KR102549781B1

KR102549781B1 - 간 조직 재생용 조성물

Info

Publication number: KR102549781B1
Application number: KR1020207008677A
Authority: KR
Inventors: 켄 야에가키; 히로시 이시카와
Original assignee: 각코호진 니혼시카다이가쿠
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2023-06-30
Also published as: KR20200058415A; US20210128635A1; WO2019038907A1

Abstract

본 발명은 간 조직 재생용 조성물, 특히 간 질환의 예방 또는 치료를 위한 간 조직 재생용 조성물을 제공하는 것으로, 간 조직 재생용 조성물에, 유효 성분으로서 사람 치수 줄기 세포를 함유시킨다.

Description

간 조직 재생용 조성물

본 발명은 간 조직 재생용 조성물, 특히 간 질환의 예방 또는 치료를 위한 간 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

종래, 각종 조직의 수복이나 재생, 질환의 치료를 목적으로 하여 세포 이식이 행해져 왔다. 세포 이식은 조직을 구성하는 세포 자체 또는 조직의 구축을 보조하는 세포를 성체에 투여하는 것인 점에서 직접적인 치료 효과가 기대된다. 예를 들어, 간 조직의 재생이나 간 질환의 치료 분야에서 지금까지의 전(前)임상 연구 및 임상 연구에서는, 예를 들어 CD34 양성 골수 줄기 세포를 간 등에 이식하는 것이 이루어져 왔다(예를 들어, 비특허 문헌 1). 그러나, 간 질환의 치료라는 관점에서는, 이와 같은 CD34 양성 골수 줄기 세포의 이식으로는 간 질환의 약간의 개선이 보이는 데에 그치고 치료에는 거리가 있어, 여명 또는 사체 간 이식·생체 간 이식을 기다리는 기간을 길게 하는 정도의 효과가 있는 데에 지나지 않았다.

한편, 치수 줄기 세포는 유치나 사랑니 등, 종래에는 폐기되고 있던 탈락치나 발거치로부터 용이하게 채취 가능한 점에서, 조직의 재생이나 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있는 줄기 세포로서 기대되고 있다. 그러나, 지금까지 치수 줄기 세포로부터 간 세포를 분화·성숙시키고, 간 조직을 포유 동물체 내에서 대량으로 제작(재생)하는 방법은 아직 확립되어 있지 않다. 또한, 치수 줄기 세포를 이용하여 간 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 대해서도 확립되어 있지 않은 것이 현실이다.

Nakamura et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, Vol. 29, 2014, pages 1830-1838

본 발명자는 이번에 예의 연구를 실시한 결과, 특정의 치수 줄기 세포를 이용하여, 간 조직을 효과적으로 재생할 수 있는 것을 발견했다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하는 것이다.

따라서, 본 발명은 사람 치수 줄기 세포를 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 간 조직 재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명으로서는 구체적으로는 이하의 것이 예시된다.

[1] 사람 치수 줄기 세포를 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 간 조직 재생용 조성물.

[2] 상기 사람 치수 줄기 세포가 간 세포로 분화하고 있는, [1]에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[3] 상기 사람 치수 줄기 세포가 사람 유치 치수 줄기 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[4] 상기 사람 치수 줄기 세포가 CD29, CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고 CD34, CD45 및 CD133을 발현하지 않는, [1] ~ [3] 중 어느 하나에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[5] 사람의 간 질환을 예방 또는 치료하기 위한, [1] ~ [4] 중 어느 하나에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[6] 비인간 포유 동물의 간 질환을 예방 또는 치료하기 위한, [1] ~ [4] 중 어느 하나에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[7] 간 질환의 예방 또는 치료의 대상이 되는 상기 사람 또는 비인간 포유 동물의 체중 15㎏ 당 5×10⁶ ~ 4×10¹⁰ 개의 사람 치수 줄기 세포가, 상기 사람 또는 비인간 포유 동물에 투여되는, [5] 또는 [6]에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[8] 상기 사람 또는 비인간 포유 동물의 비동(脾洞)에 투여되는, [1] ~ [7] 중 어느 하나에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[9] 상기 간 질환이 간암, 간부전, 간경변, 간염, 비알코올성 지방성 간 질환 및 전이성 암 및 암의 화학 요법에 기인하는 부작용에 대하여 보조 요법을 필요로 하는 병태로 이루어진 군에서 선택되는, [5] ~ [8] 중 어느 하나에 기재된 간 조직 재생용 조성물.

[10] 사람 치수 줄기 세포의 유효량을 사람 또는 비인간 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 사람 또는 비인간 포유 동물에서의 간 질환의 예방 또는 치료 방법.

