KR102519517B1 - Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 분해능을 갖는, 신규한 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주, 이를 포함하는 PAH 분해용 조성물 및 PAH 오염물의 정화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 균주 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003는 저분자량 PAH인 페난트렌(phenanthrene)과 고분자량 PAH인 플루오란테인(fluoranthene), 피렌(pyrene) 및 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene)을 복합적으로 분해할 수 있으며, 최적 분해 활성을 나타내는 pH, 온도 및 염도 조건을 확인하여 PAH 분해를 위한 조성물 및 방법에 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to a novel Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain having polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading ability, a composition for decomposing PAH containing the same, and a method for purifying PAH contaminants.
The novel strain Pigmentifaga kulai KIT-003 of the present invention is a low molecular weight PAH, phenanthrene, and a high molecular weight PAH, fluoranthene, pyrene and benzo[a]pyrene. ) can be degraded in a complex manner, and the pH, temperature, and salinity conditions that exhibit optimal decomposition activity can be confirmed to be useful for compositions and methods for decomposing PAH.

Description

다환 방향족 탄화수소 분해 활성을 갖는 신규한 피그멘티파가 쿨라이 균주 및 이의 용도 {Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof}Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof {Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof}

본 발명은 다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 분해능을 갖는, 신규한 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주, 이를 포함하는 PAH 분해용 조성물 및 PAH 오염물의 정화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain having polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading ability, a composition for decomposing PAH containing the same, and a method for purifying PAH contaminants.

벤젠 고리 두 개 이상이 축합된 구조를 가지는 다환방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)는 석탄 등의 주요 구성 성분이며, 화석 연료의 연소, 가스 및 콜타르의 제조, 목재 처리 공정, 자동차 배기 가스 및 폐기물 소각 등 여러 경로를 통해 환경을 오염시킨다(Blumer et al., 1976). 이들은 독성, 돌연변이성, 발암성을 가지고 있어 오염된 토양 및 퇴적물에 PAH가 존재하면 환경에 심각한 위험을 초래하며, 이러한 특성으로 미국환경보호국(US EPA)에서는 PAH를 우선환경오염물질로 지정하였다(Mallick et al. 2011).Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), which have a condensed structure of two or more benzene rings, are major constituents of coal, etc., combustion of fossil fuels, production of gas and coal tar, wood treatment process, automobile exhaust gas and waste. It pollutes the environment through various routes such as incineration (Blumer et al., 1976). They have toxicity, mutagenicity, and carcinogenicity, so the presence of PAH in contaminated soil and sediment poses a serious risk to the environment. Mallick et al. 2011).

한편, PAH에 의해 유도된 발암성은 benzo[a]pyrene을 포함하여 몇몇 화합물에 의해 연구되어 왔다. naphthalene, phenanthrene, anthranthene 등과 같은 저분자량 PAH는 일반적으로 토양 및 실험실 조건에서 쉽게 분해되며 그 화학구조가 발암물질에서 발견되기 때문에 PAH를 검출하고 오염을 탐지하는 역할을 하고 있으며, fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene과 같은 고분자량 PAH는 미생물에 의해 분해되기 쉽지 않은 것으로 알려져 있다(Moody et al., 2001, Kanaly et al., 2000). 특히, 대표적인 고분자량 PAH인 benzo[a]pyrene은 상대독성계수(toxic equivalency factors, TEFs) 값이 1로써 개별적인 PAH중에서 가장 높은 독성을 가지는 물질로 알려져 있기 때문에 benzo[a]pyrene를 분해하는 미생물에 대한 연구는 중요하다고 할 수 있다(Nisbet et al, 1992).On the other hand, carcinogenicity induced by PAH has been studied by several compounds including benzo[a]pyrene. Low-molecular-weight PAHs such as naphthalene, phenanthrene, and anthranthene are generally easily degraded in soil and laboratory conditions, and their chemical structures are found in carcinogens, so they play a role in detecting PAHs and detecting contamination. It is known that high molecular weight PAHs such as a]pyrene are not easily degraded by microorganisms (Moody et al., 2001, Kanaly et al., 2000). In particular, benzo[a]pyrene, a representative high molecular weight PAH, has a toxic equivalency factor (TEFs) value of 1, and is known to be the most toxic substance among individual PAHs, so it is suitable for microorganisms that degrade benzo[a]pyrene. Research on this can be said to be important (Nisbet et al, 1992).

선진국에서도 PAH에 의한 환경오염 해결을 위해 생물정화 기술을 연구하고 있으나, PAH는 분자 크기가 증가함에 따라 환경 지속성이 증가할 뿐만 아니라 벤젠고리가 증가함에 따라 유전 독성이 증가하고 환경에 축적되어 지속적으로 영향을 주기 때문에 생분해 속도에도 영향을 준다고 알려져 있어 연구에 어려움을 겪고 있다(Cerniglia et al., 1992). 또한, 오염 물질의 생물학적 정화 및 그 속도는 분해되는 화학물의 환경 조건, 성질, 미생물의 유형 및 화학적 구조에 따라 달라지며 생분해 정도와 속도는 분해조건의 pH, 온도, 염도, 영양소 등을 포함한 조건들에 따라 달라지기 때문에 최적 분해조건을 밝혀내는 것이 중요하다(Haritash et al., 2009).Developed countries are also researching bioremediation technology to solve environmental pollution by PAH, but PAH not only increases environmental sustainability as the molecular size increases, but also increases genotoxicity as the benzene ring increases, accumulates in the environment, and continues to Because it affects the biodegradation rate, it is known that it affects the rate of biodegradation, so it is difficult to study (Cerniglia et al., 1992). In addition, the bioremediation and rate of contaminants depend on the environmental conditions, properties, types and chemical structures of microorganisms, and the degree and rate of biodegradation depend on conditions including pH, temperature, salinity, nutrients, etc. It is important to find out the optimal decomposition conditions because it depends on the

이러한 배경 하에, 본 발명의 발명자들은 저분자량 PAH뿐 아니라 고분자량 PAH에 대한 생분해 활성이 우수한 미생물을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 하천 시료로부터 채집 및 분리된 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주가 신규한 균주로서 PAH에 대한 분해 활성이 우수하고, 특정 PAH에 대해 최적의 분해 활성을 나타나게끔 하는 pH, 온도 및 염도 조건 등을 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Under this background, the inventors of the present invention have made diligent efforts to discover microorganisms with excellent biodegradation activity for high molecular weight PAH as well as low molecular weight PAH, and as a result, Pigmentiphaga kullae KIT-003 collected and isolated from river samples The present invention was completed by confirming through experiments the pH, temperature, salinity conditions, etc. that allow the strain to exhibit excellent decomposition activity for PAH as a novel strain and exhibit optimal decomposition activity for a specific PAH.

본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.The present invention aims to solve the above problems and other problems related thereto.

본 발명의 일 예시적 목적은 다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 분해능을 갖는, 신규한 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) 균주를 제공하는 것이다.One exemplary object of the present invention is to provide a novel Pigmentiphaga kullae strain having polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading ability.

본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 균주를 포함하는 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물 을 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons including the strain.

본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 균주를 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는, 다환 방향족 탄화수소 오염물의 정화 방법을 제공하는 것이다.Another exemplary object of the present invention is to provide a method for purifying polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants, comprising the step of contacting the strain with a sample containing polycyclic aromatic hydrocarbons.

본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved according to the technical idea of the invention disclosed in this specification is not limited to the problem to solve the problems mentioned above, and another problem not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description. There will be.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in this application may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, the scope of the present application is not to be construed as being limited by the specific descriptions described below.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 분해능을 갖는, 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) 균주를 제공하며, 구체적으로 상기 균주는 신규한 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주이다(수탁번호 KCTC 13948BP).One aspect of the present invention for achieving the above object provides a Pigmentiphaga kullae strain having polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading ability, and specifically, the strain is a novel pigment Paga kulai KIT-003 strain (accession number KCTC 13948BP).

