KR102556554B1 - 난소암에 사용할 수 있는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 프로브와 나노 입자 및 이의 제조 방법과 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 응집 유도 방출(AIE) 효과를 갖는 수용성 형광 프로브와 나노 입자 및 제조 방법과 응용을 개시한다. 상기 형광 프로브 분자는 2개의 메톡시페닐(methoxyphenyl)과 페닐 치환된 이미다졸 고리 및 2개의 4차 암모늄염 구조 특징을 함유하며, 수중에서 우수한 분산성을 나타내고 미셀(micelle)을 형성할 수 있다. 또한 응집 유도 방출 효과, 스트로크 시프트가 큰 특징을 가지고 있어 형광 검출에 적합하다. 리소포스파티드산의 유도 하에서, 상기 프로브는 자기조립이 가능하므로 응집하여 황색 형광을 생성할 수 있고, 방출된 빛의 강도를 측정하여 리소포스파티드산의 정량 분석을 구현할 수 있다. 이는 특이성이 우수하고 감도가 높으며 간섭에 저항하는 장점 등이 있다. 특히 화학 용액 시스템에 적합하며, 생물학적 시료 등 환경에서의 리소포스파티드산 검출은 미량 리소포스파티드산의 검출과 난소암 환자 혈장 중 리소포스파티드산의 함량 검출 및 임상 조기 진단과 약물 사용 지침에 매우 중요한 실용적인 가치를 가진다.

Description

난소암에 사용할 수 있는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 프로브와 나노 입자 및 이의 제조 방법과 응용
본 발명은 형광 프로브 및 나노 입자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브 또는 형광 나노 입자 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 특히 상세하게는 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid)의 검출 측면에서 상기 형광 분자 프로브 나노 입자의 적용에 관한 것으로, 이는 화학적 분석과 생물학적 분석 검출 기술 분야에 속한다.
리소포스파티드산(lysobisphosphatidic acids, LPA)은 지금까지 발견된 가장 작고 가장 단순한 포스포글리세리드(phosphoglyceride)로, 인산을 함유한 친수성 말단과 긴 지방 사슬을 함유한 소수성 말단으로 구성된다. 이는 혈청의 정상 성분이며, 혈소판 응집 과정에서 혈소판에 의해 생성된다. 리소포스파티드산은 세포막 지질류 유도체와 대사 중간체로서, 세포 증식, 분화 및 이동 자극, 평활근 수축, 신경 전달 물질 방출 및 혈소판 응집 촉진과 같은 광범위한 생화학적, 생리학적 및 병리학적 과정을 매개한다. 최근 연구에 따르면, 난소암 세포는 LPA를 생성하고 LPA 자체는 난소암의 활성화 인자로 작용할 수도 있다. 혈장 내 LPA의 정상적인 생리적 농도는 약 0.1μM 내지 6.3μM이다. 난소암 환자에서 혈장 LPA 레벨이 현저하게 높아지므로, 높아진 혈장 LPA 레벨은 인간 난소암 검출을 위한 잠재적인 바이오 마커로 사용될 수 있다. LPA의 임계값은 1.3μM이며, 난소암 환자 진단에 대한 민감성과 특이성은 각각 95%와 92%에 달한다 (X.Fang, D.Gaudette, T.Furui, M.Mao, V.Estrella, A.Eder, T.Pustilnik, T.Sasagawa, R.Lapushin, S.Yu,R.B.Jaffe, J.R.Wiener, J.R.Erickson and G.B.Mills, Ann.N.Y.Acad.Sci., 2000, 905,188; Y.Xu, Z.Shen, D.W.Wiper, M.Wu, R.E.Morton, P.Elson, A.W.Kennedy, J.Belinson, M.Markman and G.Casey, J.A.M.A.1998, 280,719.). 난소암은 광범위한 복막 전파와 복수를 특징으로 하는 고도의 전이성 질환으로, 부인과 악성 종양 사망의 주요 원인이며 여성의 삶에 심각한 위협이 된다. 난소암의 초기 증상이 명확하지 않기 때문에 약 60%의 난소암이 말기에 진단되어 치료 효과에 영향을 미친다. 따라서 난소암의 초기 단계에 스크리닝을 통해 적시에 검출하여 치료할 수 있다면, 이러한 고질적인 질환 퇴치에 우위를 점할 수 있다. 또한 유효한 난소암의 조기 진단은 전반적인 생존율 향상에 필수적이다(Anonymous, Lancet, 2016,387,918.). 여기에서 알 수 있듯이, 간단하고 유효한 LPA 특이성 검출 방법을 개발하는 것은 난소암의 예방과 진단을 위해 해결해야 할 시급하고 중대한 사안이다.
