KR102519720B1 - High-efficiency immobilized porous membrane for enzyme fixation and portable urea biosensor based on the same for use in flow conditions - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고효율로 고정화된 효소 고정용 다공성막 및 상기 효소 고정용 다공성막을 기반으로 하는 유동 조건에서 사용 가능한 휴대용 요소 바이오센서에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 아민 작용기화된 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제로 반응시켜 상기 아민기가 활성 숙신이미딜기로 전환된 필름으로 코팅된 효소 고정용 다공성막, 상기 효소 고정용 다공성막의 제조방법, 상기 효소 고정용 다공성막을 이용한 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서 및 요소의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a porous membrane for immobilizing an enzyme immobilized with high efficiency and a portable element biosensor usable under a flow condition based on the porous membrane for immobilizing an enzyme. Specifically, the present invention relates to an amine-functionalized parylene film surface A porous film for enzyme fixation coated with a film in which the amine group is converted to an active succinimidyl group by reacting the group with a succinimidyl-based crosslinking agent, a method for manufacturing the porous film for enzyme fixation, and a sample in a fluid state using the porous film for enzyme fixation A portable urea biosensor for measuring urea concentration and a method for measuring urea concentration.

Description

고효율로 고정화된 효소 고정용 다공성막 및 상기 효소 고정용 다공성막을 기반으로 하는 유동 조건에서 사용 가능한 휴대용 요소 바이오센서{High-efficiency immobilized porous membrane for enzyme fixation and portable urea biosensor based on the same for use in flow conditions}High-efficiency immobilized porous membrane for enzyme fixation and portable urea biosensor based on the same for use in flow conditions}

본 발명은 숙신이미딜(succinimidyl) 기반의 가교제를 이용하여 고효율로 고정화된 효소 고정용 다공성막 및 상기 효소 고정용 다공성막을 기반으로 하는 유동 조건에서 사용 가능한 휴대용 요소 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to a porous membrane for immobilizing an enzyme immobilized with high efficiency using a succinimidyl-based cross-linking agent and a portable component biosensor usable under a flow condition based on the porous membrane for immobilizing an enzyme.

바이오센서는 생체 분자를 검출하는 분석 장치로서, 일반적으로 분자인식 층, 변환기 및 신호 발생기의 3개의 구성요소로 구성되어 있다. 분자인식 층의 경우, 항체, 앱타머, 효소, 수용체 등과 같은 다양한 생체 분자를 이용하여 특정 분석대상 물질을 포획하는데 사용되어 왔다. 특히 효소 기반 바이오센서는 효소가 분석대상 물질을 포착하고 측정 가능한 인식 신호를 생성하는데 사용될 수 있기 때문에 효과적인 분석 장치라 할 수 있다.A biosensor is an analysis device that detects biomolecules, and is generally composed of three components: a molecular recognition layer, a transducer, and a signal generator. In the case of the molecular recognition layer, various biomolecules such as antibodies, aptamers, enzymes, and receptors have been used to capture a specific analyte. In particular, enzyme-based biosensors are effective analytical devices because enzymes can be used to capture the analyte and generate a measurable recognition signal.

한편 요소(urea)를 가수 분해하는 우레아제(urease, 요소분해효소)는 요소(ureas)를 검출하는데 사용된다.Meanwhile, urease, which hydrolyzes urea, is used to detect ureas.

요소는 간에서 일어나는 단백질의 분해 과정에서 암모니아로부터 합성된 화합물이며, 신진 대사의 최종 질소 생성물이다. 포유동물과 양서류에서 독성이 높은 암모니아는 오르니틴 사이클에 의해 상대적으로 독성이 낮은 요소로 변형된다. 합성된 요소는 신장에 저장되고 소변을 통해 체내에서 배출된다. 따라서 요소는 신장 기능 장애를 확인하기 위한 중요한 바이오 마커이다. Urea is a compound synthesized from ammonia during protein breakdown in the liver and is the final nitrogen product of metabolism. In mammals and amphibians, highly toxic ammonia is transformed into less toxic urea by the ornithine cycle. The synthesized urea is stored in the kidneys and excreted from the body through urine. Therefore, urea is an important biomarker for identifying renal dysfunction.

이러한 이유로, 요소를 측정할 수 있는 우레아제에 기초한 다양한 바이오센서가 전기 화학, 광학, 압전적 검출 분석법들이 개발되었다. 이 중에서 전기화학적 요소 바이오센서는 감도가 높고 효율적이고 신속한 분석이 가능하여 널리 개발되어 왔다. 또한 다양한 전기화학적 요소 바이오센서가 전류 측정, 전압 전류법 및 임피던스 분광법에 기초하여 연구되고 있지만, 실제 사용과 관련된 단점은 여전히 논쟁의 여지를 가지고 있다. For this reason, various urease-based biosensors that can measure urea have been developed with electrochemical, optical, and piezoelectric detection assays. Among them, electrochemical element biosensors have been widely developed because of their high sensitivity and efficient and rapid analysis. In addition, various electrochemical component biosensors are being studied based on amperometric, voltammetry and impedance spectroscopy, but the drawbacks related to practical use are still controversial.

요소 바이오센서의 문제점으로는 좁은 동적 범위와 정적 측정 조건으로, 실제 생리학적 시료의 실시간 모니터링을 위해서는 유동 조건에서의 바이오 센싱이 필수적이다. 즉, 혈액이나 소변 수집 후 정체 상태에서의 요소 농도 측정은 용이하게 측정할 수 있지만 혈액투석이나 복막투석 등 투석 진행 상황을 모니터링 하기 위해서는 유동 상태에서 요소 농도를 측정할 수 있어야 한다. 하지만 유동 상태에서 성공적인 바이오 센싱을 가능하게 하는 기술이 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.Problems with urea biosensors include a narrow dynamic range and static measurement conditions. For real-time monitoring of actual physiological samples, biosensing under flow conditions is essential. That is, it is easy to measure urea concentration in a stagnant state after blood or urine collection, but it is necessary to measure urea concentration in a fluid state in order to monitor the progress of dialysis, such as hemodialysis or peritoneal dialysis. However, a technology that enables successful biosensing in a fluid state has not yet been developed.

효소-기반 바이오센서에서 민감한 분자 인식 층의 형성을 위해서는 트랜스 듀서 또는 고체 지지체 상에 효소를 고정시키는 기술이 핵심 기술 중 하나이다 (Delvaux and Demoustier-Champagne 2003; Wang et al. 2003). 지지체 상에 효소를 고정하기 위해 물리적 흡착, 효소 포획 및 가교와 같은 다양한 고정화 기술이 보고된 바 있고, 그 중에서도 가교에 의한 공유 고정화는 고체 지지체와 효소 사이를 가장 강하게 결합하는 방법으로 여겨지고 있다. Immobilization of enzymes on transducers or solid supports is one of the key technologies for the formation of sensitive molecular recognition layers in enzyme-based biosensors (Delvaux and Demoustier-Champagne 2003; Wang et al. 2003). Various immobilization techniques such as physical adsorption, enzyme entrapment, and crosslinking have been reported to immobilize the enzyme on the support, and among them, covalent immobilization by crosslinking is considered to be the strongest binding method between the solid support and the enzyme.

특히, 동형이중기능적 가교제(homobifunctional crosslinker)인 글루타알데히드(glutaraldehyde: GA)는 단백질의 아미노기에 대한 강력한 반응성으로 인해 효소 고정화, 생물학적 시료 고정, 생체 촉매 설계 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 그러나 글루타알데히드(glutaraldehyde: GA)는 쉽게 GA 분자가 폴리머화(polymerization)되고 알데히드기의 안정성 및 아민-알데히드 반응의 가역성과 같은 문제점을 가지고 있다. In particular, glutaraldehyde (GA), a homobifunctional crosslinker, is widely used in various fields such as enzyme immobilization, biological sample immobilization, and biocatalyst design due to its strong reactivity to amino groups of proteins. However, glutaraldehyde (GA) has problems such as easy polymerization of GA molecules, stability of aldehyde group and reversibility of amine-aldehyde reaction.

또한 효소 고정화의 경우, 반응성 작용기뿐만 아니라 기능성 말단 사이의 간격 길이도 중요하다. 가교제에서 동일한 기능기로 링커의 길이를 변경함으로써 고정화 효소의 활성이 변화될 수 있고, 이는 바이오센서의 민감도에 직접적으로 영향을 줄 수 있다.Also in the case of enzyme immobilization, not only the reactive functional group but also the length of the gap between the functional ends are important. By changing the length of the linker with the same functional group in the crosslinker, the activity of the immobilized enzyme can be changed, which can directly affect the sensitivity of the biosensor.

따라서 유동 조건에서 요소를 효과적으로 모니터링 할 수 있는 효소 고정화 기술 및 이를 이용한 새로운 바이오센서의 기술개발이 필요한 실정이며, 이에 본 발명자들은 요소분해효소의 고정화를 향상시킬 수 있기 위한 방법으로 동형이중기능적 디숙신이미딜 가교제를 사용하여 요소분해효소 고정화 막을 제조하는 기술을 개발하였고, 이를 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, it is necessary to develop an enzyme immobilization technology capable of effectively monitoring urea under flow conditions and a new biosensor using the same technology. Accordingly, the present inventors have developed a homozygous bifunctional disuccinimase as a method for improving the immobilization of urease. A technique for preparing a urease-immobilized membrane using an imidyl crosslinking agent was developed, and a portable urea biosensor based thereon was developed to complete the present invention.

한국공개특허 제10-2015-0092474호Korean Patent Publication No. 10-2015-0092474 한국등록특허 제10-1552041호Korean Patent Registration No. 10-1552041 한국공개특허 제10-2016-0131311호Korean Patent Publication No. 10-2016-0131311

따라서 본 발명의 목적은 아민 작용기화된 파릴렌 코팅 다공성막에 높은 효율로 효소를 고정화시키기 위하여, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제로 반응시켜 아민기가 활성 숙신이미딜기로 전환된 필름으로 코팅된 효소 고정용 다공성막 및 이의 제조방법을 제공하려는 것이다.Therefore, an object of the present invention is to obtain a film in which the amine group is converted into an active succinimidyl group by reacting the amine group on the surface of the parylene film with a succinimidyl-based crosslinking agent in order to immobilize the enzyme with high efficiency on the amine-functionalized parylene-coated porous film. It is intended to provide a coated porous membrane for immobilizing enzymes and a method for manufacturing the same.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 효소 고정용 다공성막을 포함하며, 검출 결과에 대한 재현성 및 검출 민감도가 우수하고 휴대 가능한 요소(urea) 바이오센서를 제공하려는 것이다.Another object of the present invention is to provide a portable urea biosensor that includes the porous membrane for immobilizing the enzyme of the present invention and has excellent reproducibility and detection sensitivity for detection results.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 휴대용 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 유동상태의 시료에 존재하는 요소의 농도를 측정하는 방법을 제공하려는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for measuring the concentration of urea present in a sample in a fluidized state by an electrochemical method using the portable urea biosensor of the present invention.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 아민 작용기화된 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제로 반응시켜 상기 아민기가 활성 숙신이미딜기로 전환된 필름으로 코팅된, 효소 고정용 다공성막을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention is a film coated with a film in which the amine group is converted to an active succinimidyl group by reacting the amine group on the surface of the amine-functionalized parylene film with a succinimidyl-based crosslinking agent. A porous membrane for use is provided.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 및 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS(PEG)5)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the succinimidyl crosslinking agent is disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and bis-N-succinimide It may be selected from the group consisting of dil-(pentaethylene glycol) esters (BS(PEG) 5 ).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 요소분해효소(urease)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the enzyme may be a urease.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다공성 막은 불용성 다공성 막으로, 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the porous membrane is an insoluble porous membrane, and fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk fibroin, polyimides, polyamix acid, polycarprolactone ), polyetherimide, nylon, polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenyl Polyphenyleneterephthalamide, polyaniline, polyacrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, polymethyl methacrylate (polymethylmethacrylate), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), a copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly{poly(ethylene oxide) terephthalate-co-butylene Terephthalate} (PEOT/PBT), polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), polytetrafluoroethylene (PTFE), poly(ortho ester) 1 selected from the group consisting of POE}, poly(propylene fumarate)-diacrylate {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA} It can be more than one kind of biocompatible material.

또한, 본 발명은, (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; 및 (2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제와 반응시켜 상기 아민기를 활성 숙신이미딜기로 전환하는 단계;를 포함하는, 효소 고정용 불용성 다공성막의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (1) uniformly depositing an amine-functionalized parylene film on an insoluble porous film at room temperature; and (2) converting the amine group on the surface of the parylene film to an active succinimidyl group by reacting the amine group on the surface of the parylene film with a succinimidyl crosslinking agent after depositing the parylene film. do.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 및 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS(PEG)5)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the succinimidyl crosslinking agent is disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and bis-N-succinimide It may be selected from the group consisting of dil-(pentaethylene glycol) esters (BS(PEG) 5 ).