[11] 상기 사람 치수 줄기 세포가 상기 사람 또는 비인간 포유 동물의 비동에 투여되는, [10]에 기재된 방법.

[12] 상기 간 질환이 간암, 간부전, 간경변, 간염, 비알코올성 지방성 간 질환 및 전이성 암 및 암의 화학 요법에 기인하는 부작용에 대하여 보조 요법을 필요로 하는 병태로 이루어진 군에서 선택되는, [10] 또는 [11]에 기재된 방법.

본 발명에 의하면, 용이하게 채취 가능한 사람 치수 줄기 세포를 이용하여, 포유 동물의 간 조직 재생을 실시하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 따르면, 비알코올성 간 질환(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD))을 비롯한 간 질환의 예방 또는 치료를 효과적으로 수행할 수 있게 된다.

도 1은 간 질환(비알코올성 지방성 간 질환(NAFLD)) 모델 동물(마이크로 미니 돼지)의 간 조직의 생검 사진,
도 2는 본 발명 조성물의 적용 전, 적용 개시시 및 적용 개시 후 4주간의 혈중 알부민 농도를 나타내는 그래프,
도 3은 본 발명 조성물의 적용 전, 적용 개시시 및 적용 개시 후 4주간의 혈중 총 콜레스테롤 농도를 나타내는 그래프,
도 4는 본 발명 조성물의 적용 전, 적용 개시 및 적용 개시 후 4주간의 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도를 나타내는 그래프,
도 5는 본 발명 조성물의 적용 전, 적용 개시시 및 적용 개시 후 4주간의 혈중 히알루론산 농도를 나타내는 그래프,
도 6은 본 발명 조성물의 적용 전, 적용 개시시 및 적용 개시 후 4주간의 혈중 알라닌 아미노 트랜스페라아제(ALT) 농도를 나타내는 그래프, 및
도 7은 비장에 본 발명의 조성물을 적용 후 4주간 경과시의 간 질환 모델 동물(마이크로 미니 돼지)의 비장 조직의 생검 사진이다.

본 발명의 간 조직 재생용 조성물은 사람 치수 줄기 세포를 유효 성분으로서 포함하여 이루어진다. 본 발명의 조성물에 포함되는 사람 치수 줄기 세포는 사람의 유치, 영구치 또는 사랑니 중 어느 것에 유래하는 것이어도 되지만, 탈락 유치 또는 사랑니에 유래하는 치수 줄기 세포인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 치수 줄기 세포는 본 발명을 실시하기 전에 미리 조제한 것을 사용해도 되고, 또한 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용해도 된다. 치수 줄기 세포를 조제하는 경우, 치수 줄기 세포를 채취하는 개체는 상기 치수 줄기 세포를 포함하는 조성물의 적용 대상이 되는 개체와 동일 또는 다른 개체 중 어느 것이어도 된다. 그러나, 조성물 적용시의 거절 반응의 발생을 억제하여 생착 효율 및 재생 효율을 높인다는 관점에서, 동일한 개체로부터 채취된 치수 줄기 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 일반적으로 시판되고 있는 사람 치수 줄기 세포로는, 예를 들어 사람 치수 줄기 세포(CLI사 제조, 제품 번호: 300702-SF)나 hDPSC-치수 줄기 세포(론자 재팬 가부시키가이샤 제조, 제품 번호: PT-5025) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 미리 조제한 치수 줄기 세포를 사용하는 경우의, 치수 줄기 세포의 채취 및 처리 방법의 일례를 이하에 나타낸다. 이 채취 및 처리 방법은 (1) 치수의 채취, (2) 효소 처리, (3) 세포 배양, (4) 세포의 회수를 차례로 실시한다.

(1) 치수의 채취

자연 탈락 직전에 발거한 사람의 유치 또는 사랑니 등의 영구치를 클로로헥시딘 또는 이소딘 용액으로 소독한 후, 멸균한 발수침(拔髓針)을 사용하여 치근관을 통하여 치수 조직을 채취한다.

(2) 효소 처리

채취한 치수 조직을, 각각 4㎎/㎖의 콜라게나아제 I 및 디스파아제에 의해, 37℃에서 1시간 처리한다.

(3) 세포 배양

효소 처리에 의해 얻어진 세포 현탁액을, 면적 25㎠의 디시에 파종하여 10% 소태아 혈청(FBS), 100U/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 0.25㎍/㎖의 암포테리신 B를 포함하는 둘베코(Dulbecco) 변법 이글 배지(DMEM)에서, CO₂ 농도 5%의 하에서 배양한다. 배양 세포가 85 ~ 90%의 컨플루언트(confluent)에 도달할 때까지 세포를 배양하고, 면적 25㎠의 새로운 디시에 약 10⁵개/㎠가 되도록 파종한다.

