Hela 세포를 하이드로겔에서 배양한 결과를 보이는 도이다.
도 6는 본 발명의 하이드로겔의 지혈 효과를 확인한 in vivo 실험의 결과로, 도 6a는 하이드로겔 처리 후 출혈 시간을 측정한 결과, 도 6b는 하이드로겔 처리 후 출혈량을 측정한 결과이다.
도 7은 하이드로겔의 상처 치유 효과를 in vivo 실험한 결과로, 도 7a와 도 7b는 하이드로겔 처리후 상처 단면 회복 두께를 확인한 것이고, 도 7c는 하이드로겔을 처리한 후 상처 단면을 보이는 도이고, 도 7d은 하이드로겔을 처리한 후 상처 단면의 두께를 측정한 결과이다.1 to 8 , AC denotes an alginate derivative and chitosan derivative-containing hydrogel, ACa denotes an alginate derivative and calcium-containing hydrogel, and ACCa denotes an alginate derivative, chitosan derivative, and Ca-containing hydrogel of the present invention. .
1 is a schematic diagram of the hydrogel of the present invention.
Figure 2 is a diagram showing the mechanism of cohesive force and adhesive force of the hydrogel of the present invention.
Figure 3a is a diagram showing the NMR (nuclear magnetic resonance) results of the chitosan derivative of the present invention.
Figure 3b is a diagram showing the NMR results of the alginate derivatives of the present invention.
Figure 4a is a diagram measuring the gelation time of the hydrogel of the present invention.
Figure 4b is the result of measuring the viscosity of AC hydrogel, ACa hydrogel, and ACCa hydrogel.
Figure 4c is a SEM (scanning electron microscope) image of the AC hydrogel.
Figure 4d is a SEM image of ACa hydrogel.
Figure 4e is a SEM image of ACCa hydrogel.
Figure 4f is the result of observing the swelling ratio (swelling ratio) of the AC hydrogel, ACa hydrogel, and ACCa hydrogel.
5a is a result of confirming the reactivity between platelets and hydrogel, and is a result of measuring the number of platelets present in blood after reacting blood and hydrogel (Alginate-Chitosan_Ca Hydrogel is a hydrogel containing unmodified alginate, chitosan, and Ca). means gel).
5B shows the result of measuring the expression level of platelet-derived growth factor (PDGF-BB) in blood after reacting blood with the hydrogel (N: negative control, P: positive control).
5C is a result of confirming the reactivity between platelets and the hydrogel, and is a result of confirming the degree of platelet binding on the surface of the hydrogel according to the reaction time of the platelets and the hydrogel through SEM.
Figure 5d is a diagram showing the results of culturing Hela cells in the hydrogel to confirm whether the hydrogel of the present invention is an environment suitable for cell growth.
Figure 6 is the result of an in vivo experiment confirming the hemostatic effect of the hydrogel of the present invention, Figure 6a is the result of measuring the bleeding time after hydrogel treatment, Figure 6b is the result of measuring the amount of blood loss after hydrogel treatment.
7 is a result of an in vivo experiment on the wound healing effect of the hydrogel, FIGS. 7a and 7b confirm the thickness of the wound cross section after hydrogel treatment, and FIG. 7c is a diagram showing the wound cross section after hydrogel treatment. , Figure 7d is the result of measuring the thickness of the wound section after treatment with the hydrogel.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

이하에서, 각 구성을 보다 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리 범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.Hereinafter, each configuration will be described in more detail, but this is only one example, and the scope of the present invention is not limited by the following content.

본 발명은 일 측면에서, 키토산 유도체; 및 알긴산 유도체를 포함하고, 상기 키토산 유도체는, 키토산의 관능기가 갈릭산(gallic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하고, 상기 알긴산 유도체는, 알긴산의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔이다.In one aspect, the present invention is a chitosan derivative; and an alginic acid derivative, wherein the chitosan derivative includes one in which the functional group of chitosan is modified with at least one selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol. The derivative is a hydrogel containing a functional group of alginic acid modified with at least one selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol.

본 명세서에서 상기 개질은, 축합 중합·첨가 중합과 같은 중합, 치환 및 첨가 등 화학적 반응을 포함하는 개념으로 사용되며, '작용기화'와 동의어로 사용될 수 있다.In the present specification, the modification is used as a concept including polymerization such as condensation polymerization and addition polymerization, and chemical reactions such as substitution and addition, and may be used synonymously with 'functionalization'.

상기 관능기(functional group)는 기능 원자단, 또는 작용기라고도 불리우며, 예컨대, 수산기(-OH), 알데히드기(-CHO), 카보닐기(-CO), 카복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 니트로기(-NO2) 등을 포함할 수 있다.The functional group is also called a functional group or a functional group, for example, a hydroxyl group (-OH), an aldehyde group (-CHO), a carbonyl group (-CO), a carboxyl group (-COOH), an amine group (-NH 2 ) , a nitro group (-NO 2 ), and the like.

일 측면에서, 상기 키토산 유도체는, 하기 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함할 수 있다.In one aspect, the chitosan derivative may include a functional group on a unit of Formula 1 modified with at least one selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol.

<화학식 1><Formula 1>

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 알긴산 유도체는, 하기 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함할 수 있다.In addition, in the above aspect, the alginic acid derivative may include one in which the functional group on the unit of Formula 2 below is modified with one or more selected from the group consisting of gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol.

<화학식 2><Formula 2>

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 키토산 유도체는 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 및 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 추가적으로 상기 화학식 1의 단위체를 더 포함할 수 있다.In addition, in the above aspect, the chitosan derivative is one in which the functional group on the unit of Formula 1 is modified with gallic acid, one in which the functional group on the unit of Formula 1 is modified with kenodeoxycholic acid, and the functional group on the unit of Formula 1 is modified with gallic acid. It may include one modified with catechol, and additionally may further include a unit of Formula 1.

