KR102562736B1 - 혈관 평활근 세포의 배양 방법 - Google Patents

혈관 평활근 세포의 배양 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102562736B1
KR102562736B1 KR1020177023972A KR20177023972A KR102562736B1 KR 102562736 B1 KR102562736 B1 KR 102562736B1 KR 1020177023972 A KR1020177023972 A KR 1020177023972A KR 20177023972 A KR20177023972 A KR 20177023972A KR 102562736 B1 KR102562736 B1 KR 102562736B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
smooth muscle
cells
vascular smooth
muscle cells
medium
Prior art date
Application number
KR1020177023972A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170125027A (ko
Inventor
이츠코 이시이
타츠로 카나키
마사키 키타하라
Original Assignee
닛산 가가쿠 가부시키가이샤
고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 닛산 가가쿠 가부시키가이샤, 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠 filed Critical 닛산 가가쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20170125027A publication Critical patent/KR20170125027A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102562736B1 publication Critical patent/KR102562736B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는, 혈관 평활근 세포의 배양 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는, 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 배지 조성물 중에 혈관 평활근 세포를 현탁시키는 것을 포함하는, 혈관 평활근 세포의 보존 방법을 제공한다. 상기 구조체는, 예를 들어, 탈아실화된 젤란검을 포함한다.

Description

혈관 평활근 세포의 배양 방법
본 발명은 혈관 평활근 세포의 배양 기술에 관한 것이다.
혈관을 구성하는 혈관 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 (이하, 혈관 세포)는, 시험관 내 실험을 위한 1차 배양 세포로서 자주 사용되며, 수립 세포주는 거의 없다. 1차 배양 혈관 세포는, 수립 세포와는 달리, 생체 내 혈관 세포의 본래 성질이 남아있는 반면, 계대 및 동결보존에 의해 형질 변환을 일으키기 쉬운 경향이 보고된 바 있다. 특히, 혈관 평활근 세포를 평판 배양 (단층 배양 : 2차원 배양)하여 통상적인 배양을 실시하면, 상기 세포가 증식하여 수축 능력이 저하하는 등의 형질 변화를 나타낸다. 이러한 형질 변화를 회피하기 위해, 하기 3가지 방법이 개발되었다. (1) 타입 I 콜라겐 겔 상에서의 배양. 혈관 평활근 세포는 증식이 정지된 상태로 배양될 수 있다 (비특허문헌 1). (2) 타입 I 콜라겐을 주성분으로서 포함하는 3차원 매트릭스를 사용한 배양 (비특허문헌 2). 이 경우, 세포 증식은 정지되고, 혈관 평활근 세포 본래의 수축 능력이 회복된다. (3) 일반적으로 젤라틴코트 상에서의 혈관 내피 세포의 배양.
그러나, 각 배양 방법에는 각각의 문제점이 있다. (1)의 방법은 장기 배양에 적합하지 않다. 따라서, 배양 3 내지 5일째에 콜라겐 겔을 용해시켜 혈관 평활근 세포를 단리할 필요가 있다. 단리하지 않고 그대로 배양하면, 세포 증식이 시작되어 종래의 2차원 배양과 같은 결과를 가져온다. 따라서, 생체에서와 가까운 형질을 유지할 수 없다. (2)의 타입 I 콜라겐 3차원 매트릭스를 이용한 배양은, 혈관 평활근 세포가 생체에서와 가까운 형질을 가지기까지 약 1주일이 필요하다. 게다가, 배양 상태에서의 보존은 불가능하기 때문에, 임상 적용이 어렵다. (3)의 젤라틴코트를 사용한 배양은, 종래의 2차원 배양법과 크게 차이가 없다.
이상과 같이, 현재의 혈관 세포의 배양 기술에서는, 세포의 형질 변환을 회피할 수 없고 (2차원 배양법), 장기 배양의 곤란성 또는 번잡성 (3차원 배양법) 때문에, 혈관 세포를 사용한 평가 방법의 개발, 혈관 세포의 수송 방법, 혈관 세포의 생체 내 이식 등이 매우 제한적이다. 또한, 배양 용기 표면을 세포 부착을 저해하는 재료로 코팅하거나 특수 가공을 실시함으로써 세포 부착을 저해하여 혈관 평활근 세포를 배양하여도, 그 생존율은 급격히 저하된다. 따라서, 배양 물질로부터 혈관 세포로의 자극을 최소한으로 억제하면서 약제 등의 평가를 간단히 할 수 있는 배양 환경, 간단한 세포 회수, 및 세포 수송을 위한 세포의 형질 변환을 일으키키 어려운 비동결 환경을 실현하는 배양 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은, 액체 배지의 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 현탁 상태를 유지하면서 세포나 조직을 배양할 수 있는 배지 조성물을 성공적으로 개발하였다 (특허문헌 1 및 2).
국제공개특허 WO2014/017513 A1 미국공개특허 US2014/0106348 A1
Koyama et al., Cell 1996; 87: 1069-78 Ishii et al., Atherosclerosis 2001; 158: 377-84
본 발명의 목적은 형질 변화를 피하면서 장기간에 걸쳐 혈관 평활근 세포를 증식시키는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 액체 배지의 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 현탁 상태를 유지하면서 세포나 조직을 배양할 수 있는 배지 조성물 중에서 암 세포 등을 현탁 배양하면, 상기 세포 증식이 플레이트 상에 부착 배양한 경우보다도 더욱 촉진되는 것을 발견한 바 있다 (특허문헌 1). 혈관 평활근 세포를 현탁 상태를 유지한 채로 세포나 조직을 배양할 수 있는 배지 조성물에서 현탁 배양하면, 뜻밖에도 양호한 생존력을 유지하면서 세포 주기가 정지되고, 세포 증식은 억제되며, 형질 변화의 위험성을 회피하면서 장기간 유지할 수 있다는 것을 발견하였다.
이러한 발견에 근거하여, 본 발명자들은 추가 연구를 수행함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
[1] 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 혈관 평활근 세포의 배양 방법.
[2] 상기 [1]에 있어서, 세포 증식-정지 상태의 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 방법.
[3] 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 혈관 평활근 세포의 세포 증식을 억제하는 방법.
[4] 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물 중에 혈관 평활근 세포를 현탁시키는 것을 포함하는 혈관 평활근 세포의 보존 방법.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 구조체가 탈아실화된 젤란검을 포함하는 방법.
[6] 상기 [5]에 있어서, 상기 배지 조성물이 0.005 내지 0.3% (w/v) 농도의 탈아실화된 젤란검을 포함하는 방법.
[7] 0.005 내지 0.3% (w/v) 농도의 탈아실화된 젤란검을 포함하는 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는, 혈관 평활근 세포의 배양 방법.
[8] 0.005 내지 0.3% (w/v) 농도의 탈아실화된 젤란검을 포함하는 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 배지 조성물 중에 혈관 평활근 세포를 현탁시키는 것을 포함하는, 혈관 평활근 세포의 보존 방법.
본 발명에 따르면, 혈관 평활근 세포는 세포 증식을 억제하면서 장기간 시험관 내에서 유지될 수 있다. 본 발명에 따르면, 혈관 평활근 세포는 동결 작업이 없는 조건하에서 수송될 수 있으며, 동결 또는 부착시에 관찰되는 세포의 형질 변화가 최소한으로 억제되는 것이 기대된다. 본 발명은 혈관 평활근 세포를 사용한 재생의학의 발전에 기여한다.
도 1은 웨스턴 블랏팅에 의한 혈관 평활근 세포 내 세포 주기 관련 단백질 발현 분석을 나타낸다.
도 2는 웨스턴 블랏팅에 의한 혈관 평활근 세포 내 세포 주기 관련 단백질 발현 분석을 나타낸다.
도 3은 웨스턴 블랏팅에 의한 NIH3T3 세포 내 세포 주기 관련 단백질 발현 분석을 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블랏팅에 의한 혈관 평활근 세포 내 세포 주기 관련 단백질 발현 분석을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블랏팅에 의한 NIH3T3 세포 내 세포 주기 관련 단백질 발현 분석을 나타낸다.
도 6은 혈관 평활근 세포의 증식 및 생존율의 경시적 변화를 나타낸다. A: 총 세포 수, B: 생존율. 흰색원: 플레이트상에 부착 배양한 세포를 플레이트에 접종하여 추가로 부착 배양을 실시함. 검은색원: 탈아실화된 젤란검을 포함하는 배지에서 현탁 배양한 세포를 플레이트에 접종하여 부착 배양을 실시함.
(1) 본 발명에 사용된 배지 조성물
본 발명에 사용된 배지 조성물은 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물이다. 상기 배지 조성물은 현탁 상태를 유지하면서목적하는 세포 (즉, 혈관 평활근 세포) 또는 이를 포함하는 조직을 배양할 수 있다. 상기 배지 조성물은 WO 2014/017513 A1 및 US 2014/0106348 A1에 기재된 설명에 따라 조제할 수 있다. 이하, 상기 배지 조성물을 배지 조성물 I라고 한다.
세포는 동물을 구성하는 가장 기본 단위이며, 그 요소로서 세포막 내부에 세포질과 각종 세포소기관을 가진다.
본 발명에 따른 세포 및/또는 조직의 현탁이란, 배양 용기에 세포 및/또는 조직이 부착하지 않은 상태 (비부착)인 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 세포 및/또는 조직을 증식, 분화 또는 유지시킬 때, 액체 배지 조성물에 대한 외부로부터의 압력이나 진동 또는 당해 조성물에서의 진탕, 회전 조작 등을 수반하지 않고 세포 및/또는 조직이 당해 액체 배지 조성물 중에서 균일하게 분산되어 현탁 상태인 상태를 "정치 현탁 (static suspension)"이라고 하며, 당해 상태에서 세포 및/또는 조직을 배양하는 것을 "정치 현탁 배양"이라고 한다. 또한, "정치 현탁"에 있어서 현탁시킬 수 있는 기간으로는 5분 이상, 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 7일 이상 등이 포함되지만, 현탁 상태가 유지되는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물은 세포 및/또는 조직의 유지 또는 배양이 가능한 온도 범위 (예를 들어, 0 내지 40℃)의 적어도 하나의 지점에서 세포 및/또는 조직의 정치 현탁을 가능하게 한다. 본 발명에 사용되는 배지 조성물은 바람직하게는 25 내지 37℃의 온도 범위에서 적어도 하나의 지점에서 세포 및/또는 조직의 정치 현탁을 가능하게 하며, 가장 바람직하게는 37℃이다.
정치 현탁의 가능 여부는, 예를 들어, 배양하고자 하는 세포를 2 x 104 세포/ml의 농도로 평가하고자 하는 배지 조성물 중에 균일하게 분산시키고, 15 ml 코니컬 튜브에 10 ml 주입하고 적어도 5분 이상(예를 들어, 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 7일 이상), 37℃에서 정치하고, 상기 세포의 현탁 상태가 유지되는지 여부를 관찰하였다. 총 세포의 70% 이상이 현탁 상태일 경우, 현탁 상태가 유지되는 것으로 정하였다. 세포를 대신하여 폴리스티렌 비즈 (사이즈 500 내지 600 μm. Polysciences Inc. 제조)를 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물은, 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 (바람직하게는 정치 현탁 배양) 구조체 및 배지를 포함하는 조성물이다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물은, 바람직하게는 배양시의 상기 배지 조성물의 교환 및 배양 종료 후의 배지 조성물로부터 세포 또는 조직의 회수가 가능한 조성물이다. 보다 바람직하게는, 배지 조성물로부터의 세포 또는 조직의 회수시, 온도 변화, 화학 처리, 효소 처리 및 전단력 (shear force)의 어느 것도 필요로 하지 않는 조성물이다.
