KR102529008B1 - Composition for Nucleic Acid Extraction and Method for Extracting Nucleic Acid Using the Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 증류수, 수산화나트륨 및 CHAPS를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 키트; 상기 조성물을 사용하는 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법; 상기 조성물을 포함하는 세균 검출용 키트; 및 상기 조성물을 사용하는 세균 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 증류수, 수산화나트륨 및 CHAPS 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 사용하는 경우, 핵산 추출 단계가 간소화되어 저비용 및 단시간으로 식중독 세균의 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 핵산 추출 민감도가 우수하여 낮은 농도의 세균도 추출 또는 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 증류수, 수산화나트륨 및 CHAPS를 포함하는 조성물은 핵산의 정제 또는 핵산 추출에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 신속한 식중독 세균 검출을 통한 식품의 품질관리에 활용될 수 있다.The present invention is a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising distilled water, sodium hydroxide and CHAPS; A kit for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising the composition; a nucleic acid purification or nucleic acid extraction method using the composition; a kit for detecting bacteria comprising the composition; And it relates to a method for detecting bacteria using the composition.
When using the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising distilled water, sodium hydroxide and CHAPS according to the present invention, it was confirmed that the nucleic acid extraction step was simplified and nucleic acids from food poisoning bacteria could be extracted at low cost and in a short time. In addition, it was confirmed that the nucleic acid extraction sensitivity was excellent and that even low concentrations of bacteria could be extracted or detected. That is, the composition containing distilled water, sodium hydroxide and CHAPS can be used not only for nucleic acid purification or nucleic acid extraction, but also for food quality control through rapid detection of food poisoning bacteria.
Description
본 발명은 증류수, 수산화나트륨(NaOH) 및 CHAPS를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 키트; 상기 조성물을 사용하는 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법; 상기 조성물을 포함하는 세균 검출용 키트; 및 상기 조성물을 사용하는 세균 검출 방법에 관한 것이다.The present invention is a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction containing distilled water, sodium hydroxide (NaOH) and CHAPS; A kit for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising the composition; a nucleic acid purification or nucleic acid extraction method using the composition; a kit for detecting bacteria comprising the composition; And it relates to a method for detecting bacteria using the composition.
식중독은 식품의 섭취에 연관된 인체에 유해한 미생물 또는 미생물이 만들어내는 독소에 의해 발생한 것이 의심되는 모든 감염성 또는 독소형 질환을 의미한다. 발열, 구역질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로, 세균이 원인인 세균성 식중독이 대부분이다. 세균성 식중독은 세균에 따라 잠복기와 증상이 다양하지만, 크게 독소형과 감염형으로 구분할 수 있다. 독소형 식중독은 식품에서 세균이 증식하면서 생산된 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독이고, 독소형 식중독의 원인균으로는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridiumbotulinum) 등이 있다. 감염형 식중독은 세균에 오염된 식품을 섭취함으로써 발생하는 식중독으로, 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrioparaheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7) 등이 주된 원인균이다. Food poisoning refers to any infectious or toxin-type disease suspected to be caused by microorganisms or toxins produced by microorganisms harmful to the human body associated with the intake of food. It is a disease accompanied by symptoms such as fever, nausea, vomiting, diarrhea and abdominal pain, and most of them are bacterial food poisoning caused by bacteria. Bacterial food poisoning varies in incubation period and symptoms depending on the bacteria, but can be largely divided into toxin-type and infectious-type. Toxin-type food poisoning is food poisoning caused by ingestion of toxins produced by bacteria growing in food, and causative bacteria of toxin-type food poisoning include Staphylococcus aureus , Clostridium botulinum , and the like. Infectious food poisoning is food poisoning caused by eating food contaminated with bacteria, and Salmonella spp, Vibrio parahaemolyticus , and Escherichia coli O157:H7 are the main causative bacteria.
대부분의 식중독균은 4℃ 에서 60℃ 사이 온도에서 증식하며, 식중독균의 번식 속도는 세균마다 차이가 있으나, 대부분 35~36℃ 내외에서 번식 속도가 가장 빠르다. 장염 비브리오 균의 경우, 세균 한 마리가 10분 후에 2마리로 증식하고 4시간 이후에는 100만 마리 이상으로 증식할 수 있다.Most food poisoning bacteria proliferate at a temperature between 4℃ and 60℃, and the propagation rate of food poisoning bacteria varies from bacteria to bacteria, but most of them reproduce the fastest around 35~36℃. In the case of Vibrio enteritis, one bacterium can multiply to 2 after 10 minutes and to 1 million or more after 4 hours.
식중독 발생에 필요한 균수는 균의 종류에 따라 다르나, 보통은 105 내지 108 CFU/g이상 필요하다고 알려져있으나, 대장균 O157:H7이나 리스테리아 모노사이토게네스(Listeriamonocytogenes) 등의 미생물은 수개 또는 10∼1000개의 균수만으로도 사람에게서 식중독을 발병시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. The number of bacteria required for food poisoning varies depending on the type of bacteria, but is usually known to be 10 5 to 10 8 CFU / g or more, but microorganisms such as Escherichia coli O157: H7 or Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenes ) are several or 10 to 10 It is known that only 1000 germs can cause food poisoning in humans.
이에, 식중독을 예방하기 위해 식중독 원인균을 조기에 발견하는 기술이 요구됨에 따라, 식품 등 시료로부터 식중독 세균을 검출하기 위한 다양한 분자생물학적 방법과 키트 등이 개발되고 있다. 그러나, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 등의 그람 양성 세균은 그람 음성 세균에 비해 세포벽의 펩티도글리칸 층이 두꺼워 핵산 추출하는데 어려움이 있다. Accordingly, in order to prevent food poisoning, as technology for early detection of food poisoning bacteria is required, various molecular biological methods and kits for detecting food poisoning bacteria from samples such as food have been developed. However, Gram-positive bacteria, such as Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , and Clostridium perfringens , have more cell walls than Gram-negative bacteria. It is difficult to extract nucleic acids due to the thick peptidoglycan layer.
또한, 기존에는 세균 핵산 추출을 위해 페놀 및 클로로포름을 이용한 방법이 사용되었으며, 최근에는 핵산을 실리카 레진에 결합시키는 실리카 흡착 방법도 널리 이용되고 있다. 하지만, 기존에 상용화된 핵산 추출 방법 및 키트는 효소를 사용하기 ?문에 효소의 최적 활성 온도 및 시간 조건 하에서 수행되어야 하며, 핵산 추출에 소요되는 비용 또한 높다는 단점이 있다.In addition, conventionally, a method using phenol and chloroform has been used to extract bacterial nucleic acids, and recently, a silica adsorption method in which nucleic acids are bound to a silica resin is also widely used. However, existing commercially available nucleic acid extraction methods and kits use enzymes, so they must be performed under conditions of optimal activity temperature and time for enzymes, and the cost required for nucleic acid extraction is also high.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존의 핵산 추출방법이 갖는 시간적 및 경제적 단점을 극복할 수 있는 핵산 추출 방법을 개발하고자 노력한 결과, 증류수, NaOH 및 CHAPS를 혼합한 용액을 사용하면 핵산 추출 단계가 간소화되어 저비용 및 단시간으로 식중독 세균의 핵산을 추출할 수 있고, 핵산 추출 민감도도 우수하여 낮은 농도의 세균도 추출 또는 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Under this background, the present inventors have tried to develop a nucleic acid extraction method that can overcome the time and economic disadvantages of existing nucleic acid extraction methods. The present invention has been completed by confirming that nucleic acids of food poisoning bacteria can be extracted at low cost and in a short time, and the nucleic acid extraction sensitivity is excellent, so that even low concentrations of bacteria can be extracted or detected.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.The present invention aims to solve the above problems and other problems related thereto.
