KR102519971B1 - 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴된 Zkscan 8은 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 항염증 인자의 발현은 촉진함으로써, 염증반응을 효율적으로 억제하는 효과가 우수하므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 적용될 수 있다.

Description

염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도{A composition for preventing or treating inflammatory diseases and uses thereof}
본 발명은 염증성 질환과 관련된 Zkscan 8 유전자에 관한 것으로, 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증성 질환이란 여러 외부 자극 혹은 내부 요인으로 인해 인체 여러 장기나 조직에 염증성 면역세포의 침윤과 더불어 부종, 발적 및 동통이 나타나고 조직학적 변화를 보이는 상태를 말한다. 이러한 염증은 손상조직과 이동하는 세포(migrating cell)로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자들은 염증 과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.
이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치료제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환 예방 또는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여 중간엽 줄기세포(MSC)를 활용하여 염증성 질환을 치료하기 위한 대안이 새롭게 떠오르고 있으나, 염증 관련 질환에 대하여 강력한 효과를 갖도록 최적화된 MSC 치료제는 아직까지도 개발이 미진한 실정이다.
Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)은 C2H2-ZNF(zinc finger) 단백질 전사 인자의 한 분류로 N-말단 쪽에 KRAB(Kruppel-associated box) 도메인과 SRE-ZBP 및 SCAN(CTfin51, AW-1 and Number 18 cDNA) 도메인을 가지고 있는 전사인자이다.
ZFP(zinc finger protein)는 다양한 생물학적인 활성이 보고되고 있으며, 특히 배아줄기세포(ESC)를 비롯한 다양한 초기 전구세포에서 발현되는 것으로 알려진 바 있다. ZNF 589, 268, 300은 조혈모세포 분화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 그러나, Zkscan 8(ZNF 192, LD5-1, Zscan 40)은 아직 생물학적 특성이 보고된 바가 없으며, 특히 염증성 질환에서 Zkscan 8의 기능에 대해서는 연구가 이루어지지 않은 실정이다.
이에. 본 발명은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위하여, 염증성 질환 치료에 있어서 Zkscan 8의 가능성을 확인하였고, 이로써 염증성 질환 예방과 치료에 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 한국등록특허 제10-1067816호
본 발명자들은 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)의 과발현을 통해 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능함을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ZKSCAN 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 단백질을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 염증성 질환에 대한 우수한 치료 활성을 갖는 효율적인 치료제 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, IL-1β에 의해 염증이 유발된 세포에서, 염증반응과 관련된 유전자(COX-2, mPGES-1, TNF-α, MMP-1, MMP-3)의 발현 수준이 감소되거나 억제시킴으로써 IL-10을 활성화하거나, 염증을 개선하거나 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있음을 확인한 바, 염증성 질환에 대한 효율적 치료 조성물로 이용될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)은 C2H2-ZNF(zinc finger) 단백질 전사 인자의 한 분류로 N-말단 쪽에 KRAB(Kruppel-associated box) 도메인과 SRE-ZBP 및 SCAN(CTfin51, AW-1 and Number 18 cDNA) 도메인을 가지고 있는 전사인자이다.
본 발명에 따르면, 상기 Zkscan 8 유전자가 코딩하는 ZKSCAN 8 단백질은 NCBI Accession number NP_001265048로 등록된 아미노산 서열일 수 있고, 서열번호 2로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 ZKSCAN 8 단백질에는 이의 변이체 또는 기능적 동등물이 포함되어 있을 수 있다. 상기 단백질 변이체 또는 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, ZKSCAN 8 단백질의 아미노산 서열과 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 ZKSCAN 8 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, ZKSCAN 8 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 ZKSCAN 8 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 ZKSCAN 8 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ZKSCAN 8 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 ZKSCAN 8 단백질은 그 자체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고, 인간에게 투여될 때 활성성분의 작용을 저해하지 않으며, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에서 상기 ZKSCAN 8 단백질 또는 이의 단편은 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963), 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명에서 용어 "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로, 구체적으로 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 기관지염 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 복막염, 골수염, 뇌막염, 뇌염, 낭포섬 섬유증, 뇌졸중, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 천추관절병증, 장질환 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 건활막염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 (sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있고, 바람직하게 상기 염증성 질환은 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 건활막염 및 근육염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물이 대상체에 투여되면 Zkscan 8의 발현을 촉진 또는 활성화하고, 이로 인해 염증이 유도된 조직에서의 염증 매개 관련 인자(COX-2, mPGES-1, TNF-α)의 발현이 감소 또는 억제되며, 염증 저해 관련 면역 인자인 IL-10의 발현은 증가하고, 기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)인 MMP-1과 MMP-3의 발현 수준은 억제됨으로써, 염증성 질환 증상의 발전을 억제하거나 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 염증성 질환의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하는 포유동물을 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 ZKSCAN 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 단백질은 염증성 질환의 치료 및 예방에 우수한 효과가 있는데, 구체적으로 염증 반응의 직접적인 매개 인자인 Cox-2, mPGES-1, TNF-α 유전자의 발현을 억제하고, IL-10(interluekin-10)의 발현은 촉진하며, MMP-1, MMP-3의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 ZKSCAN 8 과발현된 세포를 건염이 유발된 래트에 처리하면, 아무것도 처리하지 않은 래트와 비교하여 염증 반응의 직접적인 매개 인자인 Cox-2, mPGES-1, TNF-α 유전자의 발현을 억제하고, IL-10(interluekin-10)의 발현은 촉진하며, MMP-1, MMP-3의 발현을 억제함으로써, 건 조직의 염증반응을 억제하여 회복이 촉진되는 것으로 확인되었다. 따라서 ZKSCAN 8 단백질을 포함하는 조성물은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 예방 또는 치료 등의 대상이 되는 염증성 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 조성물은 ZKSCAN 8 유전자의 새로운 용도로서, 상기 용도는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 용도에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)은 C2H2-ZNF(zinc finger) 단백질 전사 인자의 한 분류로 N-말단 쪽에 KRAB(Kruppel-associated box) 도메인과 SRE-ZBP 및 SCAN(CTfin51, AW-1 and Number 18 cDNA) 도메인을 가지고 있는 전사인자이다.
상기 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)의 유전자는 서열번호 1로 표시될 수 있으며, NBCI에서 Gene symbol은 ZKSCAN 8이며, Gene ID 7745로 등록된 염기서열일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 Zkscan 8 과발현된 세포를 건염이 유발된 래트에 처리하면, 아무것도 처리하지 않은 래트와 비교하여 염증 반응의 직접적인 매개 인자인 Cox-2, mPGES-1, TNF-α 유전자의 발현을 억제하고, IL-10(interluekin-10)의 발현은 촉진하며, MMP-1, MMP-3의 발현을 억제함으로써, 건 조직의 염증반응을 억제하여 회복이 촉진되는 것으로 확인되었다. 따라서 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 유전자, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 조성물은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 예를 들어 미세 주입법(Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘포스페이트 침전법(Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기천공법(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터를 포함하는 세포는 줄기세포(stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "줄기세포"는 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 등으로 분류될 수 있다. 상기 줄기세포는 줄기체 세포(precursor cell), 전구세포(progenitor cells) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 본 발명에서 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 또는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSC)일 수 있고, 보다 구체적으로 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 골수, 지방, 탯줄 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 탯줄유래 중간엽 줄기세포는 MHC 클래스 타입I과 타입 II 항원이 적어서 면적거부가 적고, 생착에 호의적이기 때문이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 pscAAV 벡터에 서열번호 1의 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제조하고 이를 'pscAAV-Zkscan 8'로 명명하고, 이의 개열지도를 도 1b에 도시하였다. 상기 제조된 발현벡터를 인간탯줄 유래 중간엽 줄기세포(Umbilical cord matrix-derived Mesenchymal Stem Cells, UCMSC) 내로 형질감염하여 세포에 도입하였다(실시예 2 참조). Zkscan 8를 과발현시킨 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 처리하면, 건의 두께, 부기&발적 및 염증을 억제함을 확인하였다. 또한 Zkscan8를 과발현시킨 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 처리하면, 건 조직의 염증억제, 비특이적인 혈관 형성 및 염증세포의 침윤정도 억제하는 효과를 나타내었다. 즉, Zkscan8를 과발현시킨 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 회전근개에 염증이 발생하여 유발된 염증성 질환에 적용하였을 때, 건의 염증 반응을 억제하고, 건의 재생을 촉진하는 등의 효과를 달성하고 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 Zkscan 8의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구, 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 염증반응을 유발할 수 있는 자극을 처리한 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료 내 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)의 발현 수준을 측정하는 단계.
상기 (b) 단계에서 Zkscan 8의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 시험물질은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
본 발명에서 예방 또는 치료하고자 하는 염증성 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어“세포”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료이다. 상기 세포는 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 세포는 건(힘줄)(tendon), 인대(Ligament), 근육(muscle), 연골(cartilage) 및 골(bone) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있고, 바람직하게는 건 세포 또는 인대 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "염증반응"은 병원균, 자극물질 또는 손상된 세포 등과 같은 조직에 위해한 자극에 대한 조직의 복합적인 생물학적 반응으로, 면역세포, 혈관 및 분자 매개자를 포함하는 보호적인 반응이다. 염증반응은 세포 손상을 일으키는 초기 원인을 제거하고 손상된 세포 또는 조직을 제거하여 조직 복구를 개시하는 것이다. 염증반응은 열, 통증, 발적 및 부기 등의 증상을 동반한다.