또한 본 발명은, (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; (2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제와 반응시켜 상기 아민기를 활성 숙신이미딜기로 전환하는 단계; 및 (3) 상기 파릴렌 필름 표면의 활성 숙신이미딜기와 유리 아민기를 가진 요소분해효소(urease)를 화학 반응시켜 요소분해효소를 불용성 다공성 막에 고정화하는 단계;를 포함하는, 요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (1) uniformly depositing an amine-functionalized parylene film on an insoluble porous film at room temperature; (2) converting the amine group on the surface of the parylene film into an active succinimidyl group by reacting with a succinimidyl-based crosslinking agent after depositing the parylene film; And (3) chemically reacting the active succinimidyl group on the surface of the parylene film with a urease having a free amine group to immobilize the urease on the insoluble porous membrane; It provides a method for producing an insoluble porous membrane.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 및 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS(PEG)5)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the succinimidyl crosslinking agent is disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and bis-N-succinimide It may be selected from the group consisting of dil-(pentaethylene glycol) esters (BS(PEG) 5 ).

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막을 포함하는, 요소(urea) 측정용 바이오센서를 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor for measuring urea, comprising an insoluble porous membrane to which the urease prepared by the method of the present invention is immobilized.

또한 본 발명은, 유체 챔버; 상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 숙신이미딜계 가교제를 이용한 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막; 상기 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성In addition, the present invention, the fluid chamber; a parylene-A-coated insoluble porous membrane positioned in the fluid chamber and fixed to a urease by chemical bonding using a succinimidyl-based crosslinking agent; Parylene-A coating insoluble porosity to which the urease is fixed by chemical bonding

막에 근접하게 위치하며 상기 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템; 상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및 상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하는, 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서를 제공한다.a screen-printed three-electrode system including a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode positioned proximate to the membrane and sensing an electrochemical signal generated by the membrane; a sample inlet through which a sample flowing into the fluid chamber is introduced; and a sample outlet through which the sample flows out from the fluid chamber.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 및 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS(PEG)5)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the succinimidyl crosslinking agent is disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and bis-N-succinimide It may be selected from the group consisting of dil-(pentaethylene glycol) esters (BS(PEG) 5 ).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불용성 다공성 막은 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the insoluble porous membrane is fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk fibroin, polyimides, polyamix acid, polycarprolactone, polyether Polyetherimide, nylon, polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenylene terephthalamide ( polyphenyleneterephthalamide), polyaniline, polyacrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, polymethylmethacrylate, Polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), a copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly{poly(ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate} ( PEOT/PBT), polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), polyorthoester {poly(ortho ester; POE}, At least one biocompatibility selected from the group consisting of poly(propylene fumarate)-diacrylate {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA} It may be made of material.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유체 챔버와 상기 3-전극 시스템을 감싸는 하우징을 더 포함하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, it may further include a housing surrounding the fluid chamber and the 3-electrode system.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3-전극 시스템의 작용 전극은 아민화된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the working electrode of the three-electrode system may be aminated.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3-전극 시스템은 외부의 전기화학 분석장치와 연결하여 유체 챔버 내의 전기화학 신호를 탐지하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the three-electrode system may be connected to an external electrochemical analyzer to detect an electrochemical signal in the fluid chamber.

또한 본 발명은 본 발명의 휴대용 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 유동상태의 시료에 존재하는 요소의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for measuring the concentration of urea present in a sample in a fluidized state by an electrochemical method using the portable urea biosensor of the present invention.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료로서 혈액, 혈청, 소변, 눈물 및 땀으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample may be a biological sample selected from the group consisting of blood, serum, urine, tears and sweat.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유동상태의 시료는 0.5 내지 10mL/min의 유속으로 흐르는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample in the fluidized state may flow at a flow rate of 0.5 to 10 mL/min.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 휴대용 요소 바이오센서는 요소 농도가 0.6 내지 20mM로 포함된 시료 중에서 요소 검출이 가능한 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the portable urea biosensor may be capable of detecting urea in a sample containing 0.6 to 20 mM urea concentration.

본 발명에 따른 효소 고정용 다공성막은 가교제로서 숙신이미딜계 가교제를 사용함으로써 종래 글루타알데히드 가교제에 비해 고효율로 효소를 고정화시킬 수 있고 고정화된 효소가 높은 활성을 갖는 효과가 있다.The porous membrane for enzyme immobilization according to the present invention uses a succinimidyl-based crosslinking agent as a crosslinking agent, so that the enzyme can be immobilized with high efficiency compared to conventional glutaraldehyde crosslinking agents, and the immobilized enzyme has an effect of having high activity.

또한 본 발명의 효소 고정용 다공성막을 기반으로 하는 요소 바이오센서는 상기 다공성막에 고효율로 요소분해효소가 고정화되어 있어 높은 민감도로 정확하게 요소의 농도를 측정할 수 있는 효과가 있다.In addition, the urea biosensor based on the porous membrane for enzyme immobilization of the present invention has an effect of accurately measuring the concentration of urea with high sensitivity because the urease is immobilized in the porous membrane with high efficiency.

또한 본 발명의 요소 바이오센서는 유동 상태의 시료를 대상으로도 요소 농도를 측정할 수 있어, 혈액 투석이나 복막 투석 중에도 실시간으로 요소 측정이 가능하다는 장점이 있을 뿐만 아니라 본 발명의 요소 바이오센서는 크기가 작고 다루기가 편리하여 휴대가 용이하므로 사용 장소의 제약이 없고, 고농도 요소까지 검출할 수 있어 넓은 농도범위에 요소를 정량적으로 측정할 수 있는 효과가 있다.In addition, the urea biosensor of the present invention can measure the urea concentration even in a sample in a fluid state, so it has the advantage of being able to measure urea in real time even during hemodialysis or peritoneal dialysis. Since it is small and easy to handle, it is easy to carry, so there is no restriction on the place of use, and it can detect even high-concentration elements, so there is an effect of quantitatively measuring elements in a wide concentration range.

도 1은 본 발명에 다른 휴대용 요소 바이오센서의 구성 단위(a) 및 전체 구성도(b)를 나타낸 사진이다.
도 2는 가교제 종류에 따른 파릴렌-A 코팅된 마이크로 플레이트에 고정화된 요소분해효소에 대한 활성도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 여기서 회색 막대는 상업적 요소 분석키트를 사용한 것이고, ■는 전기 화학적 방법을 통해 활성을 측정 한 것이다.
도 3은 가교제 종류에 따른 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막에 고정화된 요소분해효소의 활성도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 요소분해효소를 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막에 고정화시키는 과정에 대한 모식도 및 각 단계별 막 표면의 상태를 SEM으로 관찰한 사진을 나타낸 것으로, (a)는 아무것도 처리하지 않은 PTFE 막을, (b)는 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막을, (c)는 가교제인 DSS를 처리한 막을, (d)을 요소분해효소가 고정화된 막을 나타낸 것이다.
도 5는 요소분해효소를 고정화시키는 각 단계에 대한 (FT-IR(Fourier-transform infrared) 분석 스펙트럼을 나타낸 것으로, (a)는 아무것도 처리하지 않은 PTFE 막을, (b)는 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막을, (c)는 가교제인 DSS를 처리한 막을, (d)을 요소분해효소가 고정화된 막을 나타낸 것이다.
도 6은 PBS에 용해된 요소를 검출한 결과에 관한 것으로, (a)는 가교제 종류에 따른 요소분해효소가 고정된 막을 이용하여 요소를 실시간으로 모니터링 한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 요소 농도에 다른 센서의 반응도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실제 혈청내 요소를 검출한 결과에 관한 것으로, (a)는 가교제인 DSS를 이용하여 요소분해효소를 고정시킨 막을 이용하여 실시간으로 요소 농도를 모니터링 한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 요소 농도에 다른 센서의 반응도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 가교제인 DSS를 이용하여 요소분해효소를 고정시킨 막을 기반으로 하는 본 발명의 요소 바이오센서에 대한 재현성을 분석한 결과이다.
도 9는 유동 조건에서 서로 다른 종류의 간섭 종을 이용하여 본 발명의 DSS 가교제를 기반으로 하는 요소 바이오센서에 대한 간섭도(선택성)를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 간섭 종으로 2 μM uric acid (UA), 30 μM glucose (Glu), 2 μM glycine (Gly), 3 mM sodium chloride (NaCl), 및 50 μM sucrose (Suc)를 각각 사용하였다.
도 10은 본 발명의 일실시예에서 사용한 글루타알데히드 가교제 및 숙신이미딜계 가교제들의 구조를 나타낸 것이고(a), 숙신이미딜계 가교제를 이용하여 요소분해효소(urease)가 고정화된 모식도(b)를 나타낸 것이다.1 is a photograph showing a configuration unit (a) and an overall configuration diagram (b) of a portable component biosensor according to the present invention.
Figure 2 shows the results of measuring the activity of urease immobilized on parylene-A-coated microplates according to the type of crosslinking agent. Here, the gray bar is a commercial urea assay kit, and ■ is the activity measured through an electrochemical method.
Figure 3 shows the results of measuring the activity of urease immobilized on the parylene-A-coated PTFE membrane according to the type of crosslinking agent.
Figure 4 shows a schematic diagram of the process of immobilizing urease on a parylene-A-coated PTFE membrane and photographs of the state of the membrane surface observed at each stage by SEM, (a) is an untreated PTFE membrane; (b) shows a PTFE membrane coated with parylene-A, (c) a membrane treated with DSS as a crosslinking agent, and (d) a membrane on which urease is immobilized.
Figure 5 shows the (FT-IR (Fourier-transform infrared) analysis spectrum for each step of immobilizing urease, (a) is an untreated PTFE film, (b) is a parylene-A coated The PTFE membrane, (c) shows a membrane treated with DSS as a crosslinking agent, and (d) shows a membrane on which urease is immobilized.
Figure 6 relates to the result of detecting urea dissolved in PBS, (a) shows the result of real-time monitoring of urea using a membrane on which urease is immobilized according to the type of crosslinking agent, and (b) shows the urea concentration The results of measuring the responsivity of other sensors are shown in Fig.
Figure 7 relates to the result of detecting urea in actual serum, (a) shows the result of monitoring the urea concentration in real time using a membrane in which urease is immobilized using DSS, a crosslinking agent, and (b) shows the result of urea concentration monitoring in real time. It shows the result of measuring the reactivity of different sensors to the urea concentration.
8 is a result of analyzing the reproducibility of the urea biosensor of the present invention based on a membrane in which urease is immobilized using DSS as a crosslinking agent.
9 shows the results of analyzing the interference (selectivity) of the urea biosensor based on the DSS crosslinking agent of the present invention using different types of interfering species under flow conditions. As an interfering species, 2 μM uric acid ( UA), 30 μM glucose (Glu), 2 μM glycine (Gly), 3 mM sodium chloride (NaCl), and 50 μM sucrose (Suc) were used, respectively.
Figure 10 shows the structure of glutaraldehyde crosslinking agent and succinimidyl crosslinking agent used in one embodiment of the present invention (a), and a schematic diagram (b) of immobilizing urease using a succinimidyl crosslinking agent. it is shown

본 발명은 아민 작용기화된 파릴렌 코팅 다공성막에 높은 효율로 효소가 고정화된 효소 고정용 다공성막에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 파릴렌(parylene) 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제로 반응시켜 아민기가 활성 숙신이미딜기로 전환된 필름으로 코팅된 효소 고정용 다공성막 및 이의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.The present invention relates to a porous membrane for immobilizing an enzyme in which an enzyme is immobilized with high efficiency on an amine-functionalized parylene-coated porous membrane. It is characterized by providing a porous membrane for enzyme fixation coated with a film in which an amine group is converted into an active succinimidyl group and a manufacturing method thereof.

특히 본 발명에서는 숙신이미딜계 가교제를 사용할 경우, 다공성막에 고효율로 효소를 고정화시킬 수 있고, 고정화된 효소가 높은 활성을 갖도록 하여, 검출하고자 하는 타겟 물질을 효과적으로 검출, 측정 또는 분석할 수 있음을 확인하였다.In particular, in the present invention, when a succinimidyl-based crosslinking agent is used, enzymes can be immobilized in a porous membrane with high efficiency, and the immobilized enzyme has high activity, so that a target material to be detected can be effectively detected, measured, or analyzed. Confirmed.

