KR102556153B1 - 안트라사이클린 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체 - Google Patents

안트라사이클린 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 링커 구조 X - L1 - L2 - L3 - Y를 추가로 포함하는 화학식(i) 또는 화학식(ii)를 갖는 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체를 포함하는 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체에 관한 것이다.

Description

안트라사이클린 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체{Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives}
본 발명은 안트라사이클린 독소 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체에 관한 것이다.
서두
결합단백질, 특히 종양 세포에 특이적인 항체에 대한 소 분자량 독소(MW 바람직하게는 <2,500 돌턴)의 공유 접합체는 파괴할 암세포를 특이적으로 타겟팅하는 강력한 도구이다. 따라서, 그러한 결합단백질 약물 접합체(binding protein drug conjugate, BPDC), 특히 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)는, 암의 치료를 위하여 의료적 및 상업적 관심이 높다. 암 치료에 대한 효과적이고 안전한 BPDC 또는 ADC를 개발하기 위하여, 여러 양태를 다루어야 한다: 첫째, 정상 또는 건강한 조직 세포에 의해 거의 또는 이상적으로 발현되지 않아야 하는, 주어진 종양 특이적 항체 (tumor specific antibody, TSA)에 대하여 특이적이어야 한다. 둘째, 약물과 결합단백질 사이의 공유 결합 또는 연결이 기능성을 가져서 혈액 순환에서 충분히 안정적이어서, 혈류 내의 원하지 않는 독성 페이로드의 방출을 막아야 하나, 암세포에 결합하거나 내재화할 때 약물을 효과적으로 방출하여야 한다. 셋째, 잠재적으로 제한된 양의 TSA가 암세포에 발현되어 잠재적으로 제한된 양의 ADC만 내재화되더라도, 또는 암세포에 결합하거나 암세포에 내재화할 때 독성 페이로드의 방출이 충분히 높은 효율로 영향받지 않는다면, 암세포의 파괴를 위하여는, 독성 페이로드가 충분히 높은 독성 또는 효능을 가져야 한다.
TSA를 통한 성공적으로 암을 타겟팅하기 위한 제1 측면은 특이적 결합을 위하여 개발된 타겟 생물 및 타겟팅하는 분자의 깊은 이해에 달려 있지만, 최적 링커 및 독소 페이로드와 관련 있는, 제2 및 제3 측면은 일반적으로 결합단백질 약물 접합체(BPDC) 또는 항체 약물 접합체(ADC)의 효능에 적용된다.
현재 임상 시험의 모든 ADC, 및 암 치료용으로 FDA가 승인하는 두 ADC인, 타케다(Takeda)의 항-CD30 ADC Adcetris® (브렌투숙맙-베토틴) 및 로슈/제넨텍 (Roche/Genentech)의 항-HER-2 ADC Kadcyla® (트라스투주맵 엠탄신 또는 T-DM1) (페레즈 등. 2014를 참조)는, 항체 사슬 내 디설파이드 결합의 적절한 환원에 의하여 생성된, 항체의 리신 잔기의 1차 아미노기 또는 자유 티올기에 대한, 말레이미드 링커 화학을 포함하는 독성 페이로드의 화학 접합에 의하여 생성된다. 화학적 접합은 두 가지 제한이 있다: 첫째, 화학적 말레이미드계 링커가 인간 혈청 알부민의 존재하에서 바람직하지 않은 불안정과 연관되어, ADC를 함유한 말레이미드-링커로 처리된 환자의 혈핵 순환에서 독소를 방출하는 것으로 밝혀졌다 (Alley 등, 2008 참조). 둘째, 말레이미드 링커 화학에 의한 종래의 화학적 접합은 헤테로성 BPDC 또는 ADC를 생성하는데, 이는 접합이 일어나는 아미노- 또는 티올기를 제어할 수 없기 때문이다. 따라서, 항체 당 공유적으로 결합되는 가우스 분포 수의 약물을 얻어서, 접합된 ADC는 3.5 내지 4의 범위의 평균 약물 대 항체의 비(DAR)를 가질 수 있게 된다. 그러나, 개별 접합체는 항체에 부착된 약물이 없거나(DAR=0), 시스테인 접합체의 경우 항체에 8개까지의 약물이 부착되거나(DAR=8), 리신 접합체의 경우 항체당 더 많은 약물이 부착된다(DAR>10). 따라서 종래의 화학적으로 접합된 ADC는 상이한 기능성을 나타내는 상이한 분자들의 불균질의 혼합물을 나타내며(Panowski 등, 2014), 암 환자의 치료를 위한 ADC의 개발의 맥락에 있어서 조절점으로부터 명확히 바람직하지 않다.
따라서, 부위 특이적으로 접합되어, 약물 대 항체 비와 관련하여, 균질한 ADC 또는 BPDC를 제공할 상업적 및 의학적 필요가 있다.
또한, 말레이미드 링커 화학에 기초한 전통적인 접합체보다 혈액 순환에서 더 안정적인 단백질 결합에 더 안정적인 약물을 갖는 ADC 또는 BPDC을 제공할 상업적 및 의학적 필요성이 있다.
나아가, 현재 시장에 나온 ADC 또는 BPDC보다 효능이 높고 부작용이 적은 ADC 또는 BPDC를 제공할 상업적 및 의료적 필요가 있다.
본 발명의 일반적인 특징
본 발명은 이러한 문제점을 해결한다. 본 발명은 결합단백질-약물 접합체에 사용되는 독소 및, 선택적으로는 종래의 말레이미드 링커 화학을 회피하여, 부위 특이적 방식으로, 상기 결합단백질에 이러한 독소를 접합시키는 새로운 기술을 제공한다.
이러한 두 가지 특징에 대한 일반적인 장점을 기술하면 다름과 같다.
링커 기술
상술한 혈청 불안정성 및 화학적으로 접합된, 말레이미드-링커 함유 BPDC 또는 ADC의 이질성 둘 다는 암 환자에서 이들 약물의 안정성에서 중요한 문제가 되는데, 이 둘에 환자에서, 예를 들면, ADC의 독소(탈약물(de-drugging")의 비특이적 방출에 더해지기 때문이다.
한편, 종래의 말레이미드 링커는, 인간 혈청의 유리 티올, 특히 인간 혈청에서 유리 티올의 최고 농도를 제공하는 (가장 풍부한 혈청 단백질으로서) 인간 혈청 알부민의 시스테인 34에 의해 분해될 수 있다. 인간 혈청 알부민의 시스테인-34는 독소가 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)에 전달되어 공유적으로 결합할 때 소위 역-마이클 반응의 방법으로 말레이미드 링커의 티오에테르 결합을 분해할 수 있다. 이어서, 독소-HSA 접합체는 종양 선택성 없이 신체에 또는 혈액 순환에 독소를 분배할 수 있다(Alley 등, 2008 참조).
한편, 화학적으로 결합된, 이종의 ADC에서 DAR-종이 높을수록, 이러한 ADC의 더 높은 소수성 및 집적을 위한 성향으로 인하여 혈청 반감기는 짧아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 DAR 종이 높을수록, 이러한 ADC가 타겟 양성 암세포에 결합되기 전에 독소를 더 빠르게 제거하거나 분해하거나 방출하게 된다. 또한, DAR 종이 높을수록 탈약물(de-drugging)을 더 빠르게 진행하는 것으로 알려져 있는데, 이는 개별 접합 부위가, 독소를 운반하는 아미노산의 구조적 사정에 따라, 상이한 탈약물 동력학을 가지기 때문이다.
화학적으로 접합된 ADC의 상술된 문제는, 종양 세포 특이적 항체에 대한 결합을 통해 암세포에 매우 강력한 세포 독소를 운반한다는 개념이 요구됨에도 불구하고, ADC를 임상에서 성공적으로 발전시키는 것을 방해했다. 독소 관련 부작용으로 인하여, 2000년에 FDA 승인 받은 최초의 ADC인, Pfizer/Wyeth의 Mylotarg® (겜츄주맙 오조가미신, gemtuzumab ozogamicin)은 FAD 승인 후 10년 후에 판매되기 시작했다 (http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm216448.htm).
따라서, 화학적으로 결합된 ADC의 문제는 현재의 ADC 개발 노력을, 중간 세포 독성을 갖는 독소, 예컨대, 돌라스타틴/아우리스타틴-계열 및 메이탄신-계열 약물을 저해하는 튜블린 중합으로 한정한다. 실제로, 현재 임상 평가 중인 모든 ADC의 90% 이상이 모노메틸 아우리스타틴 E (monomethyl auristatin E, MMAE) 또는 F (MMAF) 또는 메이탄신(예: DM1 또는 DM4)과 관련된 독소를 운반한다(Mullard (2013) 참조).
그러나, 세포 골격의 성분인 튜뷸린이 세포내 단백질 타겟에서 매우 풍부하기 때문에, 튜불린 중합을 억제하는 약물이 나노 몰 범위보다 낮은 경우 효능에 도달할 수 없어서, 세포 분열과 생존에 필요한 세포내 세포 골격의 대사를 막기 위하여, 많은 약물 분자는 세포로 확산하거나 운반되어야 한다. 어느 정도의 접합체의 "탈약물(de-drugging)"를 견딜 수 있는, 튜불린 중합 저해 약물의 중간 효능, 및 분열 세포 및 유사분열 세포에 대한 특이적 작용은 ADC의 개발에 가장 보편적인 이러한 작용 기전을 갖는 독소를 만들었다.
그러나, TSA의 발현 수준이 낮은 종양을 구체적으로 다루기 위해서는, 훨씬 더 강력한 독소가 필요할 것이다. 그러므로, 여전히 전임상 시험에서, 새로운 ADC 전략은, 듀오카마이신(Doktor 등, (2014) 및 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepines, PBDs) 참조)과 같은, 특히 DNA 손상성 독소에서, 높은 세포 독성과 다른 작용 방식을 갖는 독소와 관련이 있다(Hartley & Hochhauser (2012)).
안트라사이클린 유도체
BPDC 또는 ADC에 대한 페이로드로서 사용하기 위한 매우 흥미로운 종류의 DNA 삽입성 독소는 안트라사이클린인데, 이는 암 치료에서 화학 요법 약물로서 입증된 그의 임상적 유효성 때문이다(Minotti (2004) 참조). 안트라사이클린은 스트렙토마이세스 종에서 기원되는, 높은 항 종양을 갖는 적색을 띤 폴리케티드이다. 다양한 고형암 및 혈액암에 대한 항암 화학 요법으로서 일상적으로 사용되는 것들, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신이라고도 함), 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 또는 발루비신을 포함하는, 많은 유도체들이 지난 40년 동안 보고되었다. 독성 페이로드로서 독소루비신, 밀라추즈맙독소루비신을 이용한 다발성 골수종 및 기타 혈핵암에 대한 단계 I/II 임상 시험에서는 단지 하나의 항-CD74 ADC가 있다(clinicaltrials.gov idenfier: NCT01101594 참조).
모든 안트라사이클린-계열 화학 요법 약물은 대부분의 종양 세포에 대하여 μmol/ml의 범위의 IC50를 갖는 유리 약물로서 종양 세포에 대하여 제한된 효능을 보여 주는 것으로 알려져 있다(Crooke 및 Prestayko, 1981). 현재 임상 시험에서 평가되는 제1의 독소루빈-ADC의 예에도 불구하고, ADC 전략에 대한 독성 페이로드로서 종래의 안트라사이클린의 용도는 여전히 어려울 것 같다.
10여 년 전에, PNU-159682라고 불리는 새로운 안트라사이클린 유도체가 네모루비신의 대사산물로서 보고되었는데(Quintieri 등, (2005) Clin. Cancer Res. 11, 1608-1617 참조), 이것은 한 난소(A2780) 및 한 유방암(MCF7) 세포주에 피코 내지 펨토 몰 범위에서 체외 세포 사멸에 대한 매우 높은 효능을 나타낸다고 보고되었다(WO2012/073217 A1, Caruso 등). 상술된 선행 기술 문헌에 개시된 바와 같은, 안트라사이클린 유도체 PNU-159682의 구조가, 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 반응성 탄소에 대한 공식적인 안트라사이클린 넘버링 시스템과 함께, 도 2에 참고로 개시되어있다.