(4) 세포의 회수

배양 세포를, 트립신 처리 등에 의해 디시로부터 박리한 후, 원심 처리를 실시함으로써 세포를 회수하여, 행크스 평형염 용액(HBSS: Hanks' Balanced Salt Solution)에 약 2×10⁶개/100㎕가 되도록 재현탁한다. 이와 같이 하여 회수한 세포를, 본 발명에서 사용하는 치수 줄기 세포로서 사용한다.

조제된 세포가 치수 줄기 세포임을 확인하는 방법으로는 치수 줄기 세포에 특이적인 마커의 발현 패턴을 지표로서 확인하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는 치수 줄기 세포는 CD29, CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고 있고, 한편 CD34, CD45 및 CD133을 발현하고 있지 않은 것을 하나의 특징으로 하고 있다. 이들 마커의 발현은 모두 예를 들어, 면역 형광 염색법이나 FACS(Fluorescence activated cell sorting) 등에 의해 검출·확인할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 사람 치수 줄기 세포는 간 세포로 분화시켜 사용하는 것이 바람직하다. 치수 줄기 세포를 간 세포로 분화시키는 방법으로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 치수 줄기 세포를 종래 공지의 방법(예를 들어, Okada et al., “Hydrogen sulphide increases hepatic differentiation of human tooth pulp stem cells compared with human bone marrow stem cells,” International Endodontic Journal에 기재된 방법)에 기초하여 실시할 수 있다. 구체적으로는 치수 줄기 세포를 1%의 인슐린-트랜스페린-아셀렌산 나트륨 및 배아 영양 인자를 첨가한 무혈청 DMEM에서, 70% 정도의 컨플루언트가 될 때까지 배양 한 후, 20ng/㎖의 간 세포 증식 인자(HGF)를 첨가하여 5일간 처리하고, 그 후 온코스타틴 M 및 덱사메타손을 첨가하고 추가로 15일간 처리한다.

치수 줄기 세포가 간 세포로 분화한 것을 확인하는 방법으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 실제로 생체의 간에 이식하여 그 분화능을 확인하는 방법이나, 알부민이나 α-페토프로테인 등의 간 세포 분화에 특징적인 유전자 마커의 발현 레벨을 ELISA나 실시간 RT-PCR 등을 이용하여 해석하는 방법에 의해 실시된다.

본 발명의 조성물에 포함되는 사람 치수 줄기 세포는 분리된 상태의 치수 줄기 세포이어도 되지만, 조성물 적용시의 치수 줄기 세포의 생착 효율 및 재생 효율을 높이기 위해, 스피어(sphere)를 형성한 상태의 치수 줄기 세포를 사용해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 사람 치수 줄기 세포를 유효량 포함하면 고체 또는 액체 중 어느 형태를 취해도 되고, 조성물을 적용하는 방법에 따라 약학상 허용되는 담체 또는 첨가제를 배합하여, 고체 또는 액체상의 조성물로서 조제할 수도 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 사람 치수 줄기 세포의 양은 간 조직을 재생할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 적용 대상이 되는 포유 동물의 종류나 중량에 맞추어 적절히 설정할 수 있고, 예를 들어 적용 대상이 되는 포유 동물의 체중 15㎏에 대하여 5×10⁶ ~ 4×10¹⁰개의 치수 줄기 세포를 함유시킨다. 바람직하게는 대상이 되는 포유 동물의 체중 15㎏에 대하여, 1×10⁷ ~ 4×10⁷개의 치수 줄기 세포를 함유시킨다.

본 발명의 조성물을 적용하는 대상은 포유 동물이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 사람이어도 되고, 비인간 포유 동물이어도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 영장목, 우제목, 경우제목 또는 기제목 등에 속하는 고등 포유 동물에 대하여 특히 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명의 조성물의 적용 부분으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 간, 비장 및 폐 등의 장기이다. 또한, 본 발명의 조성물의 적용 방법으로서는 적용 부분이 되는 장기 또는 조직 등에 주입, 매입, 전입(塡入) 또는 도포 등의 종래 공지의 방법에 의해 적용된다. 적절한 용매 등의 담체를 사용하여 본 발명의 조성물을 적당한 유동성을 갖는 겔상으로 조제함으로써, 전입, 주입 또는 도포 등의, 간편한 수법으로 적용할 수 있다. 또한, 겔상이면 주사 바늘 등을 사용하여 대상 장기 등에 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 비장에 적용하는 경우에는 직접 비장에 적용해도 되지만, 비동에 주사기로 주입하여 혈류에 의해 비장에 반송하여 적용해도 된다. 본 발명의 조성물을 사용하여 간 이외의 장기에 간 조직을 재생한 경우, 상기 장기의 기능을 손상시키지 않고 간 조직을 재생할 수 있는 것이 확인되고 있다.