본 발명에서 상기 다공성 막에 숙신이미딜계 가교제를 이용하여 고정하고자 하는 효소는 생물학적 시료에 함유된 타겟 물질을 검출하기 위한 용도로 사용 가능한 효소 등의 단백질이라면 모두 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 요소분해효소(urease)를 사용하였다.In the present invention, the enzyme to be fixed to the porous membrane using a succinimidyl crosslinking agent may be any protein such as an enzyme usable for detecting a target substance contained in a biological sample. In , urease was used.

본 발명의 일실시예에 의하면, 가교제로서 숙신이미딜계 가교제 및 종래 가장 널리 사용되는 글루타알데히드 가교제(GA: glutaraldehyde)를 이용하였고 요소분해효소를 고정화시킨 요소분해효소(urease)가 고정화된 불용성 다공성 막을 제조하였고, 요소분해효소의 활성도를 분석하였는데, 그 결과, 글루타알데히드 가교제를 사용한 것에 비해 숙신이미딜계 가교제를 사용한 것이 효소의 활성도가 더 우수한 것으로 나타남에 따라 숙신이미딜계 가교제의 사용이 효소의 고정 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.According to one embodiment of the present invention, a succinimidyl crosslinking agent and a conventionally most widely used glutaraldehyde crosslinking agent (GA: glutaraldehyde) were used as a crosslinking agent, and an insoluble porous urease immobilized urease was used. The membrane was prepared and the activity of urease was analyzed. As a result, the use of a succinimidyl crosslinking agent showed that the enzyme activity was better than that of a glutaraldehyde crosslinking agent, so the use of a succinimidyl crosslinking agent was It was found that the fixation efficiency could be improved.

여기서 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 숙신이미딜계 가교제는 이에 제한되지는 않으나, 디숙신이미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 또는 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS(PEG)5)일 수 있고, 바람직하게는 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 일 수 있다.Here, the succinimidyl-based crosslinking agent that can be used in the present invention is, but is not limited to, disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) or bis- It may be N-succinimidyl-(pentaethylene glycol) ester (BS(PEG) 5 ), preferably disuccinimidyl suberate (DSS).

또한 본 발명은 효소 고정용 다공성막의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은, (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; 및 (2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제와 반응시켜 상기 아민기를 활성 숙신이미딜기로 전환하는 단계;를 포함한다.In addition, the present invention can provide a method for manufacturing a porous membrane for enzyme immobilization, the method comprising: (1) uniformly depositing an amine-functionalized parylene film on an insoluble porous membrane at room temperature; and (2) converting the amine group on the surface of the parylene film into an active succinimidyl group by reacting with a succinimidyl-based crosslinking agent after depositing the parylene film.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 (2) 단계의 과정을 수행한 후, 상기 파릴렌 필름 표면의 활성 숙신이미딜기와 유리 아민기를 가진 요소분해효소(urease)를 화학 반응시켜 상기 요소분해효소를 불용성 다공성 막에 고정화하는 단계를 추가로 수행하여, 요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막을 제조하였다.In one embodiment of the present invention, after performing the process of step (2), the active succinimidyl group on the surface of the parylene film and a urease having a free amine group are chemically reacted to obtain the urease A step of immobilizing on the insoluble porous membrane was additionally performed to prepare an insoluble porous membrane on which the urease was immobilized.

여기서 상기 숙신이미딜계 가교제를 이용하여 요소분해효소(urease)를 고정화시킨 모식도 및 본 발명에서 사용한 숙신이미딜계 가교제들의 구조를 도 10에 나타내었다. 10 shows a schematic view of immobilizing urease using the succinimidyl crosslinking agent and the structures of the succinimidyl crosslinking agents used in the present invention.

본 발명에서 사용 가능한 상기 불용성 다공성막은, 이에 제한되지는 않으나, 불용성 다공성 막으로, 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.The insoluble porous membrane usable in the present invention is, but is not limited to, fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk fibroin, polyimides, polyamix acid, polyimide, etc. Caprolactone, polyetherimide, nylon, polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate ), polyphenyleneterephthalamide, polyaniline, polyacrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, poly Methylmethacrylate, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly{poly(ethylene oxide) terephthalate- co-butyleneterephthalate} (PEOT/PBT), polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyorthoester{ Composed of poly(ortho ester; POE}, poly(propylene fumarate)-diacrylate {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA} One or more selected from the group may be used.

또한 본 발명은 본 발명의 요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막을 포함하는 요소(urea) 측정용 바이오센서를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a biosensor for measuring urea including an insoluble porous membrane on which the urease of the present invention is immobilized.

구체적으로 본 발명의 요소 측정용 바이오센서는, 유체 챔버; 상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 숙신이미딜계 가교제를 이용한 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막; 상기 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막에 근접하게 위치하며 상기 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템; 상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및 상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함한다.Specifically, the biosensor for measuring elements of the present invention includes a fluid chamber; a parylene-A-coated insoluble porous membrane positioned in the fluid chamber and fixed to a urease by chemical bonding using a succinimidyl-based crosslinking agent; Screen-printed 3 including a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode for detecting an electrochemical signal generated from the membrane and located close to the parylene-A coated insoluble porous membrane to which the urease is fixed by a chemical bond. - electrode system; a sample inlet through which a sample flowing into the fluid chamber is introduced; and a sample outlet through which the sample flows out from the fluid chamber.

상기 본 발명의 요소 측정용 바이오센서는 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서이다.The biosensor for measuring urea of the present invention is a portable urea biosensor that measures the concentration of urea present in a sample in a fluidized state.

상기 유체 챔버는 전기 신호를 차단하지 않는 재질로 이루어진 유체 챔버를 사용할 수 있다.The fluid chamber may use a fluid chamber made of a material that does not block electrical signals.

상기 휴대용 요소 바이오센서에 포함되는 숙신이미딜계 가교제를 이용한 화학결합에 의해 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막은 다수 개를 사용할 수 있어 요소 바이오센서 내의 효소를 높은 농도로 유지할 수 있어 검출 감도가 높다. 상기 본 발명의 다공성 막은 6~10개를 사용할 수 있고, 바람직하게는 8개를 사용할 수 있다. A plurality of parylene-A-coated insoluble porous membranes in which urease is fixed by chemical bonding using a succinimidyl-based crosslinking agent included in the portable urea biosensor can be used to maintain the enzyme in the urea biosensor at a high concentration. Detection sensitivity is high. The porous membrane of the present invention may use 6 to 10, preferably 8.

또한 본 발명의 요소 바이오센서는 유체 챔버와 상기 3-전극 시스템을 감싸는 하우징을 더 포함할 수 있으며, 상기 3-전극 시스템의 작용 전극은 아민화된 것일 수 있고, 상기 3-전극 시스템은 외부의 전기화학 분석장치와 연결하여 유체 챔버 내의 전기화학 신호를 탐지할 수 있다.In addition, the urea biosensor of the present invention may further include a housing surrounding the fluid chamber and the 3-electrode system, the working electrode of the 3-electrode system may be aminated, and the 3-electrode system may An electrochemical signal in the fluid chamber can be detected by connecting to an electrochemical analyzer.

나아가 본 발명은 본 발명의 휴대용 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 유동상태의 시료에 존재하는 요소의 농도를 측정하는 방법을 제공함에 특징이 있다.Furthermore, the present invention is characterized by providing a method for measuring the concentration of urea present in a sample in a fluidized state by an electrochemical method using the portable urea biosensor of the present invention.

요소(urea)는 신장 기능의 중요한 지표로서 크레아티닌과 함께 널리 사용된다. 혈액 내 요소와 크레아티닌의 적정 범위는 각각 7-20mg/dL 및 0.7-1.2mg/dL이다. 신장은 생체 폐기물의 배출, 산, 염기 및 전해질의 대사 유지, 혈압 유지, 칼슘 및 인산염 대사를 조절하는 부갑상선 호르몬의 생성 및 활성화 등 많은 기능을 하는 콩 모양의 내분비 기관으로, 생체에 필수적이고, 심장에서 흘러나오는 혈액의 20-25%가 신장으로 흘러들어간다. 신장에 의해 여과되는 총 혈액량은 하루 180L이다. 혈액에서 여과된 대부분의 물은 재흡수되고, 1-2L만 소변으로 배출된다. Urea is widely used along with creatinine as an important indicator of kidney function. The optimal ranges for urea and creatinine in the blood are 7-20 mg/dL and 0.7-1.2 mg/dL, respectively. The kidney is a bean-shaped endocrine organ that performs many functions, including excretion of biological waste, maintenance of metabolism of acids, bases and electrolytes, maintenance of blood pressure, and production and activation of parathyroid hormone, which regulates calcium and phosphate metabolism. 20-25% of the blood that flows out of the kidneys flows into the kidneys. The total amount of blood filtered by the kidneys is 180 liters per day. Most of the water filtered from the blood is reabsorbed, and only 1-2 L is excreted in the urine.

한편, 항상성이 유지될 수 없도록 신장 기능이 손상된 상태를 신부전이라고 한다. 신부전증에 걸리면 사구체 여과율이 급격히 떨어지므로 혈청 내 요소 및 크레아티닌 농도가 증가한다. 급성 신부전증은 심한 부상 또는 신장에 혈액 공급 부족으로 인하여 복잡한 수술 후에 발생할 수 있다. 이 경우 신장 기능은 치료 후 정상으로 회복될 수 있다. 반면, 만성 신부전증은 초기 단계에는 특별한 증상이 없고, 고혈압 및 당뇨병과 같은 다양한 증상이 나중에 관찰된다. 만성 신부전이 지속되고 심해지면 말기 신부전(end-stage renal failure; ESRF)으로 진행할 수 있으며, 말기 신부전 시에는 신장 이식이 수행되어야 하며, 이식이 수행될 때까지 혈액 투석 또는 복막 투석이 필요한데, 혈액이나 복막에서 요소와 크레아티닌 농도가 투석 진행의 주요 지표이다. On the other hand, a state in which renal function is damaged so that homeostasis cannot be maintained is called renal failure. In renal insufficiency, the glomerular filtration rate drops sharply, resulting in increased serum urea and creatinine concentrations. Acute renal failure can occur after severe injury or complicated surgery due to insufficient blood supply to the kidneys. In this case, kidney function may return to normal after treatment. On the other hand, chronic renal failure has no specific symptoms in an early stage, and various symptoms such as hypertension and diabetes are observed later. If chronic renal failure persists and worsens, it can progress to end-stage renal failure (ESRF), and in case of end-stage renal failure, kidney transplantation must be performed, and hemodialysis or peritoneal dialysis is required until transplantation is performed. Concentrations of urea and creatinine in the peritoneum are key indicators of dialysis progress.

따라서 요소의 농도를 정확하게 검출, 측정 및 분석하는 것은 요소 관련 질환의 진단, 치료, 예후관찰 등에 있어서 매우 중요하다.Therefore, accurately detecting, measuring, and analyzing the concentration of urea is very important for diagnosis, treatment, and prognosis of urea-related diseases.

이러한 점에서 본 발명에서 제공하는 효소 고정용 다공성막을 이용한 휴대용 요소 바이오센서는 시료 내에 존재하는 요소를 신속하고 정확하게 측정 또는 검출할 수 있다.In this regard, the portable elemental biosensor using the porous membrane for immobilizing enzyme provided in the present invention can rapidly and accurately measure or detect elements present in a sample.

효소 고정용 다공성 막에 고정화된 요소분해효소 활성에 의한 요소 검출은 전기 화학적 측정을 통해 수행되어지는데, 요소분해효소는 요소의 가수 분해를 촉매하여 다음과 같이 이산화탄소와 암모니아로 가수분해된다.The detection of urea by the activity of the urease immobilized on the porous membrane for enzyme immobilization is performed through electrochemical measurement. The urease catalyzes the hydrolysis of urea and is hydrolyzed into carbon dioxide and ammonia as follows.

(NH2)2CO (요소) + H2O → CO2 + 2NH3 (NH 2 ) 2 CO (urea) + H 2 O → CO 2 + 2NH 3

요소분해효소는 요소를 암모니아 및 카바메이트 분자로 가수분해하며, 불안정한 카바메이트는 이어서 제2 암모니아 분자 및 이산화탄소 분자로 분해된다. 수용액에서 암모니아는 전하를 띤 암모늄 이온으로 존재하며, 이는 요소분해효소에 의한 요소의 가수분해 과정에서 전기 화학 신호를 생성한다. 신호의 강도는 존재하는 암모늄 이온의 양에 비례하며, 따라서 요소분해효소 기반 전기 화학적 바이오센서는 정량 분석이 가능하다. Urea hydrolyzes urea into ammonia and carbamate molecules, and the unstable carbamates are then broken down into secondary ammonia molecules and carbon dioxide molecules. In aqueous solution, ammonia exists as a charged ammonium ion, which generates an electrochemical signal during the hydrolysis of urea by urease. The intensity of the signal is proportional to the amount of ammonium ions present, and thus urease-based electrochemical biosensors are capable of quantitative analysis.

