KR102556312B1 - 세뇨관 배양부 및 간질 배양부를 포함하는 신장 모사 장기 칩 - Google Patents

세뇨관 배양부 및 간질 배양부를 포함하는 신장 모사 장기 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포가 공배양 되는 신장 조직을 모사하는 장기 칩, 상기 장기 칩 제조방법, 상기 3 종의 세포 공배양 장치, 상기 장기 칩을 이용한 신장 섬유화 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 종래 사용하던 멤브레인을 사용하지 않고도 피브린 겔을 사용하여 배양액 누출(leakage) 및 물리적인 변형 없이 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 공배양할 수 있고, 이에 더하여 혈관내피세포도 함께 공배양할 수 있어 신장 조직을 보다 완벽하게 모사하였으며, 세뇨관 배양부와 간질 배양부로 구조를 간소화하고 상기 구조를 횡적으로 배치함으로써 별도의 배양액 공급 채널(feeding channel)을 두지 않고도, 각 구획에의 약물 투여 및 세포 간 물질교환이 용이하고 염색의 효율성도 증가할 뿐만 아니라 장기 칩 제조 기간 및 비용이 감소하는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하면 신장 섬유화 치료제를 스크리닝 하는데 드는 시간과 오류를 최소화할 수 있고, 객관적인 평가지표를 통해 보다 편리하고 간단하게 신장 섬유화 치료제를 스크리닝 할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

세뇨관 배양부 및 간질 배양부를 포함하는 신장 모사 장기 칩{Kidney-mimicking organ chip comprising tubular culture section and interstitial culture section}
본 명세서에는 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포가 공배양되는 신장 조직을 모사하는 장기 칩, 상기 장기 칩 제조방법, 상기 3 종의 세포 공배양 장치, 상기 장기 칩을 이용한 신장 섬유화 치료제 스크리닝 방법이 개시된다.
고령화 사회 및 당뇨, 고혈압 환자의 증가로 만성신부전 환자가 급격히 증가하고 있으며, 말기 신부전으로 진행되면 투석이나 이식 이외의 신기능을 호전시킬 수 없는 난치병이 된다. 말기 신부전증 환자수가 2014년 7 만명을 초과하였고, 이러한 신장 질환과 관련되어 지출되는 의료보험 급여가 2조원에 육박하고 있다.
이에 비하여, 만성 신부전을 치료하는데 직접적으로 사용되는 약제는 없으며 신장 치료에 효과적인 약제 개발은 아직까지 미진한 상태이다. 이는 인체 모델을 대변할 수 있는 만성 신부전의 동물 모델이 아직까지 확립되지 않았을 뿐만 아니라, 임상시험의 환자 모집에 어려움이 있고, 장기간 추적관찰이 필요하는 등 고비용 저효율의 제한점이 있기 때문이다. 따라서, 만성 신장 질환의 병태생리를 밝히고, 치료제 적용에 활용하기 위한 적절한 신부전 모델 개발이 시급한 상황이다.
신장 조직은 다른 기관과 달리 구조적으로 복잡할 뿐만 아니라, 여러 가지 세포가 혈압, 혈류량 등 다양한 가변적인 미세 환경에 노출되어 있어 치료에는 다각적인 접근이 필요하다. 특히, 신장의 섬유화는 만성신부전으로 이행되는 대부분의 신장질환에서 보이는 공통된 현상이며 사구체의 병변보다는 신세뇨관 간질의 염증 및 섬유화와 밀접한 관계가 있다.
신장 섬유화는 EMT (epitherial mesenchymal transition, 상피세포의 중간엽 세포화) 과정을 통하여 증식된 섬유아세포로 인하여 초래되는 가설과 신세뇨관 상피세포에서 Wnt/Shh 신호전달(signaling) 및 Shh signaling이 섬유아세포를 활성화시켜 초래되는 가설 등 여러 가지가 대두되고 있으나, 아직까지, 섬유화의 근원이 되는 세포나 조절에 대한 정확한 메커니즘이 알려진 바가 없다.
한편, 전임상 실험은 세포 실험 (in vitro)과 동물실험으로 구성되어 있다. 하지만, 세포 실험은 2차원적으로 생체 내 미세 환경을 모두 반영하지 못하고, 동물실험 역시 고비용, 비윤리적인 문제, 종간의 차이로 인한 인간에 직접적으로 적용하는 데 제한이 있다는 등의 문제점이 있다. 이러한 한계점으로 전임상 실험을 통과한 약제 중 40%가 실제 임상시험에서 독성 및 효능의 문제로 탈락하고 있어, 심각한 의료-경제-산업적 부담을 초래하고 있다.
이를 극복하기 위한 방안으로 대두되고 있는 장기 칩 (Organ on a Chip) 기술은 미세유체역학 기술을 이용하여 생체 내 미세환경을 재현한 칩 안에서 세포를 배양하는 기술로써, 세포실험과 동물실험의 각 장점에 시너지를 이루고 단점을 배제할 수 있는 획기적인 기술이 각광받고 있다. 즉, 장기 칩 기술을 통해 기존의 세포배양 모델을 확장하여 공학적인 도구를 낮은 가격에 제공이 가능하며, 따라서 기존의 동물실험과 임상실험에 소요되는 비용을 획기적으로 낮출 수 있는 장점을 지닌다.
기존의 신장 섬유화 동물모델은 일측성 요관 폐쇄술 혹은 허혈-재관류 모델, 약독성 신섬유화 모델 등이 전임상 실험 모델로서 연구되어 왔다. 하지만, 이러한 신장 섬유화 모델이 인체 내의 신장 섬유화를 반영하는 데에는 한계가 있다. 또한, 신장 섬유화 재현에 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포가 주 역할을 하는 세포로 대두되고 있어 두 세포를 공배양(공동배양)할 수 있는 모델을 개발하는 것이 필수적이다.
기존의 신장 장기 칩은 신세뇨관 단일세포로만 개발되어 신장 섬유화를 밝히는데 한계가 있으며, 신장 섬유아세포와의 공배양을 통한 체계적인 장기 칩 개발이 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포를 공배양할 수 있는 장기 칩을 개발하고, 이를 바탕으로 신장 섬유화를 모사할 수 있는 장기 칩을 개발하고자 연구하였다.
KR 10-2014-0013006 A US 2019/0032021 A1 US 2013/0137155 A1
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포가 공배양되고 신장을 모사할 수 있는 장기 칩을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 장기 칩을 이용한 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고, 상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고, 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되는, 신장 모사 장기 칩을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 세뇨관 배양부에 신세뇨관 상피세포를 배양하고, 상기 간질 배양부에 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 신장 모사 장치 칩 제조방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고, 상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고, 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되는, 공배양 장치를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, (a) 상기 신장 모사 장기 칩에 형질전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)를 처리하는 단계; (b) 상기 신장 모사 장기 칩에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질을 처리한 신장 모사 장기 칩에서 신장 섬유화 평가지표를 측정하는 단계;를 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 멤브레인을 사용하지 않고도 배양액 등이 누출되지 않는 이점이 있고, 무세포 피브린 겔을 이용하여 인간 신장 조직 유래 신장 섬유아세포 및 신세뇨관 상피세포를 물리적인 변형 없이 3차원적으로 공배양할 수 있으며, 이에 더하여 혈관내피세포도 함께 공배양할 수 있어 신장 조직을 보다 완벽하게 모사하였으며, 세뇨관 배양부와 간질 배양부로 구조를 간소화하고 상기 구조를 횡적으로 배치함으로써 별도의 배양액 공급 채널(feeding channel)을 두지 않고도, 각 구획에의 약물 투여 및 세포 간 물질교환이 용이하고 염색의 효율성도 증가할 뿐만 아니라 장기 칩 제조 기간 및 비용이 감소하는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하면 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하는 데 드는 시간과 오류를 최소화할 수 있고, 객관적인 평가지표를 통해 보다 편리하고 간단하게 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1a는 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 공배양하기 위한 상층 및 하층의 종적인 다층 구조를 갖는 기존의 신장 모사 장기 칩의 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 공배양하기 위한 횡적인 다구획(multi-compartment) 구조를 갖는 신장 모사 장기 칩의 모식도이다.
도 2는 콜라겐 겔을 이용한 기존의 신장 모사 장기 칩에서 신세뇨관 상피세포(NRK 52) 및 신장 섬유아세포(NRK 49)를 배양하였을 때의 각 세포의 증식을 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포(NRK 52)를 일반 배지에서 배양하였을 때와 피브린 겔 위에서 배양하였을 때의 각 세포의 증식을 촬영한 사진이다.
도 4a 내지 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩의 모식도(도 4a), 사진(도 4b), 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역을 나타낸 모식도(도 4c) 및 상기 각 영역에 세포 등을 시딩하는 과정을 나타낸 도(도 4d)이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩의 모식도(왼쪽), 사진(가운데) 및 상기 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 염색한 결과를 촬영한 사진(오른쪽)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩의 상기 신세뇨관 상피세포(NRK 52)(왼쪽)과 신장 섬유아세포(NRK 49)(오른쪽) 각각에서의 E-cadherin 형광 발현을 촬영한 사진이다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 횡적인 구조를 갖는 신장 모사 장기 칩의 모식도(도 6a), 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역을 나타낸 모식도(도 6b) 및 상기 각 영역에 세포 등을 시딩하는 과정을 나타낸 도(도 6c)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인체 신장조직으로부터 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 분리하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8a 내지 도8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 인체 신장조직으로부터 분리한 신세뇨관 상피세포(Epi)(도 8a) 및 신장 섬유아세포(Fibro)(도 8b), 및 혈관내피세포(HUVEC, GFP-HUVEC)(도 8c 및 8d) 각각에서 E-카드헤린(E-cadherin), 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8), α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA) 및 CD31(cluster of differentiation 31)의 형광 발현을 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 모사 장기 칩의 모식도(왼쪽), 및 신세뇨관 상피세포(NRK 52E) 및 신장 섬유아세포(NRK 49F)에서의 E-카드헤린, 비멘틴(vimentin)의 형광 발현을 촬영한 사진이다(오른쪽).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β 자극 시의 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 모사 장기 칩의 모식도(왼쪽), 및 신세뇨관 상피세포(NRK 52E) 및 신장 섬유아세포(NRK 49F)에서의 E-카드헤린, 비멘틴의 형광 발현을 촬영한 사진이다(오른쪽).