본 발명의 조성물을 사용하여 간 조직의 재생을 실시하는 경우, 조성물의 적용에 의한 면역 반응을 억제하기 위해 조성물의 적용 전에 적용 대상이 되는 동물에 대하여 면역 억제 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 면역 억제 처리는 시판의 면역 억제제를 사용하여 실시할 수 있다. 시판의 면역 억제제로서는 예를 들어, 타크로리무스(tacrolimus)(제품명: 프로그라프(등록 상표), 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 제조) 등을 사용할 수 있다. 면역 억제 처리는 사용하는 면역 억제제마다 종래 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.

면역 억제제로서 프로그라프를 사용하여 본 발명의 조성물을 적용하는 경우의, 프로그라프 및 본 발명의 조성물의 적용 스케줄의 일례를 이하에 나타낸다.

우선, 본 발명의 조성물의 적용 전날의 이른 아침과 밤의 각각에, 프로그라프 과립 1㎎ 포(과립 500㎎) 및 0.2㎎ 포(과립 100㎎)를 사용하여, 과립 0.075㎎/㎏ 체중의 양으로 경구 투여한다(1일의 총 투여량 0.15㎎/㎏ 체중). 적용 당일은 0.15㎎/㎏ 체중의 양의 프로그라프 주사액(5㎎/㎖)을 생리 식염수 200㎖에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을, 이른 아침과 밤에 각각 100㎖ 씩, 2시간의 지속 점적에 의해 정맥 내 투여한다(1일의 총 투여량은 0.15㎎/㎏ 체중). 적용 다음날부터 적용 후 28일까지는 0.10㎎/㎏ 체중의 양의 프로그라프 주사액(5㎎/㎖)을 생리 식염수 200㎖에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을, 이른 아침과 밤에 각각 100㎖ 씩, 2시간의 지속 점적에 의해 정맥내 투여한다(1일의 총 투여량은 0.10㎎/㎏ 체중). 체중이 15㎏의 개체에 투여하는 경우는 본 발명의 조성물의 적용 전날 아침과 밤에 각각, 프로그라프 1125㎎(프로그라프 과립 1㎎ 포를 2포와 0.2㎎포를 1과 1/4포)를 경구 투여한다. 적용 당일은 2.25㎎(프로그라프 주사액(5㎎/㎖)을 450㎕)을 200㎖의 생리 식염수에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을, 이른 아침과 밤에 각각 100㎖ 씩, 2시간의 지속 점적에 의해 정맥내 투여한다. 적용 다음날부터 적용 후 28일까지는 1.5㎎(프로그라프 주사액(5㎎/㎖)을 300㎕)을 200㎖의 생리 식염수에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을, 이른 아침과 밤에 각각 100㎖ 씩, 2시간의 지속 점적에 의해 정맥내 투여한다. 또한, 본 발명의 조성물 적용의 다음날 이후는 프로그라프의 혈중 농도를 매일 측정하고, 혈중 농도가 0.01㎎/㎖ 이하가 되지 않도록, 1.5㎎(프로그라프 주사액(5㎎/㎖) 300㎕)을 200㎖의 생리 식염수에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을 적절하게 정맥 내 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 적용 후 4 ~ 10 주간에, 적용한 본 발명의 조성물에 포함되는 사람 치수 줄기 세포 및 그곳으로부터 분열·증식한 세포를 포함하는 조직 (세포군)을 채취한다. 간 조직의 재생이 되어 있는지 여부의 확인은 채취된 조직(세포군)과 정상 개체의 간 조직을, 조직 염색 등의 조직학적 해석, 각종 간 마커에 대한 면역 염색, 인 시투 하이브리디제이션(in situ hybridization), ELISA, RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR을 이용한 분석, 또는 전자 현미경 해석 등을 이용하여 비교하여 실시한다. 각종 간 마커로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 알부민, α-페토프로테인(fetoprotein) 및 CPS(카르바모일 인산 합성 효소) 및 미토콘드리아 등을 들 수 있다. 이러한 간 마커가 정상 개체의 간에서의 발현량과 동등 정도로 발현하고 있는 경우, 또한 간의 기능이 결손되어 있는 대상에 적용하는 경우에는 결손된 간의 기능이 개선 및/또는 보완되어 있는 경우에, 채취된 세포군은 간 조직으로 분화된 것, 즉 간 조직이 재생된 것으로 판단한다.