이질적이며 화학적으로 접합된 ADC에서 말레이미드-링커의 불안정성 및 높은 DAR 종의 탈약물과 관련하여, 화학적으로 접합된 ADC의 상술된 한계에 기반하면, PNU-159682와 같이 고도로 유망한 안트라사이클린 독소는, 종양 세포를 타겟팅하기 전에 혈액 순환에서 독소를 방출하기 때문에, 종래의 화학 접합에 있어서는 심각한 문제가 될 것으로 생각된다.
따라서, 환자의 혈액 순환에서 조기에 방출되는 독소로 인한 부작용을 피하거나 최소화하기 위해, 예를 들어 PNU-159682와 같은, 균질한 ADC인 잠재적 독소는, 정의된 약물동력학적 특성과 확장된 혈청 안정성을 요한다. 그러나, 동시에, 저 타겟 발현이 특징인 종양 세포의 특이적 사멸은 여전히 가능해야 한다.
종래의 화학적 말레이미드 링커 접근법에 의해 생성된 ADC에 대한 페이로드로서 PNU-159682의 사용이 개시되었지만(WO2009/099741 A1, 코헨 등), 이 선행 기술 문서에는 어떠한 기능적 데이터도 제공되지 않았다. 종양 세포 상에 화학적으로 접합되고 이질적인 말레이미드-링커 함유 접합체에 있어서 상이한 링커 및 스페이서 구조를 갖는 항체에 연결된 PND-159682를 갖는 제1 기능 데이터가 선행 기술 문헌 WO2010/009124 A2 (Beria 등)에 개시되었으나, 안정성 및 동력학 데이터는 제공되지 않았다.
바람직한 구체예들
제1 바람직한 구현예에 따르면, 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체는 탄소 C14가 결여되어 있고 안트라사이클린에 대한 구조적 특징인 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 하이드록실기가 부착된 PNU-159682를 포함하는 것으로 기재되어 있다. 제2 바람직한 구체예에서, 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체는 C13에서 카르보닐 기능을 갖고 안트라사이클린에 대한 구조적 특징인 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 C14에서 하이드록실기를 갖는 탄소 C13 및 C14 둘 다가 결여된다고 기재되어 있다.
이들 구체예에서, 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체는 다음의 화학식 (i) 또는 (ii)를 갖는 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체를 포함한다:
Figure 112017067871584-pct00001
Figure 112017067871584-pct00002
화학식 (i) 화학식 (ii)
상기 접합체는, 물결선에서, 상이한 요소들, X-L1-L2-L3-Y (L1 내지 L3은 링커를 나타내고, L1 내지 L3 중 둘은 필수적이고, X 및 Y는 각각 하나 이상의 선택적 링커를 나타냄)를 가질 수 있는 링커 구조를 포함한다.
두 유도체는 PNU-159682, 안트라사이클린 네모루비신의 대사산물이며 Quintieri 등 (2005)에 의해 처음으로 개시된, PNU-159682와는 현저히 다르다.
C13에서는 카르보닐 작용기를 갖고 C14에서는 하이드록실기를 갖는, C13 및 C14 탄소는, 본원에 개시된 유도체 접합체의 일 부분이 아닌, PNU-159682의 필수 구조적 특징이다.
놀랍게도, 탄소 C14 및 안트라사이클린에 대한 특징인 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 부착된 하이드록실기를 갖지 않는 PNU-유도체는, 세포 독성, 예컨대, 부위(in site) 특이적으로 접합된 항체 약물 접합체를 나타내는 것이 처음으로 입증되었다. 그의 바람직한 구체예들이 도 3a, 6a, 및 6b에 나타나 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 다음 화학식을 갖는 결합단백질-약물 접합체(binding protein-drug conjugate, BPDC)가 제공된다:
Figure 112017067871584-pct00003
화학식 (iii)
또는
Figure 112017067871584-pct00004
화학식 (iv)
- L1 내지 L3는 링커를 나타내고 L1 내지 L3 중 2개는 필수적이며,
- X 및 Y 각각은 임의적 선택적인 링커를 나타내며,
- BP는 결합단백질이고,
- n은 1 이상 10 이하의 정수이다.
이 구조에서, 몇몇 링커는 하나의 결합단백질에 하나의 독소를 접합시키는 단일 사슬을 형성할 수 있으며, 및/또는 몇몇 링커는 하나의 결합단백질에 여러 독소를 연결할 수 있다. 마찬가지로, 상기 링커는 둘 이상의 독소 분자에 동일한 결합단백질의 둘 이상의 서브 유닛을 접합할 수 있다.
선택적 링커 X는, ADC에서 사용되어 암세포 내로 내재화시 독소의 특이적 방출을 허용하는, 종래 기술에서 알려진 임의의 화학적 링커 구조일 수 있다(Ducry & Stump (2010) 또는 McCombs 등 (2015) 참조).
선행 기술에 기재된 그러한 링커에 대한 몇 가지 예가 아래에 보이며, 이것들은 예로서 제공될 뿐이고 제한하려는 것은 아니다.
Figure 112017067871584-pct00005
링커 L1, L2, L3은 후술한다.
선택적 링커 Y는 결합단백질을 단일 사슬의 링커 X, L1, L2, L3 또는 변형물, 특히 L3에 최적으로 접합하도록 하는 20개까지의 아미노산을 갖는 임의의 아미노산 사슬일 수 있다.
또한, 링커 구조들은 예를 들어, 적합한 결합단백질, 예컨대 바람직하게는 항체에 대한 PNU 유도체의 부위 특이적 접합을 허용하는 링커 구조들이 제공된다. 따라서, 유도체는 부위 특이적으로 접합되는, 균질한 결합단백질-약물 접합체를 생산하는데 이용될 수 있으며, 이는 항암 치료와 같은, 치료 용도에 이용될 수 있다.
안트라사이클린(PNU) 유도체의 다른 바람직한 실시예에 따르면, 링커 구조는, 올리고-글리신(Glyn, 이 때, n은 1 이상 21 이하의 정수임) 펩티드가 자유 아미노 말단을 갖는 방식으로, 다른 링커 L1에 의하여 또는 직접, L2로서, 상기 안트라사이클린 유도체에 접합되는 올리고-글리신 펩티드(Glyn)를 포함한다.
각 경우에, (Gly)n(본원에서는 (Gly)n-NH2 또는 Glyn-스트레치로도 명명됨)는 올리고-글리신 펩티드-스트레치이다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, n은 3 이상 10 이하의 정수이다. 가장 바람직하게는, n = 5이다.
본원에 이미 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 안트라사이클린(PNU) 유도체는 PNU-159682, 탄소원자 13 및 14가 결여되거나 부착 작용기를 갖는 탄소 14만이 결여된 PNU-159682 유도체이다.
화학식 (i)에 대해, 바람직한 구체예에서는, 올리고-글리신 펩티드(Gly)n(1 이상 21 이하, 바람직하게는 n=3 또는 n=5)는, 탄소 13에 대한 제1 아미드 결합에 의하여 안트라사이클린 유도체에 접합되거나, 제2 아미드 결합에 의하여 올리고-글리신의 카르복시 말단에 접합된 알킬렌디아미노 링커(NH2-(CH2)m-NH2, m은 1 이상 11 이하, 바람직하게는 m=2)에 의하여, 안트라사이클린 유도체에 접합한다. 부위 특이적으로 접합 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체 생성에 유용한 바람직한 화합물, PNU-EDA가 도 3a에 도시되어 있다.
화학식 (ii)에 대해, 바람직한 구체예에서는, 올리고-글리신 펩티드(Gly)n (1 이상 21 이하, 바람직하게는 n=3 또는 n=5)이 PNU 유도체의 고리 A에 직접 결합하여, 탄소 13의 카르보닐기는 글리신 펩티드 링커의 카르복시-말단을 나타낸다. 부위 특이적으로 접합된 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체 생성에 유용한 바람직한 화합물, PNU-Gly5은 도 6a에 도시되어 있다.
화학식 (ii)에 대해, 다른 바람직한 구체예에서는, 올리고-글리신 펩티드 (Gly)n(이때, n은 1 이상 21 이하, 바람직하게는 n=3 또는 n=5)는, 아미드 결합에 의하여 올리고 글리신 펩티드의 카르복시 말단에 접합되는 알킬렌디아민 링커 -(CH2)m-NH2 (m은 1 이상 11 이하, 바람직하게는 m=2)를 사용하여, PNU 접합체(또는 안트라사이클린 아글리곤 구조의 C9)의 고리 A에 직접 접합된다. 부위 특이적으로 접합된 PNU-유도체 접합체 생성에 유용한 바람직한 화합물, PNU-EA-Gly5가 도 6b에 도시되어 있다.
이하에서, 상기 기술에 따른 안트라사이클린 유도체 접합체는 "PNU-EDA-Glyn-NH2", "PNU-Glyn-NH2" 또는 "PNU-EA-Glyn-NH2"라고도 하며, 또는 각각 짧은 "PNU-EDA-Glyn", "PNU-Glyn", "PNU-EA-Glyn"이라고 한다. 5 개 글리신 잔기를 갖는 바람직한 구체예에서, 각각 "PNU-EDA-Gly5", "PNU-Gly5", 또는 "PNU-EA-Gly5"라고 한다.
나아가, 본 발명은 상기 개시에 따른 안트라사이클린 유도체 접합체를 포함하는 결합단백질-약물 접합체(BPDC)를 제공하며, 나아가 상기 유도체는 추가의 아미드 결합에 의하여 올리고-글리신 펩티드(Glyn)의 자유 아미노 말단에 접합된 결합단백질을 포함한다.
안트라사이클린(PNU) 유도체 또는 결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, L2로 지정된, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)는, L1으로 지정된 알킬렌디아미노 링커에 의하여 화학식(i)의 안트라사이클린 유도체에 접합되는데, 알킬렌디아미노 링커는 제1 아미드 결합에 의하여 안트라사이클린 유도체에 접합되고, 제2 아미드 결합에 의하여 올리고-글리신 펩티드의 카르복시 말단에 접합되며, 상기 알킬렌디아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체는 다음 화학식 (v)을 가진다.
Figure 112017067871584-pct00006
화학식 (v)
이때, 물결선은 화학식 (i)의 안트라사이클린 유도체로의 연결을 나타낸다.
m은 1 이상 11 이하의 정수이고, n은 1 이상 21 이하의 정수이다. 바람직하게는, m은 2 이상 4 이하의 정수, 가장 바람직하게는 m=2 (에틸렌다아미노기, EDA)이다.
알킬렌디아미노 링커를 사용하여 소르타제 접합을 위한 (Gly)n 링커에 부착함으로써, (Gly)n 펩티드의 C-말단을 통하여 결합이 발생할 수 있으며, 따라서 소르타제 접합에 대한 최종 독소-링커 부가물의 자유 N-말단을 제공할 수 있다. 본 발명을 구현하기 위하여, 디알킬렌디아미노 링커 내 CH2 메틸렌기는 다른 안정한 결합, 예컨대, -O- (에테르), -S- (티오에테르), -NH- (아민), 또는 임의의 다른 알킬, 헤테로-알킬, 아릴 또는 헤테로-아릴기, 또는 이들의 조합에 의하여 치환될 수 있음을 이해하여야 한다.
안트라사이클린(PNU) 유도체 또는 결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)는, 화학식 (ii)의 안트라사이클린 유도체의 고리 A (또는 탄소 9)에 직접 결합된다. 이의 설명은 도 6a를 참조한다.
안트라사이클린(PNU) 유도체 또는 결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)는, L1으로 지정된, 알킬렌아미노 링커에 의하여 화학식(ii)의 안트라사이클린 유도체에 접합되는데, 알킬렌아미노 링커는 아미드 결합에 의하여 올리고-글리신 펩티드의 카르복시 말단에 접합되며, 상기 알킬렌아미노 링커 및 올리고-글리신 펩티드의 접합체는 다음 화학식 (vi)을 가진다.
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Figure 112017067871584-pct00007
화학식 (vi)
이때, 물결선은 화학식 (ii)의 안트라사이클린 유도체으로의 연결을 나타내며, m은 1 이상 11 이하의 정수이고, n은 1 이상 11 이하의 정수이다. 바람직하게는, m은 2 이상 4 이하의 정수이며, 가장 바람직하게는 m=2 (에틸렌아미노기, EA)이다.