본 발명의 일 예시적 목적은 증류수, 수산화나트륨 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 제공하는 것이다.One exemplary object of the present invention is to provide a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction containing distilled water, sodium hydroxide and CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate).
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 키트를 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a kit for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising the composition.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 사용하는 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법을 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a nucleic acid purification or nucleic acid extraction method using the composition.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 포함하는 세균 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a kit for detecting bacteria including the composition.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 사용하는 세균 검출 방법을 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a method for detecting bacteria using the composition.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved according to the technical idea of the invention disclosed in this specification is not limited to the problem to solve the problems mentioned above, and another problem not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description. There will be.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in this application may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, the scope of the present application is not to be construed as being limited by the specific descriptions described below.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 증류수, 수산화나트륨 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction containing distilled water, sodium hydroxide and CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate).
본 발명의 용어 "핵산 정제"는 핵산 외에 시료(예를 들어, 식품 등)에 포함되어 있는 불순물을 침전 등 다양한 방법에 의하여 제거하는 것을 말한다.The term "nucleic acid purification" of the present invention refers to removing impurities contained in a sample (eg, food, etc.) in addition to nucleic acids by various methods such as precipitation.
본 발명의 용어 "핵산 추출"은 시료에 포함되어 있는 핵산을 증폭이 용이하도록 분리하는 것을 말하며, 이는 세포 용해, 단백질 등 불순물의 제거에 의한 것일 수 있다.The term "nucleic acid extraction" of the present invention refers to separating nucleic acids included in a sample so as to facilitate amplification, which may be performed by cell lysis or removal of impurities such as proteins.
본 발명에서 상기 조성물은 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH을 포함할 수 있다. 또한, 상기 증류수, 수산화 나트륨 및 CHAPS는 180 내지 200 : 1 내지 20 : 0.5 내지 10의 부피비, 또는 190 : 10 : 1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the composition may include 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH. In addition, the distilled water, sodium hydroxide, and CHAPS may be mixed in a volume ratio of 180 to 200: 1 to 20: 0.5 to 10, or 190: 10: 1, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 핵산은 세균 유래 핵산일 수 있으며, 상기 세균은 그람양성균일 수 있다. 구체적으로, 상기 그람양성균은 식중독균일 수 있고, 예를 들어 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid may be a nucleic acid derived from bacteria, and the bacteria may be Gram-positive bacteria. Specifically, the Gram-positive bacteria may be food poisoning bacteria, for example, Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus , or Clostridium perfringens ), but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL의 저농도 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the concentration of the bacteria may be a low concentration of 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 조성물은 핵산 추출을 위한 세포막 용해 버퍼인 것일 수 있다.In the present invention, the composition may be a cell membrane lysis buffer for nucleic acid extraction.
본 발명에서는 경제성을 고려하여 세포막 용해를 위해 일반적으로 쓰이는 PBS 또는 Tris-HCl 등의 완충용액을 사용하는 대신, 용질을 녹이기 위한 용액의 일종으로 증류수를 사용하였다. 본 발명에 따른 조성물은 PBS 또는 Tris-HCl 등의 완충용액 또는 염소(Cl), 포타슘(K), 인산염(PO4) 성분을 포함하지 않은 CHAPS, NaOH 및 증류수의 조합만으로도 세포막을 용해시키고 핵산을 추출할 수 있다.In the present invention, distilled water was used as a kind of solution for dissolving the solute instead of using a buffer solution such as PBS or Tris-HCl, which is generally used for dissolving cell membranes, in consideration of economic feasibility. The composition according to the present invention dissolves cell membranes and dissolves nucleic acids only with a buffer solution such as PBS or Tris-HCl, or a combination of CHAPS, NaOH, and distilled water that does not contain chlorine (Cl), potassium (K), or phosphate (PO 4 ) components. can be extracted.
본 발명에서 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)는 계면활성제로 알려져 있으나, 실험예 1에서 확인한 바와 같이 CHAPS 단독으로는 핵산이 추출되지 않는 것으로 나타났다.In the present invention, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) is known as a surfactant, but as confirmed in Experimental Example 1, it was found that nucleic acid was not extracted with CHAPS alone.
본 발명에 따른 핵산 정제 또는 추출용 조성물을 사용하면, 1 Log CFU/mL 또는 2 Log CFU/mL 수준의 저농도 세균을 포함하는 시료로부터 고민감도로 세균(예를 들어 식중독균) 핵산의 정제 또는 추출이 가능하며, 현장에서도 저비용으로 간편하고 신속하게 핵산을 정제 또는 추출할 수 있다.Using the composition for purifying or extracting nucleic acids according to the present invention, purification or extraction of bacterial (e.g., food poisoning bacteria) nucleic acid with high sensitivity from a sample containing low concentrations of bacteria at the level of 1 Log CFU/mL or 2 Log CFU/mL It is possible, and it is possible to purify or extract nucleic acids simply and quickly at low cost even in the field.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 키트를 제공한다.As another aspect for achieving the above object, the present invention provides a nucleic acid purification or nucleic acid extraction kit comprising the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction.
본 발명의 용어 "핵산 정제" 및 "핵산 추출"은 전술한 바와 같다.The terms "nucleic acid purification" and "nucleic acid extraction" of the present invention are as described above.
본 발명의 핵산 정제 또는 핵산 추출용 키트는 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물 외에, 당업계에서 핵산의 정제 또는 추출에 일반적으로 사용하는 시약을 더 포함할 수 있다.In addition to the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction according to the present invention, the kit for purifying or extracting nucleic acids of the present invention may further include reagents generally used for purifying or extracting nucleic acids in the art.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 시료를 원심분리하여 펠릿(pellet)을 수득하는 단계; (b) 상기 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 펠릿과 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 가열하는 단계; 및 (d) 상기 가열한 혼합물을 식힌 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법을 제공한다.As another aspect for achieving the above object, the present invention comprises the steps of (a) centrifuging a sample to obtain a pellet (pellet); (b) mixing the nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition with the pellet; (c) heating the mixture; and (d) cooling the heated mixture and centrifuging to obtain a supernatant.
본 발명의 용어 "핵산 정제" 및 "핵산 추출"은 전술한 바와 같다.The terms "nucleic acid purification" and "nucleic acid extraction" of the present invention are as described above.
본 발명에서 상기 시료는 세균이 존재할 것으로 의심되는 것으로서 다양한 식품군일 수 있고, 또는 식품, 물, 농산물, 수산물, 축산물, 과일류, 채소류, 사람 유래의 생물학적 시료, 예컨대 동물의 타액 등 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the sample is suspected of having bacteria and may be various food groups, or may be food, water, agricultural products, aquatic products, livestock products, fruits, vegetables, human-derived biological samples such as saliva of animals, etc. It is not limited.
본 발명에서 상기 핵산은 세균 유래 핵산일 수 있으며, 상기 세균은 그람양성균일 수 있다. 구체적으로, 상기 그람양성균은 식중독균일 수 있고, 예를 들어 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid may be a nucleic acid derived from bacteria, and the bacteria may be Gram-positive bacteria. Specifically, the Gram-positive bacteria may be food poisoning bacteria, for example, Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus , or Clostridium perfringens ), but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL의 저농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the concentration of the bacteria may be a low concentration of 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, but is not limited thereto.
상기 가열 단계는 전자레인지로 5초 내지 1분, 10초 내지 30초 또는 20초 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 700W 내지 2,000W의 전자레인지, 또는 1,100W의 전자레인지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The heating step may be performed in a microwave oven for 5 seconds to 1 minute, 10 seconds to 30 seconds, or 20 seconds, but is not limited thereto. In addition, a microwave oven of 700W to 2,000W or a microwave oven of 1,100W may be used, but is not limited thereto.
