KR102530956B1 - Alzheimer's disease vaccine composition comprising epitope derived from amyloid beta as effective component and thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 상기 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 백신 조성물은 아밀로이드 베타의 생성을 효과적으로 감소시킴으로써, 알츠하이머병 또는 치매 등과 같은 아밀로이드 베타 집적 관련 질환에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a vaccine composition comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a fusion protein of the peptide and a carrier protein as an active ingredient for the prevention or treatment of amyloid beta accumulation-related diseases and its use. By effectively reducing the production of amyloid beta, the vaccine composition according to the present invention can be usefully used for fundamental prevention or treatment of amyloid beta accumulation-related diseases such as Alzheimer's disease or dementia.
Description
본 발명은 아밀로이드 베타(amyloid beta) 유래 에피토프를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an Alzheimer's dementia vaccine composition comprising an amyloid beta-derived epitope as an active ingredient and a use thereof.
알츠하이머병은 비정상적 단백질의 응집이 신경 세포의 사멸 유도 및 신경교세포의 활성을 유발하여 뇌의 기능을 저하시키는 퇴행성 뇌 질환이다. 이로 인해, 현대의 알츠하이머병 연구는 비정상적 단백질의 축적을 제어하는 것에 초점이 맞춰져 있으며, 특히 비정상적 축적 단백질의 단위체라 할 수 있는 아밀로이드 베타 (Amyloid beta, Aβ 또는 Abeta)가 발병 요인으로 알려져 있다.Alzheimer's disease is a degenerative brain disease in which abnormal protein aggregation induces the death of nerve cells and activates glial cells, thereby reducing brain function. For this reason, modern Alzheimer's disease research focuses on controlling the accumulation of abnormal proteins, and in particular, amyloid beta (Aβ or Abeta), which can be referred to as a unit of abnormally accumulated proteins, is known to be an onset factor.
아밀로이드 베타는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 주요 성분으로서, 36 내지 43의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 만들어진다고 알려져 있다. 아밀로이드 전구 단백질은 β-와 γ-세크레타아제에 의해 분해되는데, 상기 분해효소를 타겟으로 하여 아밀로이드 베타의 농도를 줄이는 연구가 진행되어 왔으나, 아밀로이드 베타의 생성 기전을 타겟으로 하는 치료물질들은 알츠하이머병에 대한 치료효과가 미미한 실정이다.Amyloid beta is a major component of amyloid plaques found in the brains of patients with Alzheimer's disease, and is a peptide consisting of 36 to 43 amino acids and is known to be made from amyloid precursor protein (APP). Amyloid precursor protein is degraded by β- and γ-secretase. Research has been conducted to reduce the concentration of amyloid beta by targeting the degrading enzyme, but therapeutic substances targeting the production mechanism of amyloid beta are not suitable for Alzheimer's disease. The treatment effect is insignificant.
비정상적 단백질의 제거를 위해, 일반적인 천연물질이 아닌 인간 B 세포에서 생산된 아밀로이드 베타에 특이적인 단클론항체에 관한 연구가 진행되고 있으나, 부작용으로 인해 임상이 중단된 상황이다. 이로 인해 정제하는 방식이 아닌, 체내의 B 세포를 이용한 체액성 면역을 이용하여 치매 단백질을 제거하는 연구가 새로이 각광받고 있으나, 아직까지 시작단계에 불과하다.In order to remove abnormal proteins, research on monoclonal antibodies specific to amyloid beta produced in human B cells, which are not common natural substances, is being conducted, but clinical trials have been discontinued due to side effects. For this reason, research on removing dementia proteins using humoral immunity using B cells in the body, rather than a purification method, has been newly spotlighted, but it is still only at the beginning stage.
체내에 생성되는 아밀로이드 베타를 제거하기 위해, 아밀로이드 베타를 투여하여 그것에 대한 항체를 생성시킨 다음, 향후 아밀로이드 베타가 생성되었을시 빠르게 처리할 수 있는 것이 체액성 면역을 기반으로 한 단백질 제거의 원리이다. 하지만 전체 서열 길이의 펩타이드를 투여하여 항체를 생성하기에는, 여러 면역 세포를 자극하여 부작용을 일으킬 수 있는 원인이 되므로, B 세포 특이적인 단백질 서열을 찾는 것이 필요하다. 또한, 짧은 서열을 사용할 경우 안정적으로 B 세포 수용체와 결합할 수 있는 화학적 변형도 필요하다.In order to remove amyloid beta generated in the body, the principle of protein removal based on humoral immunity is to administer amyloid beta to generate antibodies against it, and then to quickly process the future amyloid beta when it is generated. However, it is necessary to find a B cell-specific protein sequence to generate an antibody by administering a peptide of the full sequence length, which can cause side effects by stimulating various immune cells. In addition, when a short sequence is used, chemical modification capable of stably binding to the B cell receptor is also required.