본 발명에 따른 구조체란, 특정 화합물로부터 형성된 것으로, 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁시키는 효과를 나타내는 것이다. 보다 구체적으로는, 고분자 화합물이 이온을 통해 집합한 것, 또는, 고분자 화합물이 3차원 네트워크를 형성한 것 등이 포함된다. 또한, 다당류가 금속 이온을 통해 마이크로 겔을 형성하는 것은 공지된 것이며 (예를 들어, 일본특허공개 2004-129596호 공보), 본 발명의 구조체는 일 실시양태로서 이러한 마이크로 겔을 포함한다. 고분자 화합물이 이온을 통해 집합한 일 실시양태는 필름 구조를 들 수 있다.
본 발명에 따른 구조체의 크기는 필터를 통과할 때 0.2 μm 내지 200 μm의 기공 크기를 가지는 필터를 통과시키는 크기가 바람직하다. 기공 크기의 하한은 1 μm 초과인 것이 보다 바람직하고, 세포 또는 조직의 안정치 현탁을 고려하면 5 μm 초과인 것이 더욱 바람직하다. 기공 크기의 상한은 바람직하게는 100 μm 이하이고, 세포 또는 조직의 크기를 고려하면 더욱 바람직하게는 70 μm 이하이다.
본 발명에 있어서 특정 화합물은, 액체 배지와 혼합시에 액체 중에 균일하게 분산된 부정형의 구조체를 형성하고, 액체의 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 세포 및/또는 조직을 실질적으로 유지하는 화합물을 말하며, 그의 침전물을 방지하는 효과를 발휘한다. 상기 "액체의 점도를 실질적으로 증가시키지 않은" 것이란, 상기 액체의 점도가 8 mPa·s를 초과하지 않는 것을 의미한다. 이 경우, 상기 액체의 점도 (즉, 본 발명에 사용된 배지 조성물의 점도)는 37℃에서 8 mPa·s 이하이며, 바람직하게는 4 mPa·s 이하이고, 보다 바람직하게는 2 mPa·s 이하이다. 또한, 상기 화학 구조체를 액체 배지 중에 형성하여, 상기 액체의 점도를 실질적으로 상승시키지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁 (바람직하게는 정치 현탁)시키는 효과를 나타내는 것이라면, 특정 화합물의 화학구조, 분자량, 형질 등에 어떠한 제한도 없다.
구조체를 포함하는 액체의 점도는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로는, 37℃ 조건하에서 E-형 점도계 (Toki Sangyo Co., Ltd. 제조, TV-22 형 점도계, 모델: TVE-22I, 콘 로터 (corn roter): 표준 로터 1°34’x R24, 회전수 100 rpm)를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물의 예로는, 특별히 제한되는 것은 아니나, 고분자 화합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 음이온성 작용기를 가지는 고분자 화합물을 들 수 있다.
음이온성 작용기로는, 카르복실기, 설포기, 인산기 및 이들의 염을 들 수 있으며, 카르복실기 또는 이의 염이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 고분자 화합물로는, 상기 음이온성 작용기로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 고분자 화합물의 바람직한 구체예로는, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 단당류 (예를 들어, 트리오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 등)가 10개 이상 중합된 다당류를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는, 음이온성 작용기를 가지는 산성 다당류를 들 수 있다. 여기서, 상기 산성 다당류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 우론산 (예를 들어, 글루쿠론산 (glucuronic acid), 이두론산 (iduronic acid), 갈라투론산 (galacturonic acid), 만누론산 (mannuronic acid))을 가지는 다당류, 구조 중 일부에 황산기 또는 인산기를 가지는 다당류, 및 그 두 구조를 가지는 다당류로서 천연에서 얻을 수 있는 다당류뿐만 아니라, 미생물로부터 생산된 다당류, 유전공학적으로 생산된 다당류, 및 효소를 이용하여 인공적으로 합성된 다당류도 포함된다. 보다 구체적으로는, 히아루론산, 젤란검, 탈아실화된 젤란검 (이하, DAG 라고 하는 경우도 있음), 람산검 (rhamsan gum), 디우탄검 (diutan gum), 크산탄검 (xanthan gum), 카라기난 (carageenan), 크산탄검 (xanthan gum), 헥스론산 (hexuronic acid), 후코이단 (fucoidan), 펙틴, 펙트산, 펙틴산 (pectinic acid), 헤파란 설페이트 (heparan sulfate), 헤파린, 헤파리틴 설페이트 (heparitin sulfate), 케라토설페이트 (keratosulfate), 콘드로이틴 설페이트 (chondroitin sulfate), 데르마탄 설페이트 (dermatan sulfate), 람난 설페이트 (rhamnan sulfate) 및 이들의 염기로부터 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상으로 구성되는 고분자 화합물이 포함된다. 다당류는, 바람직하게는 히아루론산, DAG, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 또는 이의 염일 수 있으며, 저농도에서 세포 또는 조직을 현탁시키는 능력 및 세포 또는 조직 회수의 용이성 때문에, 가장 바람직하게는, DAG이다.
여기서 상기 염은, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리 금속염, 칼슘, 바륨, 마그네슘과 같은 알칼리 토금속염, 및 알루미늄, 아연, 구리, 철, 암모늄, 유기염기 및 아미노산 등의 염을 들 수 있다.
이러한 고분자 화합물 (다당류 등)의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 10,000 내지 50,000,000이고, 보다 바람직하게는, 100,000 내지 20,000,000이고, 더욱 바람직하게는 1,000,000 내지 10,000,000이다. 예를 들어, 상기 분자량은 겔투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 플루란에 기초하여 측정될 수 있다.
또한, 인산화된 DAG도 사용될 수 있다. 상기 인산화는 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서, 상술한 다당류의 복수종 (바람직하게는 2종)을 조합하여 사용할 수 있다. 상기 다당류의 조합의 종류는, 상술한 구조체가 액체 배지 중에서 형성되고, 액체의 점도를 실질적으로 증가시키지 않으면서 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁(바람직하게는 정치 현탁)시킬 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 조합은 적어도 DAG 또는 이의 염을 포함한다. 즉, 다당류의 바람직한 조합에는 DAG 또는 이의 염, DAG 또는 이의 염 이외의 다당류 (예를 들어, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검, 메틸셀룰로오스, 로커스빈검 또는 이들의 염)이 포함된다. 구체적인 다당류의 조합의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, DAG와 람산검, DAG와 디우탄검, DAG와 크산탄검, DAG와 카라기난, DAG와 크산탄검, DAG와 로커스트빈검, DAG와 k-카라기난, DAG와 소듐알지네이트, DAG와 메틸셀룰로오스 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물의 보다 바람직한 구체예로는, 히아루론산, 탈아실화된 젤란검, 디우탄검, 카라기난 및 크산탄검 및 이들의 염을 들 수 있다. 가장 바람직한 예로는, 배지 조성물의 점도를 낮게하고, 세포 또는 조직의 회수 용이성 때문에 탈아실화된 젤란검 및 이의 염을 들 수 있다.
본 발명에서 탈아실화된 젤란검은 1-3 결합된 글루코스, 1-4 결합된 글로쿠론산, 1-4 결합된 글루코스 및 1-4 결합된 람노스의 4분자의 당을 구성단위로 하는 직쇄상의 고분자 다당류 (하기 화학식 (I)의 다당류)이며, 여기서 R1, R2는 각각 수소 이온이고, n은 1 또는 2 이상의 정수이다. R1은 글리세릴기를 포함할 수 있으며, R2는 아세틸기를 포함할 수 있고, 상기 아세틸기 및 글리세릴기의 함량은 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하이다.
본 발명에서 구조체는 특정 화합물에 따라 다양한 형태를 취한다. 탈아실화된 젤란검의 경우, 액체 배지와 혼합할 때 액체 배지 중의 금속 이온 (예를 들어, 칼슘 이온)을 취하여 금속 이온을 통해 부정형의 구조체를 형성하고, 세포 및/또는 조직을 현탁시킨다. 탈아실화된 젤란검으로부터 제조된 본 발명에서 사용된 배지 조성물의 점도는 세포 또는 조직의 회수 용이성의 관점에서 8 mPa·s 이하, 바람직하게는 4 mPa·s 이하, 보다 바람직하게는 2 mPa·s 이하이다.
본 발명에서 특정 화합물은, 화합합성법에 의해 수득될 수 있다. 상기 화합물이 천연물인 경우, 상기 화합물을 포함하고 있는 각종의 식물, 각종의 동물, 각종의 미생물로부터 종래의 기술에 의해 추출, 분리 및 정제되어 수득되는 것이 바람직하다. 추출은 물 또는 초임계 가스를 사용하여 효율적으로 추출할 수 있다. 예를 들어, 젤란검의 제조 방법으로서, 발효 배지에서 생산 미생물을 배양하고, 균체외에서 생산되는 점막 물질을 일반적인 정제 방법으로 회수하고, 건조시킨 다음, 분쇄 등을 통해 분말화한다. 또한, 탈아실화된 젤란검의 경우는, 점막 물질을 회수할 때, 알칼리 처리를 실시하고, 1-3 결합한 글루코스 잔기에 결합된 글리세릴기와 아세틸기를 탈아실화하고 회수한다. 정제방법으로는, 액체-액체 추출, 분별 침전, 결정화, 여러 종류의 이온교환크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 등을 이용한 겔 여과 크로마토그래피, 활성탄, 실리카겔 등을 이용한 흡착 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피에 의한 활성물질의 흡탈착처리, 역상컬럼을 이용한 고속액체크로마토그래피 등을 단독 또는 임의의 순서로 조합하여, 또는 반복하여 사용함으로써, 불순물을 제거하여 정제할 수 있다. 젤란검의 생산 미생물의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 스핑고모나스 엘로데아 (Sphingomonas elodea) 및 상기 미생물을 유전적으로 변형시킨 미생물을 들 수 있다.
탈아실화된 젤란검의 경우, 시판의 것, 예를 들어, SANSHO Co., Ltd.의 "KELCOGEL (CP Kelco사의 등록 상표) CG-LA", San-Ei Gen F.F.I., Inc.의 "KELCOGEL (CP Kelco사의 등록 상표)" 등을 사용할 수 있다. 천연 타입의 젤란검으로는, 산에이겐 F.F.I.주식회사 제조의 "KELCOGEL (CP Kelco사의 등록 상표) HT" 등을 사용할 수 있다.