상기 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 및 상기 화학식 1의 단위체는 중합되어 연결된 것으로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 키토산 유도체는, 화학식 1의 단위체, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 폴리머일 수 있다.It may include one in which the functional group on the unit of Formula 1 is modified with gallic acid, one in which the functional group on the unit of Formula 1 is modified with chenodioxycholic acid, and one in which the functional group on the unit of Formula 1 is modified with catechol, and the above Units represented by Formula 1 may include polymerized and linked units. That is, the chitosan derivative of the present invention may be a polymer obtained by polymerizing a unit of Formula 1, a functional group on the unit of Formula 1 modified with chenodioxycholic acid, or a functional group on the unit of Formula 1 modified with catechol.

상기와 같은 측면에서. 상기 알긴산 유도체는, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 및 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 추가적으로 상기 화학식 2의 단위체를 더 포함할 수 있다.in terms of the above. The alginic acid derivative may include one in which the functional group on the unit of Formula 2 is modified with gallic acid, one in which the functional group on the unit of Formula 2 is modified with chenodioxycholic acid, and one in which the functional group on the unit of Formula 2 is modified with catechol. and may further include a unit represented by Chemical Formula 2 above.

또한, 상기 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 및 상기 화학식 2의 단위체는 중합되어 연결된 것으로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 알긴산 유도체는, 화학식 2의 단위체, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 폴리머일 수 있다.In addition, the functional group on the unit of Formula 2 may be modified with gallic acid, the functional group on the unit of Formula 2 may be modified with chenodioxycholic acid, and the functional group on the unit of Formula 2 may be modified with catechol, And the units represented by Chemical Formula 2 may be polymerized and connected. That is, the alginic acid derivative of the present invention may be a polymer obtained by polymerizing a unit of Formula 2, a functional group on the unit of Formula 2 modified with chenodioxycholic acid, or a functional group on the unit of Formula 2 modified with catechol.

일 측면에서, 본 발명의 키토산의 관능기 중 갈릭산 등으로 개질된 부위는, 아미노기를 포함할 수 있다.In one aspect, a site modified with gallic acid or the like among functional groups of chitosan of the present invention may include an amino group.

또한, 본 발명의 알긴산의 관능기 중 갈릭산 등으로 개질된 부위는, 카복실기를 포함할 수 있다.In addition, among the functional groups of alginic acid of the present invention, a site modified with gallic acid or the like may include a carboxyl group.

상기와 같은 측면에서, 본 발명의 키토산 유도체는, 하기 화학식 3의 물질을 포함할 수 있다:In terms of the above, the chitosan derivative of the present invention may include a substance represented by Formula 3 below:

<화학식 3><Formula 3>

일 측면에서, 상기 화학식 3의 키토산 유도체는 아래와 같은 방법에 의하여 제조할 수 있다.In one aspect, the chitosan derivative of Chemical Formula 3 can be prepared by the following method.

<키토산 유도체의 합성공정><Synthesis process of chitosan derivative>

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하여, 상기 화학식 1의 단위체의 아미노 잔기를 개질하였으며, 개질은 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜 순으로 수행하였다. 상기 합성 방법은 논문(Journal of Polymer Science, Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene, Wanvimol Pasanphan 외2인, 2008, https://doi.org/10.1002/app.27953)을 참고하였다. 그 결과, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜은 아민기 대비 25%(몰/몰)씩 작용기화 되었다.Specifically, the amino residue of the unit of Formula 1 was modified using a carbodiimide coupling reaction of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), and the modification was Gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol were performed in that order. The synthesis method is described in a paper (Journal of Polymer Science, Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene, Wanvimol Pasanphan et al., 2008, https://doi.org/10.1002/app. 27953) was referenced. As a result, gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol were functionalized by 25% (mol/mol) compared to the amine group.

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 알긴산 유도체는, 하기 화학식 4의 물질을 포함할 수 있다.In addition, in the above aspects, the alginic acid derivative may include a substance represented by Chemical Formula 4 below.

<화학식 4><Formula 4>

일 측면에서, 상기 화학식 4의 알긴산 유도체는 아래와 같은 방법에 의하여 제조할 수 있다.In one aspect, the alginic acid derivative of Chemical Formula 4 can be prepared by the following method.

<알긴산 유도체의 합성공정><Synthesis process of alginic acid derivatives>

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 아디픽산 디하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide)를 폴리머와 단분자 사이의 브릿지로 사용하였다. 상기 화학식 1의 단위체의 아미노 잔기를 개질하였으며, 개질은 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜 순으로 수행하였다. 상기 합성 방법은 논문(J.App.Pol.Sci.2008, 27953)을 참고하였다. 그 결과, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜은 아민기 대비 25%(mol/mol)씩 작용기화되었다.Specifically, the carbodiimide coupling reaction of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) was used, and adipic acid dihydrazide was used as a polymer and It was used as a bridge between single molecules. The amino residue of the unit of Formula 1 was modified, and the modification was performed in the order of gallic acid, chenodioxycholic acid, and catechol. The synthesis method referred to the thesis (J.App.Pol.Sci.2008, 27953). As a result, gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol were functionalized by 25% (mol/mol) compared to the amine group.

본 발명의 하이드로겔은 상기와 같은 키토산 유도체, 알긴산 유도체를 포함하여 우수한 응집력과 접착력을 나타낼 수 있다. 또한, 금속 이온을 더 포함하여 응집력과 접착력을 더욱 개선할 수 있다.The hydrogel of the present invention may exhibit excellent cohesion and adhesive strength by including the chitosan derivative and the alginic acid derivative as described above. In addition, cohesion and adhesion may be further improved by further including metal ions.

