KR102523239B1 - 페길화 단백질 조성물을 제공하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법, 및 높은 수율 및 생산성을 갖는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법이 제공된다. 방법은 특히 모노-페길화 에리트로포이에틴 조성물을 제공하는데 적합하다. 방법은 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시켜 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물을 생성하고, 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하고, 비-페길화 단백질을 추가의 페길화 반응으로 재순환시키는 것을 포함한다.

Description

페길화 단백질 조성물을 제공하기 위한 방법
본 발명은 페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법, 특히 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법 및 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO를 포함하는 페길화 에리트로포이에틴 (EPO) 조성물을 제공하는 방법 및 모노-페길화 에리트로포이에틴 (EPO) 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다.
단백질의 페길화 또는 페길레이션은 하나 이상의 PEG (폴리에틸렌 글리콜)기를 단백질에 첨가하는 것을 나타낸다. 페길화는 예를 들어 그것이 생체 내 순환 반감기를 증가시키기 때문에, 치료 단백질에 특히 유용하다. 그러나, 페길화는 또한 치료 단백질의 생물학적 활성을 감소시켜 그 효과를 감소시킬 수 있다. 따라서 증가된 순환 시간과 감소된 치료 효과 사이에는 균형이 맞아야 한다.
특정 치료 단백질의 경우, 모노-페길화는 치료 효능을 크게 손상시키지 않으면서 향상된 안정성을 제공하기 때문에 특히 바람직하다. 모노-페길화 치료 단백질은 Mircera®, PegIntron® 및 Pegasys®를 포함한다. Micera®는 모노-페길화 형태의 에리트로포이에틴 (EPO)이며 빈혈 치료에 사용된다.
페길화 반응은 비-페길화 단백질 (미반응 단백질), 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물을 생성하는 경향이 있다. 높은 수준의 페길화를 선호하는 반응 조건 (예컨대 긴 반응 시간, 높은 PEG/단백질 몰비)은 높은 비율의 올리고-페길화 단백질과의 혼합물을 생성하는 경향이 있으며, 이는 모노-페길화 단백질이 바람직한 생성물일 경우, 낮은 수율을 초래한다. 낮은 수준의 페길화를 선호하는 반응 조건 (예컨대 짧은 반응 시간, 낮은 PEG/단백질 몰비)은 높은 비율의 미반응 (비-페길화) 단백질을 가진 혼합물을 생성하는 경향이 있으며, 이는 모노-페길화 단백질이 바람직한 생성물일 경우, 역시 낮은 수율을 초래한다.
치료 단백질은 종종 제조 비용이 높기 때문에, 모노-페길화 치료 단백질 (미반응 및/또는 올리고 페길화로서 치료 단백질의 최소 폐기물)의 양호한 수율을 제공하는 방법은 경제적으로 유리하므로 특히 바람직하다.
관심있는 단백질이 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합되어 있는 동안 관심있는 단백질을 페길화하는 방법은 페길화의 특이성을 조절하여 원하는 페길화 정도를 갖는 단백질의 수율을 개선하기 위해 개발되었다 (소위 "온 컬럼" 방법). 이러한 방법은 기술적으로 복잡하고 시간 소비적이며 결과적으로 생산성이 낮다. 이러한 방법은 또한 상대적으로 많은 양의 페길화 시약을 소비할 수 있어, 경제적으로 바람직하지 않다. 다양한 "온 컬럼" 페길화 방법이 Pfister (Reac React. Chem. Eng., 2016, 1,204), Ingold (2016) 및 Fee & Van Alstine (2006)에서 논의된다.
모노-페길화 단백질을 제공하는 방법은 페길화 반응을 수행하여 비-페길화 단백질 (미반응 단백질), 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물을 제공한 다음, 정제 단계를 수행하여 모노-페길화 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
WO 2009/010270 및 WO 2012/035037은 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물로부터 모노-페길화 EPO를 정제하는 방법에 관한 것이다. 정제 방법은 페길화 반응으로부터 생성된 혼합물을 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 단계에 적용시키는 것을 포함한다. CEC 단계는 결합 및 용리 모드에서 수행되며, 상이한 용리 분획은 대부분 비-페길화, 모노-페길화 또는 올리고-페길화 EPO를 포함한다. 이러한 CEC 방법은 단백질의 등전점 아래에서 수행되어야 하며, EPO (4.0 내지 5.5 범위의 등전점)의 경우 약 3.0의 pH에서 CEC를 포함한다.
페길화 반응을 수행한 다음 생성된 혼합물로부터 모노-페길화 단백질을 정제함으로써 모노-페길화 단백질을 생성하는 방법은 미반응 (비-페길화) 단백질의 재순환을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 미반응 단백질을 회수하고 이를 후속 페길화 반응에 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 재순환은 모노-페길화 단백질의 전체 수율을 향상시킨다.
Pfister (Biotech and Bioeng, 2016)는 페길화 반응이 수행되고 이어서 미반응 (비-페길화), 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물로부터 모노-페길화 단백질을 정제하는 방법을 기재한다. 방법에서 미반응 단백질이 회수되어 후속 페길화 반응에 사용된다. 정제 방법은 결합 및 용리 모드에서 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC)를 포함하며, 여기서 미반응 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 후속 용리에서 분리된다. 미반응 단백질은 고염 용리 완충액을 사용하여 마지막으로 용리시킨다. 따라서, 미반응 단백질의 재순환은 추가의 페길화 반응에 적용되기 전에 정용 여과에 의한 염의 제거를 필요로 한다. 염의 제거에 대한 요구 사항은 생산성을 낮추고 방법의 복잡성을 증가시킨다.
본 발명은 상기 고려 사항에 비추어 고안되었다.
본 발명은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법 및 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO를 포함하는 페길화 EPO 조성물뿐만 아니라 모노-페길화 EPO 조성물을 제공하는데 특히 적합하다. 본원에 기재된 방법의 장점은 높은 수율 및 생산성을 포함한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 페길화 단백질 혼합물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: (a) 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시켜 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하는 단계, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함; (b) 반응 생성물의 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 IEC 통과 용액을 제공하는 단계; IEC 단계는 비-페길화 단백질을 결합시키기에 적합한 조건 하에서 반응 생성물의 혼합물을 IEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및 (c) 단계 b)로부터의 IEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 IEC 물질로부터 용리된 IEC 용리액에 의해 회수되며 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용됨.
비-페길화 단백질은 단계 b)에서 용리에 의해 회수되어 후속 페길화 반응에 사용될 수 있다. 즉, 단계 b)는 IEC 용리액에서 비-페길화 단백질을 용리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. IEC 용리액은 비-페길화 단백질을 포함한다.
방법은 단계 (a), (b) 및 (c)의 2 이상의 사이클을 포함할 수 있으며, 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 회수될 수 있고 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에서 사용된다.
IEC 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 단계일 수 있다.
본 발명은 페길화 단백질 혼합물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: (a) 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시켜 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하는 단계, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함; (b) 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공하는 단계; AEC 단계는 비-페길화 단백질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 반응 생성물의 혼합물을 AEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및 (c) 단계 b)로부터의 AEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 AEC 물질로부터 용리된 AEC 용리액에 의해 회수되며 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용됨.
방법은 단계 (a), (b) 및 (c)의 2 이상의 사이클을 포함할 수 있으며, 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 AEC 물질로부터 AEC 용리액을 용리함으로써 회수될 수 있고 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에서 사용된다.
반응 생성물의 혼합물은 상대적으로 낮은 비율의 올리고-페길화 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 반응 생성물의 혼합물은 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
반응 생성물의 혼합물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 70% 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
IEC 통과 용액 (AEC 또는 CEC 통과 용액)은 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, IEC 통과 용액은 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 적어도 약 99.9%의 페길화 단백질을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액은 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, AEC 통과 용액은 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 적어도 약 99.9%의 페길화 단백질을 포함할 수 있다.
단백질은 에리트로포이에틴 (EPO)일 수 있다. 단백질은 호르몬일 수 있다. 단백질은 호르몬, 사이토카인, 효소 또는 항체일 수 있다.
본 발명의 방법은 페길화 반응을 수행하고 비-페길화 단백질을 재순환시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 상대적으로 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 유리하다.
본 발명의 방법은 약 pH 7.0 내지 9.0에서 페길화 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 활성화된 PEG 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 페길화 반응은 약 pH 7.5 내지 8.5, 또는 약 pH 8.0에서 수행될 수 있고, NHS 활성화된 PEG 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 이는 상대적으로 신속한 페길화 단계를 제공하며, 이는 본원에 기재된 방법의 전체 신속성 및 높은 생산성에 기여한다. 페길화 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다.
방법은 반응 생성물의 혼합물을 제공하기 위해 페길화 반응을 수행하고, 페길화 반응으로부터 비-페길화 단백질 (미반응 단백질)을 재순환시키는 것을 포함한다. 비-페길화 단백질은 IEC 단계의 일부로서 반응 생성물의 혼합물로부터 회수된다. IEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 이온 교환 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. IEC 통과 용액은 비-페길화 단백질의 대부분이 음이온 교환 물질에 결합하기 때문에 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질 (모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질)을 포함한다. 따라서, 비-페길화 단백질은 IEC 물질로부터 용리시킴으로써 반응 생성물의 혼합물로부터 회수될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 첨가되어, 비-페길화 단백질을 재순환시킨다.
방법은 반응 생성물의 혼합물을 제공하기 위해 페길화 반응을 수행하고, 페길화 반응으로부터 비-페길화 단백질 (미반응 단백질)을 재순환시키는 것을 포함한다. 비-페길화 단백질은 AEC 단계의 일부로서 반응 생성물의 혼합물로부터 회수된다. AEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. AEC 통과 용액은 비-페길화 단백질의 대부분이 음이온 교환 물질에 결합하기 때문에 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질 (모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질)을 포함한다. 따라서, 비-페길화 단백질은 AEC 물질로부터 용리시킴으로써 반응 생성물의 혼합물로부터 회수될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 첨가되어, 비-페길화 단백질을 재순환시킨다.
본원에 개시된 방법에서 비-페길화 단백질의 재순환은 IEC 단계에서 비-페길화 단백질을 용리시킴으로써 달성된다. 본원에 개시된 방법에서 비-페길화 단백질의 재순환은 AEC 단계에서 비-페길화 단백질을 용리시킴으로써 달성된다. 음이온 교환 물질로부터 비-페길화 단백질의 용리는 상대적으로 간단하고 빠르므로, 재순환을 위해 미반응 단백질을 단순하고 신속하게 회수할 수 있다. 비-페길화 단백질 재순환에 대한 용리의 신속성은 본원에 개시된 방법의 전체 신속성 및 생산성에 기여한다.
방법은 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 함유하는 반응 생성물의 혼합물을 사용하여 수행된다. 반응 생성물의 혼합물에서 올리고-페길화 단백질의 비율은 상대적으로 낮을 수 있다. 방법은 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 IEC 통과 용액을 제공하는 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계를 포함한다. 방법은 비-페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 감소되는 IEC 통과 용액을 제공하는 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계를 포함한다. IEC 통과 용액은 높은 비율의 페길화 단백질을 함유할 수 있으며, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질로 이루어진다. 즉, 본 발명의 방법은 통과 모드에서 수행되는 IEC 단계를 포함한다. 통과 모드에서 IEC 단계는 상대적으로 신속하다. 본 발명의 상대적으로 빠른 IEC 단계는 본 발명의 방법의 상대적으로 전체적인 높은 생산성에 기여한다. IEC 단계는 AEC 단계 또는 CEC 단계일 수 있다.
IEC 통과 용액은 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가된 페길화 단백질의 분획을 갖는다. AEC 통과 용액은 반응 생성물의 혼합물에 비해 감소된 비-페길화 단백질의 분획을 갖는다.
방법은 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공하는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계를 포함할 수 있다. 방법은 비-페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 감소되는 AEC 통과 용액을 제공하는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계를 포함한다. AEC 통과 용액은 높은 비율의 페길화 단백질을 함유할 수 있으며, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질로 이루어진다. 즉, 본 발명의 방법은 통과 모드에서 수행되는 AEC 단계를 포함한다. 통과 모드에서 AEC 단계는 상대적으로 신속하다. 본 발명의 상대적으로 빠른 AEC 단계는 본 발명의 방법의 상대적으로 전체적인 높은 생산성에 기여한다.
AEC 통과 용액은 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가된 페길화 단백질의 분획을 갖는다. AEC 통과 용액은 반응 생성물의 혼합물에 비해 감소된 비-페길화 단백질의 분획을 갖는다.
AEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 물질에 적용하는 것을 포함한다. 음이온 교환 물질은 강한 음이온 교환 물질일 수 있다. 적합한 물질은 당업계에 공지되어 있으며 강한 음이온 교환 물질인 Toyopearl SuperQ 650M을 포함한다. 음이온 교환 물질은 페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 가질 수 있다.
IEC 물질은 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. IEC 물질은 약 1.0 g/L, 0.75 g/L, 0.5 g/L, 0.25 g/L, 0.10 g/L 또는 0.05 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 결합 능력은 동적 결합 능력일 수 있다. 음이온 교환 물질은 약 1.5 g/L 미만, 약 1.0 g/L 미만, 약 0.75 g/L 미만, 약 0.5 g/L 미만, 약 0.1 g/L, 약 0.05 g/L 미만, 약 0.01 g/L 미만 또는 약 0.001 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 음이온 교환 물질은 0 g/L에 가까운 (즉, 0 g의 페길화 단백질 / L AEC 수지에 가까운) 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 특히, 음이온 교환 물질은 약 0.5 g/L 미만, 약 0.05 g/L 미만, 약 0.01 g/L 미만 또는 약 0.001 g/L 미만의 페길화 EPO에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 음이온 교환 물질은 0 g/L에 가까운 (즉, 0 g의 페길화 EPO / L AEC 수지에 가까운) 페길화 EPO에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. IEC 물질은 AEC 물질일 수 있고 페길화 단백질은 페길화 에리트로포이에틴일 수 있다.
IEC 물질은 20 - 50 g/L, 30 - 40 g/L 또는 약 35 g/L의 비-페길화 단백질 (예를 들어, 비-페길화 EPO)에 대한 상대적으로 높은 결합 능력을 가질 수 있다. IEC 물질은 적어도 약 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L 또는 약 35 g/L의 비-페길화 단백질 (예를 들어, 비-페길화 EPO)에 대한 결합 능력을 가질 수 있다. 결합 능력은 동적 결합 능력일 수 있다. IEC 물질은 AEC 물질일 수 있고 비-페길화 단백질은 비-페길화 에리트로포이에틴일 수 있다. 단백질은 에리트로포이에틴 (EPO)일 수 있다. 단백질은 호르몬일 수 있다. 단백질은 호르몬, 사이토카인, 효소 또는 항체일 수 있다.
방법은 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계를 포함할 수 있고 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다.
페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 이온 교환 물질의 사용은 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 신속한 분리를 용이하게 하기 때문에 유리하다. IEC 단계는 통과 모드에서 수행될 수 있어 미반응 (비-페길화) 단백질의 대부분 또는 거의 전부가 제거된 IEC 통과 용액을 신속하게 제공할 수 있다. 따라서, IEC 단계로부터의 통과 용액은 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질을 포함한다. 이는 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 페길화 단백질, 또는 80-95% 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 적어도 약 90% 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 적어도 약 95% 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 낮은 비율, 0에 가깝거나 또는 0의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 약 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 비-페길화 단백질, 또는 약 20-5%의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 10% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 5% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
페길화 형태의 단백질에 대해 낮은 결합 능력을 갖는 이온 교환 물질을 사용하는 추가의 이점은 그것이 이온 교환 물질로부터 미반응 (비-페길화) 단백질의 신속한 회수를 용이하게 한다는 것이다. 비-페길화 단백질은 단계 용리에 의해 신속하게 회수될 수 있으며, 이는 페길화 반응에 직접 첨가하기에 적합할 수 있는 상대적으로 농축된 형태의 비-페길화 단백질을 포함하는 용리액을 제공할 수 있다. 비-페길화 단백질은 상대적으로 낮은 전도도, 또는 낮은 염 농도에서 수행되는 용리 단계에서 음이온 교환 물질로부터 용리될 수 있으며, 이는 예를 들어 높은 염 농도의 제거 (예를 들어, 정용 여과, 재농축 또는 완충액 교환)가 용출액이 후속 페길화 반응에 첨가되기 전에 필요하지 않기 때문이다. 따라서, 페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 이온 교환 물질의 사용은 후속 페길화 반응에서의 재순환에 특히 적합한 형태로 미반응 (비-페길화) 단백질의 신속한 회수를 제공하기 때문에 유리하다.
페길화 형태의 단백질에 대한 결합 능력이 낮은 음이온 교환 물질의 사용은 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 신속한 분리를 용이하게 하기 때문에 유리하다. AEC 단계는 통과 모드에서 수행될 수 있어 미반응 (비-페길화) 단백질의 대부분 또는 거의 전부가 제거된 AEC 통과 용액을 신속하게 제공할 수 있다. 따라서, AEC 단계로부터의 통과 용액은 상대적으로 높은 비율의 페길화 단백질을 포함한다. 이는 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%의 페길화 단백질, 또는 80-95%의 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 적어도 약 90% 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 적어도 약 95% 페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 낮은 비율, 0에 가깝거나 또는 0의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 약 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 비-페길화 단백질, 또는 약 20-5%의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 10% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 이는 5% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
페길화 형태의 단백질에 대해 낮은 결합 능력을 갖는 음이온 교환 물질을 사용하는 추가의 이점은 그것이 음이온 교환 물질로부터 미반응 (비-페길화) 단백질의 신속한 회수를 용이하게 한다는 것이다. 비-페길화 단백질은 단계 용리에 의해 신속하게 회수될 수 있으며, 이는 페길화 반응에 직접 첨가하기에 적합할 수 있는 상대적으로 농축된 형태의 비-페길화 단백질을 포함하는 용리액을 제공할 수 있다. 비-페길화 단백질은 상대적으로 낮은 전도도, 또는 낮은 염 농도에서 수행되는 용리 단계에서 음이온 교환 물질로부터 용리될 수 있으며, 이는 예를 들어 높은 염 농도의 제거 (예를 들어, 정용 여과, 재농축 또는 완충액 교환)가 용출액이 후속 페길화 반응에 첨가되기 전에 필요하지 않기 때문이다. 따라서, 페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 음이온 교환 물질의 사용은 후속 페길화 반응에서의 재순환에 특히 적합한 형태로 미반응 (비-페길화) 단백질의 신속한 회수를 제공하기 때문에 유리하다.
본 발명의 방법은 IEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함하는, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. IEC 통과 용액을 수집하는 것은 분리된 IEC 사이클로부터 IEC 통과 용액의 배치를 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 방식으로 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물이 제공된다. IEC 단계는 AEC 단계 또는 CEC 단계일 수 있다.
본 발명의 방법은 AEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함하는, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. AEC 통과 용액을 수집하는 것은 분리된 AEC 사이클로부터 AEC 통과 용액의 배치를 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 방식으로 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물이 제공된다. 제 2 양태에서, 본 발명은 적어도 약 90%의 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: 본 발명의 제 1 양태에 따른 방법에 의해 제조된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법에 적용하는 단계; 및 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 회수하는 단계, 여기서 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90% 모노-페길화 단백질을 포함함.
모노-페길화 단백질 조성물은 상대적으로 높은 비율의 모노-페길화 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단백질 조성물은 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
페길화 반응은 비-페길화 단백질 (미반응 단백질), 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물을 생성하는 경향이 있다. 모노-페길화 단백질은 이들이 비-페길화 및 올리고-페길화 버전의 단백질에 비해 상대적으로 증가된 반감기 및 비교할만한 생물학적 활성 사이의 균형을 제공하기 때문에 바람직할 수있다. 단백질, 특히 치료 단백질은 종종 제조 비용이 높기 때문에, 우수한 수율의 모노-페길화 치료 단백질을 제공하는 방법이 특히 바람직하다. 양호한 수율의 모노-페길화 EPO (Mircera®)를 제공하는 방법이 특히 바람직하다.
본원에 개시된 방법은 상대적으로 신속하기 때문에 유리하며, 따라서 상대적으로 높은 생산성을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법은 또한 높은 비율의 출발 단백질이 페길화되고, 특히 모노-페길화되어, 높은 수율을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법은 또한 상대적으로 높은 순도의 모노-페길화 단백질 조성물을 제공한다.
IEC 단계로부터의 통과 용액은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는데 사용된다. 예를 들어, AEC 단계로부터 통과 용액은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는데 사용된다. 이 혼합물은 정제 방법에 적용되어 올리고-페길화 단백질로부터 모노-페길화 단백질을 분리하여 상대적으로 높은 비율의 모노-페길화 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 정제 방법은 페길화 단백질 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계로 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 음이온 교환 단계 및 HIC 단계 둘다 상대적으로 신속하므로, 모노-페길화 단백질 조성물을 제조하기 위해 상대적으로 신속한 방법을 제공하고 있다. HIC 단계는 모노-페길화 단백질 조성물의 신속한 제조 방법을 제공하기 위해, 특히 신속한, 통과 모드로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 IEC 단계 (AEC 또는 CEC 단계일 수 있음)로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 IEC 통과 용액을 수집하는 것을 포함할 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 수집하는 것은 분리된 IEC (AEC 또는 CEC) 사이클로부터 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액의 배치 또는 분획을 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 방식으로 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물이 제공된다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 수집하는 것은 "인-라인 컨디셔닝" 작업에서, IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 인-라인 연결을 통해 HIC 물질로 전달하는 것을 포함할 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 수집하는 것은 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 컨디셔닝하기 위해 용기에 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 전달하는 것을 포함할 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 수집하는 것은 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액을 HIC 물질에 직접 전달하는 단계를 포함할 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액이 HIC 물질로 직접 전달될 때 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액은 예를 들어 인-라인 컨디셔닝에 의해 컨디셔닝될 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액 (페길화 단백질 혼합물)의 연속적인 낮은 통과 용액을 HIC 물질에 제공하기 위해 인-라인 컨디셔닝된 IEC (AEC 또는 CEC) 물질로부터 HIC 물질로의 IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액 (페길화 단백질 혼합물)의 연속적인 유동이 있을 수 있다. IEC (AEC 또는 CEC) 통과 용액은 낮은 비율의 비-페길화 단백질 및 높은 비율의 페길화 단백질 (모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질)을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 수행함으로써 페길화 단백질 혼합물에서 올리고-페길화 단백질로부터 모노-페길화 단백질을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 모노-페길화 EPO 조성물의 제조에 특히 적합하다. 모노-페길화 EPO의 제조 방법에서, AEC 단계는 약 7.0 내지 10.0, 약 7.0 내지 9.0, 약 7.5 내지 8.5 또는 약 8.0의 pH에서 수행된다. 이는 일반적으로 3.0 이하의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC)를 포함하는 방법보다 유리하다. 약 pH 3.0 이하의 산 조건은 EPO 품질에 악영향을 미칠 수 있으며, 이러한 악영향은 본 발명의 방법에서 감소되며, 이는 CEC를 필요로 하지 않으므로 CEC-기반 정제의 EPO에 필요한 낮은 pH 조건을 필요로 하지 않는다.
또한, EPO의 산성 형태 (산성 변이체)는 보다 높은 치료 활성을 가질 수 있어, 특히 유용하다. 그러나, CEC에 의한 모노-페길화 산성 형태의 EPO의 회수는 CEC에서의 용리 조건이 디-페길화 비-산성 형태의 EPO의 것과 유사하기 때문에 열악할 수 있다. 산성 조건은 단백질 분자에서 아미노산의 측쇄를 산화시키는 결과를 초래한다. CEC는 이들의 전하에 따라 단백질 분자를 분리하므로, 종의 기본 변이체는 산성 변이체보다 늦게 용리될 수 있다. 이러한 이유로, 디-페길화된 비-산성 형태의 EPO의 CEC 용리 프로파일은 모노-페길화 산성 형태의 EPO와 겹치는 경향이 있다. CEC에 의한 이들의 유용한 모노-페길화 산성 EPO 형태의 열악한 회수는 본원에 개시된 방법에서 감소되며, 이는 올리고-페길화 EPO로부터 모노-페길화 것을 분리하기 위해 CEC에 의존하지 않는다.
모노-페길화 EPO를 제공하기 위한 본 발명과 관련된 이점은 다른 단백질, 특히 다른 치료학적 단백질에 적용할 수 있다. 즉, 낮은 pH 조건의 회피 및 산성 변이체의 회수는 본 발명을 모노-페길화 EPO 이외의 모노-페길화 단백질을 제공하는데 유용하게 만들 수 있다. 방법은 실질적으로 동일한 pH에서 IEC 및 HIC 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 실질적으로 동일한 pH에서 페길화 반응, IEC 및 HIC 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 실질적으로 동일한 pH에서 AEC 단계 및 정제 방법을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 실질적으로 동일한 pH에서 AEC 및 HIC 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 실질적으로 동일한 pH에서 페길화 반응, AEC 및 HIC 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. pH는 약 7.0 내지 9.0, 또는 약 7.5 내지 8.5, 또는 약 8.0 일 수 있다. 실질적으로 동일한 pH는 ± 0.5 pH 단위를 나타낼 수 있다. 실질적으로 동일한 pH에서 방법의 단계를 수행하는 것은 단계 사이의 pH 조정이 필요하지 않기 때문에 유리하며, 이는 pH 조정이 시간-소모적일 수 있고 따라서 생산성-감소를 시킬 수 있다. 방법은 페길화 반응을 수행하여 반응 생성물의 혼합물을 제공하고, 반응 생성물의 혼합물을 IEC 물질에 직접 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 즉, 방법은 페길화 반응을 수행하고 혼합물의 pH를 조정하지 않고 IEC 물질에 생성된 혼합물을 적용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 IEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함하는, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. IEC 통과 용액을 수집하는 것은 분리된 IEC 사이클로부터 IEC 통과 용액의 배치를 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 방식으로 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물이 제공된다. 본 발명의 방법은 AEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함하는, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. AEC 통과 용액을 수집하는 것은 분리된 AEC 사이클로부터 AEC 통과 용액의 배치를 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 방식으로 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물이 제공된다.