배지 중의 특정 화합물의 농도는, 특정 화합물의 종류에 따르며, 특정 화합물이 상술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 상기 액체의 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 세포 및/또는 조직읠 균일하게 현탁 (바람직하게는 정치 현탁)시킬 수 있는 범위에서 적절히 설정할 수 있다. 통상적으로는, 0.0005% 내지 1.0% (w/v)이고, 바람직하게는 0.001% 내지 0.4% (w/v)이고, 보다 바람직하게는 0.005% 내지 0.1% (w/v)이고, 더욱 바람직하게는 0.005% 내지 0.05% (w/v)이다. 예를 들어, 탈아실화된 젤란검의 경우, 배지 중에 0.001% 내지 1.0% (w/v), 바람직하게는 0.003% 내지 0.5% (w/v), 보다 바람직하게는 0.005% 내지 0.3% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.01% 내지 0.05% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.03% (w/v)를 첨가할 수 있다. 크산탄검의 경우, 배지 중에 0.001% 내지 5.0 % (w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 1.0% (w/v), 보다 바람직하게는 0.05% 내지 0.5% (w/v), 가장 바람직하게는 0.1% 내지 0.2% (w/v)를 첨가할 수 있다. k-카라기난 및 로커스트빈 검 혼합물의 경우, 배지 중에 0.001% 내지 5.0% (w/v), 바람직하게는 0.005% 내지 1.0% (w/v), 보다 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v), 가장 바람직하게는 0.03% 내지 0.05% (w/v)를 첨가할 수 있다. 천연 젤란검의 경우, 배지 중에 0.05% 내지 1.0% (w/v), 바람직하게는 0.05% 내지 0.1% (w/v)를 첨가할 수 있다.
상술한 다당류를 복수종 (바람직하게는 2종) 조합하여 사용하는 경우, 상기 다당류의 농도는, 상기 다당류의 조합이 상술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 상기 액체의 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁 (바람직하게는 정치 현탁)시킬 수 있는 범위에서 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, DAG 또는 이의 염과, DAG 또는 이의 염 이외의 다당류와의 조합을 사용하는 경우, DAG 또는 이의 농도는, 예를 들어, 0.005 내지 0.02% (w/v), 바람직하게는 0.01 내지 0.02% (w/v)이고, DAG 또는 이의 염 이외의 다당류의 농도는, 예를 들어, 0.0001 내지 0.4% (w/v), 바람직하게는 0.005 내지 0.4% (w/v), 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.4% (w/v)이다. 구체적인 농도 범위의 조합은, 이하를 포함한다.
DAG 또는 이의 염: 0.005 내지 0.02% (바람직하게는 0.01 내지 0.02%) (w/v)
DAG 이외의 다당류
크산탄검: 0.1 내지 0.4% (w/v)
소듐 알지네이트: 0.0001 내지 0.4% (w/v) (바람직하게는 0.1 내지 0.4% (w/v))
천연 젤란검: 0.0001 내지 0.4% (w/v)
로커스트빈검: 0.1 내지 0.4% (w/v)
메틸셀룰로오스: 0.1 내지 0.4% (w/v) (바람직하게는 0.2 내지 0.4% (w/v))
카라기난: 0.05 내지 0.1% (w/v)
디우탄검: 0.05 내지 0.1% (w/v)
상기 농도는 하기식으로 산출할 수 있다.
농도 [% (w/v)] = 특정화합물의 무게 (g) / 배지 조성물의 부피 (ml) x 100
상기 화합물은 화합 합성법에 의해 추가로 다른 유도체로 변환할 수 있으며, 이렇게 얻어진 유도체는 본 발명에서 유효하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 탈아실화된 젤란검의 경우, 화학식 (I)로 나타나는 화합물의 R1 및/또는 R2의 하이드록실기를 C1-3 알콕시기, C1-3 알킬설포닐기, 글루코스, 프록토스 등과 같은 단당기, 수크로스, 락토스 등과 같은 올리고당기, 글리신, 아르기닌 등과 같은 아미노산기로 치환한 유도체 역시 본 발명에 사용할 수 있다. 또한, 1-에틸-3-(3-디-메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 등과 같은 가교제를 사용하여 가교시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물 또는 이의 염은 제조 조건에 따라 임의의 결정형으로 존재할 수 있으며, 임의의 수화물로서 존재할 수 있다. 이러한 결정형, 수화물 및 이들의 혼합물 역시 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 또한, 아세톤, 에탄올, 테트라하이드로퓨란 등과 같은 유기 용매를 포함하는 용매화물로서 존재할 수 있다. 그러한 형태는 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물은 고리 내 또는 고리 외 이성질화에 의해 형성되는 호변 이성질체, 기하 이성질체, 호변 이성질체 또는 기하 이성질체의 혼합물 또는 이들의 혼합물의 형태로 존재한 것일 수 있다. 본 발명의 상기 화합물이 비대칭 중심을 가질 경우, 이성체에 의해 형성되는지 여부와 관계없이, 분활된 광학이성질체 또는 임의의 비율로 포함하는 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물은 금속이온, 예를 들어, 2가 금속이온 (칼슘이온, 마그네슘이온, 아연이온, 철이온, 구리이온 등)을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 칼슘이온을 포함할 수 있다. 금속이온의 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, 칼슘이온과 마그네슘이온, 칼슘이온과 아연이온, 칼슘이온과 철이온, 및 칼슘이온과 구리이온을 조합할 수 있다. 당업계의 통상의 기술을 가지는 자는 상기 조합을 적절히 결정할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 배지 조성물은 금속이온 (예를 들어, 칼슘이온)을 포함하기 때문에, 고분자 화합물은 상기 금속이온을 통해 집합하여 고분자 화합물이 3차원 네트워크를 형성함으로써 (예를 들어, 다당류가 금속이온 (예를 들어 칼슘이온)을 통해 마이크로겔을 형성), 본 발명의 구조체가 형성된다. 상기 금속이온의 농도는 특정 화합물이 상술한 구조체를 액체 배지 중에서 형성할 수 있고, 상기 액체 배지의 점도가 실질적으로 증가되지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁 (바람직하게는 정치 현탁)시킬 수 있는 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. 금속이온의 농도는, 이에 제한되지는 않지만, 0.1 mM 내지 300 mM, 바람직하게는 0.5 mM 내지 100 mM이다. 상기 금속이온은 배지와 혼합하거나, 염 용액을 별도로 조제하여 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명에서 사용된 배지 조성물은 후술하는 세포외 매트릭스, 부착 분자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 특정 화합물로 구성된 구조체는, 세포 및/또는 조직을 시험관 내에서 배양할 때에 상기 특정 화합물로 구성된 구조체를 포함하는 액체 중에서 상기 세포 및/또는 조직을 현탁시키는 효과 (바람직하게는 정치 현탁시키는 효과)를 나타낸다. 현탁 효과로 인해, 단층 배양에 비해 일정 체적 당 더욱 증가된 세포수 및/또는 조직수를 배양할 수 있다. 종래의 현탁 배양 방법에서 회전 또는 진탕 조작을 동반하는 경우, 세포 및/또는 조직에 대해 전단력이 작용하기 때문에 세포 및/또는 조직의 증식 속도 및 회수 속도가 저하되거나, 또는 세포 기능이 손상될 수 있다. 특정 화합물로 구성된 구조체를 포함하는 본 발명의 배지 조성물을 이용함으로써, 진탕하는 것과 같은 조작 없이 세포 및/또는 조직을 균일하게 분산시킬 수 있으며, 세포 기능의 손상 없이 대량의 목적하는 세포 및/또는 조직을 용이하게 획득할 수 있다. 또한, 세포 및/또는 조직을 겔 기질을 포함하는 종래의 배지 중에서 현탁 배양할 경우, 세포 및/또는 조직의 관측 또는 회수가 곤란하거나, 회수하는 동안 그 기능이 손상될 수도 있다. 그러나, 본 발명의 특정 화합물로 구성된 구조체를 포함하는 배지 조성물을 사용함으로써, 상기 세포 및/조직을 현탁 배양을 실시할 수 있고, 그 기능에 손상 없이 관찰할 수 있으며, 회수할 수 있다. 또한, 겔 기질을 포함하는 종래 배지는 높은 점도를 보여 배지 교환에 곤란한 경우가 있다. 그러나, 본 발명의 특정 화합물로 구성된 구조체를 포함하는 상기 배지 조성물은 낮은 점도를 가지기 때문에, 피펫, 펌프 등으로 용이하게 교환할 수 있다.
세포 및/또는 조직을 본 발명의 특정 화합물을 이용하여 배양하는 경우, 세포 및/또는 조직을 배양할 때에 사용되는 배지와 특정 화합물을 혼합하여 배지 조성물을 조제할 수 있다. 이러한 배지의 조성에 의한 분류에 따르면, 천연 배지, 반합성 배지 및 합성 배지를 들 수 있다. 형태에 의한 분류에 따르면, 반 고체 배지, 액체 배지, 분말 배지 (분(粉) 배지라고 하는 경우도 있음) 등을 들 수 있다. 세포 및/또는 조직이 포유동물로부터 유래할 경우, 동물 세포 배양에 임의의 배지가 사용될 수 있다. 상기 배지의 예로는, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 햄 F12 배지 (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 막코이 5A (McCoy's 5A) 배지, 이글 MEM 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium; EMEM), αMEM 배지 (alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium; αMEM), MEM 배지 (Minimum Essential Medium), RPMI1640 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E (William medium E), IPL41 배지, Fischer's 배지, StemPro34 (Invitrogen 제조) 배지, X-VIVO 10 (Cambrex Corporation 제조), X-VIVO 15 (Cambrex Corporation 제조), HPGM (Cambrex Corporation 제조), StemSpan H3000 (STEMCELL Technology 제조), StemSpanSFEM (STEMCELL Technology 제조), StemlineI (Sigma Aldrich 제조), QBSF-60 (Qualitybiological 제조), StemPro hESC SFM (Invitrogen 제조), Essential8 (등록 상표) 배지 (Gibco 제조), mTeSR1 또는 2 배지 (STEMCELL Technology 제조), ReproFF 또는 ReproFF2 배지 (ReproCELL 제조), PSGro hESC/iPSC 배지 (System Bioscience 제조), NutriStem (등록 상표) 배지 (Biological Industry 제조), CSTI-7 배지(Cell Science & Technology Institute, Inc. 제조), MesenPRO RS 배지 (Gibco 제조), MF-Medium (등록 상표) 간엽계줄기세포 증식 배지 (TOYOBO CO., LTD. 제조), Sf-900II (Invitrogen 제조), Opti-Pro (Invitrogen 제조) 등이 포함된다.
혈관 평관근 세포의 배양에 사용되는 배지로는, 상기 배지에 세포 부착 인자가 첨가된 것일 수 있으며, 그의 예로는, 매트리젤, 콜라겐젤, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌 및 피브로넥틴이 포함된다. 이러한 세포 부착 인자 요소는, 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다. 또한, 혈관 평활근 세포의 배양에 사용되는 배지에 구아검, 타마린드검, 알긴산 프로필렌글리콜, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스 등의 부착제를 추가로 혼합할 수 있다.
상기 배지에, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인산, 염소, 각종 아미노산, 각종 비타민, 항생물질, 혈청, 지방산, 당 등을 당업자는 목적에 따라 자유롭게 첨가할 수 있다. 포유동물 유래 세포 및/또는 조직의 배양에는, 당업자는 목적에 따라 다른 화학 성분 및 생체성분을 1종 이상 조합하여 첨가할 수 있다.
