KR102552694B1

KR102552694B1 - Method for producing bone-inducing double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin

Info

Publication number: KR102552694B1
Application number: KR1020190032457A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 호반하이; 앤드류파달힌; 르티탄타오
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2023-07-05
Also published as: KR20200112256A

Abstract

본 발명은 용매에 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL) 또는 젤라틴(Gelatin, Gel)을 투입하여 PCL 수용액 및 Gel 수용액을 각각 제조하는 단계, 상기 PCL 수용액과 상기 Gel 수용액을 혼합하고, β-TCP을 혼합하여 전기방사용 용액을 제조하는 단계, 상기 전기방사용 용액을 전기방사기에 투입하고 방사하여 전기방사 막을 제조하는 단계 및 상기 전기방사 막을 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 이용하여 코팅하는 단계를 포함하는 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법을 제공한다.In the present invention, polycaprolactone (PCL) or gelatin (Gelatin, Gel) is added to the solvent to prepare a PCL aqueous solution and a Gel aqueous solution, respectively, mixing the PCL aqueous solution and the Gel aqueous solution, and mixing β-TCP preparing an electrospinning solution, introducing the electrospinning solution into an electrospinner and spinning to prepare an electrospun film, and coating the electrospinning film using an aqueous sodium alginate/gelatin solution. A method for producing a bone-inducing double-layer membrane comprising lactone and gelatin is provided.

Description

폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법{Method for producing bone-inducing double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin}Method for producing bone-inducing double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin {Method for producing bone-inducing double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin}

본 발명은 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing an osteoinductive double-layer membrane comprising polycaprolactone and gelatin.

최근 수십년 동안, 치과에서는 골 결손 부위를 복구하는 임플란트 재료로 우수한 성능을 나타내는 유도골 재생(GBR) 막 개념을 사용하는 것이 일반적으로 인식되어 왔다. 유도골 재생(GBR) 과정에서, 장벽 막의 역할은 골 재생을 위한 공간을 만들고 골 이식 재료를 그룹화하여 골 이식 재료의 확산을 방지하는 것이다. 또한, 연조직이 뼈 결함으로 인한 공간으로 이동하는 것을 방지하고, 뼈 조직의 재생 중에 결함 공간을 유지하는 것이다.
유도골 재생 막이 뼈 재생에 최고의 성능을 발휘하기 위해서는 막의 생체 적합성, 공간 유지를 위한 장벽 특성, 상피세포 이동방지 특성 및 뼈 재생의 리모델링 후 적절한 재흡수 시간을 가져야 한다.
알긴산나트륨(SA)은 1,4-연결된 β-D-만누론산(M-블록) 및 α-L-굴루론산(G-블록)으로 구성된 선형의 비분지 다당류로서 "계란-박스"-칼슘 연결된 접합부를 형성하는 양이온과 카르복실 작용기 사이의 이온 상호작용으로 인해 칼슘과 같은 2가 양이온의 존재 하에 안정한 겔을 형성한다. 알기네이트 겔은 생체 적합성, 분해성 및 비독성을 갖는 것으로 알려져 있다. 많은 그룹의 연구자들이 피부조직 피복을 위해 알기네이트 겔을 사용하고 있는 것으로 조사되었으며, 알기네이트 겔은 상처부위 피복 및 장벽 능력에 우수한 장점이 있지만 여전히 생체분자의 교환을 허용하는 문제점이 있다. 우수한 장벽 능력 특성으로 인해, 몇몇 연구 그룹은 알기네이트 막이 유도골 재생 막으로서 적용될 수 있다는 것을 확인하였다.
젤라틴(gelatin, Gel)은 소, 닭, 돼지 및 물고기와 같은 동물의 피부, 뼈 및 연결 조직에서 추출한 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 생성된 펩티드와 단백질의 혼합물이다. 가수분해 동안, 각각의 콜라겐 가닥들(strands) 사이의 자연 분자결합은 보다 쉽게 재배열되는 형태로 분해된다. 콜라겐의 우수한 생체 적합성 및 생분해성은 FDA 인증서에 의해 보고되었고, 승인되었으며, 젤라틴의 생성 비용은 동일한 출처로부터 콜라겐보다 생산하는 비용보다 훨씬 저렴합니다.
폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)은 전기방사 재료에 사용되는 가장 보편적인 합성 중합체이며, PCL의 생체적합성 및 낮은 생분해성은 종래 문헌에서도 보고되어 있다.
본 발명에서는 PCL/Gel의 전기방사 용액 혼합물에 젤라틴 함량을 증가시킴으로써, 막의 생분해 속도를 향상시키고, 골 조직의 골생성을 촉진하거나, 골 생성을 유도하기 위한 마이크로-섬유 내부에 로딩된 인자를 빠르게 방출할 수 있다는 것을 확인하였다.In recent decades, it has been generally recognized that dentistry uses the concept of guided bone regeneration (GBR) membranes, which exhibit excellent performance as an implant material for repairing bone defects. In the process of guided bone regeneration (GBR), the role of the barrier membrane is to create a space for bone regeneration and group the bone graft materials to prevent the spread of the bone graft materials. Also, it is to prevent the soft tissue from moving into the space due to the bone defect and to maintain the defect space during bone tissue regeneration.
In order for the induction bone regeneration membrane to exert its best performance in bone regeneration, the biocompatibility of the membrane, barrier properties for maintaining space, anti-epithelial cell migration characteristics, and proper resorption time after remodeling of bone regeneration are required.
Sodium alginate (SA) is a linear, unbranched polysaccharide composed of 1,4-linked β-D-mannuronic acid (M-block) and α-L-guluronic acid (G-block), "egg-box"-calcium linked Formation of stable gels in the presence of divalent cations such as calcium due to ionic interactions between the carboxyl functional groups and the cations forming the junction. Alginate gels are known to be biocompatible, degradable and non-toxic. It has been investigated that many groups of researchers are using alginate gels for skin tissue coating, and alginate gels have excellent advantages in wound coverage and barrier ability, but still have a problem of allowing exchange of biomolecules. Due to its excellent barrier capacity properties, several research groups have confirmed that alginate membranes can be applied as induced bone regeneration membranes.
Gelatin (Gel) is a mixture of peptides and proteins produced by partial hydrolysis of collagen extracted from skin, bone and connective tissue of animals such as cows, chickens, pigs and fish. During hydrolysis, the natural molecular bonds between individual collagen strands break down into a more easily rearranged form. Collagen's excellent biocompatibility and biodegradability have been reported and approved by FDA certificates, and the cost of producing gelatin is much lower than that of producing collagen from the same source.
Polycaprolactone (PCL) is the most common synthetic polymer used in electrospinning materials, and the biocompatibility and low biodegradability of PCL have been reported in prior literature.
In the present invention, by increasing the gelatin content in the PCL/Gel electrospinning solution mixture, the biodegradation rate of the membrane is improved, the osteogenesis of bone tissue is promoted, or the factor loaded into the micro-fibers for inducing osteogenesis is rapidly released. It was confirmed that it could be released.

Masoumeh Ezat et al “Development of a PCL/gelatin/chitosan/β-TCP electrospun composite for guided bone regeneration.” Progress in Biomaterials (2018), Vol 7, pp 225-237Masoumeh Ezat et al “Development of a PCL/gelatin/chitosan/β-TCP electrospun composite for guided bone regeneration.” Progress in Biomaterials (2018), Vol 7, pp 225-237

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 기계적 강도가 우수하고, 연조직의 이동을 방지하며, 골 형성을 촉진할 수 있는 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법을 제공하는 것이다. An object to be solved by the present invention is to provide a method for preparing an osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, which has excellent mechanical strength, prevents soft tissue movement, and promotes bone formation.