본 발명의 조성물은 포유 동물의 간 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 본 발명의 조성물을 포함하는 의약 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 의약 조성물의 제조에있어서의, 본 발명 조성물의 사용이 제공된다. 또한, 본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 의약 조성물은 포유 동물의 간 질환의 예방 또는 치료에 사용된다. 상기 의약 조성물에 있어서는, 본 발명의 조성물을 그대로 사용해도 되고, 본 발명의 조성물에 약학상 허용 가능한 담체를 적절하게 첨가하여 사용해도 된다.

본 발명의 조성물의 예방 또는 치료 대상이 되는 간 질환은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 간암, 간부전, 간경변, 간염, 비알코올성 지방성 간 질환 및 전이성 암 및 암의 화학 요법에 기인하는 부작용에 대하여 보조 요법을 필요로 하는 병태 등이다. 암의 화학 요법에 기인하는 부작용에 대하여 보조 요법이 필요한 병태라는 것은 구체적으로는 간부전이나 간 전이 암과 같은 병태를 의미한다. 또한, 본 발명의 조성물의 적용 대상이 되는 포유 동물은 상기 간 질환과 함께 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 고혈압 등의 생활 습관병을 병발하고 있어도 된다.

본 발명의 조성물에 있어서의 간 질환의 예방 또는 치료 효과의 확인은 본 발명의 조성물을 적용한 후에, 본 발명의 조성물을 적용한 장기 또는 조직 전체의 조직 염색에 의한 병리학적 소견 및/또는 통상 행해지고 있는 혈액 검사에 기초하여 실시할 수 있다. 여기에서, 「본 발명의 조성물을 적용한 장기 또는 조직의 전체」라는 것은 적용된 본 발명의 조성물에 포함되는 사람 치수 줄기 세포 및 그것으로부터 분열·증식한 세포로 이루어진 세포군을 포함하는 장기 또는 조직을 의미한다.

본 발명 조성물의 간 질환의 예방 또는 치료 효과의 확인을 혈액 검사에 기초하여 실시하는 경우, 이하의 (1) ~ (6)으로부터 선택되는 적어도 하나의 파라미터에 대하여 정상 개체와 비교함으로써 실시된다.

(1) 혈중 총 콜레스테롤 농도

(2) 혈중 알부민 농도

(3) 헤파플라스틴 테스트(HPT)의 값

(4) 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도

(5) 혈중 알라닌 아미노 트랜스페라아제(ALT) 농도

(6) 혈중 히알루론산 농도

구체적으로는 간 질환에 이환된 포유 동물의 개체에 있어서, 본 발명의 조성물을 적용한 경우에, 상기 파라미터 중 적어도 하나가 정상 개체와 동일한 정도의 값이 되거나, 또는 정상 개체의 값에 근접하는 경향을 나타낸 경우에, 본 발명의 조성물이 간 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 갖는 것이라고 판단한다.

또한, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 포유 동물에서의 상기 간 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 본 발명의 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서는 포유 동물의 간 질환을 예방 또는 치료하기위한 유효량의 사람 치수 줄기 세포가 포유 동물에 투여되도록, 본 발명의 조성물이 투여된다. 또한, 상기 방법에서는 사람 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물을 투여하는 형태 외에, 사람 치수 줄기 세포를 그대로 투여하는 형태도 포함된다.

사람 치수 줄기 세포의 유효량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 대상이 되는 포유 동물의 종류, 연령, 성별, 상태 등에 따라 의사에 의해 적절히 결정된다.

사람 치수 줄기 세포 또는 사람 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물의 투여 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 상술한 간 조직의 재생과 동일한 수순에 의해 실시할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

치수 줄기 세포의 조제

상법에 따라, 6 ~ 12세의 건강한 사람으로부터 유치를 채취하였다. 또한, 유치의 채취 및 채취한 유치의 치수 줄기 세포의 조제 및 사용에 대해서는 사전에 대상 또는 그 보호자에게 설명하고, 동의를 얻고 나서 실시했다. 채취한 유치로부터 멸균한 발수침을 사용하여 치근관을 통하여 치수 조직을 채취했다. 채취한 치수 조직을, 4㎎/㎖의 디스파아제Ⅱ(GIBCO사 제조, 제품 번호: 1728484) 및 4㎎/㎖의 콜라게나아제I(와코준야쿠 고교 가부시키가이샤 제조, 제품 번호: CTH2297)을 사용하여 37℃에서 1시간 소화했다. 소화 후의 세포 현탁액을, 면적 25㎠의 디시(TPP사 제조)를 사용하여, 10% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 둘베코(Dulbecco) 변법 이글 배지(DMEM)(Invitrogen사 제조, 100U/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토 마이신 및 0.25㎍/㎖의 암포테리신 B를 함유)에서, CO₂ 농도 5%의 분위기하, 37℃의 환경하에서 배양했다. 배양 세포가 85 ~ 90%의 컨플루언트에 도달할 때까지 배양한 후, 새로운 디시에 1×10⁵개/㎠가 되도록 계대(繼代)했다.