높은 감도를 얻기 위해서는 검출 가능한 양의 암모늄 이온을 생성하기 위해 고농도의 요소분해효소가 필요하다. 따라서 높은 밀도의 요소분해효소를 고정하는 것이 필수적이다. 이러한 점에서 본 발명에서 제공하는 효소 고정화 다공성막은 요소분해효소의 고정화 효율을 증가시킬 수 있어 검출 감도를 향상시킬 수 있다.To achieve high sensitivity, high concentrations of urease are required to produce detectable amounts of ammonium ions. Therefore, it is essential to immobilize a high density of urease. In this respect, the enzyme-immobilized porous membrane provided in the present invention can increase the immobilization efficiency of urease, thereby improving detection sensitivity.

본 발명의 요소 바이오센서가 적용할 수 있는 시료는 생물학적 시료라면 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않지만, 혈액, 혈청, 소변, 눈물 또는 땀일 수 있다.A sample to which the urea biosensor of the present invention can be applied may be any biological sample, but is not limited thereto, and may be blood, serum, urine, tears, or sweat.

또한 본 발명의 요소 바이오센서는 유동상태의 시료에서도 요소 검출이 가능한 특징이 있는데, 시료가 0.5 내지 10mL/min의 유속으로 흐르는 상태에서도 요소의 검출이 가능하며, 요소 농도가 0.6 내지 20mM로 포함된 시료 중에서 요소 검출이 가능하다.In addition, the urea biosensor of the present invention is characterized in that it can detect urea even in a sample in a fluid state. It is possible to detect urea in a sample.

종래 대부분의 검출용 바이오센서는 정적 조건의 시료를 대상으로만 수행되었다. 혈액이나 소변과 같이 수집 후 정체 상태에서의 요소 농도 측정은 종래 바이오센서를 이용한 진단이 가능할 수 있으나, 혈액 투석이나 복막 투석과 같이 유동조건이 수반되는 투석 진행 상황을 모니터링하기 위해서는 종래 바이오센서로는 검출이 어려운 문제가 있다.Most conventional biosensors for detection have been performed only on samples under static conditions. Measurement of urea concentration in a stagnant state after collection, such as blood or urine, can be diagnosed using a conventional biosensor. There are problems that are difficult to detect.

한편, 본원발명의 요소 바이오센서는 유동 상태의 시료를 대상으로도 요소 농도를 측정할 수 있어, 혈액 투석이나 복막 투석 중에도 실시간으로 요소 측정이 가능하다는 장점이 있다.On the other hand, the urea biosensor of the present invention can measure urea concentration even in a sample in a fluid state, and thus has the advantage of being able to measure urea in real time even during hemodialysis or peritoneal dialysis.

뿐만 아니라 본 발명의 요소 바이오센서는 크기가 작고 다루기가 편리하여 휴대가 용이하므로 사용 장소의 제약이 없고, 20mM의 고농도 요소까지 검출할 수 있어 넓은 농도범위에서의 요소를 보다 정량적으로 정확하게 높은 민감도로 측정할 수 있다. In addition, the urea biosensor of the present invention is small in size and convenient to handle, so it is easy to carry, so there is no restriction on the place of use, and it can detect urea in a wide concentration range with high sensitivity and quantitative accuracy. can be measured

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<준비예><Preparation example>

시약reagent

요소분해효소(Canavalia ensiformis 유래), 요소(urea), 인간 혈청, 글루타알데히드(glutaraldehyde: GA), 암모늄 카바메이트(ammonium carbamate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 요산, 글루코스, 글리신, 염화나트륨 및 수크로스는 Merck 사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 디숙신이미딜 글루타레이트 (Disuccinimidyl glutarate (DSG)), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate (DSS)) 및 비스-N-숙신이미딜-(펜타에틸렌 글리콜) 에스테르(BS (PEG) 5)는 Thermo Fischer Scientific (MA, US)사에서 구입하여 사용하였다. 요소 분석 키트는 BioAssay Systems (CA, US)사로부터 구입하였고, 인산 완충 식염수(PBS)는 LPS 솔루션(대전, 한국)으로부터 구입한 것을 사용하였다. 공극 크기 1.00 μm를 갖는 다공성폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene: PTFE) 막은 Advantec MFS (CA, US)사로부터 구입하여 사용하였다. Urea (from Canavalia ensiformis), urea, human serum, glutaraldehyde (GA), ammonium carbamate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate), uric acid, glucose, glycine, sodium chloride and sucrose were purchased from Merck (Darmstadt, Germany) and used. Disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and bis-N-succinimidyl-(pentaethylene glycol) ester (BS (PEG) 5) was purchased from Thermo Fischer Scientific (MA, US) and used. A urea assay kit was purchased from BioAssay Systems (CA, US), and phosphate buffered saline (PBS) was purchased from LPS Solution (Daejeon, Korea). A porous polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane having a pore size of 1.00 μm was purchased from Advantec MFS (CA, US) and used.

<실험방법><Experiment method>

PTFE 막에 파릴렌 코팅 및 요소분해효소 고정화Parylene coating and urease immobilization on PTFE membrane

PTFE 막의 표면 및 96-웰 마이크로 플레이트는 파릴렌-A를 이용하여 코팅함으로써 활성 아민으로 개질시켰다. 100 nm의 두께를 갖는 파릴렌 박막은 아래 절차에 따라 증착시켰다. (1) 아민으로 작용기화 된 파릴렌 다이머를 160℃에서 증발시켰다. (2) 다이머는 650℃에서 열분해되어 고반응성 아민-작용기화 된 p-자일렌 라디칼을 생성하였다. (3) 아민-작용기화 된 자일렌 필름을 상온에서 PTFE 막 또는 마이크로 플레이트 상에 균일하게 증착시켰다. 아민 작용기화된 표면은 1mM의 가교제인 GA, DSS, DSG 및 BS(PEG)5로 1시간 동안 각각 처리함으로써 상기 표면의 아민기를 아민 활성기인 활성 알데히드기 및 활성 숙신이미딜기로 전환시켰다. 표면 개질 후, 48 mg mL-1의 요소분해효소를 처리하여 아민 활성기와 요소분해효소의 유리 아민기 사이의 공유 결합을 통해 PTFE 막에 요소분해효소를 고정화시켰다.The surface of the PTFE membrane and 96-well microplate were modified with active amine by coating with Parylene-A. A parylene thin film with a thickness of 100 nm was deposited according to the procedure below. (1) Parylene dimers functionalized with amines were evaporated at 160 °C. (2) Dimers were thermally decomposed at 650 °C to generate highly reactive amine-functionalized p-xylene radicals. (3) An amine-functionalized xylene film was uniformly deposited on a PTFE membrane or microplate at room temperature. The amine-functionalized surface was treated with 1 mM of the crosslinking agents GA, DSS, DSG and BS(PEG) 5 for 1 hour, respectively, to convert the amine groups on the surface to active aldehyde groups and active succinimidyl groups, which are amine-active groups. After surface modification, 48 mg mL −1 of urease was treated to immobilize the urease to the PTFE membrane through a covalent bond between the amine active group and the free amine group of the urease.

요소분해효소 활성 측정Measurement of urease activity

시판 요소 분석 키트를 사용하여 요소 농도를 측정하였다. 마이크로플레이트를 이용한 활성 측정을 위해, 16.67 mM 우레아를 웰에 첨가하고 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. PTFE 막을 이용한 활성 측정을 위해, 막을 16.67 mM 요소에 담근 후, 진탕하면서 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 요소분해효소가 고정된 마이크로플레이트 또는 PTFE 막을 이용하여 요소를 가수 분해한 후, 가수 분해된 요소 용액 5 μL를 96 웰 마이크로플레이트로 옮기고 200 μL의 프탈알데히드 시약을 20 분 동안 처리하였다. 이어서 요소분해효소의 활성을 520 nm의 파장에서 광학 밀도 (OD) 측정에 의한 비색법으로 측정하였다.Urea concentration was measured using a commercially available urea assay kit. For activity measurement using a microplate, 16.67 mM urea was added to the wells and reacted at 25° C. for 1 hour. For activity measurement using a PTFE membrane, the membrane was immersed in 16.67 mM urea and reacted at 25° C. for 1 hour while shaking. After hydrolyzing urea using a microplate or PTFE membrane with urease immobilized, 5 μL of the hydrolyzed urea solution was transferred to a 96-well microplate and treated with 200 μL of phthalaldehyde reagent for 20 minutes. The activity of urease was then measured colorimetrically by optical density (OD) measurement at a wavelength of 520 nm.

유동 시스템(flow system) 및 요소 바이오센서(urea biosensor)의 제조Fabrication of flow systems and urea biosensors

도 1에 나타낸 바와 같이, 폴리디메틸실록산(PDMS)을 이용하여 직경이 8 mm이고 높이가 5 mm인 원통형 유체 챔버를 제조하였다. 8개의 요소분해효소 고정화 막을 유체 챔버에 위치시키고 4mm 직경의 작업 전극(Metrohm, 스위스 Herisau)을 갖는 아민화된 스크린 인쇄된 유리질 탄소 전극을 유체 챔버 아래에 위치시켰다(도 1b 참조). 유체 챔버를 2mm 높이의 PDMS로 덮고, 입구 및 출구 튜브를 유체 챔버의 측면에 설치하였다. 유체 챔버의 모든 구성부를 제조한 후, 챔버를 폭 2 cm, 길이 3.5 cm 및 높이 1.5 cm를 갖는 하우징에 조립하여 본 발명에 따른 요소 바이오센서 유동 시스템을 제조하였다. As shown in FIG. 1, a cylindrical fluid chamber having a diameter of 8 mm and a height of 5 mm was prepared using polydimethylsiloxane (PDMS). Eight urease immobilized membranes were placed in the fluid chamber and an aminated screen printed vitreous carbon electrode with a 4 mm diameter working electrode (Metrohm, Herisau, Switzerland) was placed below the fluid chamber (see Fig. 1b). The fluid chamber was covered with PDMS at a height of 2 mm, and inlet and outlet tubes were installed on the side of the fluid chamber. After fabricating all components of the fluid chamber, the chamber was assembled into a housing having a width of 2 cm, a length of 3.5 cm and a height of 1.5 cm to prepare a urea biosensor flow system according to the present invention.

유동 조건에서 전기화학적 측정Electrochemical measurements under flow conditions

요소 시료는 연동 펌프(ISMATEC, 독일 베르트 하임)에 의해 조절된 0.5 mL min-1의 유속으로 입구 튜브를 통해 유체 챔버 내로 유입되며, 출구는 폐기물 병에 연결되었다. 3 전극을 potentiostats (Metrohm, Herisau, Switzerland) 에 연결하여 요소분해효소에 의한 요소의 가수분해로 생성된 전류를 측정하였다. 유동 조건에서 요소의 전기 화학적 측정은 일정한 전압 값(1.0V)에서 시간대 전류측정법(chronoamperometry)을 이용하여 수행하였다.A urea sample was introduced into the fluid chamber through an inlet tube at a flow rate of 0.5 mL min −1 regulated by a peristaltic pump (ISMATEC, Wertheim, Germany), and the outlet was connected to a waste bottle. Three electrodes were connected to potentiostats (Metrohm, Herisau, Switzerland) to measure the current generated by the hydrolysis of urea by urease. Electrochemical measurements of elements in flow conditions were performed using chronoamperometry at a constant voltage value (1.0 V).

<실시예 1><Example 1>

고체 지지체 상에서 가교제 종류별 요소분해효소의 고정화 및 활성분석Immobilization and activity analysis of urease by type of crosslinking agent on a solid support

본 발명자들은 효율성이 높은 요소분해효소의 고정막을 제조하기 위해, 요소분해효소의 종류로서 다양한 간격을 갖는 디숙신이미딜 가교제인 DSG, DSS 및 BS(PEG)5를 사용하여 파릴렌-A가 코팅된 PTFE 막에 공유결합으로 고정화시켰고, 이때 대조군으로는 GA를 가교제로 사용한 군을 사용하였다. DSG, DSS 및 BS (PEG)5의 원자 간격은 각각 7.7Å, 11.4Å 및 21.7Å이다. DSG 및 DSS의 간격 구조는 알킬 사슬이고, BS(PEG)5는 사슬에 5개의 유연한 에테르 결합을 포함한다. DSG, DSS 및 BS(PEG)5의 순서로 가교제의 사슬 길이 및 유연성은 증가한다. 다공성 PTFE 막을 고체 지지체로 사용하였고, 요소분해효소를 다음 절차에 따라 고체 지지체 상에 고정화시켰다. (1) PTFE 막의 표면을 파릴렌-A로 코팅하여 아민기로 개질시켰고, (2) 아민 작용기화 된 표면을 가교제의 처리에 의해 숙신이미딜로 변형시켰으며, (3) 요소분해효소의 아민기를 통해 막 상에 요소분해효소를 고정화시켰다.In order to prepare a highly efficient immobilized membrane of urease, the present inventors use DSG, DSS, and BS(PEG) 5 , which are disuccinimidyl crosslinking agents having various intervals as a type of urease, and parylene-A is coated. In this case, as a control group, a group using GA as a crosslinking agent was used. The atomic spacing of DSG, DSS and BS(PEG) 5 are 7.7 Å, 11.4 Å and 21.7 Å, respectively. The spacing structure of DSG and DSS is an alkyl chain, and BS(PEG) 5 contains 5 flexible ether linkages in the chain. The chain length and flexibility of the crosslinker increase in the order of DSG, DSS and BS(PEG) 5 . A porous PTFE membrane was used as a solid support, and urease was immobilized on the solid support according to the following procedure. (1) the surface of the PTFE membrane was coated with parylene-A to modify it with an amine group, (2) the amine-functionalized surface was modified with succinimidyl by treatment with a crosslinking agent, (3) the amine group of urease Through this, urease was immobilized on the membrane.