상기 가열 단계는 60 내지 80℃, 구체적으로 70 내지 75℃로 가열하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 가열단계는 전자레인지 외에 항온수조(water bath) 또는 히팅 블록(heating block)을 사용하여 수행할 수 있다.The heating step may be heating to 60 to 80 ° C, specifically 70 to 75 ° C, but is not limited thereto. The heating step may be performed using a water bath or a heating block in addition to a microwave oven.
상기 가열한 혼합물은 상온에서 1분 내지 5분간 식힐 수 있고, 구체적으로 2분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The heated mixture may be cooled at room temperature for 1 minute to 5 minutes, specifically 2 minutes, but is not limited thereto.
본 발명의 방법에 따르면, 1 Log CFU/mL 또는 2 Log CFU/mL 수준의 저농도 세균을 포함하는 시료로부터 고민감도로 세균(예를 들어 식중독균) 핵산의 정제 또는 검출이 가능하며, 현장에서도 저비용으로 간편하고 신속하게 핵산을 정제 또는 추출할 수 있다.According to the method of the present invention, it is possible to purify or detect bacterial (e.g., food poisoning bacteria) nucleic acid with high sensitivity from a sample containing low-concentration bacteria at the level of 1 Log CFU/mL or 2 Log CFU/mL, and at low cost in the field. Nucleic acids can be purified or extracted simply and quickly.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 포함하는 세균 검출용 키트를 제공한다. As another aspect for achieving the above object, the present invention provides a kit for detecting bacteria including the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction.
본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물은 시료에 포함된 불순물 제거 및 세균으로부터 핵산을 추출하는데 사용할 수 있으므로, 시료에 존재하는 세균의 핵산 증폭 효율이 우수하여 세균의 검출을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.Since the composition for purifying nucleic acids or extracting nucleic acids according to the present invention can be used to remove impurities contained in a sample and extract nucleic acids from bacteria, the nucleic acid amplification efficiency of bacteria present in the sample is excellent and can be usefully used for detecting bacteria. there is.
본 발명의 핵산 검출용 키트는 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물 외에, 당업계에서 핵산의 증폭반응에 일반적으로 사용되는 프라이머 세트 및 시약을 더 포함할 수 있다.The kit for detecting nucleic acids of the present invention may further include, in addition to the composition for purifying nucleic acids or extracting nucleic acids according to the present invention, primer sets and reagents generally used for amplification of nucleic acids in the art.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 시료를 원심분리하여 펠릿(pellet)을 수득하는 단계; (b) 상기 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 펠릿과 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 가열하는 단계; (d) 상기 가열한 혼합물을 식힌 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 (e) 수득된 상층액에서 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 세균 검출 방법 방법을 제공한다.As another aspect for achieving the above object, the present invention comprises the steps of (a) centrifuging a sample to obtain a pellet (pellet); (b) mixing the nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition with the pellet; (c) heating the mixture; (d) cooling the heated mixture and centrifuging to obtain a supernatant; and (e) detecting nucleic acids in the obtained supernatant.
상기 방법에 따르면, 시료의 전처리부터 세균의 핵산 증폭까지 한번에 수행할 수 있으므로, 시료에 존재하는 세균을 신속하고 간단하게 검출할 수 있다.According to the above method, since the pretreatment of the sample and the amplification of bacterial nucleic acid can be performed at once, bacteria present in the sample can be detected quickly and simply.
본 발명에서 상기 세균은 그람양성균일 수 있다. 구체적으로, 상기 그람양성균은 식중독균일 수 있고, 예를 들어 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the bacteria may be Gram-positive bacteria. Specifically, the Gram-positive bacteria may be food poisoning bacteria, for example, Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus , or Clostridium perfringens ), but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL의 저농도 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the concentration of the bacteria may be a low concentration of 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, but is not limited thereto.
상기 단계 (e)의 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR; nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응 (Multiplex-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 또는 고리매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Detection of step (e) is polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction; PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), nested polymerase chain reaction (N-PCR; nested PCR), multiple polymerase It may be by multiplex-PCR, real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) or loop-mediated isothermal amplification ( LAMP), but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 핵산을 검출하는 단계는 PCR 방법으로 수행될 수 있다. 이 경우, 핵산의 검출을 위하여 프라이머 세트, 및 당업계에서 PCR 반응에 일반적으로 사용하는 시약, 예를 들어, dNTP 및 Taq, Q5 등의 중합효소 등을 사용하여 핵산 증폭 반응이 수행될 수 있다.Specifically, the step of detecting the nucleic acid may be performed by a PCR method. In this case, a nucleic acid amplification reaction may be performed using a primer set and reagents commonly used in PCR reactions in the art, for example, dNTP and polymerases such as Taq and Q5, etc. to detect nucleic acids.
본 발명의 방법에 따르면, 1 Log CFU/mL 또는 2 Log CFU/mL 수준의 저농도 세균을 포함하는 시료로부터 고민감도로 세균(예를 들어 식중독균)을 검출할 수 있으며, 현장에서도 저비용으로 간편하고 신속하게 세균을 검출할 수 있다.According to the method of the present invention, bacteria (for example, food poisoning bacteria) can be detected with high sensitivity from a sample containing low-concentration bacteria at the level of 1 Log CFU/mL or 2 Log CFU/mL, and it is possible to detect bacteria (e.g., food poisoning bacteria) easily and quickly at a low cost even in the field. bacteria can be detected.
그람양성균의 핵산을 추출하기 위해한 대표적인 방법/키트로는 Qiagen Kit, TaKaRa Kit, Promega Kit 및 SDS+NaOH 조합이 있다. 기존의 상용화된 키트는 절차가 복잡하여 많은 시간이 소요되고, 시료당 가격이 높으며, 필요 장비가 많다는 단점이 있다. 그러나, 정제수, NaOH 및 CHAPS를 포함하는 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 추출용 조성물을 사용하면 절차가 간편하여 짧은 시간에 효율적으로 핵산을 추출할 수 있고, 비용도 저렴하다.Representative methods/kits for extracting nucleic acid from Gram-positive bacteria include Qiagen Kit, TaKaRa Kit, Promega Kit, and SDS+NaOH combination. Existing commercialized kits have the disadvantages of requiring a lot of time due to complicated procedures, high price per sample, and many necessary equipment. However, if the composition for purifying or extracting nucleic acid according to the present invention containing purified water, NaOH, and CHAPS is used, nucleic acid can be extracted efficiently in a short time due to a simple procedure, and the cost is low.
특히, 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 추출용 조성물 사용 시, 0.25% SDS 및 0.05N NaOH 등의 방법을 사용하는 경우와 달리, 1 Log CFU/mL 농도의 그람양성균에 대해서도 핵산 추출이 가능하여, 고민감도로 세균을 검출하고 이로 인한 질병을 예방하는데 활용될 수 있다.In particular, when using the nucleic acid purification or extraction composition according to the present invention, nucleic acid extraction is possible even from Gram-positive bacteria at a concentration of 1 Log CFU/mL, unlike the case of using methods such as 0.25% SDS and 0.05N NaOH. Sensitivity can be used to detect bacteria and prevent diseases caused by them.
본 발명에 따른 증류수, NaOH 및 CHAPS 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 사용하는 경우, 핵산 추출 단계가 간소화되어 저비용 및 단시간으로 식중독 세균의 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 핵산 추출 민감도가 우수하여 낮은 농도의 세균도 추출 또는 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 증류수, NaOH 및 CHAPS를 포함하는 조성물은 핵산의 정제 또는 핵산 추출에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 신속한 식중독 세균 검출을 통한 식품의 품질관리에 활용될 수 있다. When using the nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition containing distilled water, NaOH and CHAPS according to the present invention, it was confirmed that the nucleic acid extraction step was simplified and nucleic acids from food poisoning bacteria could be extracted at low cost and in a short time. In addition, it was confirmed that the nucleic acid extraction sensitivity was excellent and that even low concentrations of bacteria could be extracted or detected. That is, the composition containing distilled water, NaOH and CHAPS can be used not only for nucleic acid purification or nucleic acid extraction, but also for food quality control through rapid detection of food poisoning bacteria.