본 발명의 일 실시예에 따른 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법은 용매에 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL) 또는 젤라틴(Gelatin, Gel)을 투입하여 PCL 수용액 및 Gel 수용액을 각각 제조하는 단계, 상기 PCL 수용액과 상기 Gel 수용액을 혼합하고, β-TCP을 혼합하여 전기방사용 용액을 제조하는 단계, 상기 전기방사용 용액을 전기방사기에 투입하고 방사하여 전기방사 막을 제조하는 단계 및 상기 전기방사 막을 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 이용하여 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 용매는, 포름산과 아세트산을 1:9 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함할 수 있다.
상기 PCL 수용액을 제조하는 단계는, 상기 용매에 PCL을 투입하고, 20~30 ℃의 온도에서 3~4 시간 동안 교반하여 제조할 수 있다.
상기 Gel 수용액을 제조하는 단계는, 상기 용매에 Gel을 투입하고, 55~65 ℃의 온도에서 3~4 시간 동안 교반하여 제조할 수 있다.
상기 Gel 수용액 및 PCL 수용액의 농도는 15%(w/v)일 수 있다.
상기 전기방사용 용액을 제조하는 단계는, 상기 PCL 수용액과 Gel 수용액을 혼합하고, β-TCP 분말을 투입하여 2~4시간 동안 혼합할 수 있다.
상기 알긴산나트륨/젤라틴 수용액은, 증류수에 알긴산 나트륨과 젤라틴 분말을 각각 투입하고 용해시켜 알긴산 나트륨 수용액과 젤라틴 수용액을 제조하는 과정과, 상기 알긴산 나트륨 수용액과 젤라틴 수용액을 1:0.1~3 중량비로 혼합하여 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 제조하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 전기방사 막을 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 이용하여 코팅하는 단계 후, 염화칼슘(CaCl₂)을 이용하여 알긴산나트륨/젤라틴 코팅층을 10~20 분 동안 가교시키고 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 상기한 방법으로 제조된 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막을 제공한다.
상기 이중층 막은 인장강도가 1~3일 수 있다.
상기 이중층 막은 다공성일 수 있다.
상기 이중층 막은 스캐폴드일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the method for producing a osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin is to inject polycaprolactone (PCL) or gelatin (Gelatin, Gel) into a solvent to obtain an aqueous solution of PCL and an aqueous solution of Gel, respectively. preparing, preparing an electrospinning solution by mixing the PCL aqueous solution and the Gel aqueous solution and mixing β-TCP, preparing an electrospinning film by inserting the electrospinning solution into an electrospinning machine and spinning; and and coating the electrospun film using an aqueous solution of sodium alginate/gelatin.
The solvent may include polycaprolactone and gelatin, characterized in that formic acid and acetic acid are mixed in a weight ratio of 1:9.
The step of preparing the PCL aqueous solution may be prepared by adding PCL to the solvent and stirring at a temperature of 20 to 30 ° C. for 3 to 4 hours.
In the step of preparing the aqueous Gel solution, the Gel may be added to the solvent and stirred at a temperature of 55 to 65 ° C. for 3 to 4 hours.
The concentration of the Gel aqueous solution and the PCL aqueous solution may be 15% (w/v).
In the step of preparing the electrospinning solution, the PCL aqueous solution and the Gel aqueous solution may be mixed, and β-TCP powder may be added and mixed for 2 to 4 hours.
The sodium alginate/gelatin aqueous solution is prepared by adding and dissolving sodium alginate and gelatin powder in distilled water to prepare a sodium alginate aqueous solution and gelatin aqueous solution, and mixing the sodium alginate aqueous solution and gelatin aqueous solution at a weight ratio of 1:0.1 to 3 It may include a process of preparing a sodium alginate/gelatin aqueous solution.
After coating the electrospun film using an aqueous sodium alginate/gelatin solution, a step of crosslinking and sterilizing the sodium alginate/gelatin coating layer using calcium chloride (CaCl ₂ ) for 10 to 20 minutes may be further included.
According to another embodiment, the present invention provides an osteoinductive bilayer membrane comprising polycaprolactone and gelatin prepared by the above method.
The double layer membrane may have a tensile strength of 1 to 3.
The bilayer membrane may be porous.
The bilayer membrane may be a scaffold.

본 발명은 기계적 강도가 우수하고, 연조직의 이동을 방지하며, 골 형성을 촉진할 수 있는 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법을 제공할 수 있다.The present invention can provide a method for manufacturing an osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, which has excellent mechanical strength, prevents soft tissue movement, and can promote bone formation.

도 1a는 전기방사 용액의 젤라틴 비율에 따른 섬유의 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 1b는 전기방사 용액의 젤라틴 비율에 따른 섬유의 직경변화를 나타낸 것이다.
도 2a는 PCL/Gel SEM과 PCL/Gel/TCP SEM를 비교한 이미지이고, 도 2b는 도 2a의 EDS 프로파일을 나타낸 것이며, 도 2c는 도2a의 접촉각 및 친수성을 비교한 것이고, 도 2d는 PCL/Gel/TCP 및 TCP 분말의 XRD 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 PBS 용액에서 전기방사 막의 팽윤비율을 나타낸 것이고, 도 3b는 전기방사 막에 접종된 MC3T3 및 L929 세포의 생존력을 분석한 것이다.
도 4는 2중층 막의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 5a는 각 샘플들의 인강강도 값을 나타낸 것이고, 도 5b는 습윤 조건에서 제1 층 및 제2 층의 물 접촉각을 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 이중충 막(out layer 및 inner layer) 표면상에서의 MC3T3-E1 및 L929 세포의 세포증식 효과를 비교한 것이다.
도 7은 이중층 막의 cross-section 이미지 및 외막 층에 부착된 세포의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 미처리 및 이중층 막 처리된 골 결손 부위의 마이크로-CT-재구성 이미지를 비교한 것이다.
도 9는 습윤 조건에서 이중층 막의 인장강도 시험 및 봉합능력 시험을 예시한 것이다.
도 10은 이중충 막(out layer 및 inner layer) 표면상에서의 MC3T3-E1 및 L929 세포의 세포증식 효과 시험을 예시한 것이다. Figure 1a shows the SEM image of the fiber according to the gelatin ratio of the electrospinning solution, Figure 1b shows the change in the diameter of the fiber according to the gelatin ratio of the electrospinning solution.
Figure 2a is an image comparing PCL/Gel SEM and PCL/Gel/TCP SEM, Figure 2b shows the EDS profile of Figure 2a, Figure 2c is a comparison of the contact angle and hydrophilicity of Figure 2a, Figure 2d is PCL It shows the XRD results of /Gel/TCP and TCP powder.
Figure 3a shows the swelling ratio of the electrospun membrane in the PBS solution, and Figure 3b shows the analysis of the viability of MC3T3 and L929 cells inoculated on the electrospun membrane.
4 shows an SEM image of the double layer film.
Figure 5a shows the tensile strength values of each sample, and Figure 5b shows the water contact angle of the first layer and the second layer in wet conditions.
6a and 6b compare the proliferative effects of MC3T3-E1 and L929 cells on the outer and inner layer surfaces.
7 shows cross-section images of bilayer membranes and SEM images of cells adhered to the outer membrane layer.
8 compares micro-CT-reconstructed images of untreated and double-layer membrane-treated bone defect sites.
Figure 9 illustrates the tensile strength test and sealability test of the double-layer membrane in wet conditions.
Figure 10 illustrates the proliferative effect test of MC3T3-E1 and L929 cells on the surface of the outer layer and inner layer.