지금까지 혈장 LPA 레벨을 검출하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었다. 전형적인 방법에는 전기 분사 이온화 질량 분석(ESI-MS), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석(MALDI-MS), GC-MS 등이 있다. 분석 감도가 높기는 하나, 이러한 방법은 통상적으로 시료 전처리, 시료 유도체화 또는 장시간의 분리가 어렵고 값비싼 장비가 필요해 일상적인 진단에 적합하지 않다(YJXiao, Y.H.Chen, W.K.Alexander, B.Jerome and Y.Xu, Ann.Ny.Acad.Sc., 2000,905, 242; T.Tanaka, H.Tsutsui, K.Hirano, T.Koike, A.Tokumuraand K.Satouchi, J.Lipd.Res., 2004, 45,2145.). 최근 몇 년 동안 모세관 전기영동 간접 자외선 검출법, 효소 결합 면역 분석법(Elisa)과 같은 신규한 LPA 정량 분석 방법도 개발되었다. 이러한 방법은 특이성이 있고 측정 기구가 비교적 간단하지만 조작 단계가 비교적 많은 단점이 있다. 시중에서 LPA 검출에 이미 사용되는 Elisa 키트는 사용되는 효소 시약이 환경의 영향을 받기 쉽고 일부 기질은 휘발되기 쉽거나 빛에 민감하기 때문에 작업 조건이 비교적 까다롭다. 또한 일부 조작 단계는 30분 또는 1시간 동안 배양해야 하는데, 이는 비교적 번거롭고 어느 정도 제한이 있다. 형광 프로브는 높은 감도, 단순성 및 편리성, 실시간 분석 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있지만 LPA 화학 센서의 사례는 드물다. Wu Junchen 등은 LPA를 특이적으로 인식할 수 있는 폴리펩티드 프로브를 보고했다. 이는 체내에서 LPA에 특이적으로 결합하여 종양 부위에 집중시킬 수 있으며, 또한 체외에서 혈청 내 LPA를 인식하고 강화된 형광을 방출할 수 있다. 그러나 상기 프로브 연구에 따르면, LPA 농도가 6 내지 20μM 범위에서 우수한 선형 관계를 가지는 것으로 나타났다. 이를 실시간으로 신속하게 즉시 검출하는 방법으로서 난소암의 임상 진단을 위한 LPA를 검출할 경우, LPA 농도가 상기 범위를 초과하면 정확한 검출 결과를 얻을 수 없다(우쥔천(吳君臣)). 리소포스파티드산 특이성 인식에 대한 폴리펩티드 프로브 및 이의 제조와 응용: 중국, 106518965 A[P].2017.03.22.). LanMinhuan 등은 리소포스파티드산의 형광 검출을 위해 3-페닐티오펜(3-phenylthiophene) 기반의 수용성 코폴리티오펜(CPT9)을 설계했다. 이는 LPA가 풍부한 음전하와 비교적 긴 소수성 사슬을 가진 특성을 이용하여 설계한 정전기적 작용, 소수성 작용 및 수소 결합을 기반으로 LPA를 특이적으로 인식하는 형광 프로브이다. 높은 감도와 높은 선택성을 가지고 있으나, 상기 프로브는 공액 폴리머로서 합성 단계가 비교적 많고 저분자 형광 프로브에 비해 배경 노이즈가 더 클 수 있다(M.H.Lan, W.M.Liu, Y.Wang, J.C.Ge, J.C.Wu, H.Y.Zhang, J.H.Chen, W.J.Zhang and P.F.Wang, ACS Appl.Mater.Interfaces, 2013,5,2283.). 또한 LPA 검출에 사용할 수 있는 이러한 소수의 형광 프로브는 완충액에서 응집체를 형성하기 쉬운 경향이 있으며 이는 응집성 소광(aggregation-caused quenching, ACQ) 현상을 유발한다. 이는 시간적 및 공간적 불안정성을 야기할 수 있다. 따라서 고감도, 고선택성으로 LPA의 실시간 정량 분석을 용이하게 수행하고, 응집성 소광 현상의 결함을 극복할 수 있는 수용성 형광 프로브의 설계가 필요하다.
