KR102535833B1 - 자성입자를 이용한 액상 유체의 전처리용 구조물 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 구체예에서는 자성입자를 기반으로 하여, 혈액 등의 액상 유체로부터 특정 성분을 선택적으로 분리하고 회수하여 각종 진단에 적용할 수 있도록 제작된 액상 유체 전처리용 구조물 및 이를 포함하는 디바이스가 제공된다.

Description

자성입자를 이용한 액상 유체의 전처리용 구조물{Structures for Pre-treating Liquid Fluids Using Magnetic Particles}

본 개시 내용은 자성입자(또는 자성비드)를 이용한 액상 유체의 전처리용 구조물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 자성입자를 기반으로 하여, 혈액 등의 액상 유체로부터 특정 성분을 선택적으로 분리하고 회수하여 각종 진단에 적용할 수 있도록 제작된 액상 유체의 전처리용 구조물 및 이를 포함하는 디바이스에 관한 것이다.

인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 주방, 주방도구, 책상, 식기 등 일상생활 속의 물건등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.

이러한 질병을 예방하고 치료하는데 있어서 반드시 선행되어야 하는 것은 질병에 대한 진단이며, 개별적인 질병의 특성에 따라 다양한 검사 또는 진단 방법이 적용되고 있다. 이를 위하여, 문제가 발생한 것으로 의심이 되는 생체 조직을 확보하고 이를 분석하여 바이러스의 감염 여부나 생체 조직의 변형을 직접적으로 확인하는 방법, 혈액 등과 같은 액상 유체를 채취하여 그 성분을 분석함으로써 감염 여부를 간접적으로 확인하는 방법 등이 사용되고 있다.

한편, 자연발생적으로 입수되는 시료의 경우, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스가 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 특히, E.coli를 함유하는 시료의 경우에 있어서, 진단하고자 하는 타겟 병원체가 제한된 량으로 존재하기 때문에 정확한 검출을 위하여는 시료 내 바이오물질의 핵산을 효과적으로 회수하는 것이 요구된다. 이를 위하여, 정전기적 인력에 의하여 실리카 표면에 핵산을 흡착시키는 방법이 이용되었는 바, 예를 들면 핵산에 결합하는 고상물질을 이용하여 핵산을 정제하는 방법을 예시할 수 있다. 이러한 방식의 경우, 출발물질, 카오트로픽 물질(chaotropic material) 및 핵산 결합 고상물질을 혼합하고, 핵산이 결합된 고상 물질을 액체로부터 분리한 다음, 고상 물질-핵산 복합체를 세척하는 과정을 수반한다. 그러나, 카오트로픽 물질은 대표적인 생물 반응의 저해물질로 별도의 세척공정을 거쳐야 하기 때문에 간편한 상용 기술에 적용하기에는 적합하지 않다.

최근에는, 신속 정확하며 소량의 시료를 이용하여 검출할 수 있는 현장진료 테스트(point of care testing; POCT) 관련 기술에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. POCT 기술은 현재 각종 병원, 연구기관 등에서 널리 적용되고 있는 바, 특히 높은 감도 특성을 갖고 정확한 진단이 가능한 POCT를 구현하는 것은 임상 및 상용 의료 분야에서는 주된 관심사 중 하나이다. 이와 관련하여, 미세유체 디바이스를 기반으로 하는 POCT 기술이 활발히 연구되고 있는 바, 미세유체 디바이스는 미소 체적을 갖는 액상의 샘플을 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성할 수 있기 때문에 바이오 칩 제작에 적합하다.

다만, 식중독과 같은 질병 진단을 위하여는 현장에서 신속한 스크리닝이 요구되는데, 전기가 공급되지 않는 등의 제한된 환경 하에서 현장 진단을 효과적으로 구현할 필요가 있다. 이와 같이 현장 진단을 구현하기 위하여는, 전문가 및 부피가 큰 설비 없이 시료 제조 및 증폭 과정이 수행될 필요가 있다. 특히, 핵산 증폭용 시료를 제조하기 위하여는 타겟 병원체를 원료 시료로부터 분리하고, 병원체로부터 핵산을 추출해야 하며, 이때 여과, 원심분리 등을 이용하여 불순물 등을 제거할 필요가 있다.

이러한 측면에서 액상 유체를 전처리하는 바이오 칩(또는 디바이스)에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있으며, 최근에는 진단검사 분야에서 상용화 기술 및 자동화 기술로 각광받고 있다. 특히, 자성입자를 이용한 시료 전처리 기술이 분자진단 분야에서 핵산 추출 또는 CTC 검출을 위한 분리/농축/정제에 활용되면서 더욱 관심이 높아지고 있으며, 액체 생검(liquid biopsy)을 위한 엑소좀 분리가 조기 암 진단에 유용하다는 결과가 보고되고 있다.

그러나, 종래기술의 경우, 여전히 바이오 칩, 구체적으로 미세유체 기반의 바이오칩을 이용하여 현장 진단을 구현하는데 원심분리 등과 같이 액상 시료 전처리에 동력을 필요로 하는 외부 설비가 요구되는 등, 기술적 한계를 갖고 있다. 특히, 미세유체 디바이스 내에서 자성입자를 이용하여 액상 시료를 전처리함에 있어서, 종래기술에서는 유체와 자성입자 간에 원활한 접촉 등이 곤란하여 전처리 효과를 높이는데 한계가 있다.

본 개시 내용의 일 구체예에서는 자성입자(또는 자성 비드)를 기반으로 하되, 액상 시료로부터 특정 성분(예를 들면, 핵산)을 간단한 방식에 의하여 선택적으로 분리하고 회수하여 각종 진단에 적용할 수 있는 전처리용 구조물 또는 이를 이용한 액상 유체(시료)의 전처리 방법을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

하측 방향으로 감소된 폭을 갖는 편향된 사변형의 종 단면을 갖고 복수의 자성입자의 수용 공간을 제공하는 챔버로서, 상기 챔버는 상측 테두리에 의하여 경계가 정하여지고 외부로부터 액상 유체를 도입하기 위한 제1 개구부 및 하측 테두리에 경계가 정하여지는 제2 개구부를 포함함;

상기 제2 개구부와 연통되고, 상기 도입된 액상 유체의 방향을 전환시키도록 구성된 가이드 영역;

상기 가이드 영역과 연통되어 상측 경사 방향으로 연장된 제1 채널; 및

상기 제1 채널과 연통되어 하측 방향으로 연장된 제2 채널;

을 포함하고,

상기 연통된 제1 채널과 제2 채널은 복수의 자성입자의 일부 또는 전부가 외부로 배출되는 것을 방지하고 도입되는 액상 유체에 의하여 상기 복수의 자성입자가 부유하도록 유도하기 위한, 반전된 "U"자형 트랩을 형성하는 액상 유체의 전처리용 구조물이 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 제2 채널은 상기 액상 유체의 전처리용 구조물의 하측 단면 아래의 소정 길이까지 연장되며, 상기 연장된 제2 채널의 단부가 액상 유체의 배출구를 제공할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 제1 채널의 경사 각도는 챔버 내에 와류 또는 소용돌이를 형성하도록 정하여질 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 제1 채널의 경사 각도는 30 내지 60°의 범위에서 조절될 수 있다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

a) 시료로서 액상 유체를 제공하는 단계;

b) 복수의 자성입자가 수용된 전술한 전처리용 구조물의 챔버 내로 상기 액상 유체를 도입하는 단계;

c) 상기 전처리용 구조물의 챔버 내에서 상기 액상 유체를 상기 복수의 자성입자의 존재 하에서 전처리하는 단계, 여기서 상기 액상 유체의 흐름에 의하여 복수의 자성입자의 적어도 일부가 부유된 상태에서 접촉함;

d) 상기 가이드 영역에 의한 전환 방향에 대향하는(opposite) 챔버의 외측 면에 자석을 고정시키거나 인접시켜 상기 복수의 자성입자가 상기 외측 면에 대응되는 챔버의 내측 면에 고정시키는 단계; 및

e) 상기 전처리된 액상 유체를 상기 제2 채널을 경유하여 전처리용 구조물로부터 배출하는 단계;

를 포함하는 액상 유체의 전처리 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제3 면에 따르면,

전술한 전처리용 구조물;

액상 시료 및 액상 시약으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 액상 유체를 상기 전처리용 구조물의 챔버 내로 도입하도록 전처리용 구조물과 연통되는 적어도 하나의 유입 채널;

상기 전처리용 구조물에 의하여 처리된 액상 유체를 전처리용 구조물의 제2 채널을 경유하여 배출하도록 전처리용 구조물과 연통되는 적어도 하나의 배출 채널;

상기 적어도 하나의 유입 채널의 경로에 형성되어 전처리용 구조물에 유입되는 액상 유체의 흐름을 제어하기 위한 적어도 하나의 유입 펌프; 및

상기 적어도 하나의 배출 채널의 경로에 형성되어 전처리용 구조물로부터 배출되는 액상 유체의 흐름을 제어하기 위한 적어도 하나의 배출 펌프;

를 포함하는 액상 유체의 전처리용 디바이스가 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 액상 유체의 전처리용 디바이스는 2차원 형상 또는 3차원 형상을 가질 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 적어도 하나의 유입 펌프와 연통되고, 누름 및 해제에 의하여 적어도 하나의 유입 펌프를 구동시킴으로써 액상 유체가 전처리용 구조물로 유입되도록 설치된 적어도 하나의 유입 버튼; 및

상기 적어도 하나의 배출 펌프와 연통되고, 누름 및 해제에 의하여 적어도 하나의 배출 펌프를 구동시킴으로써 액상 유체가 전처리용 구조물부터 배출되도록 설치된 적어도 하나의 배출 버튼;

을 더 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 유입 버튼 및 상기 배출 버튼 각각은 수동으로 누름 또는 해제될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 유입 펌프 및 상기 배출 펌프 각각은 공압 밸브(pneumatic valve), 구동 챔버(actuation chamber) 및 유체 밸브(fluidic valve)를 포함할 수 있다.

본 개시 내용의 구체예에서 제공되는 자성입자를 이용한 액상 유체의 전처리용 구조물은 액상 유체의 유입구의 후단에 경사된 통로를 갖는 반전된 "U"자형 트랩을 구비하고 있어 전처리 과정(세포 용해와 같은 반응을 비롯하여 세척 및 용출 포함) 중 자석에 고정되지 않은 자성입자가 액상 유체의 배출구를 통하여 유출되거나 손실되는 것을 방지할 수 있는 바, 기존의 자성입자 기반의 전처리 장치에서 액상 유체가 챔버(반응 챔버)의 상측 개구부를 통하여 출입되는 구성에 비하여 효율적이다. 특히, 구조물 내에 반전된 "U"자형 트랩을 구비함으로써 제2 개구부가 챔버의 하측 부위에 위치하도록 허용함으로써 액상 유체가 도입(주입)될 때마다 바닥에 가라앉은 자성입자를 밀어올려 부유시키는 역할을 하기 때문에, 추가적인 혼합 과정을 수행하거나 혼합 수단을 사용하지 않아도 자동적으로 액상유체 내에 와류/소용돌이를 발생시키고, 그 결과 자성입자와 액상 유체 내 타겟 성분 간의 상호 작용(예를 들면, 세포 용해에 의하여 생성된 핵산 등을 자성입자 표면에 바인딩하여 포획시킴)의 확률도 크게 향상시킬 수 있는 장점을 제공한다. 더욱이, 챔버는 하측 방향으로 감소된 폭을 가지면서 편향된 형상을 갖기 때문에 액상 유체의 출입 시 자석을 이용하여 자성입자를 안정적으로 고정할 수 있는 등, 자성입자가 유실되지 않으면서도 액상유체와 충분히 혼합되고 접촉할 수 있도록 함으로써 전처리 효과를 극대화할 수 있다. 따라서, 향후 광범위한 상용화가 기대된다.