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β 자극 시의 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 모사 장기 칩의 모식도(왼쪽) 및 신세뇨관 상피세포 구획(세뇨관 배양부)과 간질 구획(간질 배양부) 각각에서의 CCK8, CD31 및 α-SMA의 형광 발현을 촬영한 사진이다(오른쪽).
도 12a 내지 12c는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 섬유화 조직 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩의 모식도(도 12a), 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역을 나타낸 모식도(도 12b) 및 상기 각 영역에 세포 등을 시딩하는 과정을 나타낸 도(도 12c)이다.
도 12d는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 섬유화 조직 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩의 실제 사진(왼쪽) 및 신세뇨관 상피세포 구획(세뇨관 배양부)과 간질 구획(간질 배양부) 각각에서의 혈관내피세포(GFP-HUVEC), CCK8 및 α-SMA의 형광 발현을 촬영한 사진이다(오른쪽).
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신세뇨관 상피세포 및 정상 신장 조직 유래 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 모사 장기 칩 및 상기 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극 시의 혈관내피세포(GFP-HUVEC), CCK8 및 α-SMA의 형광 발현을 촬영한 사진(도 13a) 및 CCK8 발현량 및 α-SMA의 발현량을 정량화한 그래프(도 13b)이다.
도 13c 및 13d는 본 발명의 일 실시예 따른 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유화 조직 유래 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩 및 상기 신장 섬유화 모사 장기 칩에 TGF-β 자극 시의 혈관내피세포(GFP-HUVEC), CCK8 및 α-SMA의 형광 발현을 촬영한 사진(도 13c) 및 CCK8 발현량 및 α-SMA의 발현량을 정량화한 그래프(도 13d)이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 3 명의 신장 섬유화 환자 각각의 신장 조직의 손상 정도를 촬영한 사진으로, 빨간색 글씨는 세뇨관 위축(tubular atrophy) 및 간질 섬유화(interstitial fibrosis)의 정도를, 파란색 글씨는 섬유재막의 두꺼워 짐(fibro-intimal thickening)/세동맥경화증(arteriolosclerosis)의 정도를 나타낸다.
도 15a 내지 15c는 본 발명의 일 실시예에 따른 3 명의 신장 섬유화 환자 각각 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(Control), TGF-β 자극 후(TGF-β), TGF-β 억제제 투여 후(TGF-β inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 CCK8 및 α-SMA의 형광 발현, 및 혈관신생 정도를 측정하기 위한 혈관내피세포의 형광 발현(Angiogenesis)을 촬영한 사진이다.
도 16a 및 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 GFR이 90 초과인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 내지 90인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 미만인 신장 섬유화 환자 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(control), TGF-β 자극 후(TGFβ), TGF-β 억제제 투여 후 (TGFβ inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 CCK8 발현량(도 16a) 및 α-SMA의 발현량(도 16b)을 나타낸 그래프이다.
도 17a 및 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 GFR이 90 초과인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 내지 90인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 미만인 신장 섬유화 환자 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(control), TGF-β 자극 후(TGFβ), TGF-β 억제제 투여 후(TGFβ inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 혈관신생 정도를 측정하기 위한 혈관내피세포의 직경 50 μm 이상의 굵은 혈관의 길이의 합(도 17a)과 굵은 혈관 직경의 평균(도 17b)을 나타낸 그래프이다.
도 18a 및 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 GFR이 90 초과인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 내지 90인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 미만인 신장 섬유화 환자 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(control), TGF-β 자극 후(TGFβ), TGF-β 억제제 투여 후(TGFβ inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 혈관신생 정도를 측정하기 위한 혈관내피세포의 직경 50 μm 미만의 얇은 혈관의 길이의 합(도 18a)과 얇은 혈관 직경의 평균(도 18b)을 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 GFR이 90 초과인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 내지 90인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 미만인 신장 섬유화 환자 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(control), TGF-β 자극 후(TGFβ), TGF-β 억제제 투여 후(TGFβ inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 KIM-1 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 GFR이 90 초과인 신장 섬유화 환자 유래 세포, GFR이 60 내지 90인 신장 섬유화 환자 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서의 TGF-β 자극 전(control), TGF-β 자극 후(TGFβ), TGF-β 억제제 투여 후(TGFβ inhibitor)의 신장 섬유화 평가지표인 VEGF 발현량을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, "유전자의 발현"이라 함은 전사, 번역 및 번역 후 변형 등을 포함하는 최광의의 개념이다.
본 발명의 일 측면에서, "상대적 발현량"은 시험물질을 처리하기 전의 신장 모사 장기 칩, 구체적으로 상기 장기 칩의 세포 또는 배양액에서의 특정 유전자 또는 단백질, 구체적으로 본 발명의 일 측면에 따른 CCK8, α-SMA, KIM-1 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현량에 대한 시험물질을 처리한 후 세포 또는 배양액에서의 상기 발현량을 비교하였을 때 발현이 촉진된 정도일 수 있다. 또는, "상대적 발현량"은 시험 물질을 처리한 신장 모사 장기 칩, 구체적으로 상기 장기 칩의 세포 또는 배양액에서의 특정 유전자 또는 단백질, 구체적으로 본 발명의 일 측면에 따른 CCK8, α-SMA, KIM-1 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현량을 시험 물질을 처리하지 않은 신장 모사 장기 칩, 구체적으로 상기 장기 칩의 세포 또는 배양액에서의 상기 발현량과 비교하였을 때의 발현이 촉진된 정도일 수 있다. 상기 상대적 발현량은 예컨대, mRNA의 상대적 발현량 또는 단백질의 상대적 발현량을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고, 상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고, 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되는, 신장 모사 장기 칩을 제공한다.
기존의 신장 모사 장기 칩은 종적인 구조를 가지고 있어 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포를 공배양 시 별도의 배양액 공급 채널이 필요하고 상기 채널과 상층부 간의 연결이 없어야 하는 한계가 있었다. 그러나, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 상기 세뇨관 배양부 및 상기 간질 배양부가 횡적으로 배치될 수 있고, 구조가 단순하여, 별도의 배양액 공급 채널 없이도 각 배양부에 약물 투여가 용이한 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 간질 배양부는 피브린 겔(fibrin gel)을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 간질 배양부는 상기 신장 섬유아세포을 포함하는 신장 섬유아세포 영역; 및 상기 혈관내피세포를 포함하는 혈과내피세포 영역을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 신장 섬유아세포 영역 또는 상기 혈관내피세포 영역은 피브린 겔을 추가로 더 포함할 수 있다. 기존의 신장 모사 장기 칩은 콜라겐 겔을 이용 시 콜라겐 겔의 수축으로 인한 구조의 변형 문제가 있었고, 별도의 멤브레인을 포함함으로써 배양액 누출(leakage) 및 멤브레인에 세포의 탈착 문제가 있었으나, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 콜라겐 겔 대신 피브린 겔을 이용하여 물리적 변형이 일어나지 않고, 멤브레인을 포함하지 않아 상기 배양액 누출 문제도 발생하지 않으며, 피브린 겔에서도 세포가 부착 능력이 유지되어 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 동시에 배양할 수 있는 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 인체 유래 세포일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 인체로부터 유래한 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로부터 유래한 둘 이상의 세포를 공배양할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포는 인체 유래 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 인체 유래 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 인체 유래 신장 조직으로부터 분리된 세포일 수 있으나, 인체 유래 세포가 본래의 특징 및 기능을 유지하면서 신장 모사 장기 칩에서 공배양될 수 있다면 그 분리 방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 정상 신장 조직으로부터 분리된 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 모사 장기 칩은 세뇨관 배양부에서 상피세포 마커인 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8)만이 발현되고 α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA)은 발현되지 않은 반면, 간질 배양부에서 섬유아세포 마커인 α-SMA과 혈관내피세포 마커인 CD31만이 발현되고, CCK8은 발현되지 않음을 확인하였는바, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 인체 유래 세포를 포함하고 서로 다른 종류의 상기 세포들을 공배양 할 수 있어, 시간 및 비용을 절약할 수 있는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다(실시예 2).
본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포는 신장 질환 환자 유래 세포일 수 있고, 구체적으로 신장 섬유화가 진행된 환자 유래 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 신부전 환자 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신장 질환 환자로부터 유래한 신세뇨관 상피세포 또는 신장 섬유아세포로부터 유래한 세포를 공배양할 수 있고, 상기 신장 질환 환자로부터 유래한 신세뇨관 상피세포 또는 신장 섬유아세포를 포함하거나 공배양하는 신장 모사 장기 칩은 신장 섬유화 모사 장기 칩일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포는 신장 질환 환자 유래 세포일 수 있고, 상기 신장 질환 환자 유래 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 신장 질환 환자 유래 신장 조직으로부터 분리된 세포일 수 있으나, 신장 질환 환자 유래 세포가 본래의 특징 및 기능을 유지하면서 신장 모사 장기 칩에서 공배양될 수 있다면 그 분리 방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 신부전 환자 유래 신장 조직으로부터 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩은 세뇨관 배양부에서 상피세포 마커인 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8)만이 발현되고 α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA)은 발현되지 않은 반면, 간질배양부의 혈관내피세포 영역에서 혈관내피세포의 형광 발현을 확인하였으며, α-SMA는 발현되지 않아, 상기 영역에서 모세혈관 구조 형성을 확인하였는바, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신장 질환 환자 유래 세포를 포함하고 서로 다른 종류의 상기 세포들을 공배양할 수 있어, 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하는 모델로 활용 가능하여 치료제 개발에 들이는 시간 및 비용을 절약할 수 있는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다(실시예 3).