종래의 리소포스파티드산(LPA) 검출용 형광 프로브 성능의 단점을 극복하기 위한 본 발명의 첫 번째 목적은 난소암의 마커인 리소포스파티드산 특이성 인식에 대한 수용성이 우수하며, 동시에 응집 유도 방출 효과(AIE)를 가진 형광 분자 프로브를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 두 번째 목적은 LPA를 특이적으로 인식하며 응집 유도 방출 효과를 가지고 수용액에서 자기조립으로 나노 입자를 형성할 수 있는 형광 분자 프로브를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 세 번째 목적은 원료를 쉽게 구할 수 있고, 조작이 간단한 상기 형광 분자 프로브를 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 네 번째 목적은 조작이 간편하고, 조건이 까다롭지 않은 형광 프로브 나노 입자 제조 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 혈액 내 LPA 검출에서 상기 형광 프로브의 응용을 제공하는 데에 있다. 상기 형광 분자 프로브는 수용액에서 자기조립되어 입자가 크고 구조가 느슨한 나노 입자를 형성한다. LPA와 그 정전기적 상호 작용 및 소수성 작용력을 통해, 형광 프로브를 응집시켜 프로브 분자의 회전을 제한하여 형광을 방출함으로써 LPA에 대한 검출을 구현한다. 이는 감도와 선택성이 높으며 안정성이 우수한 특징을 나타낸다.
상기와 같은 기술적 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 LPA를 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브를 제공한다. 이는 식 1의 구조를 갖는다.
Figure 112021014801146-pct00001
식 1
본 발명에 따른 LPA를 특이적으로 인식하는 형광 분자 프로브는 응집 유도 방출 효과(AIE) 특성을 갖는다. 즉, 400nm 여기 하의 500 내지 600nm 지점에서 강한 형광을 방출하며 비교적 큰 스트로크 시프트(stokes shift)를 갖는다.
본 발명은 LPA를 특이적으로 인식하는 형광 분자 프로브 나노 입자를 더 제공한다. 이는 상기 형광 분자 프로브 자기조립에 의해 형성된다.
본 발명은 상기 LPA를 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 갖는 수용성 형광 분자 프로브의 제조 방법을 더 제공한다. 여기에는 다음 단계가 포함된다.
1) 아세트산/아세트산암모늄(acetic acid/ammonium acetate) 시스템에서 4-포르밀피리딘(4-formylpyridine), 아닐린(aniline) 및 아니실(anisil)의 원 포트(one pot) 고리화 반응을 수행하여 식 2의 중간체를 수득한다.
2) 식 2 중간체는 1,12-디브로모도데칸(1,12-dibromododecane)과 친핵성 치환 반응을 거쳐 식 3의 중간체를 수득한다.