10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 3회 계대한 후, 트립신을 사용하여 세포를 디시로부터 박리했다. 박리된 세포를 Manual MACS(등록 상표) Cell Separation protocol에 제공하여 CD117⁺ 치수 줄기 세포를 단리했다. CD117⁺ 치수 줄기 세포를, 20ng/㎖의 간 세포 증식 인자(HGF사 제조)를 포함하는 혈청 비함유 DMEM에서 5일간 배양하고, 그 후 10ng/㎖의 온코스타틴 M(R & D사 제조) 및 10nM의 덱사메타손 (와코 준야쿠 가부시키가이샤 제조)를 배지에 첨가하고, 추가로 15일간 배양했다. 배양 종료 후의 세포를 행크스 평형염 용액(Gibco사 제조)에 현탁하고 약 1×10⁷개/㎖로 하여, 본 발명의 조성물로서 사용했다.

간 질환 이환 동물 모델의 제작

마이크로 미니 돼지를 이용하여 이하의 수순으로 간 질환(비알코올성 지방성 간 질환(NAFLD)) 이환의 동물 모델을 제작했다.

약 7개월령(체중 약 10㎏)의 수컷 마이크로 미니 돼지(계통: Fuji Micromini Pig)를 후지 마이크라 가부시키가이샤로부터 구입하고, 12개체에 대해서 자연 환기, 온도: 20 ± 5℃, 상대 습도: 55 ± 25%, 조명 사이클: 7:00 ~ 19:00가 밝은, 19:00 ~ 7:00가 어두운 사육 환경의 하, 통상 사료인 고형 사료 MP-A(오리엔탈 코보 가부시키가이샤 제조, 함유 콜린: 0.29%, 함유 조(粗) 단백질: 15.3%)를 사료로 하고, 1일 300g 급이하여 순화(馴化)를 실시했다. 또한, 급이는 각 일의 8:00 경에 실시했다.

1주간 정도의 순화 기간의 종료 후의 정상적인 12개체(정상 개체)의 혈액 검사를 실시했다. 구체적으로는 정상적인 12개체의 각각에 대해 정맥혈의 채혈을 실시하여 혈청을 얻고, 얻어진 혈청 시료를 이용하여 이하의 (1) ~ (6)의 각 항목에 대해 측정을 실시하고, 그 측정값을 「정상값」으로 했다. (1) ~ (6)의 각 항목과, 그 정상값은 이하와 같았다.

(1) 혈중 총 콜레스테롤 농도: 214㎎/dl

(2) 혈중 알부민 농도: 4.192㎎/dl

(3) 헤파플라스틴 테스트(HPT)의 값: 21.9%

(4) 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도: 0.095㎍/㎖

(5) 혈중 알라닌 아미노 트랜스페라아제(ALT) 농도: 32U/l

(6) 혈중 히알루론산 농도: 32ng/㎖

상기 (1) ~ (6)의 각 항목의 측정은 이하의 방법 및 키트 등을 이용하여 실시했다.

(1) 혈중 총 콜레스테롤 농도에 대해서는 콜레스테롤 탈수소 효소(UV)법을 이용하여 측정했다.

(2) 혈중 알부민 농도에 대해서는 네펠로메트리(nephelometry)(BCP 개량법)을 이용하여 측정했다.

(3) 헤파플라스틴 테스트(HPT)값에 대해서는, 응고 시간 측정을 이용하여 측정했다.

(4) 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도에 대해서는 Type Ⅳ collagen ELISA kit, ACB (후나코시 가부시키가이샤 제조)를 이용하여 측정했다.

(5) 혈중 알라닌 아미노 트랜스페라아제(ALT) 농도에 대해서는, JSCC 표준화 대응법을 이용하여 측정했다.

(6) 혈중 히알루론산 농도에 대해서는 라텍스 응집 면역 비탁법을 이용하여 측정했다.

정상값을 측정한 후, 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 CDAA 사료 (RESERCH DIETS사 제조, 제품 번호: A15022101)를 사료로 하여, 1일 300g 급이하고, 동일한 사육 환경 하, 16주간에 걸쳐 자유 섭이에 의해 사육했다. 또한, 급이는 각 일의 8:00 경에 실시했다. 16주간에 걸친 자유 섭이에 의해 사육한 후의 12개체를 간 질환 이환 모델로 했다. 12개체의 간 질환 이환 모델에 대해서, 정상 개체와 동일하게 혈액 검사를 실시했다.

