KR102545746B1 - Composition for cardiac regeneration comprising vascular cells derived from induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells expressing SDF1a - Google Patents

Composition for cardiac regeneration comprising vascular cells derived from induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells expressing SDF1a Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장 혈관 재생용 조성물로서, 상기 조성물은 내피 세포로 분화되는 줄기 세포 및 SDF-1α을 발현하도록 형질 전환된 중간엽 줄기세포를 함께 포함하며, 분화된 내피 세포에 의한 혈관 형성(Vasculogenesis)를 촉진함과 동시에, 혈관 신생에 관여하여 심장 혈관의 재생 및 심장 질환 치료 용도로 사용될 수 있다. The present invention is a composition for regenerating cardiac blood vessels, wherein the composition includes both stem cells differentiated into endothelial cells and mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α, and the composition is capable of forming blood vessels by differentiated endothelial cells (Vasculogenesis). At the same time as promoting, it can be used for the regeneration of cardiac blood vessels and the treatment of heart disease by being involved in angiogenesis.

Description

유도만능줄기세포 유래 혈관세포 및 SDF1a를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 심장 재생용 조성물 {Composition for cardiac regeneration comprising vascular cells derived from induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells expressing SDF1a}Composition for cardiac regeneration comprising vascular cells derived from induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells expressing SDF1a

본 발명은 혈관 세포로 분화되는 유도만능 줄기세포 및 SDF-1α를 발현하는 중간엽 줄기세포를 동시에 포함하는 심장 재생용 조성물에 대한 것이다.The present invention relates to a composition for heart regeneration comprising induced pluripotent stem cells differentiated into vascular cells and mesenchymal stem cells expressing SDF-1α at the same time.

허혈성 심장 질환(IHD)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나이다. 특히 심장에서 IHD의 대표적인 질환인 심근 경색증 (MI)은 심장 근육과 혈관 모두를 과도하게 손상시킨다. 관상 동맥 손상은 MI에서 가장 중요한 병태 생리학적 원인 중 하나이기 때문에 현재까지의 접근법은 주로 치료적 혈관 신생화를 통해 허혈성 심장에서 기능적으로 관류 가능한 혈관을 재구성하는 데 초점을 두었다. 이전 연구에서는 치료적 혈관 신생이 일반적으로 혈관 신생(angiogenesis) 및 혈관 형성(vasculogenesis)과 같은 두 가지 별개의 과정으로 구성되어 있다고 설명하였다. 혈관 신생은 기존 혈관의 성장을 의미하고, 혈관 형성은 내피 세포 (EC), 내피 전구 세포 (EPC) 또는 기타 유형의 줄기 세포에서 새로운 혈관을 생성하는 과정이다.Ischemic heart disease (IHD) is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. In particular, myocardial infarction (MI), a representative disease of IHD in the heart, excessively damages both the heart muscle and blood vessels. Because coronary artery injury is one of the most important pathophysiological causes of MI, approaches to date have primarily focused on reconstructing functionally perfusable vessels in the ischemic heart through therapeutic angiogenesis. Previous studies have demonstrated that therapeutic angiogenesis generally consists of two distinct processes: angiogenesis and vasculogenesis. Angiogenesis refers to the growth of existing blood vessels, and angiogenesis is the process of generating new blood vessels from endothelial cells (ECs), endothelial progenitor cells (EPCs) or other types of stem cells.

이전의 여러 연구에서 혈관 신생 유도가 혈관 재생에 효과적이라고 광범위하게 보고된 이후, 심장 질환 치료 전략의 일환으로 심장 혈관 신생을 촉진하는 효율적인 방법을 개발하기 위해 상당한 노력이 투자되었다. 예를 들어, 여러 전임상 설정에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 혈관 신생 인자를 재조합 단백질, 네이키드 DNA 플라스미드 형태로 투여한다. 또는 변형된 VEGF RNA는 혈관 형성, 심장 기능 및 장기 생존율을 실질적으로 개선하여 혈관 신생을 촉진하는 것이 손상된 심장을 치료하는 효과적인 치료 전략임을 나타낸다. 전임상 연구에서 얻은 고무적인 결과에도 불구하고 후속 임상 시험에서 얻은 결과는 지속적으로 결정적인 결과를 산출하지 못하였다. 전임상 결과와 임상 결과 사이의 이러한 불일치에 대한 한 가지 가능한 설명은 아마도 장기간의 혈관 신생 자극을 위해 특정 기간 동안 표적 영역에서 혈관 신생 인자를 표적화 하는 최적 수준을 유지하지 못했기 때문이고, 이는 기술적으로 어렵고 비용이 많이 소요된다. Since several previous studies have widely reported that angiogenesis induction is effective for blood vessel regeneration, significant efforts have been invested to develop efficient methods to promote cardiovascular angiogenesis as part of a heart disease treatment strategy. For example, in several preclinical settings, angiogenic factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF) and hepatocyte growth factor (HGF) are administered in the form of recombinant proteins, naked DNA plasmids. Alternatively, the modified VEGF RNA substantially improves angiogenesis, cardiac function and long-term survival, indicating that promoting angiogenesis is an effective therapeutic strategy for treating the damaged heart. Despite encouraging results from preclinical studies, results from subsequent clinical trials have consistently yielded inconclusive results. One possible explanation for this discrepancy between preclinical and clinical results is probably the failure to maintain optimal levels of targeting angiogenic factors in target regions for a specific period of time for long-term stimulation of angiogenesis, which is technically difficult and costly. this takes a lot

혈관 신생은 배아와 성인기 모두에서 발생하는 것으로 알려져 있지만 혈관 형성은 배아 발달 기간에만 나타나는 것으로 간주되었다. 그러나 최근의 연구에 따르면 혈관 형성은 초기 배아 발생에 국한되지 않을 뿐만 아니라 특정 생리적 역할을 가지고 있어 출생 후 혈관 질환의 병리 생리학에 기여할 수도 있다. 이 개념은 혈액 내 EC와 EPC가 모두 공존하고 혈관이 종양 성장 중에 새로운 방식으로 발전할 수 있다는 사실에 기반한다. 성인 척추 동물에서 순환하는 EPC의 식별은 출생 후 혈관 형성에서 골수에서 파생된 여러 유형의 세포에 대한 기능적 역할을 새롭게 제안하였다. 그 후 여러 연구에서 EPC, 단핵 세포(MNC) 및 중간 엽 줄기 세포(MSC)의 이식이 성인 허혈성 조직에서 치료적 혈관 신생을 유도했다고 보고하였다. 그러나 EC로의 분화 및 연속적인 혈관 형성에 대한 잠재력은 그들의 주요 메커니즘이 새로운 혈관 형성이 아닌 파라크린 효과에 의한 것이라는 것이 알려졌다. 최근에는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 포함한 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)에서 파생된 EC가 더 강력한 혈관 형성 잠재력을 보이는 것을 발견하고, 혈관 재생 접근 방식에 대한 적극적인 연구가 진행되고 있는 실정이다. Angiogenesis is known to occur in both embryonic and adult stages, but angiogenesis was considered to occur only during embryonic development. However, recent studies have shown that angiogenesis is not limited to early embryogenesis and has specific physiological roles, which may contribute to the pathophysiology of postnatal vascular disease. This concept is based on the fact that both ECs and EPCs in the blood coexist and blood vessels can develop in new ways during tumor growth. The identification of circulating EPCs in adult vertebrates has newly suggested a functional role for several types of bone marrow-derived cells in postnatal angiogenesis. Since then, several studies have reported that transplantation of EPCs, monocytes (MNCs), and mesenchymal stem cells (MSCs) induced therapeutic angiogenesis in adult ischemic tissues. However, their potential for differentiation into ECs and subsequent angiogenesis has been shown to be due to paracrine effects, rather than de novo angiogenesis, as their main mechanism. Recently, we found that ECs derived from human pluripotent stem cells (hPSCs), including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), exhibit more potent angiogenic potential, suggesting a potential for revascularization approaches. Active research is ongoing.

네이티브 신 혈관 형성(neovascularization)의 기초는 혈관 신생에 국한되지 않고 출생 후 혈관 형성도 포함하는 것이므로, 치료적 혈관 신생을 위해서는 허혈성 심장에서 혈관 재생을 달성하기 위한 모든 메커니즘을 종합적으로 유도하는 것에 초점을 두는 것이 필요하다. Since the basis of native neovascularization is not limited to angiogenesis but also includes postnatal angiogenesis, the focus is on comprehensively inducing all mechanisms to achieve revascularization in the ischemic heart for therapeutic angiogenesis. it is necessary to put

이에 본 발명자들은 CD31+ hiPSC 유래 내피 세포(hiPSC-EC) 및 SDF-1α를 지속적으로 분비하는 인간 골수에서 파생된 유전자 조작된 중간엽 줄기세포 (SDF-eMSC)를 포함하는 조성물을 이용하여, 심근 경색(MI) 유도된 심장의 혈관 형성 및 혈관 신생을 동시에 촉진하며, 특히 상기 조성물을 포함하는 3 차원(3D) 심장 패치를 이용하여 혈관 형성과 혈관 신생을 동시에 촉진함으로써 혈관을 재생하는 다각적인 접근 방식에 대한 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors used a composition comprising CD31+ hiPSC-derived endothelial cells (hiPSC-EC) and genetically engineered mesenchymal stem cells (SDF-eMSC) derived from human bone marrow that continuously secrete SDF-1α to prevent myocardial infarction. (MI) A multifaceted approach to regenerate blood vessels by simultaneously promoting blood vessel formation and angiogenesis of the induced heart, and in particular, by simultaneously promoting blood vessel formation and angiogenesis using a three-dimensional (3D) cardiac patch containing the composition completed the present invention for.

따라서, 본 발명의 목적은 내피 세포로 분화되는 줄기 세포 및 SDF-1α을 발현하도록 형질전환된 중간엽 줄기 세포를 포함하는 심장 혈관 재생용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for cardiovascular regeneration comprising stem cells differentiated into endothelial cells and mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내피 세포로 분화되는 줄기 세포 및 SDF-1α을 발현하도록 형질전환된 중간엽 줄기세포를 포함하는 심장 혈관 재생용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for cardiovascular regeneration comprising stem cells differentiated into endothelial cells and mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 내피 세포로 분화되는 줄기 세포 및 SDF-1α을 발현하도록 형질전환된 중간엽 줄기세포를 포함하는 심장 혈관 재생용 조성물에 대한 것이다. The present invention relates to a composition for cardiovascular regeneration comprising stem cells differentiated into endothelial cells and mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α.

본 발명의 상기 심장 혈관 재생용 조성물은 기존 혈관을 성장시키는 혈관 신생(angiogenesis) 및 내피 세포(EC), 내피 전구 세포(EPC) 또는 다양한 유형의 줄기세포로부터 새로운 혈관을 생성하는 혈관 형성(vasculogenesis)에 함께 작용하며, 특히 줄기 세포로부터 분화된 내피 세포와, 이로부터의 혈관 형성을 촉진하는 역할을 하는, SDF-1α을 발현하는 중간엽 줄기세포를 함께 포함하고 있는 것에 특징을 가진다. The composition for cardiovascular regeneration of the present invention is used for angiogenesis to grow existing blood vessels and vasculogenesis to create new blood vessels from endothelial cells (EC), endothelial progenitor cells (EPC) or various types of stem cells. In particular, it is characterized in that it includes both endothelial cells differentiated from stem cells and mesenchymal stem cells expressing SDF-1α, which play a role in promoting blood vessel formation therefrom.

본 명세서에서 "내피 세포(Endothelial cell)"는 혈관의 내강과 맞닿은 상피 조직을 의미하며, 본 발명에서는 특히 심장 내막 세포, 혈관 내피 세포 또는 심장 혈관 내피세포를 의미하는 것일 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 내피 세포는 줄기 세포로부터 분화된 것일 수 있으며, 상기 줄기 세포는 그 종류에 특별히 제한되는 것은 아니나, 인간 배아줄기세포(hESC) 및 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(hPSC), 중간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유도 만능 줄기세포일 수 있다. In the present specification, "endothelial cell" means an epithelial tissue in contact with the lumen of a blood vessel, and in the present invention, it may mean an endothelial cell, a vascular endothelial cell, or a heart vascular endothelial cell in particular. In addition, in one embodiment of the present invention, the endothelial cells may be differentiated from stem cells, and the stem cells are not particularly limited to the type, but include human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC). It may be human pluripotent stem cells (hPSC) and mesenchymal stem cells, preferably human induced pluripotent stem cells.

본 명세서에서 "SDF-1α"는 93의 아미노산을 포함하고 10.7 kDa의 분자량을 갖는 비당화 단백질로, 다양한 면역 세포를 염증성 활막으로 이동시키는 역할을 하는 케모카인이며, 혈관 내피 세포에서 생성되어, 혈관 전구세포를 불러들이는 역할을 수행하는 물질이다. 즉, 혈관 신생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 SDF-1α는 인간으로부터 유래된 것일 수 있으며, 본 발명에서는 중간엽줄기세포(MSC)를 형질 전환하여, SDF-1α을 계속적으로 발현할 수 있도록 제작하였다. In the present specification, "SDF-1α" is an aglycosylated protein containing 93 amino acids and having a molecular weight of 10.7 kDa. It is a chemokine that plays a role in moving various immune cells to the inflammatory synovial membrane, and is produced in vascular endothelial cells and is a vascular progenitor. It is a substance that plays a role in calling cells. That is, it is known to be involved in angiogenesis. The SDF-1α of the present invention may be derived from humans, and in the present invention, mesenchymal stem cells (MSC) were transformed to continuously express SDF-1α.

상기 용어 "중간엽줄기세포"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 중간엽줄기세포는 골수 유래 혹은 배아 유래일 수 있으며, hTERT 및 c-Myc 유전자가 도입된 것일 수 있다.The term "mesenchymal stem cell" refers to multipotent stromal cells capable of differentiating into various cells including osteocytes, chondrocytes and adipocytes. Mesenchymal stem cells can be differentiated into cells of specific organs such as bone, cartilage, fat, tendon, nerve tissue, fibroblasts and muscle cells. These cells can be isolated or purified from adipose tissue, bone marrow, peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis, mesoderm-derived tissue, and the like. In addition, the mesenchymal stem cells may be immortalized. Specifically, the mesenchymal stem cells may be bone marrow-derived or embryo-derived, and hTERT and c-Myc genes may be introduced.