구체적으로, 알긴산의 카복실기와 키토산의 아민기의 인력, 알긴산의 카복실기와 금속 이온간의 인력을 통해 강한 응집력을 나타낼 수 있다. 또한, 유도체 내의 갈릭산은 친수성으로, 하이드로겔의 수분 흡수력을 향상시켜 혈액 응고 인자의 농도를 높일 수 있고, 케노디옥시콜산은 콜레스테롤에서 유래한 물질로서 세포 인지질 막과의 접착력이 우수하여, 하이드로겔 표면과 혈소판의 직접적인 접착을 유도할 수 있다. 또한, 카테콜은 수중 접착력이 우수한 물질로, 마이클 첨가와 수소 결합을 통하여 하이드로겔과 피부 등의 생체 조직의 섬유성 물질 간의 접착력과, 세포 간의 접착력을 향상시킬 수 있다(도 2 참조).Specifically, strong cohesive force can be exhibited through the attraction between the carboxyl group of alginic acid and the amine group of chitosan and the attraction between the carboxyl group of alginic acid and metal ions. In addition, gallic acid in the derivative is hydrophilic and can increase the concentration of blood coagulation factors by improving the water absorption capacity of the hydrogel, and chenodeoxycholic acid is a substance derived from cholesterol and has excellent adhesion to the cell phospholipid membrane, It can induce direct adhesion of platelets with the surface. In addition, catechol is a substance with excellent adhesion in water, and can improve the adhesion between hydrogel and fibrous materials of biological tissues such as skin and between cells through Michael addition and hydrogen bonding (see FIG. 2).

또한, 본 발명의 하이드로겔의 응집 물성은 점도를 통해서도 확인할 수 있다. 본 발명의 하이드로겔의 점도는 약 250Pa·s 이상일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 하이드로겔의 점도는 약 250~330 Pa·s, 더욱 구체적으로는 약 270~300 Pa·s로, 높은 점도를 나타낸다.In addition, the cohesive properties of the hydrogel of the present invention can also be confirmed through viscosity. The viscosity of the hydrogel of the present invention may be about 250 Pa·s or more. Specifically, the viscosity of the hydrogel of the present invention is about 250 to 330 Pa·s, more specifically about 270 to 300 Pa·s, and exhibits high viscosity.

또한, 본 발명의 하이드로겔은 두터운 벽 두께를 나타내며, 우수한 기계적 안정성을 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 하이드로겔의 벽 두께는, 약 6μm 이상이며, 더욱 구체적으로는 약 6~9μm, 더욱 구체적으로는 약 6.5~8.5μm일 수 있다. 개질되지 않은 일반 알긴산과 키토산을 포함하는 하이드로겔의 벽 두께가 약 1μm임을 고려할 때, 최소 약 6배 이상 우수한 기계적 물성을 나타내는 것이라고 볼 수 있다.In addition, the hydrogel of the present invention exhibits a thick wall thickness and exhibits excellent mechanical stability. Specifically, the hydrogel of the present invention may have a wall thickness of about 6 μm or more, more specifically about 6 to 9 μm, and more specifically about 6.5 to 8.5 μm. Considering that the wall thickness of the hydrogel containing unmodified normal alginate and chitosan is about 1 μm, it can be seen that it exhibits at least about 6 times superior mechanical properties.

또한, 본 발명의 하이드로겔의 평균 기공 사이즈는 약 10~25μm, 구체적으로는 약 10~21μm, 더욱 구체적으로는 약 16μm일 수 있다. 한편, 개질되지 않은 일반 알긴산과 키토산을 포함하는 하이드로겔의 경우 기공 사이즈가 약 19μm을 고려할 때, 본 발명의 하이드로겔은 동일 면적대비 더 우수한 다공성과 이로 인한 우수한 기계적 안정성을 나타낸다고 볼 수 있다.In addition, the average pore size of the hydrogel of the present invention may be about 10 to 25 μm, specifically about 10 to 21 μm, and more specifically about 16 μm. On the other hand, considering the pore size of about 19 μm in the case of the hydrogel containing unmodified alginate and chitosan, the hydrogel of the present invention can be seen to exhibit superior porosity and thus excellent mechanical stability compared to the same area.

또한, 상기와 같은 이유로 본원 발명의 하이드로겔은 수분 흡수 능력이 우수하며, 수중 환경에서도 우수한 접착성을 나타낼 수 있다.In addition, for the above reasons, the hydrogel of the present invention has excellent water absorption ability and can exhibit excellent adhesiveness even in an aquatic environment.

또한, 일 측면에서 상기 하이드로겔은 금속 이온을 더 포함할 수 있다.In addition, in one aspect, the hydrogel may further include metal ions.

일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔 또는 하이드로겔 조성물이 금속 이온을 포함 할 경우, 이에 포함되는 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 금속 이온은 각각 순서대로 1~10%, 1~8%, 0.1~1%로 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 알긴산 유도체는 3~10%, 또는 5~10%, 또는 6~10%로 포함될 수 있고, 상기 키토산 유도체는 1~6%, 또는 2~6%, 또는 3~5%로 포함될 수 있고, 상기 금속 이온은 0.1~0.8%, 또는 0.2~0.8%, 또는 0.3~0.8%, 또는 0.4~0.6%로 포함될 수 있다.In one aspect, when the hydrogel or hydrogel composition of the present invention contains metal ions, the alginate derivative, chitosan derivative, and metal ion contained therein are 1 to 10%, 1 to 8%, and 0.1 to 1%, respectively, in order. can be included as Specifically, the alginic acid derivative may be included at 3 to 10%, or 5 to 10%, or 6 to 10%, and the chitosan derivative may be included at 1 to 6%, or 2 to 6%, or 3 to 5%. And, the metal ion may be included in 0.1 to 0.8%, or 0.2 to 0.8%, or 0.3 to 0.8%, or 0.4 to 0.6%.

키토산 유도체, 알긴산 유도체 및 금속 이온이 상기와 같은 농도로 포함될 때, 신속한 겔화(gelation) 속도를 보일 수 있다. 겔화 속도가 빠를수록 응급 상황 시 지혈에 용이하다. When the chitosan derivative, the alginic acid derivative, and the metal ion are included in the above concentrations, a rapid gelation rate may be exhibited. The faster the gelation rate, the easier it is to stop bleeding in an emergency.

또한, 일 측면에서 본 발명의 하이드로겔에 포함되는 금속 이온은 2 가 금속 이온을 포함할 수 있다. 2가 금속 이온은 제한되지 않고, 칼슘(Ca), 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba) 등을 포함할 수 있으며, 2종 이상의 금속 이온을 포함할 수 있다.In addition, in one aspect, the metal ion included in the hydrogel of the present invention may include a divalent metal ion. The divalent metal ion is not limited, and may include calcium (Ca), beryllium (Be), magnesium (Mg), strontium (Sr), barium (Ba), and the like, and may include two or more metal ions. .