본 발명에서 "염증반응을 유발할 수 있는 자극"은 염증반응을 유발할 수 있는 것으로, 구체적으로 NF-kB 매개된 염증반응을 유발할 수 있는 것일 수 있으나 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 염증반응을 유발할 수 있는 자극은 NF-kB에 의한 경로를 활성화 또는 유발 또는 촉발 및 증폭시킬 수 있는 것으로, 바람직하게 TNFα(tumor necrosis factorα), IL-1β(interleukin 1-beta), PAMP(pathogen-associated molecular pattern) 및 LPS(lipopolysaccharides)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“시험물질”은 염증반응이 유발된 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 Zkscan 8의 발현 수준에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 Zkscan 8의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현 수준 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, Zkscan 8의 발현 수준이 증가한 경우 상기 시험물질은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정될 수 있다.
본 명세서에서 용어“발현 수준의 증가”는 시험물질에 의해 Zkscan 8 유전자 발현이 유의하게 증가하여, 염증반응과 관련된 인자 COX-2, mPGES-1, TNF-α, MMP-1, MMP-3의 발현 수준이 감소되거나, 항염증 인자인 IL-10의 활성이 증가함으로써, 염증반응에 대한 회복 작용이 측정 가능한 수준이 될 정도로 Zkscan 8의 발현 수준 또는 생체 내 고유한 기능이 증가하는 것을 의미한다. 구체적으로는 정상 대조군에 비하여 발현 수준이 5% 이상 증가한 상태, 10% 이상 증가한 상태, 보다 구체적으로는 20% 이상 증가한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 Zkscan 8은 염증반응과 관련된 유전자(COX-2, mPGES-1, TNF-α, MMP-1, MMP-3)의 발현 수준이 감소되거나 억제시킴으로써 IL-10을 활성화하므로, 염증성 질환을 개선하거나 예방하거나 치료하는 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 ZSCAN family의 구조에 대한 모델을 도시한 것이다.
도 1b는 pscAAV-Zkscan 8의 개열지도이다.
도 1c는 pscAAV-GFP 벡터와 pscAAV-Zkscan 8 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 배 발생의 단계별(E9.5 내지 E15.5)에서 데이터세트(dataset)의 분포를 정리한 표이다.
도 3은 단백질-단백질 상호작용(PPI, Protein-Protein Interaction) 네트워크 분석결과를 도시한 도면이다.
도 4a는 배 발생 단계별 발현 유형에 따른 건 생성 마커와 Zkscan 8의 발현 양상을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4b는 인간 정상 건(Normal)과 회전근개 질환이 환자의 건(Tendinopathy)에서 건 생성 마커와 Zkscan 8의 발현 양상을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)을 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 5b는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)의 증식능을 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5c 및 5d는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에 대한 Zkscan 8 유전자 발현여부를 RT-PCR으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5e는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에서의 Zkscan 8 단백질 발현 수준을 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 분석한 결과이다.
도 6은 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 염증 관련 유전자(IL-1β, 1L-6, TNF-α 및 MMP-1)의 발현 양상을 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 7은 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 염증 관련 유전자(COX-2, mPGES-1, MMP-3, IL-10)의 발현 양상을 qRT-PCR로 측정하여 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 8a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서 기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)인 MMP-1과 MMP-3의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 나타낸 도면이다.
도 8b는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서 기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)인 MMP-1과 MMP-3의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 9a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 bFGF의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 9b 내지 도 9d는 A, B, C, D 그룹으로부터 bFGF, TGF-β2, HGF의 단백질 분비 수준을 효소 결합 면역 흡착법으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 10a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 Scx의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 10b는 A, B, C, D 그룹으로부터 Mkx의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 10c는 A, B, C, D 그룹으로부터 Egr-1의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 10d는 A, B, C, D 그룹으로부터 Egr-2의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 11은 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에서의 지방, 골, 연골, 건, 근육, 신경 세포 관련 마커 발현 양상을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 12a는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 거시적 모습이다. 이때 건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위해, 결손 주위의 주변 조직들을 제거하였다.
도 12b는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 총 거시적점수(the total macroscopic score)를 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 12c는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 건의 두께(tendon thickness)를 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 12d는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 부기/발적(swelling/redness of tendon)을 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 12e는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 염증(inflammation)을 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 13a는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건을 H&E 염색한 사진(배율:×400)이다.
도 13b는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 혈관밀도(Vascular density)를 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 13c는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 침윤된 염증 세포(Infiltrated inflammatory cells)를 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
유전자 스크리닝 및 선정
염증성 질환 특히, 근골격계 염증과 관련된 바이오마커를 탐색하기 위하여, 건 재생 후보 유전자를 선별을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Gene Expression Omnibus(GEO) database(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)에서 마우스 다리(limb)의 건(tendon) 발생에 대한 whole transcriptome expression profiling microarray dataset GSE30138과 GSE54207 그리고 RNA sequencing dataset GSE65180을 다운받아 분석하였다.
GSE30138과 GSE54207의 플랫폼은 GPL1261(Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array)을, GSE65180은 GPL13112[Illumina Hiseq 2000 (Mus musculus)]을 사용하였으며, 건 생성 마커(tenogenesis markers; Tgf-β2, Scx, Mkx, Egr1, Tnmd, Thbs4, Col1, Gag, Tnc), 근 생성 마커(myogenesis markers; Pax3, Pax7, Myf5, Des, MyoD, Myogenin, MRF4, Myostatin, MHC2), 골 생성 마커(osteogenesis markers; Runx2, Osterix, Alp, Ocn, Opn) 및 연골 생성 마커(chondrogenesis markers; Comp, Sox9, Chad, Acan, Col2a1)들의 배 발생 단계(embryonic stage)별 발현 정도와 유사한 유전자를 1차적으로 선별하였다.
단백질-단백질 상호작용(PPI, Protein-Protein Interaction) 네트워크 구축과 유전자들 간의 상호 작용을 파악하기 위하여 온라인 데이터베이스(database) Cytoscape software(http://www.cytoscape.org/)의 TiCoNE와 ClueGo plugin을 이용하여 분석하였다(도 2). 다음으로, 상기 유전자들 중에서 핵심 유전자(hub genes)를 선별하기 위하여 PPI 네트워크에서 긴밀하게 연결되어 있는 중요한 모듈(module)을 Molecular Complex Detection(MCODE; degree cutoff=2.1, node score cutoff=0.2, k-core=2, max. depth=100)와 Markov Clustering(MCL)을 사용하였다. 선별된 클러스터(cluster)들은 Gene Ontology(GO)을 통해 건 재생에 대한 연관성을 분석하여 후보 유전자들을 선별하였다.
RNA-seq 분석
정상 건(n=5)과 회전근개(n=6)의 총 RNA는 RNeasy Plus Universal Kit(cat. 73404. Qiagen, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 총 RNA 무결성(integrity)은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 확인하였으며 cDNA 라이브러리(library)는 TruSeq Stranded mRNA Library prep kit(cat. 20020594; Illumina, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 풀링된 라이브러리는 2 nM의 농도로 HiSeq 2000에 로딩하였으며, v3 SBS chemistry, 76 cycle과 페어드 엔드(paired-end)로 시퀀싱을 수행하였다.
인간 탯줄 유래 줄기세포 및 건 세포의 배양
본 연구에 사용된 모든 조직은 환자의 동의하에 채취 및 사용되었다. 탯줄과 건 조직은 혈액 등의 불순물을 제거하기 위하여, 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco, NY, USA)로 2 내지 3 회 세척하였다.
제왕절개 환자로부터 탯줄을 얻었으며, 탯줄은 길이와 무게를 측정한 후 수술용 가위를 이용하여 약 2 내지 4 mm 길이로 잘게 자른 후, 1 g에 해당하는 양을 150 cm2 배양접시에 정렬하여 접종하였다. 탯줄이 배양 접시에 완전히 부착된 다음 배양 배지(LG DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS; Welgene, Daegu, Korea), and antibiotic-antimycotic solution)를 첨가하여 5% CO2 공급 하에 37 ℃ 조건에서 배양하였다.
회전근개 완전 파열 환자로부터 얻은 건 조직은 0.3% 제2형 콜라게나제(Gibco)와 항생제가 함유된 HG DMEM(high-glucose Dulbecco's modified Eagle medium, Welgene, Daegu, Korea) 내에서 가볍게 교반하면서 37 ℃ 2시간 동안 배양하였다. 이 후 동량의 배양배지(HG DMEM, 10% FBS)와 항생제(antibiotic-antimycotic solution)를 첨가한 후, 분해되지 않은 조직을 100-μm 세포 여과기를 이용하여 제거하였다. 20 ℃ 하에서 원심분리(500 g, 15 분)를 통해 세포를 회수하고, 배양배지로 2회 세척하였다. 회수한 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 세포 수를 계수하고 2 × 104 내지 5 × 104 cells/cm2 밀도로 배양접시에 넣은 후, 37 ℃, 5% CO2가 공급되는 배양기로 배양하였다.