알킬렌아미노 링커를 사용하여 소르타제 접합을 위한 (Gly)n 링커를 부착함으로써, (Gly)n 펩티드의 C-말단을 통하여 결합이 발생할 수 있으며, 따라서 소르타제 접합에 대한 최종 독소-링커 부가물의 자유 N-말단을 제공할 수 있다. 본 발명을 구현하기 위하여, 알킬렌아미노 링커 내 CH2 메틸렌기는 다른 안정한 결합, 예컨대, -O- (에테르), -S- (티오에테르), -NH- (아민), 또는 임의의 다른 알킬, 헤테로-알킬, 아릴 또는 헤테로-아릴기, 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있음을 이해하여야 한다.
결합단백질_약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에서, 링커 L3는 소르타제 효소 인식 모티프의 특이적 절단으로부터 오는 펩티드 모티프를 포함한다.
본원에서뿐만 아니라, 그 내용이 본원에 참조로서 병합되는 WO2014140317에서, 소르타제(소르타제 트랜스펩티다제로도 불림)는 특정 펩티드 모티프를 포함하는 특정 정렬 신호(sorting signal)를 인식하고 절단함으로써 표면 단백질을 변형시키는 원핵 효소 군을 형성한다. 이 펩티드 모티프는 본원에서 "소르타제 효소 인식 모티프", "소르타제 태그" 또는 "소르타제 인식 태그"로도 불린다. 일반적으로, 주어진 소르타제 효소는, 인식되는 하나 이상의 소르타제 효소 인식 모티브를 가진다. 소르타제 효소는 자연 발생적이거나 유전 공학을 거쳤을 수도 있다(Doerr 등, 2014).
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 바람직한 구체예에서, 상기 소르타제 효소 인식 모티브는 펜타펩티드를 포함한다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 바람직한 구체예에서, 상기 소르타제 효소 인식 모티프는 다음 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다 (N-말단->C-말단에 보임)
- LPXTG
- LPXSG, 및/또는
- LAXTG.
앞의 두 소르타제 효소 인식 모티프는 야생형 Staphylococcus aureus 소르타제 A에 의해 인식된다. 두 번째도 Staphylococcus aureus로부터의 조작된 소르타제 A 4S9에 의하여 인식되며, 세 번째는 Staphylococcus aureus로부터의 조작된 소르타제 A 2A-9에 의하여 인식된다(Doerr 등, 2014). 세 가지 경우 모두에서, X는 20 개의 펩티드 생성성 아미노산 중 하나일 수 있다.
예를 들면, 이러한 소르타제 효소 인식 모티프는 유전 융합에 의하여 결합단백질의 C-말단, 또는 이의 도메인 또는 서브유닛에 융합되며, 이와 함에 공동-발현된다. 상기 융합은 본원에 기재된 추가의 링커 Y를 통하여, 직접 또는 간접적으로 실행될 수 있다.
일단 링커 구조에 통합되어 L2에 접합되면, L3는 소르타제 효소 인식 모티프의 다섯 번째 아미노산 잔기(C-말단 G)가 결여되어 있다는 것은 주목할 만하다. 표 1에서, 상기 C-말단 G는 괄호 내에 도시되어있다. 소르타제 효소 인식 모티브가 펜타펩티드인 경우, L3는 테트라펩티다이다.
소르타제 접합 전에, 소르타제 효소 인식 모티프의 C-말단에 융합된, His-태그, Myc-태그 또는 Strep-태그(WO2014140317의 도 4a 참조, 이의 내용은 참조로서 본원에 병합됨) 같은 기타 태그를 더 운반할 수 있다. 그러나, 소르타제 효소 인식 모티프의 네 번째 및 다섯 번째 아미노산 사이의 펩티드가 소르타제 매개 접합에 의하여 절단되기 때문에, 이러한 추가적인 태그는 완전히 접합된 BPDC에서 결국에는 제거된다.
소르타제 효소 인식 모티브는 본원 및 WO2014140317에 개시된 소르타제 기술에 의하여 안트라사이클린 유도체에 접합되는 (Gly)n에 접합될 수 있다. 접합 공정에서, 하나의 글리신 잔기는 (Gly)n 링커로부터 방출된다.
이들 세개의 펩티드 스트레치(stretch)는 위에 보인 바와 같이 기존의 N-말단-> C-말단 방향으로이며, 펩티드 결합에 의하여 L 잔기는 결합단백질의 C-말단 또는 링커 Y의 C-말단에 융합된 것이다. L3의 다섯 번째 아미노산 잔기(G)는 (Gly)n 펩티드에 접합 시에 제거되며, L3의 네 번째 T 또는 S 아미노산 잔기는 (Gly)n 펩티드의 N-말단에 실제로 접합되는 것이다.
다음 표는 본 발명의 결합단백질-약물 접합체 (BPDC)의 바람직한 구체예의 개요를 보여주며, L1 내지 L3가 보인다.
일반적인 링커 구조
독소 L 1 L 2 L 3 (여기서는 C'-> N'로 도시) 결합단백질
화학식(i) 알킬렌-디아미노기 (Gly)n (G) TXPL
(G) LSXP
(G) TXAL		 항체
화학식 (ii) 알킬렌아미노기 (Gly)n (G) TXPL
(G) SXPL
(G) TXAL		 항체
논의된 바와 같이, 링커 구조에 통합되고 L2에 접합되면, L3는 다섯 번째 아미노산 잔기(C-말단 G)가 결여되어 있다. 표 1에서, 상기 C-말단 G는 괄호 안에 나타냈다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, 안트라사이클린(PNU) 유도체는, 하나 이상의 링커에 의하여, 결합단백질의 카르복시 말단 또는 이의 도메인 또는 서브유닛의 카르복시 말단에 접합되어 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 올리고-글리신 (Glyn) 펩티드 링커 내의 n은 3 이상 11 이하의 정수, 더 바람직하게는 3 이상 7 이하의 정수이고, 바람직하게는 n=3 또는 n=5이다. 가장 바람직하게는, 올리고-글리신(Glyn) 펩티드 링커 내의 n 은 5이다.
바람직한 하나의 구체예에서, 페이로드는 화학식 (i)중 하나이다.
바람직한 제2 구체예에서, 페이로드는 화학식 (ii) 중 하나이다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, 상기 결합단백질은 아미드 결합에 의해 올리고-글리신 펩티드 (Glyn)의 자유 아미노 말단에 접합된다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에 따르면, 결합단백질은 다음으로 구성되는 군에서 선택된다.
- 항체,
- 변형 항체 포맷(format),
- 타겟 결합 성질을 갖는 항체 유도체 또는 단편
- 항체-계열 결합단백질,
- 올리고펩티드 바인더 및/또는
- 항체 모방체
본원에 사용되는 용어 "결합단백질"은 소르타제 효소 접합 기술에 관한 추가적인 기술 사항, 개시 사항, 및 실시가능성을 제공하는 부록 1을 포함하여, 본 발명자에 의한 기타 출판물에서 사용되는 용어 "면역리간드(immunoligand)"와 동일하다.
"면역글로불린"(Ig)과 동의어로도 사용되는 "항체"는 일반적으로 두 개의 중쇄(H)와 두 개의 경쇄(L)로 구성된, 4개의 폴리펩티드를 포함하여, 다량체 단백질 또는 상응하는 이의 Ig 동족체(예, 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)만을 포함하는 카멜리드 나노바디; 전장 기능성 돌연변이체, 변이체, 또는 이들의 유도체를 포함함 (Ig 분자의 본질적인 에피토프 결합 특징을 보유하고, 중복 특이적, 이중 특이적, 다중 특이적 및 이중 가변 도메인 면역글로불린을 포함하는, 뮤린, 키메라, 인간화 및 완전 인간 항체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며; 면역글로불린은 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY) 또는 아형(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 및 동종이인자형(allotype)일 수 있다.
결합단백질이 항체인 경우, 결합단백질-약물 접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
이하, 본 발명의 ADC는 "PNU-EDA-Glyn-Ab", "PNU-Glyn-Ab" or "PNU-EA-Glyn-Ab"이라고도 한다.
본원에서 사용되는 "항체-계열 결합단백질"은, 기타 비-면역글로불린, 또는 성분에서 유래되는 비-항체에 있어서, 적어도 하나의 항체-유래 VH, VL, 또는 CH 면역글로불린 도메인을 포함하는 임의의 단백질을 나타낸다. 이러한 항체-계열 단백질은, (i) 수용체 또는 면역글로불린 CH 도메인 모두 또는 일부를 갖는 수용체 성분을 포함하는, FC-융합 단백질, (ii) VH 및/또는 VL 도메인이 대안적 분자 스캐폴드에 결합되는 결합 단백질, (iii) 면역글로불린 VH 및/또는 VL, 및/또는 CH 도메인이 일반적으로 자연적으로 발생하는 항체 또는 항체 단편에서 보통 발견되지 않는 방식으로 결합되거나 회합되는 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "항체 유도체 또는 단편"은, (i) 가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab(Fd) 단편의 중쇄 부분; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 가변 단편 (Fv); (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 도메인 항체(dAb) 단편; (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); (vii) 단일쇄 Fv 단편(scFv); (viii) VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되나, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서의 쌍을 만들기에 너무 짧아 다른 도메인의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 링커를 이용하는, 이가의 이중특이적 항체인 디아바디; (ix) 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는, 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 선형 항체; (x) 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 기타 비-전장 길이 부분, 또는 이들의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독으로 또는 조합하여 포함하나 이에 한정되지 않는, 전장이 아닌 항체로부터 유래된 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자에 관한 것이다. 어떤 경우에도, 상기 유도체 또는 단편은 타겟 결합 특성을 보유한다.
본원에서 사용되는 용어 "변형 항체 포맷"은 항체-약물-접합체, 폴리알킬렌 옥사이드-변형 scFv, 모노바디, 디아바디, 카멜리드 항체, 도메인 항체, 이중 또는 삼중 특이적 항체, IgA, 또는 J 사슬과 분비 성분에 의하여 결합된 2개의 IgG 구조체, 상어 항체, 신규한 세계 영장류 골격 + 비-신규한 세계 영장류 CDR, 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체, CH3 도메인으로 조작된 2개의 부가적인 결합 부위를 갖는 IgG, Fc 감마 수용체에 대한 친화성을 높이기 위해 Fc 영역이 변형된 항체, CH3 + VL + VH을 포함하는 이량체화된 구조체, 등등을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항체 모방체"는 면역글로불린 패밀리에 속하지 않는 단백질을 말하며, 심지어 앱타머와 같은 비-단백질, 또는 합성 중합체이다. 일부 유형에는 항체-유사 베타 시트 구조를 가진다. 항체보다 "항체 모방체" 또는 "대안적 스캐폴드"의 잠재적인 장점은 용해도가 높고, 조직 침투력이 높으며, 열 및 효소에 대한 안정성이 높고, 생산 비용이 비교적 낮다는 것이다.
몇몇 항체 모방체는 모든 인지할 수 있는 타겟에 대항하는 특이적 결합 후보 물질을 제공하는 대형 라이브러리에서 제공될 수 있다. 항체와 마찬가지로 타겟 특이적 항체 모방체는 고효율 스크리닝 (High Throughput Screening, HTS) 기술뿐만 아니라, 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 이스트 또는 포유류 디스플레이와 같은 확립된 디스플레이 기술을 사용하여 개발시킬 수 있다. 현재 개발된 항체 모방체는, 예컨대, 안키린 반복 단백질(DARPin으로 불리어짐), C-형 렉틴, S. aureus의 A-도메인 단백질, 트랜스페린, 리포칼린, 피브로넥틴의 10 번째 유형 III 도메인, 쿠니츠 도메인 프로테아제 억제제, 유비퀴틴 유래 바인더 (affilins로 불림), 감마 크리스틴 유래 바인더, 시스테인 놋(knots) 또는 노틴(knottins), 티오레독신 A 스캐폴드 기반 바인더, SH-3 도메인, 스트라도바디, 디설파이드 결합과 Ca2+으로 안정화 된 막 수용체의 "A 도메인", CTLA4-계열 화합물, Fyn SH3, 및 앱타머(특정 타겟 분자에 결합하는 펩티드 분자)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "올리고펩티드 바인더"는 주어진 타겟에 높은 친화성으로 결합하는 능력을 갖는 올리고펩티드에 관한 것이다. "올리고"라는 용어는 5 내지 50 개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 의미한다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 또 다른 구체예에 따르면, 결합 단백질은 다음으로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 개체에 결합한다:
- 수용체
- 항원
- 성장 인자,
- 사이토카인 및/또는
- 호르몬.