본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 형광 염색 세포일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로부터 유래한 하나 이상의 세포를 형광 염색할 수 있다, 구체적으로 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 면역형광 염색 세포일 수 있으나, 공배양된 상기 서로 다른 세포의 생존 또는 사멸 여부를 확인할 수 있는 세포 염색 방법이라면 그 방법은 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로부터 유래한 하나 이상의 세포를 형광 염색할 수 있다. 또는, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 형광 발현하는 세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 세뇨관 배양부 및 간질 배양부가 횡적으로 배치되고, 구조를 단순화하고 그 구분이 잘 이루어져 있어, 별도의 배양액 공급 채널을 포함하지 않고 상기 3 종의 세포 간의 물질교환 및 형광 염색의 효율성이 증가함을 알 수 있었다(실시예 1-1 및 2-2).
본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 2 이상의 간질 배양부를 포함하고, 상기 세뇨관 배양부는 2 이상의 간질 배양부 사이에 위치하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 간질 배양부 2 개가 횡적으로 배치된 경우 그 사이에 상기 세뇨관 배양부가 배치된 것일 수 있다(도 6a 및 도 12a).
다른 측면에서, 본 발명은 상기 신장 모사 장기 칩 제조방법으로서, 상기 세뇨관 배양부에 신세뇨관 상피세포를 배양하고, 상기 간질 배양부에 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신장 모사 장치 칩 제조방법을 제공한다. 상기 신장 모사 장기 칩, 세뇨관 배양부, 신세뇨관 상피세포, 간질 배양부, 신장 섬유아세포, 혈관내피세포 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 상기 세포 배양 단계 전 인간 신장조직에서 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분리 방법은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고, 상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고, 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되는, 공배양 장치를 제공한다. 상기 신세뇨관 상피세포, 세뇨관 배양부, 신장 섬유아세포, 혈관내피세포, 간질 배양부, 횡적 배치 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 상기 신장 모사 장기 칩에 형질전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)를 처리하는 단계; (b) 상기 신장 모사 장기 칩에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질을 처리한 신장 모사 장기 칩에서 신장 섬유화 평가지표를 측정하는 단계;를 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 신장 모사 장기 칩에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 (a) TGF-β 처리 단계는 상기 신장 모사 장기 칩 내의 배양액에 TGF-β를 첨가하는 것일 수 있고, 상기 첨가되는 TGF-β의 양 또는 농도는 상기 신장 모사 장기 칩에 존재하는 세포의 양 또는 시험 물질의 양 등에 의해 달라질 수 있으며, 상기 신장 모사 장기 칩에 존재하는 세포들을 손상 내지 사멸시키지 않는 범위에서 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있는 양 또는 농도라면 그 범위는 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 포함하는 서로 다른 종류의 세포들을 공배양할 수 있어, 상기 각 세포들을 각각 따로 배양하여 TGF-β를 처리할 때보다 상기 세포들을 공배양하면서 TGF-β를 처리할 때, TGF-β가 신장 섬유아세포를 더욱 자극하여 보다 다양한 사이토카인(예를 들어, 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 인터루킨-1 β(interleukin-1 β, IL-1 β), TGF-β2, TGF-β3, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등)이 함께 증폭되어, 보다 생체 내 환경을 잘 모사할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 신장 모사 장기 칩의 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 신장 질환 환자 유래 세포일 수 있고, 구체적으로 신장 섬유화가 진행된 환자 유래 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 신부전 환자 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩은 신장 질환 환자로부터 유래한 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 공배양할 수 있고, 상기 신장 질환 환자로부터 유래한 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 공배양하는 신장 모사 장기 칩은 신장 섬유화 모사 장기 칩일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 신장 질환 환자 유래 세포일 수 있고, 상기 신장 질환 환자 유래 세포는 당업계에서 알려진 방법에 의해 신장 질환 환자 유래 신장 조직으로부터 분리된 세포일 수 있으나, 신장 질환 환자 유래 세포가 본래의 특징 및 기능을 유지하면서 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있다면 그 분리 방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 신부전 환자 유래 신장 조직으로부터 분리된 신장 섬유아세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩은 신장 섬유화 치료 시험물질 처리 전후, 또는 시험물질을 처리하지 않은 장기 칩과 시험물질을 처리한 장기 칩(신장 섬유화 모사 장기 칩)에서의 신장 섬유화 평가지표들이 차이가 있는바, 시간 및 비용에 있어 효율적으로 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있는 우수한 효과가 있음을 알 수 있다(실험예 1 내지 3).
본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 신장 모사 장기 칩에 시험물질을 처리하기 전과 후 또는 시험물질을 처리하지 않은 경우와 시험물질을 처리한 경우의 신장 섬유화 평가지표를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 시험물질을 처리한 신장 모사 장기 칩과 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전의 신장 모사 장기 칩에서 신장 섬유화 평가지표를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 신장 섬유화 평가지표는 상기 신세뇨관 상피세포에서 사이토케라틴 8 (cytokeratin 8, CCK8) 및 α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량; 상기 혈관내피세포가 배양된 간질 배양부에서의 혈관신생(angiogenesis)의 정도; 상기 혈관내피세포에서의 분화 클러스터 31(cluster of differentiation 31, CD31)의 상대적 발현량; 및 배양액의 신장 손상 분자-1(Kidney Injury Molecule-1, KIM-1) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 시험물질 처리 여부에 따라 결과가 달라져서 신장 섬유화 치료제의 판정이 가능한 객관적인 평가지표라면 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 따른 상기 배양액은 상기 신장 모사 장기 칩 내에 존재하는 세포 배양액일 수 있고, 구체적으로 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 공배양하기 위한 배양액일 수 있으며, 보다 구체적으로 혈관내피세포 배양액일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 신세뇨관 상피세포에서 CCK8 및 α-SMA으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과, 상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 CCK8의 발현량이 증가한 경우, 또는 α-SMA의 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 상기 신세뇨관 상피세포를 포함하는 세뇨관 배양부에서는 CCK8의 발현량이 감소하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 TGF-β 자극 전에 비해 변화가 없거나 증가하고 TGF-β 자극 시에 비해 증가하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 CCK8 발현량 감소 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 신세뇨관 상피세포에서의 CCK8의 상대적 발현량이 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 및 2).
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 상기 신세뇨관 상피세포를 포함하는 세뇨관 배양부에서는 α-SMA의 발현량이 증가하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 TGF-β 자극 전에 비해 변화가 없거나 감소하고 TGF-β 자극 시에 비해 감소하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 α-SMA 발현량 증가 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 신세뇨관 상피세포에서의 α-SMA의 상대적 발현량이 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 및 2).
본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 혈관내피세포가 배양된 간질 배양부에서의 혈관신생(angiogenesis)의 정도를 측정하는 것을 포함할 수 있고, 상기 혈관신생의 정도는 상기 간질 배양부에서 형성된 혈관 중 굵기가 50 μm 미만인 혈관의 길이의 합일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 상기 혈관신생의 정도를 측정한 결과 상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 혈관신생 정도가 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 상기 혈관내피세포를 포함하는 간질 배양부에서는 굵은 혈관의 총 길이의 합이 감소하고, 직경도 감소하며, 얇은 혈관의 총 길이의 합이 증가하는 등 혈관신생의 정도가 증가하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 TGF-β 자극 전에 비해 변화가 없거나 감소하고 TGF-β 자극 시에 비해 감소하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 혈관신생의 증가 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 혈관내피세포를 포함하는 간질 배양부에서의 혈관신생 정도의 변화가 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 및 2).
본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 혈관내피세포에서의 분화 클러스터 31(cluster of differentiation 31, CD31) 의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과 상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 CD31의 상대적 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 신세뇨관 상피세포의 α-SMA가 혈관내피세포 영역으로 침범하여 상기 혈관내피세포를 포함하는 간질 배양부에서는 α-SMA의 발현량이 증가하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 TGF-β 자극 전에 비해 변화가 없거나 감소하고 TGF-β 자극 시에 비해 감소하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 α-SMA 발현량 증가 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 신세뇨관 상피세포에서의 α-SMA의 상대적 발현량이 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 및 2). 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, TGF-β에 의해 EMT (epitherial mesenchymal transition, 상피세포의 중간엽 세포화)가 유도되고, 이후 간질로 신세뇨관 상피세포의 침범이 유도되며, 이러한 기전에서 신장 섬유아세포의 체액성 인자(humoral factor)가 관여함을 확인할 수 있었다(실험예 1 및 2).
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 상기 혈관내피세포를 포함하는 간질 배양부에서는 VEGF의 발현량이 증가하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 감소하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 VEGF의 발현량 증가 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 혈관내피세포를 포함하는 간질 배양부에서의 VEGF의 상대적 발현량이 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 3).
본 발명의 일 측면에 따른 (c) 신장 섬유화 평가지표 측정 단계는 상기 신장 모사 장기 칩에 포함된 배양액 내의 신장 손상 분자-1(Kidney Injury Molecule-1, KIM-1) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과, 상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 KIM-1 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩에 TGF-β 자극을 통해 신장 섬유화를 유도하였을 때 상기 배양액에서는 KIM-1의 발현량이 증가하였다가, 신장 섬유화 치료제의 일종인 TGF-β 억제제를 투여 시에는 TGF-β 자극 전에 비해 변화가 없거나 감소하고 TGF-β 자극 시에 비해 감소하였는바, TGF-β 자극을 통해 유도된 신장 섬유화에 의한 KIM-1 발현량 감소 경향이 TGF-β 억제제 투여에 의해 상쇄되어, 상기 배양액에서의 KIM-1의 상대적 발현량이 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표로 활용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 3).