본 발명에서 "다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)"란 2개 또는 그 이상의 방향족 고리로 연결되어 있는 유기화합물로, 개별물질의 불완전 연소 또는 유기물의 열분해로 발생되며 인체 및 환경에 중대한 오염원이 되는 물질이다. PAH는 여러가지 배출원으로부터 배출되며 이는 자연적인 배출원과 인위적인 배출원으로 나뉜다. 인위적인 배출원의 경우 자동차, 난방설비, 산업시설, 소각로, 발전소 등에서 사용되는 화석연료의 연소, 쓰레기 및 폐기물 등의 불완전 연소, 토양 잔재의 연소 등이 대부분을 차지한다. 상기 PAH는 나프탈렌(naphthalene), 페난트렌(phenanthrene), 안트라센(anthranthene) 등과 같은 저분자량 PAH 및 플루오란테인(fluoranthene), 피렌(pyrene), 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene)과 같은 고분자량 PAH를 모두 포함하는 것으로, 구체적으로는 페난트렌, 플루오란테인, 피렌 또는 벤조에이피렌일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs)" are organic compounds linked by two or more aromatic rings, which are generated by incomplete combustion of individual substances or thermal decomposition of organic substances, and are a significant pollutant to the human body and the environment. It is a substance that becomes PAHs are emitted from various sources, which are divided into natural and anthropogenic sources. In the case of anthropogenic emission sources, combustion of fossil fuels used in automobiles, heating facilities, industrial facilities, incinerators, power plants, etc., incomplete combustion of garbage and waste, and combustion of soil residues account for most of them. The PAHs include low molecular weight PAHs such as naphthalene, phenanthrene, and anthranthene, and high molecular weight PAHs such as fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene. It includes all PAHs, and may specifically be phenanthrene, fluoranthene, pyrene, or benzoapyrene, but is not particularly limited thereto.

본 발명에서 "피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae)"는 피그멘티파가(Pigmentiphaga) 속의 막대 모양의 그람 음성 박테리아로, 아조 염료 화합물 1-(4'-carboxyphenylazo)-4-naphthol를 호기적으로 탈색시키는 활성이 있으며 이를 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용하는 것으로 알려져 있다. 특히, 본 발명의 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주는 총 1107bP의 16s rDNA 염기서열(서열번호 1)을 갖는 신규한 균주로, 본 발명의 발명자들은 이를 생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2019년 9월 17일에 수탁번호 KCTC 13948BP를 부여받았다. 본 발명의 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주는 다환 방향족 탄화수소에 대해 우수한 분해능을 나타내며, 상기 다환 방향족 탄화수소는 페난트렌, 플루오란테인, 피렌 또는 벤조에이피렌일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. In the present invention, " Pigmentiphaga kullae" is a rod-shaped gram-negative bacterium of the genus Pigmentiphaga, and azo dye compound 1- (4'-carboxyphenylazo) -4-naphthol aerobically It has a decolorizing activity and is known to use it as the only carbon and energy source. In particular, the Pigmentifaga Kulai KIT-003 strain of the present invention is a novel strain having a total of 1107 bP of 16s rDNA sequence (SEQ ID NO: 1), and the inventors of the present invention deposited it at the Biological Resource Center of the Research Institute of Bioscience and Biotechnology in 2019 On September 17, 2017, it was assigned the accession number KCTC 13948BP. The Pigmentifaga kulai KIT-003 strain of the present invention shows excellent decomposition ability for polycyclic aromatic hydrocarbons, and the polycyclic aromatic hydrocarbons may be phenanthrene, fluoranthene, pyrene or benzoapyrene, but are not particularly limited thereto.

또한, 본 발명의 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주는 분해증진제 HPCD(hydroxypropyl-ß-cyclodextrin)의 첨가에 따라 다환 방향족 탄화수소 분해능이 증가하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는, 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주가 배양시간에 의존적으로 페난트렌(300 mg/L)에 대한 분해능이 증가하는 것을 확인하였으며, 추가로 HPCD를 첨가한 경우 배양시간 5일만에 페난트렌에 대한 분해율이 100%에 이르는 것을 확인하였다(도 4). 아울러 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주가 플루오란테인, 피렌 및 벤조에이피렌(10 mg/L)에 대해서도 분해능이 있음을 확인하였으며, 추가로 HPCD를 첨가한 경우 분해율이 약 1.5 내지 4배 가량 증가하는 것을 확인하였다(도 5).In addition, the Pigmentifaga Kulai KIT-003 strain of the present invention is characterized in that the polycyclic aromatic hydrocarbon decomposition ability increases according to the addition of the decomposition enhancer HPCD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin). In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the decomposition ability of phenanthrene (300 mg/L) of the Pigmentipa kulai KIT-003 strain increased depending on the incubation time, and when HPCD was additionally added, the incubation time It was confirmed that the decomposition rate for phenanthrene reached 100% in 5 days (FIG. 4). In addition, it was confirmed that the Pygmentifaga Kulai KIT-003 strain has decomposition ability for fluoranthene, pyrene, and benzoapyrene (10 mg/L), and when HPCD was added, the decomposition rate was about 1.5 to 4 times. It was confirmed that it increased (FIG. 5).

상기 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주는 최적 분해 활성을 나타내는 pH, 온도 및 염도 범위를 갖는 것으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 균주가 pH 6.0 내지 9.0, 온도 25 내지 35℃, 염도 0 내지 1% 조건, 보다 구체적으로는 pH 6.0 내지 7.0, 온도 30℃, 염도 0 내지 0.5% 조건에서 페난트렌에 대한 최적 분해능을 나타냄을 확인하였다(도 6). 또한, 상기 균주는 pH 4.0 내지 9.0, 온도 30 내지 40℃, 염도 0 내지 1% 조건, 보다 구체적으로는 pH 7.0 내지 8.0, 온도 35℃, 염도 0 내지 0.5% 조건에서 벤조에이피렌에 대한 최적 분해능을 나타냄을 확인하였다(도 7).The Pigmentifaga Kulai KIT-003 strain has a range of pH, temperature and salinity that exhibits optimal decomposition activity. 1% condition, more specifically, it was confirmed that the optimum decomposition ability for phenanthrene was exhibited under the conditions of pH 6.0 to 7.0, temperature 30 ° C., and salinity 0 to 0.5% (FIG. 6). In addition, the strain is pH 4.0 to 9.0, temperature 30 to 40 ℃, salinity 0 to 1% conditions, more specifically pH 7.0 to 8.0, temperature 35 ℃, optimum resolution of benzoapyrene under conditions of 0 to 0.5% salinity It was confirmed that it represents (FIG. 7).

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주를 포함하는, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물을 제공한다. 상기 용어 피그멘티파가 쿨라이, 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 및 다환 방향족 탄화수소는 전술한 바와 같다.Another aspect of the present invention for achieving the above object provides a composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons, including Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain. The terms Pigmentipa is Kulai, Pigmentifa is Kulai, KIT-003, and polycyclic aromatic hydrocarbons are as described above.

상기 조성물은 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 균주의 PAH 분해능을 보다 증진시키기 위해 분해증진제 HPCD(hydroxypropyl-ß-cyclodextrin)를 추가로 더 포함할 수 있으며, 그 외에 다환 방향족 탄화수소 오염물 내에 부족할 수 있는 질소와 인, 과산화수소와 같은 산소 유발물질, 오염물질과 미생물 간의 표면 접촉을 촉진하기 위한 계면활성제 및 오염물질의 생화학적 분해의 여러 단계를 적절하게 활성화하는 효소 등을 더 포함할 수 있다. 상기 산소 유발물질, 계면활성제 및 효소 등은 당업계의 통상의 기술자의 선택에 따라 적절한 양과 비율로 상기 조성물에 더 포함될 수 있으며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.The composition may further include a decomposition enhancer HPCD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin) to further enhance the PAH decomposition ability of the Pigmentipa kulai KIT-003 strain, and in addition, nitrogen that may be lacking in polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants. It may further include oxygen-inducing substances such as wine and hydrogen peroxide, surfactants for promoting surface contact between contaminants and microorganisms, and enzymes appropriately activating various stages of biochemical decomposition of contaminants. The oxygen-inducing substance, surfactant, enzyme, etc. may be further included in the composition in an appropriate amount and ratio according to the selection of a person skilled in the art, and is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주를 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는, 다환 방향족 탄화수소 오염물의 정화 방법을 제공한다. 상기 용어 피그멘티파가 쿨라이, 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003 및 다환 방향족 탄화수소는 전술한 바와 같다.Another aspect of the present invention for achieving the above object is to purify polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants, comprising the step of contacting Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain with a sample containing polycyclic aromatic hydrocarbons provides a way The terms Pigmentipa is Kulai, Pigmentifa is Kulai, KIT-003, and polycyclic aromatic hydrocarbons are as described above.