상기와 같은 측면에서, 본 발명의 일 구현예에서 상기 금속 이온은 칼슘 이온을 포함할 수 있다. In terms of the above, in one embodiment of the present invention, the metal ion may include a calcium ion.

일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔은 상처 치유용 또는 지혈용을 포함할 수 있다. In one aspect, the hydrogel of the present invention may be used for wound healing or hemostasis.

또한, 일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔은 약학적 조성물을 포함할 수 있다. Also, in one aspect, the hydrogel of the present invention may include a pharmaceutical composition.

또한, 상기 하이드로겔은 시트화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the hydrogel may be sheeted, but is not limited thereto.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예와 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through preparation examples and examples. These Preparation Examples and Examples are only for exemplifying the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these Examples.

[제조예] 키토산 유도체, 알긴산 유도체 및 칼슘 함유 하이드로겔의 제조[Preparation Example] Preparation of chitosan derivatives, alginic acid derivatives and calcium-containing hydrogels

[제조예 1] 키토산 유도체의 제조[Preparation Example 1] Preparation of Chitosan Derivatives

키토산 유도체는 Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene(Wanvimol Pasanphan 외2인, Journal of Polymer Science, 2008, https://doi.org/10.1002/app.27953)을 참고하여 제조하였다.Chitosan derivatives are Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene (Wanvimol Pasanphan et al., Journal of Polymer Science, 2008, https://doi.org/10.1002/app.27953 ) Made with reference.

키토산 유도체 합성은 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜을 아민기 대비 각각 25%(몰/몰)씩 순서대로 작용기화 하였다.For the synthesis of chitosan derivatives, a carbodiimide coupling reaction of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) was used, and gallic acid, chenodioxycholic acid, and catechol were amine groups. 25% (mol/mol) each was functionalized sequentially.

키토산의 작용기화(개질)은 프로톤 NMR을 통하여 확인하였다. 그 결과 키토산의 갈릭산과 카테콜의 프로톤 피크는 7ppm과 8.5ppm 사이에서 나타났고, 케노디옥시콜산의 프로톤 피크는 1ppm 근처에서 나타남을 확인하여, 작용기화가 되었음을 확인할 수 있었다(도 3a).Functionalization (modification) of chitosan was confirmed through proton NMR. As a result, it was confirmed that the proton peaks of gallic acid and catechol of chitosan appeared between 7 ppm and 8.5 ppm, and the proton peak of chenodioxycholic acid appeared around 1 ppm, confirming that functionalization was achieved (FIG. 3a).

[제조예 2] 알긴산 유도체의 제조[Preparation Example 2] Preparation of alginic acid derivatives

알긴산 유도체의 합성 방법 역시 상기 논문을 참고하여 제조하였다. A method for synthesizing alginic acid derivatives was also prepared by referring to the above paper.

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 아디픽산 디하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide)를 폴리머와 단분자 사이의 브릿지로 사용하였다. 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜을 각각 아민기 대비 25%(mol/mol)씩 순서대로 작용기화 하였다.Specifically, the carbodiimide coupling reaction of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) was used, and adipic acid dihydrazide was used as a polymer and It was used as a bridge between single molecules. Gallic acid, chenodeoxycholic acid, and catechol were each functionalized in order of 25% (mol/mol) relative to the amine group.

알긴산의 작용기화(개질) 역시 프로톤 NMR을 통하여 확인하였다. 그 결과 알긴산의 갈릭산과 카테콜의 프로톤 피크는 6.5ppm~7ppm 사이에서 나타났고, 케노디옥시콜산의 프로톤 피크는 1ppm 근처에서 나타났으며, 아디픽산 디하이드라자이드의 프로톤 피크는 1.5~2.2ppm에서 확인되어, 작용기화가 되었음을 확인할 수 있었다(도 3a).Functionalization (modification) of alginate was also confirmed through proton NMR. As a result, the proton peak of gallic acid and catechol of alginic acid appeared between 6.5 and 7 ppm, the proton peak of chenodeoxycholic acid appeared around 1 ppm, and the proton peak of adipic acid dihydrazide was between 1.5 and 2.2 ppm. , it was confirmed that functionalization was achieved (FIG. 3a).

[제조예 3] 하이드로겔의 제조[Preparation Example 3] Preparation of hydrogel

본 하이드로겔은 4%의 키토산 유도체와 1%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액과, 8%의 알긴산 유도체를 녹인 수용액을 1:1 비율로 듀얼시린지를 이용하여 실온에서 혼합하였다. 그 결과 제조된 하이드로겔 내 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 칼슘 이온의 농도는 각각 순서대로 4%, 2%, 0.5%이다(ACCa 하이드로겔).The hydrogel was prepared by mixing an aqueous solution of 4% chitosan derivative and 1% calcium chloride and an aqueous solution of 8% alginate derivative in a ratio of 1:1 using a dual syringe at room temperature. As a result, the concentrations of the alginate derivative, chitosan derivative, and calcium ion in the prepared hydrogel were 4%, 2%, and 0.5%, respectively (ACCa hydrogel).

또한, AC 하이드로겔은 4% 키토산유도체를 물에 녹인 수용액과 8% 알긴산 유도체를 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 AC하이드로젤을 제조하였고, ACa 하이드로겔은 1% 칼슘이온을 물에 녹인 수용액과 8% 알긴산 유도체를 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 제조하였다. 또한, 개질되지 않은 알긴산과 키토산을 사용한 하이드로겔은 작용기를 달지 않은 8% 알긴산(alinate)을 녹인 수용액과 작용기를 달지 않은 4% 키토산과 1% 칼슘이온을 혼합하여 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 제조하였다.In addition, AC hydrogel was prepared by mixing an aqueous solution of 4% chitosan derivative in water and an aqueous solution of 8% alginate derivative in water at a 1:1 volume ratio, respectively. It was prepared by mixing an aqueous solution dissolved in water and an aqueous solution obtained by dissolving 8% alginic acid derivative in water at a volume ratio of 1:1. In addition, the hydrogel using unmodified alginic acid and chitosan is a mixture of an aqueous solution of 8% alginate without a functional group, 4% chitosan without a functional group and 1% calcium ion dissolved in water, respectively, 1: It was prepared by mixing in a 1 volume ratio.