다만, 본 명세서에 개시된 기술의 일 실시예에 따른 효과는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, effects according to one embodiment of the technology disclosed in this specification are not limited to those mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
본 명세서에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 리스테리아 모노사이토제니스(L. monocytogenes)에 대해 5종의 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 2는 리스테리아 모노사이토제니스에 대해 CHAPS만 단독으로 사용하여 핵산 추출 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
도 3은 황색포도상구균(S. aureus)에 대해 5종의 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 4는 황색포도상구균에 대해 CHAPS만 단독으로 사용하여 핵산 추출 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
도 5는 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대해 5종의 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 6은 클로스트리듐 퍼프린젠스(C. perfringens)에 대해 5종의 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 7은 클로스트리듐 퍼프린젠스에 대해 CHAPS만 단독으로 사용하여 핵산 추출 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
도 8은 저농도의 리스테리아 모노사이토제니스에 대한 각 핵산 추출 방법의 민감도를 비교한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 9는 저농도의 황색포도상구균에 대한 각 핵산 추출 방법의 민감도를 비교한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 10은 저농도의 바실러스 세레우스에 대한 각 핵산 추출 방법의 민감도를 비교한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 11은 저농도의 클로스트리듐 퍼프린젠스에 대한 각 핵산 추출 방법의 민감도를 비교한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 12는 대장균(E. coli)에 대해 본 발명에 따른 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
도 13은 살모넬라(Salmonella spp.)에 대해 본 발명에 따른 핵산 추출 방법을 적용하여, 핵산이 추출되었는지 여부를 확인한 결과이다. (PC: positive control, NC: negative control, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)In order to more fully understand the drawings cited herein, a brief description of each drawing is provided.
1 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted by applying 5 types of nucleic acid extraction methods to Listeria monocytogenes ( L. monocytogenes ). (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
2 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted using CHAPS alone for Listeria monocytogenes. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
Figure 3 is a result of confirming whether nucleic acids were extracted by applying five nucleic acid extraction methods to Staphylococcus aureus ( S. aureus ). (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
Figure 4 is the result of confirming whether nucleic acid was extracted using only CHAPS alone for Staphylococcus aureus. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
Figure 5 is a result of confirming whether nucleic acids were extracted by applying 5 types of nucleic acid extraction methods to Bacillus cereus ( B. cereus ). (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
Figure 6 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted by applying five nucleic acid extraction methods to Clostridium perfringens ( C. perfringens ). (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, T: TaKaRa Kit, P: Promega Kit, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
7 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted using only CHAPS alone for Clostridium perfringens. (PC: positive control, NC: negative control, D+C: DW+CHAPS)
8 is a result of comparing the sensitivity of each nucleic acid extraction method to a low concentration of Listeria monocytogenes. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
9 is a result of comparing the sensitivity of each nucleic acid extraction method for low-concentration Staphylococcus aureus. (PC: positive control, NC: negative control, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
10 is a result of comparing the sensitivity of each nucleic acid extraction method for a low concentration of Bacillus cereus. (PC: positive control, NC: negative control, S+N: SDS+NaOH, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
11 is a result of comparing the sensitivity of each nucleic acid extraction method for a low concentration of Clostridium perfringens. (PC: positive control, NC: negative control, Q: Qiagen Kit, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
12 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted by applying the nucleic acid extraction method according to the present invention to E. coli . (PC: positive control, NC: negative control, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
13 is a result of confirming whether nucleic acid was extracted by applying the nucleic acid extraction method according to the present invention to Salmonella spp . (PC: positive control, NC: negative control, D+C+N: DW+CHAPS+NaOH)
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention by way of example, and the scope of the present invention is not limited only to these examples.
실시예 1: 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물 제조Example 1: Preparation of composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction according to the present invention
증류수 3.8mL, 0.5% CHAPS(밀도: 1.01 g/mL) 0.02g, 0.05N NaOH 0.2mL를 혼합하여 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물을 제조하였다.A composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction according to the present invention was prepared by mixing 3.8 mL of distilled water, 0.02 g of 0.5% CHAPS (density: 1.01 g/mL), and 0.2 mL of 0.05 N NaOH.
실시예 2: 시험 균액 제조Example 2: Preparation of test bacterial solution
실시예 2-1: 리스테리아 모노사이토제니스(Example 2-1: Listeria monocytogenes ( L. monocytogenesL. monocytogenes ) 균액 제조) Bacterial solution preparation
L. monocytogenes ATCC 13932, ATCC 51774 및 ATCC BAA-839 균주를 혼합하여 균액을 제조하였다. 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였고, 민감도 확인을 위해 1 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다.A bacterial solution was prepared by mixing L. monocytogenes ATCC 13932, ATCC 51774 and ATCC BAA-839 strains. In order to confirm nucleic acid extraction, a bacterial solution diluted to 3 Log CFU/mL was prepared, and to confirm sensitivity, a bacterial solution diluted to 1 Log CFU/mL was prepared.
실시예 2-2: 황색포도상구균(Example 2-2: Staphylococcus aureus ( S. aureusS. aureus ) 균액 제조) Bacterial solution preparation
S. aureus ATCC 13565, ATCC 14458, ATCC 23235 및 ATCC 27664 균주를 혼합하여 균액을 제조하였다. 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였고, 민감도 확인을 위해 1 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다.A bacterial solution was prepared by mixing S. aureus ATCC 13565, ATCC 14458, ATCC 23235 and ATCC 27664 strains. In order to confirm nucleic acid extraction, a bacterial solution diluted to 3 Log CFU/mL was prepared, and to confirm sensitivity, a bacterial solution diluted to 1 Log CFU/mL was prepared.
실시예 2-3: 바실러스 세레우스(Example 2-3: Bacillus cereus ( B. cereusB. cereus ) 균액 제조) Bacterial solution preparation
B. cereus KCTC 1013, KCTC 1094 및 KCTC 3624 균주를 혼합하여 균액을 제조하였다. 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였고, 민감도 확인을 위해 1 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다. B. cereus KCTC 1013, KCTC 1094 and KCTC 3624 strains were mixed to prepare a bacterial solution. In order to confirm nucleic acid extraction, a bacterial solution diluted to 3 Log CFU/mL was prepared, and to confirm sensitivity, a bacterial solution diluted to 1 Log CFU/mL was prepared.
실시예 2-4: 클로스트리듐 퍼프린젠스(Example 2-4: Clostridium perfringens ( C. perfringensC. perfringens )균액 제조) Bacterial solution preparation
C. perfringens KCCM 10976, KCCM 12098, KCCM 40946 및 KCCM 40947 균주를 혼합하여 균액을 제조하였다. 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였고, 민감도 확인을 위해 1 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다.A bacterial solution was prepared by mixing C. perfringens KCCM 10976, KCCM 12098, KCCM 40946 and KCCM 40947 strains. In order to confirm nucleic acid extraction, a bacterial solution diluted to 3 Log CFU/mL was prepared, and to confirm sensitivity, a bacterial solution diluted to 1 Log CFU/mL was prepared.
실시예 2-5: 대장균(Example 2-5: Escherichia coli ( E. coliE. coli ) 균액 제조) Bacterial solution preparation
E. coli KCTC 2615 및 KCTC 2643 균주를 혼합하고, 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다. E. coli KCTC 2615 and KCTC 2643 strains were mixed, and a bacterial solution diluted to 3 Log CFU/mL was prepared to confirm nucleic acid extraction.