본 발명의 방법은 페길화 단백질 혼합물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함한다. 이는 풀링된 페길화 단백질 혼합물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함할 수 있다. IEC 통과 용액을 수집하는 것은 "인-라인 컨디셔닝 작업"에서, IEC 통과 용액을 인-라인 연결을 통해 HIC 물질로 전달하는 것을 포함할 수 있다. IEC 통과 용액을 수집하는 것은 페길화 단백질 혼합물을 제공하기 위해 IEC 통과 용액을 컨디셔닝하기 위해 IEC 통과 용액을 용기에 전달하는 것을 포함할 수 있다. IEC 통과 용액은 낮은 비율의 비-페길화 단백질 및 높은 비율의 페길화 단백질 (모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질)을 포함할 수 있다. 정제 방법은 페길화 단백질 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계로 적용하는 단계를 포함할 수 있다. HIC 단계는 통과 모드에서 수행될 수 있다. 통과 모드의 HIC 단계는 페길화 단백질 혼합물을 소수성 상호 작용 물질과 접촉시키고, 통과를 수집하는 것을 포함할 수 있다. 통과는 상대적으로 높은 비율의 모노-페길화 단백질을 포함한다. 통과 모드에서 HIC 단계를 수행하는 것은 상대적으로 신속하게 수행될 수 있어, 방법의 전체적인 신속성 및 생산성에 기여하기 때문에 유리하다. 결합 및 용리 모드가 아닌, 통과 모드에서 HIC 단계를 수행하는 것은, 상대적으로 작은 크기의 컬럼을 사용하여 수행될 수 있기 때문에 유리하다.
페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 2 개의 IEC 단계, 또는 3 개의 IEC 단계, 또는 3 개 이상의 IEC 단계, 또는 4 개의 IEC 단계 또는 5 개의 IEC 단계로부터 통과 용액을 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 IEC 통과 용액의 풀링은 HIC 단계가 다중 페길화 반응의 생성물로부터 모노-페길화 단백질 조성물을 생성할 수 있게 하며, 이는 상대적으로 효율적이다. IEC 단계는 일련의 AEC 단계 또는 일련의 CEC 단계일 수 있다. 본 발명의 방법은 페길화 단백질 혼합물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함한다. 이는 풀링된 페길화 단백질 혼합물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액을 수집하는 것은 "인-라인 컨디셔닝 작업"에서, 인-라인 연결을 통해 AEC 통과 용액을 HIC 물질로 전달하는 것을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액을 수집하는 것은 페길화 단백질 혼합물을 제공하기 위해 AEC 통과 용액을 컨디셔닝하기 위해 용기에 AEC 통과 용액을 전달하는 것을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액을 수집하는 것은 AEC 통과 용액을 HIC 물질에 직접 전달하는 것을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액이 HIC 물질로 직접 전달될 때, AEC 통과 용액은 예를 들어 인-라인 컨디셔닝에 의해 컨디셔닝될 수 있다. 연속적인 유동의 컨디셔닝된 통과 용액을 HIC 물질에 제공하기 위해 인-라인 컨디셔닝된 AEC 물질로부터 HIC 물질로의 AEC 통과 용액의 연속 유동이 있을 수 있다. AEC 통과 용액은 낮은 비율의 비-페길화 단백질 및 높은 비율의 페길화 단백질 (모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질)을 포함할 수 있다. 정제 방법은 페길화 단백질 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계로 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
IEC 통과 용액의 컨디셔닝은 컨디셔닝된 제 2 혼합물을 제공하는 것으로 나타낼 수 있다. 컨디셔닝된 제 2 혼합물은 하기에 보다 상세하게 기재된다. IEC 통과 용액의 컨디셔닝 (또는 컨디셔닝된 제 2 혼합물의 제공)은 염의 첨가를 포함할 수 있다. 비신 (bicine)을 추가하여 IEC 통과 용액을 컨디셔닝한다. IEC 통과 용액의 컨디셔닝 (또는 컨디셔닝된 제 2 혼합물의 제공)은 염 및 비신의 첨가를 포함할 수 있다. IEC 통과 용액의 컨디셔닝 (또는 컨디셔닝된 제 2 혼합물의 제공)은 하기 기재된 컨디셔닝된 제 2 혼합물을 제공하기 위해 염 및/또는 비신의 첨가를 포함할 수 있다.
HIC 단계는 통과 모드에서 수행될 수 있다. 통과 모드의 HIC 단계는 페길화 단백질 혼합물을 소수성 상호 작용 물질과 접촉시키고, 통과 용액을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 통과 용액은 상대적으로 높은 비율의 모노-페길화 단백질을 포함한다. 통과 모드에서 HIC 단계를 수행하는 것은 상대적으로 신속하게 수행될 수 있어, 방법의 전체적인 신속성 및 생산성에 기여하기 때문에 유리하다. 결합 및 용리 모드가 아닌, 통과 모드에서 HIC 단계를 수행하는 것은, 상대적으로 작은 크기의 컬럼을 사용하여 수행될 수 있기 때문에 유리하다.
페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 2 개의 IEC 단계, 또는 3 개의 IEC 단계, 또는 3 개 이상의 IEC 단계, 또는 4 개의 IEC 단계 또는 5 개의 IEC 단계로부터 통과 용액을 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 IEC 통과 용액의 풀링은 HIC 단계가 다중 페길화 반응의 생성물로부터 모노-페길화 단백질 조성물을 생성할 수 있게 하며, 이는 상대적으로 효율적이다. 예를 들어, 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 2 개의 AEC 단계, 또는 3 개의 AEC 단계, 또는 3 개 이상의 AEC 단계, 또는 4 개의 AEC 단계, 또는 5 개의 AEC 단계로부터 통과 용액을 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 AEC 통과 용액의 풀링은 HIC 단계가 다수의 페길화 반응의 생성물로부터 모노-페길화 단백질 조성물을 생성할 수 있게 하며, 이는 상대적으로 효율적이다.
도면에서 "EPO"는 미-반응된 EPO (비-페길화 EPO), "mono"는 모노-페길화 EPO, "oligo"는 올리고-페길화 EPO를 나타낸다. "F/T"는 통과 용액을 나타낸다.
도 1: 본 발명에 따른 방법의 일 구현예의 개략적인 순서 및 핵심 데이터. 비-페길화 출발 물질은 새로운 EPO를 보충하지 않고 2 개의 추가 사이클로 사용된다. 생산성은 2 개의 CEC 크로마토그래피 컬럼이 사용되는, WO 2009/010270에 개시된 모노-페길화 EPO (Mircera®)의 공지된 생산 방법에 비해 증가되는 것으로 계산된다. AEC 물질의 동적 결합 능력은 35 g/L (35g의 비-페길화 단백질 / L 수지) (WO 2009/010270의 방법의 CEC 물질보다 30 배 더 높은 계수)이다. HIC 컬럼은 동적 결합 능력 5 g/L (5 g의 올리고-페길화 단백질 / L 수지) (WO 2009/010270의 방법에서 사용된 CEC 물질보다 ~ 4배 더 높은 계수)을 통해 통과 모드로 로딩될 수 있다. WO 2009/010270에 개시된 방법과 비교하여, 제 1 컬럼은 더 작게 만들어질 수 있고, 3 사이클로부터의 조합된 분획 (통과)은 동일한 크기의 제 2 컬럼에서 1 회 실행으로 처리될 수 있다.
도 2: 본 발명에 따른 방법의 일 구현예의 개략적인 순서 및 핵심 데이터. 배치 크기는 후속 사이클 동안 반응된 EPO를 동일한 양의 새로운 EPO로 교체함으로써 증가된다. 사이클 수는 여기서 원하는대로 변경될 수 있다. 여기서 배치 크기는 1 주일 내 완료될 수 있도록 선택되었다. 계산된 생산성은 WO 2009/010270에 개시된 모노-페길화 EPO의 공지 된 생산 방법에 비해 10 배 증가된다.
도 3: 본 발명에 따른 방법의 일 구현예의 개략적인 순서 및 핵심 데이터. 배치 크기는 페길화 반응에서 소비된 EPO가 다음 사이클에서 동일한 양의 새로운 EPO로 교체됨으로써 증가된다. 또한, 페길화 반응을 위한 EPO의 농도는 10 g/L로 증가되었다. 이러한 방식으로, 두 배의 양이 동일한 반응 부피에서 처리될 수 있다. 이러한 경우, 사이클 수는 원하는대로 변경될 수 있다. 여기서 배치 크기는 1 주일 내 완료될 수 있도록 선택되었다. 생산성은 WO 2009/010270에 개시된 모노-페길화 EPO의 공지된 생산 방법에 비해 20 배 증가된 것으로 계산된다.
도 4: 통과 모드에서 AEC로부터의 샘플의 크로마토그램으로, 통과 및 용리 분획에서 페길화 반응 혼합물로부터 EPO의 회수를 나타냄. 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO는 통과 용액에 존재한다. EPO는 추가의 페길화 반응을 위해 거의 정량적으로 및 고순도로 단계 용리에 의해 회수될 수 있다. 분획의 조성은 RP-HPLC에 의해 측정되었다.
도 5: 3 개의 후속 사이클에서 페길화 반응 혼합물로부터 EPO의 회수를 위한 예시적인 AEC 크로마토 그램. 사이클 2 및 3에서 EPO의 총량은, 이전 사이클로부터 회수된 미반응 EPO만이 사이클 2 및 3의 페길화에 사용되었기 때문에 감소된다. 모노-페길화 및 올리고-페길화 EPO는 통과 용액에 존재한다. 미반응 EPO는 추가의 페길화 반응을 위해 거의 정량적으로 및 높은 순도로 단계 용리에 의해 회수될 수 있다. 분획의 조성은 RP-HPLC에 의해 측정되었다.
도 6: 결합 및 용리 모드에서 Toyopearl Phenyl 650 M의 정제 성능에 대한 예시적인 HIC 크로마토그램. 비-페길화 EPO를 500mM Na2SO4의 통과 용액에서 제거하였다. Na2SO4 의 하강 구배에서, 모노-페길화 EPO는 약 300mM Na2SO4에서 올리고 종으로부터 우수한 해상도로 용리된다. 분획의 조성은 RP-HPLC에 의해 측정되었다.
도 7: 통과 모드에서 Toyopearl Phenyl 650 M의 정제 성능에 대한 예시적인 HIC 크로마토그램. 모노-페길화 EPO는 약 300mM Na2SO4의 통과 용액에 존재한다. 올리고-페길화 EPO 종은 재생될 때까지 컬럼 상에 남아있다. 분획의 조성은 RP-HPLC에 의해 측정되었다.
도 8: 도 8A, 8B 및 8C는 3 개의 후속 사이클에서 페길화 반응 혼합물로부터 EPO를 회수하기 위한 AEC 크로마토그램을 나타낸다.
도 9: 결합 및 용리 모드에서 Toyopearl Phenyl 650 M의 정제 성능에 대한 HIC 크로마토그램.
도 10: 통과 모드에서 Toyopearl Phenyl 650 M의 정제 성능에 대한 HIC 크로마토그램.
본 발명의 원리를 설명하는 구현예 및 실험이 이제 첨부 도면을 참조로 논의될 것이다.
모노-페길화 단백질 조성물
본 발명은 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 90%의 모노-페길화 단백질을 포함하는 단백질 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 적어도 90%의 모노-페길화 EPO를 포함하는 EPO 조성물을 제공하는 방법을 제공한다.
본 맥락에서, 모노-페길화 단백질 조성물은 단백질을 포함하는 조성물이며, 여기서 조성물에 존재하는 상대적으로 높은 비율의 단백질은 모노-페길화 단백질로서 존재한다. 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
적어도 x %의 모노-페길화 단백질을 포함하는 단백질 조성물은 그 조성물에 존재하는 단백질의 적어도 x %가 모노-페길화 단백질 조성물을 나타낸다. 예를 들어, 적어도 99% 모노-페길화 단백질을 포함하는 단백질 조성물은 조성물에 존재하는 단백질의 적어도 99%가 모노-페길화 단백질 조성물이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 단백질 조성물은 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
특히, 본 맥락에서, 모노-페길화 EPO 조성물은 EPO를 포함하는 조성물이며, 여기서 조성물에 존재하는 상대적으로 높은 비율의 EPO는 모노-페길화 EPO로서 존재한다. 적어도 "x %"의 모노-페길화 EPO를 포함하는 EPO 조성물은 그 조성물에 존재하는 EPO의 적어도 "x %"가 모노-페길화 EPO 조성물을 나타낸다. 예를 들어, 적어도 99% 모노-페길화 EPO를 포함하는 EPO 조성물은 조성물에 존재하는 EPO의 적어도 99%가 모노-페길화 EPO 조성물이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 EPO 조성물은 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%의 모노-페길화 EPO를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 EPO 조성물은 적어도 약 98% 모노-페길화 EPO를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 EPO 조성물은 적어도 약 99% 모노-페길화 EPO를 포함할 수 있다.
순도의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 비-페길화, 모노-페길화 또는 올리고-페길화 단백질의 순도는 임의의 적합한 분석 방법 (예를 들어 겔, ELISA, HPLC 등의 밴드 강도)에 의해 측정될 수 있다. 순도의 측정은 공지된 순도의 기준 물질을 사용하여 생성된 표준 곡선을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 순도는 또한 중량부-중량 기초로 측정될 수 있다. 본원에서 백분율 용어 (%)로 표현된 비-페길화 또는 페길화 단백질의 순도는 예를 들어 HPLC 크로마토그램과 같은 크로마토그램에서 피크에 대해 전형적으로 수득될 수 있는, 상대적인 "곡선 아래 영역" 값을 사용하여 측정될 수 있다. 순도를 측정하는 방법은 RP-HPLC 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함한다.
크로마토그래피
단백질의 "등전점" 또는 "pl"는 단백질의 순전하가 0인 pH이다. 즉, 단백질의 pI는 단백질이 동일한 양의 양전하 및 음전하를 갖는 pH이다. 임의의 주어진 단백질에 대한 pI의 측정은 등전 포커싱과 같은 잘 확립된 기술에 따라 수행될 수 있다. EPO의 pI는 4.0 내지 5.5 범위이다. pI를 측정하는 대안적인 방법은 약간 상이한 값을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 마이크로칩 등전 포커싱은 약 3.5 - 4.0의 명백한 pI를 제공한다 (Vlckova 2008). EPO의 정확한 pI는 예를 들어 글리코실화 및 시알산 잔기의 정도, 또는 전하 변이체의 존재에 의존할 수 있으며, 이는 이것이 생성된 수단 (예를 들어, 재조합 발현에 사용되는 숙주 세포)에 의존할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 순 표면 전하의 차이를 기초로 분자를 분리한다. 이는 단백질 분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 관심있는 단백질을 포함하는 혼합물은 이온 교환 물질을 통과할 수 있으며, 이는 전하를 운반한다. 이온 교환 물질이 음전하를 갖는 경우, 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC)로 나타내고, 양전하를 갖는 경우에는 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC)로 나타낸다. 관심있는 단백질은 단백질 및 이온 교환 물질 사이의 전하-기초 상호 작용을 조작함으로써 혼합물의 나머지로부터 분리될 수 있다. 이는 전형적으로 혼합물 및 또는 이온 교환 물질 위로 통과된 완충제의 이온 강도 또는 전도도를 조작함으로써 수행된다.
본원에서 사용된 용어 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 또는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC)를 나타낼 수 있다. 방법은 다중 IEC 단계를 포함하는 경우, 모든 AEC 단계이거나 또는 모든 CEC 단계이다. 마찬가지로 IEC 통과 용액 또는 IEC 물질에 대한 언급은 CEC 또는 AEC 통과 용액, 및 CEC 또는 AEC 물질을 나타낼 수 있다. 방법이 AEC 단계인 IEC 단계를 포함하는 경우, 모든 IEC 단계는 AEC 단계이고, IEC 물질은 AEC 물질이며, IEC 통과 용액은 AEC 통과 용액이고, 임의의 IEC 용리액은 AEC 용리액이다. 방법이 CEC 단계인 IEC 단계가 포함된 경우, IEC 단계는 CEC 단계이고, IEC 물질은 CEC 물질이며, IEC 통과 용액은 CEC 통과 용액이고, 임의의 IEC 용리액은 CEC 용리액이다.
예를 들어, 관심있는 단백질을 함유하는 혼합물은 이온 교환 물질 상에 로딩될 수 있다. 로딩 조건 (및 사용되는 경우, 세척 조건)은 혼합물의 특정 성분만 이온 교환 물질에 결합시키는 것을 촉진하도록 선택된다.
예를 들어, 로딩 조건은 이온 교환 물질에 대한 관심있는 단백질의 결합을 촉진할 수 있고, 이후 이온 교환 물질은 세척 완충액으로 세척되어, 혼합물의 원하지 않는 성분 (예를 들어, 오염물)을 제거하고 최종적으로 관심있는 단백질은 완충액의 이온 강도 (전도도)를 증가시킴으로써 용리 (이온 교환 물질로부터 제거)될 수 있다. 이러한 유형의 절차는, 관심있는 단백질이 이온 교환 물질에 결합된 후 용리되기 때문에 "결합 및 용리" 모드로 공지되어 있다. 용리 단계에서 매트릭스로부터 나오고 관심있는 단백질을 함유하는 용액은 용출액 또는 용리액으로 공지되어 있다.
대안적으로, 로딩 조건은 혼합물의 원하지 않는 성분 (예를 들어, 오염물)의 결합을 촉진할 수 있다. 이러한 모드에서, 관심있는 단백질은 이온 교환 물질의 매트릭스를 통해 유동할 수 있고 수집될 수 있다. 이러한 유형의 절차는 "통과" 모드로 공지되어 있다. 이온 교환 물질의 매트릭스를 통해 유동한 후에 수집된 조성물은 "통과" 또는 "통과 용액" 이다. 매트릭스로부터 나오고 관심있는 단백질을 함유하는 통과 용액은 또한 "유출액"으로도 나타낼 수 있다. 컬럼으로부터 관심있는 단백질을 용리하기 위해 전도도 및/또는 pH의 변화를 포함하는 "결합 및 용리" 모드와 달리, "통과" 모드는 등용매 조건 하에서 수행된다. 통과 용액은 분획으로 수집될 수 있으며, 이는 통과 풀을 제공하기 위해 풀링될 수 있다. EPO와 같은 단백질은 산성 및 염기성 잔기를 포함하는 아미노산을 포함한다. 낮은 pH (높은 H+ 농도)에서, 단백질의 카르복실산 기는 하전되지 않은 (-COOH) 경향이 있고 질소-함유한 염기성 기는 완전히 하전된 (-NH3 +) 대부분의 단백질에 순 양전하를 제공한다. 높은 pH에서 카르복실산 기는 음으로 하전되고 (-COO-) 염기성 기는 하전되지 않은 (-NH2) 경향이 있어, 대부분의 단백질에 순 음전하를 제공한다.
단백질의 등전점 (pI)은 양전하와 음전하가 균형을 이루기 때문에 단백질에 순 전하가 없는 pH 이다.
이온 교환 크로마토그래피는 순 표면 전하와 pH의 관계가 특정 단백질에 대해 고유하다는 사실을 이용한다. 등전점 미만의 pH에서 단백질은 전체 양전하를 가질 것이므로 음전하 물질 (즉, CEC 내)에 결합할 것이다. 등전점 초과의 pH에서 단백질은 전체 음전하를 가질 것이므로 양전하 물질 (즉, AEC 내)에 결합할 것이다.
이것이 AEC 단백질 혼합물 (로드 조성물) 및 상대적으로 높은 pH의 세척 완충액이 일반적으로 사용되는 이유인데, 이는 관심있는 단백질 (또는 오염물, 예를 들어 원치 않는 단백질)이 순 음전하를 가지므로 양전하 음이온 교환 물질에 결합하기 때문이다. 관심있는 단백질이 음이온 교환 물질에 결합될 때, 이는 오염물을 제거하기 위해 임의로 세척될 수 있고, 이후 용리될 수 있다. 오염물 (예: 원하지 않는 단백질)이 음이온 교환 물질에 결합되면 이는 혼합물에서 제거되어, 통과 용액에서 관심있는 하나 이상의 단백질을 정제한다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)는 이들의 표면 소수성의 상이함을 기초로 분자를 분리한다. 이는 단백질 분자를 분리하는데 사용될 수 있다. HIC에서 관심있는 단백질을 포함하는 혼합물은 HIC 물질을 통과할 수 있다. 단백질과 HIC 물질 간의 상호 작용은 특정 염의 존재에 의해 변경된다. 염 농도의 증가는 상호 작용을 증가시키고 염 농도의 감소는 상호 작용을 감소시킨다. 선택적 용리를 위해, 염 농도가 낮아질 수 있고 혼합물의 성분은 소수성 순서로 용리되며, 가장 소수성인 성분은 마지막으로 용리된다. HIC는 상기 이온 교환 크로마토그래피에 대해 기재된 바와 같이 통과 모드 또는 결합 및 용리 모드에서 수행될 수 있다.
본 맥락에서 음이온 교환 물질 또는 HIC 물질과 같은 크로마토그래피 "물질"은, 정지상 또는 고체상을 나타낸다. 이는 또한 수지 또는 매트릭스로 나타낼 수 있다. 이러한 맥락에서 "물질"은 관심있는 단백질과 같은 혼합물의 성분이 결합할 수 있는 매트릭스를 제공한다. 물질은 컬럼, 예를 들어 팽창된 베드 또는 충전된 베드 컬럼일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 물질은 개별 입자 또는 비드의 형태일 수 있다. 물질은 막 형태일 수 있다. 본 맥락에서 이동상은 정지상을 통해 유동하고 크로마토그래피에 의해 분리될 물질을 운반한다. 이동상은 제 1 또는 제 2 혼합물과 같은 혼합물, 또는 통과 용액과 같은 용액이다. 용리 완충액 또는 세척 완충액과 같은 완충액은, 또한 이동상이다.
본 맥락에서 용어 "로딩"은 혼합물 또는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 접촉시키는 단계를 나타낸다. 크로마토그래피 물질은 로딩 단계 전에 평형화될 수 있다.
평형화는 평형 완충액을 크로마토그래피 물질에 적용하는 것을 포함한다. 평형 완충액의 pH, 이온 강도, 전도도 및/또는 염 농도는 단백질 혼합물이 크로마토그래피 매트릭스 상에 로딩될 때 원하는 결합 및/또는 유동 또는 특이적 단백질 또는 오염물이 달성되도록 보장하기 위해 선택된다.
음이온 교환 물질 또는 양이온 교환 물질 또는 소수성 상호 작용 물질과 같은 크로마토그래피 물질로부터의 용리는, 구배 용리 또는 단계 용리를 사용하여 완충액의 이온 강도, pH, 전도도 또는 염 농도를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 구배 용리 또는 선형 구배 용리는, 개별의 관심있는 많은 성분이 물질에 결합될 때 사용될 수 있고 상이하게 용리될 수 있으며, 높은 해상도 분리를 위해 사용될 수 있다. 단계 용리는 크로마토그래피 물질로부터 단일 성분을 제거 (또는 특정 군의 성분을 함께 제거)하는데 유용하다. 단계 용리는 상대적으로 빠르고, 완충액을 덜 소비한다. 단계 용리는 크로마토그래피 물질로부터 관심있는 단백질을 상대적으로 농축된 형태로 용리시키기 위해 사용될 수 있다. 이온 강도의 상승 구배는 일반적으로 AEC 내 용리에서 사용된다. 염 농도의 하강 구배는 일반적으로 HIC 내 용리에서 사용된다.
모노-페길화 단백질 조성물의 생성
본 발명은 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법을 제공한다.
모노-페길화 단백질 조성물을 제공하기 위해 CEC를 사용하는 종래 기술의 방법과 비교하여, 본원에 개시된 방법은 보다 생산적이다. 모노-페길화 EPO의 생산을 위한 종래 기술의 방법은 WO 2009/010270에 기재되어 있다.
본 발명은 페길화 단백질 혼합물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: a) 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하기 위해 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시키는 단계로, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 단계; (b) 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공하기 위해, 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하는 단계; AEC 단계는 비-페길화 단백질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 반응 생성물의 혼합물을 AEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및 (c) 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하기 위해 단계 b)로부터 AEC 통과 용액을 수집하는 단계로, 여기서 비-페길화 단백질은 AEC 물질로부터 AEC 용리액을 용리시킴으로써 단계 b)에서 회수되고 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용되는 단계.
비-페길화 단백질과 페길화 시약을 반응시킴으로써 생성된 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물은 또한 본원에서 "제 1 혼합물"로 나타낼 수 있다. 이 방법에 의해 생성된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물은 또한 본원에서 "제 2 혼합물"로 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 약 90% 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: 상기에 기재된 방법에 의해 제조된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법에 적용하는 단계; 및 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 회수하는 단계, 여기서 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90%의 모노-페길화 단백질을 포함함.
본 발명은 적어도 약 90%의 모노-페길화 단백질을 포함하는 단백질 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: (a) 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 제 1 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함; (b) 제 1 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공하는 단계; AEC 단계는 비-페길화 단백질을 결합하기에 적합한 조건하에서 AEC 물질에 제 1 혼합물을 적용하는 것을 포함함; (c) 단계 b)로부터 AEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 제 2 혼합물을 제공하는 단계; 및 (d) 제 2 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분율이 제 2 혼합물에 비해 증가하는 단백질 조성물을 제공하는 단계, 여기서 단백질 조성물은 적어도 약 90% 모노-페길화 단백질을 포함함.