상기 시료는 토양, 대기, 해수 및 하천 등으로부터 유래된 것으로 다환 방향족 탄화수소를 발생 및 배출시키는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 명세서에서 다환 방향족 탄화수소 오염물 또는 오염물질과 혼용될 수 있다. 즉, 상기 다환 방향족 탄화수소 오염물은 다환 방향족 탄화수소에 오염된 토양, 대기, 해수 및 하천 시료를 의미할 수 있으며 당업계 통상의 기술자에 의해 적절히 선택될 수 있다.The sample is not particularly limited as long as it is derived from soil, air, seawater, rivers, etc. and generates and discharges polycyclic aromatic hydrocarbons, and may be mixed with polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants or pollutants in the present specification. That is, the polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants may mean soil, air, seawater, and river samples contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.

본 발명의 신규한 균주 피그멘티파가 쿨라이 KIT-003는 저분자량 PAH인 페난트렌(phenanthrene)과 고분자량 PAH인 플루오란테인(fluoranthene), 피렌(pyrene) 및 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene)을 복합적으로 분해할 수 있으며, 최적 분해 활성을 나타내는 pH, 온도 및 염도 조건을 확인하여 PAH 분해를 위한 조성물 및 방법에 유용하게 활용될 수 있다.The novel strain Pigmentifaga kulai KIT-003 of the present invention is a low molecular weight PAH, phenanthrene, and a high molecular weight PAH, fluoranthene, pyrene and benzo[a]pyrene. ) can be degraded in a complex manner, and the pH, temperature, and salinity conditions that exhibit optimal decomposition activity can be confirmed to be useful for compositions and methods for decomposing PAH.

다만, 본 명세서에 개시된 기술의 일 실시예에 따른 효과는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, effects according to one embodiment of the technology disclosed in this specification are not limited to those mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

본 명세서에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 Pigmentiphaga kullae KIT-003 균주의 균총 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 Pigmentiphaga kullae KIT-003 균주의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 Pigmentiphaga kullae KIT-003 균주의 16s rRNA 서열에 기초한 계통수를 나타낸 것이다.
도 4는 Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 균주의 배양시간에 따른 페난트렌(phenanthrene) 분해율을 나타낸 것이다.
도 5는 Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 균주의 배양시간에 따른 플루오란테인(fluoranthene), 피렌(pyrene) 및 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene) 분해율을 나타낸 것이다.
도 6은 Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 균주의 pH, 온도, 염분 농도에 따른 페난트렌(phenanthrene) 분해율을 나타낸 것이다.
도 7은 Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 균주의 pH, 온도, 염분 농도에 따른 benzo[a]pyrene 1 mg/L 분해율을 나타낸 것이다.In order to more fully understand the drawings cited herein, a brief description of each drawing is provided.
Figure 1 shows a photo of the flora of the Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain.
Figure 2 shows a SEM image of the Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain.
Figure 3 shows a phylogenetic tree based on the 16s rRNA sequence of the Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain.
Figure 4 shows the decomposition rate of phenanthrene according to the incubation time of the Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 strain.
Figure 5 shows the decomposition rate of fluoranthene, pyrene and benzo[a]pyrene according to the incubation time of the Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 strain.
6 shows the phenanthrene decomposition rate according to pH, temperature, and salt concentration of the Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 strain.
7 shows the decomposition rate of 1 mg/L of benzo[a]pyrene according to pH, temperature, and salt concentration of the Pigmentiphaga kullae strain KIT-003 strain.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention by way of example, and the scope of the present invention is not limited only to these examples.

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

(1) 균주의 분리(1) Isolation of strains

1) 시료 채집 및 농후배양1) Sample collection and enrichment culture

양산시 물금역 근처 하천에서 채취한 하천 시료를 실험실로 운반한 후 다환 방향족 탄화수소를 분해하는 미생물만 선별하기 위해 phenanthrene, fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene(Sigma-aldrich, St Louis, MO, USA)이 약 100 mg/L씩 들어있는 bushnell-haas(BH) 최소배지(Difco, Maryland, USA) 500 mL에 하천시료 20g을 접종하여 30 ℃에서 한 달 동안 진탕 배양하였다. BH 배지의 조성은 MgSO₄0.2g/L, CaCl₂0.02g/L, KH₂PO₄1.0g/L, (NH₄)₂HPO₄1.0g/L, KNO₃1.0g/L, FeCl₃0.05g/L, pH 7.0 이었다. 위의 배양액 중 일부(10 mL)를 위에서와 같은 배지 500 mL에 가해주고 한 달 동안 다시 배양하기를 반복하였다.After transporting river samples from rivers near Mulgeum Station in Yangsan-si to the laboratory, phenanthrene, fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene (Sigma-aldrich, St Louis, MO, USA) were selected to select only microorganisms that decompose polycyclic aromatic hydrocarbons. 20 g of a river sample was inoculated into 500 mL of bushnell-haas (BH) minimal medium (Difco, Maryland, USA) containing 100 mg/L of this drug, and cultured with shaking at 30 °C for one month. The composition of the BH medium was MgSO ₄ 0.2 g/L, CaCl ₂ 0.02 g/L, KH ₂ PO ₄ 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ 1.0 g/L, KNO ₃ 1.0 g/L, FeCl ₃ 0.05 g/L, pH 7.0. A portion (10 mL) of the above culture medium was added to 500 mL of the same medium as above, and the culture was repeated for one month.

2) 다환 방향족 탄화수소 분해 미생물의 분리2) Separation of polycyclic aromatic hydrocarbon degrading microorganisms

다환 방향족 탄화수소(PAHs)를 분해하는 미생물을 분리하기 위해 농후배양액을 BH 최소 고형배지에 도말한 후 아세톤에 녹아있는 1% phenanthrene을 배지의 표면이 충분히 덮이도록 가하여 주고, acetone 용액을 공기 중으로 날려 보냈다. 약 2주 동안 배양하여 phenanthrene이 도포된 배지에서 성장한 미생물 중 균체 주변에 phenanthrene이 없어져 투명한 분해환(clear zone)이 생긴 균주를 phenanthrene을 분해하는 미생물로 분리하였다. phenanthrene을 분해하는 것으로 예상되는 균이 다른 고분자량의 PAH도 분해할 것이라고 예상하였다(Moody et al., 2001). 이 중에 분해환이 두드러지게 나타나 분해 능력이 좋을 것으로 예상되는 균주를 KIT-003 균주로 명명하였다.To isolate microorganisms that decompose polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), the concentrated culture medium was spread on a BH minimum solid medium, 1% phenanthrene dissolved in acetone was added to sufficiently cover the surface of the medium, and the acetone solution was blown into the air. . Among the microorganisms grown in the medium coated with phenanthrene after culturing for about 2 weeks, strains in which phenanthrene was lost around the cells and a clear zone was formed were isolated as microorganisms that degrade phenanthrene. It was expected that the bacteria expected to degrade phenanthrene would also degrade other high molecular weight PAHs (Moody et al., 2001). Among them, the decomposition ring was prominently displayed, and the strain expected to have good decomposition ability was named KIT-003 strain.

