KR102543966B1 - 장독소성대장균의 독소부착을 억제하는 펩타이드 - Google Patents
장독소성대장균의 독소부착을 억제하는 펩타이드 Download PDFInfo
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Abstract
장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 개시된다. 상기 펩타이드는 GM1a 유사 펩타이드로 GM1a에 이열성독소(LT)의 부착을 억제할 수 있도록 선택적으로 이열성독소(LT)의 B 서브유닛과 결합함으로써 이열성독소(LT)의 후속 생리학적 결과를 방지하여, 장독소대장균 이열성독소(LT) 감염에 대한 예방 또는 치료가 가능하여 새로운 치료제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체, 상기 펩타이드를 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
장독소원성 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC)은 열에 불안정한 이열성 독소((heat labile enterotoxin, LT)의 생산을 담당한다. 장독소원성 대장균은 매년 50,000명 이상의 사망자와 수백만 건의 설사와 관련이 있다. 위생 시설의 발전에도 불구하고 질병의 사망률이 떨어지지 않지만 이환율도 떨어지지 않는다. 어린이가 장독소원성 대장균에 감염되면 종종 발달 장애 및 인지 능력 저하와 같은 장기적인 건강 문제가 발생하여 빈곤의 악순환이 시작될 수 있다. 또한, 발병 지역을 방문하는 여행자, 특히 의료 및 군사 전문가는 질병에 걸리기 쉽다. 또한 이 질병은 과민성 대장 증후군과 같은 만성 질환과 관련이 있다. 장독소에 의해 유발되는 묽은 설사는 감염에 의해 악화되는 대변-구강 경로를 통해 질병이 확산되는 것을 돕는다.
장독소성대장균은 이열성 독소(heat labile enterotoxin, LT)과 내열성 독소(heat stable enterotoxin, ST) 중 한 개 혹은 두 개의 독소를 동시에 생산한다. 이열성 독소는 항원구조나 작용기전이 콜레라 독소와 유사하며, 단백질 구조상 하나의 A subunit(분자량 25,000)과 5 개의 B subunit(분자량 11,500)로 구성되어 있고, 각각 18개와 21개의 signal 펩타이드와 함께 합성된다. 촉매 활성 A-소단위체는 상피 세포에 대한 결합을 담당하는 원환체 모양의 B-펜타머의 코어에 묶여 있다. 이 두 가지 구성 요소가 함께 단백질 복합체를 구성한다. 이열성 독소(LT)는 일반적으로 콜레라 독소(cholera toxin, CT)보다 더 불규칙적이고, 다양한 글리코스핑고리피드(glycosphingolipids)에 결합합니다. 여기에는 디시알로강글리오시드 GD2, GM1 및 락토-N-네오테트라오실세라마이드(LNnT-Cer; 파라글로보시드)와 같은 글리코스핑고지질과 장내 폴리글리코실세라마이드 및 시알산 함유 글리코스핑고가 포함된다. LT-B 소단위체는 동물 상피 세포의 원형질막 표면에서 발견되는 모노시알로강글리오시드인 GM1a에 결합하여 숙주 세포에 들어갈 수 있다.
한편, 병원성 대장균을 포함한 세균에 의한 대부분의 감염질환과 질병치료를 위해 화학치료제에 의존할 수밖에 없으며, 대부분은 항생제로 치료하고 있다.
그러나 이러한 항생제의 무분별한 남용과 오용에 의하여 현재는 많은 종류의 세균들이 항생제에 대해 내성을 획득하였을 뿐만 아니라 내성균의 출연빈도도 점차 증가하고 있다.
대장균에 의한 질환은 다른 세균성 질병과 다르게 지속적으로 발생한다는 특성이 있으며, 이를 예방하기 위해서는 철저한 소독, 위생적인 환경을 유지하여 병인체에 노출되는 것을 차단하는 것이 최우선이나 이는 현실적으로 불가능하다.
이에 세포막 표면에서 GM1a에 이열성독소(LT)의 부착을 억제할 수 있도록 선택적으로 이열성독소(LT)의 B 서브유닛과 결합하는 물질은 이열성독소(LT)의 후속 생리학적 결과를 방지하여, 장독소대장균 이열성독소(LT) 감염에 대한 예방 또는 치료가 가능하여 새로운 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 과제는 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 전술한 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 전술한 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 GM1a 유사 펩타이드로 GM1a에 이열성독소(LT)의 부착을 억제할 수 있도록 선택적으로 이열성독소(LT)의 B 서브유닛과 결합함으로써 이열성독소(LT)의 후속 생리학적 결과를 방지하여, 장독소대장균 이열성독소(LT) 감염에 대한 예방 또는 치료가 가능하여 새로운 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 LT-B에 대한 면역요법이 병원체에 대한 면역 반응에서 숙주 GM1a 글리칸 펩타이드의 관여를 결정함으로써 감염성 장애를 예방하고 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 플라클 리프트 분석을 통해 GM1a 강글리오사이드와 관련된 LT-B 렉틴 인자를 밝혀낸 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 GM1a 글리칸에 결합하는 렉틴 후보인 LT-B와의 도킹 시뮬레이션을 사용하여, 결합 친화도를 결정하고, 예상되는 결합 부위에서 발견된 3개의 리간드 결합 도메인(LBD)를 나타낸 모식도이다.