도 1 내지 도 3은 본 개시에 따른 방법의 구현예를 나타낸다.
반응 생성물의 혼합물 생성
본 발명의 방법은 반응 생성물의 혼합물을 제공하는 것을 포함한다 (단계 a). 본 발명의 방법은 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")을 사용하여 수행된다. 반응 생성물의 혼합물은 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하고, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함한다. 단백질은 EPO일 수 있다.
본 발명의 방법은 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")을 사용하여 수행되고, 여기서 올리고-페길화 단백질의 비율은 상대적으로 낮다. 반응 생성물의 혼합물은 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있고, 올리고-페길화 단백질은 올리고-페길화 EPO일 수 있다. 반응 생성물의 혼합물은 약 10% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 반응 생성물의 혼합물은 약 10% 미만의 올리고-페길화 EPO를 포함할 수 있다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 70% 의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 반응 생성물의 혼합물은 약 20-70%, 40-60%, 45-55% 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 적어도 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 70% 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 반응 생성물의 혼합물은 약 30-70%, 40-60%, 또는 45-55% 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 (A) 40-60% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 40-60% 범위의 모노-페길화 단백질 및 (C) 1-10% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다. 반응 생성물의 혼합물은 (A) 45-55% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 45-55% 범위의 모노-페길화 단백질, 및 (C) 1-5% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 (A) 비-페길화 단백질 및 (B) 모노-페길화 단백질 및 (C) 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 A:B:C의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 A는 약 40-60이고, B는 약 30-50이며, C는 약 1-10이거나; 또는 여기서 A는 약 45-55이고, B는 약 35-45이며, C는 약 1-10이거나; 또는 여기서 A는 약 35-55이고, B는 약 35-45이며, C는 약 1-25이다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 (A+B):C의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 (A+B):C는 약 19:1; 약 9:1 또는 약 9-19:1이다.
비율은 중량 또는 질량비일 수 있다. 비율은 몰비일 수 있다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 페길화 반응을 수행함으로써 제공된다. 페길화 반응을 수행하는 것은 단백질 (비-페길화 단백질일 수 있음)을 페길화 시약과 반응시키는 것을 포함한다. 단백질은 EPO일 수 있다. 페길화 반응은 EPO의 페길화와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 페길화 반응은 약 7.0 내지 9.0의 pH에서 수행될 수 있으며, 여기서 PEG/단백질 몰비는 약 0.6 - 1.0이다.
페길화 반응은 약 7.0 내지 9.0, 또는 약 7.5 내지 8.5 또는 약 8.0의 pH에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 (NHS) 활성화 된 PEG 시약을 사용하여 약 7.0 내지 9.0, 또는 약 7.5 내지 8.5 또는 약 8.0의 pH에서 수행될 수 있다. 페길화 반응이 수행되는 pH는 사용된 PEG 시약에 의존할 수 있다. PEG 시약은 mPEG-NHS, mPEG-SPA, mPEG-SVA 또는 mPEG-CI일 수 있다. 페길화 반응 속도와 pH의 관계는 Pfister 2016에서 검토된다. 페길화 반응을 위한 다른 시약은 당업계에 공지되어 있다.
페길화 반응에서 PEG/단백질의 몰비는 ≤1.0일 수 있다. 페길화 반응에서 PEG/단백질의 몰비는 약 0.8일 수 있다. PEG/단백질 몰비는 약 0.25 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.4 내지 1.0, 0.5 내지 1.0, 0.6 내지 1.0 또는 0.7 내지 1.0일 수 있다. PEG/단백질 몰비는 약 0.25 내지 1.2, 0.3 내지 1.2, 0.4 내지 1.2, 0.5 내지 1.2, 0.6 내지 1.2 또는 0.7 내지 1.2일 수 있다. PEG/단백질 몰비는 약 0.25 내지 1.5, 0.3 내지 1.5, 0.4 내지 1.5, 0.5 내지 1.5, 0.6 내지 1.5 또는 0.7 내지 1.5일 수 있다. PEG/단백질 몰비는 약 0.4, 0.5, 0.6 또는 0.7의 하한을 가질 수 있고 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5의 상한을 가질 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
제 1 혼합물은 이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계 (단계 b)에 적용된다. 이는 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가되는 IEC 통과 용액을 제공한다. 이는 비-페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 감소되는 IEC 통과 용액을 제공한다. IEC 단계는 AEC 단계 또는 CEC 단계일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계 (단계 b)에 적용될 수 있다. 이는 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공한다. 이는 비-페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 감소되는 AEC 통과 용액을 제공한다.
본 개시의 맥락에서, 증가된 분획은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 양만큼 증가될 수 있다. 증가된 분획은 적어도 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 5 배 또는 10 배 증가될 수 있다.
본 개시의 맥락에서, 감소된 분획은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 양만큼 감소될 수 있다. 감소된 분획은 적어도 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 5 배 또는 10 배 증가될 수 있다.
AEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 물질과 접촉시키거나, 또는 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 물질에 적용하는 것을 포함한다. AEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 물질을 포함하는 컬럼 상에 로딩하는 단계를 포함할 수 있다. 음이온 교환 물질은 페길화 EPO와 같은 페길화 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는다. 즉, AEC 물질은 모노-페길화 조성물이 원하는 단백질 종의 페길화 버전에 대한 상대적으로 낮은 결합 능력을 갖는다. 비-페길화 단백질과 음이온 교환 물질의 결합에 적합한 AEC 조건이 사용된다. 음이온 교환 물질을 통과하는 용액은 AEC 통과 용액이다. 페길화 단백질에 대한 음이온 교환 물질의 낮은 결합 능력은 대부분의 페길화 단백질이 음이온 교환 물질을 통과하므로 AEC 통과 용액에 존재하는 효과를 갖는다. 비-페길화 단백질의 음이온 교환 물질에 결합하기에 적합한 결합 조건은 비-페길화 단백질의 대부분이 제거되고 (음이온 교환 물질에 결합함으로써), 통과 용액에 존재하지 않는 효과를 갖는다.
AEC 물질은 페길화 단백질에 유의하게 결합하지 않는 물질일 수 있다. 이는 AEC 물질이 이에 적용되는 페길화 단백질의 약 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.01% 미만에 결합한다는 것을 의미할 수 있다. 음이온 교환 물질에 페길화 단백질의 결합은 또한 음이온 교환 물질에 다량의 비-페길화 단백질을 적용함으로써 감소될 수 있다. 이러한 방식으로, 결합된 페길화 단백질은 비-페길화 단백질에 의해 변위된다. 음이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 음이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110% 또는 120% 일 수 있다. 음이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 음이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량의 약 70-110%, 약 80-100%, 또는 약 85-95%의 범위일 수 있다. 음이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 음이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량의 약 80-95%의 범위일 수 있다.
AEC 통과 용액은 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함한다. AEC 통과 용액은 또한 비-페길화 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 비-페길화 페길화 단백질의 비율은 상대적으로 낮거나 0에 가깝다. AEC 통과 용액은 0의 비-페길화 단백질 또는 검출의 한계 미만인 양의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 단백질은 EPO일 수 있다. 통과 용액은 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.0%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 2% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 2% 미만의 비-페길화 EPO를 포함할 수 있다.
AEC 통과 용액은 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 약 99.9%의 페길화 단백질을 포함할 수 있다.
AEC 통과는 약 80% 모노-페길화 단백질 및 약 20% 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액은 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 60-90%, 70-90% 또는 75-85%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다. AEC 통과 용액은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 10-40%, 10-30%, 또는 15-25%의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
AEC 통과 용액은 (A) 0.1-5% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 60-90% 범위의 모노-페길화 단백질 및 (C) 10-40% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다. 통과 용액은 (A) 0.1-1.5% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 75-85% 범위의 모노-페길화 단백질 및 (C) 15-25% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함하고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다.
AEC 통과 용액은 (A) 비-페길화 단백질 및 (B) 모노-페길화 단백질 및 (C) 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 A : B : C의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 A는 약 1-5이고, B는 약 10-20이며, C는 약 5-15이거나; 또는 여기서 A는 약 1-3이고, B는 약 25-35이고, C는 약 5-10이다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 A:(B+C)의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 A:(B+C)는 약 1:25; 1:50; 1:100; 약 1:150, 약 1:200 또는 약 1:100-200이다. 비율은 중량 또는 질량비일 수 있다. 비율은 몰비일 수 있다.
AEC 단계는 비-페길화 단백질이 AEC 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 수행된다. 비-페길화 단백질 결합에 적합한 조건은 하나 이상의 AEC 물질, 또는 평형 완충액의 pH, 전도도, 염 함량 또는 완충 함량을 스크리닝함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.
이온 교환 물질의 관능기는 이의 전하를 측정한다. 이러한 맥락에서 용어 "강한" 및 "약한"은 관능기의 이온화 상태가 다양한 pH에 따라 변하는 정도를 나타낸다. 강한 이온 교환기는 pH 변화에 따른 이온 교환 용량의 변화가 거의 또는 전혀 없음을 나타낸다. 강한 이온 교환기는 넓은 pH 범위에서 완전히 충전된 상태를 유지한다. 약한 이온 교환기는 pH-의존적 관능을 나타내며 더 좁은 pH 범위에서 최적의 성능을 전달한다.
강한 음이온 교환 물질은 4차 암모늄기 (Q) 또는 4차 아미노 에틸기 (QAE)를 포함할 수 있다. 약한 음이온 교환 물질은 디에틸아미노에틸 잔기 (DEAE)를 포함할 수 있다. 강한 음이온 교환 물질을 사용하는 이점은 전하 손실이 없기 때문에 결합 능력이 높거나 낮은 pH로 유지된다는 것이다.
AEC 물질은 양전하 리간드 또는 관능기, 즉 염기성 리간드 또는 관능기로 관능화된 수지를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 음이온 교환 물질은 강한 음이온 교환 물질일 수 있다. 음이온 교환 물질은 바람직하게는 강한 음이온 교환 물질이다. 이는 4차 암모늄기 (Q)를 가질 수 있다. 이는 Q기로 관능화된 하이드록실화된 폴리메타크릴 중합체 비드일 수 있다. 이는 50-150 nm, 70-120 nm, 70-100 nm 또는 90-110 nm 공극 크기를 가질 수 있다. 본원에서 공극 크기는 평균 공극 크기를 나타낼 수 있다. 이는 40-150 μm, 40-120 μm, 40-100 μm, 40-80 μm 또는 약 60, 65, 70, 80 또는 90, 100 μm의 입자 크기를 가질 수 있다. 입자 크기 (또는 비드 크기)는 평균 입자 크기를 나타낼 수 있다. 이는 70-100 nm의 공극 크기와 35-100 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 100 nm의 공극 크기와 65 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 Toyopearl Super Q 650M (Tosoh Bioscience LLC; 제품 번호 43205)일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 음이온 교환 물질은 제조사의 지시에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 음이온 교환 물질은 약한 음이온 교환 물질일 수 있다. 이는 3차 및/또는 2차 아민 관능기를 가질 수 있다. 이는 1차 아민 관능기를 갖지 않을 수 있다. 이는 1종의 아민기를 가질 수도 있고, 2종 이상의 아민기를 가질 수도 있다.
음이온 교환 물질은 컬럼, 예를 들어 팽창된 베드 또는 충전된 베드 컬럼일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 음이온 교환 물질은 연속 역류 접선 크로마토그래피 시스템일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 음이온 교환 물질은 개별 입자 또는 비드 형태일 수 있다. 음이온 교환 물질은 막 형태일 수 있다. 음이온 교환 물질은 관능화된 필터, 또는 관능화된 섬유, 양털 또는 메쉬 형태일 수 있다. 음이온 교환 물질은 관능기를 가질 수 있거나 음이온 교환 특성을 나타내는 임의의 다른 고체 지지체 형태일 수 있다.
음이온 교환기의 예로는 Toyopearl Super Q 650C, Toyopearl Super Q 650S, Toyopearl GigaCap Q 650M, GigaCap Q 650S, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl DEAE 650S, Toyopearl DEAE 650M 및 Toyopearl DEAE 650C, Toyopearl Super Q 650, Toyopearl Super Q 650 QAE, Toyopearl Super Q 550C, Macroprep High Q, Fractoprep TMAE, Q Hyper DF, Capto Q, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose BB, Q-Sepharose XL, Q-Sepharose HP, MiniQ, MonoQ, MonoP, DEAE Sepharose FF, Source SQ, Source 30Q, ANX Sepharose 4 FF (high sub), Streamline DEAE, Streamline QXL, Poros HQ, Poros PI, Poros D, DEAEHyperD, Q Ceramic Hyper D, Fractogel DMAE를 포함한다.
본 발명의 방법에서 AEC 물질은 페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 음이온 교환 물질일 수 있다. 특히, 이는 페길화 EPO에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 음이온 교환 물질일 수 있다. 음이온 교환 물질은 페길화 EPO에 대한 낮은 결합 능력, 예를 들어 약 0.5 g/L, 0.05 g/L, 0.01 g/L 또는 0.001 g/L 미만, 또는 0 g/L에 근접한 결합 능력을 갖는 Toyopearl Super Q 650 M일 수 있다. 음이온 교환 물질은 pH 8.0에서 25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4로 평형화된 Toyopearl Super Q 650 M과 실질적으로 동일한 페길화 EPO 에 대한 결합 능력을 갖는 음이온 교환 물질일 수 있다.
AEC 물질은 20-50 g/L, 30-40 g/L, 또는 약 35 g/L 의 비-페길화 단백질, 예 를 들어 비-페길화 EPO에 대한 상대적으로 높은 결합 능력을 가질 수 있다. AEC 물질은 비-페길화 단백질, 예를 들어 비-페길화 EPO에 대한 적어도 약 35 g/L의 결합 능력을 가질 수 있다.
음이온 교환 물질은 반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")이 이에 적용되기 전에 평형화될 수 있다. AEC 평형 완충액은 Na2SO4 및/또는 비신과 같은 염을 포함할 수 있다. AEC 평형 완충액은 인산염을 포함할 수 있다. AEC 평형 완충액은 1차 아민기를 갖는 화합물, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)를 포함하지 않을 수 있다. AEC 평형 완충액은 약 6.5 내지 9.5, 7.0 내지 9.0, 7.5 내지 8.5 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. AEC 평형 완충액은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. AEC 평형 완충액은 약 1-20 mM, 1-10 mM, 2.5-10 mM, 5-10 mM 염 또는 약 7.5 mM 염을 포함할 수 있다. AEC에 사용하기 위한 평형 완충액은 약 25 mM 비신, 약 7.5 mM Na2SO4, pH 8.0를 포함할 수 있다. 평형 완충액은 약 1 내지 약 8mS/cm, 약 1 내지 약 5mS/cm, 약 1.5 내지 약 3.0mS/cm, 약 2.0 내지 약 3.0mS/cm, 또는 약 1.0 내지 3.0mS/cm의 전도도를 가질 수 있다. 반응 생성물의 혼합물이 평형 완충액의 전도도 범위 밖의 전도도를 갖는 경우, 이후 평형 완충액의 전도도 범위 내에 있는, 또는 평형 완충액의 0.5 mS/cm 또는 0.05 mS/cm 내에 있는 전도도를 갖는 반응 생성물의 혼합물을 제공하도록 (예를 들어 염 및/또는 완충액의 첨가에 의해) 조절될 수 있다.
비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물")은 pH, 완충액 및 평형 완충액에 대해 상기에 설정된 염가를 갖는 반응 생성물의 혼합물을 제공하도록 조절될 수 있다. 조절된 반응 생성물의 혼합물은 또한 AEC 로드 조성물 또는 로드 용액으로 나타낼 수 있다. AEC 로드 용액은 약 10 - 30 mM 비신, 약 5.0 - 10.0 mM Na2SO4, pH 7.0 - 9.0의 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질의 수용액일 수 있다. AEC 로드 용액은 약 25mM 비신, 약 7.5mM Na2SO4, pH 8.0의 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질의 수용액일 수 있다.
AEC 단계는 단백질의 pI보다 적어도 1.0 내지 2.0 pH 단위 초과의 pH에서 수행될 수 있다. 많은 단백질이 5.5 내지 7.5 범위의 pI를 가지므로 본 발명의 방법은 모노-페길화 단백질의 제조에 사용될 수 있으며 여기서 AEC 단계는 약 6.5 내지 9.5, 또는 6.5 내지 8.5, 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 수행된다.
EPO의 pI는 4.0 내지 5.5 범위이다. 단백질이 EPO인 방법은 단백질의 pI보다 적어도 2.0, 2.5 또는 3.0 pH 단위 초과로 수행될 수 있다. 이는 AEC 물질에 효율적인 EPO 결합을 가능하게 한다. 모노-페길화 EPO 조성물의 제조 방법은 적어도 약 7.0의 pH, 또는 약 pH 7.0 내지 10.0, 또는 pH 7.0 내지 9.0에서 수행되는 AEC 단계를 포함할 수 있다. pH는 약 7.5 내지 8.5, 또는 약 7.8 내지 8.2, 또는 약 8.0 일 수 있다.
AEC 단계는 약 1.0 - 3.0 mS/cm, 1.5 - 2.5 mS/cm 또는 약 2.2 mS/cm의 전도도로 수행될 수 있다. AEC 단계의 전도도는 AEC 평형 완충액 또는 AEC 세척 완충액에서 NaCl 또는 Na2SO4 와 같은 염의 농도를 조정함으로써 조정될 수 있다. AEC 단계는 약 5.0 - 15 mM, 5.0 - 10 mM 또는 약 7.5 mM의 Na2SO4 농도에서 수행될 수 있다. AEC 단계는 Na2SO4에 대해 여기에 언급된 것과 동등한 이온 강도를 제공하는 농도로 다른 염을 사용하여 수행될 수 있다.
반응 생성물의 혼합물 (또는 "제 1 혼합물"), 또는 AEC 로드 용액은 AEC 물질에 적용된 후, AEC 물질이 세척될 수 있다. AEC 물질은 평형 완충액으로 세척될 수 있다. AEC 물질은 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 세척 완충액은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. 세척 완충액은 약 1-20 mM, 1-10 mM, 2.5-10 mM, 5-10 mM 염 또는 약 7.5 mM 염을 포함할 수 있다. 이는 약 25 mM 비신, 약 7.5 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. 세척 완충액은 약 1 내지 약 8mS/cm, 약 1 내지 약 5mS/cm, 약 1.5 내지 약 3.0mS/cm, 약 2.0 내지 약 3.0mS/cm의 전도도를 가질 수 있다. AEC 물질은 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 약 1, 2, 3, 4 또는 5 컬럼 부피의 평형 완충액 또는 세척 완충액으로 세척될 수 있다. AEC 물질은 통과 용액의 단백질 함량을 모니터링하고 (예를 들어 UV 분광 분석법에 의해) 단백질 함량이 임계값 미만이 되면 (예를 들어 UV 신호가 기준선으로 되돌아올 때) 세척 방법을 정지시킴으로써 측정되는 부피의 평형 완충액 또는 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 통과 용액 또는 유출액은 분획으로 수집될 수 있으며, 이들 통과 분획의 일부 또는 전부가 풀링될 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법은 모노-페길화 EPO의 제조에 특히 바람직하며, 이는 EPO가 상대적으로 안정한, 상대적으로 높은 pH 조건의 사용을 허용하기 때문이다.
본 발명의 방법은 AEC 단계를 포함할 수 있고 여기서 AEC 물질은 Toyopearl Super Q 650 M이고; AEC 단계는 약 7.0 내지 9.0의 pH에서 수행되고; AEC 단계는 약 1.0 내지 3.0 mS/cm의 전도도에서 수행되며; 제 1 혼합물은 약 10 - 30 mM 비신 및 약 1 - 10 mM Na2SO4을 포함하는 AEC 로드 용액으로서 AEC 물질에 적용된다. 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피
IEC 단계는 CEC 단계일 수 있다. 제 1 혼합물은 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 단계 (단계 b)에 적용될 수 있다. 이는 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가되는 CEC 통과 용액을 제공한다. 이는 비-페길화 단백질의 분회이 제 1 혼합물에 비해 감소되는 CEC 통과 용액을 제공한다.
본 개시의 맥락에서, 증가된 분획은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 양만큼 증가될 수 있다. 증가된 분획은 적어도 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 5 배 또는 10 배 증가될 수 있다.
본 개시의 맥락에서, 감소된 분획은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 양만큼 감소될 수 있다. 감소된 분획은 적어도 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 5 배 또는 10 배 증가될 수 있다.
CEC 단계는 제 1 혼합물을 양이온 교환 물질과 접촉시키거나, 또는 제 1 혼합물을 양이온 교환 물질에 적용하는 것을 포함한다. CEC 단계는 양이온 교환 물질을 포함하는 컬럼 상에 제 1 혼합물을 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 양이온 교환 물질은 페길화 EPO와 같은 페길화 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는다. 즉, CEC 물질은 모노-페길화 조성물이 원하는 단백질 종의 페길화 버전에 대해 상대적으로 낮은 결합 능력을 갖는다. 비-페길화 단백질과 양이온 교환 물질의 결합에 적합한 CEC 조건이 사용된다. 양이온 교환 물질을 통과하는 용액은 CEC 통과 용액이다. 페길화 단백질에 대한 양이온 교환 물질의 낮은 결합 능력은 대부분의 페길화 단백질이 양이온 교환 물질을 통과하므로 CEC 통과 용액에 존재하는 효과를 갖는다. 비-페길화 단백질의 양이온 교환 물질로의 결합에 적합한 결합 조건은 비-페길화 단백질의 대부분이 (양이온 교환 물질에 결합함으로써) 제거되고 통과 용액에 존재하지 않는 효과를 갖는다.
CEC 물질은 페길화 단백질에 유의하게 결합하지 않는 물질일 수 있다. 이는 CEC 물질이 이에 적용되는 페길화 단백질의 약 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.01% 미만에 결합한다는 것을 의미할 수 있다. 양이온 교환 물질에 페길화 단백질의 결합은 또한 양이온 교환 물질에 다량의 비-페길화 단백질을 적용함으로써 감소될 수 있다. 이러한 방식으로, 결합된 페길화 단백질은 비-페길화 단백질에 의해 변위된다. 양이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110% 또는 120%의 양이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량일 수 있다. 양이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 양이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량의 약 70-110%, 약 80-100%, 또는 약 85-95%의 범위일 수 있다. 양이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 양이온 교환 물질의 동적 브레이크스루 용량의 약 80-95%의 범위일 수 있다.
CEC 통과 용액은 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함한다. CEC 통과 용액은 또한 비-페길화 단백질을 포함할 수 있으며, 비-페길화 단백질의 비율은 상대적으로 낮거나 0에 가깝다. CEC 통과 용액은 0의 비-페길화 단백질 또는 검출 한계 미만의 양인 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 단백질은 EPO일 수 있다. 통과 용액은 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.0%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 2% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 2% 미만의 비-페길화 EPO를 포함할 수 있다.
CEC 통과 용액은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 약 99.9%의 페길화 단백질을 포함할 수 있다.
CEC 통과는 약 80%의 모노-페길화 단백질 및 약 20%의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. CEC 통과 용액은 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 60-90%, 70-90% 또는 75-85%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다. CEC 통과 용액은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 통과 용액은 약 10-40%, 10-30%, 또는 15-25%의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
CEC 통과 용액은 (A) 0.1-5% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 60-90% 범위의 모노-페길화 단백질 및 (C) 10-40% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다. 통과 용액은 (A) 0.1-1.5% 범위의 비-페길화 단백질 및 (B) 75-85% 범위의 모노-페길화 단백질 및 (C) 15-25% 범위의 올리고-페길화 단백질을 포함하고, 여기서 (A), (B) 및 (C)의 총합은 100% 이다.
CEC 통과 용액은 (A) 비-페길화 단백질 및 (B) 모노-페길화 단백질 및 (C) 올리고-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 A : B : C의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 A는 약 1-5이고, B는 약 10-20이며, C는 약 5-15이거나; 또는 여기서 A는 약 1-3이고, B는 약 25-35이고, C는 약 5-10이다. 비-페길화 단백질, 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질은 A:(B+C)의 비로 존재할 수 있으며, 여기서 A:(B+C)는 약 1:25; 1:50; 1:100; 약 1:150, 약 1:200 또는 약 1:100-200이다. 비율은 중량 또는 질량비일 수 있다. 비율은 몰비일 수 있다.
CEC 단계는 비-페길화 단백질이 CEC 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 수행된다. 비-페길화 단백질 결합에 적합한 조건은 하나 이상의 CEC 물질, 또는 평형 완충액의 pH, 전도도, 염 함량 또는 완충 함량을 스크리닝함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.
이온 교환 물질의 관능기는 이의 전하를 측정한다. 이러한 맥락에서 용어 "강한" 및 "약한"은 관능기의 이온화 상태가 다양한 pH에 따라 변하는 정도를 나타낸다. 강한 이온 교환기는 pH 변화에 따른 이온 교환 용량의 변화가 거의 또는 전혀 없음을 나타낸다. 강한 이온 교환기는 넓은 pH 범위에서 완전히 충전된 상태를 유지한다. 약한 이온 교환기는 pH-의존적 관능을 나타내며 더 좁은 pH 범위에서 최적의 성능을 전달한다.
강한 양이온 교환 물질은 설폰산기를 포함할 수 있다. 약한 양이온 교환 물질은 카르복실산 또는 포스폰산 관능기를 포함할 수 있다. 강한 양이온 교환 물질을 사용하는 이점은 전하 손실이 없기 때문에 결합 능력이 높거나 낮은 pH로 유지된다는 것이다.
CEC 물질은 음전하 리간드 또는 관능기, 즉 산성 리간드 또는 관능기로 관능화된 수지를 포함할 수 있다.