얻어진 간 질환 이환 모델 중 1개체의 간 조직을 취출하여 생검 사진을 얻었다. 생검 사진을 도 1에 나타낸다. 도 1의 생검 사진에서 회색으로 표시한 부분은 간 세포를 나타내고, 백색의 작은 입상 부분은 지방(지방 방울)을 나타낸다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 마이크로 미니 돼지의 간 조직에서는 정상의 간 조직에서는 확인되지 않는, 다량의 지방(지방 방울)의 간 세포로의 침착이 발생하고 있고, 생검 사진으로부터도 간 질환의 소견이 확인되었다.

또한, 12개체의 간 질환 이환 모델의 혈액 검사의 결과는 이하와 같았다. 이들 측정값을 「이환값」으로 했다.

(1) 혈중 총 콜레스테롤 농도: 87㎎/dl

(2) 혈중 알부민 농도: 1.768㎎/dl

(3) 헤파플라스틴 테스트(HPT)의 값: 6.9%

(4) 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도: 0.998㎍/㎖

(5) 혈중 알라닌 아미노 트랜스페라아제(ALT) 농도: 246U/l

(6) 혈중 히알루론산 농도: 51ng/㎖

상기 혈액 검사의 결과로부터 간 질환의 소견(마커)인, (1) 혈중 총 콜레스테롤 농도의 저하, (2) 혈중 알부민 농도의 저하, (3) HPT값의 저하, (4) 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도의 상승, (5) 혈중 ALT 농도의 상승 및 (6) 혈중 히알루론산 농도의 상승이 확인되었다.

이와 같이, 얻어진 간 질환 이환 모델은 생검 사진에 의한 소견 및 혈액 검사에 의한 소견으로부터, 간 질환(NAFLD)에 외부 삽입 가능한 간 질환 이환 모델이었다.

< 실시예: 치수 줄기 세포를 포함하는 조성물의 적용에 의한 간 질환의 치료 효과의 검토 >

상술한 방법에 의해 조제된, 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물을, 상술한 방법에 의해 제작된 간 질환 이환 모델의 비장에 적용하여, 본 발명의 조성물의 간 질환 치료 효과에 대해 검토했다.

상술한 방법에 의해 제작된 12개체의 간 질환 이환 모델을, 본 발명의 조성물을 적용하는 6개체의 적용군과, 적용하지 않는 6개체의 대조군으로 구분했다.

적용군에는 이하의 방법에 의해, 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물을 간 질환 이환 모델의 비장에 적용했다. 우선, 적용군의 6개체에 대하여, 본 발명의 조성물의 적용 개시의 전날에, 타크로리무스(제품명: 프로그라프(등록 상표) 과립, 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 제조)를, 1회의 프로그라프 투여량이 0.075㎎/㎏ 체중이 되도록, 이른 아침과 밤의 2회 경구 투여하여 면역 억제를 실시했다(1일의 총 투여량은 0.15㎎/㎏ 체중). 다음에, 상술한 방법에 의해 제작된 본 발명의 조성물(치수 줄기 세포를 약 1×10⁷개/㎖ 포함)을, 1㎖ 주사기(Terumo사 제조, 제품 번호: SS-01T)를 사용하여, 적용군의 6 개체의 비동에 주사했다. 적용 개시 4주간 후에, 각 개체에 대해 정맥혈의 채혈을 실시하여 혈청을 얻고, 얻어진 혈청 시료를 사용하여 혈액 검사를 실시했다. 또한, 본 발명의 조성물 적용의 당일에, 프로그라프(등록 상표) 주사액(5㎎/㎖)을, 1회의 프로그라프 투여량이 0.075㎎/㎏ 체중이 되도록, 생리 식염액(오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 제조, 제품 번호: D05352) 100㎖에 용해하고, 이른 아침과 밤의 2회 정맥 내 투여하여 면역 억제를 실시했다(1일의 총 투여량은 0.15㎎/㎏ 체중). 본 발명의 조성물 적용의 다음날 이후는, 프로그라프(등록 상표) 주사액(5㎎/㎖)을, 1회의 프로그라프 투여량이 0.05㎎/㎏ 체중이 되도록, 생리 식염수 100㎖에 용해하여, 이른 아침과 밤의 2 회 정맥 내 투여하여 면역 억제를 실시했다(1일의 총 투여량은 0.10㎎/㎏체중). 또한, 본 발명의 조성물 적용의 다음날 이후는, 각 개체의 프로그라프의 혈중 농도를 매일 측정하여, 정맥혈 중의 프로그라프 농도가 약 0.013㎎/㎖가 되도록, 1.5㎎(프로그라프 주사액(5㎎/㎖) 300㎕)의 프로그라프를 200㎖의 생리 식염수에 용해한 프로그라프 생리 식염수 용액을 적절하게 정맥내 투여하여 면역 억제를 유지했다. 대조군에서는 프로그라프 대신 동량의 생리 식염수를 투여했다.