이후 요소분해효소 고정화에 있어서 가교제 사슬의 길이 및 유연성의 효과는 파릴렌-A로 코팅된 마이크로 플레이트를 사용하여 분석하였다. 링커 길이를 확인할 수 있는 가교제는 요소분해효소가 공유결합으로 고정화된 파릴렌-A 코팅된 96-웰 마이크로 플레이트에 처리되었다. 요소분해효소가 고정화되면 이후 요소분해효소의 활성을 측정하였다. 또한 이때 디알데히드 작용기를 갖는 가장 대표적인 가교제인 GA를 처리한 군을 대조군으로 사용하였다. Afterwards, the effect of the length and flexibility of the crosslinker chain on urease immobilization was analyzed using parylene-A-coated microplates. The crosslinker, the linker length of which can be confirmed, was applied to a 96-well microplate coated with Parylene-A on which urease was covalently immobilized. After the urease was immobilized, the activity of the urease was measured. Also, at this time, a group treated with GA, the most representative crosslinking agent having a dialdehyde functional group, was used as a control group.

분석 결과, 각기 다른 가교제인 DSG, DSS, BS(PEG)5 및 GA를 사용한 군에서의 요소분해효소의 활성은 각각 267.6 mU, 274.2 mU, 258.7 mU, and 250.1 mU으로 측정되었다. 마이크로플레이트를 이용한 활성 분석의 경우, 모든 디숙신이미딜 가교제를 사용한 군이 GA를 사용한 군보다 높은 요소분해효소 활성값을 나타내었다. 특히 DSS를 사용하여 고정화된 군에서는 가장 높은 활성값을 나타내었다(도 2 참조). As a result of the analysis, the activities of urease in the groups using different crosslinking agents, DSG, DSS, BS(PEG) 5 and GA, were measured to be 267.6 mU, 274.2 mU, 258.7 mU, and 250.1 mU, respectively. In the case of activity analysis using a microplate, the group using all disuccinimidyl crosslinking agents showed higher urease activity values than the group using GA. In particular, the group fixed using DSS showed the highest activity value (see FIG. 2).

또한, 본 발명자들은 마이크로 플레이트상에 고정화된 요소분해효소의 활성을 전기화학 분석을 통해 측정하였다. In addition, the present inventors measured the activity of urease immobilized on the microplate through electrochemical analysis.

그 결과, DSG, DSS, BS(PEG)5 및 GA 샘플로부터의 전류 값은 각각 95.1 μA, 136.4 μA, 59.5 μA 및 13.8 μA인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 상기 요소분해효소의 활성 분석과 동일한 결과를 나타내었는데, 즉 모든 디숙신이미딜 가교제를 사용한 군이 GA를 사용한 군보다 더 높은 전류 값을 보였고, 역시 DSS를 사용하여 고정화 된 군이 가장 높은 전류 값을 나타내었다.As a result, the current values from the DSG, DSS, BS(PEG) 5 and GA samples were found to be 95.1 μA, 136.4 μA, 59.5 μA and 13.8 μA, respectively. These results showed the same results as the activity analysis of the urease, that is, the group using all disuccinimidyl crosslinkers showed higher current values than the group using GA, and the group immobilized using DSS also showed the highest current value. showed high current values.

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 가교제로서 가장 많이 사용되고 있는 GA를 사용하는 것에 비해 디숙신이미딜 가교제를 사용할 경우, 요소분해효소의 고정 효율이 더 우수한 것으로 나타났고, 특히 디숙신이미딜 가교제 중에서 DSS가 요소분해효소의 고정 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. Therefore, through these results, the present inventors found that the immobilization efficiency of urease was better when disuccinimidyl crosslinking agent was used than when using GA, which is most commonly used as a crosslinking agent. In particular, among disuccinimidyl crosslinking agents, DSS It was confirmed that the fixation efficiency of urease was the highest.

나아가 본 발명자들은 직경 8mm의 다공성 PTFE 막을 파릴렌-A로 코팅하여 상기 막 표면에 작용성 아민기를 노출시켰다. 이후 요소분해효소의 고정화를 위해 가교제를 처리하였다. 그런 뒤, 고정화 된 요소분해효소의 활성을 측정하였고, 이때 대조군으로는 가교제로 GA를 처리한 군을 사용하였으며, 또한 임의의 가교제 없이 요소분해효소를 물리적으로 흡착시킨 군을 음성 대조군으로 사용하였다. Furthermore, the present inventors coated a porous PTFE membrane with a diameter of 8 mm with parylene-A to expose functional amine groups on the surface of the membrane. Thereafter, a cross-linking agent was treated for immobilization of urease. Then, the activity of the immobilized urease was measured. At this time, a group treated with GA as a cross-linking agent was used as a control group, and a group physically adsorbed with urease without any cross-linking agent was used as a negative control group.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 가교제 종류별 요소분해효소의 활성도를 측정한 결과, DSG, DSS, BS(PEG)5, GA, 및 음성대조군의 활성은 각각 179.7mU, 226.8mU, 203.4mU, 205.1mU 및 100.4mU인 것으로 나타났다. 가교제를 처리하여 고정화된 요소분해효소를 갖는 막이(DSG, DSS, BS (PEG)5, GA) 가교제를 사용하지 않은 막(물리적 흡착 적용 막)에 비해 약 1.8 배 이상의 높은 활성을 보였으며, 화학적 가교제들 중에서 DSS가 가장 높은 요소분해효소 활성을 보였다.As a result, as shown in FIG. 3, as a result of measuring the activity of urease for each type of crosslinking agent, the activities of DSG, DSS, BS (PEG) 5 , GA, and the negative control were 179.7mU, 226.8mU, 203.4mU, respectively. 205.1 mU and 100.4 mU were found. Membranes with urease immobilized by treatment with a crosslinking agent (DSG, DSS, BS (PEG) 5 , GA) showed about 1.8 times higher activity than membranes without using a crosslinking agent (physical adsorption applied membrane), and chemical Among the crosslinking agents, DSS showed the highest urease activity.

특히 DSS를 처리한 군은 DSG, BS(PEG)5 및 GA보다 각각 26.8 %, 11.5 % 및 10.6 % 활성이 더 높은 것으로 나타났다. 마이크로 플레이트 및 막에 기반한 고정화 된 요소분해효소의 활성 실험을 통해, DSS가 가장 높은 고정화 효율을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다. In particular, the DSS-treated group showed 26.8%, 11.5%, and 10.6% higher activity than DSG, BS(PEG) 5 , and GA, respectively. Through experiments on the activity of immobilized urease based on microplates and membranes, it was confirmed that DSS had the highest immobilization efficiency.

한편, DSG, DSS 및 BS(PEG)5는 서로 다른 링커 길이를 갖는 디숙신이미딜 가교제이고, 이 중에서 BS(PEG)5는 가장 긴 사슬 길이 및 유연성을 갖는다. 링커 길이의 측면에서, 더 길거나 더 유연한 연결성을 갖는 고정화된 효소는 더 많은 자유도(degree of freedom)를 가지며 더 높은 효소 활성을 보인다. 따라서 이론적인 관점에서는 BS(PEG)5가 가장 높은 고정 효율을 가질 것으로 예측되었지만 앞서 실험 결과에서 보였듯이 실제 결과는 이와는 다른 결과를 보였다. Meanwhile, DSG, DSS, and BS(PEG) 5 are disuccinimidyl crosslinkers having different linker lengths, and among them, BS(PEG) 5 has the longest chain length and flexibility. In terms of linker length, immobilized enzymes with longer or more flexible linkages have more degrees of freedom and exhibit higher enzymatic activity. Therefore, from a theoretical point of view, BS(PEG) 5 was predicted to have the highest immobilization efficiency, but as shown in the previous experimental results, the actual results showed different results.

이러한 결과를 토대로 볼 때, 길고 유연한 가교제는 동일한 고체 지지체상에서 아민기를 갖는 숙신이미딜기와 반응할 가능성이 더 높다. 이 반응에 의해 가교제의 활성이 사라지고 동시에 효소 고정화 부위가 감소한다. 결과적으로, 가교제의 효소 고정 효율은 링커 길이에 비례하지 않는다는 것을 알 수 있다. Based on these results, the long flexible crosslinker is more likely to react with succinimidyl groups with amine groups on the same solid support. By this reaction, the activity of the crosslinking agent disappears and at the same time the enzyme immobilization site is reduced. As a result, it can be seen that the enzyme immobilization efficiency of the crosslinker is not proportional to the linker length.

따라서 상기 실험 결과에 따라, 아민이 활성화된 고체 표면에서 DSG, DSS 및 BS(PEG)5 가교제를 사용하여 요소분해효소를 고정화 시킬 경우, DSS를 사용하는 것이 가장 높은 고정화 효율을 갖는다는 것을 알 수 있었다.Therefore, according to the above experimental results, when urease is immobilized using DSG, DSS, and BS(PEG) 5 crosslinking agent on an amine-activated solid surface, it can be seen that using DSS has the highest immobilization efficiency. there was.

<실시예 2><Example 2>

DSS 가교제를 이용한 요소분해효소 고정화 막에 대한 분석Analysis of urease immobilized membrane using DSS crosslinker

유동 조건에서 본 발명의 요소분해효소 고정화막을 이용하여 요소 바이오센싱이 가능한지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 사용한 디숙신이미딜 가교제 중에서 가장 활성이 우수한 DSS를 이용하여 요소분해효소 고정화 막을 제조하면서 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to confirm whether urea biosensing is possible using the urease immobilized membrane of the present invention under flow conditions, while preparing a urease immobilized membrane using DSS, which has the highest activity among the disuccinimidyl crosslinking agents used in Example 1, the following The same experiment was performed.

평균 기공 크기가 1μm 인 다공성 구조를 갖는 PTFE 막을 고체 지지체로 사용하였으며, 이때 다공성 구조는 표면적을 증가시켜 더 많은 요소분해효소의 고정 부위를 제공할 수 있고 유동 조건에서 전기 화학적 신호를 측정하는데 효과적이다. A PTFE membrane having a porous structure with an average pore size of 1 μm was used as a solid support. At this time, the porous structure can provide more fixed sites for urease by increasing the surface area, and is effective in measuring electrochemical signals under flow conditions. .

먼저 본 발명자들은 DSS를 이용하여 요소분해효소 고정화 막을 제조하는 각 단계에서 막의 미세구조를 SEM을 사용하여 관찰하였다.First, the present inventors observed the microstructure of the membrane using SEM in each step of preparing the urease-immobilized membrane using DSS.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, PTFE 막은 미세 다공성 구조가 있는 것으로 관찰되었고, 이러한 다공성 구조는 파릴렌-A 코팅에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 고체 지지체의 표면이 미세 구조에 영향을 미치지 않으면서 활성 아민기로 개질되었음을 의미한다. 또한 이러한 다공성 미세 구조는 가교제인 DSS와 효소분해효소(urease)의 처리가 진행되는 동안에도 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터 요소분해효소 고정화 과정이 다공성 미세 구조에는 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있으며, 요소분해효소 고정화 막이 유동 조건에서 효과적으로 전기 화학적 신호를 생성할 수 있음을 알 수 있다. As a result, as shown in FIG. 4, it was observed that the PTFE membrane had a microporous structure, and it was found that this porous structure was not affected by the Parylene-A coating. These results indicate that the surface of the solid support was modified with active amine groups without affecting the microstructure. In addition, it was found that this porous microstructure was continuously maintained even during the treatment of DSS and urease as a cross-linking agent. From this result, it can be seen that the process of immobilizing urease has no effect on the porous microstructure, and it can be seen that the membrane with immobilized urease can effectively generate an electrochemical signal under flow conditions.