도 4의 A는 본 발명의 일 실시예에서 LT-B에 대한 GM1a-복제 펩타이드, P2의 결합 친화도를 나타낸 그래프, B는 GM1a-복제 펩타이드 P2의 농도에 따른 저해율을 나타낸 그래프이다(*P < 0.05 및 **P < 0.01)).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 장 상피 세포 HCT-8 공격 감염 후, P2의 영향을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여 염증 유발 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생산 수준을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 플라클 리프트 분석을 통해 GM1a 강글리오사이드와 관련된 LT-B 렉틴 인자를 밝혀낸 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 GM1a 글리칸에 결합하는 렉틴 후보인 LT-B와의 도킹 시뮬레이션을 사용하여, 결합 친화도를 결정하고, 예상되는 결합 부위에서 발견된 3개의 리간드 결합 도메인(LBD)를 나타낸 모식도이다.
도 4의 A는 본 발명의 일 실시예에서 LT-B에 대한 GM1a-복제 펩타이드, P2의 결합 친화도를 나타낸 그래프, B는 GM1a-복제 펩타이드 P2의 농도에 따른 저해율을 나타낸 그래프이다(*P < 0.05 및 **P < 0.01)).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 장 상피 세포 HCT-8 공격 감염 후, P2의 영향을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여 염증 유발 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생산 수준을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 동물 상피 세포의 원형질막 표면에서 발견되는 모노시알로강글리오시드인 GM1a에 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 부착을 억제하기 위한 목적으로 GM1a 유사 펩타이드를 개발하였다. 파지 디스플레이 라이브러리에서 GM1a와 구조적으로 유사한 LT-B 결합 펩타이드를 선택하기 위해 LT-B 소단위를 사용했다. Biopanning은 LT-B 인식을 기반으로 하는 3개의 GM1a 유사 펩타이드를 식별하는 데 사용되었다. GM1a 유사 펩타이드가 LT-B가 GM1a에 결합하는 것을 차단함으로써 GM1a을 모방할 수 있음을 입증했다. 엔벨로프 단백질에 표시되는 파지-보여 펩타이드 라이브러리 기술을 사용하여 LT-B가 GM1a에 결합하는 것을 성공적으로 억제하는 3개의 펩타이드를 얻을 수 있었다. 이들 GM1a 유사 펩타이드는 GM1a와 유사한 기능적 활성을 가져, GM1a가 LT-B에 결합하는 것을 억제하는 효과가 있었다. 또한 인간 장 상피 세포주인 HCT-8 세포를 사용하여 GM1a 유사 펩타이드의 결합 능력, 기능적 억제 활성 및 시험관 내 효과를 평가하였으며, 이를 통해 GM1a 유사 펩타이드가 상피 세포에 대한 LT-B 결합을 억제하고 장독소성대장균 이열성독소(LT)에 의한 후속 생리학적 결과를 방지하기 위한 새로운 치료제로 작용할 수 있다는 것을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 펩타이드를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, LT-B를 이용한 접착력 검사에서 서열번호 1에 해당하는 GM1a 유사 펩타이드 P2는 대조군과 비교할 때 LT-B에 결합하는 수준이 상당히 높았다.