(2) 균주의 동정(2) Identification of the strain

1) 분리 균주의 현미경 시료의 제작1) Preparation of microscopic samples of isolated strains

분리된 균주의 외형 및 크기 측정은 Field emission scanning electron microscope (FE-SEM, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하였다. SEM 촬영을 위하여 고체배지 위의 세포를 ‘5% Paraformaldehyde: 5% Glutaraldehyde in PBS= 1:1’의 1차 고정액을 이용하여 시료를 상온에서 약 3시간 가량 고정하였다. PBS(Phosphate Bufferd Saline)로 2회 세척한 후, 1% osmium tetroxide(Sigma Aldrich, St. Louis, USA) 용액으로 1시간 30분에서 2시간 가량 최종 고정하고 이후 다시 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 30% ~ 100%까지 알코올 농도를 점점 높여가면서 탈수시키고 마지막에 100% 알코올로 10분간 탈수하는 과정을 3회 반복하였다. 탈수 후 100% 3-methylbutylacetate로 10분 간 2회 반복 처리하였고 임계점 건조기(Critical point dryer)에서 건조시킨 후, 백금으로 코팅한 다음 FE-SEM으로 관찰하였다.The appearance and size of the isolated strains were measured using a field emission scanning electron microscope (FE-SEM, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan). For SEM imaging, the cells on the solid medium were fixed for about 3 hours at room temperature using the primary fixative of ‘5% Paraformaldehyde: 5% Glutaraldehyde in PBS= 1:1’. After washing twice with PBS (Phosphate Buffered Saline), it was finally fixed with 1% osmium tetroxide (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) solution for 1 hour 30 minutes to 2 hours, and then washed twice with PBS again. Then, the process of dehydration while gradually increasing the alcohol concentration from 30% to 100%, and finally dehydration with 100% alcohol for 10 minutes was repeated three times. After dehydration, treatment was repeated twice for 10 minutes with 100% 3-methylbutylacetate, dried in a critical point dryer, coated with platinum, and observed with FE-SEM.

2) 분리 균주의 생화학적 특성 확인 시험2) Biochemical characterization test of the isolated strain

분리한 KIT-003 균주는 그람 염색한 결과 음성이었으며, oxidase activity를 확인한 결과 양성이었다. 분리한 미생물 균주의 생화학적 특성을 파악하기 위해서 API 20NE kit(BioMerieux, France)를 사용하여, 21 종류의 생화학적 특성을 조사하였다. 분리균주를 1/2TSA배지에 배양하여 1~4 개 콜로니 피펫으로 흡착하여 API NaCl 0.85% Medium에 넣어 희석한 후 0.5 Mcfarland(bioMerieux, France.)로 탁도를 조정하였다. 스트립에 균을 접종할 때는 NO₃에서 PNPG까지 세균 부유액을 기포가 생기지 않게 튜브까지 채웠다. API AUX Medium을 개봉하고 만들어 둔 접종액 200 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, API AUX Medium을 GLU에서 PAC까지 큐플과 튜브에 가득 채우고 GLU, ADH, URE는 혐기적인 조건을 만들어 주기 위해 광유(mineral oil)로 큐플을 채운 후 스트립 위에 뚜껑을 덮고 27~31 ℃에서 24시간 동안 호기적인 상태에서 배양하였다. 동일한 피펫을 사용하여 튜브 바닥에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 스트립을 약간 앞으로 기울이고 피펫으로 현탁액을 측면에 대고 접종하여 30 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 색변화를 통하여 양성, 음성을 판단하였다. 이렇게 판단된 결과들을 BioMerieux 사의 Database(http;//apiweb.biomerieux.com)을 통해 동정하였다.The isolated KIT-003 strain was negative as a result of Gram staining, and positive as a result of confirming oxidase activity. In order to identify the biochemical characteristics of the isolated microbial strains, the biochemical characteristics of 21 strains were investigated using the API 20NE kit (BioMerieux, France). The isolated strain was cultured in 1/2TSA medium, adsorbed with 1 to 4 colony pipettes, diluted in API NaCl 0.85% Medium, and turbidity was adjusted with 0.5 Mcfarland (bioMerieux, France.). When the strip was inoculated with bacteria, the bacterial suspension from NO ₃ to PNPG was filled up to the tube without air bubbles. Open the API AUX Medium, add 200 μl of the prepared inoculum, mix well, fill the cuple and tube with API AUX Medium from GLU to PAC, and add mineral oil to GLU, ADH, and URE to create anaerobic conditions. After filling the cuple with , a lid was placed on the strip and incubated at 27-31 ° C. for 24 hours in an aerobic state. Using the same pipette, the strip was slightly tilted forward to prevent air bubbles from forming at the bottom of the tube, and the suspension was inoculated sideways with the pipette, followed by incubation at 30 °C for 24 hours. After culturing, positive and negative were judged through color change. The results judged in this way were identified through the BioMerieux database (http;//apiweb.biomerieux.com).

3) 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정 및 계통수 작성3) Identification and creation of a phylogenetic tree through 16s rRNA gene sequencing analysis

분리균주의 정확한 동정을 위해 16s rRNA 염기서열 유사도 분석을 통한 상동성을 분석하였다. 균을 3 ㎖ 증류수에 넣고 원심분리하고, proteinase K buffer 8 μL (20 mg/mL) 넣은 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) buffer 500 μL을 펠렛에 넣어 재정지시켰다. 혼합물을 65 ℃에서 30분 간 배양한 후 샘플은 시원하게 두고, 동량의 PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol, 24;25;1)을 넣고 1분 동안 vortex한 후 4 ℃, 13,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상등액은 1.5 mL Eppendorf tube에 옮기고 450 μL의 isopropanol을 넣고 섞었다. 이를 4 ℃에서 5분간, 13,000rpm으로 원심분리 하였다. 상등액은 70% 에탄올 500 ㎕로 세척하였다(ji Cho, Hyun, et al 2016). 이후 에탄올을 제거하고 pellet을 실온에서 30분간 건조시킨 후, 50 ㎕의 Tris-EDTA bufffer(pH 8.0)에 녹이고 게놈 DNA는 PCR 증폭 전까지 -20 ℃에 보관하였다(Fatima et al., 2011). 이후 16s rRNA sequence 증폭을 위해 primer로 총 양을 증폭하였다. 서열 증폭을 위한 PCR cycling은 95 ℃에서 5분간 초기변성 단계(intial denaturaion)를 수행한 뒤 95 ℃에서 30초간 변성(denaturation), 50 ℃로 30초간 결합반응(annealing), 그리고 72 ℃에서 30초간 증폭반응(extension)을 30회 반복한 뒤 72 ℃에서 10분간 최종신장반응(final extension) 과정을 수행하였다. 증폭된 것들은 FAVORGEN cleanup kit (Biotech Corp., Taiwan)를 이용하여 16s rRNA 유전자만 순수하게 분리, 정제한 뒤 BigDye Terminator 16s rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 비교하였다(Chen et al., 2015).For accurate identification of the isolated strain, homology was analyzed through 16s rRNA nucleotide sequence similarity analysis. The bacteria were put into 3 ml of distilled water, centrifuged, and 500 μL of cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) buffer containing 8 μL of proteinase K buffer (20 mg/mL) was added to the pellet to resuspend. After incubating the mixture at 65 ℃ for 30 minutes, leave the sample cool, add the same amount of PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol, 24;25;1), vortex for 1 minute, and centrifuge for 10 minutes at 4 ℃ and 13,000 rpm. separated. The supernatant was transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube, and 450 μL of isopropanol was added and mixed. This was centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes and 13,000 rpm. The supernatant was washed with 500 μl of 70% ethanol (ji Cho, Hyun, et al 2016). After removing ethanol, the pellet was dried at room temperature for 30 minutes, dissolved in 50 μl of Tris-EDTA buffer (pH 8.0), and genomic DNA was stored at -20 ° C until PCR amplification (Fatima et al., 2011). Then, the total amount was amplified with a primer for 16s rRNA sequence amplification. PCR cycling for sequence amplification was performed by initial denaturation at 95 °C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 °C for 30 seconds, annealing at 50 °C for 30 seconds, and 72 °C for 30 seconds. After repeating the amplification reaction 30 times, a final extension process was performed at 72° C. for 10 minutes. The amplified ones were purified using the FAVORGEN cleanup kit (Biotech Corp., Taiwan) to isolate and purify only the 16s rRNA gene, and the base sequence of the BigDye Terminator 16s rRNA gene was GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) (Chen et al., 2015).