본 발명에서는 세 가지 시스템을 이용하여 B 세포 특이적으로 아밀로이드 베타 항체를 생성할 수 있는 신규 아밀로이드 베타 항원을 선정하였다. 후보 항원 에피토프 예측을 위해서, 1) B 세포를 인지하는 항원 서열을 찾은 뒤, 2) 안정화할 수 있는 잔기 변이(mutation) 및 독성 검사를 위한 시뮬레이션, 3) 치매 동물 모델에서의 생화학 및 행동학적 검증으로 항원 에피토프를 선별하였다.In the present invention, novel amyloid beta antigens capable of generating amyloid beta antibodies specifically in B cells were selected using three systems. For the prediction of candidate antigen epitopes, 1) after finding antigenic sequences that recognize B cells, 2) stabilizing residue mutations and simulations for toxicity testing, 3) biochemical and behavioral verification in dementia animal models Antigen epitopes were selected by.
한편, 한국등록특허 제1802251호에는 '아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 및 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 또는 치매에 대한 예방 또는 치료용 백신 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1926030호에는 '알츠하이머형 치매의 예방 및 면역요법을 위한 펩티드 백신'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '아밀로이드 베타 유래 에피토프를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 백신 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 1802251 discloses a 'vaccine composition for preventing or treating Alzheimer's disease or dementia containing amyloid beta (Aβ) peptide and bvPLA2 (bee venom phospholipase A2) as active ingredients', registered in Korea Patent No. 1926030 discloses a 'peptide vaccine for prevention and immunotherapy of Alzheimer's-type dementia', but the 'Alzheimer's dementia vaccine composition comprising an amyloid beta-derived epitope as an active ingredient and its use' of the present invention is described. there is no bar
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아밀로이드 베타 축적을 억제할 수 있는, 알츠하이머성 치매 백신의 제조를 위해 B 세포 특이적인 면역원성을 나타내는 신규한 아밀로이드 베타 유래 항원을 개발하고자 하였다.The present invention has been derived from the above needs, and the present inventors are trying to develop a novel amyloid beta-derived antigen that exhibits B cell-specific immunogenicity for the preparation of an Alzheimer's dementia vaccine capable of inhibiting amyloid beta accumulation. did
이를 위해 세 가지 시스템을 이용하여 후보 항원 에피토프를 예측하였고, 면역원성의 증대를 위해 예측된 후보 에피토프 서열의 일부 잔기 치환 및/또는 캐리어 단백질의 결합 등의 변형을 적용한 신규한 항원을 개발하였으며, 개발한 항원의 백신으로서의 효과를 아밀로이드 베타 주입을 통해 제조한 알츠하이머성 치매 동물 모델에서 확인한 결과, 특정 잔기 치환 및 캐리어 단백질이 결합된 항원에서 기억 및 인지능의 개선 효과와 더불어 뇌 조직 내 아밀로이드 베타 수준의 현저한 감소를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.To this end, candidate antigen epitopes were predicted using three systems, and new antigens were developed by applying modifications such as partial residue substitution and/or carrier protein binding of the predicted candidate epitope sequence to enhance immunogenicity. As a result of confirming the effect of one antigen as a vaccine in an Alzheimer's dementia animal model prepared by injecting amyloid beta, specific residue substitutions and carrier protein-bound antigens showed improvement in memory and cognitive ability, as well as a decrease in amyloid beta levels in brain tissue. By confirming a significant decrease, the present invention was completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질을 제공한다.In addition, the present invention provides a fusion protein of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a carrier protein.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating amyloid beta accumulation-related diseases, comprising the peptide or fusion protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating amyloid beta accumulation-related diseases, comprising the step of administering the vaccine composition to an animal other than human.
본 발명에 따른 백신 조성물은 아밀로이드 베타의 생성을 효과적으로 감소시킴으로써, 알츠하이머병 또는 치매 등과 같은 아밀로이드 베타 집적 관련 질환에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.The vaccine composition according to the present invention can be usefully used for fundamental prevention or treatment of diseases related to amyloid beta accumulation, such as Alzheimer's disease or dementia, by effectively reducing the production of amyloid beta.
도 1은 아밀로이드 베타의 B 세포 특이 에피토프 예측을 위한 알고리즘 분석 결과이다.
도 2는 선별된 10개의 후보 아밀로이드 베타 에피토프의 GOLD 스코어를 보여준다.
도 3은 아밀로이드 베타 에피토프 D1H 및 S8R의 B 세포에 대한 도킹 및 동적 시뮬레이션(docking and dynamic simulation) 모습을 보여준다.
도 4는 B 세포에 대한 도킹 및 동적 시뮬레이션 분석을 통한 아밀로이드 베타 에피토프 D1H 및 S8R의 결합친화도(binding affinity), 안정성(stability) 및 독성(toxicity) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명에 사용된 알츠하이머성 치매 동물 모델 실험 개요도이다.