배양 용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고, 0.05% 트립신(trypsin)과 0.53 mM EDTA(ethylenediamine tetra acetic acid)를 포함하는 trypsin-EDTA(Welgene, Daegu, Korea)로 3 분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후, 세포를 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 다음, 계수하였다. 인간 탯줄 유래 줄기세포는 3,333 cells/cm2, 건세포는 1:3 비율로 지속적으로 배양하였다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8) 제조
제조사(Cell Biolabs, CA, USA)에서 제공한 pscAAV-GFP 벡터 플라스미드(vector plasmid)를 대조군 벡터로 사용하였다. 제한효소 BamHI와 SalI으로 GFP 부분을 절단하고 그 부위에 BamHI와 SalI 제한효소를 포함하는 프라이머(FP: 5'- AAGGATCCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCGGAGGAAAGTCGG-3', RP: 5'-AAGTCGACCTAGACTGAGATAGACTC-3')를 이용하여 Zkscan8를 클로닝하여 제조하였다. pscAAV-Zkscan 8 벡터의 개열지도는 도 1b에 나타내었고, 제조된 pscAAV-GFP 벡터와 pscAAV-Zkscan 8 벡터의 구조는 개략적으로 도 1c에 나타내었다. 완성된 pscAAV-Zkscan8는 서열을 확인하기 위해 시퀀싱을 분석하였다. 바이러스 패키징 스탁을 생산하기 위해 제조사의 방법에 따라 총 3가지의 벡터(타겟 발현 벡터, pAAV-RC, pHelper)를 293세포에 주입하였다. 72 시간 후에 세포를 포함한 배양배지를 수집하고 동결, 해동 과정을 반복하여 상기 Zkscan8 유전자를 포함한 아데노바이러스를 수확하고 저장하였다. 이렇게 제조된 바이러스는 인간 탯줄 유래 줄기세포에 Zkscan8 유전자 전달 시스템으로 이용하였다.
증식능 분석
증식능은 WST를 이용하여 살아있는 세포의 양을 측정하여 분석하였다. 유전자 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 배양용기에 5 × 104 /cm2 밀도로 접종한 후, 3, 5, 9, 12, 15 일에 배양배지에 Ez-Cytox(DoGEN, Guro, Korea) 10 ㎕를 첨가하였다. 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 1 시간 반응시킨 다음, 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
유전자 도입 줄기세포(MSC-Zk8, MSC-GFP)와 건 세포의 공배양
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 주변 분비 능력을 평가하기 위해서 건 세포와 공배양을 실시하였다. 1.6 × 104 개의 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)과 대조군(MSC-GFP)은 각각 배양접시에 접종하고 1.1 × 105 개의 건 세포는 인서트(Cell culture inserts 24 well 0.4 um; BD Biosciences, CA, USA)에 접종하였다. 건 세포는 항생제, 2% FBS가 첨가된 DMEM-HG 배양 배지만으로 배양한 정상환경과 항생제, 2% FBS가 첨가된 DMEM-HG 배양 배지에 10 ng/㎖ 농도의 인터루킨 1 베타(IL-1β; Peprotech, NJ, USA)를 혼합하여 염증환경으로 나누어 37 ℃ 배양기에 6 시간 배양하여 준비하였다.
6 시간이 지난 후, 정상환경 또는 염증환경으로 배양된 건 세포가 있는 인서트를 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8) 또는 대조군(MSC-GFP)이 있는 배양접시로 이동시켜, 총 4가지 그룹의 공배양 시료를 제조하였다.
구체적으로 A(IL-1β, MSC ; -. -). 인서트에 정상환경에서 배양된 건 세포만 있는 경우, B(IL-1β, MSC ; +. -). 인서트에 염증환경에서 배양된 건 세포만 있는 경우, C(IL-1β, MSC-GFP ; +. +). 인서트에 염증환경에서 배양된 건 세포가 있고, 배양접시 바닥에는 대조군(MSC-GFP)이 있는 경우, D(IL-1β, MSC-Zk8 ; +. +). 인서트에 염증환경에서 배양된 건 세포가 있고, 배양접시 바닥에는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8) 세포가 있는 경우이다. 상술한 바와 같이 건세포와 유전자 도입 줄기세포(MSC-Zk8, MSC-GFP)가 위치하도록 공배양하였다. 이때 항생제, 2% FBS, 10 ng/㎖ 농도의 인터루킨 1 베타(IL-1β; Peprotech, NJ, USA)가 첨가된 DMEM-LG 배양배지를 사용하여 48 시간 공배양하였다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)로부터 RNA 분리
Zkscan8 도입 시 다양한 유전자의 발현을 확인하고자 HiYield Total RNA mini kit(Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고, 분광광도계(NanoDrop, DE, USA)를 사용하여 260 ㎚와 280 ㎚에서의 흡광도를 측정한 후, 유출액 내의 총 RNA를 정량하였다. 각각의 총 RNA 1 ㎍을 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen, CA. USA)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.
역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)
역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 진행하기 위해 MaximeTM PCR PreMix(i-StarTaq)(iNtRON, Sungnam, Korea)를 사용하였다. 총 부피 20 ㎕에 RNase-free 증류수 16 ㎕, cDNA 2㎕ 및 프라이머 각각 1 ㎕씩 첨가하였고, 반응조건은 다음과 같이 수행하였다. 우선 전변성(pre-denaturation)은 95 ℃에서 30 분, 변성(denaturation)은 95 ℃ 30초, 결합(annealing)은 55 ℃ 30 초, 연장(extension)은 72 ℃ 1 분동안 수행하였다. 상기 과정을 총 32 번 반복한 후, 72 ℃에서 5 분동안 쿨링(cooling)하였다. 상기 과정을 통해 얻은 PCR 생성물은 1% 아가로즈젤 상에서 밴드를 확인하였다.
Target gene Primer sequence(5’->3’) Product length(bp)
Zkscan8 서열 4 CGGAGGAAAGTCGGAAACCA 198
서열 5 CTTCCCGTGGACCAAGAGTC
PPARγ2 서열 6 TTGGTGACTTTATGGAGCCC 311
서열 7 CATGTCTGTCTCCGTCTTCT
aP2 서열 8 AAGAAGTAGGAGTGGGCTTT 285
서열 9 CCACCACCAGTTTATCATCC
Osteopontin 서열 10 GAGACCCTTCCAAGTAAGTC 354
서열 11 GATGTCCTCGTCTGTAGCAT
ALP 서열 12 TGGAGCTTCAGAAGCTCAAC 454
서열 13 ATCTCGTTGTCTGAGTACCA
Sox6 서열 14 AACATGTGGCCTCCCATCTG 300
서열 15 TCAGTGTGTCCACCACATCG
Aggrecan 서열 16 TCAGGAGGGCTGGAACAAGT 350
서열 17 GGAGGTGGTAATTGCAGGGA
Mkx 서열 18 GGCCACGAACACTACCATGA 175
서열 19 AGCTGCGCTTTCACCCTTAT
Egr-1 서열 20 CCAGTGGAGTCCTGTGATCG 206
서열 21 TCGCTCCTGGCAAACTTTCT
Egr-2 서열 22 TCTTCCTCTCTGGCCTACCC 400
서열 23 GTCTGTTGGGGTACTTGCGA
COL1a1 서열 24 AGTGGTTTGGATGGTGCCAA 170
서열 25 GCACCATCATTTCCACGAGC
COL3a1 서열 26 CTTCTCTCCAGCCGAGCTT 191
서열 27 CCAGTGTGTTTCGTGCAACC
Desmin 서열 28 GAGGAAATCCGGCACCTCAA 253
서열 29 CATCCCCGTGTCTCGATGGTC
NEFL 서열 30 CTGGAAATCGAAGCATGCCG 363
서열 31 GCGGGTGGACATCAGATAGG
GAPDH 서열 32 AAATCCCATCACCATCTTCCAG 313
서열 33 CATGAGTCCTTCCACGATACC
정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)
정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR; qRT-PCR)은 Go Taqㄾ probe qPCR and RT-qPCR systems(Promega, WI, USA), TaqManㄾ Gene Expression Assays(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 LightCycler 480(Roche Applied Science, Mannhein, Germany)을 이용하여 다음의 유전자 발현을 실시간으로 확인하였다; ; Scx(Hs03054634_g1), Mkx(Hs00543190_m1), Egr-1(Hs00152928_m1), Egr-2(Hs00166165_m1), bFGF(Hs00266645_m1), IL-1β(Hs999999029_m1), IL-6(Hs99999032_m1), Cox-2(Hs00153133_m1), mPGES-1(Hs00610420_m1), IL-10(Hs00961622_m1), TNF-α(Hs99999043_m1), MMP-1(Hs00899658_m1), MMP-3(Hs00968308_m1), GAPDH(Hs99999905_m1). 중합 효소 연쇄반응은 전변성(pre-denaturation) 95 ℃에서 10 분, 변성(denaturation) 95 ℃ 15 초, 결합(annealing) 60 ℃ 1분, 연장(extension) 72 ℃ 4 초 수행하는 것을 1 사이클(cycle)로 하여, 50 사이클 반복한 후, 40 ℃에서 30 초동안 쿨링(cooling)하였다. 용융 곡선(Melting curve) 분석은 2-ΔCt 계산법을 사용하였으며, GAPDH의 발현을 참고치(reference)로 하여 qRT-PCR 결과를 분석하였다[Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods. 2001, 25:402-408].