[실험예][Experimental example]

[실험예 1] 겔화 시간 측정 및 최적의 농도 도출[Experimental Example 1] Measurement of gelation time and derivation of optimal concentration

제조예 1의 키토산 유도체 용액, 제조예 2의 알긴산 유도체 용액과 칼슘 이온 수용액을 이중 주사기를 통해 혼합하여 겔화되는 시간을 바이알 틸팅(vial tilting)법을 활용하여 측정하였다.The chitosan derivative solution of Preparation Example 1, the alginate derivative solution of Preparation Example 2, and the calcium ion aqueous solution were mixed through a double syringe, and gelation time was measured using a vial tilting method.

실험에 사용된 각 성분의 조성은 아래 표 1과 같았다.The composition of each component used in the experiment was shown in Table 1 below.

Ratio
ConcentrationRatio
Concentration A : CCa = 2 : 1 A : CCa = 2 : 1 A : CCa = 1 : 1 A : CCa = 1 : 1 A : CCa = 1 : 2 A : CCa = 1 : 2 A 2% & C 2% & Ca 0%A 2% & C 2% & Ca 0% NoNo NoNo NoNo A 4% & C 2% & Ca 0%A 4% & C 2% & Ca 0% 1.2 ± 0.2 h1.2 ± 0.2h 1.2 ± 0.1 h1.2 ± 0.1 h NoNo A 8% & C 2% & Ca 0%A 8% & C 2% & Ca 0% 1.2 ± 0.1 h1.2 ± 0.1 h 1.2 ± 0.2 h1.2 ± 0.2 h 1.2 ± 0.2 h1.2 ± 0.2h A 2% & C 4% & Ca 0%A 2% & C 4% & Ca 0% NoNo NoNo NoNo A 4% & C 4% & Ca 0%A 4% & C 4% & Ca 0% 40 ± 7 s40±7s 45 ± 10 s45±10s 62 ± 11 s62±11s A 8% & C 4% & Ca 0%A 8% & C 4% & Ca 0% 32 ± 9 s32±9s 18 ± 4 s18±4s 41 ± 8 s41±8s A 8% & C 4% & Ca 1%A 8% & C 4% & Ca 1% 1s1s 1 s1s 1 s1s

(A: 알긴산 유도체, C: 키토산 유도체, Ca: 칼슘이온, h:시간, s: 초)(A: alginate derivative, C: chitosan derivative, Ca: calcium ion, h: hour, s: second)

상기 표의 해석 예시는 다음과 같다. 예컨대, 2% 농도의 알긴산 유도체 용액과, 2%농도의 키토산 유도체 용액 및 0% 농도의 칼슘 용액의 혼합액을 2:1의 부피비로 혼합하였을 때, 겔화 현상이 나타나지 않았다. 또한, 8%의 알긴산 유도체 용액과, 2%의 키토산 유도체 용액 및 0%의 칼슘 용액의 혼합액을 1:1의 부피비로 혼합할 경우의 겔화시간은 1.2 ± 0.2 h였다.An example of interpretation of the above table is as follows. For example, when a mixture of a 2% concentration of an alginate derivative solution, a 2% concentration of a chitosan derivative solution and a 0% concentration of a calcium solution was mixed in a volume ratio of 2:1, gelation did not occur. In addition, the gelation time when a mixture of an 8% alginate derivative solution, a 2% chitosan derivative solution, and a 0% calcium solution was mixed at a volume ratio of 1:1 was 1.2 ± 0.2 h.

그 결과, 8%의 알긴산 유도체 용액, 4%의 키토산 유도체 용액 및 1%의 칼슘이온 용액을 혼합하였을 때, 겔화 시간이 1초로, 즉각적인 겔화가 나타남을 알 수 있었다. 이러한 빠른 겔화 시간은 응급 상황 시 지혈을 위한 응급제제로서 활용성에 강점을 나타낼 수 있다.As a result, when 8% of the alginate derivative solution, 4% of the chitosan derivative solution and 1% of the calcium ion solution were mixed, the gelation time was 1 second, and it was found that immediate gelation appeared. Such a fast gelation time can show strength in utilization as an emergency agent for hemostasis in an emergency.

하기 실험에서 사용되는 하이드로겔은 4%의 키토산 유도체(또는 0%의 키토산 유도체를 녹인 수용액)와 1%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액(또는 0%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액)과, 8%의 알긴산 유도체를 녹인 수용액을 1:1 비율로 듀얼시린지를 이용하여 실온에서 혼합한 것을 사용하였다.The hydrogel used in the following experiment is 4% chitosan derivative (or 0% chitosan derivative dissolved in an aqueous solution) and 1% calcium chloride aqueous solution (or 0% calcium chloride dissolved in an aqueous solution), 8% alginic acid. An aqueous solution in which the derivative was dissolved was mixed in a 1:1 ratio using a dual syringe at room temperature.

[실험예 2] 하이드로겔의 응집 물성 확인[Experimental Example 2] Confirmation of aggregation properties of hydrogel

레오미터를 활용하여 하이드로겔의 G'와 G''값을 비교 분석하고, 점도 특성을 확인하였다.Using a rheometer, the G' and G'' values of the hydrogel were compared and analyzed, and the viscosity characteristics were confirmed.

일반적으로 G'이 G"을 앞서는 cross-point를 겔화 시점(gelation time)으로 추정하며, 그림 4a와 같이 제조예 3의 ACCa 하이드로겔은 G'이 G"을 앞서는 즉각적인 gelation time을 나타냈다. In general, the cross-point where G' precedes G" is estimated as the gelation time (gelation time), and as shown in Figure 4a, the ACCa hydrogel of Preparation Example 3 showed an immediate gelation time in which G' precedes G".

비교군인 알기닌 유도체와 키토산 유도체를 포함하는 AC 하이드로겔과, ACa 하이드로겔 또한 즉각적인 겔화 현상을 나타내며 이는 이온 상호 작용(ionic interaction)과 조화(coordination)가 빠른 속도로 일어나는 것을 말해준다. 또한 이러한 특성은 바이알 틸팅으로 관찰한 빠른 겔화 현상과도 일치한다. AC hydrogels containing arginine derivatives and chitosan derivatives, which are comparative groups, and ACa hydrogels also show immediate gelation, which indicates that ionic interaction and coordination occur at a high speed. In addition, these characteristics are consistent with the rapid gelation observed by tilting the vial.