이 목록은 결합단백질이 결합할 수 있는 여러 유형의 표적을 정의한다. 본원에서 사용되는 용어 "수용체"는 세포 표면 분자, 바람직하게는 (i) 특이적, 또는 특이적 시그널링 분자의 그룹(즉, 수용체, 예를 들어, VEGF 수용체)에 결합하고, 및/또는 (ii) 알려진 리간드가 없는(즉, HER2/neu와 같은 고아 수용체) 세포 표면 분자를 의미한다. 자연 수용체는 세포 집단의 표면에서 발현되거나, 단지 그러한 분자의 세포외 도메인(그러한 형태가 자연적으로 존재하든 그렇지 않든간에), 또는 혈장 내에서 또는 세포 혹은 기관에서, 자연 결합 기능을 수행하는 가용성 분자를 나타낼 뿐이다. 바람직하게는, 이러한 수용체는 특정 병원성 과정(예를 들어, 성장 인자의 시그널링 캐스캐이드에 속하는 수용체)에 관여하거나, 또는 병적인 과정과 관련된 세포 또는 입자, 예를 들면, 암세포의 표면 상에 발현되는 시그널링 캐스캐이드의 구성원이다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 특정 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는 물질을 의미하며, 표면 단백질 또는 단백질 복합체(예, 이온 채널)를 포함할 수 있다. 종종, 항원은 병원성 개체, 예를 들어, 암세포와 관련이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 다수의 세포에 의해 분비되고 세포간 연락에서 광범위하게 사용되는 시그널링 분자의 카테고리인, 작은 세포-시그널링 단백질 분자를 말한다. 사이토카인은 단백질, 펩티드, 또는 당단백질로 분류 될 수 있으며, 용어 "사이토카인"은 다양한 발생학적 기원의 세포에 의해 신체 전체에 걸쳐 생성된 크고 다양한 조절자 패밀리를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "성장 인자"는 세포 성장, 증식. 및 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질에 관한 것이다. 일반적으로 성장 인자는 단백질 또는 스테로이드 호르몬이다. 성장 인자는 다양한 세포 과정을 조절하는 데 있어서 중요하다.
본 명세서에 사용되는 용어 "호르몬"은 생물체의 다른 부분에 있는 세포에 영향을 주는 메시지를 전송하는, 신체의 한 부분에 있는 세포, 분비선, 또는 기관에 의해 방출되는 화학 물질을 말한다. 이 용어는 펩티드 호르몬, 스테로이드 호르몬을 포함하는 지질 및 인지질 유래 호르몬, 및 모노 아민을 포함한다.
결합 단백질이 수용체 또는 항원에 결합하는 경우, 결합단백질-약물 접합체 (BPDC)는 예를 들어, 특정 위치, 예를 들어, 독소와 같은 페이로드가 전달되는, 암세포와 같은 병원성 개체에 대한 것일 수 있다. 따라서, 독소 또는 화학 요법제의 전신성 독성이 감소되는 반면, 작용 부위에서의 후자의 국소 농도가 증가되어, 부작용이 감소하면서 보다 우수한 효능을 제공한다. 또한, 각각의 시그널링 캐스케이드는 결합 단백질의 결합에 의해 저해될 수 있다. 페이로드가 마커인 경우, 후자는 특정 부위, 예를 들어 진단을 위해 결합단백질에 의해 검출된 주어진 표면 항원을 특징으로 하는 암세포를 표시하는데 사용될 수 있다.
결합단백질이 성장 인자, 사이토카인, 및/또는 호르몬에 결합하는 경우, 결합단백질-약물 접합체(BPDC)는, 부위-특이적 방식으로 페이로드를 전달하기 위하여, 예를 들어, 성장 인자, 사이트카인, 또는 호르몬이 보통 결합하는 부위에 관한 것이다. 또한, 각 시그널링 캐스캐이드는 결합 단백질의 결합에 의해 저해될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "결합하는 것"은 잘 알려진 상호 작용, 또는 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편과 그의 타겟 사이의 기타 비-랜덤 연관을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 결합 반응은 타겟에 대한 높은 특이성 및/또는 민감도를 특징으로 한다. 바람직하게는, 결합 반응은 해리 상수(Kd) ≤10-3M, 바람직하게는 ≤10-4M, ≤10-5M, ≤10-6M, ≤10-7M, ≤10-8M , ≤10-9M, 가장 바람직하게는 ≤10-10M이다.
다른 구체예에 따르면, 결합 단백질은 적어도 두 개의 서브 유닛을 가진다.
이 구체예에서, 하나의 서브 유닛은 본원에 기재된 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체에 접합될 수 있다(도 3a 및 6a 및 6b 참조).
바람직하게는, 적어도 2 개의 상이한 약물이 부위 특이적으로 적어도 2 개의 서브 유닛에 접합될 수 있다. 이 옵션은 매우 다양한 결합단백질-약물 구조를 만들 수 있는 다용도 도구 상자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 적어도 2개의 상이한 약물은 상이한 세포 경로를 간섭하는 약물이다. 이것은 본원에 개시된 안트라사이클린 유도체 접합체 다음에, 제2 독소가 동일한 결합 단백질의 다른 서브 유닛에 접합 될 수 있다는 것을 의미한다.
그러한 구체예는, 예를 들어, 2개의 상이한 소르타제 효소를 이용하고, 상이한 소르타제 인식 모티프("소르타제 태그")를 인식함으로써, 2종의 약물을 전장 항체의 2개의 경쇄 각각 및 전장 항체의 2개 중쇄에 각각 접합시킴으로써, 여기에 더하여 상기 상이한 소르타제 효소에 대한 각각의 인식 모티프를 포함하는 중쇄 및 경쇄로부터 상이한 C-말단 변형을 포함하는 항체에 의하여 달성할 수 있다.
이러한 방식으로, 항체 약물 접합체는 두 개의 전장 Ig 경쇄 및 Ig 중쇄 각각으로 구성되고, 상기 중쇄 및 경쇄에 공유 결합된 상이한 페이로드를 함유하여, 생성될 수 있다.
이러한 양태는, 바람직하게는, 상기 서브 유닛 각각에 부위 특이적 및 동일한 페이로드 접합을 갖는 결합단백질 약물 접합체의 생성을 위한 적어도 2개의 서브 유닛의 부위-특이적 접합을 초래한다.
일 구체예에서, 결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 일 구체예에서, 결합 단백질은 HER-2에 결합한다. 바람직하게는, 결합 단백질은 HER-2에 특이적인 항체이다.
이 구체예에서, HER-2 특이적 항체는, 바람직하게는
a) 트라스투주맙(인간화 hu4D5)의 CDR 영역 1 내지 6을 포함하고,
b) 트라스투주맙의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
c) a) 또는 b)의 영역 또는 도메인과 90 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며,
d) 트라스투주맙, 또는 이의 타겟 결합 단편 또는 유도체이며, 및/또는
e) Her-2에 결합하기 위해 트라스투주맙과 경쟁한다.
항 HER-2 단클론 항체 트라스투주맙은 HER-2의 도메인 IV에 결합한다. 바람직하게는, 항-HER-2 항체는 도 11A의 IgH 및 IgL 사슬의 일차 아미노산 서열을 포함한다(서열 번호 1 및 2).
또한, 트라스투주맙의 서열은 본원에 참조로 병합된 약물 은행 접수 번호 DB00072 (BIOD00098, BTD00098) 및 IMGT 데이터베이스 (VH: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=7637&Part= Chain&Chain=7637H 및 VL: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/ details.cgi?pdbcode=7637&Part=Chain&Chain=7637L)에 개시되어 있다.
결합단백질-약물 접합체(BPDC)의 다른 구체예에서, 결합단백질은 CD30에 결합한다. 바람직하게는 결합 단백질은 CD30에 특이적인 항체이다.
이 구체예에서, 항체는 바람직하게는,
a) 브렌투시맙(키메라 cAc10)의 CDR 영역 1 내지 6을 포함하고,
b) 브렌투시맙의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
c) a) 또는 b)의 영역 또는 도메인과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며,
d) 브렌투시맙 또는 이의 타겟 결합 단편 또는 유도체이며, 및/또는
e) CD30에 결합하기 위해 브렌투시맙과 경쟁한다.
승인된 약물 아드세트리스/브렌투시맙 베도틴의 항체 성분인 브렌투시맙(클론 cAc10)의 서열은 US2008213289A1에 개시되어 있다.
바람직하게는, 항-CD30 항체는 도 11의 IgH 및 IgL 사슬의 1 차 아미노산 서열을 포함한다(서열 번호 3 및 4).
바람직하게는, 이들 구체예에서, 독소는 화학식(ⅰ) 중 하나이다.
- L1은 에틸렌디아미노 링커이고,
- L2는 올리고-글리신 (Glyn) 펩티드 링커(n은 바람직한 5 개의 아미노산의 길이임)이며,
- L3는 (Gly)n 펩티드에 대한 소르타제 매개 접합 시에 제거되는, 처리되는 소르타제 태그 펜타펩티드 모티프(즉, C-말단 G 잔기(5 번째 아미노산 잔기)가 없음)의 아미노산 잔기 1-4를 나타내고,
- 링커 X는 부존재하고,
- Y는 Ig 경쇄의 C 말단과 L3 사이의 5-아미노산 링커이며, 바람직하게는 아미노산 서열 GGGGS를 갖는다.
대안적으로, 독소는 화학식(ii) 중 하나이다.
- L1은 에틸렌디아미노 링커이고,
- L2는 올리고-글리신 (Glyn) 펩티드 링커(n은 바람직한 5 개의 아미노산의 길이임)이며,
- L3는 (Gly)n 펩티드에 대한 소르타제 매개 접합 시에 제거되는, 처리되는 소르타제 태그 펜타펩티드 모티프(즉, C-말단 G 잔기(5 번째 아미노산 잔기)가 없음)의 아미노산 잔기 1-4를 나타내고,
- 링커 X는 부존재하고,
- Y는 Ig 경쇄의 C 말단과 L3 사이의 5-아미노산 링커이며, 바람직하게는 아미노산 서열 GGGGS를 갖는다.
본 발명은 또한, 소르타제 효소 인식 모티프를 갖는 결합단백질이, 소르타제 효소에 의하여, L2로서 올리고-글리신 펩티드(Glyn)를 운반하는 적어도 하나의 안트라사이클린 유도체 접합체에 접합되는, 상술된 기재에 따른 결합단백질-약물 접합체(BPDC)를 제조하는 방법을 제공한다.
소르타제 기술, 그 이점(부위 특이적 접합, 독소와 결합 단백질 사이의 화학양론적으로 정의된 관계, 고효율의 접합)은 출원 WO2014140317A1에 상세히 설명되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. 소르타제 태그에 대한 자세한 설명은 상술된 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, SMAC 기술에 의한 PNU 유도체 페이로드를 결합단백질의 C-말단, 바람직하게는 항체의 C-말단에, 또는 면역글로불린을 적어도 하나의 Ig 경쇄 또는 Ig 중쇄에 접합시키는 것이다. 이는 결합 단백질의 C-말단 바로 다음의 소르타제 효소에 대한 C-말단 펜타펩티드 인식 모티프 또는 다중 결합 단백질의 폴리펩티드 서브 유닛, 예를 들면, 항체를 코딩하는 결합 단백질 또는 면역글로불린 서브유닛에 대한 포유동물 세포 발현 구조물을 생성함으로써 달성된다.