CEC 물질은 POROS HS 물질, Fractogel S 물질, Fractogel EMD SO3-(S), Fractogel EMD SO3-(M), Fractogel SMD SE HiCap (M), Fractogel EMD COO- (M) 및 Capto S 물질을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 양이온 교환 물질은 강한 양이온 교환 물질일 수 있다. 이는 50-150 nm, 70-120 nm, 70-100 nm 또는 90-110 nm 공극 크기를 가질 수 있다. 본원에서 공극 크기는 평균 공극 크기를 나타낼 수 있다. 이는 40-150 μm, 40-120 μm, 40-100 μm, 40-80 μm 또는 약 60, 65, 70, 80 또는 90, 100 μm의 입자 크기를 가질 수 있다. 입자 크기 (또는 비드 크기)는 평균 입자 크기를 나타낼 수 있다. 이는 70-100 nm의 공극 크기와 35-100 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 100 nm의 공극 크기와 65 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 SP Toyopearl 650 M일 수 있다.
양이온 교환 물질은 컬럼, 예를 들어 팽창된 베드 또는 충전된 베드 컬럼일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 양이온 교환 물질은 연속 역류 접선 크로마토그래피 시스템일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 양이온 교환 물질은 개별 입자 또는 비드 형태일 수 있다. 양이온 교환 물질은 막 형태일 수 있다. 양이온 교환 물질은 관능화된 필터 또는 관능화된 섬유, 양털 또는 메쉬 형태일 수 있다. 음이온 교환 물질은 관능기를 가질 수 있거나 음이온 교환 특성을 나타내는 임의의 다른 고체 지지체 형태일 수 있다.
본 발명의 방법에서 CEC 물질은 페길화 형태의 단백질에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 양이온 교환 물질일 수 있다. 특히, 이는 페길화 EPO에 대한 낮은 결합 능력을 갖는 양이온 교환 물질일 수 있다. 양이온 교환 물질은 페길화 EPO에 대한 낮은 결합 능력, 예를 들어 약 0.5 g/L, 0.05 g/L, 0.01 g/L 또는 0.001 g/L 미만, 또는 0 g/L에 근접한 결합 능력을 갖는 SP Toyopearl 650 M일 수 있다.
CEC 물질은 비-페길화 단백질에 대한 상대적으로 높은 결합 능력, 예를 들어 비-페길화 EPO의 20-50 g/L, 30-40 g/L, 또는 약 35 g/L를 가질 수 있다. CEC 물질은 비-페길화 단백질, 예를 들어 비-페길화 EPO에 대한 적어도 약 35 g/L의 결합 능력을 가질 수 있다.
모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물의 제공
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 반응 생성물의 혼합물 ("제 1 혼합물")을 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계 (단계 b)에 적용하는 것을 포함한다. 이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 통과 용액은 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")을 제공하는데 사용된다 (단계 c). 예를 들어, 페길화 단백질 혼합물은 하나 이상의 IEC 단계로부터 수집된 통과를 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 페길화 단백질 혼합물의 배치를 HIC 장치 (예를 들어, HIC 컬럼)에 제공하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 인-라인 연결을 통해 HIC 장치 (예를 들어, HIC 컬럼)에 통과를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")을 제공하는 단계 (단계 c)는 IEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함한다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 2, 3, 4 또는 5 개의 IEC 단계, 또는 3 개 이상의 IEC 단계로부터 통과 용액을 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 제 2 혼합물을 컨디셔닝하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 모노-페길화 단백질을 그 안에 함유된 올리고-페길화 단백질로부터 분리하기 위한 개선된 적합성을 갖는 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물을 제공할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 HIC에 의해 함유된 올리고-페길화 단백질로부터 모노-페길화 단백질의 분리에 대한 개선된 적합성을 갖는 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물을 제공할 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 HIC 로드 조성물 또는 로드 용액으로 나타낼 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 염의 첨가 및/또는 비신의 첨가를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 반응 생성물의 혼합물 ("제 1 혼합물")을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계 (단계 b)에 적용하는 것을 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 통과는 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")을 제공하는데 사용된다 (단계 c). 예를 들어, 페길화 단백질 혼합물은 하나 이상의 AEC 단계로부터 수집된 통과를 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 페길화 단백질 혼합물의 배치를 HIC 장치 (예를 들어, HIC 컬럼)에 제공하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 인-라인 연결을 통해 HIC 장치 (예를 들어, HIC 컬럼)에 통과를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")을 제공하는 단계 (단계 c)는 AEC 단계로부터 통과 용액을 수집하는 것을 포함한다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 2, 3, 4 또는 5 개의 AEC 단계, 또는 3 개 이상의 AEC 단계로부터 통과 용액을 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계는 제 2 혼합물을 컨디셔닝하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 모노-페길화 단백질을 그 안에 함유된 올리고-페길화 단백질로부터 분리하기 위한 개선된 적합성을 갖는 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물을 제공할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 HIC에 의해 함유된 올리고-페길화 단백질로부터 모노-페길화 단백질의 분리에 대한 개선된 적합성을 갖는 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물을 제공할 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 HIC 로드 조성물 또는 로드 용액으로 나타낼 수 있다. 페길화 단백질 혼합물을 컨디셔닝하는 것은 염의 첨가 및/또는 비신의 첨가를 포함할 수 있다.
미반응 단백질의 재순환
방법은 반응 생성물의 혼합물을 제공하기 위해 페길화 반응을 수행하는 것을 포함한다. 비-페길화 (미반응) 단백질은 후속 페길화 반응에 이를 포함시킴으로써 재순환된다. 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 회수된다. 용리된 비-페길화 단백질은 이후 후속 페길화 반응에 사용된다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용될 수 있다.
방법은 단계 a), b) 및 c)의 2 개 이상의 사이클을 수행하는 것을 포함할 수 있으며, 비-페길화 단백질은 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 단계 b)에서 회수된다. 용리된 비-페길화 단백질은 이후 후속 페길화 반응에 사용된다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용될 수 있다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 사용될 수 있다. 즉, 이전 사이클의 비-페길화 단백질이 그 추가 사이클의 페길화 반응에 사용되는 단계 a), b) 및 c)의 추가의 사이클이 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후 후속 페길화 반응 (단계 a) 페길화 반응일 수 있음) 및 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되고 비-페길화 단백질의 회수를 허용하는 용액을 제공하는 가공 단계로 이어질 수 있다. 즉, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후, 단계 b) IEC 단계와 상이하지만 유사한 효과를 갖는 페길화 반응 및 가공 단계가 이어지거나 교대로 이루어질 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에서 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 단계 a), b) 및 c)의 후속 사이클에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 방법은 페길화 반응을 수행하여 반응 생성물의 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. 비-페길화 (미반응) 단백질은 후속 페길화 반응에 이를 포함시킴으로써 재순환된다. 비-페길화 단백질은 단계 b)에서 AEC 용리액을 AEC 물질로부터 용리시킴으로써 회수된다. 용리된 비-페길화 단백질은 이후 후속 페길화 반응에 사용된다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용될 수 있다.
방법은 단계 a), b) 및 c)의 2 개 이상의 사이클을 수행하는 것을 포함할 수 있으며, 비-페길화 단백질은 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 단계 b)에서 회수된다. 용리된 비-페길화 단백질은 이후 후속 페길화 반응에 사용된다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용될 수 있다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 사용될 수 있다. 즉, 이전 사이클의 비-페길화 단백질이 그 추가 사이클의 페길화 반응에 사용되는 단계 a), b) 및 c)의 추가의 사이클이 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후 후속 페길화 반응 (단계 a) 페길화 반응일 수 있음) 및 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되고 비-페길화 단백질의 회수를 허용하는 용액을 제공하는 가공 단계로 이어질 수 있다. 즉, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후, 단계 b) IEC 단계와 상이하지만 유사한 효과를 갖는 페길화 반응 및 가공 단계가 이어지거나 교대로 이루어질 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에서 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 단계 a), b) 및 c)의 후속 사이클에서 사용될 수 있다.
페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되고 비-페길화 단백질의 회수가 가능한 용액을 제공하기에 적합한 다양한 가공 단계가 존재하며 당업자에게 공지될 것이다. 이들은 예를 들어, 크로마토그래피 방법 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 포함한다.
본원에 사용된 "사이클"은 단계 a), b) 및 c)의 전체 사이클을 나타낸다.
방법은 3, 4 또는 5 사이클을 포함할 수 있으며, 여기서 각 사이클의 단계 b)는 IEC 용리액을 제공하기 위해 IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것을 포함하고, 여기서 단계 b)에서 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용된다. 단계 b)에서 용리된 비-페길화 단백질은 후속 사이클에서 단계 a)의 페길화 반응에 첨가될 수 있다.
방법은 후속 페길화 반응에 사용되기 전에 단계 b)에서 회수된 비-페길화 단백질을 다수의 IEC 단계로부터 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용되기 전에 단계 b)에서 회수된 비-페길화 단백질을 다수의 IEC 단계로부터 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 2, 3, 4 또는 5 단계 b) IEC 단계, 또는 5 단계 이상 b) IEC 단계로부터 회수된 비-페길화 단백질을 풀링하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 단계 b) IEC 용리액을 후속 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 사이클의 단계 b)로부터의 IEC 용리액을 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 제 1 사이클의 단계 b)로부터의 IEC 용리액을 제 2 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 직접 첨가하는 것은 용리액에서 비-페길화 단백질을 정제 또는 세척하는 (예를 들어, 정용 여과 또는 한외 여과에 의한) 개입 단계가 없다는 것을 의미한다. 오히려, 비-페길화 단백질을 함유하는 IEC 물질로부터의 용리액은 후속 페길화 반응에 첨가된다.
후속 페길화 반응에 사용되는 비-페길화 단백질에는 새로운 단백질이 보충될 수 있다. 방법은 IEC 물질로부터 회수된 비-페길화 단백질에 더하여 새로운 단백질을 페길화 반응에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 비-페길화 단백질의 재순환의 단계는 IEC 물질로부터 회수된 비-페길화 단백질을 후속 페길화 반응에 첨가하는 것을 포함하고, 이는 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 실질적으로 일정하도록 페길화 반응에 새로운 단백질을 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 실질적으로 일정한 것은 제 2 및 후속 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 제 1 페길화 반응에서의 것과 실질적으로 동일하다는 것을 의미할 수 있다. 이는 제 2 및 후속 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 제 1 사이클의 페길화 반응에서와 실질적으로 동일함을 의미할 수 있다. 실질적으로 동일함은 평균 ± 10%를 의미할 수 있다. 신선한 단백질은 이전에 페길화 반응에 적용받지 않은 단백질을 나타낸다.
방법은 단계 a), b) 및 c)의 사이클을 포함할 수 있어서, 제 1 및 제 2 사이클이 수행되고 제 2 사이클은 최종 사이클이 된다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 제 1, 제 2 및 제3 사이클이 수행되고 제3 사이클이 최종 사이클이 되도록 단계 a), b) 및 c)의 2 개의 추가 사이클을 포함할 수 있다. 방법은 단계 a), b) 및 c)의 2 개 이상의 추가 사이클을 포함할 수 있다. 방법은 단계 a), b) 및 c)의 총 1, 2, 3, 4 또는 5 사이클을 포함할 수 있다.
최종 사이클은 PEG/단백질 몰비가 약 1.4 내지 1 내지 약 2 내지 1인 페길화 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. PEG/단백질의 몰비는 약 1.4 내지 1.0, 1.5 내지 1.0, 1.6 내지 1.0, 1.7 내지 1.0, 1.8 내지 1.0, 1.9 내지 1.0, 2.0 내지 1.0, 2.1 내지 1.0, 2.2 내지 1.0, 2.3 내지 1.0, 2.4 내지 1.0 또는 2.5 내지 1.0일 수 있다. 상대적으로 높은 PEG/단백질 비율이 최종 사이클에서 유리할 수 있다. 최종 사이클 후, 미반응 (비-페길화) 단백질의 재순환이 없으므로 미반응 단백질을 최소화함으로써 단백질의 낭비를 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 즉, 최종 사이클에서 단백질 페길화, 특히 모노-페길화를 최대화하는 것이 유리할 수 있다.
최종 사이클은 약 pH 7.0 내지 9.0에서 페길화 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 반응은 약 pH 7.5 내지 8.5, 또는 약 pH 8.0에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 약 15-25℃, 또는 약 20℃에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 30 - 120 분 또는 약 60 분의 반응 시간을 가질 수 있다. 페길화는 NHS-활성화된 PEG를 사용할 수 있다.
비-페길화 단백질은 IEC 단계에서 IEC 물질로부터 용리함으로써 회수될 수 있다. 비-페길화 단백질을 회수하는 것은 비-페길화 단백질을 포함하는 용리액을 상대적으로 농축된 형태 및/또는 상대적으로 순수한 형태로 제공하는 것을 포함할 수 있다. 용리액은 적어도 약 95%의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것은 IEC 물질을 용리 완충액과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. IEC 용리 완충액은 약 40-100 mM, 50-90 mM, 60-80 mM NaCl, 또는 약 70 mM NaCl, 또는 약 40 mM, 50 mM, 60 mM 또는 70 mM NaCl, 또는 약 20- 60mM, 40-50mM, 또는 약 45mM NaCl을 포함할 수 있다. 용리 완충액은 약 45 mM NaCl 이하를 포함할 수 있다. 용리 완충액은 약 20-50 mM, 25-45 mM, 30-40 mM Na2SO4, 또는 약 35mM Na2SO4, 또는 적어도 약 20mM, 25mM, 30mM 또는 35mM Na2SO4 을 포함할 수 있다. NaCl 및 Na2SO4에 대해 표시된 농도 범위와 동일한 양의 음전하 이온을 제공할 수 있는, 다른 염이 IEC 용리 완충액에 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 용리 완충액은 약 70mM NaCl 또는 약 35mM Na2SO4를 함유 할 수 있다. 용리 완충액은 약 20-30 mM, 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. 용리 완충액은 약 7.0 내지 9.0, 7.5 내지 8.5, 또는 약 8.0의 pH를 가질 수 있다. 용리 완충액은 약 35 mM Na2SO4, 약 25 mM 비신, pH 약 8.0을 포함할 수 있다.
IEC 물질에 대한 용리 완충액은 약 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM 또는 35 mM 이하의 양으로 염을 함유할 수 있다. 용리 완충액은 약 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM 또는 40 mM 미만의 양으로 염을 함유할 수 있다. 염은 Na2SO4일 수 있다. 염은 Na2SO4를 포함하는 염의 혼합물일 수 있다. IEC 물질의 용리 완충액은 약 5-20 mS/cm, 5-15 mS/cm, 또는 8-10 mS/cm의 전도도를 가질 수 있다. 용리 완충액은 약 20 mS/cm, 15 mS/cm, 또는 10 mS/cm 이하의 전도도를 가질 수 있다.
IEC 용리 완충액 (또는 본원에 논의 된 다른 완충액)에 사용하기 위해, 비신에 대한 대안은 예를 들어 다른 "굿 완충액"을 포함한다. 약 6 내지 10의 pKa를 갖는 완충액이 사용될 수 있다. 인산염 또는 HEPES가 사용될 수 있다. 1차 아민을 함유하지 않은 완충액이 특히 적합하다 (1차 아민은 PEG 시약의 파트너로서 작용하여 일부 페길화 완충 분자를 생성할 수 있기 때문임).
IEC 용리 완충액 (또는 본원에 논의 된 다른 완충액)에 사용하기 위해, Na2SO4에 대한 대안은 예를 들어 하기로부터 선택된 음이온: PO4 3-, SO4 2- , CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN-; 및 하기로부터 선택된 양이온을 포함하는 염을 포함할 수 있다: NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+. Na2SO4 에 대한 대안적인 염은 NaCl, KCl, NaHPO4, LiCl 및 KSCN을 포함할 수 있다.
예를 들어, 방법은 단계 a), b) 및 c)의 2 개 이상의 사이클을 수행하는 단계를 포함할 수 있으며, AEC 용리액을 AEC 물질로부터 용리시킴으로써 단계 b)에서 비-페길화 단백질이 회수된다. 용리된 비-페길화 단백질은 이후 후속 페길화 반응에 사용된다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용될 수 있다. 용리된 비-페길화 단백질은 후속 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 사용될 수 있다. 즉, 이전 사이클의 비-페길화 단백질이 그 추가 사이클의 페길화 반응에 사용되는 단계 a), b) 및 c)의 추가의 사이클이 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후 후속 페길화 반응 (단계 a) 페길화 반응일 수 있음) 및 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되고 비-페길화 단백질의 회수를 허용하는 용액을 제공하는 가공 단계로 이어질 수 있다. 즉, 단계 a), b) 및 c)의 사이클은 이후, 단계 b) AEC 단계와 상이하지만 유사한 효과를 갖는 페길화 반응 및 가공 단계가 이어지거나 교대로 이루어질 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 후속 단계 a) 페길화 반응에서 사용될 수 있다. 회수된 비-페길화 단백질은 단계 a), b) 및 c)의 후속 사이클에서 사용될 수 있다.
페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가되고 비-페길화 단백질의 회수가 가능한 용액을 제공하기에 적합한 다양한 가공 단계가 존재하며 당업자에게 공지될 것이다. 이들은 예를 들어, 크로마토그래피 방법 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 포함한다.
본원에 사용된 "사이클"은 단계 a), b) 및 c)의 전체 사이클을 나타낸다.
방법은 3, 4 또는 5 사이클을 포함할 수 있으며, 여기서 각 사이클의 단계 b)는 AEC 용리액을 제공하기 위해 AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것을 포함하고, 여기서 단계 b)에서 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용된다. 단계 b)에서 용리된 비-페길화 단백질은 후속 사이클에서 단계 a)의 페길화 반응에 첨가될 수 있다.
방법은 후속 페길화 반응에 사용되기 전에 단계 b)에서 회수된 비-페길화 단백질을 다수의 AEC 단계로부터 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 후속 단계 a) 페길화 반응에 사용되기 전에 단계 b)에서 회수된 비 -페길화 단백질을 다수의 AEC 단계로부터 풀링하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 2, 3, 4 또는 5 단계 b) AEC 단계, 또는 5 단계 이상 b) AEC 단계로부터 회수된 비-페길화 단백질을 풀링하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 단계 b) AEC 용리액을 후속 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 사이클의 단계 b)로부터의 AEC 용리액을 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 제 1 사이클의 단계 b)로부터의 AEC 용리액을 제 2 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 직접 첨가하는 것은 용리액에서 비-페길화 단백질을 정제 또는 세척하는 (예를 들어, 정용 여과 또는 한외 여과에 의한) 개입 단계가 없다는 것을 의미한다. 오히려, 비-페길화 단백질을 함유하는 AEC 물질로부터의 용리액은 후속 페길화 반응에 첨가된다.
후속 페길화 반응에 사용되는 비-페길화 단백질에는 새로운 단백질이 보충될 수 있다. 방법은 AEC 물질로부터 회수된 비-페길화 단백질에 더하여 새로운 단백질을 페길화 반응에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 비-페길화 단백질의 재순환의 단계는 AEC 물질로부터 회수된 비-페길화 단백질을 후속 페길화 반응에 첨가하는 것을 포함하고, 이는 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 실질적으로 일정하도록 페길화 반응에 새로운 단백질을 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 실질적으로 일정한 것은 제 2 및 후속 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 제 1 페길화 반응에서의 것과 실질적으로 동일하다는 것을 의미할 수 있다. 이는 제 2 및 후속 페길화 반응에서 단백질의 출발 농도가 제 1 사이클의 페길화 반응에서와 실질적으로 동일함을 의미할 수 있다. 실질적으로 동일함은 평균 ± 10%를 의미할 수 있다. 신선한 단백질은 이전에 페길화 반응에 적용받지 않은 단백질을 나타낸다.
방법은 단계 a), b) 및 c)의 사이클을 포함할 수 있어서, 제 1 및 제 2 사이클이 수행되고 제 2 사이클은 최종 사이클이 된다. 대안적으로 본 발명의 방법은 제 1, 제 2 및 제3 사이클이 수행되고, 제3 사이클이 최종 사이클이 되도록 단계 a), b) 및 c)의 2 개의 추가 사이클을 포함할 수 있다. 방법은 단계 a), b) 및 c)의 2 개 이상의 추가 사이클을 포함할 수 있다. 방법은 단계 a), b) 및 c)의 총 1, 2, 3, 4 또는 5 사이클을 포함할 수 있다.
최종 사이클은 PEG/단백질 몰비가 약 1.4 내지 1 내지 약 2 내지 1인 페길화 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. PEG/단백질의 몰비는 약 1.4 내지 1.0, 1.5 내지 1.0, 1.6 내지 1.0, 1.7 내지 1.0, 1.8 내지 1.0, 1.9 내지 1.0, 2.0 내지 1.0, 2.1 내지 1.0, 2.2 내지 1.0, 2.3 내지 1.0, 2.4 내지 1.0 또는 2.5 내지 1.0일 수 있다. 상대적으로 높은 PEG/단백질 비율이 최종 사이클에서 유리할 수 있다. 최종 사이클 후, 미반응 (비-페길화) 단백질의 재순환이 없으므로 미반응 단백질을 최소화함으로써 단백질의 낭비를 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 즉, 최종 사이클에서 단백질 페길화, 특히 모노-페길화를 최대화하는 것이 유리할 수 있다.
최종 사이클은 약 pH 7.0 내지 9.0에서 페길화 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 페길화 반응은 약 pH 7.5 내지 8.5, 또는 약 pH 8.0에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 약 15-25℃, 또는 약 20℃에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 30 - 120 분 또는 약 60 분의 반응 시간을 가질 수 있다. 페길화는 NHS-활성화된 PEG를 사용할 수 있다.
비-페길화 단백질은 AEC 단계에서 AEC 물질로부터 용리함으로써 회수될 수 있다. 비-페길화 단백질을 회수하는 것은 비-페길화 단백질을 포함하는 용리액을 상대적으로 농축된 형태 및/또는 상대적으로 순수한 형태로 제공하는 것을 포함할 수 있다. 용리액은 적어도 약 95%의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것은 AEC 물질을 용리 완충액과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. AEC 용리 완충액은 약 40-100 mM, 50-90 mM, 60-80 mM NaCl, 또는 약 70 mM NaCl, 또는 적어도 약 40 mM, 50 mM, 60 mM 또는 70 mM NaCl을 포함할 수 있다. 용리 완충액은 약 20-50 mM, 25-45 mM, 30-40 mM Na2SO4, 또는 약 35mM Na2SO4, 또는 적어도 약 20mM, 25mM, 30mM 또는 35mM Na2SO4 을 포함할 수 있다. NaCl 및 Na2SO4에 대해 표시된 농도 범위와 동일한 양의 음전하 이온을 제공할 수 있는, 다른 염이 AEC 용리 완충액에 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 용리 완충액은 약 70mM NaCl 또는 약 35mM Na2SO4를 함유 할 수 있다. 용리 완충액은 약 20-30 mM, 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. 용리 완충액은 약 7.0 내지 9.0, 7.5 내지 8.5, 또는 약 8.0의 pH를 가질 수 있다. 용리 완충액은 약 35 mM Na2SO4, 약 25 mM 비신, pH 약 8.0을 포함할 수 있다.
AEC 물질에 대한 용리 완충액은 약 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM 또는 35 mM 이하의 양으로 염을 함유할 수 있다. 용리 완충액은 약 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM 또는 40 mM 미만의 양으로 염을 함유할 수 있다. 염은 Na2SO4일 수 있다. 염은 Na2SO4를 포함하는 염의 혼합물일 수 있다. AEC 물질의 용리 완충액은 약 5-20 mS/cm, 5-15 mS/cm, 또는 8-10 mS/cm의 전도도를 가질 수 있다. 용리 완충액은 약 20 mS/cm, 15 mS/cm, 또는 10 mS/cm 이하의 전도도를 가질 수 있다.
AEC 용리 완충액 (또는 본원에 논의 된 다른 완충액)에 사용하기 위해, 비신에 대한 대안은 예를 들어 다른 "굿 완충액"을 포함한다. 약 6 내지 10의 pKa를 갖는 완충액이 사용될 수 있다. 인산염 또는 HEPES가 사용될 수 있다. 1차 아민을 함유하지 않은 완충액이 특히 적합하다 (1차 아민은 PEG 시약의 파트너로서 작용하여 일부 페길화 완충 분자를 생성할 수 있기 때문임).
AEC 용리 완충액 (또는 본원에 논의 된 다른 완충액)에 사용하기 위해, Na2SO4에 대한 대안은 예를 들어 하기로부터 선택된 음이온: PO4 3-, SO4 2- , CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN-; 및 하기로부터 선택된 양이온을 포함하는 염을 포함할 수 있다: NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+. Na2SO4 에 대한 대안적인 염은 NaCl, KCl, NaHPO4, LiCl 및 KSCN을 포함할 수 있다.
AEC 및 HIC 단계의 성능
본 발명의 방법에서 IEC 및 HIC 단계는 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 AEC 및 HIC 단계는 순차적으로 수행될 수 있다. 즉, 방법은 하기 순차적인 단계를 포함할 수 있다: a) 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 제 1 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함; b) 제 1 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가되는 AEC 통과 용액을 제공하는 단계; AEC 단계는 비-페길화 단백질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 제 1 혼합물을 AEC 물질에 적용하는 단계를 포함함; c) 단계 b)로부터 AEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 제 2 혼합물을 제공하는 단계; 및 d) 제 2 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노 -페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가되는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 단계, 여기서 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90%의 모노-페길화 단백질을 포함함.
용어 "순차적"은 단계 a 내지 d 중 임의의 단계 사이에 개입 크로마토그래피 단계가 발생하지 않음 (단계 (a) 및 (b), (b) 및 (c), (c) 및 (d) 사이에 크로마토그래피 단계 없음)을 의미한다. 용어 "순차적"은 청구항 중 어느 하나에 언급된 임의의 단계 사이에 개입 크로마토그래피 단계가 발생하지 않음을 의미한다. 본 발명의 방법의 단계는 직접 수행될 수 있는데, 이는 단계 (b) 내지 (d) 각각이 이전 단계 바로 뒤에 수행됨을 의미한다. 방법은 단계 (a) 내지 (d)로 이루어질 수 있다. 방법은 청구항 중 어느 하나에 기재된 단계들로 이루어질 수 있다.