단백질 분리 및 웨스턴 블럿팅(western blotting)
건 세포로부터 건 세포 용해물(lysate)을 얻기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다. 건 세포의 펠렛(pellet)에 용해액(lysis)(PRO-PREPTM)(iNtRON, Sungnam, Korea)을 첨가한 후, 10 초간 10 회 이상 강한 외류(vortex)를 사용하여 파쇄하였다. 상기 용액을 4 ℃, 13,000 rpm으로 20 분간 원심분리를 하여 상층액을 회수하여 건 세포 용해물을 얻었다. 건 세포 용해물의 단백질 함량을 정량화하기 위해 BCA를 사용하였다. 동일 농도의 건 세포 용해물(10 μg)을 10% 아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 전기영동(SDS-PAGE)으로 단백질 크기에 따라 분리하였다. 분리된 단백질들은 1X 전이 완충용액(transfer buffer)(20% 메탄올, 0.025 M 트리스 염(Tris base) 및 0.19 M 글리신(glycine))에 충분히 적시고, 100 V에서 90 분 동안 전류를 흘려 PVDF 막에 옮겼다. 상기 PVDF 막을 5% 탈지분유가 첨가된 1X TBS-T 용액(10 mM Tris pH7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 1 시간 동안 블러킹(blocking)하였다. 다음, 1X TBS-T 용액에 1차 항체를 1:1000 비율로 희석한 후 4 ℃에서 교반하며 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 다음과 같다; Zkscan8 antibody(STJ26239, St John's Laboratory), HA antibody(ab9110, Abcam), MMP-1 antibody(MAB901, R&D Systems), MMP-3 antibody(MAB905, R&D Systems), Vinculin antibody(13901, Cell signaling technology), β-actin antibody(ab170325, abcam). 1차 항체를 반응시킨 PVDF 막을 1X TBS-T로 10 분간 3 번 이상 충분히 세척한 다음, 1X TBS-T 용액에 2차 항체(1:20,000 희석)를 넣어 한 시간 동안 실온에서 교반하며 반응시켰다. 사용한 2차 항체는 다음과 같다; 항 쥐 면역글로불린-HRP(goat anti mouse lgG-HRP; SA001-500, GenDEPOT)과 항 토끼 면역글로불린-HRP(goat anti rabbit lgG-HRP; 7074S, Cell signaling). 1X TBS-T 용액으로 10 분씩 3 번 세척하고, ECL을 처리한 후, ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK) 기계로 촬영하였다.
효소 결합 면역 흡착 분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)
공 배양 후 채취한 배양액을 4 ℃, 13,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 상층액을 실험에 사용하였다. bFGF(RayBio Human bFGF ELISA Kit, GA, USA), HGF(DHG00; R&D system, INC., Minneapolis, MN), TGF-β2(DB250; R&D system, INC., Minneapolis, MN) 제조사의 프로토콜에 따라 효소면역측정법을 수행하였다.
동물실험 설계
본 기관의 실험동물 연구위원회에 의해 승인되었고 승인된 절차에 따라 진행되었다(IACUC_2019_0044). 32 마리의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(12주, 340~360 g)를 4 개의 군(1) 정상군(Normal group); 2) 생리식염수군(Saline group); 3) 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(US-MSC group); 4) Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(Zkscan8+ group))으로 나눠 제조하였다.
졸레틸(30 ㎎/㎏) 및 럼푼(10 ㎎/㎏)을 사용하여 마취를 유도하였고, 모든 실험에는 랫트의 왼쪽 어깨만을 사용했다. 먼저 랫트의 발바닥을 손톱으로 살짝 눌러 마취가 제대로 되었는지 확인한 후 수술을 수행하였다. 다음 왼쪽 어깨의 견봉을 촉지하고 앞가쪽 피부를 2 ㎝ 절개하였다. 견봉에 부착되어 있는 승모근과 삼각근을 절개하여 극상근의 건을 노출시킨 후, 극상근의 건과 상완골두와의 연골 부위에서 1 ㎜가 떨어진 곳에 2 ㎜ 지름(건 넓이의 약 50% 이상)을 가진 생검 펀치(Biopsy Punch)(BP-20F, Kai Medical Europe GmbH, Bremen, Germany)로 둥근 모양의 전층 파열 건 손상을 만들었다. 그 후 30 G 바늘의 주사기를 이용하여 파열된 부위 양쪽에 남아있는 건에 2) 10 ㎕의 생리식염수, 3) 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 (1 × 106 cells/10㎕ 생리식염수) 그리고 4) Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(1 × 106 cells/10㎕ 생리식염수)를 두 번에 나눠서 주입시켰다. 승모근과 삼각근을 4-0 Vicryl 봉합사(W9074, Ethicon, Cincinnati, OH, USA)로 봉합하고, 피부는 블랙실크(Black silk)(SK439, AILee, Busa, Korea)로 봉합한 후 상처 부위를 소독하였다. 수술이 완료된 후, 랫트에게 자유로운 케이지 활동을 허하였다.
각 그룹의 랫트는 수술 후 2 주와 4 주에 희생되었고 극상근의 건을 수확하여 거시적, 조직학적 평가에 사용했다.
동물실험의 각 그룹에 대한 거시적 평가
각 그룹의 랫트는 수술하고나서 2 주, 4 주가 지났을 때, 이상화탄소 챔버에서 희생시켰다. 상완골의 머리와 극상근을 제거하지 않고 랫트의 극상근의 건의 원래 모습을 유지하며 수확하였다. 건의 재생을 거시적으로 평가하기 위하여 Stoll의 수정된 반정량 평가 방법을 이용하였다[Stoll C, John T, Conrad C et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials 2011;32(21):4806-4815]. 상기 평가방법은 총 12개의 변수가 있다; 건의 파열(tendon rupture; 결손 부위 건이 끊어진 상태), 염증(inflammation; 건이 붓거나 붉은 색으로 변하고 염증이 발생한 상태), 건의 표면(tendon surface; 건의 표면이 매끄럽지 않으며, 거칠고, 불퉁불퉁하게 변한 상태), 주위 건의 변화(neighboring tendon; 결손된 부분 주위 건의 색과 두께, 겉표면이 비정상적으로 변한 상태), 결손 부위의 두께(level of the defect; 결손 부위가 매워진 것이 주위 건보다 오히려 튀어 나온 상태), 결손 크기(defect size; 결손의 크기가 3 ㎜ 이상 늘어나서 결손 크기가 커진 상태), 건의 부기/발적(swelling/redness of tendon; 손상된 건이 붉게 변하거나 만졌을 때 붓기가 있는 상태), 주위 조직과의 유착(connection surrounding tissue and slidability; 손상된 건이 주위 조직과 매끄럽게 미끄러지지(분리되지) 않고 엉겨 붙어 있는 형태), 건의 두께(tendon thickness; 건의 두께가 원래 두께 보다 두꺼워 진 상태), 건의 색(color of tendon; 빛나는 하얀색의 건이 불투명하고 탁하고 붉은 색으로 변한 상태), 하나의 근에서 연결됨(single strains of muscle; 극상근의 건이 극상근에서만 연결되지 않고 주위 근과 조직이 섞이듯 연결된 상태), 그리고 주위 건강한 조직과의 연결성(transition of the construct to the surrounding healthy tissue; 결손부위와 주위 건강한 건의 연결이 매끄럽지 않은 상태, 결손이 시작되는 부위가 확연이 구분되는 상태). 각 변수에 대해서 0점 또는 1점을 주었고, 건의 부기/발적은 0~2점 건의 두께는 0~3점을 주었다. 총 거시적 점수(total macroscopic score)은 정상과 가까울 때 0점 그리고 손상이 가장 심할 때 15점을 주었다.
동물실험의 각 그룹에 대한 조직학적 평가
육안으로 평가한 후에, 수확한 조직은 즉시 4%(w/v)의 파라포름알데히드 (paraformaldehyde, PFA; Merck, Germany)에 넣어 24 시간 동안 고정시키고 10% EDTA(ethylendiaminetetr acetic acid, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에 넣어 이틀동안 석회를 제거하였다. 그 후 점진적으로 농도가 증가하는 에탄올을 이용하여 탈수 과정을 진행하고, 클로로포름을 이용하여 탈지 과정을 수행하였다. 고정 과정이 완료된 조직은 파라핀블록으로 포매하고, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 건의 중심 주위까지 조심스럽게 절단한 후, 중심부에서는 4 cm 두께로 연속하여 잘라 조직을 슬라이드에 부착시켰다.