도 6은 알츠하이머성 치매 동물 모델에서 선발된 항원(D1H, S8R-OVA, S8R-KLH)의 기억 및 인지 기능 개선 효과를 분석한 행동실험 결과로, (A)는 Y-maze에서 측정한 자발적 교대 행동의 결과이고, (B)는 수동 회피 실험 결과이다. CTL: 정상 대조구, CTL+Aβ: 아밀로이드 베타만 주입, D1H: D1H 전처리 후 Aβ 주입, S8R-OVA: S8R-OVA 전처리 후 Aβ 주입, S8R-KLH: S8R-KLH 전처리 후 Aβ 주입, *: p< 0.05, **: p< 0.01, ***: p< 0.001.
도 7은 알츠하이머성 치매 동물 모델에서 선발된 항원(D1H, S8R-OVA, S8R-KLH) 투여시 뇌의 피질(cortex) 또는 해마(hippocampus)에서 나타나는 아밀로이드 베타 감소 효과를 확인한 웨스턴 블랏(A, B), 이의 정량화 그래프(C, D), 면역화학염색 결과(E) 및 형광 강도의 정량화 그래프(F)이다. (C)는 CTL(정상 대조구)의 발현 수준을 기준으로, (D)는 Aβ(아밀로이드 베타만 주입)의 발현 수준을 기준으로 각 실험군의 발현 정도를 나타낸 것이다. CTL: 정상 대조구, Aβ: 아밀로이드 베타만 주입, WT: WT(서열번호 2) 전처리 후 Aβ 주입, D1H: D1H 전처리 후 Aβ 주입, S8R: S8R 전처리 후 Aβ 주입, S8R-OVA: S8R-OVA 전처리 후 Aβ 주입, S8R-KLH: S8R-KLH 전처리 후 Aβ 주입, ***: p< 0.001.
도 8은 알츠하이머성 치매 동물 모델에서 선발된 항원(D1H, S8R-OVA, S8R-KLH) 투여시 나타나는 비장의 IgG 수준 변화(A), 혈장 내 IL-10 및 IgG의 수준 변화(B) 및 비장의 면역화학염색 결과(C)이다. CTL: 정상 대조구, Aβ: 아밀로이드 베타만 주입, D1H: D1H 전처리 후 Aβ 주입, S8R-OVA: S8R-OVA 전처리 후 Aβ 주입, S8R-KLH: S8R-KLH 전처리 후 Aβ 주입, ***: p< 0.001.1 is an algorithm analysis result for predicting a B cell specific epitope of amyloid beta.
Figure 2 shows the GOLD scores of the selected 10 candidate amyloid beta epitopes.
3 shows docking and dynamic simulation of the amyloid beta epitopes D1H and S8R on B cells.
4 shows the results of analysis of binding affinity, stability, and toxicity of amyloid beta epitopes D1H and S8R through docking and dynamic simulation analysis on B cells.
5 is an experimental schematic diagram of an Alzheimer's dementia animal model used in the present invention.
Figure 6 shows the results of behavioral experiments analyzing the memory and cognitive function improvement effects of antigens (D1H, S8R-OVA, S8R-KLH) selected in Alzheimer's dementia animal models, (A) is spontaneous alternation measured in Y-maze. It is the result of the action, and (B) is the result of the passive avoidance experiment. CTL: normal control, CTL+Aβ: only amyloid beta injection, D1H: Aβ injection after D1H pretreatment, S8R-OVA: Aβ injection after S8R-OVA pretreatment, S8R-KLH: Aβ injection after S8R-KLH pretreatment, *: p< 0.05, **: p < 0.01 , ***: p < 0.001.
7 is a Western blot (A, B) confirming the effect of reducing amyloid beta in the brain cortex or hippocampus upon administration of antigens (D1H, S8R-OVA, S8R-KLH) selected in an animal model of Alzheimer's disease. ), their quantification graphs (C, D), immunochemical staining results (E), and quantification graphs of fluorescence intensity (F). (C) shows the expression level of each experimental group based on the expression level of CTL (normal control), and (D) shows the expression level of Aβ (only amyloid beta injected). CTL: normal control, Aβ: only amyloid beta injection, WT: Aβ injection after WT (SEQ ID NO: 2) pretreatment, D1H: Aβ injection after D1H pretreatment, S8R: Aβ injection after S8R pretreatment, S8R-OVA: after S8R-OVA pretreatment Aβ injection, S8R-KLH: Aβ injection after S8R-KLH pretreatment, ***: p < 0.001.
8 shows changes in IgG levels in the spleen (A), changes in the levels of IL-10 and IgG in plasma (B), and spleen when the antigens (D1H, S8R-OVA, and S8R-KLH) selected in the Alzheimer's dementia animal model are administered. This is the result of immunochemical staining (C). CTL: normal control, Aβ: only amyloid beta injection, D1H: Aβ injection after D1H pretreatment, S8R-OVA: Aβ injection after S8R-OVA pretreatment, S8R-KLH: Aβ injection after S8R-KLH pretreatment, ***: p< 0.001.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
본 발명에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 아밀로이드 베타(서열번호 1) 유래 단편으로, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 첫 번째부터 열 번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 짧은 단편(서열번호 2)에서 8번째 잔기인 세린(S)을 아르기닌(R)으로 치환한 것이다. 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 B 세포 특이적 면역원성을 나타내는 것일 수 있다.The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 according to the present invention is a fragment derived from amyloid beta (SEQ ID NO: 1), and is a short fragment (SEQ ID NO: 2) consisting of the first to tenth amino acid sequences among the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 The 8th residue, serine (S), is substituted with arginine (R). The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may exhibit B cell-specific immunogenicity.