본 발명의 심장 혈관 재생용 조성물은 일부가 패치 형태로 제조된 것일 수 있다. 상기 패치는 심장 유래 세포외 기질(hdECM)에 SDF-eMSC를 혼합하여 제조된 패치를 의미한다. 상기 세포외 기질은 물리적 방법으로 탈세포화 및 분쇄되어 입자상이나 매트릭스 상태로 준비될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법으로 제작될 수 있다. 상기 패치에는 비타민 B2를 추가로 포함할 수 있다. A part of the composition for cardiovascular regeneration of the present invention may be prepared in the form of a patch. The patch refers to a patch prepared by mixing SDF-eMSC with heart-derived extracellular matrix (hdECM). The extracellular matrix may be prepared in a particulate or matrix state by decellularization and pulverization by physical methods, and may be prepared by a method known in the art to which the present invention belongs. The patch may further contain vitamin B2.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 3D 프린터를 통해 제작된 폴리카프로락톤 지지체에, SDF-eMSC, hdECM 및 비타민 B2를 혼합하여 hdECM 패치를 구축하였다. 상기 SDF-eMSC는 약 1x104~1x106 cell/ml, hdECM 1~20 mg/ml 및 0.0002~0.02% (w/v)의 비타민 B2를 혼합하여 hdECM 패치를 구축할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the hdECM patch was constructed by mixing SDF-eMSC, hdECM, and vitamin B2 with a polycaprolactone support fabricated through a 3D printer. The SDF-eMSC may construct a hdECM patch by mixing about 1x10 4 to 1x10 6 cell/ml, hdECM 1 to 20 mg/ml, and 0.0002 to 0.02% (w/v) of vitamin B2, but is not limited thereto. no.

본 발명의 상기 심장 혈관 재생용 조성물은 세포 치료제로서, 약학 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 심장 질환의 치료 효과를 가지는 것이며, 상기 심장 질환은 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 허혈성 심장질환, 심근 경색, 동맥경화증, 협심증 또는 혈관 폐색 등을 포함할 수 있다. The composition for cardiovascular regeneration of the present invention is a cell therapeutic agent and may be a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition has a therapeutic effect on heart disease, and the heart disease may include, but is not limited to, ischemic heart disease, myocardial infarction, arteriosclerosis, angina pectoris, or vascular obstruction.

따라서 상기 조성물에는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염 으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.Therefore, the composition may be used in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt. The salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and organic acids and inorganic acids can be used as the free acid. The organic acid is not limited thereto, but citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, Includes glutamic acid and aspartic acid. In addition, the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.

본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 세포외기질(ECM)및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further include pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, extracellular matrix (ECM), and combinations thereof. .

상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.The carrier may be included in about 1% by weight to about 99.99% by weight, preferably about 90% by weight to about 99.99% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, and the pharmaceutically acceptable additives are about 0.1% by weight. % to about 20% by weight.

상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 주사제, 캅셀제 또는 패치제 형태일 수도 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition may be prepared in a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and excipient according to a conventional method, or prepared by placing it in a multi-dose container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, injection, capsule or patch, and may further include a dispersing agent or stabilizer, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심장 혈관을 재생하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for regenerating cardiovascular blood vessels, comprising the step of administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.The subject may be a mammal, specifically a human. The administration route and dosage of the pharmaceutical composition may be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method and dosage may be selected by a person skilled in the art within an appropriate range. In addition, the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have therapeutic effects on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination preparation with other drugs.

상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내, 심장 내 투여가 있다.When the pharmaceutical composition is administered parenterally, examples include subcutaneous, ocular, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, intraorbital, intracerebral, intracranial, intravertebral, intraventricular, intrathecal, There are intranasal, intravenous, and intracardiac administration.

상기 투여는, 예를 들어, 내피 세포(EC)를 발현하는 유도만능 줄기세포(hiPSC-EC) 및 SDF-1α를 발현하는 중간엽줄기세포(SDF-eMSC)를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것일 수 있으며, 상기 SDF-eMSC는 세포외 기질과 혼합되어, 패치 형태로 제작된 것일 수 있다. The administration may be, for example, simultaneous or sequential administration of induced pluripotent stem cells (hiPSC-EC) expressing endothelial cells (EC) and mesenchymal stem cells (SDF-eMSC) expressing SDF-1α. In addition, the SDF-eMSC may be mixed with an extracellular matrix and manufactured in the form of a patch.

본 발명의 심장 혈관 재생용 조성물은, 내피 세포로 분화되는 줄기 세포 및 SDF-1α을 발현하도록 형질전환된 중간엽 줄기세포가 병용 투여되어, 파라크린 효과로 인하여 분화된 내피 세포에 의한 혈관 형성(Vasculogenesis)를 촉진함과 동시에, 혈관 신생에도 작용하여, 심장 혈관을 효율적으로 재생하고, 심장 질환을 치료하는 효과를 가진다. The composition for cardiovascular regeneration of the present invention, stem cells differentiated into endothelial cells and mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α are co-administered to form blood vessels by differentiated endothelial cells due to the paracrine effect ( Vasculogenesis) and at the same time act on angiogenesis, thereby efficiently regenerating cardiovascular blood vessels and having the effect of treating heart disease.

도 1은 hiPSC로부터 CD31+ 내피 세포(EC) 생성하고, in vitro에서 hiPSC-EC 및 HUVEC 세포의 EC 특이적 마커의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 hiPSC-EC로부터 발현되는 EC 특이적 단백질의 면역 형광 이미지를 확인한 것이다.
도 3은 MI 유발 8 주후에 경색 영역 (IZ), 경계 영역 (BZ) 및 원격 영역에서 로다민 결합 IB4 (빨간색)로 염색된 모세 혈관 관류의 이미지 및 IZ (m), BZ (n) 및 원격 영역 (o)의 mm2 당 모세관 밀도를 정량화한 결과이다. 스케일 바 : 100 μm. 데이터는 평균 ± SD.; 대조군 n = 5; hiPSC-EC-IN 그룹 n = 5. * p <0.05; 통계 분석은 양측 t- 검정을 사용하여 수행되었다.
도 4는 hiPSC-EC-GFP (녹색), 로다민 결합 IB4 (빨간색) 및 EC 그룹의 DAPI (파란색)를 사용한 대표적인 면역 염색 이미지이다.
도 5는 MI 유발 후 좌심실 박출율 (EF) 및 좌심실 단축율 (FS)을 나타낸 결과이며, hiPSC-EC 처리군과 미처리군의 2, 4, 8주차 결과를 측정한 것이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군 n=5; EC 그룹 n=6. * 대조군과 비교하여 p<0.05; 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 다음 Tukey 방법과의 다중 비교를 수행하였다.
도 6은 MI를 유발한 후, 치료를 시행하지 않은 Pre 및 8 주 시점에서, hiPSC-EC 처리군과 미처리군의 M-모드 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 MI 유발 후 1주, 2, 4, 8주마다 좌심실 내부 확장기 치수 (LVIDd), 좌심실 내부 수축기 치수 (LVISd), 상대 벽 두께 (RWT), 중격 벽 두께 (SWT), 후방 벽 두께 (PWT)를 측정하여 hiPSC-EC 투여군과 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군 n=5; EC 그룹 n=6. * 대조군과 비교하여 p<0.05; 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 다음 Tukey 방법과의 다중 비교를 수행함.
도 8은 심근 경색 8 주 후 수집된 심장에 Masson의 trichrome으로 염색된 무처리군 및 hiPSC-EC 처리군의 대표 이미지와, 섬유증 비율(우상) 및 생존성 심근(우하)의 정량 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군n=5; hiPSC-EC-IN에서 n=5. * p <0.05; 통계 분석은 양측 t-검정을 사용하여 수행되었음. 스케일 바 : 2000 μm.
도 9는 제작된 SDF-eMSC의 형태적 특성을 관찰한 것이다.
도 10은 제작된 SDF-eMSC 및 골수 유래 MSC의 MSC 양성 및 음성 마커의 발현을 비교한 결과이다.
도 11은 SDF-eMSC와 골수 유래 MSC에서 SDF-1α의 분비량을 비교한 결과이다.
도 12는 SDF-eMSC의 PDL 증가량을 확인한 결과이다.
도 13은 SDF-eMSC 계대 배양 시, 이로부터 분비되는 계대별 SDF-1α의 분비량을 측정한 결과이다.
도 14는 SDF-eMSC의 핵형 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 SDF-eMSC 및 BM-MSC를 배양한 30% 배양액을 hiPSC-EC에 처리하고, RT- PCR을 수행하여 혈관 신생 특성과 관련한 유전자 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 16 및 도 17은 hiPSC-EC와 HUVEC 세포에 SDF-eMSC-CM 30%를 처리한 경우와, BM-MSC-CM 30%를 처리한 경우 각각의 세포 이동 분석 결과를 나타낸 것이다. hiPSC-EC를 트랜스 웰 (위)에 배치하고 다른 배지 (EGM, EBM, BM-MSC-CM 및 SDF-eMSC-CM)를 트랜스 웰 (아래)에 7 시간 동안 배치하였다. 튜브 형성의 대표 이미지 및 이동 영역 백분율의 정량화 결과이다. 데이터는 평균 ± SD; EGM n = 3; EBM n = 3; BM-MSC-CM n = 3; SDF-eMSC-CM n = 3이다. * p <0.05; 통계 분석은 일원 분산 분석을 사용하고 Tukey 방법과의 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 18은 SDF-eMSC의 혈관 신생(angiogenesis)을 촉진여부를 확인하기 위해 Matrigel tube 형성 분석을 통해 세포의 혈관 형성 능력을 평가한 결과이다.
도 19는 SDF-eMSC가 EC 또는 심근 세포에 대한 직접적인 세포 보호 여부를 확인하기 위하여, 허혈성 손상을 유발한 뒤, SDF-eMSC를 처리한 후 이의 효과를 확인한 결과이다.
도 20은 SDF-eMSC와 hdECM을 이용하여 심장 패치를 만드는 과정을 도식화한 것이다.
도 21은 SDF-eMSC-PA로부터 SDF1α 방출 동역학을 측정한 결과이다.
도 22는 MI 후 좌심실 박출율 (EF) 및 좌심실 단축율 (FS)에 대한 결과로서, MI 유발 후 2, 4, 8주에 대조군, 패치(PA) 단독, EC 단독, 병용(EC+PA) 투여 결과를 나타낸 것이다. 우측 이미지는 MI 유도 후, 치료없이 MI 후 1 주 및 8 주 시점에서 4 개 그룹의 M 모드의 대표 이미지를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군에서 n = 7; PA 전용 그룹에서 n = 10; EC 전용 그룹에서 n = 8; EC + PA 그룹에서 n = 11. * p <0.05; 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 다음 Tukey 방법과의 다중 비교를 수행하였다.
도 23은 MI 유발 후 1주, 2, 4, 8주마다 좌심실 내부 확장기 치수 (LVIDd), 좌심실 내부 수축기 치수 (LVISd), 상대 벽 두께 (RWT), 중격 벽 두께 (SWT), 후방 벽 두께 (PWT)를 측정하여 각 실험군 별로 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군에서 n = 7; PA 전용 그룹에서 n = 10; EC 전용 그룹에서 n = 8; EC + PA 그룹에서 n = 11. * p <0.05; 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 다음 Tukey 방법과의 다중 비교를 수행하였다.
도 24는 MI 유발 후, 각 처리군에 따른 섬유증 비율 및 생존 가능한 심근의 위험도를 백분율로 나타낸 결과이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군 n = 5; PA 단일군 n = 5; EC 단일군 n = 5; EC + PA 병용투여군 n = 5. * p <0.05; 통계 분석은 일원 분산 분석을 사용하고 Tukey 방법과의 다중 비교를 사용하여 수행되었다. 스케일 바 : 2000 μm.
도 25는 MI 유발 후 8 주차에 PV 루프를 이용한 정상 상태에 대한 혈역학 적 압력 및 부피 (PV) 곡선의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다.
도 26은 수축 시 일회 박출량(SV), 분당 심 박출량(CO) LV에서 배출된 혈액량(Vmax)에 대한 각 실험군의 영향을 나타낸 결과이다. 데이터는 평균 ± SD; 대조군에서 n = 4; PA 단독군에서 n = 4; EC 단독군에서 n = 4; EC + PA 병용 투여군에서 n = 4. * p <0.05; 통계 분석은 일원 분산 분석을 사용하고 Tukey 방법과의 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 27은 MI 유발 후, 최대 수축기에서 측정된 최대 압력(P max), 최대 압력 변화율(dP/dt max) 및 최소 압력 변화율 (dP/dt min)을 각 실험군 별로 측정하여 비교한 결과이다.
도 28은 SDF-eMSC-PA에 의한 심근 내 hiPSC-EC의 in vivo 활성을 확인하기 위한 GFP 발현 양상을 확인한 도면이다.
도 29는 MI 유발 후 hiPSC-EC 단독 투여군과 EC+PA 병용 투여군의 EC 분포를 확인한 것이며, 병용 투여 시, 모든 좌심실 영역내로 분포가 늘어난 것을 알 수 있다. 경색 영역 (IZ) 및 경계 영역 (BZ)에서 GFP 양성 혈관 직경의 정량화 결과이다. 스케일 바: 20 μm. 데이터는 평균 ± SD; EC 단독 n = 4; EC + PA 병용 n = 4. * p <0.05; 통계 분석은 일원 분산 분석을 사용하고 Tukey 방법과의 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 30은 MI 후 8 주에 경색 영역 (IZ), 경계 영역 (BZ) 및 원격 영역에 로다민 결합 IB4 (빨간색)로 염색된 모세 혈관 관류의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다.
도 31은 IZ, BZ 및 원격 영역의 mm2 당 모세관 밀도를 정량화한 결과이다. 스케일 바 : 100 μm. 데이터는 평균 ± SD; 대조군 n = 5; PA 단독 n = 5; EC 단독 n = 5; EC + PA 병용 투여 시 n = 7. * p <0.05; 통계 분석은 일원 분산 분석을 사용하고 Tukey 방법과의 다중 비교를 사용하여 수행되었다. N.S. 유의한 차이 없음.
도 32는 심근 경색 유발한 뒤 8 주 후 수집 한 심장 조직을 Masson의 trichrome으로 염색 한 4 개 그룹의 대표 이미지 및 모세혈관의 수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 MI 유발 심장 모델에 대하여, 수행된 hiPSC-EC + SDF-eMSC-PA 병용 투여 방법의 모식도 및 그 효과를 나타낸 도이다.1 is a result of confirming the mRNA expression levels of EC-specific markers in hiPSC-ECs and HUVEC cells after CD31+ endothelial cells (ECs) were generated from hiPSCs in vitro.
2 confirms immunofluorescence images of EC-specific proteins expressed from hiPSC-ECs.
Figure 3 shows images of capillary perfusion stained with rhodamine-conjugated IB4 (red) in the infarct zone (IZ), border zone (BZ) and remote zone 8 weeks after MI induction, and in IZ (m), BZ (n) and remote zones. This is the result of quantifying the capillary density per mm 2 of the area (o). Scale bar: 100 μm. Data are mean±s.d.; control n = 5; hiPSC-EC-IN group n = 5. *p <0.05; Statistical analysis was performed using two-tailed t-test.
Figure 4 is representative immunostaining images using hiPSC-EC-GFP (green), rhodamine-conjugated IB4 (red) and DAPI (blue) in the EC group.
5 shows the results of left ventricular ejection fraction (EF) and left ventricular shortening (FS) after MI induction, and the results of the hiPSC-EC treated and untreated groups were measured at 2nd, 4th, and 8th weeks. Data are mean ± SD; control n=5; EC group n=6. *p<0.05 compared to control; Statistical analysis was performed using two-way ANOVA followed by multiple comparisons with Tukey's method.
FIG. 6 shows M-mode representative images of the hiPSC-EC treated and untreated groups Pre and 8 weeks after MI was induced.
7 shows left ventricular intra-diastolic dimension (LVIDd), left ventricular intra-systolic dimension (LVISd), relative wall thickness (RWT), septal wall thickness (SWT), posterior wall thickness ( PWT) was measured and compared with the hiPSC-EC administration group. Data are mean ± SD; control n=5; EC group n=6. *p<0.05 compared to control; Statistical analysis was performed using two-way ANOVA followed by multiple comparisons with Tukey's method.
8 shows representative images of untreated and hiPSC-EC treated groups stained with Masson's trichrome in hearts collected 8 weeks after myocardial infarction, and quantitative results of fibrosis ratio (top right) and viable myocardium (bottom right). . Data are mean ± SD; Control n = 5; n=5 in hiPSC-EC-IN. *p <0.05; Statistical analysis was performed using two-tailed t-test. Scale bar: 2000 μm.
Figure 9 is the observation of the morphological characteristics of the fabricated SDF-eMSC.
Figure 10 is a result of comparing the expression of MSC positive and negative markers of the prepared SDF-eMSC and bone marrow-derived MSC.
11 is a result of comparing the secretion amount of SDF-1α in SDF-eMSC and bone marrow-derived MSC.
12 is a result of confirming the amount of PDL increase of SDF-eMSC.
13 is a result of measuring the secretion amount of SDF-1α for each passage secreted from SDF-eMSC when subcultured.
14 shows the results of karyotype analysis of SDF-eMSC.
15 shows the result of confirming gene expression patterns related to angiogenesis properties by treating hiPSC-EC with 30% culture medium in which SDF-eMSC and BM-MSC were cultured, and performing RT-PCR.
16 and 17 show results of cell migration analysis when hiPSC-EC and HUVEC cells were treated with 30% SDF-eMSC-CM and 30% BM-MSC-CM, respectively. hiPSC-ECs were placed on transwells (top) and different media (EGM, EBM, BM-MSC-CM and SDF-eMSC-CM) were placed on transwells (bottom) for 7 hours. Representative images of tube formation and quantification results of percentage migration area. Data are mean ± SD; EGM n = 3; EBM n = 3; BM-MSC-CM n = 3; SDF-eMSC-CM n = 3. *p <0.05; Statistical analyzes were performed using one-way analysis of variance and multiple comparisons with Tukey's method.
18 is a result of evaluating the blood vessel formation ability of cells through Matrigel tube formation analysis to determine whether SDF-eMSC promotes angiogenesis.
19 is a result of confirming the effect after inducing ischemic damage and then treating SDF-eMSC to confirm whether SDF-eMSC directly protects ECs or myocardial cells.
20 is a schematic diagram of a process of making a heart patch using SDF-eMSC and hdECM.
21 is a result of measuring SDF1α release kinetics from SDF-eMSC-PA.
22 shows the results of left ventricular ejection fraction (EF) and left ventricular shortening rate (FS) after MI, at 2, 4, and 8 weeks after MI induction of control group, patch (PA) alone, EC alone, combination (EC+PA) It shows the result of dosing. The images on the right show representative images of the M mode of the four groups at time points 1 week and 8 weeks after MI after MI induction, without treatment. Data are mean ± SD; n = 7 in control group; n = 10 in the PA-only group; n = 8 in the EC-only group; n = 11 in the EC + PA group. *p <0.05; Statistical analysis was performed using two-way ANOVA followed by multiple comparisons with Tukey's method.
23 shows left ventricular intra-diastolic dimension (LVIDd), left ventricular intra-systolic dimension (LVISd), relative wall thickness (RWT), septal wall thickness (SWT), posterior wall thickness ( PWT) was measured and compared for each experimental group. Data are mean ± SD; n = 7 in control group; n = 10 in the PA-only group; n = 8 in the EC-only group; n = 11 in the EC + PA group. *p <0.05; Statistical analysis was performed using two-way ANOVA followed by multiple comparisons with Tukey's method.
24 is a result showing the fibrosis rate and the risk of viable myocardium in percentage according to each treatment group after MI induction. Data are mean ± SD; control n = 5; PA single group n = 5; EC single group n = 5; EC + PA combination administration group n = 5. * p <0.05; Statistical analyzes were performed using one-way analysis of variance and multiple comparisons with Tukey's method. Scale bar: 2000 μm.
Figure 25 shows representative images of hemodynamic pressure and volume (PV) curves for steady state with a PV loop at week 8 after MI induction.
26 is a result showing the effect of each experimental group on stroke volume (SV), cardiac output per minute (CO), and blood volume (Vmax) discharged from LV during contraction. Data are mean ± SD; n = 4 in control group; n = 4 in the PA alone group; n = 4 in the EC alone group; n = 4 in EC + PA combination treatment group. *p <0.05; Statistical analyzes were performed using one-way analysis of variance and multiple comparisons with Tukey's method.
27 is a result of measuring and comparing the maximum pressure (P max ), maximum pressure change rate (dP/dt max), and minimum pressure change rate (dP/dt min) measured at the maximum systolic period after MI induction for each experimental group.
28 is a view confirming the GFP expression pattern for confirming the in vivo activity of hiPSC-EC in the myocardium by SDF-eMSC-PA.
FIG. 29 shows the EC distribution of the hiPSC-EC alone administration group and the EC+PA combination administration group after MI induction. Results of quantification of GFP-positive vessel diameters in the infarct zone (IZ) and border zone (BZ). Scale bar: 20 μm. Data are mean ± SD; EC alone n = 4; EC + PA combination n = 4. *p <0.05; Statistical analyzes were performed using one-way analysis of variance and multiple comparisons with Tukey's method.
30 shows representative images of capillary perfusion stained with rhodamine-conjugated IB4 (red) in the infarct zone (IZ), marginal zone (BZ) and distant zone at 8 weeks post MI.
31 is a result of quantifying the capillary density per mm 2 in the IZ, BZ, and remote areas. Scale bar: 100 μm. Data are mean ± SD; control n = 5; PA alone n = 5; EC alone n = 5; n = 7. * p <0.05; Statistical analyzes were performed using one-way analysis of variance and multiple comparisons with Tukey's method. NS No significant difference.
32 shows representative images of 4 groups of heart tissues collected 8 weeks after induction of myocardial infarction stained with Masson's trichrome and the number of capillaries quantified.
FIG. 33 is a schematic view of the hiPSC-EC + SDF-eMSC-PA combined administration method and its effect on the MI-induced cardiac model of the present invention.