제조예 3의 하이드로겔(ACCa 하이드로겔)은 ionic interaction과 coordination 두가지 응집력 모두를 사용하여 향상된 기계적 안정성을 구현하였으며, 이는 점도가 향상됨을 통해 확인할 수 있었다The hydrogel (ACCa hydrogel) of Preparation Example 3 implemented improved mechanical stability using both ionic interaction and coordination cohesive force, which was confirmed through improved viscosity.

점도는 rheometer(Haake MARS III-ORM Package) 을 이용하여 측정하였으며, 그 결과 ACCa 하이드로겔의 점도는 283 ± 13 Pa·s, ACCa 하이드로겔은 110 ± 12 Pa·s, 마지막으로 AC 하이드로겔은 9 ± 1 Pa·s의 점도를 나타내어, 본 발명의 하이드로겔의 점도가 높음을 확인할 수 있었다(도 4b).The viscosity was measured using a rheometer (Haake MARS III-ORM Package), and as a result, the viscosity of the ACCa hydrogel was 283 ± 13 Pa s, the ACCa hydrogel was 110 ± 12 Pa s, and finally the AC hydrogel was 9 By showing a viscosity of ± 1 Pa·s, it was confirmed that the hydrogel of the present invention had high viscosity (FIG. 4b).

또한, SEM 이미지 측정을 통하여 하이드로겔의 벽 두께(wall thickness)와 기공 사이즈를 측정하였다. In addition, the wall thickness and pore size of the hydrogel were measured through SEM image measurement.

그 결과, ACCa 하이드로겔의 벽 두께는 7.6 ± 0.9 μm, AC 하이드로겔의 벽 두께는 1.0 ± 0.3 μm, ACa 하이드로겔의 벽 두께는 7.4 ± 1.4 μm임을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 하이드로겔은 두터운 벽 두께를 가지므로, 우수한 기계적 안정성을 나타낼 수 있다. As a result, it can be confirmed that the wall thickness of the ACCa hydrogel was 7.6 ± 0.9 μm, the wall thickness of the AC hydrogel was 1.0 ± 0.3 μm, and the wall thickness of the ACa hydrogel was 7.4 ± 1.4 μm. That is, since the hydrogel of the present invention has a thick wall thickness, it can exhibit excellent mechanical stability.

기공 크기의 경우 본 발명의 ACCa 하이드로겔은15.9 ± 5.1 μm, AC 하이드로겔이 18.8 ± 6.2 μm, ACa 하이드로겔은 7.4 ± 1.4 μm인 것으로 나타났다(도 4c~도 4e 참조). In the case of the pore size, the ACCa hydrogel of the present invention was 15.9 ± 5.1 μm, the AC hydrogel was 18.8 ± 6.2 μm, and the ACa hydrogel was 7.4 ± 1.4 μm (see Figs. 4c to 4e).

즉, 본 발명의 하이드로겔은 높은 다공성과 두터운 두께로 안정성이 향상된 결과를 보여주었다.That is, the hydrogel of the present invention showed improved stability due to its high porosity and thick thickness.

또한, 상기와 같은 다공성의 경향으로 인해 본원 발명의 하이드로겔은 수분 흡수율이 높음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔의 팽창률은 1189 ± 108 %이고, AC하이드로겔의 팽창률은 1483 ± 132 %이며, ACa 하이드로겔은1042 ± 119 % 이었다.In addition, it was confirmed that the hydrogel of the present invention has a high water absorption rate due to the porosity tendency as described above. Specifically, the expansion rate of the ACCa hydrogel of the present invention was 1189 ± 108%, the expansion rate of the AC hydrogel was 1483 ± 132%, and the ACa hydrogel was 1042 ± 119%.

[실험예 3] 하이드로겔과 혈소판의 접착력 확인[Experimental Example 3] Confirmation of adhesion between hydrogel and platelets

혈소판과 본 발명의 ACCa 하이드로겔의 상호작용을 확인하기 위해, 혈액과 ACCa 하이드로겔을 섞고 10분간 침강 시킨 뒤 남아있는 혈소판의 개수를 XE-2100 혈구 분석기를 사용하여 측정하였다.In order to confirm the interaction between platelets and the ACCa hydrogel of the present invention, blood and ACCa hydrogel were mixed and precipitated for 10 minutes, and the number of remaining platelets was measured using an XE-2100 hemacytometer.

대조군인 혈액 샘플의 혈소판 개수는 272 ± 33×103개이며, 작용기를 도입하지 않은 알기네이트, 작용기를 도입하지 않은 키토산 및 칼슘 함유 하이드로겔 샘플의 혈소판 개수는 233 ± 32×103개였다. 하지만, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔 샘플의 혈액 샘플의 혈소판 개수는 44 ± 19×103개로 극적인 혈소판 개수의 감소를 나타냈다. The number of platelets in the control blood sample was 272 ± 33 × 10 3 , and the number of platelets in the alginate to which no functional group was introduced, the chitosan to which no functional group was introduced, and the calcium-containing hydrogel sample was 233 ± 32 × 10 3 . However, the number of platelets in the blood sample of the ACCa hydrogel sample of the present invention was 44±19×10 3 , indicating a dramatic decrease in the number of platelets.

이러한 혈소판 감소는 혈액 중 혈소판이 하이드로겔의 표면에 들러붙어 침강된 결과로 본 연구의 다중 작용기가 혈소판의 접착에 성공적이었음을 입증한다(도 5a).This reduction in platelets was the result of platelets adhering to and precipitating on the surface of the hydrogel, demonstrating that the multi-functional group of this study was successful in platelet adhesion (FIG. 5a).