3) 식 3 중간체는 피리딘(pyridine)과 친핵성 치환 반응을 일으켜 표적 생성물을 수득한다.
Figure 112021014801146-pct00002
식 2
Figure 112021014801146-pct00003
식 3
구체적인 제조 단계: 1)의 반응 과정은 다음과 같다. 즉, 4-포르밀피리딘과 아닐린계 화합물을 빙초산 용매에 용해하고 실온에서 0.5 내지 1.5시간 동안 교반한다. 그 다음 벤질(benzil)계 화합물과 아세트산암모늄을 첨가하고 120℃ 조건에서 6 내지 12시간 동안 반응시킨다.
2)의 반응 조건은 다음과 같다. 즉, 아세토니트릴(acetonitrile)을 용매로 사용하고, 90℃ 조건에서 6 내지 10시간 동안 반응시킨다.
3)의 반응 조건은 다음과 같다. 즉, 피리딘을 용매로 사용하고, 90℃ 조건에서 6 내지 10시간 동안 반응시킨다.
본 발명은 상기 LPA를 특이적으로 인식하는 유기 형광 분자 프로브 나노 입자 제조 방법을 더 제공한다. 상기 형광 분자 프로브를 유기 용매에 용해시킨 후, 수용액에 첨가하고 초음파 처리를 수행하여 형광 분자 프로브 나노 입자를 수득한다.
바람직한 기술적 해결책에 있어서, 유기 용매는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide), 아세톤(acetone) 및 아세토니트릴 중 적어도 하나로부터 선택된다.
상기 수용액은 순수(pure water), 생리식염수, 인산염 완충액(PBS), 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 히드로클로라이드(tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride) 완충 용액 또는 HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid) 완충 용액으로부터 선택된다.
본 발명은 상기 LPA를 특이적으로 인식하는 형광 나노 프로브의 응용을 더 제공하며, LPA에 대한 검출은 난소암 진단에 사용된다.
바람직한 기술적 해결책에 있어서, 유기 형광 나노 프로브는 화학 용액 시스템, 피험자 혈액 중 LPA의 형광 정량 분석 검출에 적용된다.
본 발명에 따른 형광 프로브는 4-치환 이미다졸(imidazole) 고리 및 4차 암모늄염(quaternary ammonium salts) 구조를 가지며, 중간은 비교적 긴 소수성 지방 사슬에 의해 연결된다. 형광 프로브 분자는 수용성이 우수하며, 수용성에서 자기조립하여 구조가 느슨한 나노 입자를 형성할 수 있고, 형광을 나타내지 않는다. LPA 인식 후, LPA는 음전하가 높고 소수성 지방 사슬이 길기 때문에, 분자 간 정전기적 작용과 소수성 작용을 통해 형광 프로브의 응집을 유도할 수 있으며, 이는 형광 분자의 회전을 제한하고 강한 황색 형광을 생성한다. 이의 검출 원리는 도 5에 도시된 바와 같다.
본 발명에 따른 LPA를 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 갖는 수용성 형광 분자 프로브의 제조 경로는 다음과 같다.
Figure 112021014801146-pct00004
본 발명의 LPA를 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 갖는 수용성 형광 분자 프로브의 구체적인 제조 방법은 다음 단계에 의해 구현된다.
a. 4-포르밀피리딘과 아닐린을 빙초산에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시킨다. 그런 다음, 아니실과 아세트산암모늄을 순차적으로 첨가하여 균일하게 혼합하며, 계속해서 120℃까지 가열하며 밤새 환류 및 반응시킨다. 반응 종료를 TLC로 검출한 후 물로 반응을 ?칭(quenching)하고, 수산화나트륨 용액을 이용해 pH를 중성에 가깝도록 조정한다. 면상(flocculent) 침전물이 생성되는 것이 관찰되면, 감압 여과하여 필터 케이크를 수득하며, 건조시켜 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 화합물 1을 수득한다.
b. 화합물 1을 아세토니트릴에 용해시키고 1,12-디브로모도데칸을 첨가하여 시스템을 균일하게 혼합한다. 90℃에서 가열 환류한 후 반응이 종료되면 감압 증류하여 용매를 제거하고, 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 화합물 2를 수득한다.
c. 화합물 2를 피리딘에 용해시키고 시스템을 90℃로 가열하여 반응시킨다. 반응이 종료되면 감압 증류하여 용매를 제거하고, 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 표적 화합물을 수득한다.