이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail in order to specifically describe the present specification. However, the embodiments according to the present specification may be modified in many different forms, and the scope of the present specification is not construed as being limited to the embodiments described below. The embodiments herein are provided to more completely explain the present specification to those skilled in the art.

< 실험 방법 >< Experiment method >

실시예 1. 유도 만능 줄기세포 유래 내피 세포의 분화Example 1. Differentiation of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells

hiPSCs(CMC-hiPS-011)세포주는 KNIH에서 구입하였고, StemMACSTM iPSC-BREW (Milltenybiotec) 배지를 사용하여 Matri-gel에서 유지하였다. 그 후, 내피 세포로 분화시키기 위해 hiPSC를 Matrigel(Corning) 코팅 세포 배양 접시(Eppendorf)에 70,000 cell/cm2 로 시드하였다. 배양 후 5μM Y-27632(Tocris)를 처음 24 시간 동안 첨가하였다. 배지는 매일 교체하고, hiPSC는 세포가 60% confluent될 때까지 3일 동안 iPSC-BREW에서 배양하였다. 0일에 세포를 접종하고 CHIR99021 (Tocris) 6μM/ml로 처리, 1 일 후에 배양 배지를 교체하고 CHIR99021 2 μM/ml를 RPMI1640 + B27(-, 인슐린)에서 다시 처리하였다. 2~5 일 동안 인간-내피-무혈청-배지(Human-Endothelial-Serum-Free-Medium, Thermofiser)에서, 보충제로 사이토 카인 (20ng/ml bFGF (RnD 시스템), 10ng/ml EGF(RnD 시스템), 50ng/ml VGFG (RnD system)를 포함한 10μg/ml 인간 혈장 피브로넥틴 (Thermofisher)을 3일간 매일 교체하였다. 5 일 후 HESFM 배양액의 VEGF 농도를 30ng/ml로 낮추고 2 일에 1 회씩 7 일간 선별을 수행하였다. The hiPSCs (CMC-hiPS-011) cell line was purchased from KNIH and maintained on Matri-gel using StemMACSTM iPSC-BREW (Milltenybiotec) medium. Thereafter, to differentiate into endothelial cells, hiPSCs were seeded on Matrigel (Corning) coated cell culture dishes (Eppendorf) at 70,000 cells/cm 2 . After incubation, 5 μM Y-27632 (Tocris) was added for the first 24 hours. The medium was changed every day, and hiPSCs were cultured in iPSC-BREW for 3 days until the cells were 60% confluent. On day 0, the cells were inoculated and treated with CHIR99021 (Tocris) 6 μM/ml, and after 1 day, the culture medium was replaced and CHIR99021 2 μM/ml was treated again in RPMI1640 + B27 (-, insulin). In Human-Endothelial-Serum-Free-Medium, Thermofiser for 2-5 days, cytokines (20ng/ml bFGF (RnD system), 10ng/ml EGF (RnD system) as a supplement) , 10 μg/ml human plasma fibronectin (Thermofisher) containing 50 ng/ml VGFG (RnD system) was replaced daily for 3 days After 5 days, the VEGF concentration in the HESFM culture was lowered to 30 ng/ml and screening was performed once every 2 days for 7 days. performed.

실시예 2. SDF-1α 발현 MSC의 합성 Example 2. Synthesis of MSC expressing SDF-1α

BM-MSC (Catholic MASTER Cells)는 가톨릭 세포 치료 연구소 (CIC, Seoul, Korea)로부터 입수하였다. MSC를 불멸화하기 위해 hTERT 및 c-Myc를 포함하는 복제 불능 렌티 바이러스 벡터를 준비하고 세포로 형질 도입하였다. SDF-1α를 발현하는 불멸화된 MSC를 생산하기 위해, 인간 SDF-1α와 함께 복제 불가능한 렌티 바이러스 벡터를 준비하고 추가로 불멸화된 MSC로 형질 도입시켰다. 그런 다음 SDF-eMSC를 제한 희석 방법에 의해 단일 클론 세포 집단으로 분리하였다. 최종 단일 클론 세포는 SDF-1α 단백질 분비, 증식 속도 및 기타 MSC 표현형에 의해 선택되었다. SDF-eMSC는 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco), 10 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, Peprotech) 및 2μg/ml 독시사이클린 (Clonetech)이 보충된 저당 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM, Gibco)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양되었다.BM-MSC (Catholic MASTER Cells) were obtained from Catholic Cell Therapy Institute (CIC, Seoul, Korea). To immortalize MSCs, a replication-defective lentiviral vector containing hTERT and c-Myc was prepared and transduced into the cells. To produce immortalized MSCs expressing SDF-1α, a replication-defective lentiviral vector was prepared along with human SDF-1α and further transduced into immortalized MSCs. SDF-eMSCs were then isolated into monoclonal cell populations by a limiting dilution method. The final monoclonal cells were selected by SDF-1α protein secretion, proliferation rate and other MSC phenotypes. SDF-eMSCs were grown in low-sugar Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech) and 2 μg/ml doxycycline (Clonetech). was cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions.

실시예 3. 효소 면역 분석법Example 3. Enzyme Immunoassay

효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)을 수행하여 SDF-eMSC (또는 패치)로부터 SDF-1α의 방출 수준을 확인하였다. 첫 번째로 계대에 따른 SDF-eMSC의 SDF-1α 방출 수준을 확인하기 위해, SDF-eMSC는 독시사이클린이 없는 10ml 완전 배지가 있는 100mm 접시 (코닝)에 5x105 세포의 밀도로 시딩되었다. 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48시간 후 세포를 탈착시켜 회수한 후, 다시 독시사이클린이 없는 1ml 완전 배지에 접종하였다. 48시간 후에 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 조절된 배지를 수확하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to confirm the level of release of SDF-1α from SDF-eMSCs (or patches). First, to determine the level of SDF-1α release from SDF-eMSCs following passage, SDF-eMSCs were seeded at a density of 5×10 5 cells in 100 mm dishes (Corning) with 10 ml complete medium without doxycycline. After 48 hours at 37° C. in a 5% CO 2 incubator, the cells were detached and recovered, and then inoculated into 1ml complete medium without doxycycline. Cell debris was removed by centrifugation after 48 hours and the conditioned medium was harvested.