전기방사를 위한 용매의 제조Preparation of solvents for electrospinning

PCL 및 젤라틴을 용해시키기 위한 용매는 포름산/아세트산의 혼합물(비율 1:9)이었고, 혼합물 산 모액을 자기 교반기로 실온에서 1시간 동안 잘 혼합 하였다. 병에 함유된 용매 혼합물은 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 조심스럽게 포장되었다.The solvent for dissolving PCL and gelatin was a mixture of formic acid/acetic acid (ratio 1:9), and the mixed acid mother liquor was mixed well at room temperature for 1 hour with a magnetic stirrer. The solvent mixture contained in the bottle was carefully wrapped in paraffin film to prevent evaporation.

전기방사 용액의 제조Preparation of electrospinning solution

용액이 균질해지고 PCL 과립이 남지 않을 때까지 실온에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 PCL 과립을 첨가함으로써 15 % w/v PCl 용액 20ml를 제조하였다. 용액이 완전히 용해될 때까지 60℃에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 Gel 분말을 첨가함으로써 15% w/v의 Gel 용액 20ml를 제조하였다.20 ml of 15% w/v PCl solution was prepared by adding 3 g of PCL granules to 20 ml of solvent while stirring for 3-4 hours with a magnetic stirrer at room temperature until the solution became homogeneous and no PCL granules remained. 20 ml of 15% w/v Gel solution was prepared by stirring for 3-4 hours with a magnetic stirrer at 60° C. until the solution was completely dissolved and adding 3 g of Gel powder to 20 ml of solvent.

15% w/v의 PCL과 15% w/v의 Gel을 자기 교반기로 3시간 동안 잘 혼합하고, 10%의 β-TCP 분말을 첨가한 후 3시간 동안 더 잘 교반하여 TCP 분말을 하기 표 1의 비율로 용액에 분산시켰다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.
(실험재료 및 실험방법)
1-1. 전기방사를 위한 용매의 제조
폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)과 젤라틴(Gelatin, Gel)을 용해시키기 위한 용매로 포름산/아세트산의 혼합물(비율 1:9)을 사용하였다.
상기 포름산/아세트산의 혼합물을 1:9로 혼합한 후 마그네틱 교반기를 이용하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매의 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 포장하였다.
1-2. 전기방사 용액의 제조
먼저, 20ml의 포름산/아세트산 혼합 용매에 과립의 PCL 3g을 투입하고 PCL 과립이 완전히 용해될 때까지 실온(25℃)의 온도에서 마그네틱 교반기를 이용하여 3~4 시간 동안 교반하여 15 % w/v PCl 용액 20ml를 제조하였다.
다음으로, 20ml의 포름산/아세트산 혼합 용매에 분말의 Gel 3g을 투입하고 Gel 과립이 완전히 용해될 때까지 60℃의 온도에서 마그네틱 교반기를 이용하여 3~4 시간 동안 교반하여 15 % w/v Gel 용액 20ml를 제조하였다.
15% w/v의 PCL 용액에 15% w/v의 Gel 용액를 투입하고 마그네틱 교반기를 이용하여 3 시간 동안 혼합한 후 10%의 β-TCP 분말을 투입하여 3시간 동안 추가로 교반하여 혼합하였다.
하기의 표 1은 PCL, Gel 및 β-TCP의 성분비를 나타낸 것이다.
샘플 PCL 15% Gel 15% β-TCP 분말 P1G1 1 1 10% P1G2 1 2 10% P1G3 1 3 10% P1G4 1 4 10%
1-3. 전기방사 막의 제조
P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4 용액 샘플을 10ml 루어-락 주사기[직경 14mm, 23-G 바늘(내경 0.23mm) 및 펌프속도 4 ml/시간]에 로딩하여 전기방사 막을 제조하였다.
직경이 10cm이고, 길이가 25cm인 수집기 드럼을 사용하였으며, 수집기 드럼의 바늘 끝은 10cm였으며, 수집기 드럼의 회전 속도는 350 rpm이였다.
10ml의 용액을 전기방사하여 전기방사 막을 제조하고 이를 흄후드(fume hood)에서 1일 동안 건조시켜 남아있는 모든 산성 용매를 증발시켰다.
이때, 전기방사시 전압은 DC 고전압 전원 공급기(휴대형 NNC-30 kv-2 mA, 한국)를 이용하여 직접 공급하였다.
1-4. 전기방사 막의 특성
1-4-1. 전기방사 막의 형태 및 β-TCP 분말 함량 분석 방법
상기의 표 1에 따라 제조된 전기방사 막을 샘플 홀더에 장착하고 스퍼터 코팅기(Cressington Scientific Instruments, UK)를 이용하여 얇은 백금층을 코팅하였다. 샘플의 마이크로 섬유 형태는 주사전자 현미경(SEM, JSM6701F, JEOL, 일본)을 이용하여 분석하였다. SEM 스캐닝에서 칼슘 및 인산염 함량의 EDS 검출을 이용하여 TCP 분말 함량을 분석하였다. 섬유 직경은 "ImageJ" 소프트웨어 측정 툴을 이용하여 섬유 직경의 30 영역을 무작위로 측정하였다.
1-4-2. 인산염 완충 식염수 용액에서의 팽윤 거동 분석
건조된 전기방사 막 샘플을 1 x 1cm 크기로 절단하고 1 ml의 PBS 용액, 37℃의 인큐베이터에 침지시키고 일련의 기간(1,500분) 동안 샘플의 중량을 측정하였다.
1-4-3. MC3T3-E1 전조골세포 및 L929 섬유아세포의 세포 생존력 분석
샘플을 직경 1cm의 둥근 형태로 절단하고 24웰 플레이트에 넣은 후 70% 에탄올 및 UV 광으로 3시간 동안 멸균하였다. 그 후, 샘플을 인큐베이터에서 3시간 배양하는 동안 세포 배양배지에 침지시켜 컨디셔닝하였다. 컨디셔닝 후, 오래된 배지를 제거하고 세포 접종 전에 1시간 동안 900μL의 새로운 배지 및 37℃ 인큐베이터로 교체하였다.
전조골세포(MC3T3-E1)는 세포 배양 플레이트의 70-80% 공간에 도달할 때까지 깨끗한 플레이트에서 10% 소 태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 MEM 배양 배지에서 배양되었다. 그 후, 트립신에 의해 세포를 배양 플레이트로부터 분리한 후 배지로 재현탁하고, 100μL의 104 세포를 900μL의 배지에서 샘플에 접종하고 24시간 동안 37 ℃, 5% CO₂에서 배양하였다.
배양 플레이트의 70-80%에 도달할 때까지 섬유아세포(L929)를 깨끗한 플레이트에서 10% 말 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 EMEM 배양 배지에서 배양하였다. 다음 단계는 MC3T3 세포 접종방법과 동일한 방법을 거쳤다. 배양 24시간 후, MTT 시약(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라 졸륨 브로마이드; Sigma-Aldrich, USA)을 9:1 비율로 샘플을 갖는 각 웰에 첨가하였다. 이어서 배양액을 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 용액을 제거하고 디메틸설폭사이드(DMSO; 삼천순약 주식회사, 한국)를 각 웰에 첨가하여 포르마잔염을 용해시켰다. 생성된 용액(100L)을 96-웰 플레이트로 옮기고 Infinite F50 마이크로 플레이트 리더(Tecan, Austria)를 사용하여 흡광도(595 nm)를 측정하였다.
1-4-4. 캐스팅 용액의 제조
500ml의 증류수에 25g의 알긴산나트륨 분말을 첨가하고 실온에서 2,000 rpm으로 5 시간 동안 고속 교반하여 고점도의 5% w/v 알긴산나트륨(SA)의 수용액 500ml을 제조하고, 4℃의 온도에서 보관하였다.
60%로 가열된 자기 교반기에서 돼지 피부의 젤라틴 분말을 증류수에 용해시켜 5% w/v 젤라틴 용액(G)을 제조하였다.
1-4-5. 이중층 막의 제조
변형 및 특성화 후, 상기 표 1에서 P1G4 샘플의 전기방사 막이 생체 적합성 및 생분해성에 대한 최상의 후보로 선택되었다.
10x20cm 크기의 P1G4 막 시편을 150μm 깊이의 유리 몰드 바닥에 부착하였다. 5ml의 캐스팅 용액을 유리 몰드에 캐스팅한 후, 직선형 플라스틱 막대를 이용하여 평평한 표면을 형성시켰다.
캐스팅 후, 막 및 캐스팅 용액을 갖는 몰드를 5% CaCl₂ 용액 탱크에 15분 동안 침지시켰다. 침지 후, SA/Gel 캐스팅 층을 CaCl₂에서 칼슘 이온과 가교결합 및 겔화시키고, SA/Gel 층으로 캐스팅한 막을 분리하고 증류수로 조심스럽게 수회 세척하여 남아있는 모든 염화물염을 제거하였다.
하기의 표 2는 캐스팅층의 성분 함량비 및 제2층 성분을 나타낸 것이다.
샘플 SA(%) G(%) 전기방사 층 A100G0 100 0 P1G4 A75G25 75 25 P1G4 A50G50 50 50 P1G4 A25G75 25 75 P1G4
1-5. 이중층 막의 특성
1-5-1. 이중층 막의 봉합능력 시험
도 9는 습윤 조건에서 이중층 막의 인장강도 시험 및 봉합능력 시험을 예시한 것이다.
상기의 표 2의 이중층 막의 샘플을 5x25mm 시편으로 절단하기 전에 생물학적 식염수 용액에 5분 동안 침지시키고 의료 봉합사 번호 6으로 샘플의 2팁을 묶었으며, 로딩 셀의 속도는 1mm/분이었다. 봉합능력 측정을 위한 샘플 제조 및 설정은 도 9에서 확인할 수 있다.