본 발명의 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 형광 분자 프로브 나노 입자의 제조 방법은 다음과 같은 단계로 구현된다.
표적 화합물을 유기 용매에 충분히 용해시켜 모액을 제조한 후, 피펫(pipette)으로 모액을 빨아 들여 초음파 조건에서 일정량의 수용액에 첨가한다. 시스템은 상온에서 30분간 교반하여 리소포스파티드산 검출용 유기 나노 입자를 수득한다. 동적 광산란(DLS)과 및 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 형성된 나노 입자의 크기와 형태를 관찰한다.
본 발명의 기술적 해결책에 있어서 형광 분자 프로브 나노 입자를 기반으로 리소포스파티드산을 검출하는 것은 형광 분자 프로브를 이용해 수용액에서 자기조립으로 구조가 느슨한 나노 입자를 형성하는 것이다. 형성된 나노 입자 용액에는 형광이 없으며, 리소포스파티드산이 존재하는 경우, 리소포스파티드산과의 정전기적 상호 작용과 소수성 작용력을 통해, 형광 프로브를 응집시켜 응집 상태를 형성하여 프로브 분자의 회전을 제한함으로써 형광을 방출시킨다. 본 발명은 이를 바탕으로 리소포스파티드산 검출 방법을 확립한다. 상기 방법은 선택성과 감도가 높아 널리 보급되고 적용될 수 있다.
본 발명의 형광 분자 프로브 나노 입자는 화학적 시뮬레이션 생물학 시스템에서 리소포스파티드산의 검출에 사용될 수 있다. 또한 임상 의학에서 혈액 내 리소포스파티드산의 검출에도 사용될 수 있다.
종래 기술과 비교할 때, 본 발명의 유익한 기술적 효과는 다음과 같다.
1) 본 발명의 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 형광 분자 프로브 및 나노 입자는 수용성이 우수하고, 자기조립으로 비형광 나노 입자를 형성하는 특징이 있으며, 응집 유도 방출 효과를 나타낸다. 리소포스파티드산과 작용할 때 응집 상태를 형성하고, 557nm 형광을 생성할 수 있다. 특히 형광 검출에 적합하다.
2) 본 발명에 따른 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 형광 분자 프로브 및 나노 입자의 제조 공정은 간단하고 비용이 저렴하며 대규모 생산에 유리하다.
3) 본 발명의 형광 분자 프로브 나노 입자는 혈액 중의 리소포스파티드산을 검출하는데 사용된다. 상기 프로브는 리소포스파티드산에 대한 선택성이 우수하며, 혈청 알부민, 프롤린(proline), 글리세롤(glycerol), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine) 등은 리소포스파티드산의 검출에 대해 간섭을 일으키지 않는다. 상기 나노 프로브 용액의 형광 강도와 리소포스파티드산의 농도는 일정한 범위 내(리소포스파티드산의 농도 범위는 0 내지 33μM)에서 우수한 선형 관계를 나타내며, 정량 검출 특성을 나타낸다. 따라서 임상에서 환자 혈액 중 리소포스파티드산의 함량 검출에 대한 요구 기준을 충족시킬 수 있다.
4) 본 발명의 형광 분자 프로브 나노 입자는 리소포스파티드산에 대한 반응 시간이 짧고, 측정된 감도가 높고 선택성이 강하며 안정성이 우수하다. 또한, 조작이 간단하고 효율적이며, 비용이 낮아 대중화 활용에 적합하다.