두 번째로 BM-MSC와 SDF-eMSC의 SDF-1α의 방출수준을 비교하기 위해, 계대수 7에 해당하는 각각의 세포는 10ml의 독시사이클린이 없는 완전 배지가 있는 100mm 접시 (코닝)에 1x106 세포의 밀도로 시딩되었다. 5% CO2 인큐베이터에서 37

Figure 112020131022656-pat00001
에서 72시간 동안 배양 후, 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 조절된 배지를 수확하였다. SDF-eMSC 농도는 제조업체의 지침에 따라 Human SDF-1α ELISA 키트 (R&D Systems, DY350)를 사용하여 결정되었다. 450nm에서 샘플의 흡광도는 SpectraMAX 190 (Molecular Devices) 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다.Second, to compare the release level of SDF-1α from BM-MSC and SDF-eMSC, each cell corresponding to passage number 7 was plated with 1x10 6 cells in a 100 mm dish (Corning) with 10 ml of doxycycline-free complete medium. seeded at a density of 37 in a 5% CO 2 incubator
Figure 112020131022656-pat00001
After incubation for 72 hours, cell debris was removed by centrifugation and the conditioned medium was harvested. SDF-eMSC concentration was determined using the Human SDF-1α ELISA kit (R&D Systems, DY350) according to the manufacturer's instructions. The absorbance of the samples at 450 nm was measured using a SpectraMAX 190 (Molecular Devices) microplate reader.

실시예 4. 세포 증식 분석Example 4. Cell Proliferation Assay

SDF-eMSC의 증식 속도를 결정하기 위해 4x105 개의 세포를 T75 플라스크에 시드했다. 3~4 일 후 세포를 채취하고 일회용 혈구계(INCYTO)를 사용하여 트리판블루(Gibco) 배제법을 통해 증식률을 측정하였다. SDF-eMSC의 누적 세포 성장률 (population doubling level, PDL)은 세포 성장(PD)의 합에 의해 결정되었다. PDL은(logN-logN0)/log2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 N은 수확된 세포의 수이고 N0은 시드된 세포의 수이다.To determine the proliferation rate of SDF-eMSCs, 4 × 10 5 cells were seeded in T75 flasks. After 3 to 4 days, the cells were harvested and the proliferation rate was measured by trypan blue (Gibco) exclusion method using a disposable hemocytometer (INCYTO). The cumulative cell growth rate (population doubling level, PDL) of SDF-eMSC was determined by the sum of cell growth (PD). PDL was calculated using (logN-logN 0 )/log2, where N is the number of cells harvested and N 0 is the number of cells seeded.

실시예 5. MSC 마커 분석 Example 5. MSC marker analysis

MSC의 면역 표현형은 유세포 분석을 사용하여 분석되었다. 트립신을 사용하여 세포를 플라스크에서 분리한 다음 1500rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고 염색/세척 완충액 (2% FBS가 있는 PBS)에 재 현탁 시켰다. 염색을 위해 BM-MSC 및 SDF-eMSC를 염색/세척 완충액으로 세척하고 제조업체의 지침에 따라 Stemflow WP Human MSC 분석 키트 (BD)를 사용하여 4℃의 어두운 곳에서 30 분 동안 배양했다. MSC는 다음의 접합된 단일 클론 항체들을 이용하여 특성화되었다: CD90 FITC (클론: 5E10), CD105 PerCP-Cy5.5 (클론: 266), CD73 APC (클론: AD2) 및 PE 음성 칵테일(CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR). LSR FortessaTM 세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고 FlowJo_V10 또는 BD FACS Diva 소프트웨어로 분석하였다.The immunophenotype of MSCs was analyzed using flow cytometry. Cells were detached from the flask using trypsin, then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes and resuspended in stain/wash buffer (PBS with 2% FBS). For staining, BM-MSCs and SDF-eMSCs were washed with stain/wash buffer and incubated for 30 min at 4°C in the dark using the Stemflow WP Human MSC Assay Kit (BD) according to the manufacturer's instructions. MSCs were characterized using the following conjugated monoclonal antibodies: CD90 FITC (clone: 5E10), CD105 PerCP-Cy5.5 (clone: 266), CD73 APC (clone: AD2) and PE negative cocktail (CD34, CD11b). , CD19, CD45, HLA-DR). Flow cytometric analysis was performed using an LSR Fortessa ™ Cell Analyzer (BD Biosciences) and analyzed with FlowJo_V10 or BD FACS Diva software.

실시예 6. 튜브 형성 분석 Example 6. Tube formation assay

Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (500μl, Geltrex?? LDEV, Thermo Fisher)를 24 웰 플레이트에 첨가하고 30 분 동안 37℃에서 배양하여 고형화하였다. 1x105 cells의 hiPSC-EC 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 다양한 유형의 배지 (EGM, EBM, BM-MSC-CM 및 SDF-eMSC-CM)를 포함하는 각 Geltrex 코팅웰에 플레이팅한 다음, 37℃에서 5% CO2와 함께 9, 24, 48 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 고정을 위해 4% PFA를 첨가하고 세포를 광학 현미경을 사용하여 시각화하고 튜브 구조의 형성을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (500 μl, Geltrex® LDEV, Thermo Fisher) was added to a 24-well plate and incubated at 37° C. for 30 minutes to solidify. 1x10 5 cells of hiPSC-EC and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were plated on each Geltrex-coated well containing various types of media (EGM, EBM, BM-MSC-CM and SDF-eMSC-CM), and then , and incubated at 37°C with 5% CO 2 for 9, 24, and 48 hours. After removing the medium, 4% PFA was added for fixation, and the cells were visualized using a light microscope and the formation of tube structures was calculated using ImageJ software.

실시예 7. 내피 세포 이동 분석 Example 7. Endothelial cell migration assay

hiPSC-EC 및 HUVEC 세포 (3.5 x 104)를 EBM 기저 배지로 Transwell 삽입물 (8μm 기공)의 상부 층에 시드한 다음 배지 (EGM, EBM, BM-MSC- CM 및 SDF-eMSC-CM)를 포함하는 24-웰 플레이트에 분주하였다. 그 후 세포를 5 % CO2로 37

Figure 112020131022656-pat00002
에서 7 시간 동안 이동시켰다. 이동된 세포를 4 % PFA에 10 분간 고정하고 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (Sigma)을 사용하여 10 분간 염색하였다. Transwell 멤브레인을 증류수로 세척한 후 멤브레인의 윗면을 면봉으로 부드럽게 문질러 이동하지 않은 세포를 제거했다. 이동된 세포를 광학 현미경을 사용하여 계수하고 막의 염색된 영역을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.hiPSC-EC and HUVEC cells (3.5 × 10 4 ) were seeded on the top layer of Transwell inserts (8 μm pore) with EBM basal medium, then medium (EGM, EBM, BM-MSC-CM and SDF-eMSC-CM) were aliquoted into 24-well plates. The cells were then incubated at 37 with 5% CO 2
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moved for 7 hours. The migrated cells were fixed in 4% PFA for 10 minutes and stained with 0.1% crystal violet (Sigma) for 10 minutes. After washing the Transwell membrane with distilled water, the top surface of the membrane was gently rubbed with a cotton swab to remove non-migrating cells. Migrated cells were counted using a light microscope and the stained area of the membrane was calculated using ImageJ software.

실시예 8. hiPSC-EC의 자극 및 RT-PCRExample 8. Stimulation and RT-PCR of hiPSC-EC

hiPSC-EC (1x105)를 다양한 유형의 배지 (EGM, BM-MSC-CM 및 SDF-eMSC-CM)를 포함하는 6 웰 플레이트에 시드하고 배지를 매일 교체했다. 72 시간 후, 제조업체의 지침에 따라 플레이트의 세포에 0.5mL의 TRIzol 시약 (Life Technologies)을 첨가하여 총 RNA를 추출하였다. 1μg의 RNA에 대해, SuperScriptTM Reverse Transcriptase IV 및 랜덤 프라이머 (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성했다. SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)는 ABI Real-time PCR StepOne Plus (Applied Biosystems)를 사용하여 사이클링하는 동안 PCR 산물의 축적을 감지하는 데 사용되었다. RT-PCR은 3 회 이상의 반복 실험으로, 3회 수행되었다. 올리고 뉴클레오타이드 프라이머는 실시간 RT-PCR 시스템 서열 검출 소프트웨어 v2.3 (Applied Biosystems)을 사용하여 설계되었으며 그 서열은 표 1에 제시되어 있다. 제조업체의 지침에 따라 하우스 키핑 유전자인 18S rRNA 또는 GAPDH의 전사 수준으로 정규화된 CT 값을 사용하여 각 처리 그룹에 대해 각 유전자의 발현 수준의 배 차이를 계산했다.hiPSC-ECs (1×10 5 ) were seeded in 6-well plates containing different types of media (EGM, BM-MSC-CM and SDF-eMSC-CM) and the media was changed daily. After 72 hours, total RNA was extracted by adding 0.5 mL of TRIzol reagent (Life Technologies) to the cells in the plate according to the manufacturer's instructions. For 1 μg of RNA, cDNA was synthesized using SuperScript ™ Reverse Transcriptase IV and random primers (Invitrogen). SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used to detect accumulation of PCR products during cycling using an ABI Real-time PCR StepOne Plus (Applied Biosystems). RT-PCR was performed in triplicate, with at least three replicates. Oligonucleotide primers were designed using Real-Time RT-PCR System Sequence Detection Software v2.3 (Applied Biosystems) and their sequences are shown in Table 1. Fold differences in the expression levels of each gene were calculated for each treatment group using CT values normalized to the transcript levels of the housekeeping genes 18S rRNA or GAPDH according to the manufacturer's instructions.

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실시예 9. 신생아 랫트의 심근 세포 분리Example 9. Cardiomyocyte Isolation from Neonatal Rats

신생아 랫트의 심근 세포는 가톨릭대학교 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 지침에 따라 1 일령 Sprague-Dawley 랫트의 심장에서 분리되었다. 심실 조직을 HBSS(Welgene)에서 0.1% 트립신 용액 (Welgene)과 함께 4℃에서 밤새 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 다음날, 소화된 조직을 얼음 위의 페트리 접시로 옮기고 다진 다음 원뿔형 튜브에 수집했다. 소화 용액 [HBSS 중 콜라게나제 B 5ml (1mg/ml); Roche]를 심장 조직에 첨가하고 5ml 피펫을 사용하여 15 회 분쇄하고 부드럽게 교반하면서 37℃ 수조에서 5 분 동안 배양했다. 심근 세포를 포함하는 상청액을 분리 배지 [1X 항생제-항진균제 (Gibco)와 함께 20 % FBS (Gibco) 함유 DMEM]]로 옮기고, 소화되지 않은 심장 조직을 10ml의 소화 용액에 재현탁 시켰다. 추가 분해 단계를 수행하고 세포 함유 상청액을 수집하였다. 분해 단계를 5 회 반복한 후 1500rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고 분리 배지에서 세포 펠렛을 세척했다. 그런 다음 1500rpm에서 5 분간 원심 분리하고 Percoll (GE Healthcare, 17-5445-02) 밀도 그라데이션을 사용하기 위해 DPBS에서 세포 펠릿을 재현탁 하였다. 오염된 섬유아세포 및 EC는 3000rcf, 4℃에서 30 분 동안 Percoll 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 제거되었다. Percoll 밀도-구배 단계 후, 심근 세포를 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 분리 배지에 재현탁한 다음 1500rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고 분리 배지에서 세포 펠릿을 세척했다. 그런 다음 1500rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고 분리 매체에서 세포 펠릿을 재현 탁하였다. 그런 다음 0.1% 젤라틴(Welgene) 코팅된 배양 플레이트에 1x105 cells/cm2의 밀도로 도금하고 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 배지로는 비심근 세포의 성장을 억제하기 위해 FBS를 배제하였으며, 배지에는 말 혈청 (Sigma, H1138) 5 %와 항생제-항진균제(Gibco) 1X가 포함되어 있었다. 배지는 격일로 교체되었다. Cardiomyocytes from neonatal rats were isolated from the hearts of 1-day-old Sprague-Dawley rats according to guidelines approved by the Animal Care and Use Committee of The Catholic University of Korea. Ventricular tissue was incubated with 0.1% trypsin solution (Welgene) in HBSS (Welgene) overnight at 4° C. with gentle agitation. The next day, the digested tissue was transferred to a Petri dish on ice, minced and collected in a conical tube. Digestion solution [collagenase B 5 ml (1 mg/ml) in HBSS; Roche] was added to the heart tissue, triturated 15 times using a 5ml pipette and incubated for 5 minutes in a 37°C water bath with gentle agitation. The supernatant containing cardiomyocytes was transferred to isolation medium [DMEM containing 20% FBS (Gibco) with 1X antibiotic-antimycotic (Gibco)]] and undigested heart tissue was resuspended in 10 ml of digestion solution. A further digestion step was performed and the cell-containing supernatant was collected. The digestion step was repeated 5 times followed by centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes and washing the cell pellet in separation medium. Cell pellets were then resuspended in DPBS for centrifugation at 1500 rpm for 5 min and using a Percoll (GE Healthcare, 17-5445-02) density gradient. Contaminating fibroblasts and ECs were removed by Percoll density gradient centrifugation at 3000 rcf, 4°C for 30 min. After the Percoll density-gradient step, cardiomyocytes were transferred to a new conical tube, resuspended in isolation medium, centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes and the cell pellet washed in isolation medium. Then centrifuged at 1500 rpm for 5 min and resuspended the cell pellet in separation media. Then, it was plated on a 0.1% gelatin (Welgene)-coated culture plate at a density of 1x10 5 cells/cm 2 and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions. FBS was excluded from the culture medium to inhibit the growth of non-cardiomyocytes, and the medium contained 5% horse serum (Sigma, H1138) and 1X antibiotic-antifungal agent (Gibco). Medium was changed every other day.