(3) 분리 균주의 다환 방향족 탄화수소 분해율 및 분해특성 확인(3) Confirmation of polycyclic aromatic hydrocarbon decomposition rate and decomposition characteristics of the isolated strain

1) 분리 균주의 다환 방향족 탄화수소 분해율 확인 및 분해증진제 첨가에 따른 분해율 확인1) Confirmation of the polycyclic aromatic hydrocarbon decomposition rate of the isolated strain and confirmation of the decomposition rate according to the addition of a decomposition enhancer

분리된 단일 균주를 멸균된 TSB배지에 접종하여 30 ℃, 170rpm으로 약 24시간 동안 진탕배양한 후 spectrophotometer(Cary 300 UV-vis, Agilent, CA, USA)를 사용하여 600 nm에서 OD값을 측정하였을 때 2.0수준이 되도록 배양하였다. 배양된 균주를 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 상등액은 제거하고 동량의 BH 배지로 세척하는 과정을 총 2회 수행하여 접종 시 사용할 균을 준비하였다.The isolated single strain was inoculated into a sterilized TSB medium, shaken at 30 ° C and 170 rpm for about 24 hours, and then the OD value was measured at 600 nm using a spectrophotometer (Cary 300 UV-vis, Agilent, CA, USA). cultured to a level of 2.0. The cultured strain was centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes, the supernatant was removed, and the process of washing with the same amount of BH medium was performed twice in total to prepare bacteria to be used during inoculation.

분리된 미생물 균주의 다환 방향족 탄화수소 분해가능성을 확인하기 위해 phenanthrene, fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene이 각각 녹아있는 acetone 용액을 가하여 phenanthrene 300 mg/L, fluoranthene 10 mg/L, pyrene 10 mg/L, benzo[a]pyrene 5 mg/L 수준이 되도록 처리한 다음 clean bench에서 acetone을 완전히 제거하였다. BH 배지와 PAH의 수용성을 높여 생분해 정도를 높여주는 것으로 알려진 분해증진제인 ‘hydroxypropyl-ß-cyclodextrin; HPCD(Tokyo chemical industry Co., Ltd, Japan)를 1% 첨가(w/v)한 BH 배지(Brusseau et al., 1994)를 준비한 후 각각의 배지를 각 bottle에 첨가하여 sonicator로 10분간 sonication시켰다. KIT-003 균주 10% 수준으로 처리한 후 분해가 빠를 것으로 예상되는 phenanthrene은 1, 3, 5, 7일, 고분자량 PAH로 분해가 느릴 것으로 예상되는 fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene 각각 7, 14일 배양하여 분해율을 확인하였다.In order to confirm the polycyclic aromatic hydrocarbon degradability of the separated microbial strain, an acetone solution containing phenanthrene, fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene was added, respectively. , benzo[a]pyrene was treated to a level of 5 mg/L, and then acetone was completely removed on a clean bench. ‘hydroxypropyl-β-cyclodextrin; After preparing BH medium (Brusseau et al., 1994) containing 1% (w/v) of HPCD (Tokyo chemical industry Co., Ltd, Japan), each medium was added to each bottle and sonicated for 10 minutes with a sonicator. . After treatment at the level of 10% of the KIT-003 strain, phenanthrene, which is expected to decompose rapidly, takes 1, 3, 5, and 7 days, and fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene, which are expected to be degraded slowly as high molecular weight PAH, take 7 days, respectively. After culturing for 14 days, the degradation rate was confirmed.

2) 추출 및 분석 방법2) Extraction and analysis method

Separatory funnel에 채취한 시료 전체와 동량의 ethyl acetate(Honeywell, Burdick&Jackson, USA)를 넣고 shaker로 약 10분간 진탕한 후 아래층은 받아두고 상층은 동일한 추출 과정을 2회 반복하여 추출용액을 sodium sulfate를 통과시켜 탈수시켰다. 추출된 시료는 감압농축기로 ethyl acetate를 완전히 날린 후 tetrahydrofuran(Honeywell, Burdick&Jackson, USA)으로 최초 농도 수준이 되도록 희석하여 HPLC로 분석하였다. HPLC는 1260 series LC system(Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하였고, Detector는 DAD를 이용하였다. 컬럼은 Phenomenex Luna 5μm C18(2) (4.6X250 nm, 5 μm) 사용하였다. 용매시스템은 acetonitrile와 water로 이루어졌으며 이동상의 조건은 등용매조건으로 acetonitrile : water 가 9:1 비율로 10분간 분석하였다. 흘림속도는 1.2 mL/min, 컬럼온도는 35 ℃, 주입량은 5 μL, 검출기 파장은 phenanthrene은 254 nm, fluoranthene 286nm, pyrene 240nm, benzo[a]pyrene 295nm 설정하여 분석하였다. 크로마토그래피 데이터는 chemstation for LC 3D system Rev.B.04.03 프로그램을 이용하여 수집하였다.Put the same amount of ethyl acetate (Honeywell, Burdick & Jackson, USA) as the entire sample collected in the separatory funnel, shake it with a shaker for about 10 minutes, keep the lower layer, and repeat the same extraction process twice for the upper layer to pass the extraction solution through sodium sulfate and dehydrated. The extracted sample was analyzed by HPLC after completely diluting the sample with tetrahydrofuran (Honeywell, Burdick & Jackson, USA) to the initial concentration level after evaporating ethyl acetate with a vacuum concentrator. A 1260 series LC system (Agilent Technologies, CA, USA) was used for HPLC, and DAD was used as a detector. A Phenomenex Luna 5 μm C18(2) (4.6X250 nm, 5 μm) column was used. The solvent system was composed of acetonitrile and water, and the condition of the mobile phase was isocratic, and acetonitrile: water was analyzed for 10 minutes at a ratio of 9:1. The flow rate was 1.2 mL/min, the column temperature was 35 °C, the injection amount was 5 μL, and the detector wavelengths were analyzed by setting 254 nm for phenanthrene, 286 nm for fluoranthene, 240 nm for pyrene, and 295 nm for benzo[a]pyrene. Chromatography data were collected using the chemstation for LC 3D system Rev.B.04.03 program.

각각의 PAH를 정량하기 위해 검량곡선은 선형회귀를 사용하여 분석물질 대 분석물질 농도의 피크면적 비로 구성되었다. 표준물질은 각 PAH를 tetrahydrofuran에 녹여 사용하였고 농도는 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50, 100, 300 mg/L 이었다. 검출한계(LOD)와 정량한계 (LOQ)는 각각의 표준용액을 신호대-잡음비가 3:1과 10:1이 될 때까지 주입하여 측정하였다. 실험방법의 정밀도는 동일 농도에서 실시한 회수율 실험을 통해 검증하였다.To quantify each PAH, a calibration curve was constructed as the peak area ratio of analyte to analyte concentration using linear regression. As standard substances, each PAH was dissolved in tetrahydrofuran, and concentrations were 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50, 100, and 300 mg/L. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were measured by injecting each standard solution until the signal-to-noise ratios were 3:1 and 10:1. The precision of the experimental method was verified through a recovery rate experiment conducted at the same concentration.

(4) KIT-003 균주의 phenanthrene, benzo[a]pyrene 분해특성 확인(4) Confirmation of phenanthrene and benzo[a]pyrene decomposition characteristics of strain KIT-003

분해율 확인 후 KIT-003 균주의 최적 분해조건을 확인하기 위해 phenanthrene 300 mg/L benzo[a]pyrene 2 mg/L 농도에서의 pH, 염도, 온도 조건을 달리하여 분해율은 확인하고자 하였다. pH에 따른 분해능을 확인하기 위해 최소배지(BH배지 또는 1% HPCD가 포함된 BH 배지(w/v))를 0.25 M KOH와 80% Phosphoric acid로 pH를 각각 4.0~9.0(1.0간격)으로 조절하여 30 ℃, 염도 0% 조건에서 배양하였고, 온도에 따른 분해능을 확인하기 위해 온도는 20 ℃ ~ 45 ℃(5 ℃간격)에서 pH 7.0, 염도 0% 조건에서 배양하였다. 또한 염도에 따른 분해능을 확인하기 위해 최소배지에 sodium chloride(Sigma-aldrich, St Louis, MO, USA)를 0%~3% 수준으로 처리하여 pH 7.0, 30 ℃에서 배양하였다. 모든 시험병에 KIT-003 균주를 10%수준으로 처리한 후 배양하여 phenanthrene은 3일차, benzo[a]pyrene은 7일차의 분해율을 확인하였다. 모든 실험은 모두 3회 반복으로 수행되었다.After confirming the degradation rate, the degradation rate was checked by varying the pH, salinity, and temperature conditions at the concentration of phenanthrene 300 mg/L and benzo[a]pyrene 2 mg/L to confirm the optimal degradation conditions of the KIT-003 strain. To check the resolution according to pH, the pH of the minimal medium (BH medium or BH medium containing 1% HPCD (w/v)) was adjusted to 4.0 to 9.0 (1.0 interval) with 0.25 M KOH and 80% Phosphoric acid, respectively. and cultured at 30 ℃ and 0% salinity conditions, and in order to confirm the resolution according to temperature, the temperature was 20 ℃ ~ 45 ℃ (5 ℃ intervals), pH 7.0, 0% salinity conditions. In addition, to confirm the resolution according to the salinity, sodium chloride (Sigma-aldrich, St Louis, MO, USA) was treated at a level of 0% to 3% in a minimal medium and cultured at pH 7.0 and 30 ℃. All test bottles were treated with KIT-003 at a level of 10% and then cultured to confirm the decomposition rate of phenanthrene on the 3rd day and benzo[a]pyrene on the 7th day. All experiments were performed in triplicate.