본 발명의 용어, "아밀로이드 베타"는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는아밀로이드 베타 플라크(amyloid beta plaque)의 주요 성분으로서, 36 내지 43의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 β-와 γ-세크레타아제에 의해 분해되어 만들어진다고 알려져 있다.As the term of the present invention, "amyloid beta" is a major component of amyloid beta plaque found in the brains of patients with Alzheimer's disease, and is a peptide consisting of 36 to 43 amino acids, amyloid precursor protein (APP). ) is known to be produced by degradation by β- and γ-secretase.
본 발명은 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질을 제공한다.The present invention also provides a fusion protein of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a carrier protein.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) 또는 OVA (ovalbumin)일 수 있다. 상기 KLH는 Uniprot no. Q10583 또는 Uniprot no. Q10584일 수 있고, 상기 OVA는 Uniprot no. P01012일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the fusion protein according to the present invention, the carrier protein may be, but is not limited to, preferably KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) or OVA (ovalbumin). The KLH is Uniprot no. Q10583 or Uniprot no. Q10584, and the OVA is Uniprot no. P01012, but is not limited thereto.
또한, 상기 캐리어 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 C-말단에 티올기를 가진 시스테인 등의 링커를 통해 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the carrier protein may be one bonded to the C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 through a linker such as cysteine having a thiol group, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단은 아세틸화(acetylation)에 의해 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the fusion protein according to the present invention, the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be modified by acetylation, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질은 뇌 조직에서 아밀로이드 베타를 감소시키는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the fusion protein of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a carrier protein is characterized by reducing amyloid beta in brain tissue.
본 발명은 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질;을 유효성분으로 포함하는, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; or a fusion protein of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a carrier protein; as an active ingredient, a vaccine composition for preventing or treating amyloid beta accumulation-related diseases is provided.
본 발명에 따른 백신 조성물은 뇌 조직에서 아밀로이드 베타를 감소시키는 효과를 가지는 펩타이드 또는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고 있어, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 기재할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 융합 단백질은 전술한 것과 같다.The vaccine composition according to the present invention contains, as an active ingredient, a peptide or fusion protein having an effect of reducing amyloid beta in brain tissue, and thus may have a preventive or therapeutic effect on amyloid beta accumulation-related diseases. The peptide or fusion protein is as described above.
본 발명에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머병, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 치매 또는 알츠하이머병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the vaccine composition according to the present invention, the amyloid beta accumulation-related disease is any one selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's disease, amyloid angiopathy, cerebral amyloid angiopathy, systemic amyloid disease, Dutch-type amyloidosis, and inclusion body stomatitis. It may be one, and more preferably dementia or Alzheimer's disease, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 용어 "면역증강제"는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 면역원은 아니지만 숙주에게 면역계의 세포활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 면역증강제는 임의의 다양한 면역증강제를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니나, 프로인트 면역증강제(Freund adjuvant), 알룸 화합물(alum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리사카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 있다.In one embodiment of the present invention, the vaccine composition may further include an adjuvant. The term "immune enhancer" as used herein refers to a substance that promotes an immune response to an antigen in a non-specific manner during the initial activation of immune cells. means (Warren et al., 1986, Annu. Rev. Immunol,. 4:369). The adjuvant of the present invention includes any of various adjuvants, but is not limited thereto, Freund adjuvant, alum compound, muramyl dipeptide, lipopolysaccharide (LPS), monophosphoryl lipid A, or queyl A.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.In addition, the vaccine composition of the present invention may further include a solvent, an excipient, and the like. The solvent includes physiological saline, distilled water, etc., and the excipients include, but are not limited to, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, aluminum potassium sulfate, etc., materials commonly used in vaccine production in the field to which the present invention belongs may further include.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.The vaccine composition of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art to which the present invention belongs. The vaccine composition of the present invention can be prepared as an oral or parenteral formulation, preferably prepared as an injection solution, which is a parenteral formulation, and is intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, nasal or epidural ( It can be administered by eidural route.
본 발명은 또한, 인간을 제외한 동물에게 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preventing or treating amyloid beta accumulation-related diseases, comprising the step of administering the vaccine composition to an animal other than human.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 백신 조성물은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 캐리어 단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상세한 내용은 전술한 것과 같다.In the method according to the present invention, the vaccine composition includes a fusion protein of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a carrier protein as an active ingredient, and details are as described above.
본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 알츠하이머병 또는 치매 등을 포함하는 아밀로이드 베타 집적 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과, 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능하다.The vaccine composition of the present invention can be administered to a subject in an immunologically effective amount. The "immunologically effective amount" means an amount sufficient to exhibit a preventive or therapeutic effect on amyloid beta accumulation-related diseases, including Alzheimer's disease or dementia, and an amount sufficient to not cause side effects or severe or excessive immune reactions. The exact dosage concentration depends on the specific immunogen to be administered, and depends on factors well known in the medical field, such as age, weight, health, sex of the vaccinated subject, sensitivity to drugs of the subject, administration route, and administration method, to those skilled in the art. It can be easily determined by, and can be administered once or several times.