또한, 원자 조성은 SEM에서 에너지 분산 분석법(EDS)을 사용하여 분석한다. PTFE 막은 불소로 포화된 알킬 사슬을 가지며, 탄소(40.7 %) 및 불소(59.3 %)를 나타내었다. 또한 파릴렌-A층이 코팅될 때, 질소(6.4 %)는 탄소 (32.3 %) 및 불소 (61.3 %)의 존재 하에 나타나며, DSS 처리 후, 탄소 (41.4 %), 질소 (6.9 %) 및 불소 (40.9 %)에서 추가 산소(10.7 %)가 확인되었다. 이러한 산소는 DSS의 숙신이미딜기에서 유래한 것임을 알 수 있다. 요소분해효소의 고정 후 탄소, 질소, 산소 및 불소의 원자 분포는 각각 30.7 %, 7.3 %, 11.9 % 및 50.1 %로 나타났다. DSS가 처리된 막과 비교해 보면 질소 및 산소의 원자 비가 증가되었다. 이는 다른 유기 중합체보다 상대적으로 많은 양의 질소와 산소를 함유한 요소분해효소가 성공적으로 고정화 되었다는 것을 의미한다.In addition, the atomic composition is analyzed using energy dispersive analysis (EDS) in SEM. The PTFE membrane had alkyl chains saturated with fluorine and exhibited carbon (40.7%) and fluorine (59.3%). Also when the Parylene-A layer is coated, nitrogen (6.4%) appears in the presence of carbon (32.3%) and fluorine (61.3%), and after DSS treatment, carbon (41.4%), nitrogen (6.9%) and fluorine (40.9%) found additional oxygen (10.7%). It can be seen that this oxygen is derived from the succinimidyl group of DSS. After fixation of urease, the atomic distributions of carbon, nitrogen, oxygen and fluorine were 30.7%, 7.3%, 11.9% and 50.1%, respectively. Compared to the DSS-treated film, the atomic ratio of nitrogen and oxygen was increased. This means that urease containing a relatively large amount of nitrogen and oxygen than other organic polymers was successfully immobilized.

나아가 본 발명자들은 요소분해효소가 고정화된 막을 FT-IR을 사용하여 분석하였다. Furthermore, the present inventors analyzed the membrane on which urease was immobilized using FT-IR.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 노출된 PTFE 막은 1201 nm 및 1153 nm에서 강한 CF2 연신 피크(stretching peaks)를 나타냈고, 파릴렌-A가 PTFE 막 상에 코팅되었을 때에는 방향족 C = C 연신 피크가 관찰되었다(도 5b 참조). 파릴 렌-A는 골격에 페닐기를 가지므로 이는 파릴렌-A가 PTFE 막에 성공적으로 코팅되었다는 것을 의미한다. DSS 처리 후, 숙신이미딜기 유래의 아미드 A 및 카보닐 C = O 스펙트럼은 각각 3400 nm 및 1730 nm에서 검출되었다(도 5c 참조). 또한, DSS의 간격부인 알킬 그룹으로부터 CH2 신장 피크는 2920 nm 및 2850 nm에서 관찰되었다. 이러한 결과는 DSS가 아민 활성화된 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막에 성공적으로 고정되었음을 의미한다.As a result, as shown in FIG. 5a, the exposed PTFE membrane exhibited strong CF 2 stretching peaks at 1201 nm and 1153 nm, and when parylene-A was coated on the PTFE membrane, aromatic C=C stretching peaks. A peak was observed (see Fig. 5b). Since parylene-A has a phenyl group in its backbone, it means that parylene-A was successfully coated on the PTFE membrane. After DSS treatment, amide A and carbonyl C = O spectra derived from succinimidyl groups were detected at 3400 nm and 1730 nm, respectively (see Fig. 5c). In addition, CH 2 elongation peaks from the alkyl group, which is an interval part of DSS, were observed at 2920 nm and 2850 nm. These results indicate that DSS was successfully immobilized on the amine-activated parylene-A coated PTFE membrane.

도 5d에 나타낸 바와 같이, 요소분해효소 고정화 후, 요소분해효소의 펩티드 결합으로부터 다양한 유형의 아미드 피크, 아미드 A, 아미드 B, 아미드 I 및 아미드 II가 각각 3400 nm, 2920 nm, 1640 nm 및 1455 nm에서 관찰되었고, 이 결과로부터 요소분해효소가 PTFE 기반의 고체 지지체 상에 잘 고정되었음을 알 수 있고, 이러한 본 발명에 따른 요소분해효소가 고정화 된 막은 요소 바이오 센싱을 위한 유체 챔버에 통합되어 요소 바이오센서 또는 요소 바이오센서 시스템으로 사용 가능함을 알 수 있었다.As shown in Figure 5d, after immobilization of urease, various types of amide peaks, amide A, amide B, amide I and amide II from the peptide bonds of urease, were obtained at 3400 nm, 2920 nm, 1640 nm and 1455 nm, respectively. , and from this result, it can be seen that the urease is well immobilized on the PTFE-based solid support, and the membrane on which the urease according to the present invention is immobilized is integrated into a fluid chamber for urea biosensing to form a urea biosensor. Alternatively, it was found that it can be used as a urea biosensor system.

<실시예 3><Example 3>

요소분해효소 고정화 막을 이용한 요소 바이오센싱Urea biosensing using urease immobilized membrane

도 1에 나타낸 바와 같이, 8 개의 요소분해효소 고정화 막을 PDMS 유체 챔버에 삽입하고 아민화된 유리질 탄소 전극을 상기 막 아래에 위치시켰다. 유체 시스템을 사용하여 PBS에 용해된 요소를 유체 챔버로 흘려주었고, 신호는 일정한 전압을 시간대 전류측정기(chronoamperometry)를 이용하여 측정하였다.As shown in Figure 1, eight urease immobilized membranes were inserted into the PDMS fluid chamber and an aminated glassy carbon electrode was placed underneath the membranes. Using a fluid system, urea dissolved in PBS was flowed into the fluid chamber, and a constant voltage signal was measured using chronoamperometry.

요소분해효소로 가수 분해된 요소는 다음과 같은 반응에 의해 카르바민산 및 암모니아로 분해된다:Urea hydrolyzed by urease is decomposed into carbamic acid and ammonia by the following reaction:

(NH2)2CO + H2O → NH2COOH + NH3 (NH 2 ) 2 CO + H2O → NH 2 COOH + NH 3

가수 분해 후, 불안정한 카르바민산은 이량체화 및 탈카르복실화에 의해 히드라진을 생성하였다. 이후, 히드라진으로부터 유리 질소를 생성함으로써 전극 산화가 일어났다. 본 발명에 따른 요소 바이오센서의 실시간 모니터링을 테스트하기 위해, 다양한 농도의 요소를 PBS에 첨가하고 1.0 mL min-1의 유속으로 본 발명의 요소 바이오센서에 유입시켰다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 다양한 가교제가 처리된 막으로부터의 실시간 전기 화학적 신호는 시간대 전류측정기(chronoamperometry)로 측정하였다.After hydrolysis, the unstable carbamic acid gave hydrazine by dimerization and decarboxylation. Electrode oxidation then occurred by generating free nitrogen from hydrazine. To test the real-time monitoring of the urea biosensor according to the present invention, various concentrations of urea were added to PBS and flowed into the urea biosensor according to the present invention at a flow rate of 1.0 mL min −1 . As shown in Figure 6a, real-time electrochemical signals from the membranes treated with various crosslinkers were measured by chronoamperometry.

가교제(DSG, DSS 및 BS(PEG)5)가 처리된 모든 막에서 요소 농도를 증가시킴에 따라 센서 반응이 증가되는 것으로 나타났고, 대조군인 GA가 처리된 막(오렌지)보다 높은 전류를 나타냈다. 또한, 유동 상태에서도 전류 신호는 7 분 이내에 포화되었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 요소 바이오센서가 유동 조건에서 요소 농도를 모니터링 할 수 있음을 나타내는 것이며, 가교제들 중에서도 특히 DSS가 처리된 막은(적색) 모든 요소 농도에서 가장 높은 전류 값을 보였다.Crosslinkers (DSG, DSS, and BS(PEG) 5 ) were found to increase the sensor response as the urea concentration increased in all treated membranes, and the control, GA, showed a higher current than the treated membrane (orange). Also, even in the flowing state, the current signal saturated within 7 min. These results indicate that the urea biosensor according to the present invention can monitor the urea concentration under flow conditions, and among the crosslinking agents, the DSS-treated membrane (red) showed the highest current value at all urea concentrations.

이 결과는 마이크로 플레이트(도 2 참조)와 막(도 3 참조)을 기반으로 한 활성 분석 결과와도 일치한다. 따라서 본 발명에서 제조된 요소 바이오센서의 반응은 고정된 요소분해효소 활성에 비례하고, 고정화 후 요소분해효소 활성이 높으면 요소분해효소 기반 요소 바이오센서의 감도를 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 한편, 물리적으로 흡착된 요소분해효소(바이올렛)가 고정된 막은 신호가 안정적이지 않았으며 요소 농도가 6mM 이상으로는 증가하지 않는 것으로 나타났다.This result is also consistent with the results of activity assays based on microplates (see Fig. 2) and membranes (see Fig. 3). Therefore, it can be seen that the response of the urease biosensor prepared in the present invention is proportional to the immobilized urease activity, and if the urease activity is high after immobilization, the sensitivity of the urease-based urea biosensor can be increased. On the other hand, the membrane on which the physically adsorbed urease (violet) was immobilized had an unstable signal and the urea concentration did not increase beyond 6 mM.

또한, 비교적 낮은 요소 농도에서의 신호 포화는 물리적 흡착의 고정 용량이 공유결합에 의한 고정화보다 훨씬 낮으므로, 요소분해효소의 공유결합에 의한 고정화가 유동 조건에서 요소의 실시간 모니터링에 적합함을 알 수 있다. 요소분해효소 처리가 없는 음성 대조군인 파릴렌-A 코팅된 PTFE 막(검정색)은 요소 시료가 유동하는 동안 전기 화학적 신호가 생성되지 않았다. 따라서 요소분해효소의 존재 하에서만 전기화학 신호가 생성될 수 있으며, 요소만으로는 노이즈 신호를 생성할 수 없다는 것을 알 수 있었다. In addition, signal saturation at a relatively low urea concentration shows that the fixed capacity of physical adsorption is much lower than immobilization by covalent bonding. Therefore, it can be seen that immobilization by covalent bonding of urease is suitable for real-time monitoring of urea under flow conditions. there is. The parylene-A coated PTFE membrane (black), which is a negative control without urease treatment, did not generate an electrochemical signal while the urea sample was flowing. Therefore, it was found that an electrochemical signal can be generated only in the presence of urease, and a noise signal cannot be generated only with urea.

또한 도 6b에 나타낸 바와 같이, 전류 값은 1mM 내지 8mM의 요소 농도에 대해 측정하였는데, 모든 요소분해효소 고정화 막(DSG (●), DSS (■), BS(PEG)5 (▲), GA (▼) 및 물리적 흡착 (◆)) 기반의 요소 바이오센서는 각각 0.97, 0.99, 0.99, 0.99 및 0.99로 양호한 R-제곱 값의 선형을 나타냈다.In addition, as shown in Figure 6b, current values were measured for urea concentrations of 1 mM to 8 mM, all urease immobilized membranes (DSG (●), DSS (■), BS (PEG) 5 (▲), GA ( ▼) and physical adsorption (◆)) based urea biosensors exhibited good R-squared values of 0.97, 0.99, 0.99, 0.99 and 0.99, respectively.

음성 대조군의 경우, R- 제곱 값이 0.66으로 선형이 불량한 것으로 나타났다. 검출한계 (LOD)는 3-시그마 신뢰 구간을 사용하여 선형 그래프로부터 계산하였다. DSG, DSS, BS(PEG)5, GA 및 물리적 흡착에 대한 각각의 LOD는 1.3, 1.1, 1.3, 1.5 및 1.6 mM로 계산되었다. For the negative control, the R-squared value was 0.66, indicating poor linearity. The limit of detection (LOD) was calculated from the linear graph using 3-sigma confidence intervals. The respective LODs for DSG, DSS, BS(PEG) 5 , GA and physisorption were calculated to be 1.3, 1.1, 1.3, 1.5 and 1.6 mM.