실시예 2-6: 살모넬라(Example 2-6: Salmonella ( Salmonella spp.Salmonella spp. ) 균액 제조) Bacterial solution preparation
살모넬라 아고나(Salmonella agona) NCCP12231; 살모넬라 엔터리티디스(Salmonella enteritidis) NCCP 12236, NCCP 12243 및 NCCP 12244; 및 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) NCCP 10140 균주를 혼합하고, 핵산 추출 여부를 확인하기 위해 3 Log CFU/mL로 희석한 균액을 제조하였다.Salmonella Agona ( Salmonella agona ) NCCP12231; Salmonella enteritidis ( Salmonella enteritidis ) NCCP 12236, NCCP 12243 and NCCP 12244; And Salmonella Montevideo ( Salmonella Montevideo ) NCCP 10140 strain was mixed, and a bacterial solution diluted to 3 Log CFU / mL was prepared to check whether nucleic acid was extracted.
실시예 3: 핵산 추출Example 3: Nucleic Acid Extraction
실시예 3-1: Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 사용Example 3-1: Use of Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit
아래와 같은 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit의 사용 설명서에 따라 핵산을 추출하였다.Nucleic acids were extracted according to the instructions for use of the Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit as follows.
1) 균액 1 mL을 e-tube에 넣고 원심분리(7,500 rpm, 10분)한 후 펠릿(pellet)을 추출한다.1)
2) Enzymatic lysis buffer(20 mM Tris-Cl pH 8.0, 2 mM sodium EDTA, 1.2% Triton X-100, 라이소자임 20 mg/mL) 180 μL로 pellet을 현탁한다.2) Suspend the pellet with 180 μL of Enzymatic lysis buffer (20 mM Tris-Cl pH 8.0, 2 mM sodium EDTA, 1.2% Triton X-100, lysozyme 20 mg/mL).
3) 37℃에서 30분 배양(incubation)한다.3) Incubate at 37℃ for 30 minutes.
4) 프로테이나제 K 20 μL와 AL 버퍼 200 μL를 넣고 볼텍싱(vortexing)한다.4) Add 20 μL of proteinase K and 200 μL of AL buffer and vortex.
5) 56℃ heat block에서 30분 배양한다.5) Incubate for 30 minutes in a 56℃ heat block.
6) 99% 에탄올 200 μL을 넣고 강하게 볼텍싱한다.6) Add 200 μL of 99% ethanol and vortex vigorously.
7) DNeasy minispin column을 2 mL 컬렉션 튜브 에 끼우고 ⑥의 혼합물을 컬럼에 옮긴다. 원심분리(6,000×g, 1분) 후 통과액(flow-through)과 컬렉션 튜브는 버린다.7) Insert the DNeasy minispin column into a 2 mL collection tube and transfer the mixture from ⑥ to the column. Discard the flow-through and collection tube after centrifugation (6,000 × g, 1 min).
8) DNeasy minispin column을 새로운 컬렉션 튜브에 끼우고 AW1 버퍼 500 μL를 넣고 원심분리 (6,000×g, 1분) 후 통과액(flow-through)과 컬렉션 튜브는 버린다.8) Insert the DNeasy minispin column into a new collection tube, add 500 μL of AW1 buffer, centrifuge (6,000×g, 1 minute), and discard the flow-through and collection tube.
9) DNeasy minispin column을 새로운 컬렉션 튜브에 끼우고 AW2 버퍼 500 μL를 넣고 원심분리 (20,000×g, 3분) 후 통과액(flow-through)과 컬렉션 튜브는 버린다.9) Insert the DNeasy minispin column into a new collection tube, add 500 μL of AW2 buffer, centrifuge (20,000×g, 3 minutes), and discard the flow-through and collection tube.
10) 컬럼을 e-tube에 끼우고 AE 버퍼 200 μL를 컬럼 멤브레인에 직접적으로 넣는다. 실온에서 1분 배양 후 원심분리(6,000×g, 1분) 하여 템플릿 DNA를 얻는다.10) Insert the column into the e-tube and pour 200 μL of AE buffer directly onto the column membrane. After incubation at room temperature for 1 minute, centrifugation (6,000 × g, 1 minute) is performed to obtain template DNA.
실시예 3-2: TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 사용Example 3-2: Using TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit
아래와 같은 TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit의 사용 설명서에 따라 핵산을 추출하였다. Nucleic acids were extracted according to the instructions for use of the TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit as shown below.
1) 균액 1 mL을 e-tube에 넣고 원심분리(12,000 rpm, 2분)한 후 펠렛(pellet)을 추출한다.1)
2) 버퍼 BS 500 μL, 라이소자임 50 μL (20 mg/mL)로 펠렛을 현탁한 후 37oC에서 1시간 동안 반응시킨다.2) After suspending the pellet with 500 μL of buffer BS and 50 μL of lysozyme (20 mg/mL), react at 37 ° C for 1 hour.
3) 원심분리(12,000 rpm, 5분) 후 상층액은 버린다.3) Discard the supernatant after centrifugation (12,000 rpm, 5 minutes).
4) 버퍼 GL 180 μL, 프로테이나제 K 20 μL, RNase A 10 μL (10 mg/mL)로 펠렛을 현탁한 후 56℃에서 10분간 반응시킨다.4) After suspending the pellet with 180 μL of buffer GL, 20 μL of proteinase K, and 10 μL of RNase A (10 mg/mL), react at 56°C for 10 minutes.
5) 버퍼 GB 200 μL와 99% 에탄올 200 μL을 넣어 현탁한다.5) Suspend by adding 200 μL of Buffer GB and 200 μL of 99% ethanol.
6) 스핀 컬럼을 컬렉션 튜브에 끼우고, ⑤의 혼합물을 컬럼에 옮긴 후 원심분리(12,000 rpm, 2분) 후 통과액(flow-through)을 버린다.6) Insert the spin column into the collection tube, transfer the mixture of ⑤ to the column, centrifuge (12,000 rpm, 2 minutes), and discard the flow-through.
7) 버퍼 WA 500 μL를 컬럼에 넣고 원심분리(12,000 rpm, 1분) 후 통과액(flow-through)은 버린다.7) Add 500 μL of buffer WA to the column, centrifuge (12,000 rpm, 1 minute), and discard the flow-through.
8) Buffer WB 700 μL를 컬럼에 남아있는 염(salt)이 없게 벽을 씻어가며 넣는다. 원심분리(12,000 rpm, 1분) 후 통과액(flow-through)은 버린다.8) Add 700 μL of Buffer WB to the column while washing the wall to remove any remaining salt. After centrifugation (12,000 rpm, 1 min), the flow-through is discarded.
9) 8)의 과정을 한 번 더 반복한다.9) Repeat step 8) one more time.
10) 컬럼을 컬렉션 튜브에 끼우고 원심분리(12,000 rpm, 2분)한다.10) Insert the column into the collection tube and centrifuge (12,000 rpm, 2 minutes).
11) 컬럼을 새로운 e-tube에 끼우고 용출 버퍼(elution buffer) 50 μL를 멤브레인 중앙에 직접 넣은 후 5분간 상온에서 반응시킨다.11) Insert the column into a new e-tube, put 50 μL of elution buffer directly into the center of the membrane, and react at room temperature for 5 minutes.
12) 원심분리(12,000 rpm, 2분)하여 템플릿 DNA를 추출한다.12) Extract the template DNA by centrifugation (12,000 rpm, 2 minutes).
실시예 3-3: Promega Wiziard Genomic DNA Purification Kit 사용Example 3-3: Use of Promega Wiziard Genomic DNA Purification Kit
아래와 같은 Promega Wiziard Genomic DNA Purification Kit의 사용 설명서에 따라 핵산을 추출하였다. Nucleic acids were extracted according to the instruction manual of the Promega Wiziard Genomic DNA Purification Kit as follows.