1-5-2. 물 습윤 접촉각
물 접촉각 측정은 접촉각 측정 시스템(DSA 100, KRUSS GmbH)을 이용하여 분석하였다. 시스템의 바늘에서 물방울을 분사하여 이중층 막, 캐스팅층, 전기방사층 및 주조층 상에 적하였다. 적하 후 물방울의 형상을 CCD 비디오 카메라를 이용하여 기록하고 분석하여 접촉각을 결정하였다.
이중층 막의 상이한 2층에서 전조골세포 MC3T3-E1 및 섬유아세포 L929의 증식 특성화 후, A75G25 이중층 막의 샘플은 최고의 기계적 특성을 가지므로, 이 샘플은 시험관내 및 생체내 연구를 위해 선택되었다.
1-5-3. 이중층 막에서 전조골 세포(MC3T3-E1) 및 섬유아세포(L929) 증식
MC3T3 및 L929 세포를 배양하고 제조하였다. MC3T3 및 L929 세포를 배양하고 제조는 앞서 설명하였기에 이에 대한 설명은 생략한다.
샘플은 둥근 모양(10x10mm)으로 절단하고 배양 배지로 컨디셔닝하는 단계 전에 하루 동안 70% 에탄올 및 UV 광으로 멸균하였다. 멸균 후 샘플을 24웰 플레이트에 넣고 도식도(schematic diagram)를 따라 수행하였다(도 10).
세포의 증식은 MTT 분석 방법을 통해 1일, 3일 및 5일에 수집하고, SEM 이미지를 사용하여 5일째에 막 표면상에 부착된 세포의 세포형태를 분석하였다.
1-5-4. 토끼 요골 결함에 생체내 이식
체중 2-2.5kg의 뉴질랜드 흰토끼 18마리를 구매하여 18개의 상이한 스테인리스강 주거 시설에 가두고, 한국 충청남도 순천향대학교 동물관리센터가 제공한 지침에 따라 승인된 음식과 물을 적절히 공급하였다. 수술하는 날 전에 환경을 조정하기 위한 적응기간이 주어졌으며, 모든 토끼는 수술을 위해 이소플루어런스(Isoflourance) 가스로 마취하였다. 토끼 앞발의 모발을 완전히 면도하고 70% 에탄올 및 포비돈 요오드로 멸균시켰다. 내부에 요골을 갖는 팔뚝을 절개하고 조직과 근육 층에서 요골 영역을 분리한 후, 조직의 탈수를 방지하기 위해서 연속적인 식염수 세척과 함께 트레핀 드릴을 사용하여 요골의 중간 위치에서 길이 8mm의 골을 제거하여 결함을 발생시켰다. 이중층 막은 골 이식편(Frabone-H, Inobone Company, Korea)을 결함 부위에 충진하고 랩핑하였으며, 피하조직을 닫고 그 위에 피부를 다시 봉합하였다. 실험실에서 동물을 사육하고 자유롭게 먹이를 주었다. 이식 후 2 주째와 4 주째에 토끼를 희생시키고 척골(Ulna) 및 요골을 포함하는 전완골 전체를 수집하였다. 보존을 위해 조직 샘플은 4% 포름알데히드에 침지시켜 40 ℃의 온도에서 보관하였다.
1-5-5. 마이크로-컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 평가
이식된 스캐폴드의 마이크로-CT 이미지는 Skyscan Desktop 마이크로-CT 1172 (Arrrselaar, 벨기에)를 이용하여 촬영한 것이며, 167 μA 전류의 60kV 소스 전압을 이용하여 X-선 방사선 사진을 얻었다. NRecon Software를 이용하여 스캔을 재구성하고 CTAn 소프트웨어로 분석하였다.
(실험결과)
1. 다공성 전기방사 막의 특성 분석
1-1. 전기방사 막의 형태 및 직경 분석
도 1a는 전기방사 용액의 젤라틴 비율(P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4)에 따른 섬유의 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 1b는 전기방사 용액의 젤라틴 비율에 따른 섬유의 직경변화를 나타낸 것이다.
동일한 전기방사 조건에서 샘플(P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4)을 제조했지만 미세구조에는 차이가 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 모든 막 샘플의 섬유는 매끄럽고 균일한 형상을 나타내었으나, 젤라틴의 함량이 증가할수록 섬유의 직경은 감소하는 것을 확인할 수 있다.
1-2. PCL/Gel과 PCL/Gel/TCP 특성분석
도 2a는 PCL/Gel SEM과 PCL/Gel/TCP SEM를 비교한 이미지이고, 도 2b는 도 2a의 EDS 프로파일을 나타낸 것이며, 도 2c는 도2a의 접촉각 및 친수성을 비교한 것이고, 도 2d는 PCL/Gel/TCP 및 TCP 분말의 XRD 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2b를 참조하면, 전기 방사 섬유에 β-TCP 분말이 성공적으로 로딩된 것을 확인할 수 있다. 또한, 건조된 상태에서 전기방사된 샘플 P1G1의 물 접촉각 및 물방울의 형상은 측정 1초마다 기록되고, 전기방사된 표면 상에 떨어뜨린 후 6초 후에 물방울이 거의 사라지고 최종적으로 접촉각이 거의 0인 것을 확인할 수 있다. 이는 전기방사 막의 친수성이 우수하며 액체 흡수능이 우수함을 확인할 수 있는 결과이다. 더불어, 젤라틴 함량이 증가할수록 PCL을 함유하는 전기방사 막의 친수성을 향상시키는 것을 알 수 있다.
결과적으로, PCL 함량 높을수록 우수한 액체 흡수 능력을 보여주었으므로, P1G4 샘플이 가장 우수한 액체 흡수능력을 가질 것으로 예측하였다.
1-3. 전기방사 막의 팽윤 및 세포 생존력 분석
도 3a는 PBS 용액에서 전기방사 막의 팽윤비율을 나타낸 것이고, 도 3b는 전기방사 막에 접종된 MC3T3 및 L929 세포의 생존력을 분석한 것이다.
도 3a를 참조하면, 1일 침지 후 PBS 용액에서 전기방사 막의 팽윤 비율을 확인할 수 있다. 또한, P1G4 샘플은 최대 10% 초기 중량까지의 최고 팽창률을 나타냈고, P1G1 샘플이 중량을 감소시키기 시작하는 시점은 PCL 비율이 더 높은 다른 샘플보다 더 일찍 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 3b를 참조하면, 24 시간 후에 전기방사 막 샘플 상에 접종된 MC3T3 및 L929 세포의 생존력. 막에 접종된 세포의 80 % 이상이 생존 가능하였고, P1G1 대 P1G4의 세포 생존력 사이에 큰 차이가 없었다. 막 샘플에서 MC3T3의 생존력은 막 샘플 없이 배양된 세포 생존력과 거의 동일하였으며, 모든 막 샘플의 생체 적합성이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
또한, L929 세포 생존율에 있어서, 막이 없는 세포 생존율(100 %)과 비교하여 L929 세포의 감소가 기록되었지만, 샘플과 생존 가능한 80% 이상의 L929 세포 간에 큰 차이가 없었다. 이 결과에 의해 전기방사 막에서 젤라틴의 함량은 세포 생존력에 영향을 미치지 않으며 모든 막 샘플이 우수한 생체 적합성을 갖도록 함을 확인할 수 있다.
2. 이중층 막 분석
2-1. 2중층 막의 표면 형태, 접촉각 및 인장강도 분석
도 4는 2중층 막의 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 5a는 각 샘플들의 인장강도 값을 나타낸 것이고, 도 5b는 습윤 조건에서 제1 층 및 제2 층의 물 접촉각을 나타낸 것이고, 도 9는 습윤 조건에서 이중층 막의 인장강도 시험 및 봉합능력 시험을 예시한 것이다.
도 4 내지 도 5를 참조하면, 이중층 막의 상이한 2층의 SEM 형태와 습윤 조건에서 제1 층 및 제2 층의 액체 흡수능력을 확인할 수 있다. SEM 이미지는 상이한 형태를 갖는 막을 나타내었고, 제1 층은 조밀한 구조 및 소수성을 나타내었으며, 제2 층은 미세섬유 구조 및 고도의 친수성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 도 5b에서는 이중층 막의 제1 및 제2 층의 접촉각 값을 확인할 수 있다. 제1 층은 접촉각이 >90° 로 측정되었으며, 이는 제1 층의 표면이 소수성을 나타내는 것을 의미한다. 또한, 제2 층의 접촉각은 <70°로 측정되었으며, 이는 제2 층의 표면이 친수성을 가진다는 것을 의미한다.
도 9를 참조하면, 이중층 막의 기계적 강도 및 봉합 지점에서의 막의 인장강도를 풀아웃(pullout) 인장강도 시험을 통해 측정하여 이중층 막의 봉합 능력을 확인할 수 있다. 또한, 상기 표 2의 A75G25로 캐스팅된 샘플의 막은 2.95±0.15 MPa에서 가장 높은 인장강도를 나타냈다.