본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만, 바람직하게는 면역증강제와 함께 투여할 수 있고, 상기 면역증강제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.The vaccine composition of the present invention can be administered alone, but preferably can be administered together with an immune enhancer, and the immune enhancer can be administered simultaneously with the vaccine composition or sequentially with a time interval.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. B 세포 특이적 아밀로이드 베타 에피토프 선발Example 1. B cell specific amyloid beta epitope selection
아밀로이드 베타의 서열 중, B 세포에 결합하여 체액성 면역을 자극하는 항원 부위를 찾기 위해, The Immune Epitope Database (IEDB)를 사용하여 서열을 예측하였다. 아밀로이드 베타 서열 (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA, 서열번호 1)을 소프트웨어에 입력한 다음 IEDB에 있는 B 세포 에피토프 대표 예측 알고리즘 3가지를 이용하였다. Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0, Bepipred Linear Epitope Prediction 및 Emini Surface Accessibility Prediction로 예측한 결과는 도 1과 같다. 상기 언급된 예측 시스템을 통해 아밀로이드 베타의 42개 서열 중, 앞 부분의 10개~15개의 서열이 B 세포에 결합할 수 있는 항원으로 추정되었다. 일차적으로 아밀로이드 베타 10개 서열(DAEFRHDSGY, 서열번호 2)을 야생형(WT)으로 선정하였다.Among the sequences of amyloid beta, the sequence was predicted using The Immune Epitope Database (IEDB) to find an antigen site that binds to B cells and stimulates humoral immunity. After inputting the amyloid beta sequence (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA, SEQ ID NO: 1) into the software, three B cell epitope representative prediction algorithms from IEDB were used. The results predicted by Bepired Linear Epitope Prediction 2.0, Bepired Linear Epitope Prediction, and Emini Surface Accessibility Prediction are shown in FIG. 1 . Through the above-mentioned prediction system, among the 42 sequences of amyloid beta, the first 10 to 15 sequences were estimated as antigens capable of binding to B cells. First, 10 amyloid beta sequences (DAEFRHDSGY, SEQ ID NO: 2) were selected as wild type (WT).
WT 서열을 기반으로 안정성과 독성을 검사하였다. 분자 도킹 시뮬레이션은 타겟 분자간의 결합 모드를 분석하였다. 분자는 각 원자마다 자유롭게 움직이는 구조이므로 원자의 개수가 많아짐에 따라 한 분자 내에서도 수많은 모습을 생성해 낼 수 있다. 일반적으로 여러 번 반복실험을 실시하여 에너지적으로 가장 안정하거나 혹은 자주 반복되는 결합구조를 최종적으로 선택함으로써, 단백질과 기질 혹은 단백질 간의 결합모드를 예측한다.Stability and toxicity were tested based on the WT sequence. Molecular docking simulation analyzed the binding mode between target molecules. A molecule is a structure in which each atom moves freely, so as the number of atoms increases, numerous shapes can be created even within a single molecule. In general, by conducting repeated experiments several times and finally selecting the most energetically stable or frequently repeated bonding structure, the binding mode between a protein and a substrate or protein is predicted.
GOLD (Genetic optimization for ligand docking)을 통해 GOLD 스코어로 결합모드의 클러스터링 형성 정보를 얻었다. 분자 도킹 시뮬레이션으로 결합 친화력(binding affinity)과 안정성(stability)을 계산하여, 상위 10개의 아미노산 잔기 치환 변이된 펩타이드를 선별하였고, 교차 검증을 위해 Galaxypepdock 웹 서버에서 에피토프의 결합 친화력를 예측하였다. 10번의 GOLD를 시도하여, 나온 GOLD 스코어의 평균값을 WT 대비 높은 것을 선별하되 독성이 있는 것을 제외한 상위 2개 (D1H, S8R)의 펩타이드를 후보 아밀로이드 베타 에피토프로 선정하였다(도 2).Through GOLD (Genetic optimization for ligand docking), the clustering formation information of the binding mode was obtained with the GOLD score. The binding affinity and stability were calculated by molecular docking simulation, the top 10 amino acid residue substitution mutated peptides were selected, and the binding affinity of the epitope was predicted on the Galaxypepdock web server for cross-validation. Ten GOLD trials were conducted, and the average value of the resulting GOLD score was selected to be higher than that of WT, but the top two peptides (D1H and S8R) were selected as candidate amyloid beta epitopes, excluding those with toxicity (FIG. 2).
선별된 D1H, S8R의 B 세포와의 분자 도킹 및 동적 시뮬레이션을 통해 WT 서열보다 B 세포와의 결합 친화력 및 안정성이 높은 것을 확인하였고(도 3), 펩타이드 독성검사를 통해 인체 내 독성이 없는 것으로 확인하였다(도 4).Through molecular docking and dynamic simulation of the selected D1H and S8R with B cells, it was confirmed that the binding affinity and stability with B cells were higher than that of the WT sequence (FIG. 3), and it was confirmed that there was no toxicity in the human body through a peptide toxicity test. (FIG. 4).