LPXTG 또는 LPXSG이며 앞서 언급한 바와 같은, Staphylococcus aureus의 소르타제 A의 펜타펩티드 모티프는, 비한정적인 예로서만 제공되며, 펜타펩티드 모티프 NPQTN을 인식하는, Staphylococcus aureus으로부터의 소르타제 B와 같이, 기타 종 또는 기타 계열로부터의 소르타제 효소에 의하여 인식되는 임의의 다른 펜타펩티드 모티프로 치환될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 최근 Dorr 등에 의하여 최근에 기재된 Staphylococcus aureus의 소르타제 A의 공학적 버전에 의해 인정된, 예컨대, LAETG와 같은, 조작된 소르타제 효소에 의하여 인식되는 인식 모티프를 이용할 수 있다(2014).
WO2014140317은 추가적으로 SMAC 기술(소르타제 매개 항체 접합 기술)라고도 불리는, 소르타제 접합 기술에 관한 기술적 세부사항, 개시 내용, 및 실시가능성을 제공한다. 이 기술은 (Gly)n 스트레치(본원에서 상기 독소에 논의됨) 및, 예컨대, 결합단백질에 부착될 수 있는 것보다 펩티드 태그인, 소위 소르타제 태그인 두 개체의 접합을 허용한다.
이러한 소르타제 태그는, 보통은, 상기 소르타제 태그 올리고 펩티드의 C-말단이 유리 상태로 남는 방식으로, 제2 개체(여기서는 안트라사이클린 유도체)에 접합되어야 하는 제1 개체(여기에서는 결합 단백질)에 융합되는 펜타펩티드 모티프이다. WO2014140317에 개시된 바와 같이, 이것은 펜타펩티드 소르타제 태그용 추가적인 아미노산을 코딩하는 발현 벡터로부터 결합단백질을 발현시킴으로써 달성 될 수 있다.
이러한 소르타제 태그는, 예를 들면, LPXTG 또는 LPXSG(Staphylococcus aureus로부터 소르타제 A 용), LPXSG(Dorr 등 2014에 기재된 Staphylococcus aureus로부터의 조작된 소르타제 A 4S9용), 또는 X가 20 개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 갖는 LAXTG(Dorr 등 2014에 기재된 Staphylococcus aureus로부터의 조작된 소르타제 A 2A9용)이다. 그러나, 이러한 소르타제 태그는 기타 박테리아 종으로부터의 소르타제 효소의 서열과 WO2014140317 및 선행 기술(Spirig 등, 2011)에 개시된 바와 같은 소르타제 부류의 서열에 있어서 상이할 수 있다.
제 2개체는 자유 N-말단(-NH2)을 갖는 글리신-스트레치(Glyn-stretch)를 포함하며, 글리신-스트레치는 올리고-글리신 펩티드이다. 바람직하게는, n은 1 이상 내지 21 이하의 정수이다. 특히 바람직한 한 구체예에서, n은 3 이상 10 이하의 정수, 바람직하게는 n = 3 또는 n = 5이다. 가장 바람직하게는 n = 5이다.
이어서, C-말단 아미노산 잔기(예를 들어, LPXTG에서 G)가 절단된 후 상기 글리신 스트레치의 제1 글리신으로 치환되는 동안, 소르타제 효소는 펩티드전환 반응(transpeptidation reaction)에 의해 두 개체를 하나로 융합시킬 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 펜타펩티드 인식 모티프는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 최종 자연 발생 C-말단 아미노산에 직접 부착될 수 있는데, 이는 인간 면역글로불린 카파 경쇄의 경우 C-말단 시스테인 잔기이고, 인간 면역글로불린 람다 경쇄의 경우 C-말단 세린 잔기이고, 이는 인간 면역 글로불린 IgG1 중쇄의 경우 인간 Fcγ1 cDNA에 의해 코딩되는 C-말단 라이신 잔기일 수 있다. 그러나, 다른 바람직한 구체예에서도, 포유류 세포에서 항체 중쇄의 말단 라이신 잔기가 번역 후 변형에 의해 절단되기 때문에 인간 Fcγ1 cDNA에 의해 코딩된 두 번째 최종 C-말단 글리신 잔기에 소르타제 펜타펩티드 모티프를 직접 추가하는 것이다. 따라서, 자연 발생하는 인간 IgG1의 경우 90 % 이상에서 IgG1 중쇄의 C-말단 라이신 잔기가 결핍되어 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 펜타펩티드 인식 모티프는 인간 Fcγ1 cDNA에 의해 코딩되는 C-말단 라이신 잔기가 라이신 이외의 아미노산 잔기로 치환된 인간 면역 글로불린 IgG1 중쇄의 C-말단에 부착될 수 있다.
어떤 경우(예를 들어, Ig 카파 경쇄의 C-말단에서(Beerli 등 2015))에는, 결합단백질의 C-말단과 소르타제 태그 L3 사이에 추가 아미노산을 첨가하는 것이 유익하다는 것은 앞에서 기재하였다. 여기에서 결합 단백질에 대한 페이로드의 소르타제 효소 접합 효율을 향상시키는 것을 보여 주었다. Ig 카파 경쇄의 경우, Ig 카파 경쇄의 최종 C-말단 시스테인 아미노산과 소르타제 효소 태그 사이에 5 개의 아미노산(GGGGS)을 첨가함으로써 접합의 동역학을 개선하여, Ig 카파 경쇄 및 Ig 중쇄의 C-말단이 유사한 동역학으로 결합될 수 있다른 것을 관찰하였다 (Beerli 등 (2015) 참조). 따라서, 다른 구체예에서, 결합 단백질 또는 항체 서브 유닛의 최종 C-말단 아미노산과 소르타제 태그 L3 사이에서 1 이상 21 이하의 링커 Y를 선택적으로 포함한다.
본 발명은, 주어진 병리학적 조건에 대하여
- 고통 받는,
- 발전 위험이 있는 및/또는
- 진단 받은
인간 또는 동물 대상체의 치료를 위하여, 상기 설명에 따른, 또는 상기 설명에 의한 방법으로 제조되는, 결합단백질 약물 접합체(BPDC)의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은, 주어진 병리학적 조건에 대하여
- 고통 받는,
- 발전 위험이 있는 및/또는
- 진단 받은
인간 또는 동물 대상체의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 서술에 따라 결합 단백질 약물 접합체의 용도를 추가로 제공한다.
바람직하게는, 병리학적 조건은 종양 질환이다. 더 바람직하게는, 종양 질환은,
- IHC 또는 ISH에 의해 결정되는, 1+, 2+ 또는 3+의 HER-2 발현 점수를 갖는 암으로서, 상기 암은 바람직하게는 유방암이며,
- IHC, ELISA 또는 유동세포 분석에 의하여 결정되는 CD30 양성인 암으로서, 바람직하게는 림프종, 보다 바람직하게는 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL) 또는 전신성 역형성대세포림프종(systemic anaplastic large cell lymphoma, sALCL)이다.
HER-2 상태는, 예를 들어 Wolff 등 (2013)에 기재된 ASCO/CAP 가이드라인에 따라 결정할 수 있다.
CD30 상태는 예를 들어 Young 2014의 방법에 따라 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 설명에 따른 결합단백질 약물 접합체(BPDC)를 포함하거나 또는 상기 기술된 방법으로 제조된, 약학적 조성물, 및 적어도 하나의 기타 약학적으로 허용가능한 성분을 제공한다.
추가 기재
BPDC 및 ADC 생성을 위한 종래의 말레이미드 링커 화학의 주요 한계를 극복하기 위해, 우리는 앞에서 서열-특이적 펩티드 전환 효소를 이용하거나 소르타제 효소, 소위 스플릿-인틴(split-inteins)(WO2014140317A1 참조)을 채용하여 BPDC 또는 ADC를 생성하기 위한 효소적 접근법을 개발하였다. 특히, SMAC-기술(sortase-mediated antibody conjugation technology)으로 지칭되는, 항체에 있어서 소르타제 효소에 의한 소형 분자 페이로드의 부위 특이적 접합은, 동일한 결합단백질 및 동일한 페이로드를 사용한다면, 결합은 시험관에서 암세포를 사멸하는데 있어서 화학적으로 접합된 ADC와 동등한 재능을 갖는 ADC를 만든다는 것을 입증할 수 있었다. 또한, 동일한 타겟팅 항체(항 HER-2 트라스투주맙) 및 동일한 독성 페이로드(DM1)가 채용되는 경우, SMAC-기술은 HER-2 타겟에 특이적인 ADC를 생성하여 이종이식 모델에서 유사하게 강력한 종양 퇴화를 유도하였다(WO2014140317A1). 그러나, 첫째, SMAC-생성 ADC에서, 말레이미드 링커 화학은 이용하지 않았고, 둘째, 접합 반응은, 항체의 IgH 또는 IgL 사슬의 C-말단에 부위-특이적 방식으로 수행되어. 보다 균일한 ADC를 얻었다.
SMAC-기술의 경우, 부위-특이적 접합은, LPXTG 또는 LPXSG 펜타펩티드 모티프(X = 20 개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 아미노산)를 특이적으로 인식하고 접합용 재조합 항체에 부착될 수 있는, 예를 들면, Staphylococcus aureus의 재조합 소르타제 A 효소에 의하여 영향을 받을 수 있다. 이어서, 올리고-글리신의 아미노기가 트레오닌 또는 세린과 LPXTG 또는 LPXSG 펜타 펩티드 모티프의 글리신 사이의 펩티드 결합에 대한 친핵성 공격을 일으키는 것에 의하여, 소르타제 A는 친핵체로서 올리고-글리신 스트레치를 사용하여 펩티드 전이를 촉매시킨다. 이는 펩티드 결합을 분해하고 올리고-글리신 펩티드의 N-말단 글리신 사이에 새로운 펩티드 결합을 형성하는(도 1 참조), 즉 펩티드 전이를 일으킨다.
소르타제-매개 접합에 의해 생성된 트라스투주맙-DM1 접합체가 화학적으로 접합된 DM1 접합체(T-DM1 또는 Kadcyla®, 이미 임상에 적용됨)와 비교할만한 효능을 갖는 것으로 나타났지만, SMAC-기술로 생성된 ADC는 더 높은 효능을 달성하지 못하였다(WO2014140317A1). 동일한 타겟팅 항체 및 동일한 페이로드를 사용하였기 때문에 이것은 기대되지 않았을 것이다.
이러한 사실과, HER-2 타겟보다 암세포에 낮은 수준으로 잠재적으로 발현되거나 ADC 결합시 덜 효율적으로 내재화되는(데이터 미표시), 기타 TSA에 특이적으로 결합하는 상이한 단클론 항체에 대한 다른 실험에도 기초하여, 메이탄신보다 높은 효능 및/또는 잠재적으로 상이한 작용 방식을 갖는 독성 페이로드는 충분히 효과적인 ADC를 생산할 필요가 있다는 것이 명백해졌다. 또한, 페이로드는 적어도 하나의 반응성기에서 수정이 가능해야하며, 따라서 올리고-글리신 펩티드의 첨가는 LPXTG- 또는 LPXSG-변형 결합단백질로의 페이로드의 소르타제 접합을 가능하게 할 수 있다. 마지막으로, 높은 효능의 독소가 사용된다면, 혈액 순환에서 독성 페이로드의 바람직하지 않은 방출을 방지하기 위하여, 변형은 글리신-스트레치 및 페이로드 사이에 안정한 결합을 생성시키나, 이와 동시에, 독소가 종양 세포 내로의 BPDC 또는 ADC의 특이적 결합 및 내재화시 암세포의 효과적인 사멸을 여전이 초래한다.
SMAC-기술의 맥락에서 선행 기술에 기재된 상이한 독성 페이로드의 경험적 평가는, 펜타글리신 스트레치의 첨가를 허용하기 위하여, 에틸렌디아민-스페이서로 변형된, PNU-159682(Quintieri 등, 2005)으로 불리는, 네모루비신의 매우 강력한 안트라사이클린 유도체가, HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) 및 역-상 크로마토그래피(데이터 미표시)에 의한 생성물의 분석에 기초하여 거의 완전히 접합된 ADC를 생성하는 SMAC 기술에 의해, LPXTG 변형된 항체에 매우 효율적으로 접합될 수 있다는 것을 알게 해주었다. 또한, 하기에 제공된 실시예들에 기재된 바와 같이, PNU-EDA-Gly5로 명명된, 이러한 변형 PNU-159682 유도체가 다양한 단클론 항체에 SMAC 접합된다면, 종양 세포에 대한 매우 강력하고 TSA-의존적 사멸은 영향을 받았다. 특히, HER-2 저 발현 인간 유방암 세포는 SMAC-기술로 접합된 PNU-EDA-Gly5 접합체로 체외에서 효과적으로 사멸될 수 있지만, 메이탄신-독소 접합체는 거의 효과적이지 못했다. 이는, 바람직하게는 PNU-EDA-Gly5를 함유하는 강력한 BPDC 및 ADC를 생성하기 위한 PNU-EDA-Gly5 유도체, 또는 적어도 2개의 글리신이 부착된 올리고-글리신 펩티드를 갖는 임의의 PNU 유도체의 잠재적 유용성을 입증한다. 또한, 바람직하게는 PNU-EDA-Gly5를 함유하는 BPDC 및 ADC, 또는 암 질환 치료를 위한 페이로드로서 올리고-글리신 펩티드를 갖는 임의의 PNU-유도체의 유용성을 입증한다.