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 개발
종래 설치류 유래 신세뇨관 상피세포(NRK 52) 및 신장 섬유아세포(NRK 49)를 공배양하기 위한 종적인 다층 구조의 신장 모사 장기 칩이 존재하지만(도 1a), 하이드로겔을 이용 시 3차원 섬유아세포 배양을 위해 별도의 배양액 공급 채널(feeding channel)이 추가로 필요하고 콜라겐 겔을 이용 시 콜라겐 겔의 수축으로 하층의 구조가 일정하게 유지되지 않는 문제가 있었다. 또한, 하층 구조를 일정하게 유지할 목적으로 피브린 겔(fibrin gel)을 이용하여 신장 섬유아세포(NRK 49)를 3차원 배양하였으나, 배양액 공급이 원활하게 이루어지지 않아, 세포의 증식이 원활하게 이루어지지 못하는 한계가 있었다. 나아가, 상피 세포 쪽에서 배양액이 공급되지만 배양액 공급이 한쪽에서만 이루어질 때 3차원 섬유아세포(NRK-49F)의 증식이 잘 이루어지지 않아, 3차원 섬유아세포(NRK-49F) 배양을 위해 배양액 공급 채널을 추가하여 3차원 섬유아세포가 있는 쪽으로 배양액을 공급해야 하는 구조적인 문제가 있다.
이에, 신장 섬유아세포의 증식에 필요한 배양액 및 치료제 후보물질 투여 등이 원활하게 이루어지고 상기와 같은 구조적 문제를 해결하기 위한 신장 모사 장기 칩을 아래와 같은 방법으로 제조하였다.
[실시예 1-1] 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 제조
본 발명의 일 측면에 따른 신장 모사 장기 칩을 제조하기 위해, 설치류 유래 신세뇨관 상피세포(NRK-52E)(ATCC #CRL-1571) 및 신장 섬유아세포(NRK-49F)(ATCC #CRL-1570)와 이들의 배양액으로 5% 우아혈청(Bovine Calf Serum, gibco #16170-078)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, gibco #15140-122)이 첨가된 DMEM 고포도당 배지(welgene #LM001-51)를 사용하였으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
장기 칩에 사용되는 피브린 겔 제조 시에 사용된 시약은 다음과 같다.
- 피브리노겐(Fibrinogen from bovine plasma)(Sigma, #F8630): 1xPBS에 10 mg/ml로 녹이고, 이를 부드럽게 혼합한 후(vortex하지 않음), 37℃수조에서 30 분 동안 배양한 다음, 멸균 필터(0.22μm 필터)로 여과함.
- 트롬빈(Thrombin from bovine plasma)(Sigma, #T4648 1KU): 3'DW에 50 U/ml로 녹이고 멸균 필터(0.22μm 필터)로 여과함.
- 아프로티닌(Aprotinin from bovine lung) (Sigma, #A1153): 3'DW에 4 TIU/ml로 녹이고 멸균 필터(0.22μm 필터)로 여과함.
- 각각 500 μl의 분취량(aliquot) 제조하여, -20℃에서 보관.
또한, 무세포 피브린 겔(Blank fibrin gel), 유세포 피브린 겔(Fibrin gel+Cell)을 다음과 같은 과정으로 제조하였다. 1.5 ml E-tube에 피브리노겐 250 μl을 넣은 다음, E-tube에 40 μl의 아프로티닌을 첨가하였다. 이 때, 무세포 피브린 겔 (2.5mg/ml 피브린)은 10mg/ml의 피브리노겐 250 μl와 4 TIU/ml의 아프로티닌 40ul, 1x PBS 710 μl을 포함하고, 피브리노겐과 아프로티닌 용액은 10 mg/ml의 피브리노겐 250 μl과 4 TIU/ml의 아프로티닌 40 μl을 포함한다. 그런 다음, 세포 제조 전에, 아프로티닌과 트롬빈을 냉동실에서 꺼내 상온에서 해동하였다. 이후, 세포 현탁액, 및 피브리노겐과 아프로티닌 용액의 비율 3 : 1이 되는 세포 현탁액 37.5 μl을 각 E-tube에 분주하였다. 이 때, 세포의 농도는 목표 농도보다 4/3 배 높아야 한다. 그리고, 96웰 플레이트의 각 웰에 1 μl의 트롬빈을 로딩하고, 상기 제조된 E-tube (37.5 μl의 세포 현탁액 포함)에 피브리노겐과 아프로티닌 용액 12.5 μl을 첨가한 다음, 이를 부드럽게 섞었다. 상기 혼합물 (총 50 μl)을 1 μl의 트롬빈이 미리 로딩된 웰로 옮기고 위 아래 두 번 피펫팅 정도로 부드럽고 빠르게 혼합하였다. 상기 혼합물로부터 20 μl 또는 50 μl를 취해 부드럽게 섞어준 후 세포 배양 채널의 겔 로딩 포트에 주입하여(45 내지 60 초 내에 섬유소 응고), 설치류 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩을 제조하였다.
도 1b에 나타난 바와 같이, 상기 방법으로 제조한 신장 모사 장기 칩은, 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포을 3차원 공배양하는 구조는 유지하되, 종래의 종적인 구조가 아닌 각 구획에 배양액 공급(feeding supply)을 별도로 유지하는 횡적인 구조의 장기 칩으로 디자인을 변경하였다. 또한, 도 4a에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 신장 모사 장기 칩은 횡적인 구조로서 총 5개의 구획으로 나누어지는데, 가운데에 위치한 무세포 피브린 겔(Balnk Fibrin Gel) 로 구획을 나누고, 위 아래로 신세뇨관 상피세포 배양 구획(도 4a의 Epithelial cell Suspension)과 신장 섬유아세포 배양 구획(도 4a의 Fibroblast + Fibrin gel) 구획으로 나누어 진다. 나아가, 수축성이 적은 피브린 겔을 신장 섬유아세포 배양 공간에 활용하여, 별도의 멤브레인 구성 없이 각 구획을 구분하고 배양액을 용이하게 투여할 수 있어 공배양 조건을 완성하였다.
[실시예 1-2] 생체 모사 여부 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 신장 모사 장기 칩이 정상적으로 생체를 모사하는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
A. 피브린 겔에 배양 시 세포의 부착 및 증식 능력 확인
종래 별도의 멤브레인을 PDMS 소재 사이에 삽입하는 구조로 제작된 장기 칩에서 배양액 누출(leakage) 또는 세포 탈착 등의 문제점이 발견되어, 상기 실시예 1-1에서 제조한 신장 모사 장기 칩은 이를 보완하기 위해 무세포 피브린 겔을 이용하여 구획을 나누었다.
그리고, 먼저 신세뇨관 상피세포(NRK-52E)가 일반 웰에서 배양했을 때와 피브린 겔에서 배양했을 때 부착능력 및 증식 능력에 차이가 있는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 신세뇨관 상피세포(NRK-52E)(ATCC #CRL-1571)의 배양액으로는 5% 우아혈청(Bovine Calf Serum, gibco #16170-078)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, gibco #15140-122)이 첨가된 DMEM 고 포도당 배지(welgene #LM001-51)를 사용하였으며, 피브린 겔은 피브리노겐(Sigma, #F8630), 트롬빈(Sigma, #T4648 1KU) 및 아프로티닌(Sigma, #A1153)을 이용하여 제조하고, 세포의 생존/사멸 여부는 포유류 세포용 LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen, #L3224)를 이용하여 염색하여 확인하였다. 일반 웰에서의 배양의 경우(대조군, 도 3의 control) 상기 준비된 신세뇨관 상피세포를 96 웰 플레이트에 2 X 104/웰 만큼 시딩한 후 3일 배양하였다. 피브린 겔에서의 배양의 경우(도 3의 Fibrin gel), 10 mg/ml의 피브리노겐 250 μl와 4 TIU/ml의 아프로티닌 40 μl 및 1x PBS 710 μl를 포함하는 무세포 피브린 겔 용액을 제조하고, 상기 무세포 피브린 겔 용액 50 μl과 트롬빈 1 μl을 혼합하여 96 웰 플레이트의 웰에 넣어주고 3 내지 5분 가량 겔화시켰다. 그런 다음, 2 X 104/웰 만큼 시딩한 후 3일 배양하였다. 이후, 상기 대조군과 피브린 겔에서 배양된 세포들을 배지에서 세포핵 염색은 Hoechst 1:500, 살아있는 세포 염색은 Calcein 1:2000, 사멸한 세포 염색은 EthD-1 1:500로, 각 웰에 100 μl씩 넣어주고 상온에서 30 분 동안 배양하였다. 그리고, 1X PBS로 세척한 후, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
도 3에 나타난 바와 같이 세포의 부착능력 및 증식 능력이 일반 웰에서 배양했을 때와 피브린 겔 위에서 배양하였을 때 차이가 없음을 확인하였다.
B. 신장 모사 조직 칩의 피브린 겔에서의 신세뇨관 상피세포 부착 및 증식 능력 확인
신세뇨관 상피세포(NRK-52E)가 피브린 겔에 단층(monolayer)로 부착하여 배양하는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 이 때 사용된 신세뇨관 상피세포, 피브린 겔, 신장 섬유아세포는 상기 실시예 1-1과 동일하다.