실시예 2. 백신용 아밀로이드 베타 항원 합성Example 2. Amyloid beta antigen synthesis for vaccine
생체 내 아밀로이드 베타가 B 세포 수용체에 특이적이나, 생체 내로 전달하기까지의 과정이 워낙 복잡하고, B 세포 기반 체액성 면역을 안정적으로 이끌어 내기 위해서는 펩타이드 변형과정이 필요하다. 면역 체계는 전체 펩타이드-단백질 접합체에 반응하므로 일부 항체는 펩타이드, 링커 및 캐리어 단백질 모두에 대해 생성 유발된다. 이는 면역을 좀 더 촉진할 수 있는 발화점이 되므로, 본 발명의 후보 아밀로이드 베타 10개 서열의 펩타이드에 대표적인 캐리어 단백질인 KLH (keyhole limpet hemocyanin) 또는 OVA (ovalbumin)를 붙이기로 하였다. 또한, 펩타이드의 N-말단에 아세틸화(acetylation), C-말단에 아미드화(amidation)를 통해 실제 아밀로이드 베타와 더 가까운 펩타이드 항원을 제작함으로써 여러 가지 분해 효소에 대한 펩타이드의 안정성과 생체 내 생물학적 면역 활성을 증가시켰다.Although amyloid beta in vivo is specific to the B cell receptor, the process leading to in vivo delivery is very complicated, and a peptide modification process is required to stably induce B cell-based humoral immunity. Because the immune system responds to whole peptide-protein conjugates, some antibodies are induced against both the peptide, the linker and the carrier protein. Since this is a trigger point that can further promote immunity, it was decided to attach keyhole limpet hemocyanin (KLH) or ovalbumin (OVA), which are representative carrier proteins, to the peptides of the 10 candidate amyloid beta sequences of the present invention. In addition, by producing a peptide antigen closer to the actual amyloid beta through acetylation at the N-terminus of the peptide and amidation at the C-terminus, the stability of the peptide against various degradation enzymes and biological immunity in vivo increased activity.
백신용 항원의 제작은 WT 서열(DAEFRHDSGY, 서열번호 2)을 기반으로 음전하(negative charge)를 띠는 1번째 아미노산 D(Aspartic acid)를 양전하(positive charge)를 띠는 H(Histidine)으로 치환시킨 D1H 펩타이드(HAEFRHDSGY, 서열번호 3)의 N-말단은 아세틸화, C-말단은 아미드화시켜 D1H epitope (Ac-HAEFRHDSGY-NH2)를 제작하였다.The production of vaccine antigen is based on the WT sequence (DAEFRHDSGY, SEQ ID NO: 2) by replacing the negatively charged first amino acid D (Aspartic acid) with positively charged H (Histidine). The N-terminus of the D1H peptide ( H AEFRHDSGY, SEQ ID NO: 3) was acetylated and the C-terminus was amidated to prepare a D1H epitope (Ac-HAEFRHDSGY-NH 2 ).
또한 WT 서열을 기반으로 uncharged의 8번째 아미노산 S(Serine)을 양전하를 띠는 R(Arginine)로 치환시킨 S8R 펩타이드(DAEFRHDRGY, 서열번호 4)의 N-말단을 아세틸화시키고, C-말단에는 캐리어 단백질을 붙이기 위해 티올기(thiol group)가 포함된 C(Cysteine) 아미노산을 추가하여 KLH 또는 OVA가 결합된 S8R-OVA epitope (Ac-DAEFRHDRGY-C-OVA) 및 S8R-KLH epitope (Ac-DAEFRHDRGY-C-KLH)를 제작하였다.In addition, based on the WT sequence, the N-terminus of the S8R peptide (DAEFRHD R GY, SEQ ID NO: 4) in which the uncharged 8th amino acid S (Serine) was substituted with positively charged R (Arginine) was acetylated, and the C-terminus KLH or OVA bound S8R-OVA epitope (Ac-DAEFRHDRGY-C-OVA) and S8R-KLH epitope (Ac- DAEFRHDRGY-C-KLH) was fabricated.