화학적 접합 및 ADC의 맥락에 있어서의 안트라사이클린 유도체 PNU-159682(도 2) 및 이의 용도가 선행 기술(예를 들어, 본원에 참조를 위하여 제공된 WO2009099741A1, WO2010009124, WO2012073217)에 기재되어 있지만, PNU-EDA-Glyn과 유사한 화합물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 소르타제-접합 PNU-EDA-Glyn을 함유하는 ADC는, 선행 기술에서 아직 기술되지 않았으며, 선행 기술 문서 중 어느 것에도 기재되거나 청구된 EDA 스페이서 및 Glyn 링커를 갖는 PNU 유도체의 특정 구조도 아니다. PNU 유도체가 에스테르 결합보다는 펩티드 결합을 통해 단백질에 안정하게 연결되어있는 안정한 부가물, 및 말레이미드 링커가, 하기 실시 예에 개시된 바와 같이, 혈청 내 펩티드 결합의 일반적으로 높은 안정성으로 인하여, 생체 내 안정성 및 약물동력학적 거동의 측면에서 더 우수함을 입증할 수 있다. 또한, SMAC-기술 접합 후 안정한 약물 접합체를 나타낼 것으로 예상되는 Glyn-스트레치를 갖는 PNU 유도체가 도 6A 및 도 6B에 개시되어있다.
본 발명에 따르면 안트라사이클린 독소 유도체를 포함하는 결합단백질 약물 접합체가 제공된다.
도면 설명
도 1은 부위 특이적 소르타제 매개 항체 접합(SMAC 기술)의 개략도이다. 단클론 항체는 C-말단 LPXTG 소르타제 태그로 생산해야 한다. 독성 페이로드는 병렬로 소정 수의 글리신 잔기(n은 1 이상 21 이하, 바람직하게는 n은 3 이상 10 이하, 바람직하게는 n=3 또는 n=5, 가장 바람직하게는 n=5)를 갖는 올리고-글리신 펩티드 스트레치(Glyn-스트레치)를 함유하도록 생산해야 한다. Staphylococcus aureus로부터의 소르타제 A 효소는 LPXTG 펜타펩티드 모티프를 특이적으로 인식하여 올리고-글리신 펩티드 스트레치의 LPXTG의 트레오닌-글리신 펩티드 결합으로의 펩티드전이를 촉매하여, 트레오닌과 올리고-글리신 스트레치의 N-말단 글리신 사이의 새로운 안정한 펩티드 결합을 생성한다.
도 2는 테트라사이클린 아글리콘 구조의 반응성 탄소에 대한 공식적인 안트라사이클린 넘버링 시스템을 포함하는, 선행 기술(예를 들어, WO2009099741 또는 Quintieri 등 (2005))에 기재된 PNU-159682의 구조를 나타낸다.
도 3(A)는 본원에서의 실시예에 개시된 바와 같은 소르타제 효소를 사용하여 C-말단 LPETG 소르타제 태그된 단클론 항체에 SMAC-기술 접합에 이용되는, 본원에서 "PNU-EDA-Gly5"로 불리는, PNU 유도체-EDA-Gly5의 구조를 나타낸다. 도 3(B)는 안트라사이클린 유도체 PNU-EDA-Gly5의 합성 반응을 나타낸다.
도 4는 세포 표면(A)에서 높은 레벨의 CD30 타겟을 발현하는 인간 비-호지킨 림프종 세포주 Karpas-299 및 세포 표면에서 매우 낮은 레벨의 CD30 타겟을 발현하는 인간 호지킨 림프종 세포주 L428 세포에 대한 지시된 ADC의 세포 독성 영향에 대한 투여량 반응을 나타낸다. Adecetris는 상업적으로 입수가능한 항-CD30 ADC 브렌투시맙-베도틴을 말한다. Kadcyla는 상업적으로 입수가능한 항-HER-2/neu ADC T-DM1 (트라스투주맙-엠탄신)을 말한다. 두 세포주 모두 HER-2/neu에 음성이어서, Kadcyla는, 대상-특이적 방법으로 세포 사멸에 영향을 주어서는 안 되는 음성 대조군 ADC로서 작용한다. 세포를 4일 동안 ADC를 연속 희석하여 배양한 후, CellTiter-Glo® Luminescent Solution (Promega)을 첨가하고 Tecan Infinity F200에서 발광을 측정하여 생존 세포를 정량화하였다.
도 5는 높은 레벨의 HER-2/neu를 발현하는 사람 유방암 세포주 SKBR3(A) 및 낮은 레벨의 HER-2/neu를 발현하는 인간 유방암 세포주 T47D(B)에 대한 지시된 ADC의 세포 독성 효과에 대한 투여량 반응을 나타낸다. 세포를 4일 동안 ADC를 연속 희석하여 배양한 후, CellTiter-Glo® Luminescent Solution (Promega)을 첨가하고 Tecan Infinity F200에서 발광을 측정하여 생존 세포를 정량화하였다.
도 6은 BPAC 또는 ADC를 생산하기 위해 MAC-기술에 의해 LPXTG-태그된 결합단백질 또는 항체에 대한 부위-특이적 결합에 유용한 안트라사이클린 유도체와 관련이 있는 추가 PNU-159682를 나타낸다. Gly5-스트레치를 갖는 선호된 버전만 기술된다. 도 6A는 Gly5 아미노산 스트레치가 그의 카르복시 말단을 통해 PNU 유도체의 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 고리 A에 직접 결합된 유도체를 설명한다. 도 6B는 바람직한 에틸렌-아미노 링커 및 Gly5 아미노산 스트레치가 PNU 유도체의 테트라사이클릭 아글리콘 구조의 고리 A에 직접 결합된 유도체를 설명한다.
도 7(A)는 14 일 동안 마우스(A), 래트(B), 인간(C) 혈청 내 브렌투시맙-PNU-EDA-Gly5 ADC("cAc10-PNU ADC"로서 표지됨) 및 총 IgG의 시험관내 농도 측정을 나타낸다. 도 7(B)는 14 일 동안 마우스(A), 래트(B), 및 인간(C) 혈청에서 트라스투주맙-엠탄신(Kadcyla®) ADC 및 총 IgG의 시험관내 농도 측정을 나타낸다.
도 8은 마우스에서 Ac10-Gly5-PNU ADC 투여 후 21일 동안 6개의 시점에서 측정한 ADC 및 총 IgG의 생체내 혈장 농도를 나타낸다.
도 9는 항-HER-2 항체 트라스투주맙으로 배양 후, 형광단 함유 항-인간 IgG 항체(Fc 감마 특이적) PE으로 배양을 따르는 생체내 연구에서 선택된 EMT-6 HER-2 클론의 FACS 분석 데이터를 나타낸다.
도 10은 HER2-양성 유방암의 면역적격성 동소 마우스 모델에서 HER-2 특이적 ADC의 생체내 평가를 나타낸다. 인간 HER-2(A, C, D) 또는 무관한 항원 ROR-1을 발현하는 EMT6 마우스 유방암 세포를 Balb/c 마우스의 유방 지방 패드에서 성장시켰다. 13 일 및 20 일에, 동물에 비이클 대조군(A), 1mg/kg 트라스투주맙-PNU159682(B, D), 또는 15mg/kg Kadcyla(C)를 i.v. 처리하였다. 종양의 성장은 동물이 윤리적 이유로 인해 희생될 때까지 모니터링하였다.
도 11A 및 도 11B는 소르타제 효소 접합 후 펩티드 결합을 통해, Gly5-스트레치의 아미노기를 통해 소르타제 태그(굵은 글씨로 강조 표시됨)의 4 번째 아미노산에 연결된 도 3b에 도시된 PNU 유도체를 포함하여, 연구에 사용된 ADC를 함유하는 트라스투주맙(A) 및 브렌투시맙(B) PNU-독소 유도체의 C-말단 SMAC-기술TM 접합된 IgH 및 IgL 사슬의 아미노산 조성을 나타낸다.
실험 및 도면
본 발명은 도면 및 상술된 기재에서 상세하게 도시되고 설명되었지만, 그러한 도시 및 설명은 도해적 또는 예시적인 것으로 고려되어야 하며 제한적이지는 않다. 본 발명은 개시된 실시예들에 한정되지 않는다. 개시된 구체예에 대한 다른 변형은 도면, 개시 사항, 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시하는 데 있어서 당업자에 의해 이해되고 영향을 받을 수 있다. 청구 범위에서, "포함한다"라는 단어는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정 관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 특정 측정값이 서로 다른 종속항에서 인용된다는 단순한 사실만으로 이 측정값의 조합을 활용할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다. 청구 범위 내의 모든 참조 부호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 보여지며, 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'→3'으로 보여진다.
실시 예 1: 소르타제 매개 항체 접합 기술(SMAC-기술)에 의한 부위-특이적 C-말단 PNU-EDA-Glyn-페이로드 접합된 단클론 항체 브렌투시맙 및 트라스투주맙
인간 CD30 타겟에 특이적인 단클론 항체 브렌투시맙(클론 cAc10)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 특허 US2008213289A1에서 얻었고, 시판되는 항체 허셉틴(트라즈투주맙)에 함유된 인간 HER-2 특이적 트라스투주맙 항체, 또는 이의 파생된 ADC Kadcyla®를 온라인 IMGT 데이터베이스(VH: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=7637&Part= Chain&Chain=7637H & VL: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/ details.cgi?pdbcode=7637&Part=Chain&Chain=7637L)에서 유도하였다. 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 소르타제 A 인식 서열 및 추가 Strep II 친화성 정제 태그(HC 태그 서열: LPETGGWSHPQFEK; LC 태그 서열: GGGGSLPETGGWSHPQFEK)로 C- 말단으로 태그된 중쇄 및 경쇄를 갖는, 키메라 mAb cAc10 및 인간화된 mAb 트라스투주맙을 생산하였다(도 11a 및 도 11b 참조).
도 3B의 합성식에 따른 에틸렌디아미노(EDA) 링커를 통하여 PNU159682의 카르보닐기에 대한 펜타글리신 펩티드를 합성한, Levana Biopharma, San Diego, CA가 안트라사이클린 유도체 PNU-EDA-Gly5(도 3A)를 제공하였다. 이를 위해, 시판 중인 PNU159682를 먼저 산화하여 실온에서 3시간 동안 60% 메탄올 중 NaIO4로 이의 카르복실산(도 3B에서 1)을 수득 하였다. 그 후, 디클로로메탄(DCM) 중 N-하이드록시숙신이미드(NHS, 46mg, 400μmol) 및 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 100mg, 523μmol)를 6mL DCM 중 1(51mg, 81μmol)의 용액에 첨가하였다. 30 분 후, 혼합물을 물(2x6mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 디메틸포름아미드(DMF) 2 mL에 용해시킨 후 아민(도 3B의 2, 55mg, 81μmol, 트리플루오로아세테이트 염)을 첨가한 다음, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, 50μL)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 피페리딘(40μL)을 첨가한 다음, 20 분간 추가 교반하였다. 혼합물을 HPLC로 정제하여 적색 고체로서 PNU-EDA-Gly5 (도 3B에서 3, 34mg, 44%)를 수득하였다; MS m/z 955.2 (M + H).