단계 (b) 내지 (d)는 불연속적으로 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 단계 (b) 내지 (d)는 순차적으로 및 불연속적으로 또는 순차적으로 및 연속적으로 수행될 수 있다. 연속적으로는 AEC 물질 및 HIC 물질이 직접 연결되어 있거나 AEC 물질 및 HIC 물질 사이에 지속적인 유동을 허용하는 일부 다른 메커니즘이 있음을 의미한다. 불연속적으로는 AEC 물질 및 HIC 물질 사이에 연속적인 유동이 없음을 의미하며, 예를 들어 AEC 통과 용액 또는 유출액이 수집 및 풀링되어 제 2 혼합물을 제공한다. 단계의 연속적인 성능은 전체 방법에 동일한 유속이 사용됨을 의미할 수 있다.
IEC 통과 용액은 HIC 물질에 직접 적용될 수 있다. 바람직하게는 컨디셔닝 단계는 컨디셔닝된 제 2 혼합물을 HIC 물질에 직접 제공하기 위해 수행된다. IEC 물질 및 HIC 물질은 직렬로 직접 연결될 수 있다. 예를 들어, IEC 물질은 IEC 컬럼에 포함될 수 있고 HIC 물질은 HIC 컬럼에 포함될 수 있으며, IEC 컬럼은 HIC 컬럼에 직접 연결된다. IEC 컬럼의 IEC 통과 용액은 HIC 컬럼으로 직접 전달될 수 있다. IEC 컬럼 및 HIC 컬럼 사이에 인-라인 연결이 있을 수 있다. IEC 컬럼 및 HIC 컬럼 사이에 연속적인 유동을 허용하는 메커니즘이 있을 수 있다. 방법의 단계는 연속적으로 수행될 수 있다. 방법의 단계는 병렬로 수행될 수 있으며, 즉 단계 (b)와 (d)가 병렬로 실행되도록, 단계 (b)가 완료되기 전에 단계 (d)가 시작될 수 있다. 즉, HIC 단계 및 IEC 단계는 병렬로 실행될 수 있다. 방법을 연속적으로 (또는 병렬로) 수행하는 것은 상대적으로 빠르고 효율적이기 때문에 유리하다.
IEC 단계가 CEC 단계인 경우, CEC 및 HIC 단계는 순차적으로 수행될 수 있고, 및/또는 AEC 및 HIC 단계에 대해 상기 기재된 바와 같이, 연속적으로 또는 불연속적으로 수행될 수 있다.
모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법
본 발명의 방법은 페길화 형태의 단백질에 대한 상대적으로 낮은 결합 능력 및 비-페길화 형태의 단백질에 대한 상대적으로 높은 결합 능력을 갖는 IEC 물질을 사용한다. 이는 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 신속한 분리를 용이하게 하기 때문에 유리하다. 컬럼의 많은 결합 능력은 비-페길화 형태의 단백질에 결합하기 위해 사용되고 이는 상대적으로 작은 컬럼을 사용하여 상대적으로 다량의 제 1 혼합물 (비-페길화 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물)의 가공을 용이하게 한다. 이는 제 1 혼합물이 일반적으로 비-페길화 단백질 (IEC 결합 물질이 상대적으로 높은 결합 능력을 가짐)에 상대적으로 낮고 페길화 단백질 (IEC 결합 물질이 상대적으로 낮은 결합 능력을 가짐)에 높기 때문이다. 이는 작동 시 본원에 개시된 방법이 IEC 단계에서 상대적으로 다량의 제 1 혼합물을 가공할 수 있음을 의미한다. 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 상대적으로 신속한 분리는 비-페길화 단백질의 신속한 재순환 및 전체 방법 효율을 촉진시킨다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 적어도 약 90%의 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: 상기 기재된 IEC 통과 용액으로 생산된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법에 적용하는 단계. IEC 통과 용액은 AEC 통과 용액일 수 있다.
다양한 적합한 정제 방법, 예를 들어 침전, 크기 의존적 분리 및 여과 방법뿐만 아니라 크로마토그래피 방법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피가 존재하고 당업자에게 공지될 것이다. 본원에 기재된 방법에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피는 바람직한 정제 방법일 수 있다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피
HIC 물질은 소수성 리간드로 관능화된 수지를 포함할 수 있다. HIC 물질상의 소수성 리간드는 단백질의 소수성 표면과 상호 작용할 수 있다. HIC 물질상의 리간드 및 치환도 (높거나 낮은 치환 "서브")는 이의 최종 소수성 및 이에 따른 선택성에 기여할 수 있다. 리간드는 알킬 또는 아릴기를 함유할 수 있다. HIC 물질의 소수성은 리간드 계열: 에테르, 폴리프로필렌글리콜 (PPG), 페닐, 부틸 및 헥실을 통해 증가한다.
본 발명의 방법에 사용되는 HIC 물질은 페닐 리간드를 포함할 수 있다. 페닐 리간드로 관능화된 메타크릴 수지를 포함할 수 있다. 페닐 리간드로 관능화된 하이드록실화된 폴리메타크릴 중합체 비드일 수 있다. 이는 50-150 nm, 70-120 nm, 70-100 nm, 90-110 nm 공극 크기를 가질 수 있다. 이는 40-150 μm, 40-120 μm, 40-100 μm, 40-80 μm 또는 약 60, 65, 70, 80 또는 90, 100 μm의 입자 크기를 가질 수 있다. 이는 70-100 nm의 공극 크기와 30-65 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 100 nm의 공극 크기와 65 μm의 비드 크기를 가질 수 있다. 이는 Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Bioscience LLC; 제품 번호 14478)일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 HIC 물질은 제조사의 지시에 따라 사용될 수 있다.
HIC 물질은 컬럼, 예를 들어 팽창된 베드 또는 충전된 베드 컬럼일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. HIC 물질은 다공성 모놀리식 물질 형태일 수 있다. HIC 물질은 관능화된 섬유, 양털 또는 메쉬 형태일 수 있다. HIC 물질은 관능기를 가질 수 있거나 또는 HIC 특성을 나타낼 수있는 임의의 다른 고체 지지체 형태일 수 있다. HIC 물질은 Toyopearl Phenyl 650M, Toyopearl Phenyl 650S, Toyopearl PPG 600M, TSKgel Phenyl 5PW, Butyl Sepharose 4 FF, Butyl-S Sepharose FF, Octyl Sepharose 4 FF, Phenyl Sepharose BB, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose 6 FF High Sub, Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub, Source I SETH, Source 151 SO, Source 1 SPHE, Phenyl Sepharose BB, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose 6 FF High Sub, Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub, Source I SETH, Source 151 SO, Source 1 SPHE, Cellufine Butyl, Cellufine Octyl, Cellufine Phenyl, WP HI-Propyl (C3), Macroprep t-Butyl, Macroprep methyl을 포함한다.
본 발명의 방법은 통과 모드의 HIC 단계를 포함할 수 있다. 통과 모드에서, 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")은 모노-페길화 단백질이 HIC 물질을 통해 유동하기에 적합한 조건 하에서 HIC 물질에 적용되므로 HIC 통과액에 존재한다. 조건은 올리고-페길화 단백질이 HIC 물질에 결합하기에 적합하다.
본 발명의 방법은 결합 및 용리 모드에서 HIC 단계를 포함할 수 있다. 결합 및 용리 모드에서, 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")은 HIC 물질에 결합하기 위해 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질에 적합한 조건 하에서 HIC 물질에 적용된다. 모노-페길화 단백질은 HIC 물질로부터 용리된다. 감소하는 염의 구배는 모노-페길화 단백질을 용리시키는데 사용된다. 올리고-페길화 단백질은 보다 낮은 염 농도에서 용리되므로 모노-페길화 단백질과는 별개의 분획으로 용리된다.
HIC 물질은 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물" 또는 HIC 로드 용액)이 이에 로딩되기 전에 평형화될 수 있다. HIC 평형 완충액은 Na2SO4 및/또는 비신과 같은 염을 포함할 수 있다. HIC 평형 완충액은 약 6.5 내지 9.0, 7.5 내지 8.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. HIC 평형 완충액은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. HIC 평형 완충액은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM NaPO4를 포함할 수 있다.
올리고-페길화 단백질이 HIC 물질에 결합되는 동안 모노-페길화 단백질이 HIC 물질을 통해 유동하기에 적합한 조건은 쉽게 측정될 수 있다. 평형 완충액의 pH, 이온 강도 및 조성은 단백질 혼합물이 크로마토그래피 매트릭스 상에 로딩될 때, 원하는 결합 및/또는 통과 또는 특이적 단백질 또는 오염물이 달성되도록 보장하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 평형 완충액의 pH, 이온 강도 및 조성은 모노-페길화 단백질이 HIC 물질을 통해 유동하고 올리고-페길화 단백질이 HIC 물질에 결합되도록 보장하기 위해 선택될 수 있다.
통과 모드에서의 HIC 단계가 수행되기 전 평형을 위해, 평형 완충액은 약 200-500 mM, 250-450 mM, 300-450 mM, 300-400 mM, 350-400 mM 염, 또는 약 390 mM 염 또는 약 300 mM 염을 포함할 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 25 mM 비신, 약 390 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 25 mM 비신, 약 300 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 25mM NaPO4, 약 300 mM Na2SO4, pH 8.0를 포함할 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 30-70 mS/cm, 40-60 mS/cm, 또는 약 50 mS/cm의 전도도를 가질 수 있다.
방법이 통과 모드의 HIC 단계를 포함하는 경우, 방법은 염 (예컨대 Na2SO4) 및 비신을 포함하는 조절된 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")을 제공하는 것을 포함할 수 있고, 이는 약 300 mM Na2SO4 및 약 25 mM 비신으로 존재하거나, 또는 약 390 mM Na2SO4 및 약 25 mM 비신으로 존재할 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 HIC 로드 용액으로 나타낼 수 있다. HIC 통과 모드에 사용하기 위한 조절된 페길화 단백질 혼합물은 약 200-500 mM, 250-450 mM, 250-350 mM 염, 또는 약 300 mM 염, 또는 약 350-450 mM 염, 또는 약 390 mM 염을 포함할 수 있다. 염은 Na2SO4일 수 있다. 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. 컨디셔닝된 페길화 단백질 혼합물은 약 300 mM Na2SO4 및 약 25mM 비신을 포함할 수 있다.
HIC 통과 모드에서, 페길화 단백질 혼합물이 HIC 물질에 적용된 후, HIC 물질은 세척될 수 있다. HIC 물질은 통과 모드에서 사용하기에 적합한 평형 완충액으로 세척될 수 있다. HIC 물질은 약 200-500 mM, 250-450 mM, 300-450 mM, 300-400mM, 350-400 mM 염, 또는 약 390 mM 염, 또는 약 300 mM 염을 포함할 수 있는 HIC 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 세척 완충제는 약 25 mM 비신, 약 390 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. 통과 모드 HIC에서 사용하기 위한 세척 완충제는 약 25 mM 비신, 약 300 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. HIC 물질은 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 약 1, 2, 3, 4 또는 5 컬럼 부피의 완충액으로 세척될 수 있다. HIC 물질은 통과 용액의 단백질 함량을 모니터링하고 (예를 들어 UV 분광 분석법에 의해) 단백질 함량이 임계값 미만이 되면 (예를 들어 UV 신호가 기준선으로 되돌아올 때) 세척 방법을 정지시킴으로써 측정되는 부피의 평형 완충액 또는 세척 완충액으로 세척될 수 있다. 통과 용액 또는 유출액은 분획으로 수집될 수 있으며, 이들 통과 분획의 일부 또는 전부가 풀링될 수 있다.
페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")은 비-페길화 단백질을 0 또는 0에 가깝게 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물은 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.0%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물은 약 2% 미만의 비-페길화 단백질을 포함할 수 있다. 페길화 단백질 혼합물은 약 2% 미만의 비-페길화 EPO를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법이 통과 방식의 HIC 단계를 포함하는 경우, 페길화 단백질 혼합물의 비-페길화 단백질 함량은 최종 치료 제품에 대한 임계 사양보다 낮아야 한다.
HIC 단계가 통과 모드에서 수행되는 경우, HIC 통과는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공한다. 즉, HIC 통과는 본원에 기재된 바와 같은 모노-페길화 단백질 조성물이다. HIC 통과는 적어도 90%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
HIC 단계는 통과 방식으로 수행되는 경우, 올리고-페길화 단백질은 HIC 물질로부터 용리될 수 있다. 예를 들어 0 mS/cm의 전도도에서 구배 또는 단계 용리에 의한 것이다.
결합 및 용리 모드에서 HIC 단계가 수행되기 전 평형을 위해, 평형 완충액은 약 400-600 mM, 450-550 mM, 염 또는 약 500 mM 염을 포함할 수 있다. 결합 및 용리 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 25 mM 비신, 약 500 mM Na2SO4, pH 8.0을 포함할 수 있다. 결합 및 용리 모드 HIC에서 사용하기 위한 평형 완충액은 약 40-80 mS/cm, 50-70 mS/cm, 또는 약 60 mS/cm 또는 약 58 mS/cm의 전도도를 가질 수 있다.
방법이 결합 및 용리 모드의 HIC 단계를 포함하는 경우, 방법은 염 (예컨대 Na2SO4) 및 비신을 포함하는 조절된 페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 매질")을 제공하는 것을 포함할 수 있고, 이는 앞서 언급된 농도의 임의의 조합에도 있을 수 있으며, 약 500 mM Na2SO4 및 약 25 mM 비신으로 존재할 수 있고, 용리 단계는 500 mM 내지 0 mM Na2SO4의 감소하는 구배를 갖는 용리를 포함할 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 HIC 로드 용액으로 나타낼 수 있다. HIC 결합 및 용리 모드에 사용하기 위한 조절된 페길화 단백질 혼합물은 약 250-750 mM, 400-600 mM, 450-550 mM 염 또는 약 500 mM 염을 포함할 수 있다. 염은 Na2SO4일 수 있다. NaCl과 같은 다른 염이 사용될 수 있다. 다른 염은 Na2SO4 농도와 동등한 이온 강도를 제공하는 농도로 사용될 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 약 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM 비신 또는 약 25 mM 비신을 포함할 수 있다. 조절된 페길화 단백질 혼합물은 약 500 mM Na2SO4 및 약 25mM 비신을 포함할 수 있다.
HIC 단계가 결합 및 용리 모드에서 수행될 때, 모노-페길화 단백질은 HIC 물질로부터 용리된다. 용리는 염 구배를 감소시키는 것이다. 용리는 500 mM 내지 0 mM 염, 예컨대 Na2SO4의 선형 용리 구배를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 용리는 약 60 mS/cm 내지 0 mS/cm의 선형 용리 구배를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 감소하는 염 구배에서 모노-페길화 EPO는 약 300 mM Na2SO4에서 용리된다 (도 6 참조). HIC 물질로부터 모노-페길화 단백질을 용리하여 HIC 용리액을 제공하고, 여기서 HIC 용리액은 모노-페길화 단백질을 제공한다.
HIC 단계가 통과 모드에서 수행되는 경우, HIC 통과는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공한다. 즉, HIC 통과는 본원에 기재된 바와 같은 모노-페길화 단백질 조성물이다. HIC 통과는 적어도 90%의 모노-페길화 단백질을 포함할 수 있다.
페길화 단백질 혼합물 (또는 "제 2 혼합물")은 하나 이상의 배치에서 HIC 단계를 위해 조절될 수 있다. 페길화 단백질 혼합물은 인-라인 컨디셔닝될 수 있다. 제 2 혼합물을 제공하는 단계 (단계 c)는 혼합물을 인-라인으로 컨디셔닝하여 IEC 장치 (예를 들어 AEC 또는 CEC 컬럼)로부터 HIC 장치 (예를 들어, HIC 컬럼)로 조절된 매질을 직접 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계 (단계 c)는 혼합물을 인-라인으로 컨디셔닝하여 AEC 장치 (예를 들어 AEC 칼럼)로부터 HIC 장치 (예를 들어, HIC 칼럼)로 조절된 매질을 직접 제공하는 것을 포함할 수 있다.
실온은 약 18-25℃, 20-22℃, 약 20℃, 약 21℃ 또는 약 22℃ 일 수 있다. 본원에 개시된 방법은 실온에서 수행될 수 있다. HIC는 실온에서 수행될 수 있다. HIC는 15-25℃의 온도에서 수행될 수 있다. 재현성을 위해 특이적이고 안정적인 온도에서 HIC를 수행할 수 있다. 안정적인 온도는 특이적 온도 ± 1.0℃ 또는 ± 1.0℃ 일 수 있다.
본 발명의 방법은 제 2 혼합물을 통과 모드에서 HIC 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가되는 HIC 통과 용액을 제공하는 단계를 포함할 수 있고, HIC 단계는 올리고-페길화 단백질을 결합하기에 적합한 조건 하에서 제 2 혼합물을 HIC 물질에 적용하는 단계로서, 여기서 HIC 통과는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공한다. 이러한 방법에서, HIC 물질은 Toyopearl Phenyl 650M 일 수 있고, HIC 단계는 약 7.0 내지 9.0의 pH 및 약 30-40 mS/cm의 전도도에서 수행되고; 제 2 혼합물은 25　mM 비신 및 약 390 mM Na2SO4 를 포함하는 HIC 로드 용액으로서 HIC 물질에 적용된다. 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다.
본원에 개시된 방법은 유리하다
단백질의 형태 및 비-페길화 형태의 단백질에 대한 상대적으로 높은 결합 능력이다. 이는 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 신속한 분리를 용이하게 하기 때문에 유리하다. 컬럼의 많은 결합 능력은 비-페길화 형태의 단백질에 결합하기 위해 사용되고 이는 상대적으로 작은 컬럼을 사용하여 상대적으로 다량의 제 1 혼합물 (비-페길화 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 혼합물)의 가공을 용이하게 한다. 이는 제 1 혼합물이 일반적으로 비-페길화 단백질 (IEC 결합 물질이 상대적으로 높은 결합 능력을 가짐)에 상대적으로 낮고 페길화 단백질 (IEC 결합 물질이 상대적으로 낮은 결합 능력을 가짐)에 높기 때문이다. 이는 작동 시 본원에 개시된 방법이 IEC 단계에서 상대적으로 다량의 제 1 혼합물을 가공할 수 있음을 의미한다. 페길화 단백질로부터 비-페길화 단백질의 상대적으로 신속한 분리는 비-페길화 단백질의 신속한 재순환 및 전체 공정 효율을 촉진시킨다.
본 발명의 방법은 정용 여과 또는 한외 여과 단계를 수행하지 않고 비-페길화 단백질을 재순환시키는 것을 포함한다. 이는 비-페길화 단백질의 재순환을 포함하지만 비-페길화 단백질 분획으로부터 염의 제거 또는 환원을 필요로 하는 방법과 비교하여 더 높은 생산성을 가능하게 하는 보다 빠른 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 WO 2009/010270에 개시된 것과 같은 종래 기술의 방법과 비교하여 상대적으로 높은 수율을 갖는다. 비-페길화 (미반응) 단백질의 재순환은 전체 수율을 증가시킨다. 하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 방법은 WO 2009/010270에 개시된 방법의 것보다 40% 초과의 높은 모노-페길화 단백질의 수율을 제공한다. 본원에 개시된 방법의 생산성은 WO 2009/010270에 개시된 유형의 종래 기술 방법의 생산성의 적어도 2 배일 것으로 예상되며, 수배 더 높을 수 있다. 본원에 개시된 방법의 생산성은 동일한 크기의 장비를 사용할 때 WO 2009/010270에 개시된 유형의 종래 기술 방법의 생산성의 적어도 2 배일 것으로 예상되며, 수배 더 높을 수 있다.
Pfister (Biotech and BioEng 2016; 113)에 개시된 방법과 비교하여, 본원에 개시된 방법은 생산성의 약 2 배 (약 1.7 배 더 생산적)인 것으로 계산된다. 증가된 생산성은 대부분 후속 페길화 반응에 추가하여 재순환되기 전에 비-페길화 (미반응) EPO의 시간-소모적인 정용 여과의 필요성을 피한 결과이다. 현재 공개된 방법에서 미반응 EPO가 더 빨리 회수되기 때문에 전체 생산성이 더 높다. 본원에 개시된 방법은 또한 더 빠른 페길화 반응을 포함한다. 본원에 개시된 페길화 방법은 Pfister에 개시된 방법보다 반응 당 20-33% 더 많은 모노-페길화 EPO를 생성하도록 계산된다.
WO 2009/010270에 개시된 방법과 비교하여, 본원에 개시된 방법은 보다 생산적이고 모노-페길화 단백질의 수율이 더 높다.
결합 능력
크로마토그래피 물질의 결합 능력은 정의된 실험 조건 하에서 매질에 결합할 수 있는 단백질의 양을 의미한다. 본원에서 결합 능력은 동적 결합 능력을 나타낼 수 있다. 동적 결합 능력은 이동상 (또는 완충 용액)의 유속을 포함하는 정의된 실험 조건 하에서 매질에 결합할 수 있는 단백질의 양을 나타낸다. 결합 능력은 유속을 포함하지 않는 정의된 실험 조건을 나타내는 정적 결합 능력을 나타낼 수 있다.
특이적 단백질에 대한 동적 결합 능력은 통상적인 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 특이적 단백질에 대한 동적 결합 능력은 특이적 단백질의 공지된 농도를 함유하는 샘플을 로딩하고 용액으로의 통과에서 단백질 농도를 측정하여 상당한 양의 단백질이 "브레이크스루"되어 출발하기 전에 단백질이 단백질의 결합될 수 있는 양을 확립함으로써 측정될 수 있다. 이는 정의된 실험 조건 하에서 크로마토그래피 물질에 대한 "브레이크스루 곡선"을 생성함으로써 달성될 수 있다. 동적 결합 능력이 측정되는 실험 조건은 작동 조건일 수 있다. 실험 조건은 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하기 위해 사용된 방법에서 사용되는 조건일 수 있다. 크로마토그래피 물질을 사용하는 방법에서, 로딩 조건은 크로마토그래피 물질의 과부하를 피하기 위해, 관심있는 단백질이 크로마토그래피 물질의 "브레이크스루" 용량 미만의 범위로 적용되도록 조정될 수 있다.
본원에서 동적 결합 능력에 대한 언급은 크로마토그래피 방법 또는 단계를 위해 선택된 조건 하에서의 동적 결합 능력을 나타낸다. 특정 단백질에 대한 특정 크로마토그래피 조건 하에서 크로마토그래피 매질의 동적 결합 능력은 불필요한 단백질 손실을 유발하지 않으면서 크로마토그래피 매질 상에 로딩될 수 있는 단백질의 최대량으로 생각될 수 있다. 즉, "브레이크스루"를 유발하지 않고 로딩될 수 있는 최대 관심있는 단백질의 양이다. 단백질 브레이크스루는 예를 들어 280 nm (A280)에서 분광 광도계에 의해 모니터링될 수 있다. 브레이크스루 임계값은 10%일 수 있다. 크로마토그래피 조건은 pH, 전도도 및 유속, 및 이동상에 대한 임의의 염 또는 다른 첨가제의 농도일 수 있다. 동적 결합 능력 크로마토그래피 물질은 관련 크로마토그래피 단계에 대한 작동 조건 (선택된 조건) 하에서 측정된다. 예를 들어, AEC 물질의 동적 결합 능력은 본 발명의 방법의 AEC 단계에 대한 작동 조건 하에서 측정된다.
본 맥락에서 결합 능력은 모노-페길화 단백질 조성물을 제조하는데 사용 된 크로마토그래피 조건 하의 동적 결합 능력을 나타낼 수 있다. 예를 들어, AEC 물질의 결합 능력은 25 mM 비신, 약 7.5 mM Na2SO4, pH 8 내 AEC 물질의 동적 결합 능력을 200 cm/h의 유속, 체류 시간 3.3 분으로 나타낼 수 있다.
HIC 물질의 결합 능력은 통과 모드에서 약 5 g/L 페길화 단백질 및 결합 및 용리 모드에서 2 g/L 페길화 단백질일 수 있다. 올리고-페길화 단백질에 대한 통과 모드에서 사용되는 HIC 물질의 동적 결합 능력은 적어도 약 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 또는 5 g/L, 또는 약 2-8 g/L, 3-7 g/L, 4-6 g/L, 또는 약 5 g/L일 수 있다. 페길화 단백질에 대한 결합 및 용리 모드에 사용된 HIC 물질의 동적 결합 능력은 적어도 약 0.5 g/L, 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 또는 5 g/L, 또는 약 0.5-4　g/L, 1-3　g/L, 또는 약 5 g/L일 수 있다. 결합 능력은 150 cm/h의 유속, 체류 시간 3.3 분에서, 25 mM 비신, 약 300 mM Na2SO4, pH 8.0 내 또는 150 cm/h의 유속, 체류 시간 3.3 분에서, 25 mM 비신, 약 390 mM Na2SO4, pH 8.0 내 HIC 물질의 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 나타낼 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피인 구현예에서, AEC 단계는 비-페길화 단백질이 AEC 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 수행된다. 조건의 적합성은 동적 결합 능력의 관점에서 고려될 수 있다. AEC 단계는 통과 모드에서 수행된다. 본 발명의 방법에서 AEC를 위한 통과 모드에서, 페길화 단백질은 AEC 물질에 의해 상대적으로 약하게 결합되고 비-페길화 단백질은 비교적 강하게 (조밀하게) 결합된다. 이러한 조건에서, 비-페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력은 상대적으로 높고, 페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력은 상대적으로 낮다. 크로마토그래피 조건은 비-페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 최대화하도록 선택될 수 있다. 크로마토그래피 조건은 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 최소화하도록 선택될 수 있다. 크로마토그래피 조건은 페길화 단백질 및 비-페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력을 조정 또는 최적화하기 위해 선택될 수 있으며, 비-페길화 단백질이 AEC 물질 상에 유지되고 페길화 단백질이 통과 용액에서 회수되도록 한다. AEC 물질은 약 2.5g/L, 1.5g/L 또는 1.0g/L 미만, 또는 약 1.0 - 2.5g/L의 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, AEC 물질은 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서 제 1 혼합물을 AEC 단계에 적용하는 것은 비-페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력과 거의 동일하거나, 또는 더 낮은 하중으로 AEC 물질 상에 제 1 혼합물을 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 이는 비-페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력보다 적어도 2, 5, 10, 20, 25 또는 30 배 낮은 하중으로 AEC 물질 상에 제 1 혼합물을 로딩하는 것을 포함할 수 있다 (예컨대 비-페길화 물질이 AEC 물질 상에 유지됨). 음이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 음이온 교환 물질의 동적 결합 능력의 약 80-95%의 범위일 수 있다. 제 1 혼합물은 페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력보다 적어도 2, 5, 20, 25 또는 30 배 높은 하중으로 AEC 물질 상에 로딩될 수 있다 (예컨대 페길화 단백질이 통과 용액 또는 AEC 물질로부터의 유출액에서 회수됨).