본 발명의 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 핵산 분자를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 핵산 분자가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 핵산 분자를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 포유류 동물 세포가 될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에는 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인드(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 상기 펩타이드의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 장독소성 대장균 감염의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다. 상기 장독소성대장균에 의한 감염 질환은 장독소성대장균 감염에 따른 급성위장관염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 펩타이드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 장독소성대장균 감염 예방 또는 개선 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1
T7 페이지 디스플레이
바이오패닝 및 파지 증식을 포함한 모든 작업은 제조업체에서 제공한 지침에 따라 수행하였다. 제조사(TB178 T7Select®System; Novagen)에서 제공한 지침에 따라 다클론 항체를 사용하여 음성 및 양성 선택 모두로 차등 바이오 패닝을 수행했다. PBS(phosphate-buffered saline)로 헹구고 1% 농도의 소 혈청 알부민에서 1시간 동안 차단한 후, 25리터의 단백질 G+ 아가로스 비드를 처리(BSA)했다. 비드를 PBS로 3회 세척한 후 T7 파지 디스플레이 cDNA 라이브러리와 함께 추가로 2시간 동안 재인큐베이션하였다. 이 과정을 두 번 반복하였다. 면역 전 IgG와 반응하는 단백질을 제거하기 위해 이 감산 바이오패닝 전략을 사용할 필요가 있다. 그 후, T7 파지 cDNA 라이브러리의 상청액을 단백질 G+ 아가로스 비드에 고정화된 다클론 항체로 처리하고, 혼합물을 섭씨 4도에서 24시간 동안 인큐베이션하도록 두었다. 결합된 T7 파지 cDNA 라이브러리는 1 PBS로 3회 세척한 후 1% 나트륨 도데실 설페이트로 용리되었다. 바이오패닝의 후속 사이클 동안, 용리액은 E. coli 균주 EDL933을 사용하여 증폭되었다. 4번의 바이오패닝 과정을 거친 후, 선택된 파지 라이브러리는 면역 스크리닝을 거쳤다.
플라크 리프트 분석
한천 플레이트에서 약 1000개의 잘 분산된 개별 파지 클론을 플라크 리프트 기술을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 멤브레인(직경 82mm HATF 필터, Millipore Corp.)을 한천 위에 씌우고 실온에서 10-15분 동안 배양했다. 한천과 플라크를 방해하지 않고 니트로셀룰로오스 막을 조심스럽게 들어 올렸다. 면역 염색 절차에는 1-2시간 동안 결합 글리칸(GM1a) LT-B와 함께 초기 배양이 포함되었다. 그런 다음 멤브레인을 헹구고 검출 시약을 적용했다. 검출 시약에는 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 염소 항-마우스 IgG가 포함되며 3,3-디아미노벤지딘(DAB) 및 0.01% H2O2를 사용한 발색이 뒤따렀다.
도킹 시뮬레이션
이 방법을 통해 병원체의 렉틴 구조를 해독하고 숙주의 수용체에 부착되는 부위를 식별할 수 있었다. 상동 모델 접근법인 SWISS-MODEL을 사용하여 GM1a(PDB ID: 6LF2) 3D 구조를 사용하여 LT(PDB ID: 1LTS)의 3차원(3D) 구조를 생성했다. 도킹 시뮬레이션은 GM1a의 3차원 구조를 이용하여 진행하였다. Chem-office 애플리케이션(http://www.cambridgesoft.com, 버전: 7.0)도 에너지 사용을 줄이기 위해 사용되었다. Autodock Vina 1.1.2는 도킹 시뮬레이션에 사용되었다. 도킹 시뮬레이션 결과를 기반으로 LigPlot에서 기본 설정으로 HBPLUS 및 비결합 접촉 매개변수를 사용하여 가능한 수소 결합 및 소수성 상호 작용을 식별했다.
고체상 펩타이드 합성
수지에서 펩타이드 합성의 초기 단계는 C-말단 아미노산을 수지에 연결하는 것이었다. 일시적인 보호 그룹은 알파 아미노 그룹과 반응성 측쇄를 중합으로부터 보호한다. 다음으로 수지를 여과하고 세척하여 부산물과 과잉 시약을 제거했다. 그런 다음 N-알파 보호기를 제거하고 수지를 다시 세척하여 부산물과 과잉 시약을 제거했다. 그 다음, 펩타이드 서열이 완성될 때까지 다음 아미노산을 첨가하였다. 그런 다음 보호 그룹을 제거하기 위해 헹구고 펩타이드를 수지에서 방출했다. 상기 과정과 마찬가지로 P2에 대해서도 동일한 프로토콜로 펩타이드 제조 합성을 진행하였다. GM1a 유사 펩타이드, P2(SYTESMAGKRE: 서열번호 1)도 유사하게 합성되었다.
펩타이드
결합 및 억제 분석
P2 펩타이드를 플레이트의 각 웰에 웰당 25ng의 농도로 코팅하였다. 블로킹 후 각 웰에 LT-B를 상온에서 2시간 동안 채우고 1% BSA로 5회 세척하였다. 다음으로, 플레이트를 4℃에서 15-16시간 동안 인큐베이션했다. 또 다른 세척 후, 플레이트를 1:10,000 희석의 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합 염색 시약으로 염색하였다. 실온에서 2시간 후 플레이트를 세척하고 마이크로 리더를 이용하여 형광을 검출하였다.