포유동물 유래 세포 및/또는 조직의 배지에 첨가되는 성분의 예로는, 소태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아셀렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소혈청 알부민, 피루빈산나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로오스, 각종 사이토카인, 각종 호르몬, 각종 증식 인자, 각종 세포외 매트릭스, 각종 세포 부착 분자 등을 포함한다.
배지에 첨가되는 항생물질의 예로는, 설파제 (sulfa drug), 페니실린, 페네시실린 (phenethicillin), 메티실린 (methicillin), 옥사실린 (oxacillin), 클록사실린 (cloxacillin), 디클록사실린 (dicloxacillin), 플루클록사실린 (flucloxacillin), 나프실린 (nafcillin), 암피실린 (ampicillin), 페니실린, 아목시실린 (amoxicillin), 시클라실린 (ciclacillin), 카르베니실린 (carbenicillin), 티카르실린 (ticarcillin), 피페라실린 (piperacillin), 아즐로실린 (azlocillin), 메즐로실린 (mezlocillin), 메실리남 (mecillinam), 안디노실린 (andinocillin), 세팔로스포린 (cephalosporin ) 및 이들의 유도체, 옥솔리닌산 (oxolinic acid), 아미플록사신 (amifloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 날리딕스산 (nalidixic acid), 피로미드산 (Piromidic acid), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 시녹사신 (cinoxacin), 노르플록사신 (norfloxacin), 페르플록사신 (perfloxacin), 로삭사신 (Rosaxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 피페미드산 (pipemidic acid), 설박탐 (sulbactam), 클라뷰란산 (clavulanic acid), β-브로모페니실란산 (β-bromopenisillanic acid), β-클로로페니실란산 (β-chloropenisillanic acid), 6-아세틸메틸렌-페니실란산 (6-acetylmethylene-penisillanic acid), 세폭사졸 (cephoxazole), 설탐피실린 (sultampicillin), 아디노시린 (adinoshirin ) 및 설박탐 포름알데히드 수화물 에스테르 (sulbactam formaldehyde hydrate ester), 타조박탐 (tazobactam), 아즈트레오남 (aztreonam), 설파제틴 (sulfazethin), 이소설파제틴 (isosulfazethin), 노르카르디신 (norcardicin), m-카르복시페놀 (m-carboxyphenol), 페닐아세트아미도포스폰산메틸 (phenylacetamidophosphonic acid methyl), 클로르테트라사이클린 (Chlortetracycline), 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline), 테트라사아클린 (tetracycline), 데메클로사이클린 (demeclocycline), 독시사이클린 (doxycycline), 메탄사이클린 (methacycline) 및 미노사이클린 (minocycline)을 포함한다.
본 발명에서 특정 화합물을 상기 배지에 첨가하는 경우, 상기 특정 화합물은 사용시 적절한 용매 중에 용해되거나 분산된다 (이를, 배지 첨가제라 함). 그 후, 상기 배지 중에서의 특정 화합물의 농도는 상술한 바와 같이, 상기 액체 배지에 점도를 실질적으로 증가시키지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 현탁 (바람직하게는 정치 현탁됨)시킬 수 있는 농도, 예를 들어, 0.0005% 내지 1.0% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 0.4% (w/v), 보다 바람직하게는 0.005% 내지 0.1% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.005% 내지 0.05% (w/v)가 되도록 배지 첨가제를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 탈아실화된 젤란검의 경우, 0.001% 내지 1.0% (w/v), 바람직하게는 0.003% 내지 0.5% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.005% 내지 0.3% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.05% (w/v)를 배지에 첨가할 수 있다. 크산탄검의 경우, 0.001% 내지 5.0% (w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 1.0% (w/v), 보다 바람직하게는 0.05% 내지 0.5% (w/v), 가장 바람직하게는 0.1% 내지 0.2% (w/v)를 배지에 첨가될 수 있다. K-카라기난 및 로커스트빈검 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 5.0% (w/v), 바람직하게는 0.005% 내지 1.0% (w/v), 보다 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v), 가장 바람직하게는 0.03% 내지 0.05% (w/v)이 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 젤란검 및 디우탄검 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.005% 내지 0.01% (w/v) 배지에 첨가될 수 있다. 탈아실화된 젤란검 및 메틸셀룰로오스 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.005% 내지 0.2% (w/v)가 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 탈아실화된 젤란검 및 로커스트빈검 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v)가 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 탈아실화된 젤란검 및 소듐 알지네이트 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v)가 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 탈아실화된 젤란검 및 크산탄검 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v)가 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 탈아실화된 젤란검 및 k-카라기난 혼합물의 경우, 두 화합물의 총량이 0.001% 내지 1.0% (w/v), 가장 바람직하게는 0.01% 내지 0.1% (w/v)가 되도록 배지에 첨가될 수 있다. 상기 농도는 하기 화학식에 의해 계산될 수 있다.
농도 [% (w/v)] = 특정 화합물의 무게 (g) / 배지 조성물의 부피 (ml) x 100
여기서 배지 첨가물로 사용되는 적절한 용매의 예로는, 물, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 각종 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 부틸렌글리콜 등) 등과 같은 수성 용매를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 특정 화합물의 농도는 0.001% 내지 5.0% (w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 1.0% (w/v), 보다 바람직하게는 0.1% 내지 0.6% (w/v)이다. 또한, 특정 화합물의 효과를 향상시키기 위해 첨가제를 추가하거나 사용시 농도를 낮추는 것도 가능하다. 그러한 첨가제의 예로는 구아검, 알긴산 프로필렌글리콜 에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아가로스, 타마린드 씨드검, 풀루란 등과 같은 다당류를 1종 이상 첨가할 수 있다. 또한, 상기 특정 화합물을 배양 할 때, 담체 표면상에 고정화 또는 담체 내부에 담지하여 사용할 수도 있다. 상기 특정 화합물은, 제공시 또는 보존시에 임의의 형태를 가질 수 있다. 상기 특정 화합물은 정제, 환제, 캡슐제, 과립제와 같은 제제화된 고체, 적절한 용매 및 용해제로 용해한 용액 또는 현탁액과 같은 액체, 또는 기판이나 단일 물체에 결합된 상태일 수 있다. 제제화에 사용되는 첨가제의 예로는, p-히드록시벤조산 에스테르 등의 방부제; 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니트 등의 부형제; 스테아린산 마그네슘, 탈크 등의 윤활제; 폴리비닐알코올, 히드록시프로필 셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제; 지방산 에스테르 등의 계면활성제; 글리세린 등의 가소제 등을 포함한다. 이러한 첨가제는 상기한 것에 한정되는 것이 아니며, 당업자가 이용 가능하다면 자유롭게 선택할 수 있다. 본 발명의 특정 화합물은 필요에 따라 멸균처리를 실시할 수 있다. 멸균 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드가스 멸균, 오토클레이브 멸균, 필터 멸균 등을 들 수 있다. 필터 멸균 (이하, 여과 멸균이라 하는 경우도 있음) 을 실시할 경우, 필터 부분의 재질은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 유리 섬유, 나일론, 폴리에스테르설폰 (polyethersulfone, PES), 친수성 폴리불화비닐리덴 (polyvinylidene fluoride, PVDF), 셀룰로오스 혼합 에스테르, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 들 수 있다. 상기 필터의 기공 크기는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는, 0.1 μm 내지 10 μm, 보다 바람직하게는 0.1 μm 내지 1 μm, 가장 바람직하게는 0.1 μm 내지 0.5 μm 이다. 이러한 멸균 처리는 특정 화합물이 고체 상태 또는 액체 상태일 때도 적용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 상기에서 제조된 특정 화합물의 용액 또는 분산액을 액체 배지에 첨가함으로써 액체 배지 중에서 상술한 구조체를 형성시켜 수득할 수 있다. 일반적으로 배지는 고분자 화합물을 집합, 또는 이온을 통해 고분자 화합물의 3차원 네트워크를 형성시키기 위해 충분한 농도의 금속이온 (예를 들어, 칼슘이온 등의 2가 금속이온)을 포함하기 때문에, 본 발명에 사용되는 상기 배지 조성물은 본 발명의 특정 화합물의 용액 또는 분산액을 액체 배지에 첨가하는 것만으로도 수득할 수 있다. 또는, 배지 첨가제 (특정 화합물의 용액 또는 분산액)를 배지에 첨가하여도 좋다. 또한, 본 발명에 사용되는 상기 배지 조성물은 특정 화합물과 배지 성분을 수성 용매 (예를 들어,이온 교환수나 초순수 (ultrapure water) 등을 포함하는 물) 중에서 혼합하여 조제할 수도 있다. 혼합의 양태의 예로, 이에 제한되지 않으나, (1) 액체 배지와 배지 첨가제 (용액)를 혼합, (2) 상기의 고분자 화합물 (분말 등의 고체)를 액체 배지에 혼합, (3) 분말 배지를 배지 첨가제 (용액)에 혼합, (4) 분말 배지와 상기 고분자 화합물 (분말 등의 고체)를 수성 용매에 혼합 등을 포함한다. 본 발명에 사용되는 상기 배지 조성물 중의 특정 화합물을 불균일하게 분산되는 것을 막기 위해, (1) 또는 (4), 또는 (1) 또는 (3) 이 바람직하다.
특정 화합물을 용매 (예를 들어, 물, 액체 배지 등의 수성 용매)에 용해시키거나, 또는 특정 화합물과 분말 배지를 용매에 용해시킬 경우, 상기 혼합물을 가열하여 용해를 촉진시키는 것이 바람직하다. 가열 온도는, 예를 들어, 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 100℃ 내지 125℃ (예를 들어, 121℃) 에서 가열 멸균을 실시한다. 가열 후, 수득된 특정 화합물의 용액은 실온으로 냉각한다. 상기 용액에 상술한 금속이온 (예를 들어, 칼슘이온 등의 2가 금속이온)을 첨가함으로써 (예를 들어, 상기 용액을 액체 배지에 첨가), 상기 특정 화합물로 구성되는 구조체가 형성된다. 또는 상기 특정 화합물로 구성되는 상술한 구조체는, 금속이온 (예를 들어, 칼슘 등의 2가 금속이온)을 포함하는 용매 (예를 들어, 물과 액체 배지 등의 수성 용매)에 용해시, 가열 (예를 들어, 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 100℃ 내지 125℃ (예, 121℃)하고, 수득된 용액을 실온으로 냉각시킴으로써, 형성된다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물의 제조 방법을 하기에서 예시하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 화합물을 이온 교환수 또는 초순수에 첨가한다. 그 후, 상기 혼합물을 특정 화합물이 용해되는 온도 (예를 들어, 60℃이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상)에서 교반하여,투명한 상태가 될 때까지 용해시킨다. 용해 후, 상기 혼합물을 교반하면서 냉각하고, 멸균 (예를 들어, 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균)한다. 실온으로 냉각한 후, 상기 멸균된 수용액을 정치 배양에 사용되는 소정의 배지에 교반 (예를 들어, 호모믹서 등)하면서 첨가하여 용액을 배지와 균일하게 혼합한다. 수성 용액과 상기 배지의 혼합 방법은 특별히 제한되지 않으며, 피펫팅 등의 수동 혼합, 또는 자기 교반기, 기계식 교반기, 호모믹서 및 호모지나이저 장치로 혼합할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 상기 배지 조성물은 혼합한 후에 필터를 통해 여과할 수 있다. 여과 처리에 사용되는 필터의 기공 크기는 5 μm 내지 100 μm, 바람직하게는 5 μm 내지 70 μm, 보다 바람직하게는 10 μm 내지 70 μm 이다.