50mM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5에서 25℃ 3.5 시간 동안, 0.62μM 소르타제 A 존재 하에서 PNU-EDA-Gly5 [200μM]를 갖는 LPETG-태그된 mAbS [10μM]를 배양함으로써, PNU-EDA-Gly5를 mAbs에 접합하였다. 25mM 인산나트륨 pH 7.5로 평형화시킨 단백질 A HiTrap 컬럼(GE Healthcare)을 통과시켜서 반응을 정지시킨 후, 5 컬럼 부피 (CVs)의 완충액으로 세척하였다. 결합된 접합체를, 5 CVs의 용출 완충액(0.1M 숙신산, pH 2.8)으로 용출시키고, 1 CV 분획을 25% v/v 1M Tris 염기를 함유하는 튜브에 수집하여 산을 중화시켰다. 딘백질 함유 분획을 모아, 제조사의 설명서에 따라 NAP 25 (GE Healthcare) 컬럼을 이용하는 G25 컬럼 크로마토그래피에 의해 10 mM 숙신산 나트륨 pH 5.0, 100mg/mL 트레할로오스, 0.1 %w/v 폴리솔베이트 또는 포스페이트 20에서 제형화하였다.
각 접합체의 응집물 함량은, 10% IPA, 0.2M 인산 칼륨, 0.25M 염화칼륨, pH 6.95에서 0.5mL/분으로 작동하는 TOSOH TSKgel G3000SWXL 7.8mm x 30cm, 5μm 컬럼 상에서 크로마토그래피로 평가하였다. 약물 로딩은 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 및 역상 크로마토그래피에 의해 평가하였다. HIC는, A-1.5M (NH4)2SO4, 25mM NaPi, pH = 6.95±0.05 및 B-75% 25mM NaPi, pH = 6.95±0.05, 25% IPA 사이에 12분 선형 구배로, 0.8mL/분으로 작동하는 TOSOH Butyl-NPR 4.6mm x 3.5cm, 2.5μm 컬럼 상에서 수행하였다. 역상 크로마토그래피는, 0.05% TFA/H2O와 0.04% TFA/CH3CN 사이에서 25 분의 선형 구배로 1mL/min/80℃로 Polymer Labs PLRP 2.1mm x 5cm, 5μm 컬럼 상에서 수행하였다. 우선 샘플을 pH 8.0, 37℃에서 15분 동안 DTT로 배양하여 감소시켰다. 두 PNU-EDA-Gly5 기반 ADC들은 우세하게 단량체이며, 각각 4라는 이론적 최대값에 가까운 약물-대-항체 비를 가졌다. 표 2는 ADC 제조 결과를 요약 한 것이다.
제조된 PNU-EDA-Gly5 계열 ADC의 요약. HC, 중쇄; LC, 경쇄; % 모노, % 모노머 함량; DAR, 약물 대 항체 비
mAb 타겟 HC 태그 LC 태그 % 모노 DAR
브렌투시맙 CD30 Yes Yes 99.6 4.0
트라스투주맙 HER-2 Yes Yes 98.2 3.9
실시예 2; 소르타제 A-접합 브렌투시맙-PNU-EDA-Gly5 및 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5 ADC를 이용한 시험관내 세포 독성 분석
브렌투시맙-PNU-EDA-Gly5의 세포 독성을, 높은 수준의 CD30을 발현하는 비-호지킨 림프종 세포주인 Karpas-299와 CD30의 낮거나 중간 정도의 수준의 CD30을 발현하는 호지킨 림프종 세포주인 L428을 사용하여 조사하였다(도 4). 대조군으로서, cAc10-PNU-EDA-Gly5의 효능을 상업적으로 입수가능한 CD30-특이적 cAc10-vcPAB-MMAE 접합체 Adcetris® (양성 대조군) 및 상업적으로 입수가능한 HER-2 특이적 트랜스투주맙-DM1 접합체 Kadcyla® (음성 대조군)의 것과 비교하였다. 이를 위해, 세포를 웰 당 104 세포의 밀도로 100μl RPMI/10% FCS 내의 96-웰 플레이트에 도말하고, 5% CO2 대기에서 가습된 배양기에서 37℃로 성장시켰다. 배양 1일 후, 배지 25㎕를 조심스럽게 각각의 웰에서 제거하고, 성장 배지에서 각 ADC의 3.5 배 연속 희석액 25 ㎕로 대체하여, 최종 ADC 농도를 20㎍/ml 내지 0.25ng/ml 범위로 하였다. 각 희석은 두 번에 걸쳐 행해졌다. 추가 4 일 후, 배양기에서 플레이트를 제거하고 실온으로 평형시켰다. 약 30분 후, 100㎕의 CellTiter-Glo® 발광 용액 (Promega, Cat.No G7570)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450rpm에서 5 분간 교반한 다음 교반없이 10 분간 배양한 후, 웰 당 1 초의 통합 시간으로 Tecan Infinity F200에서 발광을 측정하였다.
예상대로, 양성 대조군으로 사용된 항-CD30 ADC Adcetris®는 8.2ng/ml의 EC50으로 CD30HI Karpas-299 세포를 강력하게 사멸하나(도 4A), CD30LO L428 세포를 죽일 때 비효율적이었다(도 4B). 대조적으로, 음성 대조군으로 사용된 항-HER-2 ADC Kadcyla®는 특이적 세포 사멸성을 보이지 않았으며 두 세포주 모두에서 효과가 없었다(도 4). 특히, 소르타제-접합된 ADC cAc10-PNU-EDA-Gly5는 6.9ng/ml의 EC50 값으로 CD30HI Karpas-299 세포를 강력하게 사멸시켰다(도 4A). cAc10-PNU-EDA-Gly5는 사용된 대조군 ADC와 유사하게 높은 농도에서만 CD30LO L428 세포를 사멸시켰으며, 이 ADC의 효능이 실제로 특이적이며 CD30 의해 매개된다(도 4B). 따라서, PNU-EDA-Gly5의 소르타제-매개 접합은 매우 높은 효능을 갖는 ADC를 생산하였으며, 심지어 참조 ADC Adcetris®를 능가하였다.
SMAC를 생성하는 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5 ADC의 종양 세포 사멸 능력을, HER-2를 과발현하는 인간 유방암 세포주인 SKBR3 세포 및 저 수준의 HER-2를 자연적으로 발현하는 유방암 세포주인 T47D 세포를 이용하여 조사하고, 이를 상업적으로 입수가한 HER-2 특이적 ADC 트라스투주맙-DM1 접합체 Kadcyla® (도 5)와 비교하였다. 이를 위해, 세포를 웰 당 104 세포의 밀도로 100㎕ DMEM/10% FCS에서 96 웰 플레이트 상에 도말하고, 분석을 상술한 바와 같이 정확하게 수행하였다.
예상대로, 양성 대조군 ADC Kadcyla®는, 23.7ng/ml의 EC50으로, HER-2 과발현하는 인간 SKBR3 유방암 세포를 강력하게 사멸한 반면에(도 5A), HER-2LO T47D 세포를 사멸하는데 비효율적이다(도 5B). 유의하게, SMAC 기술에 의해 생성된 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5는 우수한 세포독성을 나타내었고, HER-2 과발현하는 SKBR3 세포뿐만 아니라 HER-2LO T47D 세포를 사멸하며, EC50 값이 각각 4.8 및 11.0ng/ml이었다(도 5). 따라서 트라스투주맙에 대한 PNU-EDA-Gly5의 소르타제 매개 접합은 매우 높은 효능을 갖는 ADC를 생산하며, 상업적으로 입수가능하고 FDA-승인한 참조 ADC Kadcyla®의 효능을 능가하며, HER2LO 인간 유방암 세포에도 효과적이다.
실시예 3: 트라스트주맙 엠탄신(Kadcyla®)을 함유하는 말레이미드 링커와 비교한 소르타제 A-접합된 cAc10-PNU-EDA-Gly 5 ADC의 시험관내 혈청 안정성
브렌투시맙-PNU-EDA-Gly5 (cAc10-PNU-EDA-Gly5) 및 Kadcyla ADC의 시험관내 혈청 안정성을 ELISA-기반 혈청 안정성 분석으로 평가하였다. 간단히 하면, cAc10-PNU-EDA-Gly5를 마우스(Sigma, M5905), 래트(Sigma, R9759), 및 인간 혈청(Sigma, H6 914)에서 희석하고, 37℃에서 배양하였다. 시료를 0일, 3일, 7일, 14일에 액체 질소에서 급속 동결시키고, ELISA 분석까지 -80℃에서 보관했다. 설치류 혈청에 대해, 희석 계열의 cAc10-PNU-EDA-Gly5 혈청 샘플을 2㎍/ml 마우스 항-PNU mAb(인간 IgG-PNU 접합체로 마우스를 면역시키고 BSA-PNU 접합체로 스크리닝하여 내부에서 생산됨)으로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획시켜 ADC에 결합하거나, 항-인간 Fc F(ab')2 (Jackson Immunoresearch)으로 코팅된 경우에는 전 IgG와 결합시키고, HRP-접합된 항-인간 IgG F(ab')2(Jackson Immunoresearch)의 1:2500 희석율로 탐지하였다. 영장류 혈청에 대해, 2μg/ml의 재조합 인간 CD30(Sino Biologicals, 10777-H08H)을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 1:2500 희석율의 HRP-접합된 항-인간 IgG F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 또는 1μg/ml 마우스 항-PNU IgG (사내에서 생산됨), 이어서 HRP-결합된 항-마우스 Fc F(ab')2 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 총 IgG 및 ADC를 각각 검출하였다. Kadcyla의 경우, 동일한 프로토콜을 상기에서와같이 이용하여 마우스, 쥐, 및 인간 혈청에서의 안정성을 결정하였으나, 사내 생산된 항-메이탄신 mAb로 ADC에 결합하였다. ADC와 총 IgG의 혈청 농도는 알려진 농도의 동일한 ADC의 샘플과 비교하여 샘플 적정의 최대 값의 절반으로부터 계산하였다.
도 7A는 특히 Kadcyla를 함유하는 말레이미드 링커의 안정성(도 7B)과 비교하여, cAc10-PNU-EDA-Gly5 ADC의 우수한 안정성을 보여 주는데, 테스트 한 4종의 모든 혈청에서 전체 실험에 걸쳐 ADC 레벨이 사실상 감소하지 않았다. 0일과 14일 사이의 시간 지점을 최종 농도 0에 도달하도록 제한된 일-상(one-phase) 지수적 감소 함수에 맞추어서, cAc10-PNU-EDA-Gly5 및 Kadcyla의 반감기 값을 각 혈청에서 측정하였다. Kadcyla의 반감기는 마우스, 래트, 및 인간 혈청에서 각각 3.7 일, 4.4 일 및 2.9 일인 반면에, cAc10-PNU-EDA-Gly5의 반감기는 마우스, 래트, 및 인간 혈청에서 14일보다 더 길었다.
실시예 4: 마우스에서 소르타제 A-접합된 Ac10-Gly5-PNU의 생체내 안정성
Ac10-Gly5-PNU ADC를 실온에서 해동시키고 1mg/kg의 투여 농도를 위하여 멸균 PBS 에서 0.2mg/ml로 희석시켰다. 샘플을 9마리의 암컷 Swiss Webster 마우스에서 5mL/kg의 용량으로 i.v. 투여하였다. 1시간, 24시간, 72시간, 7일, 14일, 21일 후에 혈액을 채취하였다. 윤리적인 기준에 따라 개별 동물은 적어도 1주일 간격으로 2회 혈액 채취 시점에서만 사용하였다. 따라서, 그룹당 총 9마리의 마우스에서, 3 마리의 마우스는 1시간 및 7일 후에 혈액을 채취하였고, 3마리의 다른 마우스는 24 시간 및 14일 후에 혈액을 채취하였고, 3마리의 또 다른 마우스는 72시간 후 및 21 일 후 혈액을 채취하였다. 각 그룹의 동물에 대해, 첫 번째 채취 중에는 턱밑 정맥의 란셋 구멍에 의해 약 200μL의 혈액을 채취하였고, 최종 채취 (말단 출혈) 중에는 턱밑 정맥의 란셋 구멍에 의해 약 600μL의 혈액을 채취하였다. 총 혈액을 K2-EDTA를 함유하는 튜브에다 수집하였다. 혈장을 1500g에서 10분간 원심분리하여 혈액으로부터 분리하고, 실시예 4에 기재된 바와 같은 ELISA에 의해 분석할 때까지 -80℃ 저장을 위해 멸균 냉동고에 옮겼다.