AEC 물질로부터 비-페길화 단백질의 후속 용리는 비-페길화 단백질에 대한 AEC 물질의 동적 결합 능력이 상대적으로 낮은 조건 하에서 수행된다. 이는 로드 및/또는 세척 완충액과 비교하여 상대적으로 높은 전도도의 용리 버퍼를 적용함으로써 달성될 수 있다.
HIC 단계는 통과 모드에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서 HIC 단계의 통과 모드에서, 관심있는 단백질 (이 경우 모노-페길화 단백질)은 HIC 물질에 의해 상대적으로 약하게 결합되고 원하지 않는 단백질 (또는 오염물, 이 경우 올리고-페길화 단백질)은 상대적으로 강하게 (조밀하게) 결합된다. 이러한 조건에서 올리고-페길화 단백질에 대한 HIC 물질의 동적 결합 능력은 모노-페길화 단백질에 대한 HIC 물질의 동적 결합 능력보다 높다. 크로마토그래피 조건은 올리고-페길화 단백질에 대한 결합 강도를 최대화하고 및/또는 모노-페길화 단백질에 대한 결합 강도를 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
HIC 단계는 결합 및 용리 모드에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서 HIC 단계의 결합 및 용리 모드에서, 관심있는 단백질 (이 경우 모노-페길화 단백질)은 HIC 물질에 의해 상대적으로 약하게 결합되고 원하지 않는 단백질 (또는 오염물, 이 경우 올리고-페길화 단배질)은 HIC 물질에 의해 상대적으로 강하게 (조밀하게) 결합된다. 모노-페길화 단백질은 감소하는 염 구배를 사용하여, 올리고-페길화 단백질 전에 HIC 물질로부터 용리될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피인 구체 예에서, CEC 단계는 비-페길화 단백질이 CEC 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서 수행된다. 조건의 적합성은 동적 결합 능력의 관점에서 고려될 수 있다. CEC 단계는 통과 모드에서 수행된다. 본 발명의 방법에서 CEC에 대한 통과 모드에서, 페길화 단백질은 CEC 물질에 의해 상대적으로 약하게 결합되고 비-페길화 단백질은 상대적으로 강하게 (조밀하게) 결합된다. 이러한 조건에서, 비-페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력은 상대적으로 높고, 페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력은 상대적으로 낮다. 크로마토그래피 조건은 비-페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 최대화하고 및/또는 페길화 (또는 모노-페길화) 단백질에 대한 동적 결합 능력을 최소화하기 위해 선택될 수 있다. 크로마토그래피 조건은 페길화 단백질 및 비-페길화 단백질을 CEC 물질 상에 보존하고 페길화 단백질을 통과 용액에서 회수하기 위해, 페길화 단백질 및 비-페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력을 조정하거나 최적화하기 위해 선택될 수 있다. CEC 물질은 약 2.5g/L, 1.5 g/L 또는 1.0 g/L, 또는 약 1.0 - 2.5 g/L의 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, CEC 물질은 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 동적 결합 능력을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서 제 1 혼합물을 CEC 단계에 적용하는 것은 비-페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력과 거의 동일하거나, 또는 더 낮은 하중으로 CEC 물질 상에 제 1 혼합물을 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 이는 비-페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력보다 적어도 2, 5, 10, 20, 25 또는 30 배 낮은 하중으로 CEC 물질 상에 제 1 혼합물을 로딩하는 것을 포함할 수 있다 (예컨대 비-페길화 물질이 CEC 물질 상에 유지됨). 음이온 교환 물질에 적용되는 비-페길화 단백질의 양은 음이온 교환 물질의 동적 결합 능력의 약 80-95%의 범위일 수 있다. 제 1 혼합물은 페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력보다 적어도 2, 5, 20, 25 또는 30 배 높은 하중으로 CEC 물질 상에 로딩될 수 있다 (예컨대 페길화 단백질이 통과 용액 또는 CEC 물질로부터의 유출액에서 회수됨).
CEC 물질로부터 비-페길화 단백질의 후속 용리는 비-페길화 단백질에 대한 CEC 물질의 동적 결합 능력이 상대적으로 낮은 조건 하에서 수행된다. 이는 로드 및/또는 세척 완충액와 비교하여 상대적으로 높은 전도도의 용리 완충액을 적용함으로써 달성될 수 있다.
크로마토그래피 조건
크로마토그래피 물질에 로딩된 단백질의 양은 물질의 결합 능력에 따라 다를 수 있다. 예를 들어 AEC 물질이 약 35 g/L 의 비-페길화 EPO 에 대한 결합 능력을 갖고, 반응 생성물의 혼합물에서 EPO 의 약 50% 가 비-페길화되는 경우, AEC 물질에 적용되는 반응 생성물의 혼합물의 최대 로드 (총 단백질의 관점에서) 는 약 70 g/L 일 것이다.
크로마토그래피 단계에 대한 유속은 통상적인 기법에 따라 선택되고 조정될 수 있다. 더 빠른 유속은 결합 능력을 감소시킬 것이며, 이는 큰 부피의 단백질 혼합물을 분리할 때 최대 동적 결합 능력과 빠른 분리 사이의 균형에 도달할 수 있음을 의미한다. 적합한 유속은 50 - 400 cm/h 일 수 있다. 체류 시간은 사용된 크로마토그래피 물질에 따라 3-5 분, 또는 가능하게는 그 미만일 수 있다. 전체 공정 생산성을 개선하기 위해 더 빠른 유속 및 더 짧은 체류 시간이 바람직할 수 있다.
크로마토그래피 단계는 특정 단백질 (또는 단백질의 페길화 형태) 의 "결합에 적합한" 조건 하에서 수행될 수 있다. 당업자는 크로마토그래피 기법에 익숙하고 그의 통상의 일반적인 지식을 이용하여 그리고 본 개시에 의해 안내되어 특정 단백질의 결합에 적합한 조건을 실험적으로 찾을 수 있다. 파라미터, 예컨대 크로마토그래피 물질, 염의 유형 및/또는 농도, pH, 완충액, 온도 및 유속은 모두 크로마토그래피에서 특정 단백질 (또는 단백질의 페길화 형태) 의 결합에 적합한 조건을 제공하도록 변경될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 관심 있는 단백질 (또는 오염물, 예를 들어 원치 않는 단백질) 이 알짜 음전하를 가지므로 양으로 하전된 음이온 교환 물질에 결합하기 위해서, AEC 단백질 혼합물 (로드 조성물) 및 비교적 높은 pH 의 세척 완충액이 일반적으로 사용된다. 반대로, 관심 있는 단백질 (또는 오염물, 예를 들어 원치 않는 단백질) 이 알짜 양전하를 가지므로 음으로 하전된 양이온 교환 물질에 결합하기 위해, CEC 단백질 혼합물 및 비교적 낮은 pH 의 세척 완충액이 일반적으로 사용된다.
본 발명의 방법은 단백질이 약 8.0 이하, 또는 7.0 이하, 또는 6.0 이하의 pI 를 갖는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 6.0 이하의 pI 를 갖는 단백질에 특히 적합하다. 이 경우, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 AEC 단계일 수 있고 AEC 조건은 단백질의 pI 초과의 pH, 바람직하게는 단백질의 pI 보다 적어도 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 또는 4.0 pH 단위 큰 pH 에서이다. 이와 관련하여 pI 는 단백질 조성물에서 단백질의 가장 염기성인 이소형태의 pI, 또는 단백질의 가장 풍부한 이소형태의 pI 를 지칭할 수 있다.
본 발명의 방법은 단백질이 약 8.0 이상의 pI 를 갖는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이 경우, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 CEC 단계일 수 있고 CEC 조건은 단백질의 pI 보다 낮은 pH, 바람직하게는 단백질의 pI 보다 적어도 0.5, 1.0, 2.0 또는 3.0 pH 단위 낮은 pH 에서이다. 이와 관련하여 pI 는 단백질 조성물에서 단백질의 가장 산성 이소형태의 pI, 또는 단백질의 가장 풍부한 이소형태의 pI 를 지칭할 수 있다. 단백질은 약 2.0 - 6.0, 2.5 - 5.5, 3.0 - 5.5, 3.5 - 5.0, 또는 약 3.5 - 4.5 의 pI 를 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 단백질이 약 6.0 - 8.0 의 pI 를 갖는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이 경우, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 AEC 또는 CEC 단계일 수 있고 pH 조건은 AEC 에 대한 단백질의 pI 보다 낮고 CEC 에 대한 단백질의 pI 보다 높은 pH 인 것으로 선택된다. 바람직하게는 이온 교환 단계의 pH 는 단백질의 pI 와 적어도 0.5, 1.0, 2.0 또는 3.0 pH 단위 다르다 (상이하다). 이와 관련하여 pI 는 단백질 조성물에서 단백질의 가장 산성 또는 염기성 이소형태의 pI, 또는 단백질의 가장 풍부한 이소형태의 pI 를 지칭할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 확립된 기법이므로 당업자는 본 발명의 방법을 실시하기에 적합한 pH 조건을 선택하는데 (즉, 비-페길화 단백질의 이온 교환 물질에의 결합을 선호하고 통과 용액에서 페길화 단백질이 물질을 통과하여 회수되는 것을 허용하는 pH 조건을 선택하는데) 어려움이 없을 것이다.
페길화 반응의 pH 는 이온 교환 단계 (AEC 단계 또는 CEC 단계) 의 pH 와 실질적으로 동일한 것으로 선택될 수 있다. 페길화 반응의 pH 는 이온 교환 단계의 pH 와 실질적으로 동일하도록 선택되어 페길화 반응로부터 생성된 단백질 혼합물이 이온 교환 물질 상에 직접 로딩되게 한다. 이와 관련하여 실질적으로 동일한은 1.0, 0.9, 0.8, 0.6, 0.7, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 pH 단위 내를 의미한다. 이러한 방법에서 제 1 혼합물은 페길화 반응으로부터 생성된 반응 생성물의 혼합물이다. 이러한 방법은 비교적 효율적이고 빠르다. 이와 관련하여 "직접 로딩" 은 반응 생성물의 혼합물의 pH 조정이 이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용되기 전에 수행되지 않음을 의미한다. 페길화 반응을 위한 완충액은 이온 교환 단계를 위한 완충액과 동일할 수 있다.
페길화 반응은 약 6.5 내지 9.5 의 pH 에서 수행될 수 있다. 페길화 반응의 pH 는 단백질의 pI 와 적어도 0.5, 1.0, 2.0 또는 3.0 pH 단위 상이하게 선택될 수 있으며, 단백질의 결합을 선호하는 pH 에서 이온 교환 물질에 반응 생성물의 혼합물이 직접 로딩될 수 있게 한다. 이와 관련하여, 비교적 중성 pH (예를 들어 pI 약 7.5) 를 갖는 단백질은 약 pH 9.5 에서의 반응에서 페길화될 수 있고 반응 생성물의 혼합물은 AEC 단계에 적용될 수 있다. 대안적으로, 약 7.5 의 pI 를 갖는 단백질은 약 pH 6.5 에서의 반응에서 페길화될 수 있고 반응 생성물의 혼합물은 CEC 단계에 적용될 수 있다. 페길화 반응의 pH 는 단백질의 pI 와 적어도 0.5, 1.0, 2.0 또는 3.0 pH 단위 상이하게 선택될 수 있고, 이온 교환 크로마토그래피의 모드 (AEC 또는 CEC) 는 그에 따라 선택될 수 있다. 이러한 방식으로 반응 생성물의 혼합물이 이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용될 수 있다.
본 맥락에서, 크로마토그래피 단계 (예컨대, AEC, CEC 또는 HIC) 는 혼합물 (예컨대 반응 생성물의 혼합물, 또한 본원에서 "제 1 혼합물"로 지칭됨; 또는 페길화 단백질 혼합물, 또한 본원에서 "제 2 혼합물"로 지칭됨) 로부터 "오염물" 을 제거할 수 있으며, 오염물은 바람직하지 않은 형태의 단백질이다. 오염물은 불순물로도 지칭될 수 있다. 예를 들어, 본 맥락에서 원하는 형태의 단백질은 모노-페길화 단백질이기 때문에, 크로마토그래피 단계는 비-페길화 단백질 또는 올리고-페길화 단백질을 제거할 수 있다. 크로마토그래피 단계는 또한 다른 오염물, 예컨대 단백질 응집물, 또는 페길화 반응물을 제거할 수 있다.
본 개시는 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 혼합물로부터 비-페길화 단백질을 제거하기 위한 AEC 매질 또는 CEC 매질의 사용을 제공한다. 단백질은 EPO 일 수 있다. AEC 매질의 사용은 본원에 개시된 바와 같이 모노-페길화 단백질의 제조 방법에서 수행될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 크로마토그래피 조건 및 크로마토그래피 물질은 스크리닝 과정을 사용하여 선택될 수 있다. 스크리닝 과정은 결합의 선택성에 대한 스크리닝을 허용할 수 있다. 결합의 선택성이 유리하다. 예를 들어 비-페길화 단백질의 AEC 물질에 대한 결합 및 페길화 단백질의 이온 교환 물질에 대한 비-결합을 선호하는 선택성에 대하여 이온 교환 물질 및 조건을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 올리고-페길화 단백질의 결합 및 모노-페길화 단백질의 비-결합을 선호하는 선택성에 대하여 HIC 물질 및 통과 조건을 스크리닝할 수 있다. 이온 교환 물질, 예컨대 AEC 물질 또는 CEC 물질의 스크리닝 과정은 비교적 낮은 전도도에서 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질의 혼합물을 이온 교환 물질에 적용한 다음, 증가하는 전도도 (예를 들어 염) 구배를 물질에 적용하여 용리액에서 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화의 외관을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 이 과정은 몇 가지 상이한 pH 값에서 수행될 수 있다. HIC 물질에 대한 스크리닝 과정은 비교적 높은 염 조건 하에 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질의 혼합물을 HIC 물질에 적용한 다음 감소하는 염 구배를 물질에 적용하여 용리액에서 비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화의 외관을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 물질 및 조건은 UV 크로마토그래피에 의해 용리액을 분석하고 크로마토그램에서 피크의 양호한 분리를 제공하는 물질 및 조건을 스크리닝함으로써 결합의 선택성을 평가할 수 있다.
PEG
폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG 는 중성 친수성 폴리에테르이다. 본 맥락에서 용어 "분자량" (단위: kDa) 은 중합체성 화합물로서의 PEG 가 정의된 분자량으로 수득되지 않지만 실제로 분자량 분포를 갖기 때문에 PEG 의 평균 분자량으로 이해되고; 용어 "약" 은 일부 PEG 분자, 또는 잔기가 지시된 분자량보다 더 무게가 나가고 약간 미만인 것을 의미하며, 즉 용어 "약" 은 이와 관련하여 PEG 분자의 95 % 가 지시된 분자량의 +/- 10 % 이내의 분자량을 갖는 분자량 분포를 의미할 수 있다. 예를 들어, 30 kDa 의 분자량은 27 kDa 내지 33 kDa 범위를 나타낼 수 있다.
PEG 잔기는 결합 반응에 필요한 추가의 화학적 기를 함유할 수 있으며, 이는 페길화 분자의 화학적 합성으로부터 생성되거나 분자의 부분의 최적 거리를 위한 스페이서이다. 이러한 추가의 화학적 기는 PEG 잔기의 분자량의 계산에 사용되지 않는다. 또한, 이러한 PEG 잔기는 함께 공유 연결된 하나 이상의 PEG 사슬로 이루어질 수 있다. 하나 초과의 PEG 사슬을 갖는 PEG 잔기는 멀티암(multiarmed) 또는 분지형 PEG 잔기로 지칭된다. 분지형 PEG 잔기는 예를 들어 폴리에틸렌 옥사이드를 각종 폴리올, 예컨대 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨에 첨가하여 제조될 수 있다. 분지형 PEG 잔기는 예를 들어, EP 0 473 084, US 5,932,462 에 보고되어 있다.
페길화 반응에 사용된 PEG 분자 및 페길화 단백질 상의 PEG 잔기는 각각 적어도 약 12 kDa, 또는 적어도 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 40 kDa, 또는 약 30 kDa 의 분자량을 가질 수 있다. PEG 잔기는 20 kDa 내지 35 kDa 의 분자량을 가질 수 있고 선형 PEG 잔기일 수 있다. PEG 잔기는 35 kDa 내지 40 kDa 의 분자량을 가질 수 있고 분지형 PEG 잔기일 수 있다.
모노-페길화 EPO 는 적어도 약 12 kDa, 또는 적어도 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 40 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa 의 분자량을 갖는 단일 PEG 잔기를 포함할 수 있다. PEG 잔기는 적어도 약 20 kDa 의 분자량을 가질 수 있다.
모노-페길화 단백질은 단일 PEG 잔기를 포함하는 단백질이다. 즉, 모노-페길화 단백질은 오직 하나의 PEG 잔기를 갖는다. 올리고-페길화 단백질은 적어도 2 개의 PEG 잔기를 포함한다. 예를 들어 올리고-페길화 단백질은 디-, 트리- 또는 테트라-페길화 단백질일 수 있다. 용어 올리고-페길화 단백질 (또는 폴리-페길화 단백질) 은 다양한 정도의 페길화 (2, 3, 또는 그 이상의 PEG 잔기) 를 갖는 올리고-페길화 단백질 분자의 그룹을 지칭할 수 있다. 용어 페길화 단백질은 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질을 지칭한다. 용어 페길화 단백질은 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질로 이루어진 단백질을 지칭한다. 비-페길화 단백질은 임의의 PEG 잔기를 포함하지 않는 단백질이다. 비-페길화 단백질은 또한 페길화 반응의 맥락에서 미반응 단백질로 지칭될 수 있다. 비-페길화 단백질은 천연 단백질, 또는 비-페길화 단백질 또는 유리 단백질로 지칭될 수 있다.
용어 "페길화" 는 PEG 잔기와 단백질의 공유 연결을 의미한다. 특히 이는 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 내부 리신 잔기에서의 공유 연결을 지칭할 수 있다. 단백질의 페길화는 당업계에 널리 공지되어 있으며 예를 들어, Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417 에 의해 검토된다. PEG 는 상이한 작용기 및 상이한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 및 분지형 PEG 뿐만 아니라 상이한 연결기를 사용하여 연결될 수 있다 (또한 Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier 30 Systems 9 (1992) 249-304 참조). 에리트로포이에틴의 페길화는 예를 들어 WO 00/44785 에 한 구현예에 기재되어 있는 바와 같이 5 kDa 내지 40 kDa 의 분자량을 갖는 NHS-활성화된 선형 또는 분지형 PEG 분자를 사용하여 페길화 시약을 사용하여 수용액에서 수행될 수 있다. Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229 에 따르면 페길화는 또한 고체 상에서 수행될 수 있다. 무작위적이지 않은 N-말단 페길화 폴리펩티드가 또한 WO 94/01451 에 따라 제조될 수 있다. 페길화 반응은 또한 WO 2009/010270 및 WO 2012/035037 에서 검토된다.
적합한 PEG 유도체는 약 5 내지 약 40 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa 의 평균 분자량을 갖는 활성화된 PEG 분자이다. PEG 유도체는 한 구현예에서 선형 또는 분지형 PEG 이다. PEG-단백질 및 PEG-펩티드 컨쥬게이트의 제조에 사용하기에 적합한 다양한 PEG 유도체는 Shearwater Polymers (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com) 로부터 수득될 수 있다. 활성화된 PEG 유도체는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368 에 기재되어 있다.
페길화 반응은 약 6.5 내지 9.5, 약 7.0 내지 9.0, 또는 약 7.5 내지 8.5, 또는 약 8.0 의 pH 에서 수행될 수 있다. 페길화 반응이 수행되는 pH 는 사용되는 PEG 시약에 따라 달라질 수 있다. PEG 시약은 mPEG-NHS, mPEG-SPA, mPEG-SVA 또는 mPEG-CI 일 수 있다. 페길화 반응은 (NHS) 활성화된 PEG 시약을 사용하여 약 7.0 내지 9.0, 또는 약 7.5 내지 8.5, 또는 약 8.0 의 pH 에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 약 15-25℃, 또는 약 18-22℃, 또는 약 20℃ 에서 수행될 수 있다. 페길화 반응은 적어도 약 20, 30, 40, 50 또는 60 분, 또는 약 30-90, 또는 30-60 분, 또는 약 40, 50, 또는 60 분 동안 수행될 수 있다.
페길화 반응은 완충액 및 염을 포함하는 용액에서 수행될 수 있다. 염은 Na2SO4 일 수 있고 완충액은 비신일 수 있다. 염은 5-10 mM 또는 약 7.5 mM 의 양으로 존재할 수 있다. 완충액은 약 10-50 mM, 20-30 mM 또는 약 25 mM 의 양으로 존재할 수 있다. 페길화 반응은 7.5 mM Na2SO4 및 25 mM 비신에서 수행될 수 있다.
EPO
용어 "에리트로포이에틴" 및 그 약어 "EPO" 는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 이에 실질적으로 상동성인 단백질 또는 폴리펩티드로서, 생물학적 특성이, 적혈구 세포 생산 자극 및 골수에 있어 헌신적 적혈구 전구체(committed erythroid progenitor)의 분열 및 분화의 자극과 관련되어 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합 에리트로포이에틴은, 재조합 DNA 기술 또는 내인성 유전자 활성화에 의해 진핵생물 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포 또는 HeLa 세포 내에서 발현을 통하여 제조될 수 있는데, 즉 에리트로포이에틴 당단백질은 내인성 유전자 활성화에 의해 발현된다 (예를 들어 US　5,733,761, US　5,641,670, US　5,733,746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO　90/11354, WO 91/06667 및 WO 91/09955 참조). EPO 는 인간 EPO 일 수 있다. EPO 는 글리코실화된 EPO 일 수 있다.
인간 EPO 는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 인간 EPO 는 SEQ ID NO: 1 에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 용어 "EPO" 는 또한 예를 들어 EP 1 064 951 또는 US 6,583,272 에 보고된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경, 결실 또는 삽입되었고, 변형되지 않은 단백질의 생물 활성과 거의 동일한 생물 활성을 갖는, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 의 단백질 변이체를 지칭한다. 변경, 결실 또는 삽입된 아미노산의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 또는 1-10 일 수 있다. 용어 EPO 는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 단백질을 지칭한다. 변이체는 글리코실화를 위한 추가 부위를 1개 내지 6개 가지는 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 페길화 에리트로포이에틴의 특이적 활성은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 확정될 수 있다. 정제된 페길화 에리트로포이에틴의 생물 활성으로 말미암아, 주사에 의한 인간 환자에의 단백질 투여는, 주사되지 않은 대상체 군 또는 대상체 대조군의 골수 세포 내에서와 비교되었을 때, 골수 세포 내 증가한 망상적혈구 및 적혈구세포 생산을 초래한다. 본원에 보고된 바와 같은 방법에 따라서 수득 및 정제된 페길화 에리트로포이에틴의 생물 활성은, Bristow, A, Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP 에리트로포이에틴 Bio 97-2 (1997) 31-48 에 따른 방법에 의해 시험될 수 있다.
EPO 의 아미노산 서열 변이체는, EPO 를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적당한 변형을 도입하거나, 또는 펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형으로서는, 예를 들어 에리트로포이에틴의 아미노산 서열 내 잔기들의 결실 및/또는 이 에리트로포이에틴 아미노산 서열에의 잔기들의 삽입 및/또는 이 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구조체를 달성하도록 이루어질 수 있는데, 다만 이 최종 구조체는 인간 EPO 생물 활성과 거의 동일한 생물 활성을 보유한다.
보존적 아미노산 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 하기 표에 제시되어 있다. 더욱 실질적인 변화가 "예시적 치환"이라는 표제 하에 이하에 기술된 바와 같이 아미노산 측쇄 군과 관련하여 제공되어 있다. 아미노산 치환은 인간 에리트로포이에틴에 도입될 수 있으며, 생성물은 인간 에리트로포이에틴 생물 활성의 보유 여부에 대해 스크리닝된다.
비보존적 치환은 이들 군 중 하나에 속하는 일원의 다른 군에 속하는 일원과의 교환을 수반할 것이다.
EPO 는 변이체 EPO 일 수 있다. EPO 는 다른 단백질과 융합 단백질에 포함될 수 있거나, 또는 PEG 외에 다른 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다.