실시예 10. ROS 보호 분석 Example 10. ROS protection assay

hiPSC-EC, HUVEC 및 NRCM의 ROS 보호 분석은 Live/Dead Viability 키트 (Invitrogen, L3224) 및 CCK-8 시약 (Dojindo Laboratories)으로 평가되었다. H2O2(Sigma, 216763) 시약은 서로 다른 유형의 배양 배지 (5 % FBS 포함 EBM 또는 5% 말혈청 포함 저 포도당 DMEM, 30 %의 BM-MSC 및 SDF-eMSC 조정 배지)로 희석되었다. 총 H2O2 농도는 500 uM (NRCM 및 HUVEC) 및 700 uM (hiPSC-EC)이었다. H2O2 용액을 37℃에서 5% CO2로 2 시간 동안 처리한 후, 배지를 Live/Dead 분석을 위해 칼세인 2M 및 에티듐 호모다이머-1 염료 4M 혼합물을 사용하여 페놀레드가 없는 EBM 또는 DMEM으로 변경했다. 배양은 실온에서 20 분 동안 수행되었다; 세포는 형광 현미경 (Nikon)으로 이미지화 되었다. 이미지는 동일한 설정으로 촬영되었으며 ImageJ를 사용하여 처리되었다. 세포의 생존력은 CCK-8 분석을 사용하여 평가되었다. 배지는 페놀 레드가 없는 EBM 또는 DMEM으로 변경되었다. CCK-8 시약을 5% FBS와 함께 총 배지 부피의 10%를 포함하는 것에 첨가한 다음 37℃에서 5 % CO2와 함께 2 시간 동안 배양했다. 37℃에서 2 시간 동안 배양한 후, Elisa 리더 (Spectramax Plus384, MSD)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.ROS protection assays of hiPSC-ECs, HUVECs and NRCMs were evaluated with the Live/Dead Viability kit (Invitrogen, L3224) and CCK-8 reagent (Dojindo Laboratories). The H 2 O 2 (Sigma, 216763) reagent was diluted in different types of culture media (EBM with 5% FBS or low glucose DMEM with 5% horse serum, 30% of BM-MSC and SDF-eMSC conditioned media). The total H 2 O 2 concentration was 500 uM (NRCM and HUVEC) and 700 uM (hiPSC-EC). After treating the H 2 O 2 solution with 5% CO 2 at 37°C for 2 hours, the medium was phenol red-free EBM using a mixture of Calcein 2M and Ethidium Homodimer-1 dye 4M for Live/Dead analysis. or changed to DMEM. Incubation was performed for 20 min at room temperature; Cells were imaged with a fluorescence microscope (Nikon). Images were taken with the same settings and processed using ImageJ. The viability of cells was assessed using the CCK-8 assay. The medium was changed to EBM or DMEM without phenol red. CCK-8 reagent was added to one containing 10% of the total medium volume with 5% FBS and then incubated for 2 hours at 37°C with 5% CO 2 . After incubation at 37° C. for 2 hours, absorbance was measured at 450 nm using an Elisa reader (Spectramax Plus384, MSD).

실시예 11. 탈세포화 된 심장 유래 세포외 기질을 이용한 심장 패치 제조Example 11. Manufacture of heart patch using decellularized heart-derived extracellular matrix

hdECM은 공지된 방법에 따라 준비되었다. 6 개월 된 국내 돼지의 심장 조직을 공급 업체의 승인을 받아 축산물 시장에서 구매했다. 우리는 완전한 돼지 심장에서 좌심실을 해부하고 작은 조각으로 잘랐다. 그런 다음 작은 조각의 심장 조직을 1 % sodium dodecyl sulfate (affimetrix, CA) 용액에 48 시간 동안 담근 후 PBS (Biosesang, Korea)에서 1% triton X-100 용액으로 1 시간 동안 처리했다. 다음으로 탈 세포화된 조직을 PBS에 3 일 동안 담가 잔류 계면활성제를 제거하였다. 이어서, 탈 세포화 된 심장 조직을 동결 건조하고, 액체 질소에서 분쇄하고, 보충된 최종 농도 3.3w/v% (330mg의 hdECM 분말)에서 0.5M 아세트산 용액 (Merck Millipore, Billerica, MA) 10mL에 33mg의 펩신 분말을 추가로 포함하여 분해하였다. 분해된 hdECM 용액을 40 μm pore mesh를 통해 여과하고, 1 ml로 나누어서 추가 실험을 위해 -20℃에 보관했다. 심장 패치를 제조하기 전에, hdECM의 겔화를 피하기 위해 얼음에 원뿔형 튜브를 유지하면서 10 N NaOH 용액을 추가하여 hdECM 용액을 7.4의 중성 pH로 조정했다.hdECM was prepared according to a known method. Heart tissues from 6-month-old domestic pigs were purchased from the livestock market with the approval of the supplier. We dissected the left ventricle from a complete porcine heart and cut it into small pieces. Then, small pieces of heart tissue were immersed in 1% sodium dodecyl sulfate (affimetrix, CA) solution for 48 h and then treated with 1% triton X-100 solution in PBS (Biosesang, Korea) for 1 h. Next, the decellularized tissue was immersed in PBS for 3 days to remove residual surfactant. The decellularized heart tissue was then lyophilized, ground in liquid nitrogen, and supplemented with 33 mg in 10 mL of 0.5 M acetic acid solution (Merck Millipore, Billerica, MA) at a final concentration of 3.3 w/v% (330 mg of hdECM powder). The pepsin powder of was further included to digest. The degraded hdECM solution was filtered through a 40 μm pore mesh, divided into 1 ml, and stored at -20 °C for further experiments. Before fabricating the heart patch, the hdECM solution was adjusted to a neutral pH of 7.4 by adding 10 N NaOH solution while keeping the conical tube on ice to avoid gelation of the hdECM.

hdECM 패치를 생성하기 위해 먼저 생성된 코드에 따라 3D 프린터를 사용하여 지원 프레임 워크로 직경 8mm, 높이 0.5mm의 디스크형 폴리카프로락톤 (PCL)을 제작하였다. 그런 다음 PCL 프레임 워크에서 SDF-eMSC (총 1x106/ml), hdECM (20 mg/ml) 및 0.02% (w/v)의 비타민 B2를 혼합하여 hdECM 패치를 구축하였다. 그 후, hdECM 패치를 UVA 광에 약 60 초 동안 노출시켜 비타민 B2 유도 후 가교 과정 (광 강도: 30 mW/cm2)을 시작하고 추가 열 가교를 위해 24 시간 동안 37℃에서 유지하였다. 이러한 모든 절차 후, hdECM 패치의 최종 두께와 직경은 각각 평균 3mm와 8mm였다.To create the hdECM patch, disc-shaped polycaprolactone (PCL) with a diameter of 8 mm and a height of 0.5 mm was fabricated as a support framework using a 3D printer according to the code generated first. Then, hdECM patches were constructed by mixing SDF-eMSCs (total 1×10 6 /ml), hdECM (20 mg/ml) and 0.02% (w/v) of vitamin B2 in a PCL framework. Then, the hdECM patch was exposed to UVA light for about 60 seconds to start the crosslinking process (light intensity: 30 mW/cm 2 ) after vitamin B2 induction and maintained at 37° C. for 24 hours for further thermal crosslinking. After all these procedures, the final thickness and diameter of the hdECM patch averaged 3 mm and 8 mm, respectively.

실시예 12. SDF -eMSC-PA의 방출 역학Example 12. Release kinetics of SDF-eMSC-PA

SDF-eMSC-PA의 장기 방출 역학은 시간이 지남에 따라 얻은 조건화된 배지로 인간 SDF-1α에 대한 ELISA를 수행하여 평가되었다. 패치는 디스크 모양의 PCL에서 SDF-eMSC(1x106) 및 인간 SDF-1α 사이토카인(50, 100, 300 ng/ml)이 있는 hdECM(100 μl)으로 만들어졌다. 그 후, 패치를 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco) 및 5 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, Peprotech)가 보충된 저-포도당 함유 DMEM 배지(Gibco)에서, 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 매 2 일마다 배지를 교체하고 각 0, 7, 14, 21 및 28일 시점에, 72 시간 동안 축적한 패치가 조건화된 배지를 얻었다.The long-term release kinetics of SDF-eMSC-PA were evaluated by performing an ELISA for human SDF-1α with conditioned medium obtained over time. Patches were made with SDF-eMSCs (1x10 6 ) and hdECM (100 μl) with human SDF-1α cytokine (50, 100, 300 ng/ml) in disc-shaped PCL. The patches were then incubated in low-glucose DMEM medium (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco) and 5 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech) at 37°C, 5% CO. Cultured under 2 conditions. The medium was changed every 2 days, and on days 0, 7, 14, 21 and 28 respectively, patches accumulated for 72 hours were conditioned medium.

실시예 13. 심근 경색 모델 및 패치의 전달 Example 13. Delivery of myocardial infarction model and patch

모든 연구는 가톨릭 대학교 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 수행되었다. Fischer 344 랫트(160-180g, 수컷, Koatec, 한국)를 2 % 이소플루란을 흡입하여 마취하고 18 게이지 정맥 카테터를 기관을 통해 삽관하였다. 랫트는 설치류 인공 호흡기(55-7058, Harvard Apparatus, Canada)를 이용하여 기계적으로 호흡시켰다. 시술 중 냉각을 방지하기 위해 동물을 37℃가열 패드에 두었다. 흉부를 면도하고 70% 알코올로 소독한 후 왼쪽 개흉술을 시행했다. MI는 1 분 동안 왼쪽 전방 하강(LAD) 동맥에 배치된 멸균 폴리에틸렌글리콜 튜브(22G)로 봉합사를 묶어 유도한 다음 7-0 prolene 봉합사를 사용하여 매듭을 영구적으로 결찰했다. 기준 좌심실 기능(POD)을 확립하기 위해, 박출률(EF)을 수술 7일 후 조사하였다(포함 기준: 심 초음파 평가, EF<45%). 다음날, 랫트를 이소플루란을 흡입시켜 다시 마취시키고, 삽관 하여 기계 호흡시켰다. 동물의 가슴을 다시 열고 심낭을 경색된 심장에서 부분적으로 제거하였다. 우리는 하기와 같이 3 개의 치료 플랫폼을 생성하였다. All studies were performed under the approval of the Animal Care and Use Committee of The Catholic University of Korea. Fischer 344 rats (160-180 g, male, Koatec, Korea) were anesthetized by inhalation of 2% isoflurane, and an 18-gauge intravenous catheter was intubated through the trachea. Rats were mechanically ventilated using a rodent ventilator (55-7058, Harvard Apparatus, Canada). Animals were placed on a 37° C. heating pad to prevent cooling during the procedure. After shaving the chest and disinfecting with 70% alcohol, a left thoracotomy was performed. MI was induced by tying the suture with a sterile polyethylene glycol tube (22G) placed in the left anterior descending (LAD) artery for 1 min, then permanently ligating the knot using a 7-0 prolene suture. To establish baseline left ventricular function (POD), ejection fraction (EF) was investigated 7 days postoperatively (inclusion criteria: echocardiographic evaluation, EF<45%). The next day, the rats were anesthetized again by inhalation of isoflurane, and mechanically respirated by intubation. The animal's chest was reopened and the pericardium was partially removed from the infarcted heart. We created three therapeutic platforms as follows.

1) 심근 내 이식에 의한 hiPSC-EC (EC, 1 x 106) 1) hiPSC-EC by intramyocardial transplantation (EC, 1 x 10 6 )

2) 심장 외막 이식에 의한 SDF-eMSC-PA (PA, 1 x 106) 2) SDF-eMSC-PA by epicardial transplantation (PA, 1 x 10 6 )

3) hiPSC-EC와 SDF-eMSC-PA의 결합 플랫폼 (EC + PA, 각 1 x 106) 3) Combination platform of hiPSC-EC and SDF-eMSC-PA (EC + PA, 1 x 10 6 each)

hiPSC-EC를 경색된 심장의 경계 영역에 있는 두 개의 다른 부위에 주입한 다음 3 개의 봉합사를 사용하여 심 외막에 직접 3D 심장 패치를 이식했다. 가슴을 무균적으로 봉합하고 항생제와 0.9 % 생리 식염수를 투여하였다. 모든 동물은 공지된 바와 같이 면역 억제제 (azathioprine, 2mg/kg; cyclosporine A, 5mg/kg; methylprednisolone, 5mg/kg)를 매일 투여 받았다.The hiPSC-ECs were injected into two different sites in the marginal region of the infarcted heart, and then the 3D heart patch was implanted directly into the epicardium using three sutures. The chest was aseptically sutured and antibiotics and 0.9% physiological saline were administered. All animals were administered immunosuppressive agents (azathioprine, 2 mg/kg; cyclosporine A, 5 mg/kg; methylprednisolone, 5 mg/kg) daily as known.

실시예 14. 심장 초음파 Example 14. Echocardiography

동물을 이소플루란으로 마취시키고 가열 패드를 사용하여 37℃에서 유지 하였다. 15MHz L15-7io 선형 변환기(Affniti 50G, Philips)가 장착된 경흉부 심 초음파 시스템을 사용하여 치료 후 1, 2, 4 및 8 주에 연속 심장 초음파 검사를 수행하여 분출률 (EF), 분획 단축(FS), 좌심실 이완 기말 직경(LVIDd), 좌심실 수축 기말 직경 (LVID), 관련 벽 두께 (RWT), 중격벽 두께(SWT) 및 후벽 두께(PWT)을 측정하였다. 모든 매개 변수는 중간-유두근 레벨에 도달한 M 모드에서 측정되었다. 심 초음파 검사 시, 그룹 분류는 블라인드로 진행하였다. Animals were anesthetized with isoflurane and maintained at 37°C using a heating pad. Serial echocardiography was performed at 1, 2, 4, and 8 weeks after treatment using a transthoracic echocardiography system equipped with a 15 MHz L15-7io linear transducer (Affniti 50G, Philips) to determine ejection fraction (EF), fraction shortening ( FS), left ventricular end-diastolic diameter (LVIDd), left ventricular end-systolic diameter (LVID), relative wall thickness (RWT), septal wall thickness (SWT) and posterior wall thickness (PWT) were measured. All parameters were measured in M-mode reaching mid-papillary level. At the time of echocardiography, group classification was performed blindly.