T7 파지 디스플레이를 이용한
GM1a
강글리오사이드와
관련된
LT
-B의 렉틴 수용체 식별 결과
mRNA는 T7 파지 디스플레이에 사용될 수 있도록 ETEC에서 분리되었다. mRNA를 추출한 후 cDNA를 생성하고 파지 라이브러리를 조립했다. 올리고(dT), 무작위 또는 일치하는 서브유닛 특이적 프라이머를 사용한 cDNA 합성은 동일한 양의 전사체를 생성했다. 면역 스크리닝 방법은 업계의 요구 사항과 일치하는 방식으로 수행되다. 플라크 리프트 테스트는 GM1a 글리칸과 연결된 렉틴 인자를 밝혀냈다. 두꺼운 패치가 선택 및 시퀀싱을 위해 선택되었고, 결과를 조사했다. 이에 직접적인 결과로 LT-B가 대부분 확인되었으며, LT-B를 이용하여 다음과 같은 테스트를 진행하였다(도 2 참조).
LT
-B의 리간드 결합 도메인(
LBD
)의 결정
GM1a 강글리오시드 결합 친화도에 결합하는 LT-B의 리간드 결합 도메인(LBD)은 GM1a 강글리오시드에 결합하는 렉틴 후보인 LT-B와의 도킹 시뮬레이션을 사용하여 결정되었다. LT-B의 리간드 결합 도메인(LBD)을 찾기 위해 리간드와 상호작용하는 LT-B 잔기에 대한 수소결합, 이온결합, 친화도를 고려하여 조사했다. 이것은 모든 리간드에 대해 수행했다. 이것의 직접적인 결과로 예상되는 결합 부위에서 3개의 LBD가 발견되었다(도 3 참조).
접착을 억제하는
LT
-B
LBD
펩타이드의 능력 비교 및 접착 친화도 비교
조사가 완료된 후 3개의 리간드 결합 도메인(LBD)를 발견했다. 펩타이드 서열 SYTESMAGKRE(서열번호 1)는 결합 부위의 잠재적 후보였고, 이 시퀀스를 P2라고 명명했다. LT-B를 이용한 접착력 검사를 했다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4의 A를 참조하면, P2는 대조군과 비교할 때 LT-B에 결합하는 능력 수준이 상당히 높았다. 대조군(control)은 펩타이드가 없는 매트릭스의 결합 친화도를 의미한다. 대조군과 비교할 때, P2 펩타이드는 통계적으로 유의한 변화를 나타냈다.
도 4의 B를 참조하면, 0, 10, 100 및 1000 nM의 농도로 P2가 처리되었고, 펩타이드 P2을 사용한 시험관내 처리는 농도 의존적 방식으로 LT-B 활성을 억제하였다.
펩타이드
P2에 의한 HCT-8 세포에서
LT
-B 사이토카인 생성억제
장 상피 세포 HCT-8에 의한 공격 감염 후, P2의 영향을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여 사이토카인 수준을 측정하였다. 감염 후 주요 염증 인자인 TNF-a, IL-6, IL-1b의 수치를 측정한 결과, 이들 3가지 염증 마커가 모두 감소한 것으로 나타났다(도 5 참조). 이러한 발견은 P2가 세포 표면의 GM1a와 상호작용하는 LT-능력 B를 억제하고 배양 배지에 존재할 때 이를 중화할 수 있다는 결정적인 증거를 제공한다.
Claims (6)
- 장독소성대장균 이열성독소(LT)의 B 서브유닛에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
- 제1항의 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
- 제2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제3항의 재조합 발현벡터로 형질 전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
- 제1항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 장독소성대장균 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220151130A KR102543966B1 (ko) | 2022-11-13 | 2022-11-13 | 장독소성대장균의 독소부착을 억제하는 펩타이드 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220151130A KR102543966B1 (ko) | 2022-11-13 | 2022-11-13 | 장독소성대장균의 독소부착을 억제하는 펩타이드 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102543966B1 true KR102543966B1 (ko) | 2023-06-21 |
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ID=86989515
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102543966B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8877161B2 (en) * | 2011-10-19 | 2014-11-04 | Georgia Regents Research Institute, Inc. | GM1-like peptides and uses thereof |
| KR20160089466A (ko) * | 2013-11-26 | 2016-07-27 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | 대장균증용 백신 |
| US9534020B2 (en) * | 2010-09-29 | 2017-01-03 | New York University | Immunogenic polypeptides comprising a modified loop peptide presenting the HIV-1 GP120 3074 mAb epitope and scaffold proteins containing said peptide |
-
2022
- 2022-11-13 KR KR1020220151130A patent/KR102543966B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9534020B2 (en) * | 2010-09-29 | 2017-01-03 | New York University | Immunogenic polypeptides comprising a modified loop peptide presenting the HIV-1 GP120 3074 mAb epitope and scaffold proteins containing said peptide |
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