실시예 3. 합성한 아밀로이드 베타 항원의 백신으로서의 효과: 기억 및 인지능 개선Example 3. Effect of synthesized amyloid beta antigen as a vaccine: improvement of memory and cognitive ability
합성된 아밀로이드 베타 항원을 이용하여, 생체 내 실험을 다음과 같이 진행하였다. 아밀로이드 베타 항원을 복강내(intraperitoneal, IP) 주사로 마우스당 30㎍씩 주 1회 투여하였다. 총 6주령부터 10주령까지 4회 주사하였고, 4주 후에 1x PBS에 녹인 아밀로이드 베타(Aβ) 용액 (0.2㎍/㎕)을 총 0.5㎕ 뇌실에 주입하고, 1주일의 회복 기간을 거쳐 알츠하이머성 치매 동물 모델을 확립하였다(도 5). 각 실험군 당 마우스는 8마리로 설정하였다.Using the synthesized amyloid beta antigen, in vivo experiments were conducted as follows. Amyloid beta antigen was administered once a week at 30 μg per mouse by intraperitoneal (IP) injection. A total of 4 injections were performed from 6 weeks to 10 weeks of age, and after 4 weeks, a total of 0.5 μl of amyloid beta (Aβ) solution (0.2 μg/μl) dissolved in 1x PBS was injected into the ventricle, followed by a 1-week recovery period for Alzheimer's dementia. An animal model was established (FIG. 5). Eight mice were set for each experimental group.
기억 및 인지 기능을 측정하는 행동 실험(Y-maze 및 수동 회피 실험)을 진행하였다. Y-maze에서는 인지 기능 측정으로 자발적 교대 행동(spontaneous altneration)을 측정하였다. Y-maze에서, 알츠하이머성 치매 동물(CTL+Aβ, 이하 치매 쥐)은 정상군(CTL)에 비해 낮은 수준의 자발적 교대 행동을 보였으나, 아밀로이드 베타 항원 투여군에서는 자발적 교대 행동이 유의적으로 개선된 것을 확인할 수 있었다(도 6A). 특히, S8R-OVA 투여군이 가장 극적으로 회복되는 것을 알 수 있었다. 또한 전체 출입 횟수도 유의적으로 감소된 것으로 보아, 공간 인지 기능이 개선되었음을 알 수 있었다.Behavioral experiments (Y-maze and passive avoidance experiments) were conducted to measure memory and cognitive function. In Y-maze, spontaneous altneration was measured as a measure of cognitive function. In the Y-maze, animals with Alzheimer's disease (CTL+Aβ, hereinafter referred to as dementia rats) showed a lower level of voluntary alternation behavior compared to the normal group (CTL), but the voluntary alternation behavior was significantly improved in the amyloid beta antigen-administered group. It was confirmed (Fig. 6A). In particular, it was found that the S8R-OVA administration group recovered most dramatically. In addition, as the total number of entrances was also significantly reduced, it was found that the spatial recognition function was improved.
두려움을 이용하여 학습 기억력을 생성시키는 수동 회피 실험(passive avoidance test)을 진행하였다. 본 실험은 밝은(light) 박스와 어두운(dark) 박스로 구성되어 있으며, 쥐가 어두운 곳으로 진입하는 습성을 이용하여 어두운 박스로 진입시에 전기 자극을 주어 어두운 박스에 들어가면 전기자극을 받는다는 기억을 심어준 후, 실험쥐가 밝은 곳에서 어두운 박스로 들어가는게 걸리는 시간을 측정한다. 24시간 뒤 Day2에 실험을 진행한 결과, 정상군의 쥐(CTL)는 전기 자극으로 인해 어두운 박스에 들어가려고 하지 않았으나, 치매 쥐(CTL+Aβ)의 경우 지속적으로 어두운 박스에 진입하려고 하였으며, 아밀로이드 베타 항원을 투여한 치매 쥐는 정상군의 쥐처럼 밝은 박스에 머무는 시간이 증가하였다. 48시간 뒤인 Day3에서도 같은 양상을 보여 Aβ에 의해 떨어진 전기자극 학습 기억력이 아밀로이드 베타 항원을 처리하였을 때 회복한 것을 확인할 수 있었다(도 6B). A passive avoidance test was conducted to generate learning memory using fear. This experiment consists of a light box and a dark box, and by using the habit of entering a dark place, electrical stimulation is given when the rat enters the dark box, and it implants a memory that it receives electrical stimulation when entering the dark box. After that, the time taken for the rat to enter the dark box from a bright place was measured. As a result of the experiment on
실시예 4. 합성한 아밀로이드 베타 항원의 백신으로서의 효과: 뇌 내 아밀로이드 베타 축적 억제Example 4. Effect of synthesized amyloid beta antigen as a vaccine: inhibition of amyloid beta accumulation in the brain
실시예 3의 기억 및 인지능 개선 효과가 비정상적 단백질의 응집이 감소된 것과 연관이 있을 것으로 사료되어, 아밀로이드 베타 관련 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏 및 조직 면역화학염색법을 통해 확인하였다. 발현 수준 분석은 실험동물의 대뇌 피질(cerebral cortex)과 해마(hippocampus) 조직을 대상으로 수행하였다.It was thought that the memory and cognitive improvement effects of Example 3 were related to the reduction of abnormal protein aggregation, and the expression level of amyloid beta-related proteins was confirmed through Western blotting and tissue immunochemical staining. Expression level analysis was performed on cerebral cortex and hippocampus tissues of experimental animals.