도 1은 예시적 구체예에 따른 액상 유체의 전처리용 구조물의 단면 사시도이고;
도 2는 예시적 구체예에 따른 액상 유체의 전처리용 구조물의 평면도, 단면도 및 측면도이고;
도 3a 및 도 3b 각각은 다른 예시적 구체예에 따른 액상 유체의 전처리용 구조물의 단면 사시도 및 단면도이고;
도 4는 (a) 무동력 방식의 멤브레인 디바이스에 의하여 혈액으로부터 분리된 혈장을 액상 시료로 하고, 이를 자성입자 기반의 전처리용 구조물이 구비된 무동력 방식의 미세유체 디바이스로 전처리함으로써 핵산을 추출 및 정제하는 시스템을 개략적으로 도시하는 개념도, 및 (b) 혈액 시료로부터 박테리아의 핵산을 추출 및 정제하는 일련의 과정을 보여주는 도면이고;
도 5는 실시예에서 제작된 액상 유체의 전처리용 구조물의 실계 도면(평면도, 정면도 및 단면도) 및 3D 프린터에 의하여 제작된 전처리용 구조물의 정면 사진이고;
도 6은 실시예에서 사용된 혈액으로부터 혈장을 분리하기 위한 무동력 방식의 멤브레인 디바이스의 (a) 분해도, (b) 사시도, 및 (c) 유체 흐름 경로를 보여주는 단면도이고;
도 7은 실시예에서 사용된 혈액으로부터 혈장을 분리하기 위한 무동력 방식의 멤브레인 디바이스에 있어서, (a) 멤브레인의 단면도, 평면도 및 배면도, (b) 시간에 따라 디바이스 내 수거 챔버 내에 혈장이 수집되는 과정을 도시하는 도면, 그리고 (c) 혈액 챔버 내 혈액 시료 및 수거 챔버 내 분리된 혈장 각각에 대한 광학 사진이고;
도 8은 (a) 실시예에서 자성입자 기반의 전처리용 구조물이 구비된 미세유체 디바이스의 외관 사진, 및 (b) 액상 유체의 흐름 제어 원리를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 9는 실시예에서 자성입자 기반의 전처리용 구조물이 구비된 미세유체 디바이스를 이용하여 핵산 추출 및 정제를 수행하기 위한 일련의 절차를 보여주는 사진이고;
도 10은 실시예에서 자성입자 기반의 전처리용 구조물이 구비된 미세유체 디바이스를 이용하여 핵산 추출 및 정제를 수행하는 과정 중 전처리용 구조물에서 일어나는 일련의 현상을 보여주는 사진이고; 그리고
도 11은 종래 기술에 따라 (a, b) 높은 원심력 및 낮은 원심력 하에서의 분리에 따라 추출 및 정제된 E. coli O157:H7로부터의 핵산(DNA)에 대한 PCR 증폭 후 겔 전기영동법에 의하여 분석한 결과를 (c, d) 실시예에 따라 자성입자 기반의 전처리용 구조물이 구비된 무동력 방식의 미세유체 디바이스를 이용하여 E. coli O157:H7로부터의 핵산 추출 및 정제를 수행하고, PCR 후에 겔 전기영동법에 의하여 분석한 결과를 비교하는 사진이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용된 용어는 하기와 같이 이해될 수 있다.

"액상 유체"는 협의로는 생물학적 액상 유체 또는 이와 유사한 거동을 하는 유체를 의미할 수 있으며, 광의로는 적어도 하나의 화합물 또는 성분이 액상 매질 내에 용해되거나 분산된 상태에서 액상 거동을 나타내는 유체를 포함할 수 있다.

"혈액"은 일반적으로 전혈(whole blood)를 의미할 수 있으며, 경우에 따라서는 부가 성분, 예를 들면 식염수, 영양소 및/또는 항응혈제를 함유하는 경우도 포함할 수 있다. 또한, 전혈로부터 일부 성분, 예를 들면 백혈구의 일부가 제거되도록 전처리된 혈액도 포함할 수 있다.

"채널"은 유체(특히, 액상 유체)가 소정 방향으로 이동하는 경로에 해당하는 한, 반드시 폐쇄된 형태에 한정되는 것이 아니라 개방된 형태도 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

"미세유체 디바이스"는 적어도 하나의 미세 구조물을 포함하는 디바이스를 의미할 수 있는 바, 유입구 및 배출구가 적어도 하나의 채널을 통하여 연통 또는 연결될 수 있다. 이러한 미세유체 디바이스는 밸브, 펌프, 챔버 등의 추가적인 구조를 더 포함할 수 있다.

"자성"은 강자성 및 초상자성을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있으며, 이때 "강자성"은 외부 자기장의 부존재 하에서도 자성을 나타내는 물질, 그리고 "초상자성"은 자기장 존재 시에만 강한 자성을 나타내는 특성을 의미할 수 있다.

"나노스케일"은 통상적으로 서브-마이크론 스케일, 예를 들면 약 1000 nm 이하, 구체적으로 약 100 ㎛ 이하의 형태학적 특징(morphology)을 갖는 것을 의미할 수 있다.

"바인딩(binding)"은 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.

"바이오물질"은 병원체 또는 병원성 세균을 포함할 수 있다. 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물로서, 그람 양성균 및 그람 음성균을 포함할 수 있고, 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi 등일 수 있다. 이외에도, 바이러스 종류로서 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 단순 포진 1형 및 2형 바이러스, 보다 전형적으로 알파바이러스, 아데노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스, 오쏘부냐바이러스(orthobunyavirus), 폴리오바이러스, 인간 파보바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 1, 2 및 3형의 파라인플루엔재 바이러스, 또는 임의의 확인된 바이러스를 포함할 수 있다.

"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.

"핵산"은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 핵산 또는 핵산 분자는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미로 이해될 수 있으며, 이의 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 더 나아가 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 핵산 또는 핵산 분자로서 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있다.

"타겟 유전자"는 수개, 수백 개, 수천 개 또는 수백만 개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 또한 DNA, RNA 등의 절편(fragment)도 해당될 수 있다.

"용해(lysis)"는 세포의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 유출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전 단계에서 핵산을 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.

"용해 완충액(lysis buffer)"은 세포를 용해시키기 위한 목적으로 사용되는 완충액, 예를 들면 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다.

"프라이머"는 상보적 스트랜드의 합성이 폴리머라아제에 의하여 촉매화되는 조건 하에 있는 경우, 상보적 스트랜드를 따라 핵산의 합성 또는 복제 초기 지점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드(합성 또는 천연)를 의미할 수 있다.

"증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.

"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 특정 수치 범위를 기재한 경우, 해당 범위 내 임의의 값, 그리고 해당 범위 내 임의의 2개의 값을 각각 하한값 및 상한값으로 하는 서브 조합을 모두 기재한 것으로 고려될 수 있다. 예를 들면, "1 내지 5"의 경우, 1, 2, 3, 4 및 5 각각의 값은 물론, 임의의 서브 조합을 기재한 것으로 이해될 수 있다.

"접촉한다"는 용어는 협의 상 2개의 물질간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 구성 요소와 액체 흐름 간의 접촉이 이루어지는 한, 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

임의의 구성 요소 또는 부재가 다른 구성 요소 또는 부재와 "연결된다" 또는 "연통된다"고 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 다른 구성 요소 또는 부재와 직접 연결 또는 연통되어 있는 경우뿐만 아니라, 다른 구성 요소 또는 부재의 개재 하에서 연결 또는 연통되어 있는 경우도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.

"상면" 또는 "하면"은 다른 부재와의 상대적인 배열 관계를 표시하기 위하여 편의 상 사용되는 용어로서, 본 명세서에서 상면으로 기재된 용어는 해당 부재를 직립 배치할 경우에는 "전면" 또는 "후면"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.

액상 유체의 전처리용 구조물

본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 액상 시료 등과 같은 액상 유체를 자성입자의 존재 하에서 해당 액상 유체로부터 특정 성분을 선택적으로 분리하고 회수하여 각종 진단에 적용할 수 있도록 구성된 액상유체 전처리용 구조물이 제공된다.

본 개시 내용의 예시적 구체예에 따른 액상 유체의 전처리용 구조물의 단면 사시도를 도 1에 나타내었고, 또한 액상 유체의 전처리용 구조물의 평면도, 단면도 및 측면도를 도 2에 나타내었다.

상기 도면을 참조하면, 전처리용 구조물(100)은 하우징(101) 내에 복수의 자성입자를 수용하고, 또한 상측으로부터 액상 유체(또는 액상 시료)가 도입되어 전처리되는 공간인 챔버(A)가 형성되어 있다. 도시된 구체예에 있어서, 챔버(A)는 상측에서 하측 방향으로 점차적으로 폭이 감소하는 펀넬(funnel) 형상의 공간으로 이루어져 있다. 구체적으로, 도 2에 도시된 바와 같이, 종 단면 기준으로 챔버는 사변형을 갖고 있다. 이때, 챔버(A) 중 넓은 폭을 형성하는 상측 테두리는 외부로부터 액상 유체를 도입하기 위한 제1 개구부(102)를 형성한다. 또한, 챔버(A)의 하측의 테두리에 의하여는 제2 개구부(103)가 형성되어 있다. 특히, 주목할 점은 도시된 바와 같이 챔버(A)가 챔버 내 일측 방향으로 편향된 사변형의 종 단면을 갖는다는 것이다. 이때, "사변형의 종 단면"은 반전된 원뿔형(횡 단면이 원형), 반전된 피라미드형(횡 단면이 사각형), 반전된 삼각 쐐기형(횡 단면이 삼각형) 등을 모두 포함할 수 있고, 이의 첨단부가 챔버(A)로부터 전처리된 액상 유체가 제1 채널(104)과 연통 또는 연결되는 개구 영역, 즉 제2 개구부(103)를 형성하도록 절단된 형상을 갖는다. 또한, 도 2에 도시된 바와 같이, 챔버(A)는 "편향된" 형태로 형성되어 있는 바, 구체적으로 평면 기준으로 제2 개구부(103)가 전처리용 구조물(100)의 일 측 내부 벽 방향으로 치우쳐 형성되어 있다. 이와 같이, 제2 개구부(103)가 편향된 형태로 형성될 경우, 수용되는 복수의 자성입자(도시되지 않음)를 제2 개구부(103) 측 하우징(101)의 외벽에 자석(도시되지 않음)을 부착하거나 근접시켜 하우징(101)의 대응되는 내벽에 고정 또는 포획하는데 유리하다.