조직을 분석하기 위하여 무작위로 슬라이드를 선택하여 헤마토실린과 에오신 (hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였고, 광학 현미경(U-TVO 63XC; Olympus Corp., Japan)을 이용하여 분석하였다. 각 슬라이드에 대한 혈관의 밀도(vessel density; 혈관이 적은 건 조직에 손상으로 인하여 혈관 형성이 증가한 상태를 평가)를 평가하기 위하여 H&E 염색 슬라이드를 이용하였고, Fernandez-Sarmiento의 평가 방법으로 분석하였다[Fernandez-Sarmiento JA, Dominguez JM, Granados MM et al. Histological study of the influence of plasma rich in growth factors (PRGF) on the healing of divided Achilles tendons in sheep. J Bone Joint Surg Am 2013;95(3):246-255]. 혈관밀도(vessel density)는 면적당 혈관 개수로 평가하였고 ImageJ software with installed NII plugin (National Institutes of Health, MD, USA)라는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 슬라이드 마다 다섯개의 영역을 분석하였으며 그 평균값을 최종값으로 사용하였다
조직에 침윤된 염증 세포(Infiltrated inflammatory cells; 염증 세포들이 증가한 정로를 평가)를 평가하기 위해, 염증 세포의 침윤 정도를 0점에서 4점까지 등급 척도를 사용하여 평가하였다; 0(없음), 1(약간 침윤), 2(중간 침윤), 3(강한 침윤) 그리고 4(심각한 침윤)[Chen L, Liu JP, Tang KL et al. Tendon derived stem cells promote platelet-rich plasma healing in collagenase-induced rat achilles tendinopathy. Cell Physiol Biochem 2014;34(6):2153-2168.]. 모든 조직은 두 번씩 평가하였다.
통계분석
모든 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. 데이터는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 분석하였고, 사후분석은 Bonferroni multiple comparison test를 사용하였으며, 두 군을 비교할 때는 T-test를 사용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 버전 23(IBM)을 이용하여 진행하였다. p < 0.05 이하의 유의값이 나왔을 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
실험결과
배 발생 단계별 유전자 발현 양상 분석 및 PPI 네트워크 분석
건, 근, 연골, 골 생성 마커들의 배 발생 단계(embryonic stages)별 발현 양상 분석을 위하여 whole transcriptome expression profiling dataset GSE30138, GSE54207, GSE65180을 이용하여 끊임없이 연속적으로 배 발생의 모든 단계(E9.5~E15.5)에서 유전자들의 발현 양상을 분석하였다. 도 2는 배 발생의 단계별(E9.5 내지 E15.5)에서 데이터세트(dataset)의 분포를 정리하여 나타내었다.
세 개의 데이터세트(dataset)로 분석을 하였기 때문에, 각 배 발생 단계별 마커 유전자들의 발현 양상과 일치하면 거리 점수 0점을, 발현 양상이 증가하는 시점에서 한 곳이 다르면 0.33점을, 두 곳이 다르면 0.67점을, 감소하는 시점에서 한 곳이 다르면 -0.33점을, 두 곳이 다르면 -0.67점등과 같이 거리 점수를 부여하여 각 유전자들의 거리 점수 총점으로 마커 유전자들과의 발현 양상 유사도를 비교 분석하였다. 총 9,163개의 DEG들 중에서 거리 총점이 ±0.33이하 즉, 전체 배 발생 단계 중 한 개의 배 발생 단계에서만 발현 양상이 일치하지 않는 149개의 유전자들을 1차로 선별하였다. 1차 선별된 후보 유전자들에 대해 degree cut-off를 조절하면서 PPI network, functional enrichment, module 분석을 수행하였다.
도 3은 단백질-단백질 상호작용(PPI, Protein-Protein Interaction) 네트워크 분석결과를 도시한 도면으로, 이에 따르면 3개의 sub-cluster들이 구성되었음을 확인하였고, 여기서 이미 잘 알려져 있는 유전자를 제외하여 99개의 유전자를 2차 선별하였다. 다음으로 gene ontology(GO)를 통해 건 재생과 기능적으로 연관성이 있는 42개의 유전자를 3차 선별하였다. 3차 선별된 42개의 유전자는 건 재생과 관련된 최종 유전자 선별을 위해 스크리닝 실험에 사용되었다.
배 발생 단계별 건 생성 마커와 Zkscan8의 발현 양상 비교
도 4a는 배 발생 단계별 발현 유형에 따른 건 생성 마커와 Zkscan8의 발현 양상을 분석하여 나타낸 그래프이다.
각 배 발생 단계별 Zkscan8 유전자와 건 생성 마커들의 발현 양상을 비교하여 어떤 마커들과 유사한지를 분석하였고, 그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이 Scx와 Tgif1는 E9.5부터 계속 증가하다가 E13.5에서 감소하였고, Mkx는 E13.5까지 계속 증가하였고, Tgf-β2는 E9.5부터 E13.5까지 계속 높은 수준의 발현 양을 보였다. Egr1과 Thbs4는 E9.5보다 E10.5~E11.5에서 감소하다가 E12.5에서부터 다시 증가하였고, Epha4는 E10.5에서부터 크게 증가하는 것을 확인하였다, 배 발생 단계 별 Zkscan8의 발현 양상을 살펴보면, E10.5에서 증가하고 유지하는 패턴을 보이고 전반적으로 건 마커들의 발현 양과 유사함을 알 수 있다.
인간의 정상 건과 회전근개 질환 건에서의 Zkscan8의 발현 양상 분석
정상인 인간에서 얻은 정상적인 건과 회전근개 질환을 갖는 환자로부터 얻은 건에서 건 생성 마커들과 Zkscan8 유전자가 어떠한 발현 양상을 보이는지 확인하고자 하였다.
도 4b는 인간 정상 건(Normal)과 회전근개 질환이 환자의 건(Tendinopathy)에서 건 생성 마커와 Zkscan8의 발현 양상을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 건 생성 마커로 알려져 있는 Tnmd와 Thbs4의 발현 정도가 회전근개 질환의 건에서 각각 5.4 배 및 2 배 정도로 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 회전근개 질환의 건에서의 Col3a1의 발현정도가 정상 건에 비하여 3.2 배 현저히 증가하였다. 또한 회전근개 질환의 건에서 MMP-9의 발현정도도 정상 건에 비하여 11.8 배 더 증가하였다. 그러나, 회전근개 질환의 건에서의 Zkscan8 유전자만 정상 건에 비하여 특이하게 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 회전근개 질환의 염증을 예방 또는 치료할 수 있는 유전자로 Zkscan8가 바람직함을 확인하였다. Zkscan8이 최종 선정되었다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 특성 분석
대조군 벡터인 pscAAV-GFP와 Zkscan8 삽입된 pscAAV 벡터의 모식도는 도 1c에 나타내었다. pscAAV-GFP와 pscAAV-Zkscan 8을 각각 도입한 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 상술한 바와 같이 제조하였고, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)과 대조군(MSC-GFP)의 특성을 비교 분석하고자 하였다. 이를 위해 각각에 대한 세포 모양과 증식능을 분석하였다.
도 5는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에 대한 특성(세포모양과 증식능)을 분석한 결과로, 도 5a는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)을 현미경으로 촬영한 이미지이고, 도 5b는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)의 증식능을 측정하여 정량적으로 나타낸 그래프이며, 도 5c 및 5d는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에 대한 Zkscan8 유전자 발현여부를 RT-PCR으로 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 5e는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에서의 Zkscan8 단백질 발현 수준을 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 분석한 결과이다.
도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)은 특징적인 줄기세포의 모양인 섬유아세포 형태가 관찰되었다. 즉, 두 세포의 증식능 차이는 없는 것으로 확인되었다.
도 5c 내지 5e에 나타난 바와 같이, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)로부터 총 RNA와 단백질을 추출하여 시간별로 Zkscan8 발현수준을 분석하였다. 대조군(MSC-GFP)에 대한 상대적인 발현양상을 나타내었다.
RT-PCR 결과에 따르면, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)은 유전자를 도입하고 3일이 지난 시점부터 과발현되었는 것을 확인하였고, 5일 및 7일이 지남에 따라 약 20.6 ± 4.3%, 89.70 ± 1.3% 유의적으로 감소하였다.
웨스턴 블럿팅(western blotting) 결과에 따르면, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)는 Zkscan 8 도입 2일차에서 Zkscan 8, HA 항체를 이용하여 Zkscan 8 단백질이 과발현되는 것을 확인하였다, 본 발명으로부터 Zkscan 8 단백질을 과발현하는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 주변 분비가 염증관련 유전자에 미치는 영향 평가
성체줄기세포는 치유와 관련된 여러 종류의 사이토카인(cytokines)을 분비하여 질환이 발생한 부위의 염증을 감소시키고, 조직 재생의 촉진제로서의 역할을 수행할 수 있다. 사이토카인 IL-1β로 염증환경 유도한 후, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 건 세포를 공배양한 다음 건 세포의 염증관련 인자들의 발현변화를 조사함으로써, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 주변 분비능을 평가하고자 하였다.
A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양) 각각에 대하여 건 세포의 총 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 통해 염증 매개 관련 면역 인자(Interleukin 1 beta; IL-1β, Interleukin 6; IL-6, Cyclooxygenase; COX-2, Microsomal prostaglandin E synthase-1; mPGES-1, Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α) 및 염증 저해 관련 면역인자(Interleukin-10; IL-10)의 발현을 qRT-PCR을 통해 분석하였다.
도 6은 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 염증 관련 유전자(IL-1β, 1L-6, TNF-α 및 MMP-1)의 발현 양상을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 7은 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 염증 관련 유전자(COX-2, mPGES-1, MMP-3, IL-10)의 발현 양상을 측정하여 나타낸 그래프이다.
정상환경의 건 세포(A) 유전자 발현을 기준으로 다른 그룹의 상대 발현 값을 계산하였다. 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 염증환경에 노출된 건 세포(B)는 IL-1β, IL-6, COX-2, mPGES-1, TNF-α와 같은 염증 매개 관련 인자들의 발현이 각각 2886.57 ± 56.59, 4330.20 ± 106.11, 781.44 ± 122.87, 68.48 ± 10.43 및 6.20 ± 0.52 배 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 즉 염증환경에 건세포가 노출됨으로써, 세포에서 염증이 유발되었음을 알 수 있다.