또는, 분말 배지 및 상기 고분자 화합물 (예를 들어, 분말 등의 고체)을 수성 용매와 혼합하고, 상기 혼합물은 상술한 온도에서 가열하여 본 발명에 사용되는 배지 조성물을 조제한다.
예를 들어, 탈아실화된 젤란검을 조제할 경우, 0.1% 내지 1% (w/v), 바람직하게는 0.2% 내지 0.5% (w/v), 보다 바람직하게는 0.3% 내지 0.4% (w/v)가 되도록 이온 교환수 또는 초순수에 탈아실화된 젤란검을 첨가한다. 다른 양태에서, 탈아실화된 젤란검을 조제할 경우, 0.1% 내지 1% (w/v), 바람직하게는 0.2% 내지 0.8% (w/v), 보다 바람직하게는 0.3% 내지 0.6% (w/v)가 되도록 이온 교환수 또는 초순수에 탈아실화된 젤란검을 첨가한다.
이어서, 상기 탈아실화된 젤란검이 용해 가능한, 예를 들어, 60℃ 이상, 바람직하게는 80℃ 이상, 보다 바람직하게는 90℃ (예를 들어, 80 내지 130℃) 이상의 임의의 온도에서 교반하여 투명한 상태가 되도록 용해할 수 있다. 용해 후, 상기 혼합물은 교반하면서 냉각시키고, 오토클레이브에서, 예를 들어, 121℃에서 20분간 멸균한다. 실온으로 냉각시킨 후, 예를 들어, 상기 수성 용액을 호모믹서 등으로 교반하면서 DEME/F-12 배지와 같은 액체 배지에 첨가하고, 소정의 최종 농도 (예를 들어, 최종 농도가 0.015%의 경우는 0.3% 수용액 : 배지 비율은 1:19) 가 되도록 첨가하고, 균일하게 혼합한다. 상기 수성 용액과 상기 배지의 혼합 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 피펫팅 등과 같은 수동 혼합, 또는 자기 교반기, 기계식 교반기, 호모믹서 및 호모지나이저와 같은 장치로 혼합할 수 있다. 또한 본 발명에 사용되는 배지 조성물은 혼합 후에 필터를 통해 여과할 수 있다. 여과 처리에 사용하는 필터의 기공 크기는, 5 μm 내지 100 μm, 바람직하게는 5 μm 내지 70 μm, 보다 바람직하게는 10 μm 내지 70 μm 이다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물과 이의 제조 방법의 바람직한 양태는 다음과 같다.
본 발명에 사용되는 배지 조성물은, 바람직하게는, 세포 또는 조직을 현탁시켜 배양할 수 있는 배지 조성물로서, 8 mPa·s (37℃ 조건 하) 이하의 배지 조성물의 점도를 가지고, 탈아실화된 젤란검 또는 이의 염을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 배지 조성물에서 상기 탈아실화된 젤란검 또는 이의 염의 농도는 0.005 내지 0.3% (w/v) (바람직하게는, 0.01 내지 0.05% (w/v))이다. 일 실시양태에서, 상기 배지 조성물은 탈아실화된 젤란검 또는 이의 염 이외에 다당류를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 배지 조성물은, 세포 또는 조직을 현탁 배양할 수 있는 구조체를 형성하기 위해 탈아실화된 젤란검에 충분한 농도의 2가 금속이온 (예를 들어, 칼슘)을 포함한다. 상기 농도는, 예를 들어, 0.1 mM 내지 300 mM, 바람직하게는, 0.5 mM 내지 100 mM 이다.
상기 배지 조성물은 탈아실화된 젤란검 또는 그의 염과 배지를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 배지는 액제 배지이다. 일 실시양태에서, 상기 액체 배지는 세포 또는 조직을 현탁 배양시킬 수 있는 상기 구조체를 형성하기 위해 탈아실화된 젤란검에 충분한 농도의 2가 금속이온 (예를 들어, 칼슘이온)을 포함한다. 상기 농도는, 예를 들어, 0.1 mM 내지 300 mM, 바람직하게는, 0.5 mM 내지 100 mM 이다. 일 실시양태에서, 용매 중에 용해 또는 분산된 탈아실화된 젤란검 또는 이의 염과 배지를 혼합한다. 일 실시양태에서, 용매 중에 용해 또는 분산된 탈아실화된 젤란검 또는 이의 염과 배지를 멸균한다. 일 실시양태에서, 멸균은 오토클레이브 멸균으로 실시한다. 다른 양태에서, 멸균은 여과 멸균으로 실시한다. 일 실시양태에서, 여과 멸균은 0.1 내지 0.5 μm 필터를 통과함으로서 실시한다.
(2) 혈관 평활근 세포의 배양
본 발명은 배지 조성물 I 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 시험관 내 방법을 제공한다. 혈관 평활근 세포를 배지 조성물 I 중에서 현탁 배양함으로써, 생존력을 유지하면서 세포 주기가 정지되고, 세포 증식은 억제되며, 상기 세포는 형질 변화의 위험성을 회피하면서 장기간 유지할 수 있다. 또한, 본 발명은 혈관 평활근 세포 증식을 억제하는 방법, 혈관 평활근 세포의 형질 변화를 억제하는 방법 및 세포 증식 억제시 혈관 평활근 세포의 생존력을 유지하는 방법 (생존율 저하 억제 방법)을 포함한다.
본 발명에 사용되는 혈관 평활근 세포는 포유동물의 혈관 평활근 세포이다. 포유동물의 예로는, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류, 개, 고양이 등의 육식류, 인간, 원숭이, 벵골 원숭이 (Macaca mulatta), 필리핀 원숭이 (Macaca fascicularis), 마모셋 (marmoset), 우랑우탄, 침팬치 등의 영장류 등을 포함한다. 포유동물은 바람직하게는 설치류 (마우스 등), 토끼목 또는 영장류 (사람 등), 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 사용되는 혈관 평활근 세포는 적절히 단리된다. "단리"란, 목적하는 성분이나 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 행해지고, 천연에 존재하는 상태를 벗어나는 것을 의미한다. "단리된 혈관 평활근 세포"의 순도 (총 세포에서 혈관 평활근 세포의 세포수 백분율)는, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 배양 방법에 있어서, 배양물 중에 포함된 총 세포에서 혈관 평활근 세포의 세포수의 백분율은, 통상, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
예를 들어, 혈관 평활근 세포는, 대동맥으로부터 중막 만을 분리하여 플레이트 저면에 부착시키고, 1주 내지 2주 동안 배양하거나 또는 혈관 평활근 세포를 콜라게나아제 또는 엘라스타아제로 처리함으로써, 생체로부터 단리할 수 있다. 혈관 평활근 세포의 단리 방법은, 문헌 [May-Jun et al, 1984; Arteriosclerosis, 4(3):183-188, Orekhov et al, Med Biol. 1984; 62(4):255-259.]에 기재되어 있으며, 당해 기술 분야에서 주지된 것이다.
일 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 혈관 평활근 세포는 1차 배양 세포이다. 1차 배양된 세포는 통과 조작 이전에 생체로부터 분리된 세포를 의미한다. 본 발명의 배양 방법을 사용하면 혈관 평활근 세포의 세포주기가 양호한 생존력을 유지하면서 정지되기 때문에, 세포 증식이 억제되고, 형질 변화의 위험성을 회피하면서 장기간 세포를 유지할 수 있으며, 1차 배양한 혈관 평활근 세포는 체내 형질을 유지하면서 장기간 배양할 수 있다.
혈관 평활근 세포의 현탁 배양하는 데에는, 일반적으로 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테프론 (등록 상표) 백, 디쉬, 살레, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 세포 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 병 등과 같은 세포 배양에 일반적으로 사용하는 배양 용기를 사용하여 배양할 수 있다. 혈관 평활근 세포의 일부가 배양 용기에 부착되어 증식하여 형질이 변화하는 위험성을 줄이기 위해, 일 실시양태에서, 본 발명의 배양 방법에 사용하는 배양 용기는 세포 비부착성이다. 세포 비부착성 배양 용기로는, 배양 용기의 표면이 세포와의 부착성을 향상시키는 목적으로 인위적으로 처리되지 않은 표면을 갖는 배양 용기 (예를 들어, 세포 외 기질 등의 코팅 처리) 또는 인위적으로 처리되어 부착력을 감소시키는 배양 용기 세포를 사용할 수 있다.
당업자는 배양할 혈관 평활근 세포의 형태 및 상태를 자유롭게 선택할 수 있다. 구체적으로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 배지 조성물 I에 혈관 평활근 세포가 단일 세포로서 분산된 상태, 혈관 평활근 세포가 담체 표면에 부착된 상태, 혈관 평활근 세포가 담체 내에 봉인된 상태, 복수의 혈관 평활근 세포가 집합하여 세포 응집체 (구) 등을 형성하는 상태를 말한다. 혈관 평활근 세포는, 고체상으로의 부착에 의해 세포 증식 및 형질 변화가 발생하는 위험성을 줄이기 위해, 바람직하게는 배지 조성물 I 중에 단일 세포가 분산되어 있는 상태, 또는 복수의 혈관 평활근 세포가 집합하고 세포 응집체 (구)를 형성하는 상태를, 배지 조성물 I 중에서 현탁 배양 (바람직하게는 정치 현탁 배양)을 한다. 즉, 혈관 평활근 세포의 부착 또는 봉입용 담체는 사용하지 않는 것이 바람직하다. 이들 상태 중에서도, 생체 내 환경에 가까운 세포-세포 상호 작용 및 세포 구조가 재구축되고, 세포 기능을 유지하면서 장기간의 배양이 가능하며, 세포 회복이 비교적 쉬운, 세포 응집체 (구)를 형성하는 상태가 바람직하다.
세포응집체 (구)를 형성하는 방법으로는, 특별히 제한되지 않으며, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 세포 비부착성 표면을 가지는 배양 용기, 현적법 (hanging drop method), 선회배양법 (gyratory culture method), 3차원 스캐폴드법, 원심분리법, 전기장 또는 자기장에 의한 응고법 등을 이용한 방법을 들 수 있다.
구 (sphere)는 또한 배양 조성물 I를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 배양 조성물 I 중의 단세포로 단리한 목적의 혈관 평활근 세포를 균일 하게 분산시켜, 3일 내지 10일간 정치하여 현탁 배양 함으로써 조제된다. 여기서 조제된 구 는 원심분리나 여과 처리를 실시함으로써 회수할 수 있다.