동물을 이소플루란으로 마취시키고 가열 패드를 사용하여 37℃에서 유지 하였다. 손상된 심장 조직의 기능적 개선 평가는 심 초음파 검사로 수행되었다. 랫트를 이소플루란을 흡입하여 가볍게 마취하고 15MHz L15-7io 선형 변환기 (Affniti 50G, Philips)가 장착된 경흉부 심 초음파 시스템을 사용하여 생리학적 데이터를 기록했다. 연속심 초음파 검사는 치료 전, 2, 4, 8 주에 수행되었다. 심 초음파 검사 시, 그룹 분류는 블라인드로 진행하였다. 좌심실 수축기 기능의 지표인 박출률(EF)과 단편적 단축(FS)은 각각 다음 방정식으로 계산되었다.Animals were anesthetized with isoflurane and maintained at 37°C using a heating pad. Evaluation of functional improvement of damaged heart tissue was performed by echocardiography. Rats were lightly anesthetized by inhalation of isoflurane and physiological data were recorded using a transthoracic echocardiography system equipped with a 15 MHz L15-7io linear transducer (Affniti 50G, Philips). Serial echocardiography was performed before treatment and at 2, 4, and 8 weeks. At the time of echocardiography, group classification was performed blindly. Ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS), which are indicators of left ventricular systolic function, were calculated using the following equations, respectively.

EF (%) = [(LVEDV-LVESV) / LVEDV] * 100EF (%) = [(LVEDV - LVESV) / LVEDV] * 100

FS (%) = [(LVEDD-LVESD) / LVEDD] * 100FS (%) = [(LVEDD-LVESD) / LVEDD] * 100

실시예 15. 혈역학적 측정 Example 15. Hemodynamic Measurements

동물 모델의 안락사 전 8주 말에 혈역학적 측정을 수행하였다. 출혈 없는 개흉술 후, 심장의 LV 정점을 26 게이지 바늘로 뚫고 2F 전도도 카테터(SPR-838, Millar)를 LV에 삽입하였다. LV 압력-체적(PV) 파라미터는 디지털 컨버터 (PowerLab 16/35, ADInstruments, Colorado Springs, CO)와 결합된 PV 전도도 시스템 (MPVS Ultra, emka TECHNOLOGIES, Paris, France)을 사용하여 지속적으로 기록되었다. 수축기 말 압력 체적 관계 (ESPVR) 및 이완기 말 압력 체적 관계 (EDPVR)의 기울기를 포함하는 심장 기능 부하의 독립적 측정은 바늘 홀더를 사용하여 일시적으로 하대정맥(IVC) 폐색에 의해 유도된 다른 전부하들을 달성하였다. 혈역학적 측정 후 평행 전도도를 계산하기 위해 50μl의 고혈압 식염수 (20% NaCl)를 왼쪽 경정맥에 주입했다. 혈액을 좌심실에서 헤파린 처리된 주사기로 채취하고 큐벳에 배치하여 카테터를 사용하여 전도 신호를 부피로 변환했다. 래트의 절대 부피는 병렬 전도도와 큐벳 전도도를 보정하여 정의되었다.Hemodynamic measurements were performed at the end of 8 weeks before euthanasia of the animal model. After bleeding-free thoracotomy, the LV apex of the heart was pierced with a 26 gauge needle and a 2F conduction catheter (SPR-838, Millar) was inserted into the LV. LV pressure-volume (PV) parameters were continuously recorded using a PV conductivity system (MPVS Ultra, emka TECHNOLOGIES, Paris, France) coupled with a digital converter (PowerLab 16/35, ADInstruments, Colorado Springs, CO). Independent measures of cardiac functional load, including the slope of the end-systolic pressure-volume relationship (ESPVR) and the end-diastolic pressure-volume relationship (EDPVR), have been used to temporarily measure different preloads induced by inferior vena cava (IVC) occlusion using a needle holder. achieved. After hemodynamic measurements, 50 μl of hypertensive saline (20% NaCl) was injected into the left jugular vein to calculate the parallel conductance. Blood was drawn from the left ventricle with a heparinized syringe and placed in a cuvette to convert the conduction signal to volume using a catheter. The absolute volume of the rat was defined by correcting the parallel conductance and the cuvette conductance.

실시예 16. 면역조직화학Example 16. Immunohistochemistry

동물 모델의 희생 시, 심장은 실온에서 15 분 동안 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia)에 포함된 로다민-접합 이소렉틴 B4로 관류되었다. 그런 다음 심장을 4 % 파라포름알데히드에 밤새 고정한 다음 블록을 만들었다. 심장은 마이크로톰(Leica, RM2255, Germany)을 사용하여 정점 상단에서 시작하여 5μm 섹션으로 단면화되었다. 섹션은 사용하기 전에 -20℃에 보관되었다. 탈 파라핀화 및 재수화 후, 습윤 챔버에서 표적 회수 용액(DAKO)으로 항원 회수를 수행하였다. PBS로 3 회 세척한 후 핵 염색을 위해 DAPI 용액(VectaShield)으로 섹션을 염색한 다음 슬라이드에 장착했다. 형광 현미경 (Nikon)을 사용하여 5 개의 무작위 현미경 필드에서 모세 혈관의 수를 계수하고 조직 면적 평방 밀리미터 당 모세 혈관의 수로 표시하였다.At the time of sacrifice of the animal model, the heart was perfused with rhodamine-conjugated isolectin B4 contained in Griffonia simplicifolia for 15 minutes at room temperature. Then, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde overnight and then a block was made. Hearts were sectioned in 5 μm sections starting at the top of the apex using a microtome (Leica, RM2255, Germany). Sections were stored at -20°C prior to use. After deparaffinization and rehydration, antigen retrieval was performed with target retrieval solution (DAKO) in a wet chamber. After washing with PBS three times, sections were stained with DAPI solution (VectaShield) for nuclear staining and mounted on slides. The number of capillaries was counted in 5 random microscopic fields using a fluorescence microscope (Nikon) and expressed as the number of capillaries per square millimeter of tissue area.

실시예 17. 섬유증의 결정Example 17. Determination of Fibrosis

MI 심장의 섬유증 영역을 결정하기 위해 Masson의 Trichrome (MT) 염색 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 수행하였다. 파라핀 슬라이드 3 개를 탈파라핀화 및 재수화 하기 전에 37℃ 건조 오븐에서 사전 배양하였다. 파라핀 절편은 56℃ Bouin 용액에서 1 시간 동안 다시 고정하였다. 이들 절편은 Weigert의 Iron Hematoxylin Solution을 사용하여 실온에서 15 분 동안 염색한 후, Biebrich scarlet-acid fuchsin 용액을 사용하여 실온에서 20 분 동안 염색하였다. 마지막으로, 섹션을 Aniline Blue로 15 분 동안 카운터 염색한 다음 1% 아세트산에서 1 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 각 단계 사이에 광범위한 세척이 수행되었다. 콜라겐 섬유는 파란색으로, 생존 가능한 심근은 빨간색으로 관찰되었으며, 심장 섹션의 이미징은 슬라이드 스캐너(Pannoramic MIDI)로 수행되었다. 섬유증 영역을 포함한 다른 모든 항목은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.Masson's Trichrome (MT) staining (Sigma, St. Louis, MO, USA) was performed to determine the fibrotic area of the MI heart. Three paraffin slides were pre-incubated in a drying oven at 37° C. before deparaffinization and rehydration. Paraffin sections were fixed again in Bouin's solution at 56 °C for 1 hour. These sections were stained with Weigert's Iron Hematoxylin Solution for 15 minutes at room temperature and then with Biebrich's scarlet-acid fuchsin solution for 20 minutes at room temperature. Finally, sections were counterstained with Aniline Blue for 15 minutes and then incubated in 1% acetic acid for 1 minute at room temperature. Extensive washing was performed between each step. Collagen fibers were observed in blue and viable myocardium in red, and imaging of heart sections was performed with a slide scanner (Panoramic MIDI). All other items including fibrotic area were quantified using ImageJ software.

실시예 18. 데이터 분석 Example 18. Data analysis

모든 정량 데이터는 달리 표시되지 않는 한 평균±S.E로 표시된다. 두 그룹 간의 통계적 차이는 양측 스튜던트 t-검정으로 분석되었다. 4 개의 그룹 간 통계적 차이도 Bonferroni의 사후 분석과 함께 ANOVA로 분석되었다. 결과는 p- 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.All quantitative data are presented as mean ± S.E unless otherwise indicated. Statistical differences between the two groups were analyzed with a two-tailed Student's t-test. Statistical differences between the four groups were also analyzed by ANOVA with Bonferroni's post hoc analysis. Results were considered statistically significant when the p-value was less than 0.05.

<실험 결과><Experiment result>

실험예 1. hiPSC로부터 CD31+ 내피 세포(EC) 생성 및 in vitro 분석.Experimental Example 1. Generation of CD31+ endothelial cells (EC) from hiPSC and in vitro analysis.

hiPSC-EC는 소분자 기반 2D 분화 방법 (Ref, Grigoriadis et al., Blood, 115 (2010), pp. 2769-2776)을 사용하여 생성되었다 (Xiaojun Lian et al., Stem Cell Reports, (2014) 11; 3 (5): 804-16). hiPSC에서 분화된 내피 계통 세포를 풍부하게 하기 위해 CD31 항체를 사용하여 FACS로 CD31+ 세포를 분류하고 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함한 혈관성 유형의 사이토카인을 포함하는 배양 배지에서 배양하였다. hiPSC-CD31+ 세포는 전형적인 EC의 형태를 보였으며 HUVEC보다 PECAM, VE-Cadherin, VEGFR2 및 vWF와 같은 EC 특정 마커의 mRNA 수준이 훨씬 더 높았다(도 1). 또한, 면역 형광 결과에서 hiPSC-CD31+ 세포가 PECAM 및 vWF 단백질을 발현한다는 것을 추가로 확인했다 (도 2). 기능 수준에서 hiPSC-CD31+ 세포는 Ac-LDL을 흡수하고, Matrigel 위에 모세관 유사 네트워크를 형성할 수 있는 능력을 가졌음을 확인하였다.hiPSC-ECs were generated using a small molecule-based 2D differentiation method (Ref, Grigoriadis et al., Blood, 115 (2010), pp. 2769-2776) (Xiaojun Lian et al., Stem Cell Reports, (2014) 11 3 (5): 804-16). To enrich endothelial lineage cells differentiated from hiPSCs, CD31+ cells were sorted by FACS using CD31 antibody and cultured in a culture medium containing cytokines of the vascular type, including vascular endothelial growth factor (VEGF). hiPSC-CD31+ cells showed a typical EC morphology and had significantly higher mRNA levels of EC-specific markers such as PECAM, VE-Cadherin, VEGFR2 and vWF than HUVECs (Fig. 1). In addition, immunofluorescence results further confirmed that hiPSC-CD31+ cells expressed PECAM and vWF proteins (Fig. 2). At the functional level, it was confirmed that hiPSC-CD31+ cells had the ability to absorb Ac-LDL and form a capillary-like network on Matrigel.

실험예 2. 심근 내 주입된 hiPSC-EC의 혈관 신(de-novo)생합성 효과Experimental Example 2. De-novo biosynthetic effect of hiPSC-EC injected into the myocardium

hiPSC-EC가 심근경색(MI)을 유발한 동물 모델에서 심장의 혈관 형성 메커니즘을 통해 de novo 혈관을 형성할 수 있는지 확인하기 위해 MI 유도 랫트 심장의 경계 영역에 있는 두 개의 서로 다른 부위에 CD31+ hiPSC-EC를 심근 내 주입하였다. MI는 심장의 왼쪽 전방 하강 (LAD) 동맥의 결찰에 의해 생성되었다. 추적 목적으로 녹색 형광(GFP) 신호를 지속적으로 발현하는 hiPSC-EC가 사용되었다. MI 심장의 기능 혈관을 시각화하기 위해 hiPSC-EC 주입 후 8 주 후 조직 수확 전에 심장에 적색 형광 염료와 결합된 isolection-B4(IB4)로 관류 염색을 수행하였다. 형광 이미지 분석은 hiPSC-EC에 주입된 심장의 모세 혈관 수가 MI 대조군보다 유의하게 높음을 보여주었다 (도 3). 다음으로, MI 심장의 혈관 형성에 대한 hiPSC-EC의 영향을 평가하기 위해 심장 조직 내 hiPSC-EC의 GFP 신호를 추적하였다. 공초점 현미경 이미지는 hiPSC-EC의 IB4 및 GFP 신호 모두에 대해 상당한 수의 혈관이 주입 후 8주 후에, 심장 조직에 주입된 hiPSC-EC의 경색 영역에서 검출되었음을 보여주었다. 또한, 상당한 수의 hiPSC-EC가 숙주 모세관 네트워크와 통합되었고 이들 중 다수가 혈관 주위 영역에 위치한 것을 확인하였다 (도 4). 이러한 결과는 CD31+ hiPSC-EC가 허혈성 심장에서 de-novo 혈관을 재구성할 수 있음을 시사하는 것이다. To determine whether hiPSC-ECs can form de novo blood vessels through the angiogenic mechanism of the heart in an animal model of myocardial infarction (MI), CD31+ hiPSCs were seeded at two different sites in the border region of MI-induced rat hearts. -EC was injected intramyocardially. MI was created by ligation of the left anterior descending (LAD) artery of the heart. hiPSC-ECs constitutively expressing a green fluorescence (GFP) signal were used for tracking purposes. To visualize functional blood vessels in MI hearts, perfusion staining with isolection-B4 (IB4) coupled with a red fluorescent dye was performed on the heart 8 weeks after hiPSC-EC injection and before tissue harvest. Fluorescent image analysis showed that the number of capillaries in hearts injected into hiPSC-ECs was significantly higher than in MI controls (Fig. 3). Next, the GFP signal of hiPSC-ECs in heart tissue was traced to evaluate the effect of hiPSC-ECs on angiogenesis in MI hearts. Confocal microscopy images showed that significant numbers of blood vessels were detected in the infarct area of hiPSC-ECs injected into heart tissue 8 weeks after injection for both the IB4 and GFP signals of hiPSC-ECs. In addition, it was confirmed that a significant number of hiPSC-ECs integrated with the host capillary network and many of them were located in the perivascular region (FIG. 4). These results suggest that CD31+ hiPSC-ECs can reconstitute de-novo blood vessels in ischemic hearts.