이에 반해, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D)에는 COX-2, mPGES-1, TNF-α의 발현이 각각 57%, 64% 및 21% 감소하였다. 또한, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양하는 경우(D)에는 염증 저해 관련 면역인자인 IL-10의 발현이 B군에 비해 유의적으로 증가함을 확인하였다. 상기 염증 저해인자인 IL-10은 TNF-α에 대한 길항제 역할을 하여 조직 재생에 도움을 줄 수 있다. 본 발명의 Zkscan 8은 Cox-2-PGE2 경로를 통해 IL-10의 생산을 증가시키고, 성체줄기세포의 골 형성을 촉진하며, 면역세포의 증식을 억제하여 치유할 수 있도록 미세환경을 안정화시킴을 확인하였다.
기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)는 초기 치유 단계에 있어서 손상된 조직을 분해하는 역할을 하여 리모델링에 영향을 준다. 하지만 지속된 활성은 오히려 세포 외 기질분해를 일으킬 수 있기 때문에 MMP의 잘못된 조절은 되려 건 염증을 유발할 수 있다. 따라서 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양하는 경우(D), MMP-1, MMP-3의 mRNA 및 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하고자 하였다.
도 8a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서 기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)인 MMP-1과 MMP-3의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 나타낸 도면이고, 도 8b는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서 기질금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinases; MMPs)인 MMP-1과 MMP-3의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 건 세포에 염증이 유발된 경우(B), MMP-1과 MMP-3의 단백질 발현은 증가하였으나, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양하는 경우(D)에는 MMP-1, MMP-3의 발현이 유의하게 감소하였다. 특히, 밴드를 정량화하여 분석한 결과에 따르면, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 공배양한 것(D)이 대조군(MSC-GFP)을 공배양한 것(C)보다 MMP-3 단백질 발현이 유의적인 감소함을 확인할 수 있다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 주변 분비가 성장인자 관련 유전자에 미치는 영향 평가
bFGF는 혈관 신생에서 중요한 역할을 하며 이는 건 치료에 혈액을 공급하는데 필요한 성장인자으로, 치유 과정 초기에 bFGF 발현이 상승한다면, 이는 건 치유를 촉진시키고 있다고 볼 수 있다. 따라서 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 처리에 따라, 주변 분비로 인해 영향받은 건세포로부터 성장인자( bFGF, TGF-β2 및 HGF) 발현 양상을 확인하였다.
도 9a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 bFGF의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 9a에 나타난 바와 같이, 건 세포에 염증이 유발된 경우(B), bFGF 발현이 7.35 ± 1.22배 증가하였고, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D)에는 10.80 ± 2.20 배 증가하였다.
A, B, C, D 그룹으로부터 bFGF, TGF-β2, HGF의 발현 수준을 ELISA을 통해 확인하고자 하였다. 구체적으로 시판되어 있는 ELISA kit(Quantikine™, Research & Diagnostic Sy stems, Minneapolis, MN)를 이용하였다. 측정 과정은 간략하게, 시료를 bFGF, TGF-β2 또는 HGF에 대한 단세포항체가 입혀져 있는 웰에 넣고 2 시간동안 상온에 보관하였다. 이후 결합하지 않은 단백질을 세척한 다음, 기질용액을 가하여 발생시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료는 복수로 측정하여 평균을 측정치로 하였다.
도 9b 내지 도 9d는 A, B, C, D 그룹으로부터 세포 배양액을 얻어 bFGF, TGF-β2, HGF의 발현 수준을 효소 결합 면역 흡착법으로 분석하여 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 9b 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 정상환경의 건 세포(A)와 염증이 유발된 건세포(B)는 bFGF 발현양에 차이가 없었고 대조군(MSC-GFP)가 처리된 건 세포(C)의 배양액에서는 bFGF가 443.56 ± 66.38 pg/㎖ 측정되었다. Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)가 처리된 건 세포(D)는 bFGF 발현량이 5409.56 ± 1146.73 pg/㎖인 것으로 확인되었다. 이는 염증이 유발된 건세포(B)에 비해 26.55 배, 대조군(MSC-GFP)가 처리된 건 세포(C)에 비해 12.20 배이상 증가한 것임을 알 수 있다.
또한, 염증이 유발된 건세포(B)보다 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)가 처리된 건 세포(D)의 TGF-β2 분비양이 4.52 배 더 높았고, HGF의 분비양은 1.26배 더 높은 것을 확인하였다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)의 주변 분비가 건 관련 유전자에 미치는 영향 평가
도 10a는 A, B, C, D 4가지 그룹(48 시간 공배양)에서의 Scx의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이고, 도 10b는 A, B, C, D 그룹으로부터 Mkx의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이며, 도 10c는 A, B, C, D 그룹으로부터 Egr-1의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이며, 도 10d는 A, B, C, D 그룹으로부터 Egr-2의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하여 정량적으로 나타낸 그래프이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 10a 내지 도 10d에 나타난 바와 같이, 건 세포에 염증반응이 야기되면(B) Scx 발현이 4.30 ± 1.17 배 유의적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 이에 반해 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D) Scx의 발현이 유의적으로 감소하였다.
건 세포에 염증반응이 야기되면(B) Mkx 발현은 유의적으로 감소하였고, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D)에는 발현 수준 변화를 거의 나타내지 않았다.
Egr-1은 대조군(MSC-GFP)을 공배양한 것(C)에서는 발현 변화가 나타나지 않았으나, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D)에는 Egr-1 발현이 5.57 ± 2.63 배 유의적으로 증가하였음을 알 수 있다.
Egr-2는 건 세포에 염증반응이 야기되면(B) 발현이 유의적으로 감소하였다. Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 건 세포와 공배양한 경우(D)에는 Egr-2의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 이는 정상 건세포(A)와 동일한 수준으로 회복하였다.
상술한 실험결과를 종합하면, 염증 환경에서 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 건세포를 공배양하면, 염증 매개 관련 면역 인자의 발현을 감소시키고 염증 저해 관련 면역인자 IL-10의 발현을 증가시킴을 알 수 있다. 또한 MMP-3의 발현을 감소시키고 성자인자 bFGF, TGFβ2, HGF 분비와 bFGF 발현을 증가시키고 Egr-1, Egr-2의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과들을 통해, Zkscan8 유전자 과발현 또는 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)에 의해 염증 반응을 억제, 저해, 완화, 회복시킨다는 것을 알 수 있다.
Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)에 대한 지방, 골, 연골, 건, 근육 및 신경 관련 마커 발현 양상 분석
건 조직은 뼈, 연골 및 근육과 유사점이 많다. 따라서 Zkscan 8 역시 건 조직뿐만 아니라 근골격계를 구성하는 지방, 골, 연골, 건, 근육 및 신경 세포에도 긍정적인 영향을 주는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)를 제조하고 2 일 및 3 일이 지난 후 근골격계 관련 마커를 포함한 다양한 유전자들의 발현 양상을 분석하였다.
도 11은 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)와 대조군(MSC-GFP)에서의 지방, 골, 연골, 건, 근육, 신경 세포 관련 마커 발현 양상을 분석한 결과로, 이에 따르면 Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)에서 지방, 골, 연골, 근육 및 신경 관련 유전자들의 발현이 전반적으로 증가하였다. 특히, Zkscan 8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC-Zk8)는 대조군(MSC-GFP)에 비해 3 일 차에서 ALP(Alkaline phosphatase), Sox6(SRY-Box Transcription Factor 6), Egr-2, Col1A1, Desmin, NEFL(Neurofilament light polypeptide) 발현이 크게 증가함을 알 수 있다. 이는 Zkscan8의 과발현이 골, 연골, 근육 및 신경을 포함한 근골격계에 영향을 주고 있음을 의미하는 것이다.
동물실험의 각 그룹에 대한 거시적 평가
도 12a는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 거시적 모습이다. 이때 건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위해, 결손 주위의 주변 조직들을 제거하였다.
도 12b는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 총 거시적점수(the total macroscopic score)를 분석하여 나타낸 결과이다.
도 12c는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 건의 두께(tendon thickness)를 분석하여 나타낸 결과이고, 도 12d는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 부기/발적(swelling/redness of tendon)을 분석하여 나타낸 결과이며, 도 12d는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 염증(inflammation)을 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 외형적으로 심한 손상을 평가하는 총 거시적 점수를 각 군별로 비교하였다. 2 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 4.88 ± 0.64이였으나, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각 11.13 ± 1.25(p < 0.000), 7.38 ± 1.06(P < 0.000)으로 손상 정도가 심각한 것을 알 수 있다. 즉, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)가 처리된 경우에는 건 세포의 손상이 다른 군들에 비해 현저히 낮음을 알 수 있다.
4 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 총 거시적 점수가 2.75 ± 0.46이였다. 이에 반해 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각 9.13 ± 0.35(P < 0.000) 그리고 4.25 ± 0.89(P < 0.000)으로 손상 정도가 MSC-Zk8에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다. 상술한 실험을 통해 Zkscan8가 과발현될 경우, 탯줄유래 중간엽 줄기세포의 조직 손상 회복 능력이 현저히 상승함을 알 수 있다.