상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 장기 칩의 무세포 피브린 겔 영역(도 4c의 노란색 영역, Gel A)에 10 mg/ml의 피브리노겐 250 μl, 4 TIU/ml의 아프로티닌 40 μl 및 1 X PBS 710 μl이 혼합된 2.5 mg/ml의 무세포 피브린 겔 50 μl을 트롬빈 1 μl와 혼합하여 도 4d의 i 및 ii와 같이 시딩하고 10 mg/ml의 피브리노겐 250 μl 및 4 TIU/ml의 아프로티닌 40 μl이 혼합된 10 mg/ml의 피브린 겔 용액 12.5 μl을 200 X 104/ml의 신장 섬유아세포 37.5 μl과 혼합하고, 상기 혼합액 50 μl을 트롬빈 1 μl와 혼합하여 상기 신장 모사 장기 칩의 신장 섬유아세포 영역(도 4c의 파란색 영역, Gel B)에 도 4d의 iii 및 iv와 같이 시딩하고 3 내지 5 분 정도 겔화시켰다. 그런 다음, 300 X 104/ml의 신세뇨관 상피세포 현탁액 10 μl을 상기 신장 모사 칩의 무세포 피브린 겔 영역의 위쪽 영역(이하, 신세뇨관 상피세포 영역)에 도 4d의 v와 같이 시딩하고 원하는 방향(본 실험에서는 위쪽)으로 90°기울인 다음 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역에 상기 세포의 부착능력 및 증식 능력 실험에서와 동일한 배지 150 내지 200 μl을 채웠다. 상기 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포 등을 시딩하고 7일 동안 배양한 후 상기 실시예 1-2의 A.와 동일한 방법으로 살아있는 세포와 사멸한 세포를 염색을 하고, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과는 도 4e와 같다.
도 4e에 나타나 바와 같이, 신세뇨관 상피세포가 피브린 겔에 단층으로 부착하여 컨플루언시(confluency)를 이룬 것을 확인하였으며, 신장 섬유아세포 역시 피브린 겔의 독립된 공간에서 증식하고, 콜라겐 겔을 이용한 장기 칩과는 달리 추가적인 수축으로 인한 물리적 변형은 관찰되지 않았다.
C. 신장 모사 조직 칩에서 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포의 공배양 확인
상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 조직 칩에서 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포의 공배양이 원활하게 이루어지는지 확인하기 위해 상피세포 마커인 E-카드헤린에 대하여 면역형광법(Immunofluorescence staining, IF staining)을 수행하였으며, 이 때 사용된 신세뇨관 상피세포, 피브린 겔, 신장 섬유아세포는 상기 실시예 1-1과 동일하고, 이들의 시딩 및 배양 방법은 상기 실시예 1-2의 B와 동일하다.
구체적으로, 4% 파라포름알데히드 고정액(Biosesang, #P2031)으로 상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 조직 칩의 신장 섬유아세포 영역 및 신세뇨관 상피세포 영역 각각의 세포를 상온에서 15 분 동안 고정하고, 0.5% 트리톤-X(sigma, #T9284)를 처리하여 상온에서 10 분 동안 배양한 후, 1% 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)(sigma, #A2153)을 첨가하여 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 1X PBS(welgene, #LB004-02)로 세척하고, 1 X PBS에서 희석한 E-카드헤린 1차 항체 antibody(BD, #610182)를 처리 후 상온에서 3 일동안 반응시키고, 다시 1X PBS로 세척하였다. 세척 후, 1% BSA에서 1:100으로 희석한 E-카드헤린에 대한 2차 항체(2차antibody Anti-Mouse IgG H&L)(Alexa Fluor® 488) (Abcam, #ab150105)를 처리하고 상온에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 다시 1 X PBS로 세척하였다. 이후, 1X PBS에서 1:250으로 희석한 염색약 Hoechst를 처리하여 상온에서 3시간동안 염색하고, 1x PBS로 세척한 후, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 조직 칩의 신세뇨관 상피세포 영역에서는 E-카드헤린의 발현이 정상적으로 뚜렷하게 발현되고, 신장 섬유아세포 영역에서는 E-카드헤린이 발현되지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 장기 칩을 이용하여 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포를 공배양 할 수 있음을 알 수 있었다.
이를 통해, 상기 실시예 1-1에서 제조된 신장 모사 장기 칩은, 물리적인 변형을 최소화하기 위해 피브린 겔을 사용함으로써 신장 섬유아세포를 3차원 배양할 수 있고, 이 때 물리적인 변형 없이 증식이 유지됨을 확인하였고, 횡적인 구조로 5개의 구획을 확보하여 별도의 배양액 공급 채널(feeding channel)을 두지 않고도, 각 구획에 약물 투여가 용이함을 확인하였다. 또한, 멤브레인을 사용하지 않고도 배양액 등이 누출되지 않는 이점이 있고, 신세뇨관 상피세포의 생착이 용이하였으며, 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포의 공배양이 가능하여 두 종의 세포를 동시에 시딩(seeding)하는 것이 가능해져서 장기 칩 제조 기간이 단축되는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 2] 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 개발
기존의 펌프를 사용한 장기 칩은 다양한 종류의 세포를 도입하는데 한계가 있고, 대량 신속처리(high throughput)가 가능하지 않아 실험군을 단시간에 다양하게 적용하는데 단점이 있었다. 또한, 장기 칩의 횡적인 구조 내에서 각 구획간의 간극이 있어, 세포-세포 간 물질교환 및 세포 염색(면역형광 염색 등)에 많은 시간이 소요되는 문제가 있었다. 나아가, 신장 섬유화를 일으키는 주요 세포인 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 이외에도 혈관내피세포가 섬유화 진행에 참여하는 주요 인자로 알려져 있어, 이를 반영하기 위해 혈관 내피세포의 도입이 필요하였다.
이에, 위의 문제들을 반영하여 상기 실시예 1-1에서 제조한 장기 칩을 개선하여 인체 유래 세포를 이용한 신장 모사 장기 칩을 아래와 같은 방법으로 제조하였다.
[실시예 2-1] 인체 신장조직으로부터 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포 분리
인체 신장조직으로부터 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 분리하기 위해, 신장 적출술 환자에서 인체 유래 신장조직을 얻기 위한 코호트 구축하고, IRB 승인을 획득하였다(B-1408-264-003). 이후, 근치적 신장 절제술을 시행할 환자 중에서 인체 유래물 기증에 동의한 하기 표 1의 환자 4 명으로부터 신장조직 일부를 수득하고, 다음과 같은 방법으로 조직 해리(tissue dissociation) 장비를 이용하여 세포를 처리하고, 정상 신장조직에서 신장 상피세포 및 신장 섬유아세포를 분리하였으며, FACS 분석과 면역형광법(Immunofluorescence staining, IF staining)을 통해 확인하였다.
환자# 수술날짜 환자 신장기능
(eGFR)		 세포 유형 환자
리스트		 세포 유형 FACS
(+)%		 FACS
(-)%
1 2018.03.29 만성신부전
(61.2)		 정상 신세뇨관 상피세포 NX001-N Epi(+) 98.57 92.92
2018.03.29 정상 신장 섬유아세포 NX001-N Fibro(+) 92.25 67.02
2 2018.04.03 정상 신기능
(92.4)		 정상 신세뇨관 상피세포 NX003-N Epi(+) 97.35 78.31
2018.04.03 정상 신장 섬유아세포 NX003-N Fibro(+) 78.13 58.78
3 2018.04.04 만성신부전
(57.3)		 정상 신세뇨관 상피세포 NX004-N Epi(+) 68.57 64.87
2018.04.04 정상 신장 섬유아세포 NX004-N Fibro(+) 53.36 43.37
4 2018.06.12 정상 신기능
(101.7)		 정상 신세뇨관 상피세포 NX010-N Epi(+) 97.11 90.21
2018.06.12 정상 신장 섬유아세포 NX010-N Fibro(+) 87.87 44.12
구체적으로, 상기 표 1의 환자들로부터 수득한 신장 조직을 4℃ 보관한 후, 각 조직에서 필요 없는 부분을 제거하고 0.5g 이하로 나누어 E-tube에 넣고 아이스 꽂아두었다. 이후, 정상 조직 효소 혼합액(Normal Tissue Enzyme Mix) 2.5 ml씩을 C-tube에 넣고 각 조직을 PBS로 세척한 후 C-tube 안에 넣어서 가위로 3 내지 4 mm 정도의 크기가 되도록 잘라주었다. 상기 C-tube를 조직분쇄기(gentleMACSTM Octo Dissociator, Miltenyi Biotec, #130-095-937) 꽂고 조직에 맞는 프로그램 (Normal-37C_Multi_B)을 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 그런 다음, 분리된 세포를 거름망(Strainer)에 걸러주고 세척 후 세포 배양 배지 종류에 맞게 세포를 나눈 후, 각 세포를 어느 정도 배양한 후 신세뇨관 상피세포는 CD326 마이크로비즈(CD326 (EpCAM) MicroBeads human, Miltenyi Biotec, #130-061-101), 신장 섬유아세포는 항-섬유아세포 마이크로 비즈(Anti-Fibroblast MicroBeads human, Miltenyi Biotec, #130-050-601)를 붙여 라벨링 후, 세포 분리기(MidiMACSTM separator, Miltenyi Biotec, #130-042-302)와 LS 칼럼(LS Separation Columns, Miltenyi Biotec, # 130-042-401)을 이용하여 각각의 라벨링 된 세포를 분리하였다. 분리된 세포의 확인을 위해 신세뇨관 상피세포는 CD326(EpCAM)-PE 항체, 신장 섬유아세포는 Anti-Fibroblast-PE antibody를 처리한 후, FACS 분석을 수행하였으며, 그 결과 신세뇨관 상피세포와 신장 섬유아세포가 각각 분리됨을 확인하였다(도 7의 FACS analysis 그래프).