일 실시양태에서, 세포 증식이 정지된 혈관 평활근 세포를 배양하였다. 본 발명의 배양 방법을 이용하면, 혈관 평활근 세포를 양호한 생존력을 유지하면서, 세포 증식이 정지된 상태에서 장기간 유지할 수 있다. "세포 증식이 정지된 상태"란, 세포의 비증식 속도 (div/day)가 0.1 이하, 바람직하게는 0.001 이하, 보다 바람직하게는 0 이하인 것을 말한다. 세포 증식이 정지된 혈관 평활근 세포는, 통상 세포 주기가 G0 또는 G1 기에서 정지되어 있다. 일 실시양태에서는, 세포 주기는 배양된 혈관 평활근 세포의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더더욱 바람직하게는 99% 이상이 G0 또는 G1 기에 정지되어 있다. G0 또는 G1 기에 정지된 세포의 비율은, 세포를 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌로 염색함으로써 결정할 수 있으며, 유동세포계수법으로 세포내 DNA 수준을 분석하였다 (Cell, vol. 87, pages 1069-1078, 1996).
일 실시양태에서, 증식 중의 혈관 평활근 세포를 배양하였다. 증식 중의 혈관 평활근 세포를 본 발명의 배양 방법에 의해 배양할 경우, 양호한 생존력을 유지하면서 증식이 억제되고, 세포 증식이 정지되었다. 본 발명은 이와 같이 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. "증식 중"이란, 세포의 비증식속도 (div/day)가 0.1을 초과하는 것을 말한다.
본 발명의 방법에 의해 혈관 평활근 세포를 배양할 경우, 별도로 제조한 혈관 평활근 세포를 배양 조성물 I에 첨가하여 혼합하여 균일한 분산액을 얻는다. 이 경우, 혼합 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 피펫팅 등을 이용한 수동 혼합, 교반기, 볼텍스 믹서, 마이크로플레이트 믹서, 진탕기 등의 기기를 사용하여 혼합할 수 있다. 혼합한 후, 상기 수득한 혈관 평활근 세포의 현탁액을 정치 배양할 수 있고, 상기 배양 배지는 필요에 따라 회전, 진탕 또는 교반할 수 있다. 회전 속도 및 빈도는, 당업자의 목적에 따라 적절하게 설정될 수 있다. 상기 배지 조성물을 정치 배양 기간 중 교환할 필요가 있을 때는, 혈관 평활근 세포와 배지 조성물을 원심 분리 또는 여과 처리에 의해 분리하고, 새로운 배지 조성물 I를 상기 세포에 첨가할 수 있다. 또는, 원심 또는 여과 처리를 실시하고 혈관 평활근 세포를 적절히 농축시킨 후, 신선한 상기 배지 조성물 I 를 이 농축액에 첨가할 수 있다.
일 실시양태에서, 생체로부터 분리된 1차 혈관 평활근 세포, 또는 별도의 시험관 내에서 배양된 혈관 평활근 세포 (예를 들어, 부착 배양 후 혈관 평활근 세포)를, 단일 세포 또는 이에 가까운 상태까지 분산되었다. 혈관 평활근 세포의 분산은, 적절한 세포 분리액을 사용하여 실시된다. 세포 분리액으로는, 예를 들어, EDTA; 트립신, 콜라게나아제 IV, 메타프로테아제 등의 단백질 분해 효소 등을 단독 또는 적절히 조합하여 이용할 수 있다. 분산된 혈관 평활근 세포를 배지 조성물 I 중에 현탁하여, 이를 현탁 배양 (바람직하게는, 정치 현탁 배양)한다. 배양물 중의 혈관 평활근 세포는, 단일 세포 상태, 또는 구 (sphere) 상태에서 배지 조성물 I 중에 현탁된다.
배양물 중의 혈관 평활근 세포의 농도는 세포 증식이 억제된 상태에서 혈관 평활근 세포를 유지할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 통상, 3.0 x 104 내지 3.0 x 106 세포/ml, 바람직하게는 1.0 x 105 내지 1.0 x 106 세포/ml, 보다 바람직하게는 3.0 x 105 내지 5.0 x 105 세포/ml 이다.
배지 조성물 I 중의 혈관 평활근 세포의 배양 기간은, 세포 증식이 억제된 상태에서 혈관 평활근 세포를 유지할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 70시간 이상 배양할 수 있다. 이론적으로는, 배양 기간의 상한은 없다. 그러나, 세포 증식이 억제된 상태에서 과하게 장기간에 걸쳐 혈관 평활근 세포를 배양하면, 생존율이 저하될 수 있기 때문에, 배양 기간은 예를 들어, 30일 이하, 바람직하게는 14일 이하, 보다 바람직하게는 211시간 이하로 하는 것이 좋다. 본 발명의 방법을 이용하면, 혈관 평활근 세포는 세포 증식이 억제된 상태에서, 시험관 내에서 장기간 유지할 수 있다.
일 실시양태에서, 증식 중의 혈관 평활근 세포는 배지 조성물 I 중에서 세포 증식이 정지할 때까지 현탁 배양 (바람직하게는, 정치 현탁 배양)하였다. 세포 증식 억제에 도달하기 위해 증식 중인 혈관 평활근 세포에 필요한 시간은, 통상 3시간 이상, 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상이다.
혈관 평활근 세포를 배양하기 위한 온도는, 일반적으로 25 내지 39℃, 바람직하게는 37℃이다. CO2 농도는, 일반적으로 배양 분위기 중 4 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 5 중량%이다. 산소 농도는, 배양 분위기 중 15 내지 50 중량%이고, 바람직하게는 20 중량%이다.
이와 같은 배양 조작에 의해, 혈관 평활근 세포는 세포 증식이 억제된 상태에서 시험관 내에서 장기간 유지할 수 있다.
(3) 혈관 평활근 세포의 보존 또는 수송 방법
본 발명은 상기 배지 조성물 I를 이용한 혈관 평활근 세포의 보존 방법 및 수송 방법을 제공한다. 본 발명의 보존 또는 수송 방법은 상기 배지 조성물 I 중에 혈관 평활근 세포를 현탁시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 보존 또는 수송 방법에서는, 배지 조성물 I를 이용함으로써, 세포나 조직을 비동결 조건하에서 현탁 상태로 (바람직하게는, 정치 현탁 상태로) 보존 또는 수송할 수 있다.
보존 또는 수송에 이용하는 배지 조성물 I는 상기 (1)에 기재한 조성물 이외에, 세포를 비동결상태로 보존하는 동안 세포 생존 연장 효과를 갖는 각종 성분을 포함할 수 있다. 상기 성분으로는, 당류 (다만, 다당류는 제외) (예를 들어, 단당류, 2당류), 항산화제 (예를 들어, SOD, 비타민 E 또는 글루타치온), 친수성 폴리머 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA), 당알코올 (예를 들어, 만니톨, 소르비톨), 글리세롤 등을 들 수 있다.
혈관 평활근 세포는, 바람직하게는 단리되어 있다. 일 실시양태에서, 1차 배양물 내의 혈관 평활근 세포는 보존 또는 수송된다. 일 실시양태에서, 세포 증식이 정지된 혈관 평활근 세포는 보존 또는 수송된다. 일 실시양태에서, 세포 주기는 보존 또는 수송되는 혈관 평활근 세포의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특별히 바람직하게는 99% 이상이 G0 또는 G1 기에 정지된다. 일 실시양태에서, 증식 중의 혈관 평활근 세포를 보존 또는 수송하였다. 본 발명의 방법을 이용함으로써, 혈관 평활근 세포의 세포 증식을 억제할 수 있고, 세포 증식-정지 상태를 유지할 수 있기 때문에, 장기간에 걸쳐 혈관 평활근 세포를 보존하거나 수송할 수 있는 동결 또는 세포 증식에 기인한 형질 변화의 위험성을 회피할 수 있다.
본 발명의 보존 또는 수송 방법에 있어서, 혈관 평활근 세포는 배지 조성물 I 중에 분산되어, 타이트하게 밀봉될 수 있는 용기에 놓여진다. 상기 용기의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론 (등록 상표) 백, 튜브, 배양 백 등을 들 수 있다. 보존 또는 수송하는 동안 내용물의 누출이나 외부로부터의 세균 오염 등을 피하기 위해, 배지 조성물 I 중의 혈고나 평활근 세포의 분산액을 수용하는 용기는 밀폐되어 있는 것이 바람직하다.
보존 또는 수송 중의 온도는 혈관 평활근 세포의 생존력이 유지될 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 37℃ 이하이다. 낮은 온도는 보존 또는 수송 중에 혈관 평활근 세포의 생존력 저하를 피할 수 있지만, 보존 또는 수송은 일반적으로 배지 조성물 I의 융점 이상의 온도에서 수행되기 때문에 혈관 평활근 세포는 동결되지 않을 것이다. 따라서, 보존 또는 수송 중의 온도는 일반적으로, -5 내지 42℃, 바람직하게는 1 내지 37℃, 보다 바람직하게는 4 내지 32℃, 더욱 바람직하게는 18 내지 30℃에서 유지된다.
정치 현탁 상태에서의 혈관 평활근 세포의 보존 또는 수송을 가능하게 하기 위해서, 보존 또는 수송 중의 온도는 혈관 평활근 세포를 배지 조성물 I에 정치 현탁시킬 수 있는 온도인 것이 바람직하다.
보존 또는 수송 기간은 혈관 평활근 세포가 배지 조성물 I에서 생존 가능한 상태에서 유지될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 일반적으로는 12시간 이상, 10일 이하이고, 바람직하게는 1 내지 8일, 보다 바람직하게는 1 내지 3일이다. 보존 또는 수송 기간 동안, 상기 세포 또는 조직은 배지 조성물 I 중에 정치 현탁된 상태로 유지되는 것이 바람직하다.
본 발명의 보존 또는 수송 방법을 사용하면, 혈관 평활근 세포는 동결 조작이 아닌 조건에서 수송할 수 있기 때문에, 동결 및 증식에 관여하는 혈관 평활근 세포의 형질 변화를 최소한으로 억제 할 수 있을 것으로 기대된다.
특별히 언급하지 않는 한, (3)의 각 용어의 정의는 상기 (1) 및 (2)에 기재된 것과 동일하다.
특허 및 특허 출원을 포함하여, 본원에 인용된 임의의 공보에 개시된 내용은 본원에 개시된 범위 내에서 참조로서 전체적으로 통합된다.
(실시예)
이하, 본 발명에 사용되는 배지 조성물의 분석예, 시험예를 실시예로서 구체적으로 기재함으로써, 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험 실시예 1. 혈관 평활근 세포 및 NIH3T3 세포의 생존 유지 시험
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 수득한 탈아실화된 젤란검 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 탈아실화된 젤란검을 함유하는 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)을 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 토끼 혈관 평활근 세포 (치바 대학 약학 연구원 병원 약학 연구실에서 조제) 및 마우스 섬유아세포주 NIH3T3 (ATCC 제조)가 상기 배지 조성물에서 1.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 5 ml 접종하였다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM에 토끼 혈관 평활근 세포 또는 NIH3T3 세포를 현탁하고, 분주하였다. 이어서, 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 211시간 동안 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다. 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 70시간, 115시간 및 211시간 배양한 후의 배양물에 대해, 트리판 블루 시약 (Life Technology 제조)을 첨가하고, 현미경으로 생존 세포수 및 총 세포수를 계측하였다. 총 세포수와 생존 세포수로부터 생존율을 산출하였다.