도 8의 데이터는 SMAC 기술로 생성된 ADC의 높은 안정성을 보여 준다. 실험의 전체 기간 동안, ADC의 농도는 총 IgG에 대해 측정된 것보다 단지 약간만 낮은데, 이는 약물과 항체 사이의 링커가 생체 내에서 안정하다는 것을 의미한다. 3일과 21일 사이의 시간 지점을 최종 농도 0이 되도록 제한된 일-상(one-phase) 지수적 감소 함수에 맞춤으로써, 느린 상에서 생체내 반감기를 각각 총 IgG 및 ADC에 대해 8.3 및 7.8일로 결정하였다.
실시예 5: HER-2를 발현하는 EMT-6 클론의 기술 및 특성화
인간 HER-2를 과발현하도록 조작된 쥐 유방 종양 세포주 EMT-6을 사용하여 항 HER-2 ADC의 세포 독성을 조사하였다. EMT-6 세포를, 10%(v/v)의 FCS(태아 송아지 혈청), 1%(v/v)의 10,000 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 1%(v/v)의 200mM L- 글루타민으로 보충한, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium - 고포도당)에서, 단층으로 배양하였다.
EMT-6 세포를 인간 HER-2 유전자를 코딩하는 발현 벡터 및 퓨로마이신 내성 마커로 전기천공하고, 인간 HER-2를 안정하게 발현하는 세포풀을 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 선별하였다.
HER-2 발현은 유세포분석에 의해 확인하였다. 간단히, 트립신화 이후, 106 세포를 FACS 튜브에서 원심분리하였다; 수득된 펠렛을 2% FCS가 보충된 PBS(인산 완충 식염수)에 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 항-HER-2 항체 트라스투주맙(30 분, 4℃)과 함께 배양한 후, 원심 분리 및 세척(2% FCS가 첨가된 PBS 3mL)하였다. 이어서, 세포를 이전처럼 재현탁하고, 어두움(30 분, 4℃)에서 항-인간 IgG 항체(Fc 감마-특이적) PE (Ebioscience)과 함께 배양한 후, 세척(2% FCS가 포함 된 4 mL PBS)하였다. 이어서 유동세포 분석을 FACS Calibur (BD)에서 수행하였다.
HER-2로 형질 감염된 EMT-6 세포를 FACS ARIA II를 이용하는 유세포 분석에 의해 단일 세포 분류하여 단일 세포 클론을 단리하였다. 이것들을 증폭하였고 HER-2 발현을 유세포 분석에 의하여 확인하였다.
도 9는 생체내 연구로 선택된 클론의 FACS 분석 데이터를 보여준다 (실시예 6).
실시예 6: 동소 유방암 모델에서의 소르타제 A- 접합된 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly 5 ADC의 생체내 효능
트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5의 생체내 효능을 HER-2 양성 유방암의 면역적격성 동소 마우스 모델에서 평가하였다. 이를 위해, 이전에 생체내 성장에 적합한 것으로 판명된 인간 HER-2를 발현하는 106 개의 EMT6 마우스 유방암 세포(실시예 6)를 암컷 Balb/c 마우스의 우측 유방 지방 패드에 이식하였다. 또한, 대조군 동물에게 HER-2 음성 EMT6 세포를 이식하였다. 다음에서는, 1차 종양 부피를 캘리퍼링으로 측정했다. 평균 종양 체적이 100-150mm3에 도달 한 13일 후, 종양 보유 동물을 종양 크기에 따라 각각 6마리씩 무작위로 그룹화하였다. 같은 날(13일, 즉 무작위 배정 당일) 및 7일 후(20일)에, 동물들에 참조 ADC Kadcyla®(15mg/kg), 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5 (1mg/kg) 또는 비이클 대조군을 정맥 주사하였다. 종양 크기를 캘리퍼링으로 모니터링하고 종양 체적이 1000-1500m3에 이를 때 동물을 종결시켰다(도 10).
비이클 대조군 마우스의 종양은 빠르게 성장하여 세포 이식 30일 이내에 약 1000mm3의 평균 크기에 이르렀다(도 10A). Kadcyla® 치료는 대부분의 동물에서 종양 성장에 거의 영향을 미치지 않았다. 6마리 중 1마리만이 종양 성장에 상당한 지연을 보였다(도 10C). 대조적으로, 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5로 치료한 모든 동물에서, 종양은 치료 동안에 지속적으로 퇴행하였으며, 세포 이식 후 30일까지 본질적으로 감지할 수 없었다(도 10D). 종양은 60일까지 대부분의 동물에서 검출되지 않았고, 종양의 재발은 40 일경에 한 마리의 동물에서만 관찰되었다. 유의하게, 트라스투주맙-PNU-EDA-Gly5의 항종양 활성은 매우 특이적이었고, HER-2 음성 종양을 갖는 마우스의 치료는 종양 퇴행을 초래하지 않았다(도 10B). 종합적으로 살펴보면, 데이터는 소르타제-매개 부위-특이적으로 접합되는 트라스투주맙-EDA-Gly5-PNU ADC는 벤치 마크 ADC Kadcyla®보다 훨씬 우수한 생체내 종양 세포 사멸 활성을 갖는 ADC를 생산했다는 것을 보여준다.
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145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Leu Pro Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly 450 455 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Trastuzumab-LC-GGGGS-LPETGGGGG-PNU-toxin <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Gly 225 <210> 3 <211> 456 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Brentuximab-HC-LPETGGGGG-PNU-toxin <400> 3 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Leu 210 215 220 Pro Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly 225 230

Claims (26)

  1. 다음의 화학식 (i) 또는 (ii)를 갖는 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체인 안트라사이클린(PNU) 유도체 접합체로서,
    Figure 112023036037200-pct00033
    Figure 112023036037200-pct00034

    화학식 (i) 화학식 (ii)
    상기 접합체는, 물결선에서, 링커 구조 L1-L2 (L1 내지 L2 는 링커를 나타내고, L1 내지 L2 는 필수적임)를 포함하며,
    여기서, 상기 링커 L2는, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)가 자유 아미노 말단을 갖는 방식으로, 링커 L1에 의하여 상기 안트라사이클린 유도체에 결합되는 올리고-글리신 펩티드(Glyn)이며, 여기서 n은 1 이상이며 21 이하의 정수이다,
    여기서 상기 올리고-글리신 펩티드(Glyn)은 다음 (a) 또는 (b)의 안트라사이클린 유도체에 접합된다.
    (a) L1으로 지정된, 알킬렌디아미노 링커(-NH-(CH2)m-NH-)에 의한 화학식(i), 여기서 제1아미드 결합에 의하여 알킬렌디아미노 링커는 상기 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬디아미노 링커는 제2 아미드 결합에 의하여 상기 올리고-글리신 펩티드의 카르복시 말단에 접합한다.
    (b) L1으로 지정된, 알킬렌아미노 링커(-(CH2)m-NH-)에 의한 화학식(ii), 여기서 아미드 결합에 의하여 알킬렌아미노 링커는 상기 안트라사이클린 유도체의 카르복시 말단에 접합되며,
    여기서, m은 1 이상이며 11이하의 정수이다.
  2. 다음 화학식을 갖는, 결합 단백질-약물 접합체(BPDC):
    Figure 112023036037200-pct00035

    화학식 (iii)
    또는
    Figure 112023036037200-pct00036

    화학식 (iv)
    이때,
    * L1 내지 L3는 링커를 나타내고,
    * Y는 링커를 나타내며,
    * BP는 결합단백질이고, 여기서 상기 결합단백질은 항체이고,
    * n은 1 이상이며 10 이하인 정수이며,
    여기서, 상기 링커 L2는, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)가 자유 아미노 말단을 갖는 방식으로, 링커 L1에 의하여 상기 안트라사이클린 유도체에 결합되는 올리고-글리신 펩티드(Glyn)이며, 여기서 n은 1 이상이며 21이하의 정수이다,
    여기서 상기 올리고-글리신 펩티드(Glyn)은 다음 (a) 또는 (b)의 안트라사이클린 유도체에 접합된다.
    (a) L1으로 지정된, 알킬렌디아미노 링커(-NH-(CH2)m-NH-)에 의한 화학식(i), 여기서 제1아미드 결합에 의하여 알킬렌디아미노 링커는 상기 안트라사이클린 유도체에 접합되며, 상기 알킬디아미노 링커는 제2 아미드 결합에 의하여 상기 올리고-글리신 펩티드의 카르복시 말단에 접합한다.
    (b) L1으로 지정된, 알킬렌아미노 링커(-(CH2)m-NH-)에 의한 화학식(ii), 여기서 아미드 결합에 의하여 알킬렌아미노 링커는 상기 안트라사이클린 유도체의 카르복시 말단에 접합되며,
    여기서, m은 1 이상이며 11이하의 정수이고,
    여기서, 상기 링커 L3는 LPXTG, LPXSG 및 LAXTG로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펜타펩티드이고, 여기서 X는 20개의 자연발생 아미노산 중 어느 하나이며,
    여기서, 상기 링커 Y는 1 내지 21개 아미노산의 사슬 또는 아미노산 서열 GGGGS를 포함하는 아미노산의 사슬이다.
  3. 제2항에 있어서, 제1항에 따른 상기 안트라사이클린(PNU) 유도체가 상기 링커 -L1-L2-L3-Y-에 의해 상기 결합단백질의 카르복시 말단에 접합되는, 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 다음으로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 개체에 결합하는, 결합단백질-약물 접합체(BPDC):
    - 수용체
    - 항원
    - 성장 인자,
    - 사이토카인 또는
    - 호르몬.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항체는 2 개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  6. 제5항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄 중 적어도 하나는 제1항에 따른 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체를 포함하는, 결합단백질-약물 접합체 (BPDC).
  7. 제2항에 있어서, 상기 항체는 HER-2에 결합하는 항체인, 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는:
    a) 트라스투주맙의 CDR 영역 1 내지 6을 포함하고,
    b) 트라스투주맙의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
    c) a) 또는 b)의 영역 또는 도메인과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며,
    d) 트라스투주맙, 또는 이의 타겟 결합 단편 또는 유도체이며, 및/또는
    e) Her-2에 결합하는 것에 대해 트라스투주맙과 경쟁하는 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  9. 제2항에 있어서, 상기 항체는 CD30에 결합하는 항체인, 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는:
    a) 브렌투시맙의 CDR 영역 1 내지 6을 포함하고,
    b) 브렌투시맙의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
    c) a) 또는 b)의 영역 또는 도메인과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며,
    d) 브렌투시맙 또는 이의 타겟 결합 단편 또는 유도체이며, 및/또는
    e) CD30에 결합하는 것에 대해 브렌투시맙과 경쟁하는 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  11. LPXTG, LPXSG 및 LAXTG로 이루어진 군에서 선택되는 소르타제 효소 인식 모티프를 포함하는 결합단백질이, 소르타제 효소에 의해, L2로서, 올리고-글리신 펩티드(Glyn)를 포함하는, 제1항에 따른 안트라사이클린 유도체 접합체에 접합하는, 제2항에 따른 결합단백질-약물 접합체(BPDC)를 제조하는 방법.
  12. 종양 질환의 치료를 위한, 제2항에 따른 또는 제11항의 방법으로 제조되는, 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  13. 제12항에 있어서,
    상기 종양 질환은,
    - IHC 또는 ISH에 의해 결정되는, 1+, 2+ 또는 3+의 HER-2 발현 점수를 갖는 암,
    - IHC, ELISA 또는 유동세포 분석에 의하여 결정되는, CD30 양성인 암으로서, 바람직하게는 림프종인 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  14. 제13항에 있어서,
    상기 림프종은,
    호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL) 또는 전신성 역형성대세포림프종(systemic anaplastic large cell lymphoma, sALCL)인 결합단백질-약물 접합체(BPDC).
  15. 제2항에 따른 또는 제11항의 방법으로 제조된 결합단백질 약물 접합체(BPDC), 및 적어도 하나의 다른 약학적으로 허용가능한 성분을 포함하며 종양 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
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