또한, 면역형광법을 수행하기 위해 4% 파라포름알데히드 고정액(Biosesang, #P2031)으로 상기 분리한 신장 섬유아세포 및 신세뇨관 상피세포와, 2 종의 혈관내피세포(HUVEC는 LONZA #C-2519A, HUVEC-Umbil Vein, Pooled Cells; GFP-HUVEC는 ANGIO-PROTEOMIE #cAP-0001GFP, GFP Expressing Human Umbilical Vein Endotheial Cell) 각각을 상온에서 20 분 동안 고정하고, 1X PBS로 세척한 다음, 0.5% 트리톤-X(sigma, #T9284)를 처리하여 상온에서 20 분 동안 배양하였다. 그런 다음, 1% BSA에서 희석한 1차 항체(신장 섬유아세포는 α-SMA 항체, 신세뇨관 상피세포는 E-카드헤린 항체 및 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8) 항체, 혈관내피세포는 CD-31 항체)를 처리 후 4℃에서 하룻밤동안 반응시키고, 다시 1X PBS로 세척하였다. 세척 후, 1% BSA에서 1:100으로 희석한 각 마커에 대한 2차 항체를 처리하고 4℃에서 2 시간 동안 반응시킨 다음, 다시 1 X PBS로 세척하였다. 이후, 1X PBS에서 1:500으로 희석한 상기 3종의 세포에 대한 항체 Hoechst를 처리하여 상온에서 30분동안 반응시키고, 1x PBS로 세척한 후, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과를 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다. 도 8a 내지 8b에 나타난 바와 같이, 상기 방법에 의해 분리된 신세뇨관 상피세포에서 상피세포 마커인 E-카드헤린 및 사이토케라틴 8만이 발현되고(도 8a), 신장 섬유아세포에서 α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA)만이 발현됨을 확인하였으며, 도 8c 및 도 8d에 나타난 바와 같이, 하기에서 사용되는 혈관내피세포(HUVEC, LONZA #C-2519A, HUVEC-Umbil Vein, Pooled Cells; GFP-HUVEC, ANGIO-PROTEOMIE #cAP-0001GFP, GFP Expressing Human Umbilical Vein Endotheial Cell)에서 표면분화항원 31 (cluster of differentiation 31, CD31)이 발현됨을 확인하였다.
[실시예 2-2] 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 제조 및 생체 모사 여부 확인
A. 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 제조
상기 실시예 2-1에서 수득한 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포와, 혈관내피세포(HUVEC)(LONZA #C-2519A, HUVEC-Umbil Vein, Pooled Cells)를 이용하여 도 6a의 오른쪽 모식도와 같은 신장 모사 장기 칩을 제조하였다.
이 때, 상기 실시예 2-1에서 수득한 400 X 104/ml의 인체 유래 신장 섬유아세포(primary human renal fibroblast)와 2000 X 104/ml의 혈관내피세포(HUVEC)(LONZA #C-2519A, HUVEC-Umbil Vein, Pooled Cells) 및 10 mg/ml의 피브린 겔을 상기 제조된 신장 모사 장기 칩의 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포 영역(도 6b의 노란색 영역, Gel A)에 도 6c의 i 및 ii와 같이 시딩하고 상온에서 2 내지 3 분 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 2-1에서 수득한 300 X 104/ml의 인체 유래 신세뇨관 섬유아세포 현탁액 5 내지 10μl를 상기 신장 모사 장기 칩의 신세뇨관 상피세포 영역(도 6b의 파란색 영역, Gel B)에 도 6c의 iii 및 iv와 같이 시딩하고 원하는 방향(본 실험에서는 위쪽)으로 90°기울인 다음 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역에 EGMTM-2 배지(LONZA, #CC-3162) 150 내지 200 μl을 채웠다. 상기 신세뇨관 상피세포, 혈관내피세포 및 신장 섬유아세포 등을 시딩한 후 3일 동안 배양한 후 5 ng/ml의 TGF-β를 처리하고 24시간 동안 반응시켰다.
B. 인체 유래 신세뇨관 상피세포 및 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩의 생체 모사 여부 확인
상기 제조된 신장 모사 장기 칩이 정상적으로 생체를 모사하는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 면역형광법을 수행하였다. 4% 파라포름알데히드 고정액(Biosesang, #P2031)으로 상기 신장 모사 조직 칩의 각 영역 내의 세포들을 상온에서 20 분 동안 고정하고, 1X PBS로 세척한 다음, 0.2% 트리톤-X(sigma, #T9284)를 처리하여 상온에서 20 분 동안 배양하였다. 이후, 3% BSA를 처리하고 상온에서 40 분간 반응시킨 후 1X PBS로 세척하였다. 그런 다음, 1% BSA에서 희석한 1차 항체(신장 섬유아세포는 α-SMA 항체(1:100 희석), 신세뇨관 상피세포는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8) 항체(1:200 희석), 혈관내피세포는 CD-31 항체(1:50 희석))를 처리 후 상온에서 3일 동안 반응시키고, 다시 1X PBS로 세척하였다. 세척 후, 1% BSA에서 1:100으로 희석한 각 마커에 대한 2차 항체를 처리하고 상온에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, 다시 1 X PBS로 세척하였다. 이후, 1X PBS에서 1:250으로 희석한 항체 Hoechst를 처리하여 상온에서 3시간 동안 반응시키고, 1x PBS로 세척한 후, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 상기 방법으로 제조한 신장 모사 장기 칩은 기존의 펌프를 사용하는 구조를 배제하여 대량 신속처리가 가능하였다. 또한, 보다 더 유사하게 인체 신장 조직을 모사하기 위해 혈관내피세포를 도입하였는데, 그 결과, 상기 제조된 신장 모사 장기 칩의 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포영역에서 α-평활근 액틴(α-SMA)과 CD31만이 발현되고, 신세뇨관 상피세포 영역에서 상피세포 마커인 사이토케라틴 8(CCK8)만이 발현되고, α-평활근 액틴(α-SMA)은 발현되지 않음을 확인하였다. 이로써, 상기 제조된 신장 모사 장기 칩은 인체 유래 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포를 원활하게 공배양 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 3종의 세포간의 물질교환 및 면역형광 염색의 효율성을 높이기 위해, 상기 제조된 신장 모사 장기 칩은 신세뇨관 상피세포 구획(세뇨관 배양부)과 간질 구획(간질 배양부)의 두 가지 구획으로 간소화하였다.
이를 통해, 상기 실시예 2-2에서 제조된 신장 모사 장기 칩은 세뇨관 배양부와 간질 배양부로 구조를 단순화하여, 상기 간질 배양부에서는 신장 섬유아세포와 혈관내피세포를 3차원으로 동시에 배양할 수 있어 혈관내피세포와 신장 섬유아세포 간의 물질 교환이 좀 더 용이해지고, 염색의 효율성도 증가하는 장점이 있음을 알 수 있었다. 또한, 상기 간질 배양부에서는 형광 발현하는 혈관내피세포를 배양할 수 있어, 치료제를 스크리닝 하는데 드는 시간과 오류를 최소화할 수 있고, 보다 객관적인 평가지표를 확보할 수 있다. 즉, 상기 실시예 2-2에서 제조된 신장 모사 장기 칩은 장기 칩 내에서 미세혈관구조 형성이 가능하고, 장기 칩의 구조가 세뇨관 배양부와 간질 배양부로 간소화되고, 구분이 잘 이루어져, 정상 신장상피-혈관-섬유조직을 모사할 수 있는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 3] 신장 섬유화 조직 유래 신장 섬유아세포를 이용한 신장 섬유화 모사 장기 칩 개발
A. 신장 섬유화 조직 유래 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩 제조
상기 실시예 2-2에서 제조한 신장 모사 장기 칩이 정상적인 신장을 모사할 수 있음을 확인하였는바, 이에 더 나아가 신장 섬유화를 모사하는 장기 칩을 개발하기 위해 하기와 같은 방법으로 신장 섬유화 조직으로부터 세포를 분리하고 이를 배양한 장기 칩을 제조하였다.
먼저, 신부전 환자(분당서울대병원, 신절제술을 받은 신장세포암 또는 신장암(renal cell carcinoma) 환장)로부터 신장 조직 검체를 확보하여, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 신장 섬유아세포를 분리하고, 다음과 같은 방법으로 신장 섬유화 모사 장기 칩을 제조하였으며, 상기 제조된 장기 칩의 모식도는 도 12a와 같다. 이 때, 신세뇨관 상피세포도 인체 조직 유래 세포를 사용하는 경우, 생체 모사 여부를 확인하기 위하여 혈관내피세포로 형광 발현하는 혈관내피세포(GFP-HUVEC)(ANGIO-PROTEOMIE #cAP-0001GFP, GFP Expressing Human Umbilical Vein Endotheial Cell)를 사용 시 분리된 상피세포 확인에 사용한 마커와 같은 파장의 형광을 나타내어 각각의 세포를 판별하는 데 어려움이 있어, 상기 실시예 2-2와 달리 상기 인체 유래 신세뇨관 상피세포가 아닌 구입한 인간 신세뇨관 상피세포(Human Kidney-2 cell, HK-2 cell)(한국세포주은행, #22190)를 사용하였다.
구체적으로, 2000 X 104/ml의 혈관내피세포(GFP-HUVEC) 및 10 mg/ml의 피브린 겔을 상기 제조된 신장 모사 장기 칩의 간질배양부의 혈관내피세포 영역 (도 12b의 노란색 영역, Gel A)에 도 12c의 1과 같이 시딩하고 상온에서 2 내지 3 분 동안 배양하였다. 그런 다음, 400 X 104/ml의 신부전 환자 유래 신장 섬유아세포(primary human renal fibroblast)와 10 mg/ml의 피브린 겔을 상기 제조된 신장 모사 장기 칩의 간질배양부의 신장 섬유아세포 영역(도 12b의 빨간색 영역, Gel C)에 도 12c의 2와 같이 시딩하고 상온에서 2 내지 3 분 동안 배양하였다. 이후, 상기 300 X 104/ml의 인간 신세뇨관 상피세포(Human Kidney-2 cell, HK-2 cell) 현탁액 5 내지 10μl를 상기 신장 모사 장기 칩의 세뇨관 배양부(도 12b의 파란색 영역, Gel B)에 도 12c의 3과 같이 시딩하고 원하는 방향(본 실험에서는 위쪽)으로 90°기울인 다음 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 신장 모사 장기 칩의 각 영역에 상기 실시예 2-2의 A.에서와 동일한 배지 150 μl을 채웠다. 상기 신세뇨관 상피세포, 혈관내피세포 및 신장 섬유아세포 등을 시딩한 후 3일 동안 배양한 후 5 ng/ml의 TGF-β와, 5 ng/ml의 TGF-β 및 10 μM의 TGF-β 억제제를 각각 처리하고 24시간 동안 반응시켰다.