도 1은 본 발명에서 제조된 형광 분자 프로브 나노 입자의 동적 산란도이다.
도 2는 본 발명에서 제조된 형광 분자 프로브 나노 입자와 리소포스파티드산 인식의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에서 형광 분자 프로브 나노 입자의 형광 강도와 리소포스파티드산 농도의 선형 관계이며, 횡좌표는 리소포스파티드산 농도이고, 종좌표는 형광 강도이다.
도 4는 본 발명에서 리소포스파티드산에 대한 형광 분자 프로브 나노 입자의 선택성을 도시한 개략도이다.
도 5는 형광 프로브 나노 입자를 리소포스파티드산 검출에 사용하는 원리도이다.
이하 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
본 발명에서 응집 유도 형광 방출 강화의 화합물 3의 합성, 합성 경로는 다음과 같다.
Figure 112021014801146-pct00005
화합물 1의 합성: 4-포르밀피리딘(107.1mg, 1mmol)과 아닐린(93.1mg, 1mmol)을 각각 칭량하여 6 내지 8mL의 빙초산에 용해시키고 실온에서 1시간 동안 교반한다. 아니실(207.2mg, 1mmol)과 아세트산암모늄(462.5mg, 6mmol)을 반응 시스템에 순차적으로 첨가하고 120℃ 조건에서 밤새 반응시킨다. 물로 반응을 ?칭하고 반응 시스템을 200mL 얼음물에 넣는다. 0.1mmol/L의 수산화나트륨 용액을 이용해 시스템 pH를 중성으로 조절하며, 혼합물을 여과하여 물로 3회 세척한다. 진공 건조한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 생성물을 수득한다. 수율은 21.9%이다. 핵자기공명(NMR) 분석 결과는 다음과 같다. 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.47(d,2H),7.55(d,2H),7.45-7.25(m,5H),7.09(t,2H),7.05(d,2H),6.83(d,2H),6.78(d,2H),3.79(d,6H). 13C NMR(100MHz,CDCl3)δ159.40,158.64,149.59,143.36,136.80,132.29,126.77,122.18,113.95,113.71,55.20,55.13.
화합물 2의 합성: 화합물 1(191.5mg, 0.44mmol)과 1,12-디브로모도데칸(145.0mg, 0.44mmol)을 칭량하여 3mL 아세토니트릴 용액에 용해시키고, 실온에서 충분히 교반한다. 반응 시스템을 90℃에서 8시간 동안 충분히 환류시키고, TLC 플레이트로 반응 완료를 모니터링한 후, 감압 증류로 용매를 제거하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 화합물 2를 수득한다. 수율은 34.7%이다. NMR 분석 결과는 다음과 같다. 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.88(d,2H),7.74(d,2H), 7.49(dd,7H),7.20(d,2H),6.90(d,4H),4.45(t,2H),3.73(d,6H),3.51(t,2H),1.79(dd,4H),1.23(s,16H). 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.99,159.14,132.75,130.42,130.10,128.97,128.24,126.12,123.70,121.22,114.57,114.37,60.38,55.57,35.67,32.68,30.77,29.31,29.28,29.18,28.78,28.55,27.95,25.82.