2-2. 이중충 막에서의 MC3T3-E1 및 L929 세포의 세포증식 효과 분석
도 6a 및 6b는 이중충 막(out layer 및 inner layer) 표면상에서의 MC3T3-E1 및 L929 세포의 세포증식 효과를 비교한 것이고, 도 7은 이중층 막의 cross-section 이미지 및 외막 층에 부착된 세포의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 7을 참조하면, 막의 상이한 2층에서 MC3T3-E1 세포의 증식을 확인할 수 있으며, 대조군 세포와 이중층 막의 제2 층에서의 세포증식 사이에 큰 차이가 없었다. 이는 세포부착과 세포증식이 우수하다는 것을 의미한다.
전조골세포는 새로운 골 형성에 기여하고 골 재생을 촉진하는 가장 중요한 세포주이었다. 막의 제2 층은 골 조직과 접촉하는 층이며 내부 골 환경과 상호작용 수 있으며, 전조골세포의 세포부착 및 증식에 대한 제2 층 지원의 결과는 막의 효과 측면의 능력으로부터 강하게 유도된 골 재생에 유망할 수 있다. 제1 층이 MC3T3 세포의 낮은 증식을 보여주는 이외에. 생체내 시험에서 골 재형성을 유도하는 장벽 다이어프램으로서의 장벽 특성 및 예상된 결과를 확인하였다. 배양 1일째에 대조군과 세포밀도의 차이가 크게 다르지 않아, 2개 층 모두가 높은 세포 생체적합성을 나타냈다.
L929 세포의 결과는 2개의 상이한 막 층에서 MC3T3 세포 증식과 동일한 거동을 보여주었다. 생체적응성이 높고 적응력이 뛰어나며 호스트 몸체의 연조직 측면이 있는 막과 양립할 수 있음을 확인하였다. L929 세포의 느린 성장은 막의 제1 층의 장벽 능력에 대해 입증되었으며, 이중층 막은 연조직의 이동을 방지하고 골 결함 측면으로부터 새로운 골 형성을 위한 이상적인 공간을 형성하기 위한 커버 층으로서 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
5일 후 이중층 막의 2개의 상이한 측면상에 부착된 MC3T3 세포의 SEM 이미지는, 제1 층이 세포 부착을 강력하게 방지하는 것 외에도, 세포 막 확산 및 제2 층에서의 성장을 위한 우수한 지원에 대해 입증하였다. 제2 층은 증식된 MC3T3 세포의 고밀도를 나타냈고, 세포막은 양호하게 확산되었으며 제2 층 막 표면을 완전히 덮었다. 제1 층은 세포부착을 거의 감지하지 못하였다.
도 8에서는 골 이식편 및 이중층 막으로 처리되거나 처리되지 않은 골 결함의 마이크로-CT 이미지를 통해 막의 그룹화 및 유도 골 재생능력을 확인하였다.15% w/v PCL and 15% w/v Gel were mixed well with a magnetic stirrer for 3 hours, and 10% β-TCP powder was added and further stirred for 3 hours to obtain TCP powder as shown in Table 1 below. dispersed in the solution at a ratio of
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
(Experiment materials and experiment methods)
1-1. Preparation of solvents for electrospinning
A mixture of formic acid/acetic acid (ratio 1:9) was used as a solvent for dissolving polycaprolactone (PCL) and gelatin (Gel).
The formic acid/acetic acid mixture was mixed in a ratio of 1:9 and then stirred at room temperature for 1 hour using a magnetic stirrer. It was wrapped with paraffin film to prevent evaporation of the solvent.
1-2. Preparation of electrospinning solution
First, 3 g of granulated PCL was added to 20 ml of formic acid/acetic acid mixed solvent and stirred for 3 to 4 hours using a magnetic stirrer at room temperature (25 ° C) until the PCL granules were completely dissolved to obtain 15% w/v 20 ml of PCl solution was prepared.
Next, 3g of powdered Gel was added to 20ml of formic acid/acetic acid mixed solvent and stirred for 3 to 4 hours using a magnetic stirrer at 60°C until the gel granules were completely dissolved to obtain a 15% w/v Gel solution. 20 ml was prepared.
A 15% w/v Gel solution was added to a 15% w/v PCL solution, mixed using a magnetic stirrer for 3 hours, and then 10% β-TCP powder was added and further stirred and mixed for 3 hours.
Table 1 below shows the component ratios of PCL, Gel and β-TCP.
Sample PCL 15% Gel 15% β-TCP powder P1G1 One One 10% P1G2 One 2 10% P1G3 One 3 10% P1G4 One 4 10%
1-3. Preparation of Electrospun Membranes
Electrospun membranes were prepared by loading P1G1, P1G2, P1G3 and P1G4 solution samples into a 10 ml luer-lock syringe [diameter 14 mm, 23-G needle (inner diameter 0.23 mm) and pump speed 4 ml/hr].
A collector drum with a diameter of 10 cm and a length of 25 cm was used, the tip of the needle of the collector drum was 10 cm, and the rotation speed of the collector drum was 350 rpm.
10 ml of the solution was electrospun to prepare an electrospun film, which was dried in a fume hood for 1 day to evaporate any remaining acidic solvent.
At this time, the voltage during electrospinning was directly supplied using a DC high voltage power supply (portable NNC-30 kv-2 mA, Korea).
1-4. Characteristics of Electrospun Film
1-4-1. Electrospun film morphology and β-TCP powder content analysis method
The electrospun membrane prepared according to Table 1 above was mounted on a sample holder and coated with a thin platinum layer using a sputter coater (Cressington Scientific Instruments, UK). The microfiber morphology of the sample was analyzed using a scanning electron microscope (SEM, JSM6701F, JEOL, Japan). TCP powder content was analyzed using EDS detection of calcium and phosphate content in SEM scanning. The fiber diameter was randomly measured in 30 areas of the fiber diameter using the “ImageJ” software measurement tool.