혈관 형성을 통한 혈관 재생으로 인하여 MI가 회복될 수 있으므로, hiPSC-EC를 MI 심장에 심근 내 주입할 경우, 심장 기능을 촉진할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다. MI 유도 후 심근 내 주사 또는 패치 이식을 하기 전, 주사 또는 패치 이식 후 2, 4 및 8 주에 각각 좌심실 (LV) 기능 및 심장 리모델링을 평가하기 위한 직렬 심장 초음파 검사를 수행하였다. 분출률(EF) 및 분획 단축 (FS)에 의해 결정된 심장 초음파 검사 결과, hiPSC-EC를 주입한 심장(EC)이 8 주까지 MI 대조군에 비해 훨씬 더 높은 EF, FS를 나타냄을 확인하였다(도 5). 좌심실 내부 이완기 치수(LVIDd), 좌심실 내부 수축기 치수(LVISd), 중격 벽 두께(SWT) 및 후벽 두께(PWT)와 같은 심장 리모델링을 위한 여러 매개 변수에 대하여, hiPSC-EC가 주입된 모델에서 LVIDd 및 LVID 심장은 MI 대조군 심장보다 현저히 낮았는데 이는 hiPSC-EC가 심장을 불리한 심장 재 형성으로부터 보호하였음을 보여주는 결과이다(도 7). 이와 유사하게, MI 후 8 주에 채취 한 심장 조직을 사용하여 얻은 Masson의 trichrome 염색 결과는 hiPSC-EC 주입 그룹의 섬유증 면적(%)이 MI 대조군에 비해 상당히 작고 생존 가능한 심근(%)이 더 컸음을 보여주었다 (도 8). 이러한 결과를 바탕으로 hiPSC-EC가 MI 심장에서 생체 내 de-novo 혈관을 생성하고 심장 기능을 향상시키는 데 직접 기여할 수 있음을 확인하였다.Since MI can be recovered due to blood vessel regeneration through angiogenesis, it was experimentally confirmed that cardiac function can be promoted when hiPSC-ECs are intramyocardially injected into an MI heart. Serial echocardiography to assess left ventricular (LV) function and cardiac remodeling was performed before intramyocardial injection or patch implantation after MI induction and at 2, 4, and 8 weeks after injection or patch implantation, respectively. As a result of echocardiography determined by ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS), it was confirmed that the hiPSC-EC-injected heart (EC) showed significantly higher EF and FS compared to the MI control group up to 8 weeks (Fig. 5). For several parameters for cardiac remodeling, such as left ventricular intra-diastolic dimension (LVIDd), left ventricular intra-systolic dimension (LVISd), septal wall thickness (SWT) and posterior wall thickness (PWT), LVIDd and LVID hearts were significantly lower than MI control hearts, indicating that hiPSC-ECs protected the hearts from adverse cardiac remodeling (FIG. 7). Similarly, Masson's trichrome staining results obtained using heart tissue harvested 8 weeks after MI showed that the hiPSC-EC injected group had significantly smaller fibrotic area (%) and larger viable myocardium (%) compared to the MI control group. showed (FIG. 8). Based on these results, it was confirmed that hiPSC-ECs can directly contribute to generating de-novo blood vessels in vivo and improving cardiac function in MI hearts.

실험예 3. SDF-eMSC의 세포적 특성 Experimental Example 3. Cellular characteristics of SDF-eMSC

조작된 SDF-eMSC는 MSC의 대표적인 형태학적 특성인 균질한 방추형 세포 형태를 가지므로 일반 BM-MSC와 형태적으로 구별하기 어려우며(도 9), 도 10과 같이 SDF-eMSC는 MSC 양성 및 음성 마커의 발현에 있어 일치되는 양상을 보임을 확인하였다. 또한, SDF-eMSC는 세포 성장률(PDL)이 배양 시간동안 안정적으로 유지되었으며, 동시에 높은 수준의 SDF-1 단백질의 발현 능력을 가지고 있음을 확인하였다 (도 11, 12). SDF-eMSC는 인간 SDF-1α 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 분석 (도 13)에 의해 확인한 결과, 계대 16까지 인간 SDF-1α 단백질을 안정적으로 분비하였으며, 핵형에서 염색체 이상이 확인되지 않으므로, 유전적으로도 안정성을 가지는 것을 알 수 있다. (도 14).The engineered SDF-eMSCs have a homogeneous spindle-shaped cell morphology, which is a representative morphological characteristic of MSCs, so they are morphologically difficult to distinguish from normal BM-MSCs (FIG. 9), and as shown in FIG. 10, SDF-eMSCs are MSC positive and negative markers It was confirmed that the expression of . In addition, it was confirmed that the cell growth rate (PDL) of SDF-eMSCs was maintained stably during the culture period, and at the same time, they had the ability to express high levels of SDF-1 protein (FIGS. 11 and 12). As confirmed by human SDF-1α enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis (FIG. 13), SDF-eMSC stably secreted human SDF-1α protein until passage 16, and no chromosomal abnormalities were found in the karyotype. It can be seen that it is completely stable. (FIG. 14).

실험예 4. In vitro에서 SDF-eMSC의 내피 세포의 혈관 신생 향상 효과 Experimental Example 4. Endothelial cell angiogenesis enhancement effect of SDF-eMSC in vitro

SDF-eMSC가 EC의 혈관 신생을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해 SDF-eMSC를 사용하여 다양한 유형의 in vitro 실험을 수행하였다. To investigate whether SDF-eMSCs can increase angiogenesis of ECs, various types of in vitro experiments were performed using SDF-eMSCs.

먼저, SDF-eMSC가 EC 및 혈관 신생 특성과 관련된 유전자 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 배양된 SDF-eMSC 또는 BM-MSC로부터 얻은 30% 컨디셔닝 배지(CM)를 배양된 hiPSC-EC에 3 일 동안 처리하고 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 결과적으로 Ig 및 표피 성장 인자 상동성 도메인 2 (Tie-2), 폰 빌레브란트 인자 (vWF), SDF-1α, E-셀렉틴(CD62) 및 세포간 접착 분자-1(ICAM-1)을 갖는 티로신 키나아제의 발현 수준이 BM-MSC-CM로 처리한 hiPSC-EC에 비해 SDF-eMSC-CM으로 처리한 hiPSC-EC에서 훨씬 더 높았다(도 15). 특히, 활성화된 ECs로서 혈관 신생에 관여하는 것으로 알려진 E-selectin 및 ICAM-1의 발현 증가가 눈에 띄게 관찰되었다. First, 30% conditioning medium (CM) obtained from cultured SDF-eMSCs or BM-MSCs was added to cultured hiPSC-ECs to investigate whether SDF-eMSCs affect the expression of genes related to ECs and angiogenic properties. days and subjected to qRT-PCR analysis. Consequently, tyrosine with Ig and epidermal growth factor homology domain 2 (Tie-2), von Willebrand factor (vWF), SDF-1α, E-selectin (CD62) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) The expression level of kinase was much higher in hiPSC-EC treated with SDF-eMSC-CM compared to hiPSC-EC treated with BM-MSC-CM (FIG. 15). In particular, the expression of E-selectin and ICAM-1, which are known to be involved in angiogenesis as activated ECs, were markedly increased.

다음으로, 내피 세포 (EC) 이동 분석에서, 도 15 및 도 16에 표시된 바와 같이 SDF-eMSC-CM 30% 추가 처리된 경우, BM-MSC-CM이 처리된 경우에 비하여 hiPSC-EC(도 16) 또는 HUVEC(도 17)의 이동을 크게 향상시켰음을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, SDF-eMSC에서 방출된 사이토카인이 EC의 이동성을 강화한다는 것을 확인할 수 있다. Next, in the endothelial cell (EC) migration assay, as shown in FIGS. 15 and 16, when 30% of SDF-eMSC-CM was additionally treated, hiPSC-EC (FIG. ) or HUVEC (FIG. 17). From these results, it can be confirmed that cytokines released from SDF-eMSC enhance the mobility of ECs.

또한 SDF-eMSC가 직접 혈관 신생(angiogenesis)을 촉진하는지 여부를 확인하기 위해 Matrigel tube 형성 분석을 수행하여 세포의 혈관 형성 능력을 평가하였다. Matrigel tube 형성 분석의 결과, 배양된 SDF-eMSC로부터 얻은 30% CM으로 처리한 hiPSC-EC 및 인간 제대 내피 세포 (HUVEC) 모두에서 형성된 여러 가지 및 튜브 길이가 BM-MSC-CM 처리 EC에 비하여 훨씬 컸다는 것을 보여준다(도 18). 흥미로운 점은 SDF-eMSC-CM을 사용한 치료는 hiPSC-EC의 튜브 형성 기능을 촉진했을 뿐만 아니라 hiPSC-EC가 형성된 혈관이 유지되도록 도와준다. hiPSC-ECs는 BM-MSC-CM를 처리한 경우 혈관 형성 후 24 시간 이내에 혈관 구조가 파괴되기 시작한 반면, SDF-eMSC-CM을 처리하여 형성된 혈관의 경우, 최대 48 시간까지 혈관이 파괴되지 않고 유지되었다. In addition, in order to confirm whether SDF-eMSC directly promotes angiogenesis, Matrigel tube formation assay was performed to evaluate the ability of cells to form blood vessels. As a result of Matrigel tube formation assay, both hiPSC-ECs and human umbilical endothelial cells (HUVECs) treated with 30% CM obtained from cultured SDF-eMSCs showed significantly higher tube lengths than BM-MSC-CM treated ECs. It shows that it is large (Fig. 18). Interestingly, treatment with SDF-eMSC-CMs not only promoted the tube formation function of hiPSC-ECs, but also helped maintain the blood vessels formed by hiPSC-ECs. When hiPSC-ECs were treated with BM-MSC-CMs, the vasculature began to be disrupted within 24 hours after angiogenesis, whereas in the case of vessels formed with SDF-eMSC-CMs, the vasculature was maintained without destruction for up to 48 hours. It became.

마지막으로, SDF-eMSC가 EC 또는 심근 세포에 직접적인 세포 보호 효과를 부여할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, H2O2(500 uM)에 세포를 노출시켜 허혈성 손상을 유발한 뒤, 이의 효과를 확인하였다. 결과는 SDF-eMSC-CM가 투여된 경우, 비 투여군과 비교하여 허혈성 손상에 대한 EC 및 심근 세포의 세포 생존력을 유의하게 개선했음을 보여주었다. 즉, SDF-eMSC-CM은 허혈성 손상에 대한 세포 보호 효과를 가지고 있다 (도 19). Finally, in order to confirm whether SDF-eMSCs can impart a direct cytoprotective effect to EC or myocardial cells, ischemic damage was induced by exposing the cells to H 2 O 2 (500 uM), and then its effect was evaluated. Confirmed. The results showed that when SDF-eMSC-CMs were administered, cell viability of EC and cardiomyocytes against ischemic injury was significantly improved compared to the non-administered group. That is, SDF-eMSC-CMs have a cytoprotective effect against ischemic damage (FIG. 19).

종합적으로, 다양한 in vitro 실험에서 얻은 결과는 SDF-eMSC가 hiPSC-EC의 혈관 신생 특성을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 세포 보호 SDF 사이토카인의 일관된 분비를 통해 EC 및 심근 세포를 직접 보호 할 수 있음을 분명히 보여준다.Collectively, the results obtained from various in vitro experiments indicate that SDF-eMSCs can not only promote the angiogenic properties of hiPSC-ECs, but also directly protect ECs and cardiomyocytes through consistent secretion of cytoprotective SDF cytokines. clearly show

실험예 5. SDF-eMSC-PA의 SDF-1α 지속적 방출 효과 Experimental Example 5. SDF-1α sustained release effect of SDF-eMSC-PA

SDF-eMSC 패치(SDF-eMSC-PA)가 SDF-1α를 효율적으로 방출할 수 있는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 먼저 SDF-eMSC-PA의 생산을 위해 SDF-eMSC를 2% 심장 유래 탈세포화 세포 외 매트릭스 (hdECM) 기반 바이오 잉크와 혼합하고 폴리카프로락톤(PCL) 메시에 로딩하였다(도 20). 이후, SDF-eMSC-PA를 시험관 내 조건에서 28 일 동안 배양하고 다양한 지점에서 상층 액을 수집하여 SDF-1α ELISA 분석 키트를 통해 SDF-eMSC-PA의 방출 동역학을 분석하였다 (도 21). 도 21에서 보듯이, 누적 방출 곡선은 SDF-1α의 초기 농도가 0 일에 SDF-eMSC-PA보다 SDF-cytokine-PA(300ng/ml)에서 더 높았지만 SDF-1α는 SDF-cytokine-PA에서는 검출되지 않았으며, 반면, SDF-eMSC-PA에서 방출된 SDF-1α는 21 일 까지 지속적으로 증가하여 SDF-eMSC가 패치 내에서 SDF-1α를 지속적으로 방출하고 있다는 것을 알 수 있다. Experiments were conducted to determine whether the SDF-eMSC patch (SDF-eMSC-PA) could efficiently release SDF-1α. First, for the production of SDF-eMSC-PA, SDF-eMSC were mixed with 2% heart-derived decellularized extracellular matrix (hdECM)-based bioink and loaded onto a polycaprolactone (PCL) mesh (FIG. 20). Thereafter, the SDF-eMSC-PA was cultured in vitro for 28 days, and the supernatant was collected at various points, and the release kinetics of the SDF-eMSC-PA were analyzed using the SDF-1α ELISA assay kit (FIG. 21). As shown in FIG. 21, the cumulative release curve shows that the initial concentration of SDF-1α was higher in SDF-cytokine-PA (300 ng/ml) than in SDF-eMSC-PA on day 0, but SDF-1α was not in SDF-cytokine-PA. On the other hand, SDF-1α released from SDF-eMSC-PA continued to increase until day 21, indicating that SDF-eMSC continuously released SDF-1α within the patch.