화합물 3의 합성: 화합물 2(155.0mg, 0.20mmol)를 칭량하여 4 내지 5mL 피리딘 용액에 용해시키고 실온에서 충분히 교반한다. 반응 시스템을 90℃에서 8시간 동안 충분히 환류시키고, TLC 플레이트로 반응 완료를 모니터링한 후, 감압 증류로 용매를 제거하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 표적 생성물 3을 수득한다. 수율은 68.2%이다. NMR 분석 결과는 다음과 같다. 1H NMR(500MHz,CD3OD)δ9.11-8.98(m,2H),8.85-8.66(m,2H),8.60(t,1H),8.12(s,2H),7.86(d,2H),7.50(d,5H),7.38(s,2H),7.13(d,2H),6.84(s,4H),4.66(s,2H),4.50(s,2H),3.89-3.62(m,6H),1.99(d,4H),1.56-1.04(m,16H). 13C NMR(125MHz,CD3OD)δ160.33,159.48,145.45,144.54,144.41,143.81,143.77,141.37,139.62,139.58,136.00,132.17,132.14,129.91,129.88,128.32,128.10,123.66,120.69,113.79,113.76,113.41,113.39,61.72,60.69,54.38,54.33,31.10,30.84,30.81,29.76,29.72,29.36,29.33,29.13,29.05,28.68,25.77.
실시예 2
수용성 유기 형광 분자 프로브 나노 입자의 제조:
피펫으로 40μL 화합물 3(1mM)의 인산염 완충 용액을 취하여 ep 튜브에 넣고, 초음파 조건 하에서 1960μL의 인산염 완충 용액(pH=7.4)을 첨가하여 화합물 3의 최종 농도를 20μM으로 만든다. 실온에서 30분간 교반하였을 때 시스템에 유광이 생성되었다. 그 나노 응집 행위를 확인하기 위해 동적 광산란 실험에서 그 평균 입자 크기가 600nm인 것을 측정하였다. 이는 도 1에 도시된 바와 같다.
실시예 3
제조된 형광 분자 프로브 나노 입자와 리소포스파티드산 인식의 주사 전자 현미경(SEM) 테스트:
피펫으로 40μL 화합물 3(1mM)의 인산염 완충 용액을 취하여 ep 튜브에 넣고, 초음파 조건 하에서 1900μL의 인산염 완충 용액(pH=7.4)을 첨가한다. 다시 60μL 리소포스파티드산의 인산염 완충액(1mM)을 첨가하여 용액 중 화합물 3의 최종 농도를 20μM으로, 리소포스파티드산의 최종 농도는 30μM으로 만들며, 실온 조건에서 30분간 교반한다. 제조된 용액 한 방울을 취하여 구리 망에 떨어뜨리고, 여과지로 수분을 흡수한 후 자연 건조시키고 투사 전자 현미경에 두고 관찰한다. 투사 전자 현미경 사진은 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 4
형광 분자 프로브 나노 입자의 형광 강도와 리소포스파티드산 농도의 선형 관계:
실시예 2에서 제조된 시스템에 일련의 상이한 부피의 리소포스파티드산의 인산염 완충 용액 모액을 각각 첨가하여, 리소포스파티드산의 최종 농도가 각각 0μM, 0.2μM, 0.4μM, 0.8μM, 1.0μM, 1.2μM, 1.4μM, 1.8μM, 2.0μM, 4.0μM, 8.0μM, 10.0μM, 12.0μM, 14.0μM, 16.0μM, 18.0μM, 20.0μM, 25.0μM, 30.0μM, 33.0μM이 되도록 한다. 모든 테스트 용액 제조를 완료한 후, 와류기를 이용하여 이를 균일하게 혼합한다. 실온에서 1분 동안 배양한 후 557nm에서 형광 방출 강도를 측정한다. 획득한 결과는 도 3에 도시된 바와 같이, 시스템 중 557nm의 형광 강도와 리소포스파티드산의 농도가 0 내지 33μM 사이에서 우수한 선형 관계를 나타냈다.