1) 균액 1 mL을 e-tube에 넣고 원심분리(13,000×g, 2분)한 후 펠렛을 추출한다.1)
2) 50 mM EDTA 480 μL로 펠렛을 현탁한다.2) Suspend the pellet with 480 μL of 50 mM EDTA.
3) 라이소자임 120 μL를 넣는다.3) Add 120 μL of lysozyme.
4) 37℃에서 30분간 배양한다.4) Incubate at 37℃ for 30 minutes.
5) 원심분리(13,000×g, 2분)한 후 상층액은 버린다.5) Discard the supernatant after centrifugation (13,000×g, 2 minutes).
6) Nuclei lysis solution 600 μL를 넣고 피펫팅한다.6) Add 600 μL of Nuclei lysis solution and pipette.
7) 80℃에서 5분간 배양 후, 상온에서 식힌다.7) After incubation at 80℃ for 5 minutes, cool at room temperature.
8) RNase solution 3 μL를 넣고 섞은 후, 37℃에서 40분간 배양하고 상온에서 식힌다.8) Add 3 μL of RNase solution, mix, incubate at 37℃ for 40 minutes, and cool at room temperature.
9) 단백질 침전 용액 200 μL를 넣고 볼텍싱한다.9) Add 200 μL of protein precipitation solution and vortex.
10) 얼음에서 5분간 배양한다.10) Incubate on ice for 5 minutes.
11) 원심분리(13,000×g, 3분) 한다.11) Centrifuge (13,000×g, 3 minutes).
12) 이소프로판올600 μL가 담긴 e-tube에 상층액을 옮기고 섞는다.12) Transfer the supernatant to an e-tube containing 600 μL of isopropanol and mix.
13) 원심분리(13,000×g, 2분)한 후, 상층액을 버린다.13) After centrifugation (13,000×g, 2 minutes), discard the supernatant.
14) 70% 에탄올 600 μL를 넣는다.14) Add 600 μL of 70% ethanol.
15) 원심분리(13,000×g, 2분)한다.15) Centrifuge (13,000 × g, 2 minutes).
16) 에탄올을 버리고 펠렛을 10분간 건조(air-dry)시킨다.16) Discard the ethanol and air-dry the pellet for 10 minutes.
17) DNA 펠렛에 재수화 용액(rehydration solution) 100 μL를 넣고 65℃에서 1시간 반응시킨 후 이를 템플릿 DNA로 사용한다.17) Add 100 μL of rehydration solution to the DNA pellet, react at 65°C for 1 hour, and use this as template DNA.
실시예 3-4: 0.25% SDS 및 0.05 N NaOH 사용Example 3-4: Using 0.25% SDS and 0.05 N NaOH
1) 균액 1 mL을 e-tube에 넣고 원심분리(13,000×g, 10분)한 후 펠렛을 추출한다.1)
2) 0.25% SDS, 0.05 N NaOH와 멸균증류수의 혼합액 50 μL에 펠렛을 현탁시킨다.2) Suspend the pellet in 50 μL of a mixture of 0.25% SDS, 0.05 N NaOH and sterile distilled water.
3) 멸균증류수 100 μL를 첨가한다.3) Add 100 μL of sterile distilled water.
4) 3)을 99℃ heat block에서 15분 동안 열을 가한다.4) Heat 3) in a 99℃ heat block for 15 minutes.
5) 상온에서 2분간 식힌 후 원심분리(13,000×g, 10분) 진행 후 얻은 상층액을 템플릿 DNA로 사용한다.5) After cooling at room temperature for 2 minutes, and centrifugation (13,000×g, 10 minutes), the obtained supernatant is used as template DNA.
실시예 3-5: 증류수, NaOH 및 CHAPS를 포함하는 본 발명에 따른 용해 버퍼 사용Example 3-5: Use of dissolution buffer according to the present invention comprising distilled water, NaOH and CHAPS
1) 균액 1 mL을 e-tube에 넣고 원심분리(13,000×g, 10분)한 후 펠렛을 추출한다.1)
2) 1 mL의 증류수, NaOH 및 CHAPS를 포함하는 용해 버퍼로 펠렛을 현탁시킨다.2) Suspend the pellet with 1 mL of dissolution buffer containing distilled water, NaOH and CHAPS.
3) 전자레인지(1,100 W)에 현탁액이 담긴 e-tube를 넣고 20초간 가열한다.3) Put the e-tube containing the suspension in a microwave oven (1,100 W) and heat it for 20 seconds.
4) 상온에서 2분간 식힌 후 원심분리(13,000×g, 10분) 진행 후 얻은 상층액을 템플릿 DNA로 사용한다.4) After cooling at room temperature for 2 minutes, centrifugation (13,000×g, 10 minutes) and the obtained supernatant is used as template DNA.
실험예 1: 세균 핵산 추출 여부 확인Experimental Example 1: Confirmation of Bacterial Nucleic Acid Extraction
상기 실시예 3에 따른 방법으로 리스테리아 모노사이토제니스(L. monocytogenes), 황색포도상구균(S. aureus), 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 클로스트리듐 퍼프린젠스(C. perfringens)의 핵산을 추출할 수 있는지 여부를 확인하였다.Listeria monocytogenes by the method according to Example 3 ( L. monocytogenes ), Staphylococcus aureus ( S. aureus ), Bacillus cereus ( B. cereus ) and Clostridium perfringens ( C. perfringens ) nucleic acids It was confirmed whether it could be extracted.
실험예 1-1: 리스테리아 모노사이토제니스(Experimental Example 1-1: Listeria monocytogenes ( L. monocytogenesL. monocytogenes ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
실시예 3에 따른 각 핵산 추출 방법에 대해 3 Log CFU/mL의 리스테리아 모노사이토제니스 핵산 추출 효과를 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 1 및 표 2에 나타내었다.For each nucleic acid extraction method according to Example 3, the effect of extracting 3 Log CFU/mL of Listeria monocytogenes nucleic acid was confirmed through PCR and electrophoresis. The PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 1 and 2 below.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 L. monocytogenes 핵산을 추출할 경우, 기존 키트 대비 더 우수하거나 유사한 수준으로 핵산을 추출함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 1, when extracting L. monocytogenes nucleic acid with the mixed composition (D+C+N) of distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH according to the present invention, it is superior to or better than the existing kit. It was confirmed that nucleic acids were extracted at a similar level.
또한, 실시예 3-5의 방법을 사용하되, 용해 버퍼로 CHAPS만 단독으로 사용하여 PCR 및 전기영동을 통해 리스테리아 모노사이토제니스 핵산 추출 여부를 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 핵산이 추출되지 않는 것으로 나타났다.In addition, using the method of Example 3-5, but using only CHAPS as a dissolution buffer, PCR and electrophoresis confirmed whether Listeria monocytogenes nucleic acid was extracted. As a result, as shown in FIG. 2, nucleic acid was not extracted. appeared not to
실험예 1-2: 황색포도상구균(Experimental Example 1-2: Staphylococcus aureus ( S. aureusS. aureus ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
실시예 3에 따른 각 핵산 추출 방법에 대해 3 Log CFU/mL의 황색포도상구균 핵산 추출 효과를 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 3 및 표 4에 나타내었다.For each nucleic acid extraction method according to Example 3, the effect of 3 Log CFU/mL of Staphylococcus aureus nucleic acid extraction was confirmed through PCR and electrophoresis. The PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 3 and 4 below.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 S. aureus 핵산을 추출할 경우, 기존 키트 대비 더 우수하거나 유사한 수준으로 핵산을 추출함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, when extracting S. aureus nucleic acid with the composition (D+C+N) in which distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH are mixed according to the present invention, it is superior or better than the existing kit. It was confirmed that nucleic acids were extracted at a similar level.