그 결과, 음성 대조에서의 각 세포의 생존율은 토끼 혈관 평활근 세포에서는 12시간, NIH3T3 세포에서는 36시간에서 50% 미만이였다. 한편, 탈아실화된 젤란감을 함유하는 배지에서는, 두 세포의 생존율은 115시간까지 50% 이상을 나타냈다. 토끼 혈관 평활근 세포의 생존 세포수 및 생존율을 표 1 및 표 2에, NIH3T3 세포의 생존 세포수 및 생존율을 표 3 및 표 4에 나타냈다.
생존세포수 음성대조 탈아실화된 젤란검 0.015%
0 시간 500000 500000
12 시간 42000 369000
24 시간 13000 336000
36 시간 4000 361000
48 시간 1000 306000
70 시간 실시하지 않음 304000
115 시간 실시하지 않음 221000
211 시간 실시하지 않음 100000
생존율 (%) 음성대조 탈아실화된 젤란검 0.015%
0 시간 100 100
12 시간 30.5 79.5
24 시간 18.6 76.6
36 시간 9.3 72.6
48 시간 5.6 70.2
70 시간 실시하지 않음 66.7
115 시간 실시하지 않음 52.6
211 시간 실시하지 않음 25.6
생존세포수 음성대조 탈아실화된 젤란검 0.015%
0 시간 500000 500000
12 시간 129000 474000
24 시간 40000 489000
36 시간 19000 488000
48 시간 19000 389000
70 시간 실시하지 않음 377000
115 시간 실시하지 않음 296000
211 시간 실시하지 않음 140000
생존율 (%) 음성대조 탈아실화된 젤란검 0.015%
0 시간 100 100
12 시간 91.3 90.0
24 시간 74.7 90.9
36 시간 32.5 91.9
48 시간 30.6 91.7
70 시간 실시하지 않음 90.1
115 시간 실시하지 않음 68.1
211 시간 실시하지 않음 33.6
실험 실시예 2. 혈관 평활근 세포의 세포 주기 분석
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 수득한 탈아실화된 젤란검 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 탈아실화된 젤란검을 함유하는 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)을 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 토끼 혈관 평활근 세포 (치바 대학 약학 연구원 병원 약학 연구실에서 조제) 및 마우스 섬유아세포주 NIH3T3 (ATCC 제조)가 상기 배지 조성물에서 4.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 9 ml 접종하였다. 이어서, 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 5일간 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다. 또한, 대조군으로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 토끼 혈관 평활근 세포를 현탁하고, 일반적인 단층배양용의 샬레 상에서 배양하였다.
각 세포로부터 세포 용해액 (IP 버퍼)를 사용하여 단백질을 회수하고, BCA법 (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 20 μg의 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology 제조)로서, 폴리클로날 항 p27 항체 (C-19), 폴리클로날 항 p21 항체 (M-19), 폴리클로날 항 CDK2 항체 (M-2), 및 폴리클로날 항 β-액틴 항체 (I-19)를 200배 희석하여 사용하였다. 2차 항체로서, 항 토끼 IgG-HRP 항체 (Amersham Bioscience)를 10,000배 희석하여 사용하였다. 검출은 ECL 웨스턴 블랏팅 검출제 (Amersham Bioscience) 또는 Immobilon 웨스턴 (Millipore)을 이용하여, LAS4000 (FUJIFILM)으로 실시하였다.
탈아실화된 젤란검 함유 배지 중에서의 현탁 배양과 탈아실화된 젤란검 불함유 배지 중에서의 단층 배양 간, 토끼 혈관 평활근 세포의 세포 주기 인자의 발현을 비교하였다. 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지에서 토끼 혈관 평활근 세포를 배양하면, 세포 주기의 G1/S기 전이를 촉진하는 cdk2의 발현과 G1/S기 전이를 억제하는 p21 및 p27의 발현이 같이 저하된다 (도 1). 이런 현상은, 단층 배양에서의 토끼 혈관 평활근 세포에서는 나타나지 않았다. G1/S기의 촉진 인자 및 제어 인자가 같이 저하하는 결과로부터, 탈아실화된 젤란검 함유 배지 중에서의 현탁 배양은 토끼 혈관 평활근 세포의 세포 주기를 G0에서 정지시키는 것을 시사한다.
실험 실시예 3. 혈관 평활근 세포의 세포 주기 분석
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 이 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 상기 용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)을 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 토끼 혈관 평활근 세포 (치바 대학 약학 연구원 병원 약학 연구실에서 조제) 가 상기 배지 조성물에서 3.0 x 105 세포/ml (토끼 혈관 평활근 세포)가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 5 ml 접종하였다. 이어서, 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 3일간 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다. 또한, 대조군으로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 토끼 혈관 평활근 세포를 현탁하고, 종래의 단층 배양용 페트리 디쉬 상에서 배양한 것을 사용하였다.
각 세포로부터 세포 용해액 (IP 버퍼)를 사용하여 단백질을 회수하고, BCA법 (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 10 내지 15 μg의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology 제조)로서, 폴리클로날 항 사이클린 E1 항체 (M-20), 폴리클로날 항 CDK2 항체 (M-2), 폴리클로날 항 p27 항체 (C-19), 폴리클로날 항 p21 항체 (M-19), 폴리클로날 항 β-액틴 항체 (I-19)를 200배 희석하고, 모노클로날 항 사이클린 D1 항체 (HD11) 를 250배 희석하고, BD Bioscience 제조의 모노클로날 항 사이클린 D3 항체를 1000배 희석하고, 모노클로날 항 CDK4 항체를 250배 희석하여 사용하였다. 2차 항체로서, 항 마우스IgG-HRP 항체 (GE Healthcare)를 50,000 배 희석하여 사용하고, 항 토끼IgG-HRP 항체 (Cell Signaling Technology)를 10,000배 희석하여 사용하였다. 검출은 ECL 웨스턴 블랏팅 검출제 (Amersham Bioscience) 또는 Immobilon 웨스턴 (Millipore)를 이용하여, LAS4000 (FUJIFILM)으로 실시하였다.
탈아실화된 젤란검 함유 배지와 단층 배양간의, 토끼 혈관 평활근 세포의 세포 주기 인자에 대해 비교하였다. 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지에서 토끼 혈관 평활근 세포를 배양하면, 세포 주기에서의 G1/S기 전이를 촉진하는 cdk2의 발현과 G1/S기 전이를 억제하는 p21의 발현이 같이 저하된다 (도 2). 이런 현상은, 단층 배양에서의 토끼 혈관 평활근 세포에서는 나타나지 않았다. G1/S기의 촉진 인자 및 제어 인자가 같이 저하하는 결과로부터, 탈아실화된 젤란검 함유 배지 중에서의 현탁 배양은 토끼 혈관 평활근 세포를 G0기로 전이시켰음을 시사한다.
실험 실시예 4. NIH3T3 세포의 세포 주기 분석
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 수득한 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)를 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 마우스 섬유아세포주 NIH3T3 (ATCC 제조) 이 상기 배지 조성물에서 3.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 5 ml 접종하였다. 이어서, 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 5일간 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다. 또한, 대조군으로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 NIH3T3 세포를 현탁하고, 종래의 단층 배양용 페트리 디쉬 상에서 배양하였다.
각 세포로부터 세포 용해액 (IP 버퍼)를 사용하여 단백질을 회수하고, BCA법 (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 10 내지 15 μg의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 1차 항체로서, Santa Cruz Biotechnology 제조 제조의 폴리클로날 항 사이클린 E1 항체 (M-20), 폴리클로날 항 CDK2 항체 (M-2), 폴리클로날 항 p27 항체 (C-19), 폴리클로날 항 p21 항체 (M-19), 폴리클로날 항 β-액틴 항체 (I-19)를 200배 희석하여 사용하고, Santa Cruz Biotechnology 제조 제조의 모노클로날 항 사이클린 D1 항체 (HD11) 를 250배 희석하여 사용하고, BD Bioscience 제조의 모노클로날 항 사이클린 D3 항체를 1000배 희석하여 사용하고, BD Bioscience 제조의 모노클로날 항 CDK4 항체를 250배 희석하여 사용하였다. 2차 항체로서, 항 마우스 IgG-HRP 항체 (GE Healthcare)를 50,000배 희석하고, 항 토끼 IgG-HRP 항체 (Cell Signaling Technology)를 10,000배 희석하여 사용하였다. 검출은 ECL 웨스턴 블랏팅 검출제 (Amersham Bioscience) 또는 Immobilon 웨스턴 (Millipore)를 이용하여, LAS4000 (FUJIFILM)으로 실시하였다.
탈아실화된 젤란검 함유 배지와 단층 배양 간의, NIH3T3 세포의 세포 주기 인자에 대해 비교하였다. 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지에서 NIH3T3 세포를 배양하면, 세포 주기에 있어서 G1/S기로의 전이를 촉진하는 cdk2의 발현이 저하하는, 토끼 혈관 평활근 세포에서의 결과와 같았다. 그러나, G1/S기로의 전이를 억제하는 p21의 발현은 감소하지 않아, 토끼 혈관 평활근 세포에서의 결과와 상이하였다(도 3). 탈아실화된 젤란검 함유 배지에서 토끼 혈관 평활근 세포와 NIH3T3 세포를 배양하면, 상이한 세포 주기 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.
실험 실시예 5. 혈관 평활근 세포에서의 인산화 Erk 및 인산화 FAK의 단백질 분석
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 수득한 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)를 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 토끼 혈관 평활근 세포 (치바대학 약학 연구원 병원 약학 연구실에서 조제) 가 상기 배지 조성물에서 3.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 5 ml 접종하였다. 이어서, 대조군으로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 토끼 혈관 평활근 세포를 현탁하고, 종래의 단층 배양용 페트리 디쉬 상에서 배양하여 사용하였다. 이어서 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 3일간 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다.
각 세포로부터 세포 용해액 (IP 버퍼)를 사용하여 단백질을 회수하고, BCA법 (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 10 내지 15 μg의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 1차 항체로서, Upstate Biotechnology 제조의 폴리클로날 항 인산화 FAK (p125) 항체를 100배 희석하고, BD Bioscience 제조의 모노클로날 항 FAK 항체를 200배 희석하고, Cell Signaling 제조의 폴리클로날 항 인산화 p44/42 MARK (Erk1/2) 항체 (Thr202/Tyr204)를 500배 희석하고, ZYMED 제조의 모노클로날 항 MAP 키나아제 (ERK 1 + ERK 2) 항체를 500배 희석하여 사용하였다. 2차 항체로서, 항 마우스 IgG-HRP 항체 (GE Healthcare)를 50,000배 희석하고, 항 토끼 IgG-HRP 항체 (Cell Signaling Technology)를 10,000배 희석하여 이용하였다. 검출은 ECL 웨스턴 블랏팅 검출제 (Amersham Bioscience) 또는 Immobilon 웨스턴 (Millipore)를 이용하여, LAS4000 (FUJIFILM)으로 실시하였다.