실시예 5
유기 형광 나노 프로브의 리소포스파티드산 검출에 대한 선택성:
제조된 형광 분자 프로브 용액을 사용하여 상기 프로브의 리소포스파티드산에 대한 선택성을 평가하며, 상기 나노 프로브의 여기 파장은 400nm이다. 상기 시스템 중 화합물 3의 농도는 10μM이다. 각각 상기 시스템에 리소포스파티드산을 첨가하여 그 최종 농도를 50μM으로 만든다. 최종 농도가 1mM인 L-프롤린, 글리세롤, 인산나트륨, 황산마그네슘, 아세트산나트륨, 질산나트륨, 불화 나트륨, 포도당, 요소 및 리소포스파티딜콜린(LPC)을 충분히 혼합한다. 그 다음 실온에서 1분 동안 배양한 후 그 형광 방출 스펙트럼을 측정하고 557nm에서 형광 방출 강도를 기록한다. 결과는 도 4에 도시된 바와 같이, 리소포스파티드산을 첨가한 시스템에서만 강한 황색 형광이 생성되었으며, 다른 종류의 물질을 첨가한 용액에서는 황색 형광이 거의 관찰되지 않았다. 상기 결과는 상기 유기 형광 분자 프로브 나노 입자가 리소포스파티드산 검출에 대해 우수한 선택성과 실질적인 적용성을 가짐을 나타낸다.

Claims (9)

  1. 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브에 있어서,
    Figure 112023013884632-pct00006

    식 1
    식 1의 구조를 갖고, 4-치환 이미다졸 고리, 도데실 사슬 및 피리딘 고리가 염 형성을 통해 연결되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브.
  2. 삭제
  3. 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 형광 나노 프로브에 있어서,
    제1항에 따른 상기 형광 분자 자기조립에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 형광 나노 프로브.
  4. 제1항에 따른 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브의 제조 방법에 있어서,
    이하의 단계,
    1) 아세트산/아세트산암모늄(acetic acid/ammonium acetate) 시스템에서 4-포르밀피리딘(4-formylpyridine), 아닐린(aniline) 및 아니실(anisil)의 원 포트(one pot) 고리화 반응을 수행하여 식 2의 중간체를 수득하는 단계;
    2) 식 2 중간체는 1,12-디브로모도데칸(1,12-dibromododecane)과 친핵성 치환 반응을 거쳐 식 3의 중간체를 수득하는 단계;
    3) 식 3 중간체는 피리딘(pyridine)과 친핵성 치환 반응을 일으켜 표적 생성물을 수득하는 단계;
    Figure 112021014801146-pct00007

    식 2
    Figure 112021014801146-pct00008

    식 3
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    1)의 반응 과정은, 4-포르밀피리딘과 아닐린계 화합물을 빙초산 용매에 용해하고 실온에서 0.5 내지 1.5시간 동안 교반한 다음, 벤질(benzil)계 화합물과 아세트산암모늄을 첨가하고, 120℃ 조건에서 6 내지 12시간 동안 반응시키고;
    2)의 반응 조건은, 아세토니트릴(acetonitrile)을 용매로 사용하고, 90℃ 조건에서 6 내지 10시간 동안 반응시키고;
    3)의 반응 조건은, 피리딘을 용매로 사용하고, 90℃ 조건에서 6 내지 10시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 응집 유도 방출 효과를 가진 수용성 형광 분자 프로브의 제조 방법.
  6. 제3항에 따른 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 유기 형광 분자 프로브 나노 입자의 제조 방법에 있어서,
    제1항에 따른 상기 형광 분자 프로브를 유기 용매에 용해시킨 후, 수용액에 첨가하고, 초음파 처리를 수행하여 형광 분자 프로브 나노 입자를 수득하는 것을 특징으로 하는 리소포스파티드산을 특이적으로 인식하는 유기 형광 분자 프로브 나노 입자의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide), 아세톤(acetone) 및 아세토니트릴 중 적어도 하나로부터 선택되고, 상기 수용액은 순수(pure water), 생리식염수, 인산염 완충액(PBS), 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 히드로클로라이드(tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride) 완충 용액 또는 HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid) 완충 용액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 분자 프로브 나노 입자의 제조 방법.
  8. 제3항의 형광 나노 프로브를 포함하는 난소암 검출용 조성물.
  9. 삭제
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