1-4-2. Analysis of swelling behavior in phosphate buffered saline solution
The dried electrospun membrane sample was cut into 1 x 1 cm size, immersed in 1 ml of PBS solution, in an incubator at 37° C., and the weight of the sample was measured for a series of periods (1,500 minutes).
1-4-3. Cell viability analysis of MC3T3-E1 preosteoblasts and L929 fibroblasts
The sample was cut into a round shape with a diameter of 1 cm, placed in a 24-well plate, and then sterilized with 70% ethanol and UV light for 3 hours. Thereafter, the samples were conditioned by being immersed in a cell culture medium for 3 hours incubation in an incubator. After conditioning, the old medium was removed and replaced with 900 μL of fresh medium and a 37° C. incubator for 1 hour prior to cell inoculation.
Preosteoblasts (MC3T3-E1) were cultured in MEM culture medium with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin in clean plates until they reached 70-80% space in the cell culture plate. Thereafter, the cells were separated from the culture plate by trypsin, resuspended in the medium, and 100 μL of 104 cells were inoculated into the sample in 900 μL of the medium, and cultured at 37° C. and 5% CO ₂ for 24 hours.
Fibroblasts (L929) were cultured in EMEM culture medium containing 10% horse serum and 1% penicillin-streptomycin in clean plates until they reached 70-80% of the culture plate. The next step was the same method as the MC3T3 cell inoculation method. After 24 hours of incubation, MTT reagent (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma-Aldrich, USA) was added to each sample with a 9:1 ratio. was added to the well. The culture medium was then incubated at 37°C for 4 hours. The solution was removed and dimethyl sulfoxide (DMSO; Samcheon Soonyak Co., Ltd., Korea) was added to each well to dissolve the formazan salt. The resulting solution (100 L) was transferred to a 96-well plate and absorbance (595 nm) was measured using an Infinite F50 microplate reader (Tecan, Austria).
1-4-4. Preparation of casting solution
25 g of sodium alginate powder was added to 500 ml of distilled water and stirred at high speed at 2,000 rpm for 5 hours at room temperature to prepare 500 ml of a highly viscous 5% w/v sodium alginate (SA) aqueous solution and stored at 4°C.
Pig skin gelatin powder was dissolved in distilled water in a magnetic stirrer heated to 60% to prepare a 5% w/v gelatin solution (G).
1-4-5. Manufacture of double-layer membranes
After modification and characterization, the electrospun membrane of the P1G4 sample in Table 1 above was selected as the best candidate for biocompatibility and biodegradability.
A 10x20 cm size P1G4 membrane specimen was attached to the bottom of a glass mold with a depth of 150 μm. After casting 5 ml of the casting solution into a glass mold, a flat surface was formed using a straight plastic rod.
After casting, the mold with the film and casting solution was immersed in a 5% CaCl ₂ solution tank for 15 minutes. After immersion, the SA/Gel cast layer was cross-linked and gelled with calcium ions in CaCl ₂ , and the membrane cast as the SA/Gel layer was separated and carefully washed several times with distilled water to remove any remaining chloride salt.
Table 2 below shows the component content ratio of the casting layer and the components of the second layer.
Sample SA (%) G(%) electrospun layer A100G0 100 0 P1G4 A75G25 75 25 P1G4 A50G50 50 50 P1G4 A25G75 25 75 P1G4
1-5. Characteristics of double-layer membranes
1-5-1. Sealability test of double layer membrane
Figure 9 illustrates the tensile strength test and sealability test of the double-layer membrane in wet conditions.
Before cutting the sample of the double-layer membrane in Table 2 above into a 5x25 mm specimen, it was immersed in a biological saline solution for 5 minutes, and the 2 tips of the sample were tied with medical suture No. 6, and the speed of the loading cell was 1 mm/min. Sample preparation and settings for measuring sealing ability can be seen in FIG. 9 .