B. 신장 섬유화 조직 유래 신장 섬유아세포를 이용한 신장 모사 장기 칩의 생체 모사 여부 확인
상기 제조된 신장 모사 장기 칩이 정상적으로 생체를 모사하는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 면역형광법을 수행하였다. 4% 파라포름알데히드 고정액(Biosesang, #P2031)으로 상기 신장 모사 조직 칩의 세뇨관 배양부와 간질 배양부 각각의 세포들을 상온에서 20 분 동안 고정하고, 1X PBS로 세척한 다음, 0.2% 트리톤-X(sigma, #T9284)를 처리하여 상온에서 20 분 동안 배양하였다. 이후, 3% BSA를 처리하고 상온에서 40 분간 반응시킨 후 1X PBS로 세척하였다. 그런 다음, 1% BSA에서 희석한 1차 항체(신장 섬유아세포는 α-SMA 항체(1:100 희석), 신세뇨관 상피세포는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8, CCK8) 항체(1:200 희석))를 처리 후 상온에서 2일 동안 반응시키고, 다시 1X PBS로 세척하였다. 세척 후, 1% BSA에서 1:100으로 희석한 각 마커에 대한 2차 항체 및 1:250으로 희석한 항체 Hoechst를 처리하고 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 다시 1 X PBS로 세척한 후, 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 그 결과를 도 12d에 나타내었다.
도 12d에 나타난 바와 같이, 세뇨관 배양부(신세뇨관 상피세포 영역)에서 CCK8만이 발현됨을 확인하였으며, 간질배양부의 혈관내피세포 영역에서 상기 세포의 형광이 발현되며, α-SMA는 거의 발현되지 않아, 상기 영역에서 모세혈관 구조 형성을 확인하였는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩은 정상 신장 조직 외에도 신장 섬유화가 진행된 신장 조직으로부터 유래한 신세뇨관 세포 및 섬유아세포와 함께 혈관내피세포를 공배양할 수 있고, 신장 조직을 모사할 수 있는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
[실험예 1] 정상 신장 모사 장기 칩과 신장 섬유화 모사 장기 칩의 비교 분석을 통한 신장 섬유화 치료제 스크리닝을 위한 평가지표 도출
정상 신장 조직을 모사하는 장기 칩과 신장 섬유화를 모사하는 장기 칩에서의 비교 분석을 통해 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표를 하기와 같은 방법으로 도출하였다. 이 때, 상기 실시예 3에서 제조된 신장 모사 장기 칩(도 12a)에 상기 실시예 3의 A.와 같은 방법으로 인체 유래 신장 섬유아세포와, 혈관내피세포(GFP-HUVEC) 및 신세뇨관 상피세포를 시딩하고 배양하여 신장 모사 장기 칩을 제조하였으며, 다만 상기 신장 섬유아세포는 정상 신장 조직 유래 신장 섬유아세포(이하, 정상 신장 모사 장기 칩)와 신섬유화 신장 조직 유래 신장 섬유아세포(이하, 신장 섬유화 모사 장기 칩)의 2 종을 각각 사용하여 2 종의 장기 칩을 제조하였다.
상기 2 종의 장기 칩 각각에 상기 실시예 3과 달리 TGF-β를 처리하지 않은 대조군(도 13a 내지 13d의 control)과 TGF-β를 처리한 TGF-β군(도 13a 내지 13d의 TGF β)의 그룹으로 나누어 상기 실시예 3의 B.와 같은 방법으로 면역형광법을 수행하였다. 이 때, 각 신장 모사 조직 칩의 세뇨관 배양부의 신세뇨관 상피세포에 CCK8 항체 및 α-SMA 항체를 각각 처리하고, 이들의 형광 발현을 공초점 현미경(MICROSCOPE CONFOCAL LASER SCANING ZEISS LSM 710)으로 촬영한 후, 각 이미지를 공초점 현미경의 분석 프로그램을 이용하여 각각 형광 평균 강도(Fluorescence mean Intensity)를 측정한 다음, 각 그룹별도 측정된 CCK8과 α-SMA의 결과값을 대조군(control)과 비교하여 각각의 발현량 차이를 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 13a 내지 13d와 같다.
도 13a와 도 13b에 나타난 바와 같이, 정상 신장 모사 장기 칩에서 TGF-β 자극 시 세뇨관 배양부의 신세뇨관 상피세포 영역은 CCK8 발현량이 감소하고, α-SMA 발현량은 증가하였으며, 간질 배양부의 혈관내피세포 영역은 가는 혈관이 증가하였다.
또한, 도 13c와 도 13d 에 나타난 바와 같이, 신장 섬유화 모사 장기 칩에서도 TGF-β 자극 시 세뇨관 배양부의 신세뇨관 상피세포 영역은 CCK8 발현량이 감소하고, α-SMA 발현량은 증가하였으며, 간질 배양부의 혈관내피세포 영역은 가는 혈관이 증가하였다.
상기에서 사용한 신세뇨관 상피세포(HK-2 세포)는 TGF-β 처리 시 상피-간엽 이행(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 일어나 간엽세포(mesenchymal cell), 근섬유세포(myofibroblast), 섬유아세포(fibroblast) 순으로 섬유화(fibrosis)가 진행되어 섬유화세포의 형태로 모양이 변한다. 도 13c 및 13d의 결과에 따르면, 상기 신장 섬유화 모사 장기 칩에 TGF-β 자극 시 CCK 및 α-SMA의 발현량이 변화하였는바, 이로써 상기 칩 내의 신세뇨관 상피세포의 EMT 정도를 확인할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩은 신장 섬유화와 관련된 TGF-β 자극 시 세뇨관 배양부에 존재하는 신세뇨관 상피세포에서의 CCK8의 상대적 발현량 측정과, α-SMA의 상대적 발현량 측정이 가능하고, 혈관의 굵기 측정을 통한 혈관신생(angiogenesis) 정도의 측정이 가능하여 이를 평가지표로 활용하여 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 2] 신장 섬유화 환자의 병리 조직과의 비교를 통한 신장 모사 장기 칩을 이용한 신장 섬유화 치료제 스크리닝
실험실적 신장 섬유화 동물 모델과 비교하는 것보다 신장세포를 얻은 환자의 병리조직과 상기 실시예 3의 신장 모사 장기 칩을 비교하는 것이 보다 합리적인 바, 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 신장 모사 장기 칩을 제조하고, 비교 분석을 통해 도출하였다. 이 때, 신장 조직을 제공한 3 명의 신장 섬유화 환자는 각각 사구체여과율(glomerulus, GFR)이 90 초과(도 14의 Patient with GFR > 90), 60 내지 90(도 14의 Patient with GFR 60-90), 및 60 미만(도 14의 Patient with GFR < 60)이다. 또한, 본 실험에서는, 실험예 1의 TGF-β를 처리하지 않은 대조군(도 15 내지 20의 control)과 TGF-β를 처리한 TGF-β군(도 15 내지 20의 TGF β) 외에도, 5 ng/ml의 TGF-β 및 10 μM의 TGF-β 억제제를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 TGF-β 억제군(도 15 내지 20의 TGF β inhibitor)의 3 종의 신장 모사 장기 칩을 제조하였다.
[실험예 2-1] 신장 섬유화 치료제의 스크리닝을 위한 평가지표로서 CCK8 및 α-SMA 확인
상기 제조된 3 종의 신장 모사 장기 칩에 대하여, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 CCK8 항체 및 α-SMA 항체를 각각 처리하여 이들의 형광 발현 비교 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 15 및 16과 같다.
도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 상기 방법으로 제조한 신장 섬유화 환자의 신장 조직 유래 세포들을 이용해 제조한 3 종의 신장 섬유화 모사 장기 칩은 모두 세뇨관 배양부의 신세뇨관 상피세포 영역에서의 CCK8 발현량은 TGF-β 자극 시 감소하고, TGF-β 억제제 투여 시 증가하였고, α-SMA 발현량은 TGF-β 자극 시 증가하고, TGF-β 억제제 투여 시 감소하여, 마커 CCK8 및 α-SMA가 신장 섬유화 치료제를 스크리닝하기 위한 평가지표가 될 수 있음을 확인하였다.
[실험예 2-2] 신장 섬유화 치료제의 스크리닝을 위한 평가지표로서 혈관신생(angiogenesis) 정도 확인
상기 대조군, TGF-β군 및 TGF-β 억제군의 3 종의 신장 모사 장기 칩에 대하여 간질배양부의 혈관내피세포 영역에 존재하는 혈관내피세포(GFP-HUVEC)를 공초점 현미경으로 촬영하였다 (MICROSCOPE CONFOCAL LASER SCANING ZEISS LSM 710). 수득한 이미지를 ImageJ program을 이용하며 각각 직경 50 μm 미만의 얇은 혈관길이와 이의 직경, 직경 50 μm 이상의 굵은 혈관의 길이와 이의 직경 측정을 측정하고, 대조군과 TGF-β군, TGF-β 억제군별로 측정된 결과값을 각각의 지표에 따라 대조군의 값과 비교하여 얇은 혈관길이와 직경, 굵은 혈관의 길이와 직경을 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 17 및 18과 같다.
도 17 및 18에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 3 종의 신장 섬유화 모사 장기 칩에서, TGF-β 자극 시 간질배양부의 혈관내피세포 영역에서 굵은 혈관(50 μm 이상)의 총 길이의 합이 감소하고(도 17a), 굵은 혈관의 직경도 감소한 반면(도 17b), 얇은 혈관(50 μm 미만)의 총 길이의 합이 증가하고(도 18a), 얇은 혈관의 직경은 감소하였으나(도 18b), 이러한 변화는 TGF-β 억제제를 통해 상쇄되었다.