에리트로포이에틴의 화학적 페길화는 일반적으로 리신 잔기의 ε-아미노기 하나 이상에서 및/또는 N-말단 아미노기에서 페길화된 에리트로포이에틴을 포함하는 단백질 제제를 생성한다. N-말단 아미노산에서의 선택적 페길화는 Felix (1997) 에 따라 수행될 수 있다. 선택적 N-말단 페길화는 고체상 합성이 진행되는 동안 Nα-페길화 아미노산 유도체의 펩티드 사슬 N-1 말단 아미노산에의 커플링에 의해 달성될 수 있다. 측쇄 페길화는 고체상 합성이 진행되는 동안 Nε-페길화 리신 유도체의 성장하는 사슬에의 커플링에 의해 수행될 수 있다. 조합된 N-말단 및 측쇄 페길화는 전술된 바와 같이 고체상 합성 중에 실현 가능하거나, 또는 활성화된 PEG 시약의 아미노 탈보호 펩티드에의 적용에 의한 용액상 합성에 의해 실현 가능하다.
Figure 112020078547254-pct00001
아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 하기와 같이 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬의 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 군 중 하나에 속하는 일원의 다른 군에 속하는 일원과의 교환을 수반할 것이다.
단백질
본 발명의 방법은 모노-페길화 EPO 조성물을 제조하는데 특히 적합하다. 단백질 또는 본원에서 관심 있는 단백질에 대한 언급은 EPO 를 참조할 수 있다.
본 발명의 방법은 다른 단백질, 특히 치료 단백질의 모노-페길화 단백질 조성물을 제조하는데 적합할 수 있다. 예를 들어 인터류킨-2 (IL-2), 페그인터페론 알파-2a, 인간 성장 호르몬 (hGH), 골 형성 단백질 2 (BMP-2), 골 형성 단백질 7 (BMP-7), 골 형성 단백질 15 (BMP-15), 뉴로트로핀-3 (NT-3), von Willebrand 인자 (vWF) 프로테아제, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 조직형 플라스미노겐 활성화제 (IPA), 렙틴, 히루딘, 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형 간염 표면 단백질 (HbsAg), 키메라 디프테리아 독소-IL-2, 인간 융모성 생식선 자극호르몬 (hCG), 갑상선 퍼옥시다제 (TPO), 알파-갈락토시다아제, 알파-L-이두로니다제, 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A, 산 a-글루코시다아제 (산 말타아제), 항-트롬빈 III (AT III), 모낭 자극 호르몬 (FSH), 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1), 글루카곤 유사 펩티드-2 (GLP-2), 섬유아세포 성장 인자 7 (FGF-7), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF-21), 섬유아세포 성장 인자 23 (FGF-23), 인자 X, 인자 XIII, 프로키네티신, 익스텐딘-4, CD4, 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R), a-CD20, P-셀렉틴 당단백질 리간드-I (PSGL-I), 컴플리먼트, 트랜스페린, 글리코실화-의존성 세포 접착 분자 (GlyCAM), 신경 세포 접착 분자 (N-CAM), INF 수용체-IgG Fe 영역 융합 단백질. 이러한 단백질은 또한 항체, 예컨대 호흡기 세포 융합 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스의 단백질 F, INF-a, 당단백질 IIb/IIIa, CD20, VEGF-A, PSGL-1, CD4, a-CD3, EGF, 암배아 항원 (CEA), TNFα 및 IL-2 수용체 중 어느 하나에 대한 단일 클론 항체를 포함한다.
본 발명의 방법은 단백질, 예컨대 호르몬, 사이토카인 또는 효소의 모노-페길화 조성물을 제조하는데 적합할 수 있다. 이러한 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다. 단백질은 인터페론-α-2a 또는 인터페론-α-2b 일 수 있다. 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자, 인간 성장 호르몬, 또는 요산 산화 효소일 수 있다.
본 발명은 비교적 짧은 반감기를 갖는 치료 단백질에 특히 유용한데, 페길화가 생체내 순환 반감기를 증가시키기 때문이다. 일반적으로 호르몬 및 사이토카인은 비교적 짧은 반감기를 갖는다. 보다 작은 생체 분자는 비교적 짧은 반감기를 갖는 경향이 있다. 비교적 작은 생체 분자의 약동학적 프로파일은 페길화에 의해 개선될 수 있으므로 본 발명은 또한 비교적 작은 치료 단백질에 특히 유용할 수 있다. 일반적으로 약 70 kDa 보다 작은 단백질 및 펩티드는 더 큰 단백질보다 신장 여과에 의해 제거될 가능성이 더 높다. 보다 작은 생체 분자, 또는 단백질은 약 70 kDa 미만의 분자량을 갖는 것들로 정의될 수 있다. 에리트로포이에틴은 약 37 kDa 의 분자량을 갖는다. 본 발명은 약 70 kDa 미만의 분자량을 갖는 치료 단백질 (비-페길화 형태) 에 유용하다. 본 발명은 약 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 또는 40 kDa 미만의 분자량을 갖거나, 또는 약 10-70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa, 또는 30-40 kDa 의 분자량을 갖는 치료 단백질에 유용하다. 본 발명은 약 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 또는 40 kDa 미만의 분자량을 갖거나, 또는 약 10-70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa, 또는 30-40 kDa 의 분자량을 갖는 호르몬 또는 사이토카인에 유용하다.
단백질은 항체일 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 생물학적 기능성 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, 단일-도메인 항체 (sdAb, 또는 dAB), 상보성 결정 영역 단편, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 미니바디, 디아바디 및 다중 특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨) 를 포함한다. 많은 항체 단편은 비교적 짧은 생체내 반감기를 갖는데, 이는 이들의 비교적 작은 크기 및 이들이 Fc 영역을 더 이상 갖지 않기 때문에 발생한다. 본 발명은 비교적 작은 크기를 갖는 항체 단편, 예컨대 단일-도메인 항체, Fabs, Fab's, 및 scFvs 에 특히 유용하다. 본 발명은 약 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 또는 40 kDa 미만의 분자량을 갖거나, 또는 약 10-70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa, 또는 30-40 kDa 의 분자량을 갖는 항체 단편에 유용하다.
모노-페길화 단백질 조성물은 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 모노-페길화 단백질 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 제형화될 수 있고/있거나, 생리학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 생리 식염수에서 제형화될 수 있다. HIC 단계의 평형화, 세척 또는 용리 완충액에 사용되는 염 및/또는 완충액은 모노-페길화 단백질 조성물을 약학 조성물로 제형화하기 전에 제거될 수 있다. 예를 들어 모노-페길화 단백질 조성물은 투석될 수 있다. 모노-페길화 단백질 조성물의 모노-페길화 단백질은 동결 건조될 수 있다. 모노-페길화 단백질 조성물의 모노-페길화 단백질은 약학 조성물에서 단리 및 재제형화될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 산업 규모 공정일 수 있다. 산업 규모 공정은 배치 당 또는 사이클 당 적어도 약 5g, 10g, 25g, 50g, 100g, 250g 또는 500g 을 생산하는 공정일 수 있다. 이와 관련하여 배치 또는 사이클은 본원에 개시된 바와 같은 모든 단계 a) 내지 c) 를 포함하는 공정일 수 있다. 산업 규모 공정은 AEC 단계에 적용되는 제 1 혼합물 (비-페길화, 모노-페길화 및 올리고-페길화 단백질 포함) 의 부피가 적어도 100L, 500L, 1000L, 5000L, 10000L, 50000L, 또는 100000L 인 공정일 수 있다.
본 발명은 이러한 조합이 명확하게 허용되지 않거나 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고 설명된 양태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
특정한 형태 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 또는 개시된 결과를 수득하기 위한 방법 또는 과정으로 표현된, 전술한 설명, 다음의 청구 범위, 또는 첨부된 도면에 개시된 특징은, 적절한 경우, 개별적으로, 또는 이러한 특징들의 임의의 조합으로, 본 발명을 다양한 형태로 구현하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 전술한 예시적인 구현예와 관련하여 설명되었지만, 본 개시가 주어질 때 당업자에게는 많은 등가 수정 및 변형이 명백할 것이다. 따라서, 상술한 본 발명의 예시적인 실시예는 예시적인 것이며 제한적인 것으로 간주되지 않는다. 설명된 구현예들에 대한 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본원에 제공된 임의의 이론적 설명은 독자의 이해를 향상시키기 위해 제공된다. 본 발명자들은 이러한 이론적 설명에 구속되고자 하지 않는다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 양태 및 구현예는 이제 첨부 도면을 참조하여 예로서 설명될 것이다. 추가의 양태 및 구현예는 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
명세서 및 하기의 청구 범위에 있어서, 문맥 상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는" 과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값, 및/또는 "약" 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 구현예는 하나의 특정 값 및/또는 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게, 선행사 "약" 의 사용에 의해 값이 근사치로 표현될 때, 특정 값이 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치와 관련하여 용어 "약" 은 임의적이며 예를 들어 +/- 10% 를 의미한다.
상기 언급된 모든 참고 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 청구 범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
8.0 에서 25 mM 비신 및 7.5 mM Na2SO4 중 NHS-활성화된 PEG 시약 (분자량 약 30 kDa) 을 사용하여 EPO 를 페길화하여 비-페길화 EPO, 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO 를 포함하는 반응 생성물의 혼합물 ("제 1 혼합물")을 제공하였다.
제 1 혼합물을 pH 8.0, 25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4 에서 AEC 에 적용하였다. AEC 수지는 Toyopearl SuperQ 650M 이었다. 이는 약 34 g/L 의 EPO 에 대한 동적 결합 능력을 갖는다. 용리는 pH 8 에서 25 mM 비신, 35 mM 소듐 설페이트로의 단계 용리에 의해 수행되었다. 용리에 의해 회수된 비-페길화 EPO 는 후속 페길화 반응으로 재순환되었고, 그 생성물 (후속 "제 1 혼합물") 은 제 2 AEC 단계에 적용되었다. 이 과정은 방법이 페길화 및 AEC 단계의 3 회 사이클을 포함하도록 다시 반복되었다.
AEC 단계에서 단백질 용리를 보여주는 크로마토그래프가 도 4 에 도시되어 있다. 3 개의 AEC 단계를 보여주는 3 개의 크로마토그래프가 도 5 에 도시되어 있으며, 이는 제 2 사이클에서 EPO 의 양은 제 1 사이클에서 보다 적고, 제 3 사이클에서 EPO 의 양은 제 2 사이클에서 보다 적다는 것을 보여준다.
표 1 은 다양한 중간 조성물의 함량을 보여준다. 페길화 생성물은 "제 1 혼합물" 이고, 생성물 풀은 AEC 통과 용액이고, epo 풀은 AEC 용리액이다.
[표 1]
Figure 112020078547254-pct00002
이어서 올리고-페길화 EPO 로부터 모노-페길화 EPO 를 분리하는 HIC 의 능력을 결합 및 용리 모드 및 통과 모드에서 조사하였다.
결합 및 용리 모드에서 HIC 수지는 Toyopearl Phenyl-650M 이었다. 수지는 pH 8.0 에서 25 mM 비신 및 500 mM Na2SO4 로 평형화되었다. 수지에 적용된 혼합물은 시험 목적으로 비-페길화 EPO, 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO 를 포함하였다. 혼합물을 pH 8.0 에서 25 mM 비신 및 500 mM Na2SO4 로 컨디셔닝하고 HIC 수지에 적용하였다. 500 mM 에서 0 mM Na2SO4 로 감소하는 염 농도의 용리 구배를 적용하였다. 도 6 은 EPO 가 통과되고, 모노-페길화 EPO 가 비교적 높은 염에서 용리되는 반면 올리고-페길화 EPO 는 비교적 낮은 염에서 용리되는 것을 보여주는 크로마토그램이다.
통과 모드에서 HIC 수지는 Toyopearl Phenyl-650M 이었다. 수지는 pH 8.0 에서 25 mM 비신 및 390 mM Na2SO4 로 평형화되었다. 수지에 적용된 혼합물은 모노-페길화 EPO 및 올리고-페길화 EPO 를 포함하였고, 유의한 양의 비-페길화 EPO 는 함유하지 않았으므로 본 발명에 따른 "제 2 혼합물" 을 나타낸다. 혼합물을 pH 8.0 에서 비신 및 Na2SO4 로 컨디셔닝하고 HIC 수지에 적용하였다. 염 농도를 390 mM 로 조정하였다. 도 7 은 모노-페길화 EPO 가 통과되는 것을 보여주는 크로마토그램이다. 올리고-페길화 EPO 는 감소하는 염 구배를 사용하여 용리되었다.
실시예 2
EPO 의 페길화
EPO 저장 용액을 해동시키고, 3 kDa Centricon 원심 분리 필터를 사용하여 6.5 g/ℓ 로 농축시키고, 25 mM 비신, pH 8 에서 완충시켰다. 이어서, 7.7 ㎖ 의 이 용액을 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고 0.3 ㎖ 의 25 mM 비신, pH 8 완충액과 혼합하였다. 96 mg 의 PEG 시약을 칭량하고 3 ㎖ 의 1 mM HCl 에 용해시켜 페길화 용액을 제조하였다.
페길화 반응은 2 ㎖ 의 페길화 용액 (분자량 약 30 kDa) 을 EPO 용액에 첨가함으로써 시작되었다. 반응을 수조에서 20℃ 에서 50 분 동안 수행하였다.
이온 크로마토그래피를 이용한 주기적 페길화 및 정제
제 1 단계로서, 페길화 EPO 를 상기 개략된 바와 같이 제조하였다. 1 ㎖ 의 페길화 EPO 용액을 에펜도르프 컵에 옮기고, 50 ㎖ 시린지를 사용하여 나머지 9 ㎖ 를 150 ㎖ Superloop 에 주입하고 음이온 교환 크로마토그래피를 시작하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로서 직경 1 cm 의 16 ㎖ Toyopearl SuperQ-650M 을 사용하였다. 컬럼을 25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4, pH 8 완충액으로 평형화시켰다. 용리는 pH 8 에서 25 mM 비신, 35 mM 소듐 설페이트로의 단계 용리에 의해 수행되었다. 상응하는 크로마토그램이 도 8A 에 도시되어 있다.
1 ㎖ 의 분획 1B3 을 제거하고 그 조성을 HPLC 로 측정하였다. 이어서, 분획 1B3 내지 1C1 을 조합하고, 이 혼합된 분획의 1 ㎖ 샘플의 조성을 또한 RP HPLC 로 측정하였다. 단백질 농도를 광도계로 측정하고, 1.25 의 흡광 계수에서 0.097 g/ℓ 였다. 이 혼합된 분획 (AEC 용리액) 은 용리 단계로부터의 것이다.
나머지 21 ㎖ 의 혼합된 분획을 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고 재개된 페길화를 위해 20℃ 수조에 넣었다. 1 ㎖ 의 26.89 g/ℓ 페길화 시약 용액을 첨가하고 제 2 페길화 반응을 시작하였다.
AEC 용리액 (EPO-분획) 은 상기 개략된 바와 같이 제 1 크로마토그래피의 용리 완충액과 동일한 조건 (35 mM 소듐 설페이트) 에 있다. 50 분 후, 반응 용액을 25 mM 비신 완충액으로 4.66 배 희석하여 평형 조건으로 조정하였다. 수득된 97.9 ㎖ 샘플을 150 ㎖ Superloop 에 다시 주입하고 제 2 크로마토그래피를 시작하였다. 크로마토그래피 방법은 보다 큰 샘플 부피에 대해서만 변경되었다. 다른 모든 파라미터 및 성분은 변경되지 않았다. 상응하는 크로마토그램이 도 8B 에 도시되어 있다.
분획 2A3 내지 2A5 를 다시 풀링하고 상기 절차를 제 3 사이클로서 반복하였다.
제 3 크로마토그래피의 분획 1A1 내지 1C5 를 조합하고 3 kDa Centricon 원심 분리 필터를 사용하여 농축시켰다.
분획 2A1 내지 2A3 의 농축물 및 풀은 RP HPLC 에 의해 측정되었다. 상응하는 크로마토그램이 도 8C 에 도시되어 있다.
페길화 반응 및 희석 단계의 모든 피펫팅된 부피가 표 2 에 열거되어 있다.
[표 2]
표 2 - 출발 성분 및 샘플의 부피
Figure 112020078547254-pct00003
결과 및 논의
RP HPLC 분석의 측정 결과는 표 3 에 제시되어 있다. 주기적 페길화 EPO 풀에서 EPO 의 질량 백분율은 평균 약 95% 이다.
[표 3]
표 3 - 페길화 반응 및 크로마토그래피 분리 전후의 조성
Figure 112020078547254-pct00004
각각의 사이클뿐만 아니라 전체 공정에 대한 질량 균형이 표 4 에 열거되어 있다. 생성물 풀에 대한 정보는 측정된 값을 기반으로 하지 않지만 계산되었다.
[표 4]
표 4 - 질량 균형
Figure 112020078547254-pct00005
공정 종료시 모든 샘플에 대해 95.5% 가 회수되었다. 샘플링 및 분석으로 인해 총 단백질의 4.5% 손실이 관찰되었다. EPO 풀 1 및 EPO 풀 2 는 페길화 2 및 3 에서 소비되었다. 초기 EPO 의 63.6% 가 모노-PEG-EPO 로 전환되었다. 중간 풀 중 모노-PEG-EPO 함량 82.0%.
질량 균형에 기초하여, 1.4% Epo, 82.0% 모노-PEG Epo 및 16.6% 올리고-형태의 혼합물로서 존재하는 사용된 50 mg 비-페길화 EPO 로부터 32.5 mg 의 모노-페길화 EPO 가 제조될 수 있음을 알 수 있다. 따라서, AEC 단계는 82 % 모노-페길화 EPO (82% 순도) 포함하는 용액 (AEC 통과 용액) 을 생성하였다.
모노-PEG-EPO의 반응 수율은 63.6% 이다. 즉, 공정 시작시 EPO 단백질의 양 (50 mg) 63.6% 가 모노-페길화 EPO (32.5 mg) 로 전환되었다. 페길화 반응이 약 44% 의 수율로 한 번만 수행되는 WO 2009/010270 의 선행 기술 방법과 비교하여, 이는 약 44% 의 수율 증가에 해당한다.
이 실험에서 기술적인 이유로 제 2 페길화 반응 이후에 AEC 의 통과에서 모든 EPO 를 제거할 수 없었다. 따라서, 제 2 반응의 생성된 조성물은 예상 값과 다르다. 페길화 1 및 3 은 약 50 % EPO, 40 % 모노-PEG-EPO 및 <10% 올리고-PEG-EPO 를 생성하였다. 제 2 페길화 반응은 덜 효과적이어서, 단지 33% 의 모노-PEG EPO 및 5% 의 올리고-PEG-EPO 를 생성하였다.
이러한 결과는 AEC 가 많은 페길화 형태 없이 페길화 반응 혼합물로부터 미반응 EPO 를 단리 및 회수할 수 있음을 입증한다. 회수된 EPO 분획에서 페길화 형태의 합은 약 5% 이며, 이는 이러한 특정 실험에 사용된 AEC 컬럼이 너무 크기 때문일 수 있다. 적당한 크기일 때, 페길화 종의 용량은 변위 효과 또는 리간드에 대한 경쟁으로 인해 감소될 것으로 예상된다.
이들 결과는 또한 사이클 1 및 사이클 3 에서 음이온 교환 크로마토그래피를 적용함으로써 거의 정량적으로 EPO 를 제거할 수 있음을 보여준다. 중간 생성물은 통과에서 컬럼을 통과하고, 일반적으로 약 80% 모노-PEG-EPO 및 20% 올리고-PEG-EPO 의 조성을 갖는다.
실시예 3
주기적 페길화, AEC 크로마토그래피에 의한 에리트로포이에틴의 제거 및 HIC 에 의한 모노-PEG EPO 의 정제
이 실험의 목적은 EPO 를 3 사이클에서 페길화하고 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 및 HIC 를 사용하여 반응 생성물 (비-페길화 EPO, 단일 페길화 EPO (모노-PEG EPO) 및 EPO 의 올리고-페길화 형태) 을 분리하는 것이다.
AEC 단계에서 EPO 를 제거하기 위해, Tosoh Bioscience 의 Toyopearl SuperQ-650M 을 흡착제로 사용하였다. 이는 강력한 음이온 교환기이다. HIC 단계에서 올리고 형태로부터 모노-PEG EPO 를 분리하기 위해, Tosoh Bioscience 의 Toyopearl Phenyl-650M 을 사용하였다.
AEC 컬럼의 디자인
내부 직경이 7 mm 이고 베드 높이가 100 mm 인 컬럼을 Toyopearl SuperQ-650M 흡착제 물질로 패킹하고 200 cm/h (1.28 ml/min) 의 유속으로 작동시켜 3.847 ㎖ 의 컬럼 부피에서 약 30 min 의 공정 단계 시간을 수득하였다.
주기적 페길화 및 AEC
25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4 중 12.5 g/ℓ 의 농도를 갖는 EPO 저장 용액을 사용하였다. 225 mg EPO 에 상응하는 18 ㎖ 의 이 저장 용액의 출발 부피를 사용하였다.
제 1 페길화 반응을 위해, 18 ㎖ 의 EPO 저장 용액을 22.5 ㎖ 의 25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4 와 혼합하고 50 ㎖ 팔콘 튜브에 넣었다.
328 mg 의 PEG 시약 (분자량 약 30 kDa) 을 15 ㎖ 팔콘 튜브에 칭량하고 4.97 ㎖ 의 1 mM HCl 에 용해시켰다.
반응을 시작하기 위해, 4.5 ㎖ 의 PEG 시약 용액을 40.5 ㎖ EPO 용액에 피펫팅하였다.
반응 혼합물을 300 rpm 으로 혼합하고, 온도를 크라이오스탯(cryostat)에 의해 20℃ 로 조정하였다.
반응을 60 분 동안 수행하였다. 이어서 농도를 280 nm 에서 광도계로 측정하고 250 ㎕ 샘플을 취하였다. 농도는 5.56 g/ℓ 였다. 나머지 용액으로부터 전도도를 측정하였다. 전도도는 2.19 mS/cm 이었으며, AEX 크로마토그래피의 평형 조건 (2.21 mS/cm) 으로의 컨디셔닝은 수행되지 않았다. 나머지 44.8 ㎖ 용액을 AEC 에 의해 정제하였다. 이는 25 mM 비신, 7.5 mM Na2SO4, pH 8 로 평형화되었다.
용리는 25 mM 비신, 35 mM Na2SO4 로 단계적으로 수행되었다. 분획 1B1-1B4 를 서로 조합하여 16.5 ㎖ 를 제조하였으며 이후 EPO 풀 1 로 지칭할 것이다. EPO 풀 1 의 농도를 5.263 g/ℓ 에서 광도계로 측정하였다. 200 ㎕ 샘플을 취하였다.
분획 1A1-1A5 를 조합하여 62.17 ㎖ 를 제조하였으며 이후 생성물 풀 1 로 지칭한다. 이것의 농도는 2.27 g/ℓ 였다. 500 ㎕ 샘플을 취하였다.
나머지 부피의 EPO 풀 1 을 제 2 페길화를 위해 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮겼다. 164.73 mg 의 PEG 시약을 칭량하고 2.4 ㎖ 의 1 mM HCl 로 용해시켰다. 1.62 ㎖ 의 이 용액을 EPO 풀 1 에 첨가하고 제 2 페길화 반응을 시작하였다. 반응을 다시 20 ℃ 에서 60 분 동안 수행하였다. 이어서 농도를 측정하고 250 ㎕ 샘플을 취하였다. 농도는 4.73 g/ℓ 였다.
나머지 용액의 전도도를 22 ㎖ 의 25 mM 비신, pH 8 완충액을 사용하여 2.1 mS/cm 의 전도도로 조정하고 크로마토그래피로 정제하였다.
제 2 크로마토그래피의 분획 1B2-1B4 를 조합하여 EPO 풀 2 를 제조하였다. 부피는 15 ㎖ 였다. 500 ㎕ 샘플을 취하였다. 농도 측정은 2.5 g/ℓ 의 농도를 제공하였다.
분획 1A1-1A5 를 62.7 ㎖ 의 생성물 풀 2 와 조합하였다. 2 ㎖ 샘플을 취하였다. 농도는 0.75 g/ℓ 였다.
나머지 부피의 EPO 풀 2 를 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮겼다. 119.4 mg 의 PEG 시약을 칭량하고 1.9 ㎖ 의 1 mM HCl 로 용해시켰다. 1.72 ㎖ 의 이 용액을 EPO 풀 2 에 첨가하고 제 3 페길화 반응을 시작하였다. 반응을 다시 20 ℃ 에서 수행하였다. 60 분의 반응 시간 후, 농도를 측정하고 500 ㎕ 샘플을 취하였다. 농도는 2.8 g/ℓ 였다.
25 mM 비신 완충액을 사용하여 반응 생성물을 평형 조건으로 다시 조정하고 크로마토그래피로 정제하였다.
분획 1C2-1C5 을 조합하여 15 ㎖ EPO 풀 3 을 제조하였다. 이것으로부터 4 ㎖ 샘플을 취하였다. 농도는 0.429 g/ℓ 였다.
분획 1A1-1C1 을 조합하여 160.5 ㎖ 의 생성물 풀 3 을 제조하였다. 농도는 0.15 g/ℓ 였다. 10 ㎖ 샘플을 취하였다.
HIC 를 사용한 모노-PEG EPO 의 정제
10 mm 의 내부 직경을 갖는 220 mm 높이 컬럼을 사용하였다. 사용된 흡착제는 Tosoh 의 Toyopearl Phenyl-650M 이었다. 컬럼의 부피는 17.27 ㎖ 였다. 이를 150 cm/h 의 유량으로 작동시켰다. 이 컬럼을 사용하여 모노-PEG EPO 및 올리고의 혼합물로부터 목표 생성물 모노-PEG EPO 를 추출하였다.