도시된 구체예에 따르면, 제1 개구부(102) : 제2 개구부(103)의 면적 비는 챕머(A)의 처리용량, 후속 채널의 사이즈 등을 고려하여 정하여질 수 있는 바, 예를 들면 1 : 약 0.001 내지 0.1, 구체적으로 1 : 약 0.005 내지 0.05 보다 구체적으로 1 : 약 0.01 내지 0.02의 범위일 수 있다. 다만, 이는 예시적 취지로 이해될 수 있으며, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 도시된 구체예에 따르면, 챔버(A) 내에서 전처리(또는 처리) 과정을 거친 액상 유체는 제2 개구부(103)와 연통되면서 도입된 액상 유체의 방향을 전환시키도록 구성된 가이드 영역(104)을 거쳐 이송된다. 일 예로서, 가이드 영역(104)은 제2 개구부(103)로부터 배출된 액상 유체를 횡 방향으로 전환시킬 수 있는 형상 또는 몰폴로지를 갖도록 형성될 수 있다. 이때, 가이드 영역(104)은 유체의 방향을 전환시킬 수 있는 임의의 형상을 가지면 충분하다. 경우에 따라서는 채널 형태로 형성될 수도 있다.

도시된 예에서 가이드 영역(104)은 유체의 전환 방향으로 바닥 면이 점차적으로 상승하여 약간 축소된 사이즈를 가질 수 있는 바, 이는 챔버(A)에서 상측으로부터 하측으로 이동하는 액상 유체가 원활히 방향 전환될 수 있도록 하고, 또한 제1 채널(105) 내에서 연속적인 흐름을 용이하게 형성하도록 할 수 있기 때문이다. 다만, 액상 유체를 방향 전환시킬 수 있으면 족하므로, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

도시된 구체예에 따르면, 가이드 영역(104)은 상측 경사 방향으로 연장 형성된 제1 채널(105)과 연통되고, 또한 제1 채널(105)의 연장 방향 단부는 하측 방향으로 연장 형성된 제2 채널(106)과 연통되어 반전된 "U"자형 트랩 구조를 형성한다. 챔버(A)의 하단에 형성되어 있는 제2 개구부(103)를 통하여 전처리(처리) 과정을 거친 액상 유체가 주입됨에 따라, 액상 유체는 가이드 영역(104)을 경유하면서 방향 전환되고, 이후 제1 채널(105)의 경사면을 타고 이동하면서 제2 채널(106)을 거쳐 배출되는데, 전술한 "U"자형 트랩 구조는 액상 유체가 챔버의 벽면과 충돌함으로써 챔버(A) 내에 와류(vortex) 또는 소용돌이(swirling)의 생성을 유도할 수 있다. 이를 위하여, 제1 채널(105)의 경사 각도는 챔버(A) 내에 와류 또는 소용돌이를 형성하는 범위에서 정하여질 수 있는 바, 예를 들면 약 30 내지 60°, 구체적으로 약 35 내지 55°, 보다 구체적으로 약 40 내지 50° 범위에서 조절될 수 있다. 도시된 구체예의 경우, 제1 채널의 경사 각도는 수평 기준으로 약 45°이다. 이와 관련하여, 전술한 각도 범위가 일정 수준에 미달하거나 초과할 경우에는 챔버(A)가 종으로 과도하게 좁고 길거나 횡으로 과도하게 얕고 넓어 와류 또는 소용돌이가 영향을 주는 공간이 감소할 수 있는 만큼, 와류 또는 소용돌이를 발생시켜 자성입자와 액상 유체 간에 긴밀한 접촉을 유도할 수 있도록 전술한 범위 내에서 각도를 선정하는 것이 유리할 수 있다.

상술한 상측 경사 방향으로 연장된 제1 채널(105) 및 "U"자형 트랩 구조가 형성된 결과, 챔버(A) 내에 수용된 자성입자가 부유하여(밀어 올려져) 별도의 수단 없이도 액상 유체와 자동으로 혼합될 수 있다. 또한, 제1 채널(105)과 제2 채널(106)에 의하여 형성되는, 반전된 "U"자형 트랩 구조는 챔버 내에 수용된 복수의 자성입자의 일부 또는 전부가 가이드 영역, 제1 채널 및 제2 채널을 거쳐 구조물의 외부로 배출되는 것을 방지할 수 있는 배리어(또는 장벽)로 기능한다. 이와 같이 전처리된 액상 유체는 제2 채널(106)의 단부에 형성된 제3 개구부(107)를 통하여 외부로 배출될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 도시된 바와 같이 제2 채널(106)이 전처리용 구조물(100)의 하측 단면 아래의 소정 길이(B)까지 연장될 수 있으며, 연장된 제2 채널(106)의 단부가 액상 유체가 배출되는 제3 개구부(107)에 해당된다. 이때, 연장된 길이(B)는, 전처리용 구조물의 본체 길이(C)에 대하여, 예를 들면 약 0.1 내지 0.5, 구체적으로 약 0.2 내지 0.4, 보다 구체적으로 약 0.25 내지 0.35 범위에서 적절히 정하여질 수 있으나, 이는 예시적인 취지로 이해될 수 있다. 이처럼, 제2 채널(106)이 연장될 경우 미세유로를 포함하는 다른 구조물, 튜브, 핏팅 등과의 연결이 용이하므로 유리할 수 있다.

한편, 전처리용 구조물 내에서 가이드 영역(104)을 통하여 액상 유체가 방향 전환되어 흐르는 방향과 대향하는(반대되는) 챔버의 내측 벽(면), 구체적으로 제2 개구부(103)가 편향되어 있는 챔버의 내측 벽은 사출 성형, CNC 가공 등에서의 한계를 고려하여 수평 기준으로 소정 각도(예를 들면 약 60 내지 90°, 구체적으로 약 75 내지 90°, 보다 구체적으로 약 80 내지 90°)를 형성할 수 있다. 다만, 상술한 각도 범위는 본 구체예의 구현에 중대한 영향을 미치는 요인에 해당되는 것은 아니므로, 자석에 의하여 자성입자를 효과적으로 고정할 수 있는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.

예시적 구체예에 따르면, 전처리용 구조물(100)은 당업계에서 알려진 공정(구체적으로 성형 공정)에 의하여 제작될 수 있다. 일 예로서, 사출 성형, 칼렌더 가공, 캐스팅 가공, 압출 성형, 압출 블로우 성형, 중공 성형, 발포 성형, 압출 적층, 적층 성형, 주형, 프레스, 회전 성형, 3D 프린팅, 초음파 융착, 머시닝센터(MCT), 수치제어(CNC) 가공 등을 적용할 수 있으며, 특히 제작 비용이 저렴하고 커스터마이즈화가 용이한 3D 프린팅 기술을 적용하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 전처리용 구조물의 재질은, 예를 들면 PC, PMMA, COC, PET PP, PS, ABS 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있는 바, 특히 3D 프린팅 방식으로 제작하기 위하여 광경화형(구체적으로 자외선 경화형) 스테레오리소그래피 레진일 수 있다.

한편, 일 구체예에 따르면, 액상 유체의 전처리를 위하여 구조물(100)의 챔버(A) 내에 복수의 자성입자를 수용하는 바, 이러한 자성입자는 일시적 또는 영구적 자성을 나타낼 수 있다. 자성입자는 전형적으로 산화 철 입자일 수 있다. 산화 철은 산화 상태에 따라 크게 8가지 종류로 알려져 있는 바, 자성(강자성 또는 초상자성)을 나타내는 산화 철, 대표적으로 헤마타이트(α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(γ-Fe₂O₃) 및 자철석(마그네타이트, Fe₃O₄)을 사용할 수 있다. 특히, 마그네타이트 및 마그헤마이트 결정형의 경우 강한 자성을 가지고 있는 철광석 결정형으로서 자석을 이용한 고정 및 회수에 유리하다. 예시적 구체예에 따르면, 산화 철 입자는, 선택적으로 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 가돌리늄(Gd)으로부터 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 이중 자철석은 안료, MRI, 약물 전달 등과 같은 다양한 분야에서 사용 가능한 산화 철로서, 시판 중인 것을 사용하거나, 또는 합성하여 사용할 수도 있다. 이와 관련하여, 체외(in vitro) 진단 기기의 경우, 시료 내 생체 물질을 농축하는 과정이 수반되는 바, 자성입자를 이용할 경우에는 자석을 이용하여 외부 자기장을 인가함으로써 생체 물질이 고정(결합 또는 부착)된 자성입자만을 신속하게 분리할 수 있고, 이로부터 특정 표적 분자 또는 세포를 용이하게 분리할 수 있기 때문에 표적 성분 또는 생체 물질의 세척 및 농축에 유리하다. 특정 구체예에 있어서, 상자성 금속을 기반으로 하는 자성입자를 사용할 수 있는 바, 이러한 자성입자는 특유의 자성으로 인하여 DNA/RNA, 단백질, 항체, 형광체, 세포 등을 이의 표면에 용이하게 바인딩(또는 결합)하거나 분리할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 자성입자에 기능성을 부여할 목적으로, 자성입자(예를 들면, 산화 철 입자) 상에, 예를 들면 실리카, 금(Au), 은(Ag) 등으로부터 적어도 하나가 선택되는 재질, 구체적으로 실리카(또는 글라스)-함유 코팅층을 형성할 수 있다.

이와 같이, 실리카 등으로 코팅된 자성입자는 이의 표면 상에 하이드록실기(-OH)가 존재하는 바, 이때 실리카 또는 글라스 표면은 핵산(DNA, RNA 등)에 포함된 포스페이트기와 결합함으로써 핵산을 흡착하여 그 표면 상에 고정시키는 역할을 한다. 예시적 구체예에 따르면, 이러한 기능성 코팅층의 두께는, 예를 들면 약 100 ㎚ 이하, 구체적으로 약 1 내지 50 ㎚, 보다 구체적으로 약 10 내지 20 ㎚의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적 취지로 이해될 수 있다.

한편, 기능성 코팅층이 형성된 자성입자의 경우, 코팅층으로 인하여 자성입자는 비특이적 바인딩 특성을 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, "특이적 반응"은 특정 물질에 우선적으로 반응 또는 결합하는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 특이적 반응에서는 시료 내 특정 물질만이 반응 또는 결합하기 때문에, 예를 들면 분자진단용 단백질 검출 시스템 내에서 특이적 바인딩 특성을 가질 경우, 다양한 작용기를 고정시키는데 불리할 수 있다. 다만, 코팅층이 형성된 자성입자의 경우에 표면이 비특이적 바인딩 특성을 나타낼 수 있기 때문에 필요에 따라서는 다양한 작용기 등을 고정하여 특이적 반응을 유도할 수 있다. 이처럼, 자성입자(또는 코팅된 자성입자)는 단백질 정제, 프로테오믹스, 유전학 분야 등에 적용 가능하며. 이의 표면에는, 예를 들면 질환 표지 물질의 작용기(예를 들면, -COOH, -NH₂, -OH, -SH, -CHO, 토실기 등), 스트렙타비딘(Streptavidin), 단백질 A(Protein A), 단백질 G(Protein G), 항-마우스 IgG(예를 들면 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체)와 같은 면역진단용 시약의 항체, 및/또는 다른 리간드 특이적 분자(즉, 진단 시약의 검출용 바인더)를 고정하거나 코팅할 수 있다.