탈아실화된 젤란검 함유 배지와 단층 배양 간의, 토끼 혈관 평활근 세포의 신호전달인자 (Erk 및 FAK)에 대해 비교하였다. 단층 배양에서는 배양 시작 1시간 후에 인산화된 Erk의 발현양은 검출 불가능하였다. 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지에서 배양된 토끼 혈관 평활근 세포의 경우, 인산화된 Erk의 발현양은 단층 배양과 동일한 수준을 나타냈다. 한편, 인산화된 FAK 발현양은 단층 배양에서의 발현양보다 낮았다 (도 4).
실험 실시예 6. NIH3T3 세포에서의 인산화 Erk 및 인산화 FAK의 단백질 분석
국제공개특허 WO2014/017513 A1에 기재된 제조 방법에 따라, 세포의 현탁 배양에 사용하는 배지 조성물을 조제하였다. 즉, 탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 본 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 수용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)를 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 마우스 섬유아세포주 NIH3T3 (ATCC 제조) 이 상기 배지 조성물에서 3.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 5 ml 접종하였다. 또한, 대조군으로서 탈아실화된 젤란검을 포함하지 않는 DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 NIH3T3 세포를 현탁하고, 종래의 단층 배양용 페트리 디쉬 상에서 배양하여 사용하였다. 이어서 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에 정치함으로써, 최대 5일간 세포를 정치 상태에서 현탁 배양하였다.
각 세포로부터 세포 용해액 (IP 버퍼)를 사용하여 단백질을 회수하고, BCA법 (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 10 내지 15 μg의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 1차 항체로서, Upstate Biotechnology 제조의 모노클로날 항 인산화 FAK (p125) 항체를 100배 희석하고, BD Bioscience 제조의 모노클로날 항 FAK 항체를 200배 희석하고, Cell Signaling 제조의 폴리클로날 항 인산화 p44/42 MARK (Erk1/2) 항체 (Thr202/Tyr204)를 500배 희석하고, ZYMED 제조의 모노클로날 항 MAP 키나아제 (ERK 1 + ERK 2) 항체를 500배 희석하여 사용하였다. 2차 항체로서, 항 마우스 IgG-HRP 항체 (GE Healthcare)를 50,000배 희석하고, 항 토끼 IgG-HRP 항체 (Cell Signaling Technology)를 10,000배 희석하여 사용하였다. 검출은 ECL 웨스턴 블랏팅 검출제 (Amersham Bioscience) 또는 Immobilon 웨스턴 (Millipore)을 이용하여, LAS4000 (FUJIFILM)으로 실시하였다.
탈아실화된 젤란검 함유 배지와 단층 배양 간의, NIH3T3 세포의 신호전달인자 (Erk 및 FAK)에 대해 비교하였다. 단층 배양에서는 인산화된 Erk의 발현양은 검출 불가능하였다. 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지에서 배양된 상기 세포의 경우, 인산화된 Erk의 발현양은 단층 배양에서의 발현양보다 높았다. 한편, 인산화된 FAK 발현양은 단층 배양에서의 발현양보다 낮았다 (도 5). 토끼 혈관 평활근 세포와 NIH3T3 세포 간, Erk 및 FAK의 인산화 패턴이 상이하기 때문에, 신호 전달은 두 세포 간에 서로 다른 것으로 나타났다.
실험 실시예 7
탈아실화된 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 0.3% (w/v)가 되도록 초순수 (Milli-Q)에 현탁시킨 후, 90℃에서 가열하면서 교반하여 용해하였다. 본 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하였다. 본 수용액을 사용하여 최종 농도 0.015% (w/v) 의 DMEM/F12 (Kohjin Bio Co., Ltd. 제조)을 제조하고, 10% (v/v) 소태아혈청을 추가로 첨가하여 배지 조성물을 조제하였다. 이어서, 토끼 혈관 평활근 세포 (치바대학 약학 연구원 병원 약학 연구실에서 조제)가 상기 배지 조성물에서 3.0 x 105 세포/ml가 되도록 조제한 후, 15 ml 튜브에 접종하였다. 이어서 본 튜브를 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 내에서 2일간 정치 상태에서 배양하였다. 이후, 트립신 처리한 세포를 DEME (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)를 사용하여 페트리 디쉬에 9 x 104 세포/3 cm 로 접종하고, 배양을 지속하였다. 3일, 5일 및 7일간 배양한 후에 배지를 교환하였다. 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일간 배양한 후의 세포를 회수하여, 트리판 블루 시약 (Life Technology 제조)를 첨가하여 현탁시키고, 현미경으로 생존 세포수, 총 세포수를 계측하였다. 총 세포수와 생존 세포수로부터 생존율을 산출하였다.
혈관 평활근 세포를 현탁 상태를 유지하면서 탈아실화된 젤란검을 함유하는 배지 중에서 현탁 배양하면, 양호한 생존력을 유지하면서 세포 증식이 억제되었다. 이러한 특성은 혈관 평활근 세포를 현탁 배양으로부터 플레이트 상으로 부착 배양으로 계대한 후에도, 일정 기간 이 형질이 유지되었으나, 이후의 혈관 평활근 세포는 증식하였다 (도 6).
본 발명에 의해, 혈관 평활근 세포를 세포 증식이 억제된 상태에서, 장기간, 시험관 내에서 유지할 수 있게 된다. 본 발명에 의해, 동결 조작이 없는 조건에서의 혈관 평활근 세포의 수송이 가능하게 되고, 동결이나 부착될 때 보이는 세포의 형질 변화를 최소한으로 하는 것이 기대된다. 본 발명은, 혈관 평활근 세포를 이용한 재생 의료의 발전에 기여한다.
본 명세서에서 기술한 특허, 특허원, 과학 문헌을 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용된 것으로 인해, 그 전부가 명시된 것과 동등한 정도로 본 명세서에 통합되는 것이다.
본 출원은, 일본에서 출원한 특허출원 번호 2015-017839 (출원일: 2015년 1월 30일), 특허출원 번호 2015-065007 (출원일: 2015년 3월 26일) 및 특허출원 번호 2015-183940 (출원일: 2015년 9월 17일)을 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (8)

  1. 탈아실화된 젤란검(deacylated gellan gum)을 포함하는 배지 조성물 중에서 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 혈관 평활근 세포의 배양 방법으로서,
    세포 증식-정지 상태의 혈관 평활근 세포를 현탁 배양하고, 및
    배지 조성물은 0.01 내지 0.03% (w/v) 농도의 탈아실화된 젤란검을 포함하는
    혈관 평활근 세포의 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 탈아실화된 젤란검을 포함하는 배지 조성물 중에 혈관 평활근 세포를 현탁시키는 단계를 포함하는 혈관 평활근 세포의 보존 방법으로서,
    세포 증식-정지 상태의 혈관 평활근 세포를 현탁시키고, 및
    배지 조성물은 0.01 내지 0.03% (w/v) 농도의 탈아실화된 젤란검을 포함하는
    혈관 평활근 세포의 보존 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
KR1020177023972A 2015-01-30 2016-01-29 혈관 평활근 세포의 배양 방법 KR102562736B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2015-017839 2015-01-30
JP2015017839 2015-01-30
JPJP-P-2015-065007 2015-03-26
JP2015065007 2015-03-26
JP2015183940 2015-09-17
JPJP-P-2015-183940 2015-09-17
PCT/JP2016/052571 WO2016121896A1 (ja) 2015-01-30 2016-01-29 血管平滑筋細胞の培養方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170125027A KR20170125027A (ko) 2017-11-13
KR102562736B1 true KR102562736B1 (ko) 2023-08-03

Family

ID=56543500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177023972A KR102562736B1 (ko) 2015-01-30 2016-01-29 혈관 평활근 세포의 배양 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20180008646A1 (ko)
EP (1) EP3252151B1 (ko)
JP (1) JP6678997B2 (ko)
KR (1) KR102562736B1 (ko)
CN (1) CN107208059A (ko)
TW (1) TWI698528B (ko)
WO (1) WO2016121896A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017154952A1 (ja) * 2016-03-09 2017-09-14 日産化学工業株式会社 細胞回収が容易な浮遊培養用培地組成物、及び細胞回収方法
US11252954B2 (en) 2017-09-08 2022-02-22 Nissan Chemical Corporation Method for preserving a cell material in an unfrozen state
TWI820055B (zh) 2017-11-16 2023-11-01 日商日產化學股份有限公司 成為米色及白色脂肪細胞之分化誘導及生產方法
CN108998441A (zh) * 2018-08-02 2018-12-14 南方医科大学深圳医院 一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法
CN112567223A (zh) * 2018-08-17 2021-03-26 国立大学法人大阪大学 粒子的分配方法
WO2023281831A1 (ja) * 2021-07-05 2023-01-12 株式会社先端生殖技術研究所 細胞操作用溶液、細胞凍結保存方法及び細胞融解方法
CN113388576A (zh) * 2021-07-12 2021-09-14 新乡医学院 一种大鼠血管平滑肌细胞培养基及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014017513A1 (ja) * 2012-07-24 2014-01-30 日産化学工業株式会社 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7494669B2 (en) * 2001-02-28 2009-02-24 Carrington Laboratories, Inc. Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides
WO2003002044A2 (fr) * 2001-06-27 2003-01-09 Chuwa Tei Procede d'inhibition de la proliferation de cellules du muscle lisse vasculaire
ATE524203T1 (de) * 2003-11-03 2011-09-15 Medtronic Inc Hydrogel für zellspezifisches einwachsen
CN102168062B (zh) * 2010-12-24 2013-02-13 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种人肺动脉平滑肌细胞分离、培养方法及其应用
US9664671B2 (en) * 2012-07-24 2017-05-30 Nissan Chemical Industries, Ltd. Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
KR20150054850A (ko) * 2012-08-23 2015-05-20 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤 단백질 산생 촉진제
PT2983727T (pt) * 2013-04-09 2017-11-29 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Tech & Therapies (A4Tec) Hidrogel esponjoso de goma gelana, sua preparação e aplicações biomédicas do mesmo

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014017513A1 (ja) * 2012-07-24 2014-01-30 日産化学工業株式会社 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201636423A (zh) 2016-10-16
EP3252151A4 (en) 2018-07-11
JPWO2016121896A1 (ja) 2017-11-09
EP3252151A1 (en) 2017-12-06
KR20170125027A (ko) 2017-11-13
EP3252151B1 (en) 2020-04-08
US20180008646A1 (en) 2018-01-11
WO2016121896A1 (ja) 2016-08-04
TWI698528B (zh) 2020-07-11
CN107208059A (zh) 2017-09-26
JP6678997B2 (ja) 2020-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102562736B1 (ko) 혈관 평활근 세포의 배양 방법
JP7036165B2 (ja) 培地組成物
JP6879517B2 (ja) 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法
US11252954B2 (en) Method for preserving a cell material in an unfrozen state
Linkova et al. Cryostorage of mesenchymal stem cells and biomedical cell-based products
JP6642439B2 (ja) 細胞回収に関する方法
WO2017057599A1 (ja) 癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法
WO2016125884A1 (ja) 担癌哺乳動物モデルの作成方法
TW201823449A (zh) 高品質之三維培養用培養基組成物的製造方法，及三維培養用培養基組成物之保存安定性的評估方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right