2. 결과2. Results

(1) KIT-003 균주의 동정(1) Identification of KIT-003 strain

1) KIT-003 균주의 형태학적 특성1) Morphological characteristics of strain KIT-003

KIT-003균주의 외형은 도 1과 같았으며, KIT-003 균주에 대한 형태학적 특성을 분석하기 위해 1/2 TSA배지에서 배양하여 주사전자현미경(SEM)으로 촬영한 결과는 도 2와 같았다. 본 실험에서 분리한 KIT-003균주의 외형은 편모나 선모가 없는 형태였고, 폭과 길이는 각각 0.5~0.6 μm, 0.8~1.1 μm로 길이가 폭보다 긴 막대 모양의 간균(rod)의 형태인 것으로 관찰되었다.The appearance of the KIT-003 strain was as shown in FIG. 1, and the results of culturing in 1/2 TSA medium and photographing with a scanning electron microscope (SEM) were shown in FIG. 2 to analyze the morphological characteristics of the KIT-003 strain. The appearance of the KIT-003 strain isolated in this experiment was without flagella or glandular hairs, and the width and length were 0.5~0.6 μm and 0.8~1.1 μm, respectively. was observed to be

2) KIT-003 균주의 생화학적 특성2) Biochemical characteristics of strain KIT-003

API 20NE kit(BioMerieux, France)를 이용하여 KIT-003 균주의 생화학적 특성을 확인할 수 있는 총 21개의 시험 중에서 KIT-003 균주는 Maltose, Adipate, citrate, phenyl-acetate 동화반응, cytochrome 산화효소에서 양성을 나타내었고 그 밖의 질산염으로부터 아질산염 생산, Indole 생산을 포함한 다른 시험에서는 음성반응을 나타내었다(표 1).Among a total of 21 tests that can confirm the biochemical characteristics of strain KIT-003 using the API 20NE kit (BioMerieux, France), strain KIT-003 was positive for maltose, adipate, citrate, phenyl-acetate assimilation, and cytochrome oxidase. and showed negative reactions in other tests including nitrite production and indole production from nitrate (Table 1).

시험test 활성activation 시험test 활성activation 질산염에서 아질산염으로의 환원Nitrate to Nitrite Reduction -- 만니톨 동화mannitol assimilation -- 인돌 생산indole production -- N-아세틸-글루코사민 동화N-acetyl-glucosamine assimilation -- 포도당 산성화glucose acidification -- 말토오스 동화maltose fairy tale ++ 아르기닌 수해arginine flood -- 글루코네이트 동화gluconate assimilation -- 요소분해효소urease -- 카프레이트 동화caprate fairy tale -- 에스쿨린 가수분해
(β-glucosidase)esculin hydrolysis
(β-glucosidase) -- 아디페이트 동화adipate fairy tale ++ 겔 가수분해(protease)Gel hydrolysis (protease) -- 말레이트 동화malate fairy tale -- β-칼락토시드 가수분해효소β-galactoside hydrolase -- 구연산염 동화citrate assimilation ++ 글루코오스 동화glucose assimilation -- 페닐-아세테이트 동화Phenyl-acetate assimilation ++ 아라비노오스 동화arabinose fairy tale -- 시토크롬 산화효소cytochrome oxidase ++ 마노스 동화fairy tale of manos --

3) 16s rDNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정 결과3) Identification result through 16s rDNA gene sequencing

분리해낸 균주를 16s rDNA 염기서열을 분석한 결과, 총 1107bP의 서열을 확인할 수 있었다(서열번호 1). 이를 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 확인한 결과, Pigmentiphaga kullae 균주와 sequence 유사성이 99% 이상 일치하는 것을 확인할 수 있었으며 이를 작성한 계통수는 도 3과 같았다. 분리균주와 가까운 계통수를 가진 Pigmentiphaga kullae 균주에 대한 논문을 확인한 결과 2001년에 확인된 신종 균주로 Gram-negative이며, oxidase-positive, catalase-positive, 포자를 형성하지 않는 막대 모양의 균주로 확인되었다.As a result of analyzing the 16s rDNA nucleotide sequence of the isolated strain, a total sequence of 1107 bP could be confirmed (SEQ ID NO: 1). As a result of confirming this in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), it was confirmed that the Pigmentiphaga kullae strain and sequence similarity matched more than 99%, and the phylogenetic tree created was as shown in FIG. 3. As a result of checking the paper on the Pigmentiphaga kullae strain with a phylogenetic tree close to the isolate strain, it was identified as a new strain identified in 2001 as a Gram-negative, oxidase-positive, catalase-positive, rod-shaped strain that does not form spores.

본 연구를 통해서 분리한 KIT-003 균주를 Pigmentiphaga kullae KIT-003로 명명하였고, 이 16s rDNA 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank에 등록(MK886576)하였다. 또한 상기 Pigmentiphaga kullae KIT-003 균주는 전라북도 정읍에 소재한 생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2019년 9월 17일 수탁번호 KCTC 13948BP를 부여받았다.The KIT-003 strain isolated through this study was named Pigmentiphaga kullae KIT-003, and this 16s rDNA sequence was registered (MK886576) in GenBank of the National Center for Biological Information (NCBI). In addition, the Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain was deposited at the Biological Resource Center of the Research Institute of Bioscience and Biotechnology located in Jeongeup, Jeollabuk-do, and was given accession number KCTC 13948BP on September 17, 2019.

(2) (2) Pigmentiphaga kullaePigmentiphaga kullae KIT-003 균주의 다환 방향족 탄화수소 분해율 결과 Polycyclic aromatic hydrocarbon decomposition results of strain KIT-003

분리된 KIT-003 균주의 pheanthrene 300 mg/L에 대한 분해율을 확인한 결과, 도 4와 같이 BH배지에서 배양한 시료의 경우 1,3,5,7일 차에 각 48.2%, 83.7%, 86,1%, 96,9% 분해율을 보였으며 분해증진제인 1% HPCD이 들어있는 BH배지에서 배양한 시료의 경우 1일차에 82.2%, 3일차 이후에는 100%의 분해율을 보였다. 1% HPCD이 첨가되어 있는 BH배지에서 배양한 시료가 BH 배지에서 배양한 시료보다 1일차 약 2배 가까운 빠른 분해율을 보였으며, 3일차에 100%를 분해하여 훨씬 빠른 분해율을 보였다.As a result of confirming the degradation rate of pheanthrene 300 mg/L of the isolated KIT-003 strain, as shown in Figure 4, in the case of samples cultured in BH medium, 48.2%, 83.7%, 86, The degradation rate was 1%, 96.9%, and in the case of samples cultured in BH medium containing 1% HPCD as a degradation enhancer, the degradation rate was 82.2% on the first day and 100% after the third day. Samples cultured in BH medium supplemented with 1% HPCD showed about twice as fast degradation rate on day 1 than samples cultured in BH medium, and 100% degradation rate on day 3 showed much faster degradation rate.