자성입자의 사이즈는 특정 범위로 한정되는 것은 아니지만, 전형적으로 나노스케일에서 마이크론 스케일 범위일 수 있는 바, 예를 들면 약 0.01 내지 10 ㎛, 구체적으로 0.1 내지 6 ㎛, 보다 구체적으로 1 내지 3 ㎛ 범위일 수 있다. 또한, 예시적 구체예에 따르면, 자성입자의 형상은, 예를 들면 구형, 로드-형, 큐빅-형, 육각-형, 삼각-형, 중공-형, 꽃과 같은 구조-형 등일 수 있으나, 합성법, 표면 에너지의 안정성, 표면적을 고려하면 구형을 갖는 것이 유리할 수 있다. 다만, 이는 예시적 의미로 이해될 수 있다. 상술한 자성입자의 투입량은 챔버의 용량, 분리/정제 전처리 대상인 바이오 물질의 농도, 자석의 세기, 챔버(A)의 벽 두께 등을 고려하여 정하여질 수 있는 만큼, 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 개시 내용의 다른 예시적 구체예에 따른 액상 유체의 전처리용 구조물의 단면 사시도 및 단면도를 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

상기 도면을 참조하면, 챔버 내 제1 개구부(202)와 제2 개구부(203) 사이의 임의의 높이에 공기 투과성 구조물(208), 구체적으로 2차원적 구조물(예를 들면, 필름 형태)이 설치되어 있으며, 나머지 구성 요소는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 실질적으로 동일하다(부재번호 100 내지 107 각각은 200 내지 207에 대응됨). 이러한 공기 투과성 구조물은 액상 유체가 해당 구조물에 스며들어(젖어) 외부로 빠져 나오지 않도록 수분의 유입 및 배출을 억제할 수 있는 한편, 공기가 비교적 자유롭게 투과할 수 있는 특성을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 공기 투과성 구조물(208)은 소수성을 갖는 재질이거나 소수성 처리된 재질의 구조물일 수 있다. 이와 관련하여, 소수성 처리 시 사용되는 물질로서, 예를 들면 PTFE(Polytetrafluoroethylene) 등을 예시할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 공기 투과성 구조물의 재질은, 예를 들면 폴리에스테르, 폴리올레핀, 천연 섬유(셀룰로오스) 또는 이의 조합일 수 있으며, 이로부터 제조된 부직포일 수 있다. 보다 구체적으로, 섬유가 랜덤 웹, 매트 또는 섬유의 융합 방식에 의하여 기계적으로 얽혀 있는 형태일 수 있다. 상기 예시된 종류 중 폴리에스테르는 수분에 대한 내성이 양호하고, 폴리올레핀, 특히 폴리프로필렌은 본질적으로 소수성을 나타낸다. 이외에도, 전술한 바와 같이, 친수성 재질의 부직포에 소수성 물질을 도포하거나 처리하여 공기 투과성 구조물(특히, 필름과 같은 2차원 구조물)을 제조할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 공기 투과성 구조물(208)의 두께는, 예를 들면 약 10 내지 1000 ㎛, 구체적으로 약 50 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 ㎛의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적 목적으로 이해될 수 있다.

액상 유체의 전처리 프로세스

본 개시 내용의 다른 구체예에 따르면, 전술한 전처리용 구조물(100, 200)을 이용하여 액상 유체(액상 시료)를 전처리하는 프로세스가 제공된다.

이러한 전처리 프로세스의 대표적인 예는 액상 시료 내 타겟 세포로부터 후속 단계에서 수행되는 진단 또는 검출에 적합한 성상의 시료를 제조하는 것이다.

일 구체예에 따르면, 먼저 시료로서 액상 유체가 제공된다. 이러한 액상 시료는 검출하고자 하는 타겟 병원체를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 액상 시료는 생체에서 유래하는 유체(fluid)일 수 있는데, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 예시할 수 있다. 또한, 이러한 액상 시료는 희석(액상) 매질, 예를 들면 물, 식염수, 완충 용액 등으로 희석된 상태로 제공될 수도 있다.

이와 같이, 액상 시료가 제공되면, 이를 전술한 전처리용 구조물(100, 200)의 제1 개구부(102, 202)를 통하여 자성입자가 수용되어 있는 챔버(A) 내로 도입된다. 이때, 자성입자는 챔버(A) 내에서 동결건조 등에 의하여 미리 수용된 상태에 있거나, 전처리를 개시하면서 제1 개구부(102, 202)를 통하여 챔버 내로 투입 또는 주입하거나, 또는 제3 개구부(107, 207)를 이용하여 챔버(A) 내로 투입 또는 주입할 수 있다. 이와 같이, 액상 시료가 챔버(A) 내에 도입됨에 따라 챔버(A) 내에 수용되어 있는 자성입자와 접촉하게 된다. 이때, 액상 시료의 흐름은 챔버(A) 내 벽면과 충돌함으로써 와류(vortex) 또는 소용돌이(swirling)를 형성함으로써 챔버 내에 수용되어 있는 자성입자와 자연스럽게 혼합되어 균일하게 접촉함으로써 전처리된다. 더 나아가, 제3 개구부(107, 207)를 이용하여 챔버 내로 투입 또는 주입할 경우, 유도되는 와류 또는 소용돌이 현상은 상측으로 경사진 제1 채널(105, 205)에 의하여 형성된 기하학적 공간 특성으로 인하여 더욱 촉진될 수 있다. 이때, 전처리 시간은, 도입되는 액상 시료의 투입량, 함유된 바이오물질의 농도, 자성입자 표면에 코팅된 기능기의 화학적 친화도(affinity) 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.1 내지 200 분, 구체적으로 약 1 내지 60 분, 보다 구체적으로 약 5 내지 20 분의 범위에서 정하여질 수 있으나, 구조물 내에서 이루어지는 전처리 타입(예를 들면, 세포 용해, 세척, 용출 등)에 따라 변화 가능한 만큼, 예시적인 취지로 이해될 수 있다.

특히, 상측 경사 방향으로 연장되어 있는 제1 채널(105, 205)과 이와 연통된 제2 채널(106, 206)에 의하여 형성된 "U"자형 트랩 구조가 챔버(A) 내에 수용된 자성입자 중 일부 또는 전부가 제1 채널과 제2 채널을 거쳐 전처리용 구조물(100, 200)의 외부로 유출되는 것을 억제할 수 있다. 또한, "U"자형 트랩 구조는 챔버(A) 내로 액상 유체가 주입될 때마다 챔버(A) 바닥에 가라앉는 자성입자(액상 유체에 비하여 밀도가 크기 때문임)를 밀어올려 부유시키고, 와류 또는 소용돌이 현상을 유도함으로써 전처리 대상인 액상 유체(또는 액상 시료)와 용이하게 접촉할 수 있도록 한다. 이러한 구조적 특징은 기존의 자성입자 기반의 전처리 디바이스에서 액상 유체가 상측의 개방 영역을 통하여 유입되고 배출되는 점과는 명확히 구별된다.

예시적 구체예에 따르면, 챔버(A) 내 액상 유체의 전처리 효과를 높이기 위하여 제3 개구부(107, 207)를 이용하여 제2 채널(106, 206)을 거쳐 가스, 예를 들면 공기, 아르곤 가스, 질소 가스 등으로부터 선택되는 적어도 하나의 가스를 주입할 경우, 제2 채널의 단부(즉, 제3 개구부) 근처에서부터 버블(bubble)의 생성을 유도하고 이러한 버블이 떠오르면서 챔버(A) 내에서 와류 또는 소용돌이 현상을 지속적으로 유지시킬 수 있다.

상술한 바와 같이, 자성입자의 존재 하에서 전처리(또는 반응)된 액상 유체가 제3 개구부를 통하여 구조물(100, 200) 외부로 배출될 수 있다. 이때, 전처리된 액상 유체와 함께 챔버 내에 존재하는 자성입자의 일부가 여전히 전처리용 구조물(100, 200)로부터 배출될 가능성이 있다. 이러한 현상을 방지하기 위하여, 편향된 위치에 형성된 제2 개구부(103, 203)에 가까운 챔버 벽면(외측면)에 자석을 부착하거나 근접시킴으로써 자성입자를 고정시킬 수 있고, 자성입자의 실질적인 유실 없이 전처리된 액상 유체를 구조물로부터 배출시킬 수 있다. 배출된 액상 유체는 당업계에서 공지된 과정(예를 들면, 검출(또는 진단), 증폭 등)을 거칠 수 있는 바, 일 예로서 미세유체 칩 등의 미세유로 내로 도입될 수 있다.

한편, 본 개시 내용의 다른 구체예에 따르면, 전처리용 구조물(100, 200)은 액상 시료 내 바이오물질, 예를 들면 병원체, 구체적으로 박테리아, 바이러스 등을 검출 또는 진단하는데 적합하도록 추출 및 정제 프로세스에 적용할 수 있다.

이러한 프로세스는 전형적으로 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 액상 시료 내 바이오물질(예를 들면, 박테리아 등)을 용해(lysis)시키고 이로부터 얻어진 추출액(핵산 함유)을 자성입자와 접촉(혼합)시켜 추출액 내 핵산을 자성입자에 바인딩시키는 단계, 추출액 중 바인딩되지 않은 성분들을 제거하기 위하여 세척 완충액을 이용하여 세척하는 단계, 및 바인딩된 핵산을 자성입자로부터 분리시키기 위하여 용출 완충액을 이용하여 용출시키는 단계를 포함할 수 있다.

상술한 프로세스에 있어서, 전술한 전처리용 구조물은 액상 시료 내 세포의 용해(예를 들면, 핵산 추출) 및 바인딩 단계, 세척 단계 및 용출 단계 중 적어도 하나, 구체적으로 추출 및 정제 프로세스 전반에 걸쳐 적용 가능하다.

예시적 구체예에 따르면, 먼저 액상 시료(바이오물질을 함유하거나(양성), 또는 함유하지 않을 수 있음(음성))을 전처리용 구조물로 도입하는 바, 액상 시료의 도입 전후 및 도입 과정 중 임의의 시점(분할 주입도 가능함)에서 세포 용해 완충액을 전처리용 구조물의 챔버 내로 주입한다. 예시적으로, 액상 시료와 세포 용해 완충액의 조합 비는, 예를 들면 체적 기준으로 1 : 약 0.1 내지 5, 구체적으로 1 : 약 0.2 내지 2, 보다 구체적으로 1 : 약 0.5 내지 1 의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 도입되는 액상 시료의 투입량, 함유된 바이오물질의 농도, 자성입자 표면에 코팅된 기능기의 화학적 친화도를 고려하여 조절 가능하다.

특정 구체예에 따르면, 용해 완충액은 화학적 방법에 의하여 세포를 용해시켜 핵산을 비롯하여 불순물인 단백질, 기타 성분 등을 용출시키는 용액이며, 용해 완충액에 첨가 가능한 버퍼(buffer) 성분의 예로서, HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼(K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, 및/또는 NaH₂PO₄), 또는 이의 조합 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 3 내지 30 mM, 구체적으로 약 5 내지 20 mM, 보다 구체적으로 약 6 내지 10 mM 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 취지로 이해될 수 있다. 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 스트렙토그리신 등과 같이 당업계에서 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 함유할 수도 있다. 예시적 구체예에 따르면, 용해 완충액으로 Chemicell사의 Cat. No. 3101-100, Cat. No.3001-100, Cat. No3301-100 등을 사용할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 용해 완충액의 pH는, 예를 들면 약 6 내지 9 구체적으로 약 6.4 내지 8.5의 범위일 수 있다.