접착된 혈소판은 활성화를 통해 혈소판 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF-BB)를 방출하고, 방출된 혈소판 성장 인자는 세포 증식 및 혈관 생성을 유도하여 상처 치유에 중요한 역할을 하게 된다. 따라서, 본 발명의 ACCa 하이드로겔에 접착된 혈소판이 활성화되었음을 증명하기 위해, 혈액과 ACCa 하이드로겔을 섞어 18시간 후 PDGF-BB가 방출됨을 웨스턴 블롯을 이용하여 검증하였다). 그 결과 음성 대조군(N) 인 혈액속의 PDGF-BB signal intensity는 25.6 ± 9이고, 양성 대조군(P)인 혈액과 물을 섞은 PDGF-BB signal intensity는 20.4 ± 3.3이었으며, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔 혈액 샘플의 PDGF-BB signal intensity는 67.2 ± 3.6이었다. 즉, 본원 발명의 하이드로겔은 대조군 대비 2배 이상의 PDGF-BB 증가를 보였으며, 이는 본원 발명의 하이드로겔에 접착된 혈소판이 대조군들에 비하여 활성화도가 높고, 이로 인해 혈소판 유도 성장 인자를 더욱 다량 방출 하였음을 의미한다(도 5b).Adhered platelets release platelet-derived growth factor (PDGF-BB) through activation, and the released platelet growth factor induces cell proliferation and angiogenesis to play an important role in wound healing. Therefore, in order to prove that the platelets adhered to the ACCa hydrogel of the present invention were activated, blood and ACCa hydrogel were mixed and PDGF-BB was released after 18 hours was verified using Western blot). As a result, the PDGF-BB signal intensity in the negative control (N) blood was 25.6 ± 9, and the positive control (P) PDGF-BB signal intensity mixed with blood and water was 20.4 ± 3.3, and the ACCa hydrogel blood of the present invention The PDGF-BB signal intensity of the sample was 67.2 ± 3.6. That is, the hydrogel of the present invention showed an increase of PDGF-BB more than 2 times compared to the control group, which means that the platelets adhered to the hydrogel of the present invention have a higher activity than the control group, thereby increasing the platelet-derived growth factor This means that it was released (Fig. 5b).

하이드로겔 표면에의 혈소판 접착은 SEM 이미지를 통해서도 확인하였다. 혈액과 ACCa하이드로겔을 섞은 혼합물을 1분 및 5분 뒤에 세척하여, NBS 고정 용액에 담근 후 에탄올 드라잉을 시켜 표면을 관찰하였다. 음성 대조군과 비교 시, 1분간 혈액에 노출된 ACCa 하이드로겔의 표면에는 1~2 μm 크기의 혈소판이 접착되기 시작하였고, 5분 뒤 ACCa 하이드로겔 표면 위에는 다량의 혈소판들이 빽빽하게 위치하고 있음을 확인하였다(도 5c).Platelet adhesion to the hydrogel surface was also confirmed through SEM images. The mixture of blood and ACCa hydrogel was washed after 1 and 5 minutes, immersed in NBS fixing solution, and dried in ethanol to observe the surface. Compared to the negative control, platelets of 1 to 2 μm in size began to adhere to the surface of the ACCa hydrogel exposed to blood for 1 minute, and after 5 minutes, it was confirmed that a large number of platelets were densely located on the surface of the ACCa hydrogel ( Fig. 5c).

[실험예 4] 하이드로겔의 생체 적합성 확인[Experimental Example 4] Confirmation of biocompatibility of hydrogel

본 발명의 ACCa 하이드로겔이 세포 증식에 적합한 환경을 제공할 수 있는지를 확인하기 위해, Hela 세포를 ACCa 하이드로겔 속에 넣어 7일간 배양한 후 dead or live staining을 진행하였다. 그 결과, 배양 후 1일차에 Hela 세포들이 균일하게 하이드로겔의 3D 구조에 분포되었으며 독성이 없음을 확인하였다. 배양 후 7일차에 Hela 세포들은 증식 과정을 거치면서 덩어리로 뭉쳐 자라났고 세포독성이 없음을 확인하여, ACCa 하이드로겔의 세포 적합성이 우수하다는 것을 입증하였다(도 5d).In order to confirm whether the ACCa hydrogel of the present invention can provide an environment suitable for cell growth, Hela cells were placed in the ACCa hydrogel and cultured for 7 days, and then dead or live staining was performed. As a result, on the first day after culture, Hela cells were uniformly distributed in the 3D structure of the hydrogel and it was confirmed that there was no toxicity. On day 7 after culture, Hela cells grew in clumps while undergoing a proliferative process, and it was confirmed that there was no cytotoxicity, proving that the ACCa hydrogel had excellent cytocompatibility (FIG. 5d).

[실험예 5] 하이드로겔의 지혈 효과 확인 -in vivo 실험[Experimental Example 5] Confirmation of hemostatic effect of hydrogel - in vivo experiment

본 발명의 ACCa 하이드로겔의 지혈 성능을 테스트하기 위해, 마우스의 꼬리를 4cm로 절단한 후 출혈 시간과 출혈량을 음성 대조군과 비교하였다. 자연 출혈(음성 대조군)의 경우, 13분 동안 366 ± 28 mg의 출혈이 발생하였으며 13분 이후 자연적으로 출혈이 멈췄다. 반면, 본 발명의 ACCa 하이드로겔을 사용하였을 시 출혈 시간은 1분 동안 28 ± 6 mg 의 출혈량이 발생하여, 음성 대조군 대비 출혈 시간과 출혈량 모두 10배 이상 단축시킨 결과를 보였다(도 6a 및 도 6b).In order to test the hemostatic performance of the ACCa hydrogel of the present invention, the tail of the mouse was cut to 4 cm, and the bleeding time and amount of blood loss were compared with those of the negative control group. In the case of spontaneous bleeding (negative control group), 366 ± 28 mg of bleeding occurred in 13 minutes and bleeding stopped spontaneously after 13 minutes. On the other hand, when the ACCa hydrogel of the present invention was used, the bleeding time was 28 ± 6 mg for 1 minute, resulting in a reduction of more than 10 times in both bleeding time and bleeding amount compared to the negative control group (FIGS. 6a and 6b). ).

이는 본 발명의 ACCa 하이드로겔이 응급 지혈제로 응용 가능함을 충분히 시사해주는 것이다.This sufficiently suggests that the ACCa hydrogel of the present invention can be applied as an emergency hemostatic agent.