이러한 목적을 위해, 두 가지 실험이 수행되었다. 첫 번째로, 모노-PEG EPO 및 올리고를 컬럼 물질에 결합시킨 다음 구배를 통해 선택적으로 용리하였다. 두 번째로, 올리고 형태를 컬럼 물질에 결합시키고 모노-PEG EPO 는 결합시키지 않았다.
HIC 결합 및 용리 모드에서의 분리
상기 기재된 생성물 풀 1 (본원에 개시된 방법에 따른 "제 2 혼합물"; 단백질 농도 2.27 g/ℓ) 로부터 15 ㎖ 를 취한 다음 20 ml, 25 mM 비신, 1 M Na2SO4 pH 8 용액을 사용하여 56 mS/cm 의 전도도로 조정하였다. 이 샘플을 150 ㎖ Superloop 통해 완전히 분배하였다.
Phenyl-650M 컬럼을 평형화하기 위해, 25 mM 비신, 500 mM Na2SO4, pH 8 완충액을 사용하였다. 15 CV 동안 500 mM Na2SO4 에서 0 mM Na2SO4 의 구배를 사용하여 용리를 수행하였다. 상응하는 크로마토그램은 도 9 에 도시되어 있다.
분획 1A1 - 1B1, 1B5 - 2A3 및 2A4 내지 2B4 를 각각 풀링하고 RP-HPLC 에 의해 이들의 조성을 분석하였다.
HIC 통과 모드에서의 분리
47.03 mg 의 단백질 수준에 상응하고, 0.58% EPO, 79.9% 모노-PEG EPO 및 19.52% 올리고 형태로 구성된, 완전한 62.7 ㎖ 의 생성물 풀 2 (본원에 개시된 방법에 따른 "제 2 혼합물") 를 분리를 위한 샘플로서 사용하였다. 샘플의 전도도는 25 mM 비신, 1 M Na2SO4, pH 8 완충액을 사용하여 목표 50 mS/cm 의 전도도로 조정되었고, 150 ㎖ Superloop 를 통해 주입되었다.
HIC 수지는 25 mM 비신, 390 mM Na2SO4 를 사용하여 평형화되었다. 390 mM Na2SO4 에서 0 mM Na2SO4 의 구배로 용리를 수행하였다. 상응하는 크로마토그램이 도 10 에 도시되어 있다.
실제로 샘플은 의도하지 않게 (목표 50 mS/cm 가 아닌) 56 mS/cm 로 조정되었다. 따라서 단계적 브레이크스루 곡선은 도 10 에서 볼 수 있다. 처음에는 EPO 만 통과한다. 약 80 ㎖ 후 UV 신호는 모노-PEG-EPO 의 브레이크스루로 인해 약 120 mAU 로 상승한다. 전도도가 전이에서 로드로부터 로드 후 평형으로 감소하면 초기에 결합된 모노-PEG-EPO 의 피크가 용리된다. 올리고-PEG-EPO 형태는 다음의 구배에서 용리된다. 그럼에도 불구하고 올리고-PEG-EPO 로부터의 모노-PEG-EPO 의 분리가 나타났다. 미반응 EPO 수준이 제품 사양의 목표값보다 높으면 통과 모드는 적합하지 않다.
결과 및 논의
주기적 페길화 및 AEC
표 5 는 개별 샘플의 조성 및 단백질 양의 균형을 보여준다.
[표 5]
표 5 - 공정 동안 개별 샘플의 조성, 질량 및 부피
Figure 112020078547254-pct00006
Figure 112020078547254-pct00007
AEC 의 제 1 사이클이 실수로 오버 로딩되었다. 이로 인해 이 실험에서 미 반응 EPO 의 회수는 단지 약 78% 이다. 컬럼에 EPO 가 오버 로딩되었기 때문에 용리 풀에 페길화 형태가 없다. 이는 AEC 컬럼의 적절한 사이징이 AEC 용리 풀에서 페길화 형태의 함량을 감소시켜 중간 풀에서 페길화 형태의 수율을 최대화한다는 것을 입증한다. 페길화 2 및 3 에 EPO 가 완전히 로딩되지 않은 후 AEC 가 실행되므로 용리 풀에 소량의 페길화-EPO 가 있으며, 두 경우 모두 <2% 이다.
페길화 1 및 2 의 결과는 반응 결과의 일관성을 보여준다. 선택된 조건 하에서 결과는 약 50% EPO, 40% 모노-PEG-EPO 및 <10% 올리고-PEG-EPO 이다.
최종 페길화로서의 페길화 3 은 가능한 최대 모노-PEG-EPO 함량의 형성을 선호하기 위해 상이한 조건을 사용한다. 이는 46% 모노-PEG-EPO 함량에서 잘 작동했다.
각각의 중간 생성물 풀의 조성은 상이하다. 제 1 통과 작업의 풀은 약 10% EPO (상기 언급된 브레이크스루로 인함), 72% 의 모노-PEG-EPO 및 16% 의 올리고-PEG EPO 로 이루어진다. EPO 의 브레이크스루 없이 조성은 실행 2 (80% 모노-PEG-EPO 및 20% 올리고-PEG-EPO) 와 동일했을 것이다. 제 3 실행은 상이한 페길화 조건을 사용하며, 이는 반응 혼합물에서 더 높은 함량의 올리고-PEG-EPO 를 생성하였다. 이는 59% 모노-PEG-EPO 및 41% 올리고 Peg EPO 의 풀 조성으로 해석된다.
"페길화 반응 + AEC 에 의한 EPO 회수" 의 3 사이클 후 중간 풀에서 모노-PEG-EPO 의 총 수율은 68.4% 이다. 이는 원래 공정보다 이미 >50% 우수하지만 제 1 AEC 실행의 통과 로딩 동안 유의한 양의 EPO 손실이 없으면 훨씬 더 양호할 수 있다.
HIC 에 의한 모노-PEG EPO 의 정제 - 결합 및 용리 모드에서 분리
표 5 는 RP HPLC 분석의 결과를 보여준다.
[표 5]
표 5 -결합 및 용리 모드에서 HIC 풀에 대한 RP-HPLC 분석 데이터
Figure 112020078547254-pct00008
EPO 를 함유하는 AEC 실행 1 로부터의 중간체 풀을 사용하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 최종 정제 단계의 성능을 나타냈다. EPO 및 모노-PEG-EPO 풀은 100% 순수하다. 소량의 모노-PEG-EPO 가 올리고-PEG-EPO 풀에서 여전히 발견될 수 있다.
HIC 에 의한 모노-PEG EPO 의 정제 - 통과 모드에서 분리
개별 분획의 낮은 단백질 농도로 인해 RP HPLC 를 사용하여 의미 있는 결과를 생성할 수 없었다. 그러나, 크로마토그램은 비-페길화 및 올리고-페길화 형태로부터의 모노-페길화 EPO 의 분리가 달성되었음을 보여준다.
참고 문헌
본 발명 및 본 발명이 속하는 기술적 수준을 보다 완전하게 기술하고 개시하기 위해 다수의 공보가 상기에 인용되었다. 이러한 참고 문헌에 대한 전체 인용은 다음과 같다. 이들 참고 문헌 각각의 전문이 모든 목적을 위해 참고로 본원에 포함된다.
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다음의 번호가 매겨진 진술은 본 개시의 양태와 관련되고 설명의 일부를 형성한다.
1. 하기 단계를 포함하는, 적어도 약 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법:
a) 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 제 1 혼합물을 제공하는 단계, 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함;
b) 제 1 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가된 IEC 통과 용액을 제공하는 단계; IEC 단계는 비-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에서 제 1 혼합물을 IEC 물질에 적용하는 것을 포함함;
c) 단계 b) 로부터의 IEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 제 2 혼합물을 제공하는 단계; 및
d) 제 2 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 단계, 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
2. 진술 1 에 있어서, 단백질이 호르몬, 사이토카인, 효소 또는 항체인 방법.
3. 진술 1 또는 진술 2 에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법.
4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, IEC 단계가 AEC 단계인 방법.
5. 하기 단계를 포함하는, 적어도 약 90% 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법으로서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법:
e) 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 제 1 혼합물을 제공하는 단계, 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함;
f) 제 1 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 제 1 혼합물에 비해 증가된 AEC 통과 용액을 제공하는 단계; AEC 단계는 비-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에서 제 1 혼합물을 AEC 물질에 적용하는 것을 포함함;
g) 단계 b) 로부터의 AEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 제 2 혼합물을 제공하는 단계; 및
h) 제 2 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 단계, 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, IEC 물질이 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 방법.
7. 진술 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, AEC 물질이 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 방법.
8. 진술 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. 제 1 혼합물은 25% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함함; 및/또는
ii. IEC 통과 용액은 적어도 90% 의 페길화 단백질을 포함함; 및/또는
iii. 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 99.9% 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. 제 1 혼합물은 25% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함함; 및/또는
ii. AEC 통과 용액은 적어도 90% 의 페길화 단백질을 포함함; 및/또는
iii. 모노-페길화 단백질 조성물은 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 99.9% 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 단계 a) 가 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시키는 것을 포함하는 페길화 반응을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
11. 진술 10 에 있어서, 페길화 반응이 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행되고, PEG/단백질 몰비가 약 0.6 - 1.0 인 방법.
12. 진술 10 또는 진술 11 에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
단계 a), b) 및 c) 를 포함하는 제 1 사이클을 수행하는 것, 여기서 단계 b) 는 IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리하여 IEC 용리액을 제공하는 것을 추가로 포함함, 및
단계 a), b) 및 c) 의 제 2 사이클을 수행하는 것, 여기서 제 1 사이클의 단계 b) 에서 용리된 비-페길화 단백질이 단계 a) 의 페길화 반응에 첨가됨.
13. 진술 10 또는 진술 11 에 있어서, 하기를 포함하는 방법으로서, IEC 단계는 AEC 단계인 방법:
단계 a), b) 및 c) 를 포함하는 제 1 사이클을 수행하는 것, 여기서 단계 b) 는 AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리하여 AEC 용리액을 제공하는 것을 추가로 포함함, 및
단계 a), b) 및 c) 의 제 2 사이클을 수행하는 것, 여기서 제 1 사이클의 단계 b) 에서 용리된 비-페길화 단백질이 단계 a) 의 페길화 반응에 첨가됨.
14. 진술 12 에 있어서, IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것이 약 45 mM 이하의 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하는 방법.
15. 진술 13 에 있어서, AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것이 약 45 mM 이하의 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하는 방법.
16. 진술 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 방법이 3, 4 또는 5 개의 사이클을 포함하고, 각 사이클의 단계 b) 는 IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리하여 IEC 용리액을 제공하는 것을 포함하고, 단계 b) 에서 용리된 비-페길화 단백질은 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 첨가되는 방법.
17. 진술 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, IEC 단계가 AEC 단계인 방법으로서, 방법이 3, 4 또는 5 개의 사이클을 포함하고, 각 사이클의 단계 b) 는 AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리하여 AEC 용리액을 제공하는 것을 포함하고, 단계 b) 에서 용리된 비-페길화 단백질은 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 첨가되는 방법.
18. 진술 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 사이클의 단계 b) 로부터의 IEC 용리액이 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 직접 첨가되는 방법.
19. 진술 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, IEC 단계가 AEC 단계인 방법으로서, 사이클의 단계 b) 로부터의 AEC 용리액이 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 직접 첨가되는 방법.
20. 진술 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 사이클의 단계 b) 에서 용리된 비-페길화 단백질이 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 첨가되고, 각 사이클의 단계 a) 에서 실질적으로 일정한 페길화 반응 조건을 유지하기 위해 새로운 비-페길화 단백질이 또한 단계 a) 에 첨가되는 방법.
21. 진술 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 단계 a), b) 및 c) 의 2 이상의 사이클을 수행하는 것을 포함하고,
단계 c) 는 각각의 IEC 단계로부터 수집된 통과 용액을 풀링하여 풀링된 제 2 혼합물인 제 2 혼합물을 제공하는 것을 추가로 포함하고,
단계 d) 는 제 2 혼합물을 HIC 단계에 적용하는 것을 포함하는, 방법.
22. 진술 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 단계 a), b) 및 c) 의 2 이상의 사이클을 수행하는 것을 포함하고,
단계 c) 는 각각의 AEC 단계로부터 수집된 통과 용액을 풀링하여 풀링된 제 2 혼합물인 제 2 혼합물을 제공하는 것을 추가로 포함하고,
단계 d) 는 제 2 혼합물을 HIC 단계에 적용하는 것을 포함하는, 방법.
23. 진술 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, IEC 단계가 AEC 단계인 방법으로서, 하기와 같은 방법:
i. AEC 물질은 Toyopearl Super Q 650 M 임; 및/또는
ii. AEC 단계는 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행됨; 및/또는
iii. AEC 단계는 약 1.0 내지 3.0 mS/cm 의 전도도에서 수행됨; 및/또는
iv. 제 1 혼합물은 약 10 - 30 mM 비신 및 약 1 - 10 mM Na2SO4 를 포함하는 AEC 로드 용액으로서 AEC 물질에 적용됨.
24. 진술 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 d) 가 제 2 혼합물을 통과 모드에서 HIC 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가된 HIC 통과 용액을 제공하는 것을 포함하고,
HIC 단계는 올리고-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에 제 2 혼합물을 HIC 물질에 적용하는 것을 포함하고, HIC 통과는 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법.
25. 진술 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 d) 가 제 2 혼합물을 결합 및 용리 모드에서 HIC 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 제 2 혼합물에 비해 증가된 HIC 용리액을 제공하는 것을 포함하고, HIC 단계는
모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에서 제 2 혼합물을 HIC 물질에 적용하는 것,
HIC 물질로부터 모노-페길화 단백질을 용리하여 HIC 용리액을 제공하는 것, HIC 용리액은 모노-페길화 단백질을 제공함
을 포함하는, 방법.
26. 진술 24 에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. HIC 물질은 Toyopearl Phenyl 650M 임; 및/또는
ii. HIC 단계는 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행됨; 및/또는
iii. HIC 단계는 약 30-40 mS/cm 의 전도도에서 수행됨; 및/또는
iv. 제 2 혼합물은 약 25 mM 비신 및 약 390 mM Na2SO4 를 포함하는 HIC 로드 용액으로서 HIC 물질에 적용됨.
27. 진술 25 에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. HIC 물질은 Toyopearl Phenyl 650M 임; 및/또는
ii. HIC 단계는 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행됨; 및/또는
iii. HIC 물질로부터 모노-페길화 단백질을 용리하는 단계는 약 50 mS/cm 에서 0 mS/cm 의 구배를 적용하는 것을 포함함; 및/또는
iv. 제 2 혼합물은 약 25 mM 비신 및 약 390 mM Na2SO4 를 포함하는 HIC 로드 용액으로서 HIC 물질에 적용됨.
28. 진술 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. IEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨; 또는
ii. 페길화 반응, IEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨.
29. 진술 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. AEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨; 또는
ii. 페길화 반응, AEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨.
30. 진술 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 모노-페길화 단백질이 적어도 약 20 kDa 의 분자량을 갖는 PEG 잔기를 포함하는 방법.
31. 진술 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 단백질 조성물을 약학적으로 허용되는 담체와 제형화하여 약학 조성물을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
32. 하기를 포함하는, 페길화 단백질 혼합물의 제조 방법:
a) 비-페길화 단백질과 페길화 시약을 반응시켜 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하는 단계, 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함;
b) 반응 생성물의 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가된 IEC 통과 용액을 제공하는 단계;
IEC 단계는 비-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에서 반응 생성물의 혼합물을 IEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및
c) 단계 b) 로부터의 IEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계,
단계 a), b) 및 c)의 2 이상의 사이클이 수행되고, 비-페길화 단백질은 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 단계 b)에서 회수되고 용리된 비-페길화 단백질은 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 사용됨.
33. 진술 32 에 있어서, 단백질이 호르몬, 사이토카인, 효소 또는 항체인 방법.
34. 진술 32 또는 진술 33에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법.
35. 진술 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, IEC 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 인 방법.
36. 하기 단계를 포함하는, 페길화된 단백질 혼합물의 제조 방법으로서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법:
a) 비-페길화 단백질과 페길화 시약을 반응시켜 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하는 단계, 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함;
b) 반응 생성물의 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가된 AEC 통과 용액을 제공하는 단계;
AEC 단계는 비-페길화 단백질의 결합에 적합한 조건 하에서 반응 생성물의 혼합물을 AEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및
c) 단계 b) 로부터의 AEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계,
단계 a), b) 및 c)의 2 이상의 사이클이 수행되고, 비-페길화 단백질은 AEC 물질로부터 AEC 용리액을 용리함으로써 단계 b)에서 회수되고 용리된 비-페길화 단백질은 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 사용됨.
37. 진술 32 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 반응 생성물의 혼합물이 적어도 약 20%의 비-페길화 단백질을 포함하는 방법.
38. 진술 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 방법이 3, 4 또는 5 개의 사이클을 포함하고, 각 사이클의 단계 b)에서 비-페길화 단백질이 회수되어 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에서 사용되는 방법.
39. 진술 32 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)가 각각의 IEC 단계로부터 수집된 통과 용액을 풀링하여 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
40. 진술 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)가 각각의 AEC 단계로부터 수집된 통과 용액을 풀링하여 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
41. 진술 32 내지 40 중 어느 하나에 있어서, IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것이 약 45 mM 이하의 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하는 방법.
42. 진술 35 내지 40 중 어느 하나에 있어서, AEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리시키는 것이 약 45 mM 이하의 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하는 방법.
43. 진술 32 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 사이클의 IEC 용리액이 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가되는 방법.
44. 진술 35 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 사이클의 AEC 용리액이 다음 사이클의 단계 a)의 페길화 반응에 직접 첨가되는 방법.
45. 진술 32 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 비-페길화 단백질이 회수되어 다음 사이클의 단계 a) 의 페길화 반응에 사용되고,각 사이클의 단계 a) 에서 실질적으로 일정한 페길화 반응 조건을 유지하기 위해 새로운 비-페길화 단백질이 또한 단계 a) 에 첨가되는 방법.
46. 진술 32 내지 45 중 어느 하나에 있어서, IEC 물질이 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 방법.
47. 진술 35 내지 45 중 어느 하나에 있어서, AEC 물질이 약 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 방법.
48. 진술 32 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. 반응 생성물의 혼합물은 25 % 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함함; 및/또는
ii. IEC 통과 용액은 적어도 90 % 의 페길화 단백질을 포함함.
49. 진술 35 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. 반응 생성물의 혼합물은 25 % 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함함; 및/또는
ii. AEC 통과 용액은 적어도 90 % 의 페길화 단백질을 포함함.
50. 진술 35 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 방법:
i. AEC 물질은 Toyopearl Super Q 650 M 임; 및/또는
ii. AEC 단계는 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행됨; 및/또는
iii. AEC 단계는 약 1.0 내지 3.0 mS/cm 의 전도도에서 수행됨; 및/또는
iv. 제 1 혼합물은 약 10 - 30 mM 비신 및 약 1 - 10 mM Na2SO4 를 포함하는 AEC 로드 용액으로서 AEC 물질에 적용됨.
51. 진술 50 에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법.
52. 진술 32 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 페길화 반응이 약 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행되고, PEG/단백질 몰비가 약 0.6 - 1.0 인 방법.
53. 하기 단계를 포함하는, 적어도 약 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법:
진술 32 내지 51 중 어느 하나에 의해 생성된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법에 적용하는 단계; 및
모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 회수하는 단계, 모노-페길화 단백질 조성물이 적어도 약 90 % 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
54. 진술 53 에 있어서, 정제 방법이 페길화 단백질 혼합물을 통과 모드에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 HIC 통과 용액을 제공하는 단계를 포함하고,
HIC 단계는 올리고-페길화 단백질을 결합하는데 적합한 조건 하에서 페길화 단백질 혼합물을 HIC 물질에 적용하는 것을 포함하고, HIC 통과가 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 방법.
55. 진술 53 에 있어서, 정제 방법이 페길화 단백질 혼합물을 결합 및 용리 모드에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 HIC 용리액을 제공하는 단계를 포함하고, HIC 단계는 하기를 포함하는 방법:
모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 결합하기에 적합한 조건 하에서 HIC 물질에 제 2 혼합물을 적용하는 단계,
HIC 물질로부터 모노-페길화 단백질을 용리하여 HIC 용리액을 제공하는 단계, HIC 용리액은 모노-페길화 단백질을 제공함.
56. 진술 32 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 모노-페길화 단백질 조성물이 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 99.9% 의 모노-페길화 단백질을 포함하는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> PROCESS FOR PROVIDING PEGYLATED PROTEIN COMPOSITION <130> KSG/FP7426729 <140> PCT/EP2018/ <141> 2018-12-28 <150> EP 17211124.7 <151> 2017-12-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims (21)

  1. 하기 단계를 포함하는, 페길화 단백질 혼합물의 제조 방법:
    a) 비-페길화 단백질을 페길화 시약과 반응시켜 비-페길화 단백질 및 페길화 단백질을 포함하는 반응 생성물의 혼합물을 생성하는 단계, 페길화 단백질은 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함함;
    b) 반응 생성물의 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 단계에 적용하여 페길화 단백질의 분획이 반응 생성물의 혼합물에 비해 증가된 IEC 통과 용액을 제공하는 단계;
    IEC 단계는 반응 생성물의 혼합물을 IEC 물질에 적용하는 것을 포함함; 및
    c) 단계 b) 로부터 IEC 통과 용액을 수집하여 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계,
    비-페길화 단백질은 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 단계 b)에서 회수되고, 용리된 비-페길화 단백질은 후속 페길화 반응에 사용됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질이 호르몬, 사이토카인, 효소 또는 항체인 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴인 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, IEC 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계인 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 a), b) 및 c) 의 2 이상의 사이클이 수행되고, 비-페길화 단백질이 IEC 물질로부터 IEC 용리액을 용리함으로써 회수되고 용리된 비-페길화 단백질이 후속 페길화 반응에 사용되는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 방법이 3, 4 또는 5 개의 사이클을 포함하고, 각 사이클의 단계 b) 에서 비-페길화 단백질이 회수되어 후속 페길화 반응에 사용되는 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 단계 c)가 각 IEC 단계로부터 수집된 통과 용액을 풀링하여 풀링된 페길화 단백질 혼합물인 페길화 단백질 혼합물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, IEC 물질로부터 비-페길화 단백질을 용리하는 것이 45 mM 이하의 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하는 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 단계 b) IEC 용리액이 후속 페길화 반응에 직접 첨가되는 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 비-페길화 단백질이 회수되어 후속 페길화 반응에 사용되고, 새로운 비-페길화 단백질이 또한 각 페길화 반응에서 실질적으로 일정한 페길화 반응 조건을 유지하기 위해 후속 페길화 반응에 첨가되는 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, IEC 물질이 1.5 g/L 미만의 페길화 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 하기와 같은 제조 방법:
    i. 반응 생성물의 혼합물은 25% 미만의 올리고-페길화 단백질을 포함함; 및/또는
    ii. IEC 통과 용액은 적어도 90% 의 페길화 단백질을 포함함.
  13. 제 1 항에 있어서, IEC 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계이고, 하기와 같은 제조 방법:
    i. AEC 물질은 Toyopearl Super Q 650 M 임; 및/또는
    ii. AEC 단계는 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행됨; 및/또는
    iii. AEC 단계는 1.0 내지 3.0 mS/cm 의 전도도에서 수행됨; 및/또는
    iv. 반응 생성물의 혼합물은 10 - 30 mM 비신 및 1 - 10 mM Na2SO4 를 포함하는 AEC 로드 용액으로서 AEC 물질에 적용됨.
  14. 제 1 항에 있어서, 페길화 반응이 7.0 내지 9.0 의 pH 에서 수행되고, PEG/단백질 몰비가 0.6 내지 1.0 인 제조 방법.
  15. 하기 단계를 포함하는, 적어도 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함하는 모노-페길화 단백질 조성물의 제조 방법:
    제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 포함하는 페길화 단백질 혼합물을 모노-페길화 단백질 및 올리고-페길화 단백질을 분리하는 정제 방법에 적용하는 단계; 및
    모노-페길화 단백질 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 증가된 모노-페길화 단백질 조성물을 회수하는 단계, 모노-페길화 단백질 조성물이 적어도 90% 의 모노-페길화 단백질을 포함함.
  16. 제 15 항에 있어서, 정제 방법이 페길화 단백질 혼합물을 통과 모드에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 상대적으로 증가된 HIC 통과 용액을 제공하는 단계를 포함하고,
    HIC 단계가 페길화 단백질 혼합물을 HIC 물질에 적용하는 것을 포함하고, HIC 통과 용액이 모노-페길화 단백질 조성물을 제공하는 제조 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 정제 방법이 페길화 단백질 혼합물을 결합 및 용리 모드에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 단계에 적용하여 모노-페길화 단백질의 분획이 페길화 단백질 혼합물에 비해 상대적으로 증가된 HIC 용리액을 제공하는 단계를 포함하고, HIC 단계는 하기를 포함하는 제조 방법:
    HIC 물질에 제 2 혼합물을 적용하는 단계,
    HIC 물질로부터 모노-페길화 단백질을 용리하여 HIC 용리액을 제공하는 단계, HIC 용리액은 모노-페길화 단백질을 제공함.
  18. 제 15 항에 있어서, 모노-페길화 단백질 조성물이 적어도 95%, 98%, 99% 또는 99.9% 의 모노-페길화 단백질을 포함하는 제조 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 하기와 같은 제조 방법:
    i. IEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨; 또는
    ii. 페길화 반응, IEC 단계 및 HIC 단계는 실질적으로 동일한 pH 에서 수행됨.
  20. 제 15 항에 있어서, 모노-페길화 단백질이 적어도 20 kDa 의 분자량을 갖는 PEG 잔기를 포함하는 제조 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 단백질 조성물을 제약 상 허용되는 담체와 제형화하여 약학 조성물을 제공하는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
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