또한, 실시예 3-5의 방법을 사용하되, 용해 버퍼로 CHAPS만 단독으로 사용하여 PCR 및 전기영동을 통해 황색포도상구균 핵산 추출 여부를 확인한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 핵산이 추출되지 않는 것으로 나타났다.In addition, using the method of Example 3-5, but using only CHAPS as a lysis buffer, PCR and electrophoresis confirmed whether or not Staphylococcus aureus nucleic acid was extracted. As a result, as shown in FIG. 4, nucleic acid was not extracted. appeared to be
실험예 1-3: 바실러스 세레우스(Experimental Example 1-3: Bacillus cereus ( B. cereusB. cereus ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
실시예 3에 따른 각 핵산 추출 방법에 대해 3 Log CFU/mL의 바실러스 세레우스 핵산 추출 효과를 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 5 및 표 6에 나타내었다.For each nucleic acid extraction method according to Example 3, the effect of extracting 3 Log CFU/mL of Bacillus cereus nucleic acid was confirmed through PCR and electrophoresis. The PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 5 and 6 below.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 B. cereus 핵산을 추출할 경우, 기존 키트 대비 더 우수하거나 유사한 수준으로 핵산을 추출함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, when extracting B. cereus nucleic acid with the composition (D+C+N) in which distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH are mixed according to the present invention, it is superior or better than the existing kit. It was confirmed that nucleic acids were extracted at a similar level.
실험예 1-4: 클로스트리듐 퍼프린젠스(Experimental Example 1-4: Clostridium perfringens ( C. perfringensC. perfringens ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
실시예 3에 따른 각 핵산 추출 방법에 대해 3 Log CFU/mL의 클로스트리듐 퍼프린젠스 핵산 추출 효과를 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 7 및 표 8에 나타내었다.For each nucleic acid extraction method according to Example 3, the effect of extracting 3 Log CFU/mL Clostridium perfringens nucleic acid was confirmed through PCR and electrophoresis. The PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 7 and 8 below.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 B. cereus 핵산을 추출할 경우, 기존 키트 대비 더 우수하거나 유사한 수준으로 핵산을 추출함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6, when B. cereus nucleic acid is extracted with the composition (D+C+N) in which distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH are mixed according to the present invention, it is superior or better than the existing kit. It was confirmed that nucleic acids were extracted at a similar level.
또한, 실시예 3-5의 방법을 사용하되, 용해 버퍼로 CHAPS만 단독으로 사용하여 PCR 및 전기영동을 통해 클로스트리듐 퍼프린젠스 핵산 추출 여부를 확인한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 핵산이 추출되지 않는 것으로 나타났다.In addition, using the method of Example 3-5, but using only CHAPS as a lysis buffer, PCR and electrophoresis confirmed whether Clostridium perfringens nucleic acid was extracted, as shown in FIG. 7, nucleic acid It turned out not to be extracted.
실험예 2: 그람 양성균에 대한 핵산 추출 민감도 확인Experimental Example 2: Verification of nucleic acid extraction sensitivity for Gram-positive bacteria
실험예 2-1: 리스테리아 모노사이토제니스(Experimental Example 2-1: Listeria monocytogenes ( L. monocytogenesL. monocytogenes )에 대한 핵산 추출 방법의 민감도 확인) Confirmation of the sensitivity of the nucleic acid extraction method for
실시예 3에 따른 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit(Q) 및 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물(D+C+N)로 1 Log CFU/mL 농도로 희석된 L. monocytogenes 균액의 핵산을 추출하여 각 핵산 추출 방법의 민감도를 확인하였다.The nucleic acid of the L. monocytogenes bacterial solution diluted to a concentration of 1 Log CFU/mL with the Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (Q) according to Example 3 and the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction (D+C+N) according to the present invention The sensitivity of each nucleic acid extraction method was confirmed by extraction.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)을 사용하는 경우, 매우 저농도인 1 Log CFU/mL의 L. monocytogenes 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8, when using the mixed composition (D + C + N) of distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH according to the present invention, a very low concentration of 1 Log CFU / mL of L. It was confirmed that monocytogenes nucleic acid could be extracted.
실험예 2-2: 황색포도상구균(Experimental Example 2-2: Staphylococcus aureus ( S. aureusS. aureus )에 대한 핵산 추출 방법의 민감도 확인) Confirmation of the sensitivity of the nucleic acid extraction method for
실시예 3에 따른 0.25% SDS 및 0.05N NaOH의 혼합액(S+N) 및 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물(D+C+N)로 1 Log CFU/mL 농도로 희석된 S. aureus 균액의 핵산을 추출하여 각 핵산 추출 방법의 민감도를 확인하였다. S diluted to a concentration of 1 Log CFU / mL with a mixture of 0.25% SDS and 0.05N NaOH (S + N) according to Example 3 and a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction (D + C + N) according to the present invention. The sensitivity of each nucleic acid extraction method was confirmed by extracting nucleic acids from the bacterial solution of aureus .
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)을 사용하는 경우, 매우 저농도인 1 Log CFU/mL의 S. aureus 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 9, when using the mixed composition (D + C + N) of distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH according to the present invention, a very low concentration of 1 Log CFU / mL of S. It was confirmed that aureus nucleic acid could be extracted.
실험예 2-3: 바실러스 세레우스(Experimental Example 2-3: Bacillus cereus ( B. cereusB. cereus )에 대한 핵산 추출 방법의 민감도 확인) Confirmation of the sensitivity of the nucleic acid extraction method for
실시예 3에 따른 0.25% SDS 및 0.05N NaOH의 혼합액(S+N) 및 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물(D+C+N)로 1 Log CFU/mL 농도로 희석된 B. cereus 균액의 핵산을 추출하여 각 핵산 추출 방법의 민감도를 확인하였다. B diluted to a concentration of 1 Log CFU / mL with the mixture of 0.25% SDS and 0.05N NaOH according to Example 3 (S + N) and the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction (D + C + N) according to the present invention. The sensitivity of each nucleic acid extraction method was confirmed by extracting nucleic acids from cereus strains.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)을 사용하는 경우, 매우 저농도인 1 Log CFU/mL의 B. cereus 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 10, when using the composition (D + C + N) in which distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH are mixed according to the present invention, a very low concentration of 1 Log CFU / mL of B. It was confirmed that cereus nucleic acid could be extracted.
실험예 2-4: 클로스트리듐 퍼프린젠스(Experimental Example 2-4: Clostridium perfringens ( C. perfringensC. perfringens )에 대한 핵산 추출 방법의 민감도 확인) Confirmation of the sensitivity of the nucleic acid extraction method for
실시예 3에 따른 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit(Q) 및 본 발명에 따른 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물(D+C+N)로 1 Log CFU/mL 농도로 희석된 C. perfringens 균액의 핵산을 추출하여 각 핵산 추출 방법의 민감도를 확인하였다.The nucleic acid of C. perfringens bacterial solution diluted to a concentration of 1 Log CFU/mL with the Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (Q) according to Example 3 and the composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction (D+C+N) according to the present invention The sensitivity of each nucleic acid extraction method was confirmed by extraction.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)을 사용하는 경우, 매우 저농도인 1 Log CFU/mL의 C. perfringens 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 11, when using the mixed composition (D + C + N) of distilled water, 0.5% CHAPS and 0.05N NaOH according to the present invention, a very low concentration of 1 Log CFU / mL of C. It was confirmed that perfringens nucleic acid could be extracted.