이로써, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 TGF-β 자극에 의한 EMT(Epithelial-mesenchymal transition)를 확인할 수 있었다. 특히, 신장 기능이 감소하고 신장 조직의 섬유화 및 혈관 손상이 보다 더 많이 진행한 환자(즉 GFR 수치가 낮은 환자)에서 유래한 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩의 경우, 혈관내피세포의 증식이 보다 활발하여 굵은 혈관 형성이 잘 이루어지고, TGF-β 자극 시 신장 손상이 적은 환자(즉 GFR 수치가 높은 환자) 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에 비해, 신장 손상이 많은 환자(즉 GFR 수치가 낮은 환자) 유래 세포를 이용하여 제조한 신장 섬유화 모사 장기 칩에서 혈관 구조의 변화도 상대적으로 적음을 확인하였다(도 17 및 18). 이를 통해 신장 손상이 많은 조직에서 유래한 신장 섬유아세포로부터 혈관 증식을 유도하는 체액성 인자(humoral facor)가 분비되는 것을 간접적으로 확인할 수 있었으며, 이러한 변화가 환자의 신장 조직에서 섬유 내막의 두꺼워짐(fibro-intimal thickening) 및 세동맥경화증(arteriolosclerosis)으로 나타나는 것을 알 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 상기 실험예 1에서 확인한 평가지표인 CCK8 발현량, α-SMA 발현량, 및 혈관 직경 측정을 통한 혈관신생(angiogenesis) 정도를 측정함으로써 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3] 신장 섬유화 치료제 스크리닝을 위한 추가 평가지표 도출
상기 실험예 1 및 2를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였는바, 추가적인 평가지표를 다음과 같은 방법으로 도출하였다.
[실험예 3-1] 신장 섬유화 치료제의 스크리닝을 위한 평가지표로서 KIM-1 확인
상기 실험예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 신장 손상 분자-1(Kidney Injury Molecule-1, KIM-1)을 평가지표로서 활용할 수 있는지 확인하기 위해 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA assay) 을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 제조한, GFP > 90, GFP 60 내지 90 및 GFP < 60인 3 명의 환자 각각으로부터 수득한 신장 섬유아세포와, 구입한 혈관내피세포(GFP-HUVEC) 및 신세뇨관 상피세포세포(HK-2 세포)를 상기 혈관내피세포 배지로 공배양하여 3 종의 신장 모사 장기 칩을 제조하였다. 그런 다음, 상기 3 종의 신장 모사 장기 칩 각각의 대조군, TGF-β군, TGF-β 억제군별로 배지를 각각 모으고, 각 그룹의 배지를 알맞은 비율로 희석 후 KIM-1 (human) ELISA 키트(Enzo Life Sciences, Inc, # ADI-900-226-0001)의 설명서에 따라 ELISA 분석을 수행하였다. 이후, ELISA READER (SPECTRAMAX PLUS384)을 이용하여 450 nm로 각 그룹별의 결과값을 측정한 다음, 각각 측정된 결과값을 3 종의 신장 모사 장기 칩 각각의 대조군 값과 비교하여 KIM-1 발현량 차이를 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 19와 같다.
도 19에 나타난 바와 같이, 상기 3 종의 신장 섬유화 모사 장기 칩에서 세포들의 공배양을 위한 배양액으로 사용된 혈관내피세포(GFP-HUVEC)의 배양액(LONZA #CC-3162 EGM-2.)의 KIM-1 발현량이 TGF-β 자극 시 증가하고, TGF-β 억제제 투여 시 이러한 변화가 상쇄됨을 확인하였다. 특히, 각 장기 칩을 제조 시 이용한 세포의 환자들의 신장 기능이 감소할수록 KIM-1의 발현량과, TGF-β 자극 또는 TGF-β 억제제에 의한 변화 정도가 감소하였다. 이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 KIM-1의 발현량을 측정함으로써 신장 섬유화 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3-2] 신장 섬유화 치료제의 스크리닝을 위한 평가지표로서 VEGF 확인
상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)를 평가지표로서 활용할 수 있는지 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 3-1에서 제조한 GFP > 90 및 GFP 60 내지 90인 2 명의 환자 각각으로부터 제조한 2 종의 신장 모사 장기 칩 각각의 대조군, TGF-β군, TGF-β 억제군별로 각 신장 모사 장기 칩에 공배양되어 있는 신세뇨관 상피세포(HK-2 세포), 섬유아세포, 혈관내피세포(GFP-HUVEC) 모두로부터 RNA를 분리한 후, 이로부터 당업계에 알려진 방법에 따라 cDNA를 합성하고, 이에 VEGF 프라이머와 SYBER green을 혼합하여 실시간 PCR 장비(REAL TIME PCR SYSTEM, Applied Biosystems ViiA7)를 이용하여 VEGF 발현량을 측정하였다. 측정 후, 상기 장비를 이용하여 측정된 각 그룹 별 결과값을 3 종의 신장 모사 장기 칩 각각의 대조군 값과 비교하여 VEGF 발현량 차이를 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 20과 같다.
도 20에 나타난 바와 같이, 상기 2 종의 신장 섬유화 모사 장기 칩에서 VEGF 발현량이 TGF-β 자극 시 증가하고, TGF-β 억제제 투여 시 감소함을 확인하였다. 특히, 각 장기 칩을 제조 시 이용한 세포의 환자들의 신장 기능이 감소할수록(즉, GFP 수치가 감소할수록) VEGF의 발현량과, TGF-β 자극 또는 TGF-β 억제제에 의한 변화 정도가 감소하였다.
이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 모사 장기 칩을 이용하여 KIM-1의 발현량 및 VEGF 발현량을 평가지표로 하여 신장 섬유화 치료제를 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.

Claims (22)

  1. 신장 모사 장기 칩 제조방법으로서,
    상기 신장 모사 장기 칩은
    신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및
    신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고,
    상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고,
    상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되며,
    상기 제조방법은
    상기 간질 배양부의 혈관내피세포 영역에 혈관내피세포 및 피브린 겔의 제1 혼합액을 시딩하고 배양하는 단계;
    상기 간질 배양부의 신장 섬유아세포 영역에 신장 섬유아세포 및 피브린 겔의 제2 혼합액을 시딩하고 배양하는 단계; 및
    상기 세뇨관 배양부에 신세뇨관 상피세포를 시딩하고 배양하는 단계;
    를 포함하는, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 인체 유래 세포인, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 신장 질환 환자 유래 세포인, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포는 형광 염색 세포인, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 신장 모사 장기 칩은 신장 섬유화 모사 장기 칩인, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 신장 모사 장기 칩은 2 이상의 간질 배양부를 포함하고,
    상기 세뇨관 배양부는 2 이상의 간질 배양부 사이에 위치하는, 신장 모사 장기 칩 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제조방법은 상기 세포 시딩 및 배양 단계 전 인간 신장조직에서 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 신장 모사 장치 칩 제조방법.
  8. 공배양 장치 제조방법으로서,
    상기 공배양 장치는
    신세뇨관 상피세포가 배양되는 세뇨관 배양부; 및
    신장 섬유아세포 및 혈관내피세포가 배양되는 간질 배양부;을 포함하고,
    상기 세뇨관 배양부 및 간질 배양부는 횡적으로 배치되고,
    상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포는 공배양되며,
    상기 제조방법은
    상기 간질배양부의 혈관내피세포 영역에 혈관내피세포 및 피브린 겔의 제1 혼합액을 시딩하고 배양하는 단계;
    상기 간질배양부의 신장 섬유아세포 영역에 신장 섬유아세포 및 피브린 겔의 제2 혼합액을 시딩하고 배양하는 단계; 및
    상기 세뇨관 배양부에 신세뇨관 상피세포를 시딩하고 배양하는 단계;
    를 포함하는, 공배양 장치 제조방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 신장 모사 장기 칩.
  10. 제8항에 따른 방법으로 제조된 공배양 장치.
  11. (a) 제9항에 따른 신장 모사 장기 칩에 형질전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)를 처리하는 단계;
    (b) 상기 신장 모사 장기 칩에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 시험물질을 처리한 신장 모사 장기 칩에서 신장 섬유화 평가지표를 측정하는 단계;를 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 신장 모사 장기 칩의 상기 신세뇨관 상피세포, 신장 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상은 신장 질환 환자 유래 세포인, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 신장 모사 장기 칩에 시험물질을 처리하기 전과 후 또는 시험물질을 처리하지 않은 경우와 시험물질을 처리한 경우의 신장 섬유화 평가지표를 비교하는 단계를 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 시험물질을 처리한 신장 모사 장기 칩과 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전의 신장 모사 장기 칩에서 신장 섬유화 평가지표를 비교하는 단계를 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 신세뇨관 상피세포에서 사이토케라틴 8 (cytokeratin 8, CCK8) 및 α-평활근 액틴(α-smooth muscle action, α-SMA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과
    상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 CCK8의 발현량이 증가한 경우, 또는 α-SMA의 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 혈관내피세포가 배양된 간질 배양부에서의 혈관신생(angiogenesis)의 정도를 측정하는 것을 포함하고,
    상기 혈관신생의 정도는 상기 간질 배양부에서 형성된 혈관 중 굵기가 50 μm 미만인 혈관의 길이의 합인, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 상기 혈관신생의 정도를 측정한 결과 상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 혈관신생 정도가 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 혈관내피세포에서의 분화 클러스터 31(cluster of differentiation 31, CD31)의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과
    상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 CD31의 상대적 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  21. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 신장 모사 장기 칩 내의 배양액의 신장 손상 분자-1(Kidney Injury Molecule-1, KIM-1) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 상기 상대적 발현량을 측정한 결과
    상기 시험물질을 처리하지 않거나 상기 시험물질을 처리하기 전보다 상기 시험물질을 처리한 후의 상기 KIM-1 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현량이 감소한 경우 상기 시험물질을 신장 섬유화 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 신장 섬유화 치료제의 스크리닝 방법.
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