염증과 관련된 변수인 건의 두께만을 구체적으로 살펴보면, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 0.50 ± 0.53이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 2.25 ± 0.89(p < 0.000), 1.25 ± 0.46인 것으로 확인되었다, 즉 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건 두께가 다른 군들에 비해 현저히 낮은 것으로 확인된 바, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 건에서의 염증반응을 억제하여 건 두께를 크게 회복시킴을 알 수 있다.
4 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건의 두께는 0.00 ± 0.00이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 1.50 ± 0.53(P < 0.000), 0.25 ± 0.46인 것으로 확인되었다. 즉 여전히 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건 두께가 가장 낮은 것을 알 수 있다.
염증과 관련된 변수인 건의 부기 및 발적만을 구체적으로 살펴보면, 2 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 0.75 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 1.75 ± 0.46(p < 0.000), 0.75 ± 0.46인 것으로 확인되었다. Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건 부기 및 발적 수준은 다른 군들에 비해 현저히 낮은 것으로 확인되었다. 즉, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 의해 건의 부기와 발적이 회복되었음을 알 수 있다.
4 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건의 두께는 0.25 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 1.00 ± 0.00(P = 0.001), 0.75 ± 0.46(P = 0.029)인 것으로 확인되었다. 즉 여전히 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건의 부기 및 발적 정도가 가장 낮은 것을 알 수 있다. 즉, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 시간이 지남에 따라 건의 부기와 발적이 현저히 회복됨을 알 수 있다.
염증과 관련된 변수인 건의 염증만을 구체적으로 살펴보면, 2 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 0.25 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 1.00 ± 0.00(p = 0.001), 0.75 ± 0.46(p = 0.029)인 것으로 확인되었다. Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건 염증 수준은 다른 군들에 비해 현저히 낮은 것으로 확인되었다. 즉, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 의해 건의 염증이 회복되었음을 알 수 있다.
4 주째일 때, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건의 염증 수준은 0.25 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 1.00 ± 0.00(P = 0.001), 0.50 ± 0.53 인 것으로 확인되었다. 즉 여전히 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 건의 염증 정도가 가장 낮은 것을 알 수 있다. 즉, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 시간이 지남에 따라 건의 염증이 현저히 회복됨을 알 수 있다.
본 발명의 실험결과를 종합하면, 회전근개의 손상으로, 회전근개에 염증성 질환이 발생하면, 회전근개의 염증에 의해 붓고, 발적되고, 두께가 커지며, 염증이 심해져, 환자의 움직임이 제한되고 극심한 통증을 유발하게 된다. 그러나 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)을 투여하면, 회전근개의 두께, 부기, 발적, 염증 등을 예방 또는 회복시키므로, 건의 염증성 질환에 의해 야기될 수 있는 환자의 고통과 증상을 완화, 개선, 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
동물실험의 각 그룹에 대한 조직학적 평가
도 13a는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건을 H&E 염색한 사진(배율:×100)이고, 도 13b는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 혈관밀도(Vascular density)를 분석하여 나타낸 결과이며, 도 13c는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 침윤된 염증 세포(Infiltrated inflammatory cells)를 분석하여 나타낸 결과이다. 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준오차(S.E.M)로 표시하였다(*p< 0.05).
도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 실험 수행 2주차에는 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-GFP group)의 혈관밀도는 49.22 ± 16.60이였고, 생리식염수 군은 22.14 ± 5.70(P = 0.033)이였고, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 26.34 ± 7.54(P = 0.004)이였다. 즉 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-GFP group)에서 비특이적인 혈관 형성이 많이 일어남을 알 수 있었다.
실험 수행 4주차에는, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 혈관밀도가 22.94 ± 2.26이였고, 생리식염수군의 혈관밀도는 49.95 ± 14.59(P = 0.004)이였다. 즉 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-GFP group)보다 비특이적인 혈관 형성이 현저히 적게 일어남을 알 수 있었다.
도 13a 및 도 13c에 나타난 바와 같이, 실험 수행 2주차에는 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)의 염증세포의 침윤정도는 2.75 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 각각 3.50 ± 0.53(P = 0.001), 4.00 ± 0.00(P < 0.001)이였다. 즉 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-GFP group)은 다른 군들에 비해 염증세포의 침윤정도가 현저히 낮음을 알 수 있다.
실험 수행 4주차에는, Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 염증세포 침윤정도가 1.00 ± 0.00이였고, 생리식염수군의 혈관밀도는 3.25 ± 0.89(P < 0.001)이였으며, 탯줄유래 중간엽 줄기세포군은 2.50 ± 0.53 (P = 0.001)이였다. 즉 Zkscan8 도입 탯줄유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 다른 군들보다 염증세포 침윤 정도가 현저히 감소함을 알 수 있다.
치료를 위하여 중간엽 줄기세포를 사용하는 경우, NK-, T- 그리고 B-세포와 같은 선천적 및 후천적 면역반응의 표적이 될 수 있다. 외부 물질에 반응하는 이 두 주요 기전은 모든 사람에게 존재하고, 종 사이의 이종 이식만이 아니라 서로 같은 종에게 이식한다 하더라도 피할 수 없다. 본 발명에서는 염증성 질환과 관련된, 특히 근골격계 염증성 질환과 관련된 유전자를 밝히고, 이를 과발현 시켰을 때, 나타나는 효과를 관찰한 결과, 완성하게 되었다. 특히 Zkscan 8 유전자의 과발현을 위해 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 사용한 결과, 전혀 다른 종인 랫트에게 주입하는 이종이식을 시행하였음에도, 거부반응과 같은 부작용이 관찰되지 않고, 염증에 의해 망가진 건을 재생 및 회복시키고 있음을 확인하였다.
Zkscan 8을 과발현하기 위해, 본 발명의 일 구현예에 따르면 Zkscan 8이 도입된 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 제조하였고, 이를 처리한 경우, 탯줄유래 중간엽 줄기세포만을 처리한 것보다 혈관 형성 및 염증 정도가 현저히 감소하였고, 건의 두께, 건의 부기/발적 및 염증도 확연히 감소하였다. 또한 Zkscan 8이 도입된 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 처리한 경우가, 항 염증성 사이토카인 IL-10을 증가시켜 현저히 강력하게 염증을 조절할 수 있다.
종합하면, Zkscan 8이 도입된 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 임상에서 사용할 경우 면역 거부 반응이 유도되지 않으며, 오히려 염증으로 인해 증가된 면역을 조절하고, 결국 건 조직의 염증반응을 억제 및 완화하는 등의 긍정적인 결과를 도출하는 것을 알 수 있다.