실험예 3: 그람음성균의 핵산 추출 여부 확인Experimental Example 3: Confirmation of nucleic acid extraction from Gram-negative bacteria
실험예 3-1: 대장균(Experimental Example 3-1: Escherichia coli ( E.coliE. coli ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물을 사용하여 3 Log CFU/mL의 E. coli에 대해서도 핵산 추출이 효과적으로 이루어지는지 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 9 및 표 10에 나타내었다.It was confirmed through PCR and electrophoresis whether nucleic acid extraction was effective even for E. coli at 3 Log CFU/mL using the composition in which distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH were mixed according to the present invention. The PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 9 and 10 below.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 E.coli 핵산이 효과적으로 추출됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 12, it was confirmed that E. coli nucleic acid was effectively extracted with the composition (D+C+N) in which distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH were mixed according to the present invention.
실험예 3-2: 살모넬라(Experimental Example 3-2: Salmonella ( Salmonella spp.Salmonella spp. ) 핵산 추출 여부 확인) Confirmation of nucleic acid extraction
본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물을 사용하여 3 Log CFU/mL의 살모넬라에 대해서도 핵산 추출이 효과적으로 이루어지는지 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다. 사용한 PCR 조건 및 프라이머 서열은 아래 표 11 및 표 12에 나타내었다.It was confirmed through PCR and electrophoresis whether nucleic acid extraction was effective against Salmonella at 3 Log CFU/mL using the mixed composition of distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH according to the present invention. PCR conditions and primer sequences used are shown in Tables 11 and 12 below.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 증류수, 0.5% CHAPS 및 0.05N NaOH가 혼합된 조성물(D+C+N)로 살모넬라 핵산이 효과적으로 추출됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 13, it was confirmed that Salmonella nucleic acid was effectively extracted with the composition (D+C+N) in which distilled water, 0.5% CHAPS, and 0.05N NaOH were mixed according to the present invention.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later and equivalent concepts rather than the detailed description above are included in the scope of the present invention.
<110> Sookmyung Women's university industry-academic cooperation foundation <120> Composition for Nucleic Acid Extraction and Method for Extracting Nucleic Acid Using the Same <130> KPA2021-064 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prfA forward <400> 1 caatgggatc cacaagaata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prfA reverse <400> 2 agcctgctcg ctaatgactt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucA forward <400> 3 gcgattgatg gtgatacggt t 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucA reverse <400> 4 agccaagcct tgacgaacta aagc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bceT forward <400> 5 cgtatcggtc gttcactcgg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bceT reverse <400> 6 gttgattttc cgtagcctgg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpb forward <400> 7 gcgaatatgc tgaatcatct a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpb reverse <400> 8 gcaggaacat tagtatatct tc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA forward <400> 9 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA reverse <400> 10 cggttacctt gttacgactt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> salm forward <400> 11 gctgcgcgcg aacggcgaag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> salm reverse <400> 12 tcccggcaga gttcccatt 19 <110> Sookmyung Women's university industry-academic cooperation foundation <120> Composition for Nucleic Acid Extraction and Method for Extracting Nucleic Acid Using the Same <130> KPA2021-064 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> prfA forward <400> 1 caatgggatc cacaagaata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> prfA reverse <400> 2 agcctgctcg ctaatgactt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucA forward <400> 3 gcgattgatg gtgatacggt t 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucA reverse <400> 4 agccaagcct tgacgaacta aagc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> bceT forward <400> 5 cgttcggtc gttcactcgg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> bceT reverse <400> 6 gttgattttc cgtagcctgg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cpb forward <400> 7 gcgaatatgc tgaatcatct a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cpb reverse <400> 8 gcaggaacat tagtatatct tc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 16s rRNA forward <400> 9 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 16s rRNA reverse <400> 10 cggttacctt gttacgactt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> <400> 11 gctgcgcgcg aacggcgaag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> 223 <#223> <400> 12 tcccggcaga gttcccatt 19
Claims (21)
상기 조성물은 0.5% CHAPS 및 0.05N 수산화나트륨을 포함하는 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 1,
The composition is a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction comprising 0.5% CHAPS and 0.05N sodium hydroxide.
상기 증류수, 수산화 나트륨 및 CHAPS는 180 내지 200 : 1 내지 20 : 0.5 내지 10의 부피비로 혼합된 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 1,
Wherein the distilled water, sodium hydroxide and CHAPS are mixed in a volume ratio of 180 to 200: 1 to 20: 0.5 to 10, nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition.
상기 핵산은 세균 유래 핵산인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 1,
The nucleic acid is a bacterial-derived nucleic acid, a composition for nucleic acid purification or nucleic acid extraction.
상기 세균은 그람양성균인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 4,
The bacteria are Gram-positive bacteria, nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition.
상기 그람양성균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물. According to claim 5,
The gram-positive bacteria are Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , or Clostridium perfringens , for nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition.
상기 조성물은 핵산 추출을 위한 세포막 용해 버퍼인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 1,
The composition is a cell membrane lysis buffer for nucleic acid extraction, nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition.
상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출용 조성물.According to claim 4,
The concentration of the bacteria is 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, nucleic acid purification or nucleic acid extraction composition.
(b) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 펠릿과 혼합하는 단계;
(c) 상기 혼합물을 가열하는 단계; 및
(d) 상기 가열한 혼합물을 식힌 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계
를 포함하는 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법.(a) centrifuging the sample to obtain a pellet;
(b) mixing the composition according to any one of claims 1 to 8 with pellets;
(c) heating the mixture; and
(d) cooling the heated mixture and centrifuging to obtain a supernatant
Nucleic acid purification or nucleic acid extraction method comprising a.
상기 핵산은 세균 유래 핵산인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법.According to claim 10,
The nucleic acid is a bacterial-derived nucleic acid, nucleic acid purification or nucleic acid extraction method.
상기 세균은 그람양성균인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법.According to claim 11,
The bacteria are Gram-positive bacteria, nucleic acid purification or nucleic acid extraction method.
상기 그람양성균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법.According to claim 12,
Wherein the gram-positive bacteria are Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , or Clostridium perfringens , nucleic acid purification or nucleic acid extraction method .
상기 가열 단계는 전자레인지로 10 내지 30초간 수행하는 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법. According to claim 10,
The heating step is performed in a microwave oven for 10 to 30 seconds, nucleic acid purification or nucleic acid extraction method.
상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL인 것인, 핵산 정제 또는 핵산 추출 방법.According to claim 11,
The concentration of the bacteria is 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, nucleic acid purification or nucleic acid extraction method.
(b) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 펠릿과 혼합하는 단계;
(c) 상기 혼합물을 가열하는 단계;
(d) 상기 가열한 혼합물을 식힌 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
(e) 수득된 상층액에서 핵산을 검출하는 단계
를 포함하는 세균 검출 방법.(a) centrifuging the sample to obtain a pellet;
(b) mixing the composition according to any one of claims 1 to 8 with pellets;
(c) heating the mixture;
(d) cooling the heated mixture and centrifuging to obtain a supernatant; and
(e) detecting nucleic acids in the obtained supernatant
Bacterial detection method comprising a.
상기 세균은 그람양성균인 것인, 세균 검출 방법.According to claim 17,
Wherein the bacteria are Gram-positive bacteria, a method for detecting bacteria.
상기 그람양성균은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)인 것인, 세균 검출 방법.According to claim 18,
Wherein the gram-positive bacteria are Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus, or Clostridium perfringens .
상기 세균의 농도는 1 Log CFU/mL 내지 2 Log CFU/mL인 것인, 세균 검출 방법.According to claim 17,
The concentration of the bacteria is 1 Log CFU / mL to 2 Log CFU / mL, a method for detecting bacteria.
상기 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR; nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응 (Multiplex-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 또는 고리매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)에 의한 것인, 세균 검출 방법.According to claim 17,
The detection is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), nested polymerase chain reaction (N-PCR; nested PCR), multiplex-polymerase chain reaction (Multiplex- PCR), real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) or loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which is a bacterial detection method.
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