또한, 고분자량 PAH인 fluoranthene 10 mg/L, pyrene 10 mg/L, benzo[a]pyrene 5 mg/L에 대한 분해율을 확인한 결과 도 5와 같이 14일차에 BH배지에서 각각을 64.2%, 37.1%, 13.1% 분해하였으며, 1% HPCD이 첨가된 BH배지에서는 100%, 68.7%, 47.4%를 분해하여 phenanthrene 분해 결과와 유사하게 분해증진제인 HPCD이 1% 첨가된 배지에서 PAH의 분해율이 2배 가량 높은 것을 확인할 수 있었다. 표 2는 KIT-003 균주의 7,14일차 Phenanthrene, fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene의 분해농도를 표시한 것이다.In addition, as a result of confirming the decomposition rate for fluoranthene 10 mg / L, pyrene 10 mg / L, and benzo [a] pyrene 5 mg / L, which are high molecular weight PAH, 64.2% and 37.1% respectively in the BH medium on the 14th day as shown in FIG. , 13.1% decomposition, and 100%, 68.7%, and 47.4% were decomposed in the BH medium supplemented with 1% HPCD, similar to the results of phenanthrene degradation. high was confirmed. Table 2 shows the decomposition concentrations of phenanthrene, fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene on the 7th and 14th days of strain KIT-003.

PAHPAH 배지badge 7 day7 days 14 day14 days
Phenanthrene
Phenanthrene BH 배지BH badge ++++++++ 1% HPCD이 첨가된 BH 배지BH medium supplemented with 1% HPCD ++++++++
Fluoranthene
Fluoranthene BH 배지BH badge ++++++ ++++++ 1% HPCD이 첨가된 BH 배지BH medium supplemented with 1% HPCD ++++++++ ++++++++
Pyrene
Pyrene BH 배지BH badge ++++ ++++ 1% HPCD이 첨가된 BH 배지BH medium supplemented with 1% HPCD ++++++ ++++++
Benzo[a]pyrene
Benzo[a]pyrene BH 배지BH badge ++ ++ 1% HPCD이 첨가된 BH 배지BH medium supplemented with 1% HPCD ++++ ++++ + : ≤ 1 mg/L; ++ : ≤ 4 mg/L; +++ : ≤ 7 mg/L; ++++ : ≤ 10 mg/L+: ≤ 1 mg/L; ++: ≤ 4 mg/L; +++ : ≤ 7 mg/L; ++++ : ≤ 10mg/L

상기 결과로부터 본 발명에서 분리한 KIT-003 균주는 phenanthrene, fluoranthene, pyrene, benzo[a]pyrene를 복합적으로 분해할 수 있는 미생물로 확인되었으며, PAH의 수용해도를 높여주는 분해증진제로 사용된 HPCD을 소량 첨가하면 KIT-003 균주의 PAH 분해능이 첨가하지 않은 최소배지에 비해 약 2배 가량 증가하는 것을 확인할 수 있었다.From the above results, the KIT-003 strain isolated in the present invention was identified as a microorganism capable of complexly decomposing phenanthrene, fluoranthene, pyrene, and benzo[a]pyrene, and HPCD used as a decomposition enhancer to increase the water solubility of PAH When a small amount was added, it was confirmed that the PAH decomposition capacity of the KIT-003 strain was increased by about 2 times compared to the minimal medium without addition.

(3) (3) Pigmentiphaga kullaePigmentiphaga kullae KIT-003 균주의 phenanthrene, benzo[a]pyrene 분해특성 결과 Results of degradation of phenanthrene and benzo[a]pyrene in strain KIT-003

KIT-003 균주의 Phenanthrene 분해특성을 확인하기 위해 1% HPCD 첨가 여부만 다른 두 종류의 배지에서 pH, 온도 그리고 염도를 달리한 후 KIT-003 균주를 접종하여 배양한 후 phenanthrene 300 mg/L의 3일차 분해율을 확인하였다.To confirm the phenanthrene decomposition characteristics of strain KIT-003, after inoculating and culturing strain KIT-003 after varying pH, temperature, and salinity in two types of media with only 1% HPCD added or not, three samples of phenanthrene 300 mg/L The primary decomposition rate was confirmed.

먼저, 도 6의 (a)는 pH 4.0~9.0 범위에서의 phenanthrene에 대한 분해율을 나타낸 것이다. KIT-003 균주는 pH 7.0에서 가장 높은 분해율을 보였고 pH 6.0~ 9.0에서도 pH 7.0과 유사하게 높은 분해율을 보였으며, 1% HPCD이 첨가된 BH배지에서는 pH6.0~9.0에서 거의 100%의 분해율을 보였다. 한편 pH 5.0에서는 낮은 분해율을 보였고 pH4.0, pH10에서는 분해가 거의 되지 않은 경향을 보였다.First, (a) of FIG. 6 shows the decomposition rate of phenanthrene in the pH range of 4.0 to 9.0. The KIT-003 strain showed the highest degradation rate at pH 7.0 and showed a high degradation rate similar to pH 7.0 at pH 6.0~9.0, and almost 100% degradation rate at pH 6.0~9.0 in BH medium with 1% HPCD added. seemed On the other hand, at pH 5.0, the decomposition rate was low, and at pH 4.0 and pH 10, decomposition was almost insignificant.

도 6의 (b)는 온도 조건에 따른 분해율을 나타낸 것이며, phenanthrene을 효율적으로 분해하는 최적 분해 조건은 30 ℃이었으나 20~35 ℃에서도 phenanthrene을 분해하는 것으로 확인되었고, 40 ℃이상에서는 거의 분해가 되지 않은 경향을 보였다. 한편 배지에 1% HPCD이 첨가된 BH배지에서는 20~30 ℃에서 100% 가까운 분해율을 보였다.Figure 6 (b) shows the decomposition rate according to temperature conditions. The optimal decomposition condition for efficiently decomposing phenanthrene was 30 ℃, but it was confirmed that phenanthrene was also decomposed at 20 ~ 35 ℃, and above 40 ℃, almost no decomposition. showed no trend. On the other hand, in the BH medium with 1% HPCD added to the medium, the degradation rate was close to 100% at 20~30 ℃.

도 6의 (c)는 염도 조건에 따른 분해율을 나타낸 것이며 염도 0%일 때 84%로 가장 높은 분해율을 보였으며 염도 0.5, 1% 조건에서도 70% 이상의 분해율을 보였으며 염도가 2% 이상 증가하면 분해가 거의 되지 않는 경향을 보였다. 1% HPCD가 첨가된 BH배지에서는 0~1% 염도조건에서 약 100%의 분해율을 보였다.Figure 6 (c) shows the decomposition rate according to the salinity condition, and showed the highest decomposition rate at 84% when the salinity was 0%, and showed a decomposition rate of 70% or more even at the salinity of 0.5 and 1%, and when the salinity increased by 2% or more showed little tendency to decomposition. In the BH medium supplemented with 1% HPCD, the degradation rate was about 100% under 0~1% salinity conditions.

한편, KIT-003균주의 benzo[a]pyrene의 분해특성을 확인하기 위해 1% HPCD이 첨가된 배지에서 pH, 온도, 염도를 각각 달리하여 KIT-003 균주를 접종하여 배양한 후 Benzo[a]pyrene 2 mg/L의 7일차 분해율을 확인하였다.On the other hand, in order to confirm the decomposition characteristics of benzo[a]pyrene of KIT-003 strain, KIT-003 strain was inoculated and cultured at different pH, temperature, and salinity in a medium containing 1% HPCD, and Benzo[a] The 7th day decomposition rate of 2 mg/L of pyrene was confirmed.

도 7의 (a)는 pH4.0~10.0 범위에서 Benzo[a]pyrene의 분해율을 나타낸 것이다. KIT-003 균주는 pH4.0~8.0 사이에서 전반적으로 60% 이상의 분해율을 보였으며 pH 10.0에서 20.4%로 다소 낮은 분해율을 보였다.Figure 7 (a) shows the decomposition rate of Benzo[a]pyrene in the pH range of 4.0 to 10.0. The KIT-003 strain showed an overall degradation rate of over 60% between pH 4.0 and 8.0, and a slightly lower degradation rate of 20.4% at pH 10.0.