액상 시료 내에 바이오물질이 함유된 경우, 용해 완충액의 작용에 의하여 핵산이 추출되고, 챔버 내에 수용되어 있는 자성입자(특히, 실리카 등의 재질로 코팅된 자성입자)의 기능성 표면에 핵산이 바인딩될 수 있다. 전처리 후에 남은 액상 성분(폐액)은 자석을 이용하여 자성입자를 챔버 내에 고정시킨 상태에서 가이드 영역, 제1 채널 및 제2 채널을 거쳐 전처리용 구조물 외부로 배출되어 폐기되거나 폐액 저장조로 이송될 수 있다.

세척 단계에서는 세척 완충액을 앞선 단계에서와 동일하게 전처리용 구조물(100, 200)의 챔버(A)로 도입하여 자성입자와 접촉시켜 바인딩되지 않은 불순물(예를 들면, 세포 부스러기(debris) 등)를 제거할 수 있다. 또한, 자석을 이용하여 챔버 내 자성입자가 세척에 사용된 액상 유체와 함께 배출되어 유실되는 것을 억제할 수 있다. 이와 관련하여, 세척 완충액은 당업계에 공지된 종류를 사용할 수 있는데, 예를 들면 에탄올을 함유할 수 있고, 구체적으로는 염화나트륨 및 트리스(Tris)-HCl 중 적어도 하나를 더 함유할 수 있으며, 이때 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 10 내지 100 mM, 구체적으로 약 20 내지 50 mM의 범위일 수 있다. 이 경우, 세척 완충액의 pH는, 예를 들면 약 7 내지 8, 구체적으로 약 7.6 내지 8의 범위일 수 있다. 이처럼, 세척 과정이 종료되면, 가이드 영역, 제1 채널 및 제2 채널을 거쳐 전처리용 구조물로부터 배출될 수 있고, 사용된 세척 완충액은 폐기되거나 폐액 저장조로 이송될 수 있다.

그 다음, 자성입자에 바인딩된 핵산을 분리 또는 용출시켜 핵산-함유 액상 유체를 수득하는 단계가 수행되는 바, 구체적으로 용출 완충액을 전처리용 구조물(100, 200)의 챔버(A)로 도입하여 핵산 등이 바인딩된 자성입자와 접촉시킨다. 용출 완충액으로서, 당업계에서 공지된 종류를 사용할 수 있는 바, 예를 들면 Tris-HCl를 함유할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 용해 완충액 내 Tris-HCl의 농도는, 예를 들면 약 10 내지 100 mM, 구체적으로 약 20 내지 50 mM의 범위일 수 있다. 또한, 용출 완충액의 pH는, 예를 들면 약 7.5 내지 8, 구체적으로 약 8일 수 있다. 이와 같이, 용출 과정을 거쳐 전처리용 구조물로부터 배출되는 정제된 액상 유체는 타겟 유전자(핵산 등)를 함유하며(양성인 경우), 이를 회수하여 후속 검출 또는 진단 과정(증폭 포함)을 수행할 수 있다.

본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 액상 시료 내 바이오물질의 용해 및 바인딩, 세척 및 용출의 순으로 처리하여 핵산-함유 유체를 수득하는 일련의 전처리 과정은 전처리용 구조물(100, 200)을 포함하는 단일 구조의 디바이스 형태로 구현할 수 있다. 이러한 전처리용 디바이스는 전술한 전처리용 구조물이 연결 또는 결합될 수 있고 할 수 있는 한, 다양한 2차원 또는 3차원 구조 형태로 제작될 수 있다. 2차원 구조의 디바이스로서 미세유체 기반의 디바이스 또는 바이오 칩을 예시할 수 있는 한편, 3차원 구조의 디바이스로서 카트리지를 예시할 수 있다. 이와 같이 전처리용 구조물에 대하여 복수의 액상 유체를 시간 간격을 두고 유입 및 배출하기 위하여, 디바이스는 전처리용 구조물을 중심으로 액상 유체가 이동(유입 및 배출)하는 경로를 제공하는 채널(적어도 하나의 유입 채널 및 적어도 하나의 배출 채널), 액상 유체의 흐름을 제어하기 위한 펌프 등을 포함할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 유체 흐름의 제어를 위한 펌프는 공압 밸브(pneumatic valve), 구동 챔버(actuation chamber) 및 유체 밸브(fluidic valve)를 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 자성입자 기반의 전처리용 구조물을 이용하여 혈장 내에 함유된 바이오물질로부터 핵산을 추출 및 정제하는 일련의 과정을 수행할 수 있는 액상 유체의 전처리 디바이스를 무동력 방식으로 구현한 시스템을 도 4a에 나타내었다. 또한, 도 4b에서는 혈액 시료 내 바이오물질로서 박테리아로부터 핵산을 추출 및 정제하는 일련의 과정을 보여준다.

상기 도면을 참조하면, 혈장 분리 디바이스(또는 칩) 내에 혈액이 주입된 후에 멤브레인을 이용한 분리 과정을 거쳐 혈장 성분이 수거 챔버에 수집된다. 수집된 혈장은 수거 챔버에 형성된 배출 경로 및 배출구를 통하여 배출되어 액상 시료로서 전처리 디바이스에 유입되도록 연통되어 있다. 이와 관련하여, 혈장 분리용 멤브레인 기반의 디바이스는 본 출원인의 국내특허번호 제2121953호 및 제2183082호에 개시되어 있는 바, 상기 문헌은 본 명세서의 참고자료로 포함된다.

도시된 구체예에 있어서, 전처리용 구조물은 반응 챔버로 지칭되어 있으며, 적어도 하나의 유입 펌프(즉, 제1 펌프 및 제2 펌프) 각각의 작동 및 이와 대응되는 적어도 하나의 유입 채널을 통하여 액상 유체가 전처리용 구조물로 유입된다. 이때, 제1 펌프는 혈장 수거 챔버와 연통되어 있고, 제2 펌프는 시약(예를 들면, 세척 완충액 및/또는 용해 완충액) 저장조와 연통되어 있다.

이와 유사하게, 전처리용 구조물에서 자성입자와의 접촉에 의한 전처리를 거쳐 배출되는 액상 유체는 적어도 하나의 배출 펌프(즉, 제3 펌프 및 제4 펌프) 각각의 작동 및 이와 대응되는 적어도 하나의 배출 채널을 통하여 전처리용 구조물로부터 배출된다. 도시된 구체예에 있어서, 제3 펌프는 전처리용 구조물로부터 배출되는 폐액의 저장조로 유체를 이송시키는 한편, 제4 펌프는 전처리된 액상 유체(즉, 핵산-함유 액상 유체)를 추출/정제 유체의 저장조로 이송한다.

예시적 구체예에 따르면, 펌프는 채널을 통하여 전처리용 구조물로 액상 유체가 이동하는 유입 메커니즘, 그리고 전처리용 구조물로부터 전처리된 액상 유체가 이동하는 배출 메커니즘을 제공할 수 있는 한, 당업계에서 알려진 펌프 구동 방식을 적용할 수 있다. 일 예로서, 펌프는 전자식, 기계식 및/또는 수동식으로 구동될 수 있으며, 각각의 구동 원리 및 기본 구성은 당업계에 공지된 만큼, 이에 관한 세부 기술은 생략하기로 한다.

도시된 구체예에 따르면, 적어도 하나의 유입 펌프(제1 펌프 및 제2 펌프) 각각을 구동하기 위한 적어도 하나의 유입 버튼(즉, 제1 버튼 및 제2 버튼), 그리고 적어도 하나의 배출 펌프(제3 펌프 및 제4 펌프) 각각을 구동하기 위한 적어도 하나의 배출 버튼(즉, 제3 버튼 및 제4 버튼)이 형성되어 있다. 이때, 버튼은 간단한 기계적 외력(예를 들면, 가압)에 의하여 작동될 수 있으며, 특히 손가락 등을 이용한 수동식으로 버튼의 누름(가압) 또는 해제에 의하여 펌프를 구동시킬 수 있다. 또한, 버튼과 연결된 펌프, 예를 들면 공압 밸브, 구동 챔버 및 유체 밸브 간의 일련의 개폐 작용에 의하여 유체를 소정 방향으로 이동시킬 수 있다(후술하는 실시예 참조).

도 4b를 참조하면, 시료인 혈액(1)은 적혈구와 박테리아를 함유하며(양성인 경우), 이를 혈장 분리 디바이스(또는 칩)로 도입하여 혈액을 멤브레인에 의하여 필터링할 경우에 혈장 및 박테리아는 적혈구로부터 분리된다(2). 이와 같이 분리된 박테리아-함유 혈장을 액상 시료로 하고, 이를 전처리 디바이스 내 유입 펌프의 작동에 의하여 전처리용 구조물로 도입하여 자성입자(실리카-코팅된 자성입자)의 존재 하에서 용해(lysis)시키는데, 이때 자성입자 상에 핵산이 바인딩되는 한편, 용해 과정에서 세포 부스러기 등의 불순물이 생성된다(3). 이후, 배출 펌프의 작동에 의하여 전처리용 구조물로부터 배출된 용해 추출액을 폐액 저장조로 이동시킨 결과, 챔버 내에는 핵산이 바인딩된 자성입자 및 배출되지 않은 일부 불순물이 존재한다(4).

그 다음, 유입 펌프의 작동에 의하여 세척 완충액을 전처리용 구조물로 도입하여 불순물을 제거하면, 전처리용 구조물의 챔버 내에는 핵산이 바인딩된 자성입자가 남게 되고(5), 세척 후 액상 유체는 배출 펌프의 작용으로 폐액 저장조로 이송된다.

후속적으로, 유입 펌프의 작동에 의하여 용출 완충액을 전처리용 구조물로 도입하여 자성입자로부터 핵산을 분리하고, 배출 펌프의 작동에 의하여 분리된 핵산-함유 액상 유체를 추출/정제 유체의 저장조로 이송시킨다(5).