한편, 혈액 내 요소의 정상 범위는 1.2 ~ 3.3 mM이며(Dabla 2010; Lin et al. 2004), 혈청에서 요소의 농도 감소는 일반적이지 않다. 따라서 DSS 처리된 본 발명의 고정화 막의 LOD는 임상 시료에서 요소 농도를 모니터링하기에 적합하다는 것을 알 수 있었다.On the other hand, the normal range of urea in the blood is 1.2 to 3.3 mM (Dabla 2010; Lin et al. 2004), and a decrease in the concentration of urea in serum is not common. Therefore, it was found that the LOD of the immobilized membrane of the present invention treated with DSS was suitable for monitoring urea concentration in clinical samples.

물리적 흡착을 제외하고, 공유 결합으로 요소분해효소가 고정화된 모든 막은 20 mM까지 요소 농도의 단일 증가를 나타냈다. 이는 요소 바이오센싱의 포화 농도가 20mM 보다 높다는 것을 의미한다. 따라서 요소분해효소 고정화 막 기반의 요소 바이오센서의 동적 범위는 LOD에서부터 20mM까지 임을 확인하였고, 보통 신부전의 경우, 혈액의 요소 농도는 10mM 보다 높은 것으로 알려져 있다. 만일 본 발명의 요소 유체 센서를 사용하여 시험 대상자의 생리액 요소 농도를 모니터링하는 경우,, 요소 센서 농도가 10mM 보다 높게 측정되면 정상 범위를 벗어나기에 의학적 치료가 필요하다고 진단할 수 있다. 따라서 본 발명의 바이오센서의 동적 범위는 유동 상태의 생리학적 유체에서 요소를 모니터링하기에 적합하며, 요소 관련 질환의 발병가능성 및 진행 상태를 검출 및 진단하는데도 유용하게 사용할 수 있다.Except for physical adsorption, all membranes with covalently immobilized urease showed a single increase in urea concentration up to 20 mM. This means that the saturation concentration of urea biosensing is higher than 20 mM. Therefore, it was confirmed that the dynamic range of the urease-immobilized membrane-based urea biosensor ranges from LOD to 20 mM, and in the case of renal failure, the blood urea concentration is known to be higher than 10 mM. If the urea fluid sensor of the present invention is used to monitor the urea concentration of the test subject's menstrual fluid, if the urea sensor concentration is higher than 10 mM, it can be diagnosed that medical treatment is required because it is out of the normal range. Therefore, the dynamic range of the biosensor of the present invention is suitable for monitoring elements in a physiological fluid in a flowing state, and can also be usefully used for detecting and diagnosing the onset and progression of urea-related diseases.

또한 DSG, DSS, BS(PEG)5, GA 및 물리적 흡착에 상응하는 감도는 각각 1.5, 3.4, 1.6, 1.1 및 0.9 mA M-1 cm-2 인 것으로 측정되었고, 이 결과는 마이크로 플레이트(도 2)와 막(도 3)을 기반으로 한 활성 분석 결과와도 일치한다. 이는 본 발명에서 선택하여 사용한 가교제(DSS)가 일반적으로 사용되고 있는 GA 가교제에 비해 전기 화학적 효소 기반의 바이오센서 감도가 3배 이상으로 우수하다는 것을 알 수 있었고, 가교제의 높은 고정 효율이 효소 기반의 전기 화학적 바이오센서의 민감도를 향상시키는데 크게 기여한다는 것을 알 수 있었다. In addition, the sensitivities corresponding to DSG, DSS, BS(PEG) 5 , GA and physical adsorption were measured to be 1.5, 3.4, 1.6, 1.1 and 0.9 mA M -1 cm -2 , respectively, and these results were measured on a microplate (Fig. 2 ) and the results of the activity assay based on the membrane (Fig. 3) are also consistent. It was found that the crosslinking agent (DSS) selected and used in the present invention has more than three times the sensitivity of the electrochemical enzyme-based biosensor compared to the generally used GA crosslinking agent, and the high fixation efficiency of the crosslinking agent is superior to the enzyme-based electrochemical It was found that it greatly contributed to improving the sensitivity of chemical biosensors.

<실시예 4><Example 4>

본 발명의 바이오센서를 이용한 혈청 시료 내 요소 농도의 측정Measurement of urea concentration in serum samples using the biosensor of the present invention

본 발명자들은 본 발명에서 제조한 DSS 가교제를 이용하여 요소분해효소를 고정화시킨 고정화 막이 구비된 유동 요소 바이오센서로 인간 혈청 시료에 함유된 요소 검출이 가능한지를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. The inventors of the present invention measured whether urea contained in human serum samples could be detected by a flow urea biosensor equipped with an immobilized membrane in which urease was immobilized using the DSS crosslinker prepared in the present invention by the following method.

요소가 함유된 혈청 시료를 1.0 mL min-1의 유속으로 본 발명의 바이오센서에 흘려주었고, 실시간 전기 화학 신호를 시간대 전류측정기(chronoamperometry)로 측정하였다. Serum samples containing urea were flowed through the biosensor of the present invention at a flow rate of 1.0 mL min -1 , and real-time electrochemical signals were measured by chronoamperometry.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 수천 개의 단백질을 함유한 생리학적 유체(혈청)에 대한 측정 결과는, 요소 농도의 증가에 따라 센서 반응도 증가하는 것으로 관찰되었다. 혈청 시료로부터의 센서 신호는 서로 다른 요소 농도 간에 명확한 신호 차이를 보이는 것으로 나타났다. As a result, as shown in FIG. 7 , it was observed that the sensor response also increased as the urea concentration increased in the measurement result for the physiological fluid (serum) containing thousands of proteins. Sensor signals from serum samples showed clear signal differences between different urea concentrations.

이는 DSS 가교제를 이용하여 제조된 본 발명의 바이오센서가 유동 조건 하에서도 실제적인 생리학적 시료를 대상으로 요소를 신속하고 정확하게 모니터링할 수 있음을 의미한다. This means that the biosensor of the present invention prepared using the DSS crosslinking agent can quickly and accurately monitor urea in an actual physiological sample even under flow conditions.

전류 값을 분석한 도 7b의 결과를 보면, 요소 농도에 대한 전류값의 측정이 1mM 내지 8mM의 요소 농도 범위에서 0.99의 R- 제곱 값으로 우수한 선형의 그래프를 보였다. 또한, LOD는 1.2 mM 인 것으로 측정되었고, DSS 가교제 기반의 요소 바이오센서의 동적 범위는 1.2 mM 내지 20 mM 인 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 요소 바이오센서는 유동 상태에서 실제 환자 혈청 시료를 대상으로 요소 측정을 실시간으로 모니터링할 수 있다.Looking at the result of analyzing the current value in FIG. 7B , the measurement of the current value for the urea concentration showed an excellent linear graph with an R- square value of 0.99 in the urea concentration range of 1 mM to 8 mM. In addition, the LOD was measured to be 1.2 mM, and the dynamic range of the DSS crosslinker-based urea biosensor was confirmed to be 1.2 mM to 20 mM. Therefore, the urea biosensor of the present invention can monitor urea measurement in real time in a real patient serum sample in a flowing state.

또한, 혈청 내 요소의 바이오 센싱 감도는 1.6 mA M-1 cm-2 인 것으로 계산되었다. 이 결과는 GA 가교제 결합 요소 바이오 센싱의 감도 보다도 높다. 즉, 본 발명에 따른 DSS 가교제에 기초한 요소 바이오센서가 기존 효소 고정 바이오센서보다 더 높은 감도로 시료 내 요소 농도를 유동 조건 하에서 모니터링 할 수 있음을 의미하며, 특히 가교제 중에서 DSS가 요소 바이오센서의 성능을 향상시킬 수 있고, 유동 상태에서 생리학적 유체 내에 함유된 요소의 농도를 효과적으로 모니터링할 수 있음을 알 수 있었다.In addition, the biosensing sensitivity of urea in serum was calculated to be 1.6 mA M -1 cm -2 . This result is higher than the sensitivity of GA crosslinker binding element biosensing. That is, it means that the urea biosensor based on the DSS crosslinking agent according to the present invention can monitor the urea concentration in the sample under flow conditions with higher sensitivity than the conventional enzyme immobilized biosensor. It was found that the concentration of urea contained in the physiological fluid can be effectively monitored in a flow state.

<실시예 5><Example 5>

재현성 및 간섭 분석(Repeatability and interference analysis)Repeatability and interference analysis

서로 다른 종류의 가교제를 이용하여 제조한 요소 바이오센서에 대한 재현성 분석은 10mM 요소의 3회 연속 측정에 따라 수행하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, PBS 중의 10mM 요소가 20 분 동안 바이오센서에 유입된 후, PBS를 20 분 동안 흘려주었다. 모든 측정에서, 10mM 요소가 흐를 때 전기 화학적 신호가 증가하였고 블랭크 샘플(PBS)이 흐를 때에는 신호가 즉시 감소하는 것으로 나타났다. 3 회 반복 측정에서 DSG (파란색), DSS (빨간색), DS(PEG)5 (녹색) 및 GA(검정) 처리군의 상대 표준 편차 (RSD)는 3.7, 0.7, 3.2 및 6.0 %로 측정되었다. 모든 디숙신이미딜 기반의 가교제들은 5 % 미만의 재현성을 나타내었고, GA는 가교제 중에서 가장 높은 수치를 나타내어, 이를 통해 본 발명에서 선택하여 사용한 디숙신이미딜 가교제가 현재 널리 사용되는 GA 가교제 보다 측정의 신뢰성이 더 높음을 알 수 있었다. 또한, 디숙신이미딜 가교제 중에서, DSS는 특히 1 % 미만, 0.7%의 가장 낮은 RSD 값을 나타냄으로써, DSS는 유동 조건에서 민감하고 신뢰할 수 있는 요소 실시간 모니터링을 위한 요소분해효소의 고정화에 가장 효과적임을 확인하였다. Reproducibility analysis of urea biosensors prepared using different types of crosslinkers was performed according to three consecutive measurements of 10 mM urea. As shown in FIG. 8, after 10 mM urea in PBS was introduced into the biosensor for 20 minutes, PBS was flowed for 20 minutes. All measurements showed that the electrochemical signal increased when 10 mM urea was flowed and the signal immediately decreased when blank sample (PBS) was flowed. In triplicate measurements, the relative standard deviations (RSDs) of the DSG (blue), DSS (red), DS(PEG) 5 (green), and GA (black) treatment groups were 3.7, 0.7, 3.2, and 6.0%, respectively. All disuccinimidyl-based cross-linking agents showed reproducibility of less than 5%, and GA showed the highest value among cross-linking agents, so that the disuccinimidyl cross-linking agent selected and used in the present invention was more measurable than the currently widely used GA cross-linking agent. It was found that the reliability of In addition, among the disuccinimidyl crosslinkers, DSS shows the lowest RSD value of less than 1% and 0.7%, so that DSS is most effective for immobilization of urease for sensitive and reliable real-time monitoring of urea under flow conditions. It was confirmed that

또한, 간섭 분석을 위해, 2μM 요산, 30μM 글루코스, 2μM 글리신, 3mM 염화나트륨 및 50μM 수크로스의 서로 다른 유기종 및 이온종을 10mM 요소가 함유된 PBS 용액에 첨가하고 바이오센서에 유입시켰다. 10mM 요소를 흘려보낸 후, 시간에 따른 전류값을 측정하였는데, 도 9에 나타낸 바와 같이, 가시적인 응답 변화는 검출되지 않았다. 시간대 전류측정기(chronoamperometry)로 측정한 요산, 글루코스, 글리신, 염화나트륨 및 수크로스 첨가에 의한 신호 변화는 각각 0.3, 2.3, 3.4, 3.0 및 4.4 %로 나타났으며, 5 % 미만의 간섭은 유동 상태의 생리학적 유체에서 요소에 대한 DSS 기반의 요소 바이오센서가 우수한 선택성이 있음을 의미한다. 따라서 이러한 결과로부터 본 발명자들은 DSS 가교제를 이용하여 개발된 본 발명의 요소 바이오센서가 향상된 감도(sensitivity), 재현성(repeatability) 및 선택성(selectivity)을 가지며, 유동의 조건하에서도 생리학적 유체 내의 요소 농도를 효율적으로 모니터링할 수 있음을 알 수 있었다. In addition, for interference analysis, different organic and ionic species of 2 μM uric acid, 30 μM glucose, 2 μM glycine, 3 mM sodium chloride and 50 μM sucrose were added to a PBS solution containing 10 mM urea and flowed into the biosensor. After flowing 10 mM urea, the current value was measured over time, and as shown in FIG. 9, no visible response change was detected. Signal changes by addition of uric acid, glucose, glycine, sodium chloride, and sucrose, measured by chronoamperometry, were 0.3, 2.3, 3.4, 3.0, and 4.4%, respectively, and interferences of less than 5% were found to be in the flow state. This means that DSS-based urea biosensors for urea in physiological fluids have excellent selectivity. Therefore, from these results, the present inventors found that the urea biosensor of the present invention developed using the DSS crosslinker has improved sensitivity, repeatability, and selectivity, and urea concentration in physiological fluid even under flow conditions. can be effectively monitored.