1-5-2. water wetting contact angle
Water contact angle measurement was analyzed using a contact angle measurement system (DSA 100, KRUSS GmbH). Water droplets were sprayed from the needle of the system and deposited on the double layer film, the casting layer, the electrospun layer and the casting layer. After dropping, the shape of the water droplet was recorded and analyzed using a CCD video camera to determine the contact angle.
After proliferative characterization of preosteoblasts MC3T3-E1 and fibroblasts L929 in two different layers of bilayer membranes, samples of A75G25 bilayer membranes had the best mechanical properties, so these samples were selected for in vitro and in vivo studies.
1-5-3. Proliferation of precursor bone cells (MC3T3-E1) and fibroblasts (L929) in bilayer membranes
MC3T3 and L929 cells were cultured and prepared. MC3T3 and L929 cells were cultured and prepared as described above, so a description thereof is omitted.
Samples were cut into round shapes (10x10 mm) and sterilized with 70% ethanol and UV light for one day before conditioning with culture medium. After sterilization, the sample was placed in a 24-well plate and performed according to a schematic diagram (FIG. 10).
Cell proliferation was collected on days 1, 3, and 5 through the MTT assay method, and the cell morphology of cells attached to the membrane surface was analyzed on day 5 using SEM images.
1-5-4. In vivo implantation in rabbit radial defects
Eighteen New Zealand white rabbits, weighing 2–2.5 kg, were purchased, housed in 18 different stainless steel housing facilities, and supplied with appropriately approved food and water according to guidelines provided by the Animal Care Center of Soonchunhyang University, Chungcheongnam-do, Korea. Before the day of surgery, an adaptation period was given to adjust the environment, and all rabbits were anesthetized with isoflourance gas for surgery. The hair on rabbit paws was completely shaved and sterilized with 70% ethanol and povidone iodine. After dissecting the forearm with the radius inside and isolating the radius area from the tissue and muscle layer, a bone of 8 mm length was cut at the midpoint of the radius using a treffin drill with continuous saline washing to prevent dehydration of the tissue. removed, resulting in a defect. The double-layered membrane was filled with a bone graft (Frabone-H, Inobone Company, Korea) and wrapped around the defect, and the subcutaneous tissue was closed and the skin was again sutured thereon. Animals were housed in the laboratory and fed ad libitum. Rabbits were sacrificed at 2 weeks and 4 weeks after implantation, and the entire forearm bone including the ulna and radius was collected. For preservation, tissue samples were immersed in 4% formaldehyde and stored at 40 °C.
1-5-5. Micro-computed tomography (micro-CT) evaluation
Micro-CT images of the implanted scaffolds were taken using a Skyscan Desktop micro-CT 1172 (Arrrselaar, Belgium), and X-ray radiographs were obtained using a 60 kV source voltage of 167 μA current. Scans were reconstructed using NRecon Software and analyzed with CTAn software.
(Experiment result)
1. Characterization of porous electrospun membranes
1-1. Morphology and diameter analysis of electrospun membranes
Figure 1a shows SEM images of fibers according to the gelatin ratio (P1G1, P1G2, P1G3 and P1G4) of the electrospinning solution, and Figure 1b shows the change in fiber diameter according to the gelatin ratio of the electrospinning solution.
Although samples (P1G1, P1G2, P1G3 and P1G4) were prepared under the same electrospinning conditions, it can be seen that there is a difference in the microstructure. In addition, although the fibers of all membrane samples exhibited a smooth and uniform shape, it was confirmed that the diameter of the fibers decreased as the gelatin content increased.
1-2. Characterization of PCL/Gel and PCL/Gel/TCP
Figure 2a is an image comparing PCL/Gel SEM and PCL/Gel/TCP SEM, Figure 2b shows the EDS profile of Figure 2a, Figure 2c is a comparison of the contact angle and hydrophilicity of Figure 2a, Figure 2d is PCL It shows the XRD results of /Gel/TCP and TCP powder.
Referring to Figures 2a to 2b, it can be seen that the β-TCP powder was successfully loaded on the electrospun fiber. In addition, the water contact angle and the shape of water droplets of sample P1G1 electrospun in the dry state were recorded every second of measurement, and the water droplets almost disappeared 6 seconds after being dropped on the electrospun surface, and finally the contact angle was almost zero. You can check. This is a result confirming that the electrospun membrane has excellent hydrophilicity and excellent liquid absorption capacity. In addition, it can be seen that as the gelatin content increases, the hydrophilicity of the electrospun membrane containing PCL is improved.
As a result, the higher the PCL content, the better liquid absorption capacity was shown, so the P1G4 sample was predicted to have the best liquid absorption capacity.
1-3. Analysis of swelling and cell viability of electrospun membranes
Figure 3a shows the swelling ratio of the electrospun membrane in the PBS solution, and Figure 3b shows the analysis of the viability of MC3T3 and L929 cells inoculated on the electrospun membrane.
Referring to Figure 3a, it can be confirmed the swelling ratio of the electrospun membrane in the PBS solution after immersion for 1 day. In addition, the P1G4 sample showed the highest expansion rate up to 10% of the initial weight, and the point at which the P1G1 sample started to lose weight appeared earlier than other samples with a higher PCL ratio.
Referring to Figure 3b, viability of MC3T3 and L929 cells seeded on electrospun membrane samples after 24 hours. More than 80% of the cells seeded on the membrane were viable, and there was no significant difference between cell viability of P1G1 versus P1G4. The viability of MC3T3 in membrane samples was almost the same as that of cells cultured without membrane samples, and it can be seen that all membrane samples have excellent biocompatibility.
Also, for L929 cell viability, a decrease in L929 cells compared to cell viability without membrane (100%) was recorded, but there was no significant difference between the sample and more than 80% viable L929 cells. From this result, it can be confirmed that the content of gelatin in the electrospun membrane does not affect cell viability and all membrane samples have excellent biocompatibility.
2. Bilayer membrane assay
2-1. Analysis of surface morphology, contact angle and tensile strength of double layer membrane
Figure 4 shows the SEM image of the double layer film, Figure 5a shows the tensile strength values of each sample, Figure 5b shows the water contact angle of the first layer and the second layer in wet conditions, Figure 9 is wet conditions In, the tensile strength test and sealing ability test of the double layer membrane are exemplified.
Referring to FIGS. 4 and 5 , it is possible to confirm the SEM morphology of the two different layers of the double-layer membrane and the liquid absorption capacity of the first layer and the second layer under wet conditions. It can be seen from the SEM images that the membranes have different morphologies, the first layer exhibiting a dense structure and hydrophobicity, and the second layer exhibiting a microfibrous structure and a high degree of hydrophilicity. In FIG. 5B , contact angle values of the first and second layers of the double layer film can be confirmed. The first layer measured a contact angle of >90°, indicating that the surface of the first layer was hydrophobic. In addition, the contact angle of the second layer was measured to be <70°, which means that the surface of the second layer has hydrophilicity.
Referring to FIG. 9 , the sealing ability of the double-layer membrane can be confirmed by measuring the mechanical strength of the double-layer membrane and the tensile strength of the membrane at the sealing point through a pullout tensile strength test. In addition, the film of the sample cast with A75G25 in Table 2 showed the highest tensile strength at 2.95±0.15 MPa.
2-2. Analysis of proliferative effect of MC3T3-E1 and L929 cells in double layer membrane
Figures 6a and 6b compare the cell proliferation effects of MC3T3-E1 and L929 cells on the surface of the double layer membrane (out layer and inner layer), and Figure 7 shows cross-section images of the double layer membrane and cells attached to the outer layer. SEM images are shown.
Referring to FIGS. 6A to 7 , the proliferation of MC3T3-E1 cells in the second layer of the membrane was confirmed, and there was no significant difference between the control cells and the cell proliferation in the second layer of the bilayer membrane. This means that cell adhesion and cell proliferation are excellent.
Preosteoblasts were the most important cell line contributing to new bone formation and promoting bone regeneration. The second layer of the membrane is the layer in contact with the bone tissue and can interact with the internal bone environment, and the result of the second layer support for the cell adhesion and proliferation of precursor osteocytes is the bone regeneration strongly induced from the ability of the membrane's effect side. could be promising In addition to the first layer showing low proliferation of MC3T3 cells. In vivo tests confirmed the barrier properties and expected results as a barrier diaphragm inducing bone remodeling. On day 1 of culture, the cell density was not significantly different from that of the control group, indicating high cell biocompatibility in both layers.
The results of L929 cells showed the same behavior as MC3T3 cell proliferation in two different membrane layers. It was confirmed that it is highly biocompatible, has excellent adaptability, and is compatible with membranes with soft tissue aspects of the host body. The slow growth of L929 cells demonstrated the barrier ability of the first layer of the membrane, confirming that the bilayer membrane can be used as a cover layer to prevent soft tissue migration and form an ideal space for new bone formation from the side of the bone defect. .
SEM images of MC3T3 cells adhered on two different sides of the bilayer membrane after 5 days showed that in addition to the first layer strongly preventing cell attachment, cell membrane spreading and good support for growth on the second layer. Proven. The second layer showed a high density of proliferated MC3T3 cells, and the cell membrane was well spread and completely covered the second layer membrane surface. The first layer barely detects cell adhesion.
In FIG. 8 , membrane grouping and induced bone regeneration ability were confirmed through micro-CT images of bone grafts and bone defects treated with or without the double-layer membrane.