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600 agttctggag accaggaaat gacagctaca cttctcacag cagggttcca gactttggag 660 aagattgaag acatggctgt gtcccttatt cgagaggagt ggcttcttga tccatcacag 720 aaggatctgt gtagagataa caggccagaa aatttcagaa acatgttctc cctgggtggt 780 gagaccagga gtgagaacag ggaattagct tcaaaacagg taatatctac tggaatccag 840 ccacatggag agacagctgc caaatgcaac ggggatgtta tcaggggtct tgagcatgaa 900 gaagcccgag accttctggg cagattagag aggcagcggg gaaatcccac acaagagaga 960 cgacataaat gtgatgaatg tgggaaaagc tttgctcaga gctcaggcct tgttcgccac 1020 tggagaatcc acactgggga gaaaccctat cagtgtaatg tgtgtggtaa agccttcagt 1080 tacaggtcag cccttctttc acatcaggat atccacaaca aagtaaaacg ctatcactgt 1140 aaggagtgtg gcaaagcctt cagtcagaac acaggcctga ttctgcacca gagaatccac 1200 actggggaga agccatatca gtgcaatcag tgtgggaagg ctttcagtca gagtgcgggc 1260 cttattctgc accagagaat ccacagtgga gagagaccct atgaatgtaa tgagtgtggg 1320 aaagctttca gtcatagctc acacctcatt ggacatcaga gaatccacac tggggagaag 1380 ccctatgagt gtgatgagtg tgggaaaacc ttcaggcgga gctcacatct tattggtcat 1440 cagaggagcc acactgggga gaaaccctac aaatgcaatg agtgtgggag ggccttcagt 1500 cagaagtcag gccttattga acatcagaga atccacactg gagaaagacc ctataaatgt 1560 aaagaatgtg ggaaagcttt caatgggaac actggtctca ttcaacacct gagaattcac 1620 acaggggaga agccctacca atgtaatgag tgtgggaaag cctttattca gaggtcaagt 1680 ctcattcgac atcagagaat ccacagtggt gaaaaatctg aatccataag cgtttag 1737 <210> 2 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) <400> 2 Met Ala Glu Glu Ser Arg Lys Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Asp Gln 1 5 10 15 Thr Pro Glu Glu Asp Leu Val Ile Val Lys Val Glu Glu Asp His Gly 20 25 30 Trp Asp Gln Glu Ser Ser Leu His Glu Ser Asn Pro Leu Gly Gln Glu 35 40 45 Val Phe Arg Leu Arg Phe Arg Gln Leu Arg Tyr Gln Glu Thr Leu Gly 50 55 60 Pro Arg Glu Ala Leu Ile Gln Leu Arg Ala Leu Cys His Gln Trp Leu 65 70 75 80 Arg Pro Asp Leu Asn Thr Lys Glu Gln Ile Leu Glu Leu Leu Val Leu 85 90 95 Glu Gln Phe Leu Thr Ile Leu Pro Glu Glu Leu Gln Thr Leu Val Lys 100 105 110 Glu His Gln Leu Glu Asn Gly Glu Glu Val Val Thr Leu Leu Glu Asp 115 120 125 Leu Glu Arg Gln Ile Asp Ile Leu Gly Arg Pro Val Ser Ala Arg Val 130 135 140 His Gly His Arg Val Leu Trp Glu Glu Val Val His Ser Ala Ser Ala 145 150 155 160 Pro Glu Pro Pro Asn Thr Gln Leu Gln Ser Glu Ala Thr Gln His Lys 165 170 175 Ser Pro Val Pro Gln Glu Ser Gln Glu Arg Ala Met Ser Thr Ser Gln 180 185 190 Ser Pro Thr Arg Ser Gln Lys Gly Ser Ser Gly Asp Gln Glu Met Thr 195 200 205 Ala Thr Leu Leu Thr Ala Gly Phe Gln Thr Leu Glu Lys Ile Glu Asp 210 215 220 Met Ala Val Ser Leu Ile Arg Glu Glu Trp Leu Leu Asp Pro Ser Gln 225 230 235 240 Lys Asp Leu Cys Arg Asp Asn Arg Pro Glu Asn Phe Arg Asn Met Phe 245 250 255 Ser Leu Gly Gly Glu Thr Arg Ser Glu Asn Arg Glu Leu Ala Ser Lys 260 265 270 Gln Val Ile Ser Thr Gly Ile Gln Pro His Gly Glu Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Cys Asn Gly Asp Val Ile Arg Gly Leu Glu His Glu Glu Ala Arg Asp 290 295 300 Leu Leu Gly Arg Leu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Pro Thr Gln Glu Arg 305 310 315 320 Arg His Lys Cys Asp Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ala Gln Ser Ser Gly 325 330 335 Leu Val Arg His Trp Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys 340 345 350 Asn Val Cys Gly Lys Ala Phe Ser Tyr Arg Ser Ala Leu Leu Ser His 355 360 365 Gln Asp Ile His Asn Lys Val Lys Arg Tyr His Cys Lys Glu Cys Gly 370 375 380 Lys Ala Phe Ser Gln Asn Thr Gly Leu Ile Leu His Gln Arg Ile His 385 390 395 400 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asn Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser 405 410 415 Gln Ser Ala Gly Leu Ile Leu His Gln Arg Ile His Ser Gly Glu Arg 420 425 430 Pro Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser His Ser Ser His 435 440 445 Leu Ile Gly His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys 450 455 460 Asp Glu Cys Gly Lys Thr Phe Arg Arg Ser Ser His Leu Ile Gly His 465 470 475 480 Gln Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Asn Glu Cys Gly 485 490 495 Arg Ala Phe Ser Gln Lys Ser Gly Leu Ile Glu His Gln Arg Ile His 500 505 510 Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn 515 520 525 Gly Asn Thr Gly Leu Ile Gln His Leu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 530 535 540 Pro Tyr Gln Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Arg Ser Ser 545 550 555 560 Leu Ile Arg His Gln Arg Ile His Ser Gly Glu Lys Ser Glu Ser Ile 565 570 575 Ser Val <210> 3 <211> 1737 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized zkscan8 gene sequence <400> 3 atggcggagg aaagtcggaa accatccgcc cccagtccgc ccgatcaaac ccctgaagaa 60 gaccttgtca tagtcaaagt cgaggaggac cacggctggg atcaggaaag cagccttcac 120 gagtctaacc cgcttggaca agaggttttt cgcctgagat ttcgtcagtt gcgttaccag 180 gagactcttg gtccacggga agctcttata caactgagag cattgtgtca ccaatggttg 240 cggccagacc ttaatactaa agagcagata ttagaactgc tggttttgga gcaatttttg 300 acaatactgc cggaggaact gcaaactctt gtcaaagagc accaactgga aaatggtgag 360 gaagttgtaa cccttcttga ggacctggag agacagattg atatccttgg ccgcccagta 420 tcagcgcgcg tgcatggcca tcgcgtcttg tgggaagagg tcgtccatag cgcaagtgcc 480 cctgagccac caaacactca gcttcagagc gaggcgacac agcataagtc gcctgttcct 540 caggagagcc aggaacgggc catgagtacc agtcagtcgc ctacaagaag ccaaaagggc 600 tctagtgggg atcaggaaat gacagccacg ttacttaccg cagggttcca gaccttagaa 660 aaaatcgagg atatggccgt atcgttgatc cgggaagagt ggctgcttga cccatctcag 720 aaggatctgt gcagagacaa tcggcctgag aacttccgca atatgttctc ccttggtgga 780 gaaacgcggt cggaaaatag agagctggca agcaagcaag ttatcagcac aggcatccag 840 cctcatggcg aaacggctgc taaatgtaat ggtgatgtca tacgtgggtt agaacatgag 900 gaagcccggg atttattggg gcgtctggaa cgccagcgtg gaaatccgac acaggagcgg 960 cgtcataaat gcgatgaatg tggtaagagt ttcgctcaat cgtctgggct tgttcggcat 1020 tggcggattc atacgggaga gaagccttac cagtgtaatg tatgcgggaa agcgttttca 1080 taccggtctg cccttctttc acatcaagat atccataaca aggtcaaacg ttatcactgc 1140 aaagaatgcg gtaaagcgtt ttctcagaat acggggctga tcttacatca gagaatccat 1200 accggagaaa aaccttatca atgcaatcag tgcggaaagg ccttttctca gagcgcaggg 1260 ctgattttgc atcaaagaat tcattcaggc gagcgtccct atgagtgtaa tgagtgcggc 1320 aaagctttta gccacagctc gcacctgatt ggtcatcaac gcattcacac gggtgaaaag 1380 ccctatgaat gcgatgagtg cggaaagacg tttcgccgct cgtcgcattt aataggccac 1440 caacgttctc atacaggaga aaaaccgtac aagtgcaatg aatgtgggag agccttcagc 1500 cagaaaagcg gtctgataga gcaccaacgt atccacacgg gggagagacc gtacaaatgc 1560 aaagaatgtg ggaaagcctt taatggaaat accgggctga ttcagcacct gagaattcac 1620 actggagaga agccttacca atgtaacgag tgcggtaaag cttttataca acgttcgagt 1680 ttaatacgcc atcaacggat acacagtggt gagaaatcag agtctatctc agtctaa 1737 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Zkscan8 <400> 4 cggaggaaag tcggaaacca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Zkscan8 <400> 5 cttcccgtgg accaagagtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of PPAR gamma 2 <400> 6 ttggtgactt tatggagccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of PPAR gamma 2 <400> 7 catgtctgtc tccgtcttct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of aP2 <400> 8 aagaagtagg agtgggcttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of aP2 <400> 9 ccaccaccag tttatcatcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Osteopontin <400> 10 gagacccttc caagtaagtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Osteopontin <400> 11 gatgtcctcg tctgtagcat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of ALP <400> 12 tggagcttca gaagctcaac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of ALP <400> 13 atctcgttgt ctgagtacca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Sox6 <400> 14 aacatgtggc ctcccatctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Sox6 <400> 15 tcagtgtgtc caccacatcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Aggrecan <400> 16 tcaggagggc tggaacaagt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Aggrecan <400> 17 ggaggtggta attgcaggga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Mkx <400> 18 ggccacgaac actaccatga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Mkx <400> 19 agctgcgctt tcacccttat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Egr-1 <400> 20 ccagtggagt cctgtgatcg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Egr-1 <400> 21 tcgctcctgg caaactttct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Egr-2 <400> 22 tcttcctctc tggcctaccc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Egr-2 <400> 23 gtctgttggg gtacttgcga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of COL1a1 <400> 24 agtggtttgg atggtgccaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of COL1a1 <400> 25 gcaccatcat ttccacgagc 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of COL3a1 <400> 26 cttctctcca gccgagctt 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of COL3a1 <400> 27 ccagtgtgtt tcgtgcaacc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Desmin <400> 28 gaggaaatcc ggcacctcaa 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of Desmin <400> 29 catccccgtg tctcgatggt c 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of NEFL <400> 30 ctggaaatcg aagcatgccg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of NEFL <400> 31 gcgggtggac atcagatagg 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of GAPDH <400> 32 aaatcccatc accatcttcc ag 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence of GAPDH <400> 33 catgagtcct tccacgatac c 21

Claims (13)

  1. ZKSCAN 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 단백질을 유효성분으로 함유하는 염증성 건 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 ZKSCAN 8은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 염증성 건 질환은 건염, 건초염, 건주위염 및 건활막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증성 건 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스성 벡터는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기세포(stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 COX-2, mPGES-1, TNF-α, MMP-1, MMP-3의 발현 또는 활성을 억제하고, IL-10의 발현은 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. (a) 염증반응을 유발할 수 있는 자극을 처리한 건(힘줄)(tendon) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료 내 Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8)의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하고,
    상기 (b) 단계에서 Zkscan 8의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 시험물질은 염증성 건 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정하는 것을 특징으로 하는 염증성 건 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 염증성 건 질환은 건염, 건초염, 건주위염 및 건활막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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