그 결과, APP와 Aβ의 발현이 치매 쥐에서 정상군(CTL) 대비 높은 것을 확인할 수 있었으며, WT 항원을 투여한 군(Aβ+N)에서 APP와 Aβ의 감소 수준 또한 치매 쥐와 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 7A 및 7C). 또한, D1H 및 S8R 항원 투여군은 WT 항원 투여군에 비해 APP와 Aβ의 발현 수준이 대뇌 피질에서는 현저히 낮았으나, 해마 조직에서는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 7B 및 7D). 또한, S8R 항원 투여군(S8R) 보다 캐리어가 융합된 항원(S8R-OVA 및 S8R-KLH) 투여군에서 APP 및 Aβ의 감소 수준이 높은 것으로 확인되었다(도 7B 및 7D).As a result, it was confirmed that the expression of APP and Aβ was higher in the dementia rats compared to the normal group (CTL), and the reduced levels of APP and Aβ in the group administered with the WT antigen (Aβ+N) were also not significantly different from those of the dementia rats. It was confirmed (Fig. 7A and 7C). In addition, the D1H and S8R antigen-administered groups showed significantly lower APP and Aβ expression levels in the cerebral cortex than the WT antigen-administered group, but there was no significant difference in the hippocampal tissue (FIGS. 7B and 7D). In addition, it was confirmed that the reduced levels of APP and Aβ were higher in the carrier-fused antigen (S8R-OVA and S8R-KLH)-administered groups than in the S8R antigen-administered group (S8R) (FIGS. 7B and 7D).
본 발명의 항원 투여시 APP 및 Aβ의 발현 수준이 감소된 것으로 볼 때, 치매 쥐에서 체액성 면역 반응에 따른 아밀로이드 단백질의 제거가 일어났음을 유추할 수 있었다. 특히, Aβ 유래 항원 중 S8R에 캐리어를 결합한 항원이 가장 극적으로 아밀로이드 관련 단백질의 발현을 낮추었다. APP를 가공하여 Aβ 생성을 촉진하는 프로테아제 BACE1 (beta-secretase 1)의 발현도 치매 동물 모델에서 높아져 있으나, 본 발명의 항원 투여군에서 감소하는 것으로 볼 때, 체액성 면역 반응에 의해 아밀로이드 베타가 제거되고 이에 따라 활성이 감소된 것으로 추정할 수 있었다(도 7).Considering that the expression levels of APP and Aβ were reduced upon administration of the antigen of the present invention, it was inferred that amyloid protein was removed according to the humoral immune response in dementia rats. In particular, among the Aβ-derived antigens, the antigen bound to S8R as a carrier most dramatically lowered the expression of amyloid-related proteins. The expression of the protease BACE1 (beta-secretase 1), which processes APP to promote Aβ production, is also increased in dementia animal models, but is reduced in the antigen-administered group of the present invention, so that amyloid beta is removed by the humoral immune response Accordingly, it could be assumed that the activity was reduced (FIG. 7).
상기 치매 백신제로 선별된 항원 투여 시, 치매 모델 동물의 비장과 혈장(plasma)에서의 IgG 수준을 확인해 항체 생성 정도를 평가하였고, 혈장 내 IL-10 (Interleukin 10) 수치로 항체 생성에 따른 염증 정도를 확인한 결과는 도 8과 같다. 선발된 항원 투여 시 비장과 혈장에서 더 많은 IgG 수치를 확인하였고, 이를 통해 선별된 항원이 B 세포에 결합하여 아밀로이드 베타 항체를 생성함을 알 수 있었으며, 혈장 내 IL-10 수치를 통해 항체 생성에 따른 염증 수치의 감소도 알 수 있었다.When the antigen selected as the dementia vaccine was administered, the degree of antibody production was evaluated by checking the IgG level in the spleen and plasma of the dementia model animal, and the degree of inflammation according to antibody production was measured by the level of IL-10 (Interleukin 10) in the plasma. The results of checking are shown in FIG. 8 . When the selected antigen was administered, more IgG levels were confirmed in the spleen and plasma, and through this, it was found that the selected antigen bound to B cells to produce amyloid beta antibody, and the IL-10 level in the plasma showed an effect on antibody production. A decrease in the level of inflammation was also observed.
Claims (9)
상기 아밀로이드 베타 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머병, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.A vaccine composition for preventing or treating amyloid beta accumulation-related diseases, comprising the peptide of claim 1 or the fusion protein of claim 3 as an active ingredient,
The amyloid beta accumulation-related disease is any one selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's disease, amyloid angiopathy, cerebral amyloid angiopathy, systemic amyloid disease, Dutch-type amyloidosis, and inclusion body stomatitis. A vaccine composition for preventing or treating related diseases.
상기 아밀로이드 베타 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머병, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 베타 집적 관련 질환의 예방 또는 치료방법.A method for preventing or treating an amyloid beta accumulation-related disease, comprising administering the vaccine composition of claim 6 to an animal other than humans,
The amyloid beta accumulation-related disease is any one selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's disease, amyloid angiopathy, cerebral amyloid angiopathy, systemic amyloid disease, Dutch-type amyloidosis, and inclusion body stomatitis. A method for preventing or treating a related disease.
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2022
- 2022-09-08 KR KR1020220114057A patent/KR102530956B1/en active IP Right Grant
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