상기 결과를 통해, 본 발명은 PCL/Gel의 전기방사 용액 혼합물에 젤라틴 함량을 증가시킴으로써, 막의 생분해 속도를 향상시키고, 골 조직의 골생성을 촉진하거나, 골 생성을 유도하기 위한 마이크로-섬유 내부에 로딩된 인자를 빠르게 방출할 수 있다는 것을 확인하였다.Through the above results, the present invention increases the gelatin content in the electrospinning solution mixture of PCL/Gel, thereby improving the biodegradation rate of the membrane, promoting osteogenesis of bone tissue, or inside micro-fibers for inducing bone production. It was confirmed that the loaded factor could be rapidly released.

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Claims

용매에 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL) 또는 젤라틴(Gelatin, Gel)을 투입하여 PCL 수용액 및 Gel 수용액을 각각 제조하는 단계,
상기 PCL 수용액과 상기 Gel 수용액을 혼합하고, β-TCP을 혼합하여 전기방사용 용액을 제조하는 단계,
상기 전기방사용 용액을 전기방사기에 투입하고 방사하여 전기방사 막을 제조하는 단계 및
상기 전기방사 막을 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 이용하여 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법으로서,
상기 이중층 막은 제1 층 및 제2 층의 막을 갖으며,
상기 제1 층은 접촉각이 >90° 로 소수성이 증가되며,
상기 제2 층의 접촉각은 <70° 로 친수성이 증가되며,
이중층 막의 인장강도는 2.95±0.15 MPa인 골유도형 이중층 막의 제조방법.Injecting polycaprolactone (PCL) or gelatin (Gel) into a solvent to prepare an aqueous PCL solution and an aqueous Gel solution, respectively;
Preparing an electrospinning solution by mixing the PCL aqueous solution and the Gel aqueous solution and mixing β-TCP;
Injecting the electrospinning solution into an electrospinning machine and spinning to prepare an electrospun film; and
A method for producing a osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, comprising the step of coating the electrospun membrane using an aqueous solution of sodium alginate/gelatin,
The double layer film has a first layer and a second layer of film,
The first layer has increased hydrophobicity with a contact angle >90 °,
The contact angle of the second layer is <70 ° and the hydrophilicity is increased,
A method for producing a bone-inducing double-layer membrane having a tensile strength of 2.95 ± 0.15 MPa.

제1항에 있어서,
상기 용매는,
포름산과 아세트산을 1:9 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
The solvent is
A method for producing an osteoinductive double-layer membrane comprising polycaprolactone and gelatin, characterized in that formic acid and acetic acid are mixed in a weight ratio of 1:9.

제1항에 있어서,
상기 PCL 수용액을 제조하는 단계는,
상기 용매에 PCL을 투입하고, 20~30 ℃의 온도에서 3~4 시간 동안 교반하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
The step of preparing the PCL aqueous solution,
A method for producing a osteoinductive double-layer membrane comprising polycaprolactone and gelatin, characterized in that the preparation is prepared by adding PCL to the solvent and stirring at a temperature of 20 to 30 ° C. for 3 to 4 hours.

제1항에 있어서,
상기 Gel 수용액을 제조하는 단계는,
상기 용매에 Gel을 투입하고, 55~65 ℃의 온도에서 3~4 시간 동안 교반하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
The step of preparing the Gel aqueous solution,
A method for producing a osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, characterized in that the gel is added to the solvent and stirred at a temperature of 55 to 65 ° C. for 3 to 4 hours.

제1항에 있어서,
상기 Gel 수용액 및 PCL 수용액의 농도는 15%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법. According to claim 1,
Method for producing a osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, characterized in that the concentration of the Gel aqueous solution and the PCL aqueous solution is 15% (w / v).

제1항에 있어서,
상기 전기방사용 용액을 제조하는 단계는,
상기 PCL 수용액과 Gel 수용액을 혼합하고, β-TCP 분말을 투입하여 2~4시간 동안 혼합하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
The step of preparing the electrospinning solution,
A method for producing a osteoinductive double-layer membrane containing polycaprolactone and gelatin, characterized in that the PCL aqueous solution and the Gel aqueous solution are mixed, and β-TCP powder is added and mixed for 2 to 4 hours.

제1항에 있어서,
상기 알긴산나트륨/젤라틴 수용액은
증류수에 알긴산 나트륨과 젤라틴 분말을 각각 투입하고 용해시켜 알긴산 나트륨 수용액과 젤라틴 수용액을 제조하는 과정과,
상기 알긴산 나트륨 수용액과 젤라틴 수용액을 1:0.1~3 중량비로 혼합하여 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 제조하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
The sodium alginate/gelatin aqueous solution is
Preparing sodium alginate aqueous solution and gelatin aqueous solution by adding and dissolving sodium alginate and gelatin powder in distilled water, respectively;
A method for producing a osteoinductive double-layer membrane comprising polycaprolactone and gelatin, comprising mixing the sodium alginate aqueous solution and the gelatin aqueous solution in a weight ratio of 1:0.1 to 3 to prepare a sodium alginate/gelatin aqueous solution.

제1항에 있어서,
상기 전기방사 막을 알긴산나트륨/젤라틴 수용액을 이용하여 코팅하는 단계 후,
염화칼슘(CaCl₂)을 이용하여 알긴산나트륨/젤라틴 코팅층을 10~20 분 동안 가교시키고 멸균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법.According to claim 1,
After coating the electrospun film using sodium alginate/gelatin aqueous solution,
Using calcium chloride (CaCl ₂ ) to crosslink and sterilize the sodium alginate/gelatin coating layer for 10 to 20 minutes, characterized in that it further comprises the step of producing an osteoinductive double-layer membrane comprising polycaprolactone and gelatin Method for producing.

제1항의 제조방법으로 제조된 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막.An osteoinductive bilayer membrane comprising polycaprolactone and gelatin prepared by the method of claim 1.

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제9항에 있어서,
상기 이중층 막은 다공성인 것을 특징으로 하는, 골유도형 이중층 막.According to claim 9,
The double-layer membrane is characterized in that the porous, osteoinductive double-layer membrane.

제9항에 있어서,
상기 이중층 막은 스캐폴드인 것을 특징으로 하는, 골유도형 이중층 막.According to claim 9,
Characterized in that the bilayer membrane is a scaffold, osteoinductive bilayer membrane.