실험예 6. hiPSC-EC 및 SDF-eMSC-PA 병용 시, 심장 기능 개선 및 혈관 재생 효과Experimental Example 6. Improvement of heart function and blood vessel regeneration effect when hiPSC-EC and SDF-eMSC-PA are used together

hiPSC-EC 및 SDF-eMSC-PA를 함께 사용하여 혈관 형성 및 혈관 신생을 동시에 유도할 경우, 심근 경색(MI) 유도 심장에서 포괄적인 혈관 재생 및 심장 기능 개선을 이끌 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 랫트의 심장의 LAD 결찰에 의한 MI를 유도하고, 1) Sham control, 2) MI control, 3) SDF-eMSC-PA 이식 MI 심장 심외막 (PA, 1x106), 4) hiPSC-EC 심근내 주사 (EC, 1x106) 및 5) hiPSC-EC 및 SDF-eMSC-PA (EC+PA, 각각 1x106)의 병용 투여의 5가지 방법으로 실험을 수행하였다. An experiment to determine whether the simultaneous induction of angiogenesis and angiogenesis using hiPSC-EC and SDF-eMSC-PA together can lead to comprehensive revascularization and improvement of cardiac function in myocardial infarction (MI)-induced heart proceeded. MI was induced by LAD ligation of the rat heart, 1) Sham control, 2) MI control, 3) SDF-eMSC-PA transplant MI epicardium (PA, 1x10 6 ), 4) hiPSC-EC intramyocardial injection (EC, 1x10 6 ) and 5) combined administration of hiPSC-EC and SDF-eMSC-PA (EC+PA, 1x10 6 each).

PRE (MI 후 1 주 및 처리 전), 처리 후 2, 4 및 8 주에 모든 실험 그룹에 대해 연속 심장 초음파 검사를 수행하였다. 그 결과, 심 초음파 검사에서 병용 치료군의 심장 기능이 8 주까지 단독 처리군에 비해 유의하고 지속적으로 높음을 확인할 수 있었다 (도 22). 또한, LVIDd, LVID, RWT 및 SWT에 의해 결정된 이상 심장 리모델링은 다른 실험 그룹에 비해 EC+PA 그룹에서 현저하게 감소하였다 (도 23). 또 다른 결과는, 병용 투여군이 심장 섬유증을 현저하게 감소시켰다는 것이다. 투여 후 8 주에 채취한 심장 조직을 Masson의 trichrome 염색으로 확인한 결과, 다른 실험군에 비해 병용 치료군에서 섬유증 면적(%)이 현저히 낮았음을 확인하였다 (도 24).Serial echocardiography was performed for all experimental groups at PRE (1 week after MI and before treatment), 2, 4 and 8 weeks after treatment. As a result, it was confirmed by echocardiography that the cardiac function of the combination treatment group was significantly and consistently higher than that of the single treatment group up to 8 weeks (FIG. 22). In addition, abnormal cardiac remodeling determined by LVIDd, LVID, RWT and SWT was significantly reduced in the EC+PA group compared to other experimental groups (FIG. 23). Another result was that the combination administration group significantly reduced cardiac fibrosis. As a result of confirming the heart tissue collected 8 weeks after administration by Masson's trichrome staining, it was confirmed that the fibrosis area (%) was significantly lower in the combination treatment group than in the other experimental groups (FIG. 24).

또한, 심장 기능을 더욱 정밀하게 평가하기 위해 LV 혈역학적 압력과 부피를 측정 할 수 있는 침습적 압력-볼륨(PV) 카테터를 통해 LV 혈역학적 측정을 추가로 수행하였다. MI 후 8 주차에 PV 루프의 측정 결과, EC+PA 그룹에서 다른 그룹에 비해 심장 기능을 크게 개선하고 불리한 심장 리모델링을 보호하는 것으로 나타났다(도 25). 또한, EC+PA 그룹에서 뇌졸중 용적(SV) 및 심장 박출량(CO)과 같은 일반적인 심장 기능의 두 가지 파라미터가 상당히 높았으며, 최대 확장기에서 측정된 심장 재 형성 지수인 최대 용적(V max)의 경우, EC+PA 투여군은 다른 그룹에 비해 유의하게 낮았다(도 26). 최대 수축기에서 측정된 최대 압력(P max)은 그룹 간에 큰 차이가 없었지만, 최대 압력 변화율(dP/dt max)과 LV의 압력 변화를 나타내는 최소 압력 변화율 (dP/dt min)은 EC+PA 투여군에서 초당 증가하였다(도 27). 종합적으로, LV 혈역학 측정 결과는 hiPSC-EC 및 SDF-eMSC-PA를 병용 투여할 경우, MI 심장 회복을 개선한다는 것을 입증하였다.In addition, LV hemodynamic measurement was additionally performed through an invasive pressure-volume (PV) catheter capable of measuring LV hemodynamic pressure and volume to more precisely evaluate cardiac function. Measurements of the PV loop at 8 weeks after MI showed significant improvement in cardiac function and protection against adverse cardiac remodeling in the EC+PA group compared to the other groups (FIG. 25). In addition, two parameters of general cardiac function, such as stroke volume (SV) and cardiac output (CO), were significantly higher in the EC+PA group, and in the case of maximal volume (V max), an index of cardiac remodeling measured at maximal diastole, , EC + PA administration group was significantly lower than other groups (FIG. 26). There was no significant difference in the maximum pressure (P max ) measured at maximum systole between the groups, but the maximum pressure change rate (dP/dt max) and the minimum pressure change rate (dP/dt min) representing the change in LV pressure were in the EC+PA group. increased per second (FIG. 27). Collectively, the results of LV hemodynamic measurements demonstrated that the co-administration of hiPSC-ECs and SDF-eMSC-PAs improved MI cardiac recovery.

실험예 7. 병용 투여에 의한 심근 내 hiPSC-EC 생착 향상 및 신생 혈관 개선 효과Experimental Example 7. Improvement of hiPSC-EC engraftment in the myocardium and improvement of new blood vessels by combined administration

SDF-eMSC-PA에 의한 심근 내 hiPSC-EC의 in vivo 활성을 조사하였다. hiPSC-EC의 심장 조직 내 활성은 GFP의 발현을 통해 확인하였다. 처리 후 8 주 경과시 채취된 심장 조직을 공 초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, SDF-eMSC-PA의 이식이 심근 내 주사 된 GFP 양성 hiPSC-EC의 유지 및 생착을 상당히 개선하였음을 확인할 수 있었다. 양적으로, EC+PA 병용 투여군에서 GFP 양성 hiPSC-EC의 비율은 EC 단독 그룹보다 상당히 높았다 (도 28). 또한, hiPSC-EC 단독 투여군의 hiPSC-EC는 주사 부위 근처에만 국한되었지만 EC+PA 그룹의 hiPSC-EC는 좌심실의 모든 영역에 분포되어 있었다(도 29). 결과적으로, SDF-eMSC-PA가 조직학적 분석을 통해 숙주 혈관으로부터 hPSC-ECs 의존성 혈관 형성 및 혈관 신생을 동시에 촉진한다는 것을 확인하였다. The in vivo activity of hiPSC-EC in the myocardium by SDF-eMSC-PA was investigated. The activity of hiPSC-ECs in cardiac tissue was confirmed through the expression of GFP. Heart tissue collected 8 weeks after treatment was observed under a confocal microscope. As a result, it was confirmed that the transplantation of SDF-eMSC-PA significantly improved the maintenance and engraftment of GFP-positive hiPSC-EC intramyocardially injected. Quantitatively, the proportion of GFP-positive hiPSC-ECs in the EC+PA combination administration group was significantly higher than that in the EC alone group (FIG. 28). In addition, the hiPSC-ECs of the hiPSC-EC alone administration group were confined to the vicinity of the injection site, whereas the hiPSC-ECs of the EC+PA group were distributed in all areas of the left ventricle (FIG. 29). As a result, it was confirmed through histological analysis that SDF-eMSC-PA simultaneously promotes hPSC-ECs-dependent angiogenesis and angiogenesis from host blood vessels.

또한, EC의 기능을 확인하기 위해 동물 모델의 희생 전에 RFP 염료가 결합된 ILB4가 전신 주입되었다. IB4 관류 염색 이미지는 EC+PA 그룹에서 심장의 경계 영역(border zone)과 경색 영역(infarct zone) 모두에 있는 모세 혈관 수가 EC 단독 투여군을 포함한 다른 실험 그룹보다 상당히 높았음을 보여주었으며, 이는 혈관 신생이 병용 투여에 의해 향상되었음을 명확히 증명하는 것이다(도 30 및 도 31). In addition, to confirm the function of EC, ILB4 coupled with RFP dye was systemically injected before sacrifice of the animal model. IB4 perfusion staining images showed that the number of capillaries in both the border zone and infarct zone of the heart in the EC+PA group was significantly higher than in the other experimental groups, including the EC-only group, indicating angiogenesis. This clearly proves that the combined administration improved (FIG. 30 and FIG. 31).

또한, hiPSC-EC-GFP+에 의해 형성된 de-novo 혈관의 수가 EC 단독 투여 그룹 보다 EC+PA 그룹에서 상당히 높았으며 이는 SDF-eMSC-PA가 hiPSC-EC에 종속된 혈관 형성에 영향을 주는 것을 의미한다(도 32). 특히, 병용 투여 그룹에서 더 큰 직경 (직경 범위 : 5-10μm)을 가진 모세 혈관의 수는 다른 실험군보다 많았으며, 이는 SDF-eMSC-PA가 혈관 성장에 효과가 있다는 것을 보여주는 것이다. 종합적으로 볼 때, 이러한 결과는 병용 투여를 통한 치료가 혈관 재생을 강화하고, 이를 통해 통합적인 심장 기능 회복으로 이어진다는 것을 보여주는 것이다. In addition, the number of de-novo blood vessels formed by hiPSC-EC-GFP+ was significantly higher in the EC+PA group than in the EC-only group, indicating that SDF-eMSC-PA affects hiPSC-EC-dependent angiogenesis. (FIG. 32). In particular, the number of capillaries with larger diameters (diameter range: 5–10 μm) in the combined administration group was higher than in the other experimental groups, indicating that SDF-eMSC-PA is effective in blood vessel growth. Taken together, these results show that combined treatment enhances blood vessel regeneration, leading to comprehensive cardiac function recovery.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to its preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent range should be construed as being included in the present invention.

Claims (12)

심근 내 주사로 투여되는, 유도만능줄기세포로부터 분화된 내피 세포(Endothelial cell); 및
심외막에 패치 형태로 이식되는, SDF-1α을 발현하도록 형질 전환되고 불사화된 중간엽줄기세포를 포함하는 심장 혈관 재생용 조성물. Endothelial cells differentiated from induced pluripotent stem cells administered by intramyocardial injection; and
A composition for cardiovascular regeneration comprising immortalized mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α and implanted in the form of a patch on the epicardium. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 조성물은 SDF-1α를 발현하도록 형질전환된 중간엽 줄기세포의 배양액을 추가로 포함하는 것인, 심장 혈관 재생용 조성물. According to claim 1,
The composition further comprises a culture medium of mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α, a composition for cardiovascular regeneration. 제1항에 있어서,
상기 조성물은 심장 유래 세포외 기질(ECM)을 추가로 더 포함하는 것인, 심장 혈관 재생용 조성물. According to claim 1,
The composition further comprises a heart-derived extracellular matrix (ECM), the composition for cardiovascular regeneration. SDF-1α을 발현하도록 형질 전환되고 불사화된 중간엽줄기세포를 포함하는 심장 혈관 재생용 패치로,
상기 패치는 심외막에 패치 형태로 이식되고,
상기 패치는 유도만능줄기세포로부터 분화된 내피 세포(Endothelial cell)를 심근 내 주사하며 적용되는 것을 특징으로 하는, 심장 혈관 재생용 패치. A patch for cardiovascular regeneration containing immortalized mesenchymal stem cells transformed to express SDF-1α,
The patch is implanted in the form of a patch on the epicardium,
The patch is a patch for cardiovascular regeneration, characterized in that applied by intramyocardial injection of endothelial cells differentiated from induced pluripotent stem cells. 제6항에 있어서,
상기 패치는 심장 유래 세포외 기질(ECM) 및 비타민 B2로 추가로 포함하는 것인, 심장 혈관 재생용 패치.According to claim 6,
The patch further comprises a heart-derived extracellular matrix (ECM) and vitamin B2, the patch for cardiovascular regeneration. 제6항 또는 제7항의 심장 혈관 재생용 패치; 및
유도만능줄기세포로부터 분화된 내피세포(EC)를 포함하는 심근 내 주사 제형;을 포함하는 심장 혈관 재생용 키트. The patch for cardiovascular regeneration of claim 6 or 7; and
Cardiovascular regeneration kit comprising a; intramyocardial injection formulation containing endothelial cells (EC) differentiated from induced pluripotent stem cells. 삭제delete 삭제delete 제1항, 제4항 또는 제5항의 조성물을 포함하는 허혈성 심장질환, 심근 경색, 동맥경화증, 협심증 및 혈관 폐색로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 심장 질환 치료용 약학적 조성물. A pharmaceutical composition for the treatment of at least one heart disease selected from the group consisting of ischemic heart disease, myocardial infarction, arteriosclerosis, angina pectoris, and vascular occlusion, comprising the composition of claim 1, claim 4 or claim 5. 삭제delete
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