<결론><Conclusion>

본 발명에서는 유동 조건에서 전기 화학적 신호의 생성을 위해 요소분해효소 고정화 막을 기반으로 하여 폭 2 cm, 길이 3.5 cm 및 높이 1.5 cm인 휴대용 요소 바이오센서를 개발하였다. 요소분해효소를 지지체 상에 효율적으로 고정하기 위해, 디숙신이미딜 기반의 가교제로서 DSG, DSS 및 BS(PEG)5를 이용하였다. 마이크로 플레이트 및 막(membrane)에 기초한 요소분해효소의 활성 분석으로부터 가교제 종류 중에서 DSS가 가장 높은 요소분해효소의 고정 효율을 보였다. In the present invention, a portable urea biosensor with a width of 2 cm, a length of 3.5 cm and a height of 1.5 cm was developed based on a urease immobilized membrane for electrochemical signal generation under flow conditions. In order to efficiently immobilize the urease on the scaffold, DSG, DSS and BS(PEG) 5 were used as disuccinimidyl-based crosslinking agents. From analysis of urease activity based on microplates and membranes, DSS showed the highest urease fixation efficiency among crosslinking agents.

또한, 요소분해효소의 고정화 과정은 SEM 및 FT-IR 분석에 의해 확인되었고, 요소분해효소 고정 PTFE 막은 다공성 미세 구조를 유지하는 것으로 확인되었고, 요소분해효소는 가교제에 의해 파릴렌-A 코팅된 다공성 막에 공유 결합으로 고정화되었다. 요소분해효소 고정화 막을 전극 상에 놓고 PDMS 유체 챔버에 삽입한 다음, 요소 시료를 본 발명에서 제조된 요소 바이오센서 상에 유동시켜 요소 검출 신호를 측정하였다. 그 결과, DSG, DSS, BS(PEG)5 및 GA를 이용한 각 실험에 따른 감도는 각각 1.5, 3.4, 1.6 및 1.1 mA M-1 cm-2 으로 측정되었고, 이 결과로부터 DSS가 가장 효과적인 가교제임을 알 수 있었으며, 실제 인간 혈청에 첨가된 요소 시료를 이용한 경우, 시료에 첨가된 요소를 실시간 모니터링할 수 있음을 알 수 있었다. 이때, 측정 감도는 1.6 mA M-1 cm-2 인 것으로 계산되었다. In addition, the immobilization process of urease was confirmed by SEM and FT-IR analysis, and it was confirmed that the urease-immobilized PTFE membrane maintained a porous microstructure, and the urease was parylene-A coated by a crosslinking agent. It was covalently immobilized to the membrane. A urease-immobilized membrane was placed on the electrode and inserted into the PDMS fluid chamber, and then the urea sample was flowed over the urea biosensor prepared in the present invention to measure the urea detection signal. As a result, the sensitivity according to each experiment using DSG, DSS, BS (PEG) 5 and GA was measured as 1.5, 3.4, 1.6 and 1.1 mA M -1 cm -2 , respectively, and from these results, DSS was the most effective crosslinking agent. It was found that, in the case of using a urea sample added to actual human serum, it was found that the urea added to the sample could be monitored in real time. At this time, the measurement sensitivity was calculated to be 1.6 mA M -1 cm -2 .

또한, 본 발명의 요소 바이오센서에 대한 재현성 분석 결과, 1 % 미만으로 확인되었고, 상이한 유기 및 이온 종으로부터의 간섭은 5 % 미만으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 DSS 가교제 기반의 요소 바이오센서는 향상된 감도, 재현성 및 선택성을 가지며, 유동적인 생리학적 유체를 대상으로 요소 농도를 효율적으로 모니터링할 수 있음을 알 수 있었다. In addition, as a result of reproducibility analysis of the urea biosensor of the present invention, it was confirmed to be less than 1%, and interference from different organic and ionic species was confirmed to be less than 5%. Therefore, it was found that the DSS crosslinker-based urea biosensor of the present invention has improved sensitivity, reproducibility and selectivity, and can efficiently monitor urea concentration in a fluid physiological fluid.

그러므로 유동 조건에서 사용 가능한 본 발명의 휴대용 요소 바이오센서는 현장 검사, 휴대용 투석 시스템과 같은 실시간 모니터링 시스템 및 인공 신장 등을 포함한 휴대용 애플리케이션에 모두 활용 가능함을 알 수 있었다. Therefore, it can be seen that the portable component biosensor of the present invention usable in a flow condition can be used for all portable applications including point-of-care, real-time monitoring systems such as portable dialysis systems, and artificial kidneys.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to its preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope will be construed as being included in the present invention.

Claims (19)

아민 작용기화된 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제로 반응시켜 상기 아민기가 활성 숙신이미딜기로 전환된 필름으로 코팅되고,
상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidyl suberate, DSS)인,
효소 고정용 불용성 다공성막.The amine group on the surface of the amine-functionalized parylene film is reacted with a succinimidyl-based crosslinking agent to be coated with a film in which the amine group is converted into an active succinimidyl group,
The succinimidyl-based crosslinking agent is disuccinimidyl suberate (DSS),
Insoluble porous membrane for enzyme immobilization. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 효소는 요소분해효소(urease)인 것을 특징으로 하는, 효소 고정용 불용성 다공성막.According to claim 1,
Characterized in that the enzyme is urease, an insoluble porous film for fixing an enzyme. 제1항에 있어서,
상기 다공성 막은 불용성 다공성 막으로, 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료인 것을 특징으로 하는, 효소 고정용 불용성 다공성막.According to claim 1,
The porous membrane is an insoluble porous membrane, and includes fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk fibroin, polyimides, polyamix acid, polycarprolactone, polyetherimide, Nylon, polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenyleneterephthalamide, polyaniline ( polyaniline, polyacrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, polymethylmethacrylate, polylactic acid ; PLA), polyglycolic acid (PGA), a copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly{poly(ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate} (PEOT/PBT), Polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), polyorthoester {poly(ortho ester; POE}, poly(propylene fumarate) ) -diacrylate {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate {poly(ethylene glycol) diacrylate; characterized by being one or more biocompatible materials selected from the group consisting of PEGDA} , an insoluble porous membrane for enzyme immobilization. (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; 및
(2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제와 반응시켜 상기 아민기를 활성 숙신이미딜기로 전환하는 단계;를 포함하고,
상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidyl suberate, DSS)인,
효소 고정용 불용성 다공성막의 제조방법.(1) uniformly depositing an amine-functionalized parylene film on an insoluble porous film at room temperature; and
(2) converting the amine group to an active succinimidyl group by reacting the amine group on the surface of the parylene film with a succinimidyl-based crosslinking agent after depositing the parylene film;
The succinimidyl-based crosslinking agent is disuccinimidyl suberate (DSS),
Method for manufacturing an insoluble porous membrane for enzyme immobilization. 삭제delete (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계;
(2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 숙신이미딜계 가교제와 반응시켜 상기 아민기를 활성 숙신이미딜기로 전환하는 단계; 및
(3) 상기 파릴렌 필름 표면의 활성 숙신이미딜기와 유리 아민기를 가진 요소
분해효소(urease)를 화학 반응시켜 요소분해효소를 불용성 다공성 막에 고정화하는 단계;를 포함하고,
상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidyl suberate, DSS)인,
요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막의 제조방법.(1) uniformly depositing an amine-functionalized parylene film on an insoluble porous film at room temperature;
(2) converting the amine group on the surface of the parylene film into an active succinimidyl group by reacting with a succinimidyl-based crosslinking agent after depositing the parylene film; and
(3) an element having an active succinimidyl group and a free amine group on the surface of the parylene film
Including; immobilizing the urease to the insoluble porous membrane by chemically reacting the urease,
The succinimidyl-based crosslinking agent is disuccinimidyl suberate (DSS),
A method for producing an insoluble porous membrane immobilized with urease. 삭제delete 제7항의 방법으로 제조된 요소분해효소가 고정화된 불용성 다공성 막을 포함하는, 요소(urea) 측정용 바이오센서.A biosensor for measuring urea, comprising an insoluble porous membrane to which the urease prepared by the method of claim 7 is immobilized. 유체 챔버;
상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 숙신이미딜계 가교제를 이용한 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막;
상기 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성
막에 근접하게 위치하며 상기 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템;
상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및
상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하고,
상기 숙신이미딜계 가교제는 디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidyl suberate, DSS)인,
유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서.fluid chamber;
a parylene-A-coated insoluble porous membrane positioned in the fluid chamber and fixed to a urease by chemical bonding using a succinimidyl-based crosslinking agent;
Parylene-A coating insoluble porosity to which the urease is fixed by chemical bonding
a screen-printed three-electrode system including a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode positioned proximate to the membrane and sensing an electrochemical signal generated by the membrane;
a sample inlet through which a sample flowing into the fluid chamber is introduced; and
Including; a sample outlet through which the sample flows out from the fluid chamber;
The succinimidyl-based crosslinking agent is disuccinimidyl suberate (DSS),
A portable urea biosensor that measures the urea concentration present in a fluidized sample. 삭제delete 제10항에 있어서,
상기 불용성 다공성 막은 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것임을 특징으로 하는, 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서.According to claim 10,
The insoluble porous membrane is made of fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk fibroin, polyimides, polyamix acid, polycarprolactone, polyetherimide, nylon , polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-benzyl-glutamate, polyphenyleneterephthalamide, polyaniline, poly acrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose, polyacrylate, polymethylmethacrylate, polylactic acid (PLA), Polyglycolic acid (PGA), copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), poly{poly(ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate} (PEOT/PBT), polyphosphoester (polyphosphoester; PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride (PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), poly(ortho ester; POE}, poly(propylene fumarate)-diacryl Characterized in that it is made of one or more biocompatible materials selected from the group consisting of poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEGDA}, A portable urea biosensor that measures the urea concentration present in a fluidized sample. 제10항에 있어서,
상기 유체 챔버와 상기 3-전극 시스템을 감싸는 하우징을 더 포함하는 것을
특징으로 하는, 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서.According to claim 10,
Further comprising a housing surrounding the fluid chamber and the three-electrode system.
Characterized in that, a portable urea biosensor for measuring urea concentration present in a sample in a fluidized state. 제10항에 있어서,
상기 3-전극 시스템의 작용 전극은 아민화된 것임을 특징으로 하는, 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서.According to claim 10,
A portable urea biosensor for measuring urea concentration present in a fluidized sample, characterized in that the working electrode of the three-electrode system is aminated. 제10항에 있어서,
상기 3-전극 시스템은 외부의 전기화학 분석장치와 연결하여 유체 챔버 내의
전기화학 신호를 탐지하는 것을 특징으로 하는, 유동상태의 시료에 존재하는 요소 농도를 측정하는 휴대용 요소 바이오센서.According to claim 10,
The 3-electrode system is connected to an external electrochemical analyzer in the fluid chamber.
A portable urea biosensor for measuring urea concentration present in a sample in a fluidized state, characterized in that it detects an electrochemical signal. 제10항의 휴대용 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 유동상태의 시료에 존재하는 요소의 농도를 측정하는 방법.A method for measuring the concentration of urea present in a sample in a fluidized state by an electrochemical method using the portable urea biosensor of claim 10. 제16항에 있어서,
상기 시료는 생물학적 시료로서 혈액, 혈청, 소변, 눈물 및 땀으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 요소의 농도를 측정하는 방법.According to claim 16,
The method of measuring the concentration of urea, characterized in that the sample is selected from the group consisting of blood, serum, urine, tears and sweat as a biological sample. 제16항에 있어서,
상기 유동상태의 시료는 0.5 내지 10mL/min의 유속으로 흐르는 것을 특징으로 하는, 요소의 농도를 측정하는 방법.According to claim 16,
The method for measuring the concentration of urea, characterized in that the sample in the fluid state flows at a flow rate of 0.5 to 10 mL / min. 제16항에 있어서,
상기 휴대용 요소 바이오센서는 요소 농도가 0.6 내지 20mM로 포함된 시료 중에서 요소 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 요소의 농도를 측정하는 방법.According to claim 16,
The method of measuring the concentration of urea, characterized in that the portable urea biosensor is capable of detecting urea in a sample containing a urea concentration of 0.6 to 20 mM.
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KR101871781B1 (en) * 2016-01-18 2018-07-31 한림대학교 산학협력단 Portable Urea Sensor Module Using Urease-immobilized Insoluble Porous Support

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Immunolo. Methods.,353(1-2):44-48 (2010.02.28.)*
Sensors and Actuators B:chemical,154(2):89-95 (2010.02.10.)*

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