도 7의 (b)는 온도 조건에 따른 Benzo[a]pyrene의 분해율을 나타낸 것이며 다른 온도에 비해 30~40 ℃에서 85% 이상의 높은 분해율을 보였으며 낮은 온도인 20, 25 ℃에서는 50% 미만으로 낮은 분해율을 보였고 45 ℃에서는 12%로 가장 낮은 분해율을 보였다.(b) of FIG. 7 shows the decomposition rate of Benzo[a]pyrene according to temperature conditions, and showed a higher decomposition rate of 85% or more at 30 ~ 40 ℃ compared to other temperatures, and less than 50% at low temperatures of 20 and 25 ℃. It showed a low decomposition rate and at 45 ℃ showed the lowest decomposition rate at 12%.

도 7의 (c)는 염도 조건에 따른 Benzo[a]pyrene 분해율을 나타낸 것이며, 염도 0%에서 가장 높은 분해율을 보였고 염도 농도가 0%에서 0.5%, 1%, 2%로 증가할수록 분해율이 85.8%, 69.0%, 53.3%, 13.7%로 감소하는 경향을 보였고 염도 3%에서는 분해가 거의 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.(c) of FIG. 7 shows the decomposition rate of Benzo[a]pyrene according to the salinity conditions. %, 69.0%, 53.3%, and 13.7%, and it was confirmed that almost no decomposition occurred at a salinity of 3%.

위 실험의 결과로부터 KIT-003균주는 유일한 탄소원으로 처리한 phenanthrene, benzo[a]pryene 분해 실험에서 일반적인 균주들과 달리 약산성에서 약알카리 범위인 pH4.0~9.0에서 PAH의 분해가 가능한 것으로 판단되며, 비교적 낮은 농도의 염도에 내성이 있어 염분이 있는 조건에서도 PAH를 분해할 수 있을 것으로 생각되었다. 또한, 넓은 범위의 온도 조건에서 PAH를 분해하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 1% HPCD 첨가된 배지에서 더욱 높은 분해율을 보였다.From the results of the above experiment, it is judged that the KIT-003 strain is capable of decomposing PAH in the pH 4.0 ~ 9.0, which is in the weakly acidic to weakly alkaline range, unlike the general strains in the phenanthrene and benzo[a]pryene decomposition experiment treated as the only carbon source. , it was thought that PAHs could be degraded even in the presence of salt because they were tolerant to relatively low concentrations of salinity. In addition, it was confirmed that PAH was decomposed in a wide range of temperature conditions, which showed a higher decomposition rate in the medium supplemented with 1% HPCD.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later and equivalent concepts rather than the detailed description above are included in the scope of the present invention.

한국생명공학연구원 생물자원센터Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center KCTC13948BPKCTC13948BP 2019091720190917

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof <130> KPA01544 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pigmentiphaga kullae <400> 1 cgcaagacct ctcactattg gagcggccga tgtcggatta gctagttggt ggggtaaagg 60 cctaccaagg cgacgatccg tagctggttt gagaggacga ccagccacac tgggactgag 120 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggggcaaccc 180 tgatccagcc atgccgcgtg tgcgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac ttttggcggg 240 aaagaaacgg cgccggataa tacctggcgt aactgacggt acccgcagaa taagcaccgg 300 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca agcgttaatc ggaattactg 360 ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggttcggaaa gaaagatgtg aaatcccagg gctcaacctt 420 ggaactgcat ttttaactcc cgaactagag tatgtcagag gggggtggaa ttccacgtgt 480 agcagtgaaa tgcgtagata tgtggaggaa caccgatggc gaaggcagcc ccctgggata 540 atactgacgc tcatgcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 600 acgccctaaa cgatgtcaac tagctgttgg gttcttcgga gcttggtagc gcagctaacg 660 cgtgaagttg accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg 720 gacccgcaca agcggtggat gatgtggatt aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta 780 cccttgacat gtctggaatc ctgaagagat ttaggagtgc tcgaaagaga accggaacac 840 aggtgctgca tggccgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 900 gcgcaaccct tgtcattagt tgctacgaaa gggcactcta atgagactgc cggtgacaaa 960 ccggaggaag gtggggatga cgtcaggtcc tcatggccct tatgggtagg gcttcacacg 1020 tcatacaatg gtcgggacag agggcagcca acccgcgagg gggagccaat cccagaaacc 1080 cgatcgtagt ccggattgca gtctgca 1107 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Novel pigmentiphaga kullae strain with polycyclic aromatic hydrocarbon degrading activity and use thereof <130> KPA01544 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> unknown <220> 223 <Pigmentiphaga kullae> <400> 1 cgcaagacct ctcactattg gagcggccga tgtcggatta gctagttggt ggggtaaagg 60 cctaccaagg cgacgatccg tagctggttt gagaggacga ccagccacac tgggactgag 120 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggggcaaccc 180 tgatccagcc atgccgcgtg tgcgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac ttttggcggg 240 aaagaaacgg cgccggataa tacctggcgt aactgacggt acccgcagaa taagcaccgg 300 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca agcgttaatc ggaattactg 360 ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggttcggaaa gaaagatgtg aaatcccagg gctcaacctt 420 ggaactgcat ttttaactcc cgaactagag tatgtcagag gggggtggaa ttccacgtgt 480 agcagtgaaa tgcgtagata tgtggaggaa caccgatggc gaaggcagcc ccctgggata 540 atactgacgc tcatgcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 600 acgccctaaa cgatgtcaac tagctgttgg gttcttcgga gcttggtagc gcagctaacg 660 cgtgaagttg accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg 720 gacccgcaca agcggtggat gatgtggatt aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta 780 cccttgacat gtctggaatc ctgaagagat ttaggagtgc tcgaaagaga accggaacac 840 aggtgctgca tggccgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 900 gcgcaaccct tgtcattagt tgctacgaaa gggcactcta atgagactgc cggtgacaaa 960 ccggaggaag gtggggatga cgtcaggtcc tcatggccct tatgggtagg gcttcacacg 1020 tcatacaatg gtcggggacag agggcagcca acccgcgagg gggagccaat cccagaaacc 1080 cgatcgtagt ccggattgca gtctgca 1107

Claims (11)

다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 분해능을 갖는 피그멘티파가 쿨라이(Pigmentiphaga kullae) KIT-003 균주(수탁번호 KCTC 13948BP)를 포함하고,
상기 다환 방향족 탄화수소는 페난트렌(phenanthrene), 플루오란테인(fluoranthene), 피렌(pyrene) 또는 벤조에이피렌(benzo[a]pyrene)인 것인, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물. Pigmentiphaga kullae KIT-003 strain (Accession No. KCTC 13948BP) having polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading ability,
Wherein the polycyclic aromatic hydrocarbon is phenanthrene, fluoranthene, pyrene or benzo[a]pyrene. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 조성물은 HPCD(hydroxypropyl-β-cyclodextrin)를 추가로 더 포함하는 것인, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물.The composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons according to claim 1, wherein the composition further comprises HPCD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin). 제1항에 있어서, 상기 균주는 HPCD(hydroxypropyl-β-cyclodextrin)의 첨가에 따라 다환 방향족 탄화수소 분해능이 증가하는 것을 특징으로 하는, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물. The composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons according to claim 1, wherein the strain has an increased ability to decompose polycyclic aromatic hydrocarbons according to the addition of HPCD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin). 제1항에 있어서, 상기 균주는 pH 6.0 내지 9.0, 온도 25 내지 35℃, 염도 0 내지 1% 조건에서 페난트렌에 대한 최적 분해능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물.The composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons according to claim 1, wherein the strain exhibits optimum decomposition ability for phenanthrene under conditions of pH 6.0 to 9.0, temperature 25 to 35 °C, and salinity 0 to 1%. 제1항에 있어서, 상기 균주는 pH 4.0 내지 9.0, 온도 30 내지 40℃, 염도 0 내지 1% 조건에서 벤조에이피렌에 대한 최적 분해능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물.The composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons according to claim 1, wherein the strain exhibits optimum decomposition ability for benzoapyrene under conditions of pH 4.0 to 9.0, temperature 30 to 40 ° C, and salinity 0 to 1%. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 다환 방향족 탄화수소 분해용 조성물을 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는, 다환 방향족 탄화수소 오염물의 정화 방법.A method for purifying polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants, comprising contacting a sample containing polycyclic aromatic hydrocarbons with the composition for decomposing polycyclic aromatic hydrocarbons according to any one of claims 1 and 3 to 6. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete

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