적용군 및 대조군의 각각의 혈액 검사의 결과(6 개체의 평균값: 「처치값」)와, 정상값 및 이환값을 항목별로 정리한 그래프를 도 2~도 6에 나타낸다. 도 2~도 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 적용군에서는 혈액 검사에서의 간 질환의 각 마커가, 본 발명의 조성물의 적용 개시 4주간에서 정상값에 근접하고 있고(이환값으로부터 처치값으로의 추이), 이는 본 발명의 조성물을 적용함으로써 간 질환이 치유되고 있는 것을 의미하는 것이다. 또한, 도면에는 나타나 있지 않지만, 본 발명 조성물의 적용 개시 4주간 후의 혈액 검사에서, 헤파플라스틴 테스트(HPT)의 값은 11.0%이고, 혈중 Ⅳ형 콜라겐 농도는 0.382㎍/㎖였다. 이들 간 질환 마커도, 본 발명 조성물의 적용 개시 4주간에서 정상값에 근접하는 경향을 나타내고 있고, 본 발명의 조성물을 적용함으로써 간 질환이 치유되고 있는 것을 나타내는 것이다.

한편, 대조군에서는 간 질환의 각 마커가 이환값과 처치값 사이에서 거의 변화가 없었다. 구체적으로는 처치값이 정상값에 약간 접근하는 경향을 나타내거나, 처치값이 이환값보다도 정상값으로부터 멀어지는 결과가 되었다. 이들 결과는 간 질환이 거의 치유되고 있지 않거나, 오히려 진전되고 있음을 나타내는 것이다.

또한, 적용군으로부터 본 발명 조성물의 적용 개시 4주간 후에 1개체의 비장 조직을 취출하여 디아미노벤지딘(DAB)을 이용하여 염색하였다. 염색 후의 생검 사진을 도 7에 나타낸다. 도 7의 생검 사진에서 흑색의 작은 입상 부분이 간 세포를 나타낸다. 이 생검 사진으로부터 본 발명의 조성물을 적용한 비장에서는 간 조직이 재생되고 있고, 간의 기능을 보완하는, 소위 제2 간이 만들어지는 것을 알 수 있다. 병리학적 소견에 기초하면, 이 생검 사진의 결과는 추가적인 시간의 경과에 따라 간 조직의 재생이 더욱 진행되어, 간 질환의 치유에 이르는 병리상을 나타내는 것이다.

이상에서 혈액 검사 및 생검 사진에 기초하여, 사람 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물을 적용함으로써, 간 조직의 재생 및 그에 따른 간 질환의 예방 또는 치료라는 효과가 나타나는 것이 밝혀졌다. 또한, 이 결과로부터, 사람 치수 줄기 세포를 포함하는 본 발명의 조성물이 간 조직의 재생 및 간 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다고 할 수 있다.

(산업상 이용가능성)

본 발명에 의해 탈락치나 발거치로부터 용이하게 채취 가능한 사람 치수 줄기 세포를 이용하여, 간 조직의 재생 및 간 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제조하는 것이 가능해진다.

Claims

사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포를 유효 성분으로 포함하는, 대상체에서 비알코올성 지방성 간 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포가 6 내지 12세의 건강한 사람으로부터의 사람 유치 치수 줄기 세포인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포가 CD29, CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고, CD34, CD45 및 CD133을 발현하지 않는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포가 대상체의 체중 15㎏ 당 5×10⁶ 내지 4×10¹⁰개의 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포의 양으로 대상체에 투여되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대상체의 비동에 투여되는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 대상체가 사람 또는 사람이 아닌 포유동물인, 약제학적 조성물.
사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포의 유효량을 사람이 아닌 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 사람이 아닌 포유동물에서의 비알코올성 지방성 간 질환의 예방 또는 치료 방법.
제9항에 있어서,
상기 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포가 상기 사람이 아닌 포유동물의 비동에 투여되는, 비알코올성 지방성 간 질환의 예방 또는 치료 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 사람 치수 줄기 세포로부터 분화시킨 간세포가 6 내지 12세의 건강한 사람으로부터의 유치 치수 줄기 세포인, 비알코올성 지방성 간 질환의 예방 또는 치료 방법.
삭제