상술한 바와 같이, 얻어진 핵산-함유 액상 유체는 증폭 반응을 거칠 수 있는데, 이때 PCR(DNA 증폭 방식), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; RNA를 이용한 등온 조건 하에서의 증폭 방식) 등과 같이 당업계에서 공지된 임의의 증폭 기술을 활용할 수 있다. 예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제593687호 등에 기재되어 있고, NASBA 방식은 EP 0 329 822 B1, 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. 또한, PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR, 등온-PCR 등을 예시할 수 있다. 이후, 증폭산물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 진단 또는 검출(detection)될 수 있는 바, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

혈장 분리 디바이스(또는 칩)의 제작

국내특허번호 제2121953호 및 제2183082호에 개시된 바에 따라 혈액으로부터 혈장을 분리하기 위한 디바이스를 제작하였다. 구체적으로, 혈장 분리 디바이스의 폭, 길이 및 높이는 각각 40 mm, 80 mm 및 5 mm이었다. 디바이스는 8개의 층, 즉 공기 필터, 상측 플레이트, 멤브레인, 하측 플레이트, 혈장 흐름 채널, 흐름 채널 커버 및 2개의 접착 테이프로 구성되었다(도 6a 참조). 이때, 상측 및 하측 플레이트 각각은 아크릴 재질이며, 3개의 폴리카보네이트 접착 테이프(노란색)가 플레이트 또는 필름 층 사이에 사용되어 주입된 혈액이 유출되는 것을 방지하도록 하였다. Vivid 혈장 분리 멤브레인(Cat. # GR T9EXPPA0200S00R; Pall Life Sciences, Port Washington, NY, USA)을 상측 플레이트와 하측 플레이트 사이의 중간 접착 테이프 상에 위치시켰다. 상측 플레이트에는 혈액 주입용 유입구가 형성되었고, 혈액 챔버 및 수거 챔버 내 공기를 벤팅하기 위하여 공기 필터(Cat. # J020A293D; Advantec, Dublin, CA, USA)를 부착하였다. 하측 플레이트 아래에는 채널을 형성하여 혈액 시료로부터 분리된 혈장을 수동식 미세유체 칩으로 이송하였다.

박테리아의 혈장 분리 디바이스 투과 정도 평가

혈장 분리 멤브레인을 액체 질소 내에서 동결시킨 후에 파손시켰고, 이온 코터를 사용하여 백금으로 코팅하여 FE-주사현미경(S-4800; Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 촬영함으로써 포어 구조를 분석하였다. 투과 효율 테스트를 위하여, 5.53ㅧ10⁸ CFU/mL에서 5.53ㅧ10³ CFU/mL까지의 농도로 E. coli O157:H7가 스파이크된 혈액 3 mL를 혈장 분리 디바이스에 주입하였다. 상기 디바이스는 3분 동안 수평으로 위치시킨 후에 4분 동안 수직으로 위치시켰다. 투과된 혈장 내 E. coli O157:H7를 튜브로 회수하고, 100 ㎕의 분리된 혈장을 LB 아가 플레이트 상에 로딩시킨 후에 콜로니 테스트를 위하여 스프레드시켰다. 이후, 플레이트를 37℃에서 18 시간 동안 배양하였고, 인-아웃 콜로니 수를 세어 E. coli O157:H7의 투과율을 산출하였다. 투과 테스트를 수행한 후, 멤브레인의 최상측 면 상에 잔류하는 혈액 시료 및 수거 챔버 내에 분리된 혈장을 광학 현미경으로 관찰하였다.

미세유체 디바이스의 제작 및 구동

미세유체 디바이스는 3개의 PDMS 층(두께: 2 mm) 및 1개의 PDMS 멤브레인(두께: 25 ㎛)로 구성되었다. 3개의 층은 각각 커버 층, 유체 채널 층 및 공압 채널 층을 형성하였다. 이러한 층 제조용 몰드는 포토리소그래피 테크닉을 이용하여 제작하였다. 공압 밸브 구조물이 PDMS 멤브레인에 접착되는 것을 방지하기 위하여, SU-8 2005 (MicroChem Corp., Westborough, MA, USA)를 먼저 실리콘 웨이퍼 상에 5 ㎛의 두께로 스핀-코팅하였다.

층 형성을 위하여, PDMS 전구체 및 열 개시제를 10 : 1의 비율로 완전히 혼합하였고, SU-8 몰드 상에 부었다. 후속적으로, PDMS 층을 85℃에서 40분 동안 베이킹하여 경화시킨 다음, 몰드로부터 박리하였다. PDMS 멤브레인은 베어 실리콘 웨이퍼 상에서 PDMS 및 열 개시제의 혼합물(7 : 1)을 1500 rpm으로 60분 동안 스핀코팅하고 150℃에서 10분 동안 베이킹함으로써 제조하였다. 먼저, 유체 채널로 패턴화된 PDMS 층을 1분 동안 산소 플라즈마 처리한 후에 PDMS 커버층에 부착시켰고, 이후 65℃에서 10분 동안 베이킹하였다. 2개의 고정된 층을 베어 실리콘 웨이퍼 상의 PDMS 멤브레인에 부착하여 유체 채널을 형성하였고, 조립된 층을 공압 채널 층과 부착하여 PDMS 멤브레인이 유체 채널과 공압 채널 사이에 위치하도록 하였다. 버튼을 눌러 공압 채널 내에 음압을 생성하고, 아크릴 로드로 공기 출구를 블로킹하며, 그리고 버튼의 누름 상태를 해제함으로써 유체 디바이스를 구동하여 설정된 량의 유체를 분주하였다. 전처리용 구조물(반응 챔버) 및 유체를 함유하는 저장조는 스테레오리소그래피 레진(JS-UV-2018-R; Kings 3D printing, Shenzhen, China)을 사용하여 3D 프린터(SLA 3D printer, Kings 3035; Kings 3D printing)에 의하여 제조하였다.

미세유체 디바이스를 이용한 DNA 추출 및 정제

중간 접착 테이프를 이용하여 혈장 분리 디바이스와 미세유체 디바이스를 조합하였다. E. coli O157:H7를 10⁸ CFU/mL에서 10³ CFU/mL까지 연속적으로 희석한 후에 3 mL의 혈액 시료에 스파이크한 다음, 무동력 혈장 분리 디바이스를 이용하여 스파이크된 혈장 시료를 수득하였다. 도 5에 도시된 설계에 따라 3d-프린잉에 의하여 전처리 구조물(반응 챔버)를 제작하였고, 100 ㎕의 혈장 시료 및 100 ㎕의 용해 완충액(Cat. # 3101??100; Chemicell, Berlin, Germany)을 실리카-코팅된 자성입자를 함유하는 전처리용 구조물(반응 챔버)에 첨가한 다음, 100 ㎕의 공기를 펌핑하여 와류를 형성하였다. 혈장 시료 내 E. coli O157:H7를 상온에서 5분 동안 용해시켰다. 전처리용 구조물 내 실리카-코팅된 자성입자를 100 ㎕의 세척 완충액 1 및 2(NX-48 bacterial DNA kit; Genolution, Seoul, Korea) 각각을 사용하여 2회 세척한 다음, 100 ㎕의 세척 완충액(NX-48 bacterial DNA kit; Genolution, Seoul, Korea)을 이용하여 E. coli O157:H7의 DNA 시료를 제조하였다.

DNA 증폭 및 전기영동

10⁸ CFU/mL에서 10³ CFU/mL까지 6가지 농도로 이루어지는 2개의 DNA 시료 세트를 제조한 다음, 열 순환법을 이용하여 증폭시켰다. 하나의 세트는 무동력 혈장 분리 및 무동력 핵산 추출 및 정제 디바이스를 이용하여 제조한 것이고, 다른 하나의 세트는 종래의 방법(즉, 원심분리, PCR 튜브 및 마이크로피펫)을 이용하여 제조된 것이다.

무동력 방법의 경우, 실험 조건은 앞서 기재된 바와 동일하였다. 종래 방식의 경우, 혈장은 2000 g에서 5분 동안 원심분리(높은 g-힘 조건)를 수행한 후에 분리하였고; 그 다음, 앞서 기재된 바와 같이 동일한 체적의 완충액을 이용하여 PCR 튜브 내에서 수동으로 정제된 DNA를 제조하였다. 또 다른 2개의 DNA 시료 세트를 동일한 방식으로 반복하여 제조하였다. 다만, 혈장은 1200 g에서 20분 동안 원심분리(낮은 g-힘 조건)를 수행한 후에 분리하였다.

E. coli O157:H7의 염기서열은 GenBank로부터 입수하였고, eaeA 유전자를 타겟 유전자로 선택하였다. E. coli O157:H7의 DNA 증폭의 경우, forward 프라이머 및 reverse 프라이머는 각각 5′-GACCCGGCACAAGCATAAGC-3′ 및 5′-CCACCTGCAGCAACAAGAGG-3′이었다. 타겟 유전자의 앰플리콘 사이즈는 382 bp이었다. 추출된 E. coli gDNA를 PCR 칵테일(dNTP(dATP, dGTP, dCTP, and dTTP), MgSO4, ㅍ라이머 및 폴리머라아제를 포함함)과 혼합하였고, 이후 용액을 피펫을 이용하여 수동으로 PCR 튜브 내에 로딩하였다. PCR은 열 순환기(Bio-Rad, C1000 Touch)를 이용하여 하기의 순환 조건 하에서 수행하였다: 예비변성을 위하여 95℃에서 30초, 이중 스트랜드를 변성시키기 위하여 95℃에서 30초, 단일 스트랜드 DNA 주형에 각각의 프라이머를 어닐링하기 위하여 60℃에서 30초, 폴리머라아제에 의하여 주형 스트랜드에 상보적인 DNA 스트랜드 합성하기 위하여 72℃에서 30초, 그리고 최종 연장을 위하여 72℃에서 30초.

열적 사이클을 35회 반복하였다. 전기영동은 PCR 증폭산물을 동정하기 위하여 2% 아가로오스 겔 상에서 수행하였다. 전기영동 후, PCR 증폭 산물의 사이즈(384 bp)를 UV 트랜스일루미네이터(Slite 140; Avegene, Taipei, Taiwan)를 이용하여 체크하였다.

무동력 혈장 분리

도 6에 도시된 바와 같이 멤브레인 필터 및 유체 제어에 기초하여 혈액 시료에 대한 무동력 전처리를 수행하였다. 혈장 분리 디바이스는 수동식으로 조작할 수 있도록 필름 및 플라스틱 플레이트로 제작하였고, 혈장 분리를 위하여 디바이스를 평평한 표면 상에 위치시켰으며, 1 mL의 혈액 시료를 3회(총 3 mL) 유입구(도 6b에서 상측 플레이트(푸른색)의 좌측 홀) 내로 주입하였다. 후에 주입된 혈액이 앞서 주입된 혈액을 상측 플레이트 내에 형성된 혈액 챔버 내로 밀어내도록 하였다. 챔버 내부에 이미 존재하는 공기는 상측 플레이트에 부착된 공기 필터를 통하여 빠져나가도록 하여 혈액이 용이하게 흘러 챔버 내에 공극을 남기지 않도록 하였다(도 6c). 또한, 혈액이 유입됨에 따라 멤브레인 필터는 즉시 습윤화되고, 혈장이 멤브레인을 침투하는 한편, 혈구 세포는 멤브레인 필터의 3차원 네트워크 구조의 마이크로포어 구조에 의하여 포획되었다. 투과 시 구동력은 마이크로포어에 의하여 형성된 모세관력이고, 모세관 현상 역시 챔버 내부로 주입된 혈액을 당기도록 하는 보조 구동력으로 작용한다.