[실험예 6] 하이드로겔의 상처 치유 효과 확인 -in vivo 실험[Experimental Example 6] Confirmation of wound healing effect of hydrogel - in vivo experiment

지혈 후에는, 상처 회복 과정이 자연적으로 뒤따르며 본 발명 ACCa 하이드로겔은 혈소판의 활성으로 방출된 혈소판 성장인자를 방출하여 상처 회복을 촉진시킬 것으로 예상하였다.이에, 본 발명의 ACCa 하이드로겔의 in vivo 상처치유 성능을 테스트 하기 위하여, 도 7a와 같이 Rat 모델에 직경 5 mm 둥근 상처를 낸 후, 0, 5, 10, 및 15일 동안 상처 회복률(수축률)과 상처 단면 회복 두께를 측정하였다. Rat의 자연적 회복을 음성 대조군으로, 병원에서 흔히 사용되는 surgicel 과 fibrin(tisseel) 지혈제를 양성 대조군으로 비교하였다. 5일차에 모든 샘플은 25% 이하의 유사한 상처 회복률을 보였다. 그러나 10일차 경과 시 surgicel(48 ± 6.2%)과 자연회복(52 ± 4.1%)과 비교하여, 하이드로겔(71 ± 3.8%)과 피브린(73 ± 5.3%)에서 눈에 띄는 상처 회복이 나타났다. 15일차 경과 시 하이드로겔(92 ± 2.4%)과 피브린 (94 ± 2.2%)의 상처 회복률은 90%으로 회복 속도가 빠른 반면, surgicel (73 ± 2.3%)과 자연회복(70 ± 1.8%) 그룹은 상대적으로 더딘 상처 회복률을 보였다. 본 발명의 ACCa 하이드로겔이 피브린과 유사한 상처 회복률을 보이는 것은 동물 지혈 추출물인 피브린 또한 혈소판 접착과 활성을 이용한 동일한 메커니즘을 가지기 때문이라고 짐작된다. 그러나, 본 발명의 하이드로겔은 피브린 보다 저렴한 가격으로 대량 생산 및 공급이 가능하며, 보관과 사용에 있어서도 사용자의 편의성을 높여 더욱 경쟁력이 있다고 판단된다. After hemostasis, the wound healing process naturally follows, and the ACCa hydrogel of the present invention is expected to promote wound healing by releasing platelet growth factor released by platelet activation. Accordingly, the in vivo In order to test the wound healing performance, after giving a round wound with a diameter of 5 mm to the rat model as shown in FIG. The rat's natural recovery was compared as a negative control, and surgicel and fibrin (tisseel) hemostatic agents commonly used in hospitals were compared as positive controls. At day 5, all samples showed similar wound healing rates of less than 25%. However, by day 10, significant wound healing was observed with hydrogel (71 ± 3.8%) and fibrin (73 ± 5.3%) compared to surgicel (48 ± 6.2%) and spontaneous recovery (52 ± 4.1%). On the 15th day, the wound healing rate of hydrogel (92 ± 2.4%) and fibrin (94 ± 2.2%) was 90%, which was fast, whereas the surgicel (73 ± 2.3%) and spontaneous recovery (70 ± 1.8%) groups showed a relatively slow wound healing rate. It is assumed that the reason why the ACCa hydrogel of the present invention shows a wound recovery rate similar to that of fibrin is that fibrin, an animal hemostatic extract, also has the same mechanism using platelet adhesion and activity. However, the hydrogel of the present invention can be mass-produced and supplied at a lower price than fibrin, and is considered to be more competitive by increasing user convenience in storage and use.

또한, 상처 회복 정도를 심층적으로 파악하기 위해, Hematoxylin and Eosin staining을 통하여 10일차와 15일차의 상처 회복 단면들을 비교하여 두께를 측정하였다. 그 결과, 눈에 띄는 상처 회복을 보이는 10일차의 상처 단면 두께는 하이드로겔과(719 ± 23 μm), 피브린(728 ± 28 μm)이 surgicel(508 ± 21 μm)과 자연회복(517 ± 32 μm)보다 두꺼우며 앞선 상처 회복률과 일치하는 결과를 보여주었다 (도 7c및 도7d).In addition, in order to understand the degree of wound healing in depth, the thickness was measured by comparing wound healing cross sections on the 10th and 15th days through Hematoxylin and Eosin staining. As a result, the thickness of the wound section on day 10 showing remarkable wound healing was 719 ± 23 μm with hydrogel and 728 ± 28 μm with fibrin, 508 ± 21 μm with surgicel and 517 ± 32 μm with natural healing (517 ± 32 μm). ) and showed results consistent with the previous wound recovery rate (Fig. 7c and Fig. 7d).

Claims (17)

하이드로겔로서,
상기 하이드로겔은,
키토산 유도체; 알긴산 유도체; 및 금속 이온을 포함하고,
상기 키토산 유도체는,
하기 화학식 3의 물질을 포함하고,
<화학식 3>
.
상기 알긴산 유도체는,
하기 화학식 4의 물질을 포함하는, 하이드로겔.
<화학식 4>
As a hydrogel,
The hydrogel,
chitosan derivatives; alginic acid derivatives; and metal ions;
The chitosan derivative,
Including a substance of Formula 3 below,
<Formula 3>
.
The alginic acid derivative,
A hydrogel comprising a material represented by Formula 4 below.
<Formula 4>
 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 금속 이온은, 2가 금속 이온을 포함하는, 하이드로겔.According to claim 1,
The metal ion comprises a divalent metal ion, a hydrogel. 제1항에 있어서,
상기 금속은, 칼슘을 포함하는, 하이드로겔.According to claim 1,
The metal comprises calcium, hydrogel. 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은,
상처 치유용, 또는 지혈용인, 하이드로겔.According to claim 1,
The hydrogel,
A hydrogel for wound healing or hemostasis. 제1항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 하이드로겔은, 약학적 조성물을 포함하는, 하이드로겔.The hydrogel of any one of claims 1 and 14 to 16 comprising a pharmaceutical composition.
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