멤브레인 표면 상에서 수직 방향으로 혈장이 투과됨에 따라, 마이크로포어의 사이즈는 감소하는 바(도 7a 참조), 궁극적으로 혈장은 멤브레인의 후면 상에서 흘러나왔다(도 7b 참조). 그러나, 이러한 멤브레인 기반의 혈장 분리는 연속적으로 작동할 수 없었다. 마이크로포어 구조에 의하여 포획된 혈구 세포가 많을수록 혈장의 침투 경로는 혈구 세포에 의하여 더욱 방해받게 된다. 따라서, 상술한 분리 디바이스는 혈장 침투가 완전히 블로킹될 때 한계 상태에 도달하게 되고, 분리 프로세스는 혈구 세포가 모세관 력에 의하여 터져나올 때 중단된다(적혈구 내 헤모글로빈은 주지의 PCR 저해제에 상당함).

분리 프로세스 과정에서 혈장은 모세관 력 및 일부 중력에 의하여 혈장 챔버 방향으로 멤브레인 필터를 투과하였다(도 7b의 가운데 사진 참조). 그러나, 디바이스가 수평으로 배치될 경우에는 챔버 내 분리된 혈장이 수거 챔버까지 저절로 횡 방향으로 이동하지는 않았다. 디바이스를 직립 배치할 경우, 중력이 혈장 챔버 내 분리된 혈장을 수거 챔버로 밀어내었다. 이때, 분리된 혈장의 량을 극대화하기 위한 최적의 조건은 시료 주입 시 수평 위치에서 3분, 그리고 혈장 수거 시 직립 위치에서 4분이었다.

그 결과, 총 7분 동안 분리를 수행한 결과, 전력 또는 추가적인 기구 사용 없이도 150 ㎕까지의 혈장이 분리되어 수거되었다. 주입된 혈액 시료의 체적(3 mL)에 대하여 적은 량의 혈장이 수득되었다. 상당 량의 혈장은 회수되지 못하였는 바, 이는 사용된 혈액 시료의 일부분이 혈장 분리 멤브레인의 제한된 용량으로 인하여 혈장 분리 디바이스 내에서 필터링되지 않은 상태로 남아있기 때문이다. 따라서, 혈장 분리 디바이스의 면적을 증가시킬 경우, 혈장 회수량을 증대시키는데 도움이 될 것으로 판단된다.

박테리아의 혈장 분리 멤브레인의 투과

전기가 공급되지 않는 지역에서 패혈증의 증상을 갖는 환자가 있다는 가정하에서, E. coli O157:H7와 같은 병원체는 전처리 후에도 분리된 혈장 내에 잔류한다. 이러한 요건을 충족하기 위하여, 현장에서 혈액 시료를 제조하여 무동력 혈장 분리 디바이스를 이용하여 혈구로부터 병원체를 분리하였다. 전술한 바와 같이, 혈장 분리 멤브레인은 3차원의 마이크로포어 네트워크 구조를 갖고 있고, 포어 사이즈는 수직 방향으로 변화한다. 상단 표면은 30-100 ㎛ 범위의 큰 포어를 갖고 있는 반면, 바닥 표면은 1-16 ㎛ 범위의 보다 작은 포어를 갖고 있다(도 7a 참조). 이러한 사이즈 차이는 혈구 세포가 혈액 시료로부터 효과적인 스크리닝하는 것을 용이하게 하는 바, 이는 세포가 무동력 혈장 분리 과정에서 멤브레인의 3차원 네트워크에 의하여 포획되기 때문이다. 멤브레인 상단 면의 혈액 시료 및 혈장 챔버 내로 분리된 혈장을 광학 현미경으로 관찰할 경우, 혈액 시료 내 적혈구가 관찰되었으나, 분리된 혈장에서는 관찰되지 않았다(도 7c 참조). 따라서, 무동력 혈장 분리 디바이스는 설계된대로 작동하는 것으로 판단되었다.

적혈구 및 백혈구와 달리, E. coli O157:H7는 전형적인 그램-음성 로드형 박테리아로서 1-2 ㎛ 길이 및 약 0.5 ㎛ 반경을 갖는 상대적으로 작은 실린더 형상을 갖고 있다. 멤브레인의 바닥 표면의 포어 사이즈를 고려하면, E. coli O157:H7는 충분히 투과될 정도로 작은 크기를 갖고 있다. 그러나, E. coli O157:H7가 적혈구 세포막과 같은 다른 물질에 부착될 가능성도 높다.

따라서, DNA 추출 및 정제에 앞서 무동력 혈장 분리를 통하여 E. coli O157:H7의 투과 현상을 관찰할 필요가 있다. 얼마나 많은 E. coli O157:H7 박테리아가 멤브레인 필터를 통과하는지 테스트하기 위하여, 희석된 E. coli O157:H7(10⁸ CFU/mL에서 10³ CFU/mL까지)을 혈액 시료에 스파이크하였고, 이를 무동력 혈장 분리 디바이스에 주입하여 LB 아가 플레이트에서 분리된 혈장을 배양하였고, 주입된 시료 대비 E. coli O157:H7 콜로니를 세었다. 그 결과, 투과율은 약 1%로서 매우 낮았는 바, 이는 적혈구에 부착되었기 때문으로 추측되었다 투과율이 낮음에도 불구하고, 낮은 농도(10³ CFU/mL)에서도 E. coli O157:H7은 멤브레인 필터를 투과하였다. 이러한 결과는 무동력 혈장 분리 디바이스가 낮은 검출 한계 및/또는 높은 진단 감도로 다운스트림 프로세스를 가능케 함을 보여준다. 또한, 높은 농도(10⁷ CFU/mL 및 10⁸ CFU/mL)의 경우, 낮은 농도에 비하여 낮은 투과율을 나타내었다. 이외에도, 혈장 분리 디바이스 내로 주입하기에 앞서 혈액 시료에 대한 추가적인 초음파 처리 또는 와류 형성은 박테리아의 응집을 제거하여 투과율을 높이는데 기여할 수 있다.

무동력 핵산 추출 및 정제

병원체로부터 핵산을 추출하고 정제하기 위한 방법들 중 최근에 각광받는 방법은 용해 완충액으로 세포를 파열시킨 다음, 실리카-코팅된 자성입자를 사용하여 핵산을 용출시키는 것이다. 이러한 프로세스는 자동화된 핵산 추출기 또는 마이크로피펫을 이용한 수동 방식에 의하여 수행되고 있다. 그러나, 이러한 장치는 현장에서의 진단 환경에서는 입수가 용이하지 않고, 자동화된 핵산 추출기 역시 마찬가지이다. 마이크로피펫의 경우에도 전문적인 기술을 필요로 하므로 비전문가가 수행하는데 한계가 있다. 이러한 곤란성을 해결하기 위한 방안으로 도 8a에 도시된 수동식 미세유체 디바이스를 기반으로 하는 무동력 핵산 추출기를 사용할 수 있다.

상기 도면을 참조하면, 무동력 디바이스는 4개의 펌프를 포함하는 바, 각각의 펌프는 하나(제1 펌프 및 제2 펌프; 작은 체적용으로 프레싱 당 5 ㎕의 주입) 또는 2개(제3 펌프 및 제4 펌프; 큰 체적용으로 프레싱 당 10 ㎕의 주입)의 구동 챔버를 구비한다. 이때, 하나의 구동 챔버는 구동 당 5 ㎕의 유체를 펌핑한다. 밸브 및 구동 챔버 각각은 PDMS 멤브레인에 의하여 구획된 공압 채널 및 유체 채널을 나란히 조립하여 구성한 것이다(도 8b 참조). 구동 챔버 및 밸브 1은 공압 채널 내 압력 변화(버튼의 누름 및 해제에 의하여 유발됨)에 의하여 구동되는 한편, 밸브 2는 공압 채널이 아닌 유체 채널 내 압력 변화에 의하여 구동된다. 펌프 버튼을 누르는 경우, 공압 채널 내 압력을 증가시켜 밸브 1의 폐쇄를 유도하고 구동 챔버를 가압하여 유체 채널 내 압력을 빌드-업시킴으로써 밸브 2를 개방하고 정해진 체적의 유체가 배출되도록 한다. 이와 반대로, 펌프 버튼 상의 압력을 해제할 경우, 공압 채널 내 압력을 감소시켜 밸브 1을 개방하고 구동 챔버의 가압을 낮춘다. 그 결과, 유체 채널 내 압력 강하로 인하여 밸브 2가 폐쇄되고, 구동 챔버를 유체로 채우게 된다. 이처럼, 펌프 버튼의 누름(가압) 및 해제를 반복하여 역류 없이 조절된 량의 유체를 흐르게 할 수 있다.

상술한 원리에 기초하여, 전기 없이 용해, 세척 및 용출을 수행하도록 무동력 핵산 추출 및 정제 디바이스를 설계하였고, 전술한 무동력 혈장 분리 디바이스로부터 수집된 혈장 내 E. coli O157:H7로부터 핵산을 추출하여 정제하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 디바이스는 4개의 펌프, 전처리용 구조물(반응 챔버) 및 3개의 저장조를 포함한다. 4개의 펌프는 혈장 이송, 완충액 주입, 폐액 배출 및 시료 배출용 유체를 펌핑하도록 할당하였다. 제1 펌프(혈장 이송, 구동 챔버, 구동 당 5 ㎕) 및 제2 펌프(완충액 주입, 구동 챔버, 구동 당 10 ㎕)는 유체를 전처리용 구조물(반응 챔버) 내로 주입하는 한편, 제3 펌프(폐액 배출, 구동 챔버, 구동 당 10 ㎕) 및 제4 펌프(시료 배출, 구동 챔버, 구동 당 5 ㎕)는 전처리용 구조물로부터 유체를 배출하였다. 용해, 세척 및 용출과 같은 순차적 반응은 실리카-코팅된 자성입자(MNP)를 함유하는 전처리용 구조물(반응 챔버) 내에서 일어났고, 3개의 저장조는 완충액, 폐액 및 용출된 DNA를 저장하는데 사용하였다. 작동에 앞서 전처리용 구조물로부터 제3 및 제4 펌프로 시약이 역류하는 것을 방지하기 위하여, 밸브(capillary burst valve; 도 8에서 도시되지 않음)가 전처리용 구조물 및 제3 및 4 펌프를 연결하는 미세채널 내로 통합되었다.

저장조는 유입구 또는 배출구 내로 삽입된 실린더형 용기이었다. 그러나, 전처리용 구조물은 전처리용 구조물로부터 배출되지 않아야 하는 자성입자로 인하여 복잡한 구조를 갖도록 하였다. 특히, 반전된 "U"자형 트랩 구조를 갖는 펀넬 형상으로 인하여 실리카-코팅된 자성입자 용해 프로세스 과정에서 바닥으로 가라앉는 것, 그리고 세척 및 용출 단계에서 유출되는 것을 방지하였다(도 9 및 도 10 참조).

도 4를 다시 참조하면, 평면도에 있어서, 전처리용 구조물(반응 챔버)은 하측 방향으로 좁아지는 펀넬 형상을 갖고 있고, 유체의 유입구/배출구는 임의의 벽에 편향되어 있어 자성이 자성입자를 안정적으로 고정하도록 한다. 단면도에 따르면, 반전된 "U'자형 채널은 45ㅀ의 경사를 갖고 있어 자성입자가 유출되지 않도록 하는 배리어로 작용하며, 주입된 유체 또는 공기가 가라앉은 실리카-코팅된 자성입자를 교란시키기 위한 도약대로 기능한다.

혈장 분리 디바이스와 결합되는 방식으로 무동력 핵산 추출 및 정제 디바이스는 펌프 버튼을 간단히 누르는 것만으로 작동된다(도 9 참조). E. coli O157:H7를 함유하는 100 ㎕의 혈장을 플라즈마 분리 디바이스의 수거 챔버로부터 제1 펌프를 거쳐 전처리용 구조물(반응 챔버) 내로 이송하였는 바, 전처리용 구조물에서 박테리아는 실리카-코팅된 자성입자(MNP)와 혼합되었다. 그 다음, 100 ㎕의 용해 완충액을 제2 펌프에 의하여 전처리용 구조물 내로 주입하여 핵산이 박테리아로부터 추출되어 실리카-코팅된 자성입자의 표면에 바인딩되도록 유도하였다. 용해 완충액의 주입 이후, 100 ㎕의 공기를 제2 펌프를 통하여 추가적으로 주입하여 종래의 방식에서 충분한 교반을 위한 와류 믹서를 모사하였다. 제2 펌프 버튼을 누르면, 10 ㎕의 주입된 공기는 자성입자가 용해 완충액 내에서 효과적으로 소용돌이되도록 유도하여 전처리용 구조물의 챔버 내에서 버블을 생성하였다. 다만, 버블이 전처리용 구조물을 넘치도록 하지는 않았으나, 5분 간의 인큐베이션 과정에서 점차적으로 사라졌다. 인큐베이션 후, 제3 펌프에 의하여 전처리용 구조물로부터 액체를 제거하였고, 동일한 방식으로 100 ㎕의 세척 완충액 1 및 2를 주입하는 과정을 반복하였으며, 그 다음 제2 및 제3 버튼을 이용하여 세포 부스러기를 제거하였다. 잔여 에탄올(PCR을 저해할 수 있음)을 제거하기 위하여 전처리용 구조물을 건조시킨 다음, 100 ㎕의 용출 완충액을 제2 펌프에 의하여 전처리용 구조물로 이송하였으며, 정제된 DNA를 제4 펌프에 의하여 최종적으로 펌핑하여 시료 저장조로 배출하였다. 이러한 방식으로, 간편하게 수동으로 버튼을 누르는 것만으로 전체적인 핵산 추출 및 정제 프로세스를 성공적으로 수행하였다.

이러한 디바이스를 종래의 튜브-기반의 방법과 비교하였다. 이때, 실리카-코팅된 자성입자를 공통적으로 사용하였다. 그 결과, 실시예에 따른 디바이스가 종래의 튜브-기반의 방법을 간편하게 대체할 수 있음을 확인하였다.

시료 제조용 디바이스의 성능 평가

실시예에 따른 시료 제조 디바이스의 성능을 평가하기 위하여, 혈장 분리, 핵산 추출 및 정제에 의하여 수득된 DNA를 증폭한 결과를 종래의 원심분리, 마이크로피펫 및 PCR 튜브를 이용한 시료 전처리 결과와 대비하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 종래의 방법 중 높은 g-힘 원심분리를 수반하는 경우, 10⁸ CFU/mL에서 10⁴ CFU/mL까지의 밴드는 관련 PCR 마커 밴드에 존재하였다. 한편, 실시예에 따른 방법의 경우, 10⁸ CFU/mL에서 10³ CFU/mL까지의 PCR 밴드가 명확히 존재하였다(도 11a 및 도 11c 참조). 또한, 혈액 시료 내 E. coli O157:H7의 농도가 증가함에 따라 밴드 강도 역시 점차적으로 상승한 반면, 음성 대조군에서는 밴드가 관찰되지 않았다. 이는 시료 전처리 방법이 타겟 유전자를 정확하게 제조하였음을 지시한다.

실시예에 따른 시료 제조방법에서는 높은 g-힘 조건의 종래 방법에 비하여 보다 낮은 검출 한계를 나타내었다. 이러한 결과는 혈구뿐만 아니라 박테리아가 원심 분리 과정에서 혈장에 존재하기 곤란한 것으로 고려될 수 있다. 높은 g-힘 원심분리에서와 달리, 낮은 g-힘 원심분리에서는 10⁸ CFU/mL에서 10³ CFU/mL까지의 PCR 밴드가 존재하였는 바(도 11b 참조), 이는 박테리아가 낮은 g-힘으로는 원심분리되지 않았음을 시사한다. 실시예의 경우, 혈구를 제거하는데 외부 힘이 인가되지 않아 혈장 분리 과정 중 혈장 내에 소량의 병원체가 존재할 수 있다. 실시예에 따른 방법의 경우, 낮은 g-힘 조건의 종래 방법과 동일한 검출 한계(10³ CFU/mL)를 나타내었다(도 11d 참조). 이는 실시예에 따른 방법이 원심 분리 조건에 의한 영향 없이도 저농도의 병원체를 안정적으로 전처리할 수 있음을 보여준다. 따라서, 고감도의 생체 외 진단에 사용될 수 있고, 종래 방법에서 위음성 확률을 낮추는 장점을 갖는다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

100, 200: 액상 유체의 전처리용 구조물(반응 챔버)
101, 201: 하우징
102, 202: 제1 개구부
103, 203: 제2 개구부
104, 204: 가이드 영역
105, 205: 제1 채널
106, 206: 제2 채널
107, 207: 제3 개구부
208: 공기 투과성 구조물

Claims (18)

1. 하측 방향으로 감소된 폭을 갖는 편향된 사변형의 종 단면을 갖고 복수의 자성입자의 수용 공간을 제공하는 챔버로서, 상기 챔버는 상측 테두리에 의하여 경계가 정하여지고 외부로부터 액상 유체를 도입하기 위한 제1 개구부 및 하측 테두리에 경계가 정하여지는 제2 개구부를 포함함;
   상기 제2 개구부와 연통되고, 상기 도입된 액상 유체의 방향을 전환시키도록 구성된 가이드 영역;
   상기 가이드 영역과 연통되어 상측 경사 방향으로 연장된 제1 채널; 및
   상기 제1 채널과 연통되어 하측 방향으로 연장된 제2 채널;
   을 포함하고,
   상기 연통된 제1 채널과 제2 채널은 복수의 자성입자의 일부 또는 전부가 외부로 배출되는 것을 방지하고 도입되는 액상 유체에 의하여 상기 복수의 자성입자가 부유하도록 유도하기 위한, 반전된 "U"자형 트랩을 형성하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
2. 제1항에 있어서, 상기 제2 채널은 상기 액상 유체의 전처리용 구조물의 하측 단면 아래의 소정 길이까지 연장되며, 상기 연장된 제2 채널의 단부가 액상 유체의 배출구를 제공하는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1 채널의 경사 각도는 챔버 내에 와류 또는 소용돌이를 형성하도록 정하여지는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
4. 제3항에 있어서, 상기 제1 채널의 경사 각도는 30 내지 60°의 범위에서 조절되는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
5. 제1항에 있어서, 상기 가이드 영역의 전환 방향에 대향하는 챔버의 내측 면은 수평 기준으로 60 내지 90°의 각도로 형성되는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
6. 제1항에 있어서, 상기 전처리용 구조물은 사출 성형, 칼렌더 가공, 캐스팅 가공, 압출 성형, 압출 블로우 성형, 중공 성형, 발포 성형, 압출 적층, 적층 성형, 주형, 프레스, 회전 성형, 3D 프린팅, 초음파 융착, 머시닝센터(MCT) 및 수치제어(CNC) 가공으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공정에 의하여 제작된 것임을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
7. 제1항에 있어서, 상기 챔버 내 제1 개구부와 제2 개구부 사이의 임의의 높이에 공기 투과성 구조물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
8. 제7항에 있어서, 상기 공기 투과성 구조물의 재질은 폴리에스테르, 폴리올레핀, 천연 섬유 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
9. 제8항에 있어서, 상기 공기 투과성 구조물의 두께는 10 내지 1000 ㎛ 범위에서 정하여지는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 구조물.
10. a) 시료로서 액상 유체를 제공하는 단계;
    b) 복수의 자성입자가 수용된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 전처리용 구조물의 챔버 내로 상기 액상 유체를 도입하는 단계;
    c) 상기 전처리용 구조물의 챔버 내에서 상기 액상 유체를 상기 복수의 자성입자의 존재 하에서 전처리하는 단계, 여기서 상기 액상 유체의 흐름에 의하여 복수의 자성입자의 적어도 일부가 부유된 상태에서 접촉함;
    d) 상기 가이드 영역에 의한 전환 방향에 대향하는(opposite) 챔버의 외측 면에 자석을 고정시키거나 인접시켜 상기 복수의 자성입자가 상기 외측 면에 대응되는 챔버의 내측 면에 고정시키는 단계; 및
    e) 상기 전처리된 액상 유체를 상기 제2 채널을 경유하여 전처리용 구조물로부터 배출하는 단계;
    를 포함하는 액상 유체의 전처리 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 복수의 자성입자는 기능성 코팅층을 갖고,
    여기서 상기 기능성 코팅층의 재질은 실리카, 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 자성입자의 사이즈는 0.01 내지 10 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 제2 채널을 통하여 상기 전처리용 구조물의 외부로부터 챔버 측으로 가스를 주입하여 상기 액상 유체가 도입된 챔버 내에 와류 또는 소용돌이 현상을 유지하는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리 방법.
14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 전처리용 구조물;
    액상 시료 및 액상 시약으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 액상 유체를 상기 전처리용 구조물의 챔버 내로 도입하도록 전처리용 구조물과 연통되는 적어도 하나의 유입 채널;
    상기 전처리용 구조물에 의하여 처리된 액상 유체를 전처리용 구조물의 제2 채널을 경유하여 배출하도록 전처리용 구조물과 연통되는 적어도 하나의 배출 채널;
    상기 적어도 하나의 유입 채널의 경로에 형성되어 전처리용 구조물에 유입되는 액상 유체의 흐름을 제어하기 위한 적어도 하나의 유입 펌프; 및
    상기 적어도 하나의 배출 채널의 경로에 형성되어 전처리용 구조물로부터 배출되는 액상 유체의 흐름을 제어하기 위한 적어도 하나의 배출 펌프;
    를 포함하는 액상 유체의 전처리용 디바이스.
15. 제14항에 있어서, 상기 액상 유체의 전처리용 디바이스는 2차원 형상 또는 3차원 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 디바이스.
16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유입 펌프와 연통되고, 누름 및 해제에 의하여 적어도 하나의 유입 펌프를 구동시킴으로써 액상 유체가 전처리용 구조물로 유입되도록 설치된 적어도 하나의 유입 버튼; 및
    상기 적어도 하나의 배출 펌프와 연통되고, 누름 및 해제에 의하여 적어도 하나의 배출 펌프를 구동시킴으로써 액상 유체가 전처리용 구조물부터 배출되도록 설치된 적어도 하나의 배출 버튼;
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 디바이스.
17. 제16항에 있어서, 상기 유입 버튼 및 상기 배출 버튼 각각은 수동으로 누름 또는 해제되는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 디바이스.
18. 제15항에 있어서, 상기 유입 펌프 및 상기 배출 펌프 각각은 공압 밸브(pneumatic valve), 구동 챔버(actuation chamber) 및 유체 밸브(fluidic valve)를 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 유체의 전처리용 디바이스.

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